使用拮抗性抗－cd40單克隆抗體治療多發性骨髓瘤的製作方法

2023-06-02 17:15:31

專利名稱：使用拮抗性抗－cd40單克隆抗體治療多發性骨髓瘤的製作方法
技術領域：
本發明涉及使用拮抗性抗-CD40單克隆抗體治療多發性骨髓瘤的方法。
背景技術：
多發性骨髓瘤(MM)是B細胞惡性腫瘤，其特徵為具有低增殖指數和延長的生命跨度的分泌型漿細胞在骨髓中潛在的積累。該疾病最終攻擊骨或骨髓，在整個骨骼系統中導致多發性腫瘤和病損。所有癌症中約1％和所有血液性惡性腫瘤中略超過10％由多發性骨髓瘤所致。MM在老年人群中發病率上升，診斷到該病的中值年齡是約61歲。當前的治療方案(包括聯用諸如長春新鹼、BCNU、美法侖、環磷醯胺、阿黴素和潑尼松或地塞米松的化療藥物)產生的完全消退率僅是約5％，自診斷之時起的中值存活時間是約36-48個月。近年來高劑量化療後進行自體骨髓或外周血組細胞(PBMC)移植的進展增加了完全消退率和消退持續時間。然而總的存活(時間)僅略微延長，並且未獲得完全治癒的證據。即使單用幹擾素-α(IFN-α)或與類固醇聯合進行維持治療，最終所有MM患者都會復發。
低細胞增殖率和產生多藥抗性限制了所有可用的MM化療治療方案的效力。對於超過90％的MM患者，該疾病變為化學抗性(chemoresisitant)。因此，人們尋求目標為靶向表面抗原，例如漿細胞上的CD20和CD40的過繼性免疫治療的替代治療方案。
CD40是一種存在於正常和致瘤性人B細胞、樹突狀細胞、其它抗原呈遞細胞(APC)、內皮細胞、單核細胞和上皮細胞表面的55kDa細胞表面抗原。CD40配體與B細胞表面的CD40抗原結合刺激B細胞、導致B細胞成熟為分泌高水平可溶性免疫球蛋白的漿細胞。B細胞系的幾種腫瘤的惡性B細胞表達高水平的CD40並且其存活和增殖似乎依賴CD40信號傳導。因此，具有低級和高級B細胞淋巴瘤、B細胞急性成淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病和何杰金病的患者的轉化細胞表達CD40。重要的是，與CD20相比，在較高百分比的多發性骨髓瘤細胞上發現有CD40(Maloney等，(1999)，Semin.Hematol.36(增刊3)30-33)。
由於多發性骨髓瘤患者的預後不佳，需要替代治療方法。
發明簡述本發明提供了治療多發性骨髓瘤人對象的方法，該方法包括給予對象抗-CD40抗體或其抗原結合片段，當所述抗體或其抗原結合片段與人CD40表達細胞上的CD40抗原結合時無明顯的激動活性。本發明也提供了抑制表達CD40抗原的多發性骨髓瘤細胞生長的方法。
用於本發明方法的合適的拮抗性抗-CD40抗體對CD40具有強親和力，其特徵為至少10-6M、優選至少約10-7M-10-8M、更優選至少約10-8M-10-12M的解離平衡常數(KD)。這些單克隆抗體和它們的抗原結合片段能特異性結合表達在人細胞表面的人CD40抗原。當它們與人細胞上的CD40抗原結合時，無明顯的激動活性而顯示拮抗活性。在一個實施方案中，當抗-CD40抗體或其片段結合正常人B細胞上的CD40抗原時顯示拮抗活性。在另一個實施方案中，當抗-CD40抗體或其片段結合惡性人B細胞上的CD40抗原時，顯示拮抗活性。合適的單克隆抗體具有人恆定區；它們也優選具有完全或部分的人源化框架區；最優選完全的人抗體或它們的抗原結合片段。
這種單克隆抗體的例子是可通過重組產生的本文名為5.9和CHIR-12.12的抗體；名為131.2F8.5.9(本文稱為細胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(稱為細胞系12.12)的雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體；含有SEQ ID NO6所示、SEQ ID NO7所示、SEQ ID NO8所示、同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示胺基酸序列的單克隆抗體；含有SEQ ID NO2所示、SEQ ID NO4所示、SEQ ID NO5所示、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示胺基酸序列的單克隆抗體；具有由含有SEQ ID NO1所示、SEQ ID NO3所示、同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示核苷酸序列的核酸分子編碼的胺基酸序列的單克隆抗體；和保留了特異性結合人CD40能力的這些單克隆抗體的抗原結合片段，當它們結合人細胞上的CD40抗原時，無明顯的激動活性而顯示拮抗活性。這種單克隆抗體的例子也包括結合某表位的單克隆抗體，所述表位能結合雜交瘤細胞系12.12產生的單克隆抗體；結合某表位的單克隆抗體，所述表位含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示胺基酸序列的殘基82-87；在競爭性結合試驗中與單克隆抗體CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；和為CHIR-12.12單克隆抗體或任一上述單克隆抗體的抗原結合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結合人CD40抗原的能力。
在本發明的一個實施方案中，治療方法包括給予患者治療有效劑量的藥物組合物，該組合物含有合適的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段。抗-CD40抗體或其抗原結合片段的治療有效劑量約是0.01mg/kg-40mg/kg、約0.01mg/kg-30mg/kg、約0.1mg/kg-30mg/kg、約1mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-25mg/kg、約3mg/kg-20mg/kg、約5mg/kg-15mg/kg或約7mg/kg-12mg/kg。應理解該治療方法包括單次給予治療有效劑量或多次給予治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段。
可修飾適用於本發明方法的本文所鑑定的拮抗性抗-CD40抗體。這些拮抗性抗-CD40抗體的修飾物包括，但不限於免疫活性的嵌合性抗-CD40抗體、人源化抗-CD40抗體和免疫活性的鼠抗-CD40抗體。
附圖簡述

圖1顯示了mAb CHIR-12.12的輕鏈和重鏈的胺基酸序列。圖1A顯示輕鏈的前導區(SEQ ID NO2的殘基1-20)、可變區(SEQ ID NO2的殘基21-132)和恆定區(SEQ ID NO2的殘基133-239)。圖1B顯示重鏈的前導區(SEQID NO4的殘基1-19)、可變區(SEQ ID NO4的殘基20-139)和恆定區(SEQ IDNO4的殘基140-469)。圖1B所示mAb CHIR-12.12重鏈的交替恆定區反映了SEQ ID NO4的153位用絲氨酸殘基替換丙氨酸殘基。mAb CHIR-12.12重鏈的該變體的完整序列示於SEQ ID NO5。
圖2顯示mAb CHIR-12.12的輕鏈(圖2A；SEQ ID NO1)和重鏈(圖2B；SEQ ID NO3)的編碼序列。
圖3列出了mAb 5.9的輕鏈和重鏈的胺基酸序列。圖3A顯示了輕鏈的前導區(SEQ ID NO6的殘基1-20)、可變區(SEQ ID NO6的殘基21-132)和恆定區(SEQ ID NO6的殘基133-239)。圖3B顯示了重鏈的前導區(SEQ ID NO7的殘基1-19)、可變區(SEQ ID NO7的殘基20-144)和恆定區(SEQ ID NO7的殘基145-474)。圖3B所示mAb 5.9重鏈的交替恆定區反映了SEQ ID NO7的158位用絲氨酸殘基替換丙氨酸殘基。mAb 5.9重鏈的該變體的完整序列示於SEQ ID NO8。
圖4顯示了人CD40的短同種型(胺基酸序列示於圖4B；SEQ ID NO10)的編碼序列(圖4A；SEQ ID NO9)和人CD40的長同種型(胺基酸序列示於圖4D)的編碼序列(圖4C；SEQ ID NO11)。
圖5闡述了使用人多發性骨髓瘤IM-9異種移植模型以單克隆抗體CHIR-12.12和硼替佐米(bortezomib)(VELCADE_)聯合治療提高了體內抗腫瘤活性。
圖6顯示了通過示差掃描量熱法(DSC)測定的CHIR-12.12在不同pH製劑中的熱解鏈溫度。
發明詳述本文所用的「腫瘤」指所有致瘤性細胞(無論是惡性還是良性的)的生長和增殖，和所有前癌和癌細胞和組織。
術語「癌症」和「癌性的」表示或描述了以不受調控的細胞增殖為典型特徵的哺乳動物的生理狀況。癌症的例子包括，但不限於淋巴瘤、多發性骨髓瘤和白血病。
「抗體」和「免疫球蛋白」(Ig)是具有相同結構特徵的糖蛋白。雖然抗體顯示對抗原的結合有特異性，但免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏抗原特異性的抗體樣分子。後一類型的多肽有例如淋巴系統以低水平產生和骨髓瘤以高水平產生的多肽。
術語「抗體」以最廣義用時包括全裝配的抗體、能結合抗原的抗體片段(例如，Fab′、F′(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙體分子)和包含以上物質的重組肽。
本文使用的術語「單克隆抗體」指得自基本上同質的抗體群的抗體，即除了可能存在極少量天然發生的突變以外，構成該群的每個抗體是相同的。
「天然抗體」和「天然免疫球蛋白」通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成的約150,000道爾頓的異源四聚糖蛋白。每條輕鏈經共價二硫鍵與重鏈相連，而二硫鍵的數目視不同免疫球蛋白同種型的重鏈而不同。每條重鏈和輕鏈也具有有規律地隔開的鏈內二硫橋。每條重鏈的一端為可變區(VH)，其後是多個恆定區。每條輕鏈的一端為可變區(VL)，在另一端為恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一恆定區配對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區配對。據信，特定的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區之間形成相互作用界面。
術語「可變」表示以下內容在抗體之間，可變區的某些部分在序列上差別很大，這部分是每種特定抗體用於與其特定抗原特異性結合的部分。然而，可變性不是均勻分布於整個抗體可變區中。它集中於位於輕鏈或重鏈可變區的稱為互補決定區(CDR)或超變區的3個區段。可變區的較保守部分稱為框架(FR)區。天然輕鏈和重鏈的可變區包含主要採取β-片層構型並由3個CDR相連的4個FR區，CDR形成(有時形成部分)連接β-片層結構的環。每條鏈中的CDR通過FR區緊密相聚，並且與另一條鏈的CDR緊靠在一起形成抗體的抗原結合位點(參見，Kabat等，(1991)NIH Publ.No.91-3242，第I卷，647-669頁)。
恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但顯示各種效應器功能，例如Fc受體(FcR)結合、抗體參與依賴抗體的細胞毒性、調理作用、啟動依賴補體的細胞毒性和肥大細胞脫顆粒。
本文使用的術語「超變區」指負責結合抗原的抗體胺基酸殘基。超變區包括「互補決定區」或「CDR」的胺基酸殘基(即，輕鏈可變區的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，(1991)《免疫學感興趣的蛋白質的序列》(Sequences of proteins ofImmunological Interest)(第5版，Public Health Service，National Institute ofHealth，Bethesda，MD)和/或「超變環」的胺基酸殘基(即，輕鏈可變區的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Clothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196901-917)。「框架」或「FR」殘基是除超變區殘基以外的可變區殘基。
「抗體片段」包括完整抗體的一部分，優選完整抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙體分子；線性抗體(Zapata等，(1995)Protein Eng 8(10)1057-1062)；單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性(multispecific)抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個稱為「Fab」片段的相同的抗原結合片段(每種具有一個抗原結合位點)與一殘留的「Fc」片段(其名字反映它易於結晶)。胃蛋白酶處理得到具有兩個抗原結合位點的F(ab′)2片段，該片段仍能交聯抗原。
「Fv」是含有完整的抗原識別和結合位點的最小抗體片段。在雙鏈Fv抗體中，該區由緊密的非共價締合的一條重鏈可變區和一條輕鏈可變區的二聚體組成。在單鏈Fv抗體中，一條重鏈可變區和一條輕鏈可變區經可彎曲的肽接頭共價相連從而使輕鏈和重鏈締合成類似於雙鏈Fv抗體中的「二聚體」結構。每個可變區的3個CDR正是在這種構型中相互作用而確定了VH-VL二聚體表面上的抗原結合位點。6個CDR共同賦予了該抗體的抗原結合特異性。然而，即使一個可變區(或僅含有3個抗原特異性CDR的半個Fv)也能識別並結合抗原，雖然親和力低於完整的結合位點。
Fab片段也含有輕鏈恆定區和重鏈第一恆定區(CH1)。Fab片段因在重鏈CH1結構域的羧基末端多幾個殘基(包括抗體絞鏈區的一個或多個半胱氨酸殘基)而不同於Fab』片段。本文稱為Fab′-SH的是其恆定區半胱氨酸殘基帶有一個游離巰基的Fab′。F(ab′)2抗體片段最初製備為之間具有絞鏈半胱氨酸的成對Fab′片段。抗體片段的其它化學偶聯反應也是已知的。
任何脊椎動物種類的抗體(免疫球蛋白)的「輕鏈」可分為截然不同的兩種類型，該兩種類型根據它們恆定區的胺基酸序列稱為kappa(κ)和lambda(λ)。
免疫球蛋白可依它們重鏈恆定結構域的胺基酸序列分為不同類型。人免疫球蛋白主要有5類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中幾類可進一步分成亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應於不同類免疫球蛋白的重鏈恆定區結構域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型是熟知的。不同的同種型具有不同的效應器功能。例如，人IgG1和IgG3同種型可介導依賴抗體的細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性。
本文所用的「標記」指直接或間接與抗體偶聯而產生「標記」抗體的可檢測化合物或組合物。標記本身可檢測(例如，放射性同位素標記或螢光標記)，或者就酶標記而言，可催化底物化合物或組合物化學轉變成可檢測化合物。可用作可檢測標記的放射性核素包括，例如I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212和Pd-109。標記也可以是不可檢測的實體，例如毒素。
術語「拮抗劑」以最廣義使用，包括能部分或完全阻斷、抑制或中和本文公開的天然靶分子的生物活性或其轉錄或翻譯的任何分子。
本文所用的「載體」包括當其以所用劑量和濃度與細胞或哺乳動物接觸時沒有毒性的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑。生理上可接受的載體通常是pH緩衝水溶液。生理上可接受的載體的例子包括緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖或其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑，例如吐溫、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克。「聯合」一種或多種其它治療性藥物給藥包括同步(同時)和以任何順序連續給藥。
本文所用的術語「宿主細胞」指以單核實體培養的微生物或真核細胞或細胞系，它們可以是或已用作重組載體或其它轉移多核苷酸的受者，並且包括受轉染原始細胞的後代。應理解，由於天然的、偶發的或設計的突變，一個細胞的後代在形態或基因組或總DNA互補性上無需和原始的親代完全相同。
「人效應細胞」是表達一種或多種FcR並行使效應器功能的白細胞。這些細胞優選至少表達FcγRII並行使依賴抗原的細胞介導細胞毒性(ADCC)效應器功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞，優選PBMC和NK細胞。具有ADCC活性的抗體通常是IgG1或IgG3同種型。應注意，除了分離得到IgG1和IgG3抗體以外，這種ADCC介導性抗體可通過將非ADCC抗體的可變區或可變區片段工程改造為IgG1或IgG3同種型的恆定區來製備。
術語「Fc受體」或「FcR」用於描述能結合抗體Fc區域的受體。優選的FcR是天然序列的人FcR。此外，優選的FcR可結合IgG抗體(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體或者交替剪接形式。FcγRII受體包括具有相似胺基酸序列、主要在於胞質結構域不同的FcγIIA(「活化性受體」)和FcγIIB(「抑制性受體」)。活化性受體FcγRIIA在其胞質結構域中含有免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受體FcγRIIB在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見Daeron(1997)Annu.Rev.Immunol.15203-234)。FcR綜述見Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991)；Capel等，(1994)Immunomethods 425-34和de Haas等，(1995)J.Lab.Clin.Med.126330-341。本文的術語「FcR」包括其它FcR，包括將來鑑定到的FcR。該術語也包括將成熟IgG轉移至胎兒的新生受體，FcRn(Guyer等，(1976)J.Immunol.117587和Kim等，(1994)J.Immunol.24249(1994))。
製備人抗體的方法有很多。例如，可用Epstein-Barr病毒(EBV)感染使分泌細胞無限增殖。然而，EBV-感染的細胞難於克隆並且得到的免疫球蛋白通常產量較低(James和Bell(1987)J.Immunol.Methods 1005-40)。將來，可能通過引入轉化基因的有限組合來實現人B細胞的無限增殖。近來的發現增加了這種可能性，即端粒酶催化性亞基連同H-ras的SV40大癌蛋白和H-ras癌等位基因一起表達可導致正常人上皮細胞和成纖維細胞的致癌性轉變(Hahn等，(1999)Nature 400464-468)。現在已可能製備經過免疫後能產生全套人抗體不產生內源性免疫球蛋白的轉基因動物(例如，小鼠)(Jakobovits等，(1993)Nature 362255-258；Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.1365-93；Fishwild等，(1996)Nat.Biotechnol.14845-851；Mendez等，(1997)Nat.Genet.15146-156；Green(1999)J.Immunol.Methods 23111-23；Tomizuka等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97722-727；綜述見Little等，(2000)Immunol.Today 21364-370)。例如，嵌合型和種系突變小鼠的抗體重鏈連接區(JH)基因的純合子消除可完全抑制內源性抗體的產生已見描述(Jakobovits等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551-2555)。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉移入這種種系突變小鼠可製備轉基因小鼠品系(Jakobovits等，(1993)Nature 362255-258)。Mendez等，(1997)(Nature Genetics 15146-156)，當用抗原攻擊後可產生高親和力完全人抗體。這可通過將兆鹼基的人重鏈和輕鏈基因座通過種系整合入刪除了上述內源性JH區段的小鼠來實現。這些小鼠(XenoMouse_II technology(Abgenix；Fremont，California))具有1,020kb的人重鏈基因座和800kb的人κ基因座，其中人重鏈基因座含有約66個VH基因、完全的DH和JH區域，以及3個不同的恆定區，人κ基因座含有32個Vκ基因、Jκ片段和Cκ基因。這些小鼠中產生的抗體在各方面，包括基因重排、裝配和所有成分極其類似於在人中觀察到的抗體。由於刪除了內源性片段從而防止了鼠基因座中基因重排，此種人抗體的表達優先壓倒內源性抗體。這種小鼠可用特別感興趣的抗原免疫。
可篩選這種免疫動物血清對原先(接種)抗原的抗體反應性。可從淋巴節或脾細胞分離淋巴細胞，選擇CD138-陰性和CD19-陽性淋巴細胞來選擇B細胞。一方面，可將這種B細胞培養物(BCC)與骨髓瘤細胞融合以產生上述雜交瘤。
在另一方面，宜進一步篩選這種B細胞培養物對原先(接種)抗原的反應性。這種篩選包括用靶/抗原蛋白質的ELISA、用能與感興趣抗原結合的已知抗體進行競爭性試驗和與瞬時感染的表達該靶抗原的CHO或其它細胞的體外結合試驗。
本發明涉及治療多發性骨髓瘤的人患者的組合物和方法。這些方法包括用本文所述的抗-CD40抗體或其抗原結合片段治療，其中給予該抗體或其抗原結合片段可在接受該治療方法的對象內提高陽性治療應答。適用於本發明方法的抗-CD40抗體能特異性結合表達於人細胞表面的人CD40抗原，並且當與人CD40表達細胞上的CD40抗原結合後無明顯激動活性而顯示拮抗活性，如對於表達CD40的正常和瘤性人B細胞所證實的那樣。這些抗-CD40抗體和其抗原結合片段在本文中稱為拮抗性抗-CD40抗體。這種抗體包括，但不限於下文所述的完整的人單克隆抗體5.9和CHIR-12.12，和具有單克隆抗體5.9和CHIR-12.12結合特性的單克隆抗體。這些可重組產生的單克隆抗體描述於下文和分別於2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名為「拮抗性抗-CD40單克隆抗體及它們的使用方法」的待批臨時申請，以及轉讓的美國專利申請號60/517,337(代理人審理號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人審理號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人審理號PP20107.003(035784/277214))所述，各專利申請的內容均全文納入本文作為參考。
具有單克隆抗體5.9和CHIR-12.12結合特性的抗體包括能競爭性幹擾CD40結合和/或與5.9和CHIR-12.12相同表位結合的抗體。技術人員可採用本領域已知的標準方法確定某抗體是否競爭性幹擾5.9或CHIR-12.12。
當這些抗體結合展示於人細胞，例如人B細胞表面上的CD40時，無明顯的激動活性；在一些實施方案中，抗體與展示於人細胞表面的CD40結合抑制了這些人細胞的增殖與分化。因此，適用於本發明方法的拮抗性抗-CD40抗體包括對表達細胞表面CD40抗原的正常和惡性人細胞可顯示拮抗活性的單克隆抗體。
拮抗性抗-CD40抗體單克隆抗體5.9和CHIR-12.12代表了用於本發明方法的合適的拮抗性抗-CD40抗體。5.9和12.12抗體是雜交瘤細胞系131.2F8.5.9(本文稱為細胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(本文稱為細胞系12.12)產生的IgG1同種型完全人抗-CD40單克隆抗體。採用含有人IgG1重鏈基因座和人κ鏈基因座的免疫的異種小鼠(XenoMouse_technology；Abgenix；Fremont，Califomia)脾細胞獲得了這些細胞系。使脾細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細胞(Sierra BioSource)融合。將得到的雜交瘤亞克隆數次得到穩定的單克隆細胞系5.9和12.12。本發明的其它抗體可用含有人免疫球蛋白基因座的轉基因小鼠或通過本領域已知和/或本文所述的其它方法類似地製備。
CHIR-12.12抗體的可變區的核苷酸和胺基酸序列，5.9抗體的可變區的胺基酸序列分別見2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名為「拮抗性抗-CD40單克隆抗體及它們的使用方法」的待批臨時申請，以及轉讓的美國專利申請號60/517,337(代理人審理號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人審理號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人審理號PP20107.003(035784/277214))中所述，各申請的內容全文納入本文作為參考。mAb CHIR-12.12輕鏈和重鏈的前導區、可變區和恆定區的胺基酸序列分別示於圖1A和1B。也參見SEQ IDNO2(mAb CHIR-12.12輕鏈的完整序列)、SEQ ID NO4(mAb CHIR-12.12重鏈的完整序列)和SEQ ID NO5(SEQ ID NO4所示mAb CHIR-12.12的重鏈變體的完整序列，其變體包含在SEQ ID NO4所示153位絲氨酸殘基替換了丙氨酸殘基)。編碼mAb CHIR-12.12輕鏈和重鏈的核苷酸序列分別示於圖2A和2B。也參見SEQ ID NO1(mAb CHIR-12.12輕鏈的編碼序列)和SEQ ID NO3(mAb CHIR-12.12重鏈的編碼序列)。5.9mAb輕鏈和重鏈的前導區、可變區和恆定區的胺基酸序列分別示於圖3A和3B。也參見SEQ ID NO6(mAb 5.9輕鏈的完整序列)、SEQ ID NO7(mAb 5.9重鏈的完整序列)和SEQ ID NO8(SEQ ID NO7所示mAb 5.9的重鏈變體的完整序列，其變體包含在SEQ IDNO7所示158位絲氨酸殘基替換了丙氨酸殘基)。此外，表達5.9和CHIR-12.12抗體的雜交瘤分別在ATCC中以專利保藏號PTA-5542和PTA-5543保藏。
除了拮抗活性外，本發明的抗-CD40抗體優選具有另一種抗腫瘤細胞的作用機理。例如，天然5.9和CHIR-12.12抗體具有ADCC活性。或者，5.9和CHIR-12.12抗體的可變區可表達在具有ADCC活性的另一種抗體同種型上。如下文所述，也可將5.9或CHIR-12.12的天然形式、重組形式或其抗原結合片段偶聯於細胞毒素。
如流式細胞術試驗測定的那樣，在ELISA型測定中5.9和CHIR-12.12單克隆抗體與可溶性CD40結合、阻止了CD40-配體與細胞表面CD40結合併置換了先前結合的CD40-配體。抗體5.9和CHIR-12.12可彼此競爭而不與15B8競爭結合CD40，15B8是2000年10月2日提交的名為「人抗-CD40抗體」的美國臨時申請系列號60/237,556和2001年10月2日提交的也名為「人抗-CD40抗體」的PCT國際申請號PCT/US01/30857(代理人審理號PP 16092.003)中所述的抗-CD40單克隆抗體，該兩篇申請的內容均全文納入引為參考。當在體外測試對正常人對象的B細胞增殖的作用時，5.9和CHIR-12.12起拮抗性抗-CD40抗體作用。此外，5.9和CHIR-12.12不誘導正常人對象的淋巴細胞強增殖。這些抗體能通過依賴抗體的細胞毒性(ADCC)殺死CD40表達靶細胞。如BiacoreTM試驗所測定的，5.9與人CD40的結合親和力是1.2×10-8M，CHIR-12.12的結合親和力是5×10-10M。
用於本發明方法的合適的拮抗性抗-CD40抗體對CD40細胞表面抗原顯示強的單一位點結合親和力。採用標準試驗，例如BiacoreTM測定本發明的單克隆抗體對CD40的解離平衡常數(KD)顯示為至少10-5M、至少3×10-5M、優選至少10-6M-10-7M、更優選至少10-8M-約10-12M。Biacore分析是本領域已知的並詳述於《BIA應用手冊》(BIAapplications handbook)。WO 01/27160所述的方法用於調節結合親和力。
「CD40抗原」、「CD40細胞表面抗原」、「CD40受體」或「CD40」指屬於腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的跨膜糖蛋白(參見，例如美國專利號5,674,492和4,708,871；Stamenkovic等，(1989)EMBO 81403；Clark(1990)Tissue Antigens 3633；Barclay等，(1997)《白血球抗原手冊》(The LeucocyteAntigen Facts Book)(第二版；Academic Press，San Diego))。已鑑定到該基因交替剪接轉錄變體編碼的人CD40的兩種同種型。第一種同種型(也稱為「長同種型」或「同種型1」)表達為具有由前19個殘基代表的信號序列的277個胺基酸的前體多肽(SEQ ID NO12(首次報導為GenBank登錄號CAA43045，在GenBank登錄號NP_001241中鑑定為同種型1)，由SEQ ID NO11(參見GenBank登錄號X60592和NM_001250)編碼)。第二種同種型(也稱為「短同種型」或「同種型2」)表達為也具有由前19個殘基表示的信號序列的203個胺基酸的前體多肽(SEQ ID NO10(首次報導為GenBank登錄號NP_690593)，由SEQ ID NO9(GenBank登錄號NM_152854)編碼)。人CD40的這兩種同種型的前體多肽的前165個殘基相同(即，SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的殘基1-165)。短同種型的前體多肽(SEQ ID NO10所示)由缺乏編碼區段，導致翻譯讀框移位的轉錄物變體(SEQ ID NO9)編碼；與CD40長同種型所含有的(SEQ ID NO12的殘基166-277所示C-末端)相比，得到的CD40同種型含有較短且不同的C-末端(SEQ ID NO10的殘基166-203)。對於本發明的目的，術語「CD40抗原」、「CD40細胞表面抗原」、「CD40受體」或「CD40」包括CD40的短和長同種型。本發明的抗-CD40抗體可與下文所述該細胞表面抗原的短同種型或長同種型中相同位置的人CD40表位結合。
如本文別處所述，CD40抗原展示在各種類型細胞的表面。「展示於表面」和「表達於表面」指全部或部分CD40抗原暴露於細胞的外部。展示或表達的CD40抗原可完全或部分糖基化。
「激動活性」指作為激動劑的物質功能。激動劑與細胞受體的結合引起了與該受體的天然配體所引起的相似或相同的反應或活性。例如，CD40激動劑可誘導任何或全部的下列應答B細胞增殖和/或分化；抗體產生；胞內粘附；B細胞記憶產生(memory generation)；同種型轉換、上調II類MHC和CD80/60的細胞表面表達；分泌促炎性細胞因子，例如IL-8、IL-12和TNF等。「拮抗活性」指作為拮抗劑的物質功能。例如，CD40的拮抗劑可防止或降低通過CD40受體與激動性配體，特別是CD40L結合誘導的任何應答。拮抗劑可使激動劑結合所誘導的一種或多種應答降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、優選40％、45％、50％、55％、60％、更優選70％、80％、85％和最優選90％、95％、99％或100％。檢測抗-CD40抗體和CD40-配體結合特異性與拮抗活性的方法是本領域技術人員已知的，包括但不限於標準的競爭性結合試驗、監測B細胞分泌免疫球蛋白的試驗、B細胞增殖試驗、Banchereau樣B細胞增殖試驗、抗體產生的T細胞輔助試驗、B細胞增殖的共同刺激試驗和上調B細胞激活標記的試驗。參見，例如分別公開於以下專利或申請中的試驗WO 00/75348；美國專利號6,087,329；和2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名為「拮抗性抗-CD40單克隆抗體及它們的使用方法」的待批臨時申請，以及轉讓的美國專利申請號60/517,337(代理人審理號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人審理號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人審理號PP20107.003(035784/277214))，各申請的內容均全文納入本文作為參考。
「明顯的」激動活性指在B細胞應答試驗中所檢測的激動活性比天然物質或陰性對照誘導的高至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。「明顯的」激動活性優選在B細胞應答試驗中檢測到的激動活性比天然物質或陰性對照誘導的高至少2倍或3倍。因此，例如當感興趣的B細胞應答是B細胞增殖時，「明顯的」B細胞增殖指誘導的B細胞增殖水平比天然物質或陰性對照誘導的B細胞增殖水平大至少2倍或3倍。在一個實施方案中，不結合CD40的非特異性免疫球蛋白，例如IgG1作為陰性對照。「無明顯激動活性」的物質顯示在B細胞應答試驗中檢測到的激動活性不高於天然物質或陰性對照誘導的激動活性約25％，優選不高約20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或甚至不高約0.1％。如上所述，當與人細胞上的CD40抗原結合時，本發明方法所用的拮抗性抗-CD40抗體無明顯的激動活性。在本發明的一個實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體在B細胞應答中無明顯的激動活性。在本發明的另一個實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體在多種細胞應答試驗中(例如，增殖和分化，或增殖、分化和抗體產生)無明顯的激動活性。
本文所用的「抗-CD40抗體」包括特能異性識別CD40B細胞表面抗原的抗體，包括多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體以及它們的片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留了親代抗-CD40抗體的抗原結合功能的其它片段。對本發明而言，特別感興趣的是與上述單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12具有相同結合特性的本文公開的拮抗性抗-CD40抗體。這種抗體包括，但不限於以下抗體(1)分別以專利保藏號PTA-5542和PTA-5543由ATCC保藏的，命名為131.2F8.5.9(本文稱為細胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(本文稱為細胞系12.12)的雜交瘤細胞系所產生的單克隆抗體；(2)含有選自SEQ ID NO2所示、SEQ ID NO4所示、SEQ ID NO5所示胺基酸序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示，與同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示胺基酸序列的單克隆抗體；(3)含有選自SEQ ID NO6所示、SEQ ID NO7所示、SEQ ID NO8所示胺基酸序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示，與同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示胺基酸序列的單克隆抗體；(4)具有由選自含有SEQ ID NO1所示、SEQ ID NO3所示、同時含有SEQ IDNO1和SEQ ID NO3所示核苷酸序列的核酸分子編碼的胺基酸序列的單克隆抗體；(5)能與雜交瘤細胞系5.9或12.12產生的單克隆抗體所結合的表位相結合的單克隆抗體；(6)能結合含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示胺基酸序列的殘基82-87表位的單克隆抗體；(7)在競爭性結合試驗中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；和(8)作為CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或前項(1)-(7)中所述單克隆抗體的抗原結合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結合人CD40抗原的能力。本領域技術人員知道，使用本領域已知和下文所述方法重組產生的本文公開的拮抗性抗體和這些抗體的抗原結合片段包括，例如已經重組產生的單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12。
製備拮抗性抗-CD40抗體用於本發明的拮抗性抗-CD40抗體可用本領域技術人員已知的任何方法製備。因此，可通過常規方法製備多克隆血清。通常先用含CD40抗原的溶液免疫合適的動物，優選小鼠、大鼠、家兔或山羊。由於可得到的血清體積多和可用已有的抗-家兔和抗-山羊標記抗體，優選用家兔和山羊製備多克隆血清。
可在轉基因動物，優選攜帶人免疫球蛋白基因座的小鼠中製備多克隆血清。在一優選的實施方案中，表達CD40的SF9細胞用作免疫原。也可用鹽水，優選用完全弗氏佐劑混合或乳化含有抗原的溶液，經胃腸外(通常是皮下或肌肉內)注射該混合物或乳劑來免疫。每次注射50-200μg的劑量一般足夠。通常在2-6周後注射用鹽水配製，優選用不完全弗氏佐劑配製的蛋白質加強免疫一次或多次。或者可用本領域已知的方法體外免疫產生抗體，就本發明目的而言體外與體內免疫等效。將免疫動物的血液放入玻璃或塑料容器25℃孵育該血液1小時，然後4℃孵育2-18小時獲得多克隆抗血清。離心(例如，1,000×g 10分鐘)回收血清。每次放血可自家兔獲得約20-50ml血清。
Sf9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))細胞的製備方法見納入本文作為參考的美國專利號6,004,552中所述。簡言之，將編碼人CD40的序列用轉移載體重組入杆狀病毒。將質粒與野生型杆狀病毒DNA共同轉染入Sf9細胞。鑑定重組杆狀病毒感染的Sf9細胞並克隆純化。
優選的抗體性質上是單克隆抗體。「單克隆抗體」指得自基本上均質抗體群的抗體，即除了存在極少量天然發生的突變以外，組成該群的每個抗體是相同的。該術語不受限於抗體的種類或來源。該術語包括完整的免疫球蛋白及其片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留了抗體結合功能的其它片段。單克隆抗體是高度特異性的，針對一個的抗原性位點，即在本發明中為CD40細胞表面抗原。此外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體製劑相反，每種單克隆抗體針對抗原上一個決定簇。修飾詞「單克隆的」表示得自基本上均質的抗體群的抗體特性，不可理解為需要通過任何具體方法產生該抗體。例如，本發明所用的單克隆抗體可通過Kohler等，(1975)Nature 256495首次描述的雜交瘤方法或重組DNA方法製備(參見，例如美國專利號4,816,567)。「單克隆抗體」也可用，例如Clackson等，(1991)Nature 352624-628；Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222581-597；和美國專利號5,514,548中所述技術自噬菌體抗體文庫分離得到。
「表位」指抗原性分子中能誘導產生抗體並結合該抗體的那一部分。表位可含有線性胺基酸殘基(即，表位內的殘基以線性方式一個接一個順序排列)，非線性胺基酸殘基(本文稱為「非線性表位」；這些表位非順序排列)或線性與非線性胺基酸殘基。
可使用Kohler等，(1975)Nature 256495-496所述方法或其改進形式製備單克隆抗體。通常用含抗原的溶液免疫小鼠。可用鹽水，優選用完全弗氏佐劑混合或乳化含有抗原的溶液，經胃腸外注射混合物或乳劑來免疫。可用本領域已知的任何免疫方法來獲得本發明的單克隆抗體。免疫動物後，取出脾臟(任選取出幾個大的淋巴結)解離成為單個細胞。使細胞混懸液塗布於包被有感興趣抗原的板或孔來篩選脾細胞。表達抗原特異性膜結合免疫球蛋白的B細胞與板結合而不被洗掉。然後誘導得到的B細胞或所有分離的脾細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤，用選擇性培養基培養。接種得到的細胞系列稀釋液並測定能特異性結合感興趣抗原的抗體(和不結合無關抗原的抗體)的產生。然後將分泌單克隆抗體(mAb)的選出的雜交瘤在體外(例如，在組織培養瓶或中空纖維反應器中)或體內(作為小鼠的腹水)培養。
當用重組DNA方法製備本發明的拮抗性抗-CD40抗體時，使用常規方法(例如，用能特異性結合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)不難分離得到並測序編碼單克隆抗體的DNA。本文所述的雜交瘤細胞是這種DNA的優選來源。一旦分離後，可將此DNA置於表達載體中，然後將載體轉染入本身不產生免疫球蛋白的宿主細胞，例如大腸桿菌、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞中從而獲得在該重組宿主細胞中合成的單克隆抗體。在細菌中重組表達編碼抗體的DNA的綜述性文章包括Skerra等，(1993)Curr.Opinion in Immunol.5256和Phickthun(1992)Immunol.Revs.130151。或者，如納入本文作為參考的美國專利號5,545,403；5,545,405和5,998,144中所公開的，可在細胞系，例如CHO細胞系中製備抗體。簡言之，用能表達輕鏈和重鏈的載體分別轉染該細胞系。嵌合性抗體可通過轉染不同載體上的兩種蛋白質來製備。另一優點是該抗體正確糖基化。
在一些實施方案中，用GS基因表達系統(Lonza Biologics，Portsmouth，New Hampshire)在CHO細胞中製備拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結合片段，所述表達系統使用穀氨醯胺合成酶作為標記。也參見其內容全文納入本文作為參考的美國專利號5,122,464；5,591,639；5,658,759；5,770,359；5,827,739；5,879,936；5,891,693；和5,981,216。
CD40的單克隆抗體是本領域已知的。參見，例如以下文獻中有關B-細胞抗原的章節，McMichael編，(1987；1989)《白細胞分型III和IV》(LeukocyteTyping III and IV)(牛津大學出版社，紐約)；美國專利號5,674,492；5,874,082；5,677,165；6,056,959；WO 00/63395；國際公布號WO 02/28905和WO 02/28904；Gordon等，(1988)J.Immunol.1401425；Valle等，(1989)Eur.J.Immunol.191463；Clark等，(1986)PNAS 834494；Paulie等，(1989)J.Immunol.142590；Gordon等，(1987)Eur.J Immunol 171535；Jabara等，(1990)J.Exp.Med.1721861；Zhang等，(1991)J.Immunol.1461836；Gascan等，(1991)J.Immunol.1478；Banchereau等，(1991)Clin.Immunol.Spectrunt 38；和Banchereau等，(1991)Science 25170；所有文獻納入本文作為參考。本發明特別感興趣的是本文公開的與上述單克隆抗體5.9和CHIR-12.12具有相同結合特性的拮抗性抗-CD40抗體。
本文使用的術語「CD40-抗原表位」指除CD40抗原本身以外能與本發明的抗-CD40單克隆抗體起免疫反應的分子。CD40-抗原表位包括蛋白質、蛋白質片段、肽、碳水化合物、脂質和其它分子，但就本發明的目的而言，最常用蛋白質、短的寡肽、寡肽模擬物(即，能模擬CD40抗原的抗體結合性能的有機化合物)或它們的組合。PCT申請US 91/04282描述了合適的寡肽模擬物。
此外，本文使用的術語「抗-CD40抗體」包括嵌合性抗-CD40抗體；用於本發明方法的這種嵌合性抗-CD40抗體具有本文所述5.9和CHIR-12.12單克隆抗體的結合特性。「嵌合」抗體指最好是用重組脫氧核糖核酸技術衍生的含有人(包括免疫「相關「種類，例如黑猩猩)和非人組分的抗體。因此，嵌合性抗體恆定區最好基本上與天然的人抗體恆定區相同；嵌合性抗體可變區最好衍生自非人來源並具有所需CD40細胞表面抗原的抗原性特異性。非人來源是可用來產生針對人CD40細胞表面抗原或含有人CD40細胞表面抗原物質的抗體的任何脊椎動物來源。這種非人來源包括，但不限於嚙齒類(例如，家兔、大鼠、小鼠等；參見，例如，納入本文作為參考的美國專利號4,816,567)和非人靈長類(例如，古猴(Old World Monkey)，類人猿等；例如納入本文作為參考的美國專利號5,750,105和5,756,096)。當本文所用的短語「免疫活性」指嵌合性抗-CD40抗體時，指能結合人CD40的嵌合性抗體。
本文所用的術語抗-CD40抗體也包括嵌合性與人源化抗-CD40抗體。嵌合性抗體含有衍生自不同種類的抗體的片段。Rituxan_是具有鼠可變區和人恆定區的嵌合性抗體例子。
「人源化」指含有衍生自非人免疫球蛋白序列的最小序列的抗-CD40抗體形式。就大部分序列而言，人源化抗體指其中受者的超變區殘基(也稱為互補決定區或CDR)被非人種類(供體抗體)，例如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類的超變區殘基取代的，具有所需特異性、親和力或能力的人免疫球蛋白(受者抗體)。短語「互補決定區」指共同確定了天然免疫球蛋白結合位點的天然Fv區域的結合親和力和特異性的胺基酸序列。參見，例如Chothia等，(1987)J.Mol.Biol.196901-917；Kabat等，(1991)美國健康與人類服務部(U.S.Dept.ofHealth and Human Services)，NIH公布號91-3242)。短語「恆定區」指抗體分子中賦予效應器功能的那部分。在以前涉及產生用於治療人疾病的無免疫原性抗體的研究中，小鼠恆定區被人恆定區取代。所述人源化抗體的恆定區衍生自人免疫球蛋白。然而，這些人源化抗體仍能在人中引發有害且可能危險的免疫應答並且喪失了親和力。用於本發明方法的人源化抗-CD40抗體具有類似於本文所述5.9和CHIR-12.12單克隆抗體所顯示的結合特性。
人源化基本上可根據Winter及其同事(Jones等，(1986)Nature 321522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332323-327；Verhoeyen等，(1988)Science2391534-1536)的方法通過用嚙齒類或突變型嚙齒類CDR或CDR序列取代人抗體的相應序列來進行。也參見納入本文作為參考的美國專利號5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762和5,859,205。在一些例子中，人免疫球蛋白的一個或多個可變區的框架區內的殘基為對應的非人殘基所取代(參見，例如美國專利號5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370)。此外，人源化抗體可含有在受者抗體或供體抗體中沒發現的殘基。製備這些修飾物可進一步精製抗體的性能(例如，獲得所需的親和力)。總體上，人源化抗體基本上含有所有可變區、至少一個，通常兩個可變區，其中所有或基本上所有的超變區是對應的非人免疫球蛋白序列，所有或基本上所有的框架區是對應的人免疫球蛋白序列。人源化抗體也任選包含免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恆定區的至少一部分。更多的細節見引作參考的Jones等，(1986)Nature 331522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2593-596。因此，這種「人源化」抗體可包括其中基本上小於完整的人可變區被非人種類的相應序列取代的抗體。實際上，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些框架殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘基取代的人抗體。參見，例如美國專利號5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。也參見美國專利號6,180,370，和國際公布號WO01/27160，其中公開了人源化抗體和產生對預定抗原具有改進親和力的人源化抗體的技術。
術語抗-CD40抗體也包括非人哺乳動物宿主，更具體說是以滅活的內源性免疫球蛋白(Ig)基因座為特徵的轉基因小鼠產生的異種或修飾的抗-CD40抗體。在這種轉基因動物中，使得表達宿主免疫球蛋白輕鏈和重鏈的活性內源性基因無功能，並用同類人免疫球蛋白基因座取代。這些轉基因動物可產生基本上無宿主免疫球蛋白輕或重鏈亞基的人抗體。參見，例如納入本文作為參考的美國專利號5,877,397和5,939,598。
針對CD40的完整人抗體優選通過免疫轉基因小鼠獲得。這種小鼠可用XenoMouse_技術(Abgenix；Fremont，Califomia)獲得並公開於納入本文作為參考的美國專利號6,075,181；6,091,001和6,114,598中。為製備本文公開的抗體，用表達人CD40的Sf9細胞免疫具有人IgG1重鏈基因座和人K輕鏈基因座的轉基因小鼠。小鼠也可以是其它同種型的轉基因動物。本發明所用的完整人抗體的特徵在於其結合特性與本文公開的5.9和CHIR-12.12單克隆抗體所顯示的特徵相似。
只要抗-CD40抗體的片段保留了所需的全長抗體的親和力，它們就適用於本發明的方法。因此，抗-CD40抗體的片段保留了結合CD40B細胞表面抗原的能力。這種片段的特徵在於其性能與相應的全長拮抗性抗-CD40抗體相似，即這種片段能特異性結合表達於人細胞表面的人CD40抗原，並且當與人CD40表達細胞上的CD40抗原結合時無明顯激動活性而顯示拮抗活性。本文將這種片段稱為「抗原結合」片段。
抗體的合適的抗原結合片段含有全長抗體的一部分，通常是其抗原結合區或可變區。抗體片段的例子包括，但不限於Fab、F(ab′)2、Fv片段和單鏈抗體分子。「Fab」指由輕鏈或重鏈的一部分組成的免疫球蛋白的單價抗原結合片段。F(ab′)2指含有兩條輕鏈和兩條重鏈的一部分的免疫球蛋白的二價抗原結合片段。「單鏈Fv」或「sFv」抗體片段指含有抗體的VH和VL結構域的片段，其中這些結構域以一條多肽鏈的形式存在。參見，例如納入本文作為參考的美國專利號4,946,778；5,260,203；5,455,030和5,856,456。Fv多肽通常在VH和VL結構域之間還含有一多肽接頭使sFv形成能與抗原結合所需的結構。sFv的綜述見Pluckthun(1994)《單克隆抗體的藥理學》(The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore編，(Springer-Verlag，New York)，269-315頁。如下文所述，本文公開的拮抗性抗-CD40抗體的抗原結合片段也可與細胞毒素偶連以起殺死靶癌細胞的作用。
可利用例如McCafferty等，(1990)Nature 348552-554(1990)和美國專利號5,514,548中描述的技術從抗體噬菌體文庫分離得到抗體或抗體片段。Clackson等，(1991)Nature 352624-628和Marks等，(1991)J.Mol.Bird.222581-597分別描述了利用噬菌體文庫分離得到鼠和人抗體。隨後的出版物描述了通過構建非常大的噬菌體文庫方案的鏈改組(Marks等，(1992)Bio/Technology10779-783)以及組合感染和體內重組來產生高親和力(nM範圍)人抗體(Waterhouse等，(1993)Nucleic.Acids Res.212265-2266)。因此，這些技術是分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行替代方法。
已開發了各種技術來製備抗體片段。這些片段通過使完整抗體蛋白水解消化而獲得(參見，例如Morimoto等，(1992)Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24107-117(1992)和Brennan等，(1985)Science 22981)。然而，現在這些片段可通過重組宿主細胞直接製備。例如，可從上述噬菌體文庫分離抗體片段。或者，可從大腸桿菌中直接回收Fab′-SH片段並化學偶聯形成F(ab′)2片段(Carter等，(1992)Bio/Technology 10163-167)。根據另一方法，可從重組宿主細胞培養物直接分離得到F(ab′)2片段。其它製備抗體片段的技術是技術人員熟知的。
本發明方法所用的拮抗性抗-CD40抗體包括本文公開的5.9和CHIR-12.12單克隆抗體以及與該抗體不同但保留了CDR的抗體；具有一個或多個胺基酸添加、刪除或取代的抗體，可通過抑制B細胞增殖和/或分化來測定其拮抗活性。本發明也包括脫免疫的(de-immunized)拮抗性抗-CD40抗體，該抗體可按納入本文作為參考的國際公布號WO 98/52976和WO 0034317所述製備。本發明的拮抗性抗-CD40抗體內的殘基以該方式修飾而使得該抗體對人無免疫原性或較低，但卻保留了對人CD40表達細胞的拮抗活性，所述活性可用本文其它部分所述試驗測定。權利要求的範圍也包括本領域已知的含有本發明拮抗性抗-CD40抗體或其片段的融合蛋白，所述融合蛋白可合成或從相應的多核苷酸載體表達。參考下述抗體偶聯法所描述的這種融合蛋白。
本發明的抗體可具有用例如納入本文作為參考的專利公布號EP 0 983303A1、WO00/34317和WO98/52976中所述方法產生的序列變異。例如，CDR中的序列顯示可導致抗體與II型MHC結合併引發有害的輔助性T細胞應答。保守取代可使得該抗體保留結合活性而喪失其引發有害T細胞應答的能力。可用本領域已知，例如本文其它部分所述的方法進行任何這種保守或非保守取代，得到的抗體屬於本發明的範圍。用本文所述方法常規測試變體抗體的拮抗活性、親和力和特異性。
如果上述任何方法或其它本文未公開的方法製備的抗體在體外和/或體內擁有至少一種以下生物活性，其屬於本發明範圍抑制T細胞刺激的正常人外周B細胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T細胞刺激的正常人外周B細胞增殖；抑制表達CD40L的細胞或可溶CD40配體(sCD40L)刺激的正常人外周B細胞增殖；抑制sCD40L或固態CD40L刺激的任何細胞中「存活性」抗-凋亡胞內信號轉導；抑制細胞與sCD40L或固態CD40L結合時的CD40信號轉導；和抑制下述人惡性B細胞增殖。這些試驗可如以下待批臨時申請所述進行2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名為「拮抗性抗-CD40單克隆抗體及它們的使用方法」的待批臨時申請，以及轉讓的美國專利申請號60/517,337(代理人審理號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人審理號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人審理號PP20107.003(035784/277214))，每篇文獻的內容全文納入本文作為參考。也參見納入本文作為參考的以下文獻所述的試驗Schultze等，(1998)，Proc.Natl.Sci.USA 928200-8204；Denton等，(1998)，Pediatr.Transplant.26-15；Evans等，(2000)，J.Immunol.164688-697；Noelle等，(1998)，AgentsActions Suppl.4917-22；Lederman等，(1996)，Curr.Opin.Hematol.377-86；Coligan等，(1991)，《當代免疫學方法》(Current Protocols in Immunology)1312；Kwekkeboom等，(1993)，Immunology 79439-444和美國專利號5,674,492和5,847,082。
檢測本文所鑑定的CD40-抗原表位特異性拮抗性抗-CD40抗體的代表性試驗是「競爭性結合試驗」。競爭性結合試驗是通過抑制標記的已知配體和其特異抗體結合的能力來檢測和定量未知物的血清學試驗。也稱為競爭性抑制試驗。在代表性的競爭性結合試驗中，標記的CD40多肽與樣品中的候選抗體，例如與針對本發明單克隆抗體的一種或多種表位而產生的單克隆抗體結合而沉澱。可通過篩選針對CD40蛋白或含有感興趣CD40蛋白特定表位的蛋白片段而製備的一系列抗體來鑑定能與感興趣某表位特異性反應的抗-CD40抗體。例如，就人CD40而言，感興趣的表位包括含有以下同種型的線性和/或非線性胺基酸殘基的表位如圖4B所示(SEQ ID NO10)的由圖4A所示序列(SEQ IDNO9；也參見GenBank登錄號NM_152854)編碼的人CD40短同種型(見GenBank登錄號NP_690593)，或如圖4D所示(SEQ ID NO12)由圖4C所示序列(SEQ ID NO11；參見GenBank登錄號X60592和NM_001250)編碼的人CD40長同種型(參見GenBank登錄號CAA43045和NP001241)。或者，可用以前鑑定的合適的拮抗性抗-CD40抗體進行競爭性結合試驗來選擇與以前鑑定的抗體相當的單克隆抗體。
這種免疫試驗採用的抗體可以是標記的或未標記的。未標記的抗體可用於凝結試驗；採用各種各樣標記物的標記抗體可用於各種試驗。通過使抗體與可檢測物質連接有助於檢測抗-CD40抗體與感興趣表位之間形成的抗體-抗原複合物。合適的檢測方式包括使用例如放射性核素、酶、輔酶、螢光劑、化學發光劑、色原、酶底物或輔助因子、酶抑制劑、輔基複合物、自由基、顆粒、染料等標記。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適的輔基複合物例子包括鏈黴抗生物素蛋白/生物素和親和素/生物素；合適的螢光物質例子包括傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光物質的例子是魯米諾；生物發光物質的例子包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白；合適的放射性物質的例子包括125I、131I、35S或3H。這種標記的試劑可用於各種熟知的試驗，例如放射性免疫試驗，酶免疫試驗如ELISA、螢光免疫試驗等。參見，例如美國專利號3,766,162；3,791,932；3,817,837和4,233,402。
可將任何前述的拮抗性抗-CD40抗體或它們的抗體片段偶聯然後用於本發明方法。製備偶聯抗體的方法是本領域已知的。因此，可用間接標記或間接標記方法來標記抗-CD40抗體。「間接標記」或「間接標記方法」指將螯合劑共價偶聯於抗體並且將至少一种放射性核素插入該螯合劑中。例如，參見納入本文作為參考的Srivagtava和Mease，(1991)Nucl.Med.Bio.18589-603中所述的螯合劑和放射性核素。合適的標記包括螢光基團、生色團、放射性原子(特別是32P和125I)、電子密集試劑(electron-dense reagent)、酶和具有特異性結合伴侶(partner)的配體。一般通過其活性來檢測酶。例如，常通過將3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)轉變為可用分光光度計定量的藍色色素的能力來檢測辣根過氧化物酶。「特異性結合伴侶」指能以高特異性結合配體分子的蛋白質，例如抗原和其特異性單克隆抗體。其它特異性結合伴侶包括生物素和親和素或鏈黴抗生物素蛋白、IgG和蛋白A、本領域已知的許多受體-配體對。因為相同的標記可以幾種不同模式使用，以上描述應該理解為不是要將各種標記歸為截然不同的種類。例如，125I可用作放射性標記或作為電子密集試劑。HRP可用作酶或mAb的抗原。此外，可為所需的作用組合各種標記。例如，mAb與親和素在實施本發明中也需要標記因此，可用生物素標記mAb，然後用標記125I的親和素或用標記HRP的抗-生物素mAb檢測其存在。其它預先(製備)的突變與可能性對本領域普通技術人員不難理解，應認為是本發明範圍內的等價物。
或者，抗-CD40抗體可使用放射性核素與抗體直接共價相連(一般通過胺基酸殘基)的「直接標記」或「直接標記方法」標記。優選的核素見Srivagtava和Mease(1991)，同上。特別優選間接標記方法。也參見，例如國際公布號WO 00/52031和WO 00/52473，其中接頭用於連接放射性標記與抗體；抗-CD40抗體的受標記形式描述於納入本文作為參考的美國專利號6,015,542。
此外，抗體(或其片段)可與治療性部分，例如細胞毒素、治療性藥物或放射性金屬離子或放射性同位素偶聯。細胞毒素或細胞毒藥物包括對細胞有害的任何藥物。例子包括紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、足葉乙苷、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、長春新鹼、長春鹼、秋水仙素、阿黴素、道諾紅菌素、二羥基炭疽菌素二酮、米託蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤黴素及它們的類似物或同系物。治療性藥物包括，但不限於抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine))、烷化劑(例如，氮芥、thioepachlorambucil、美法侖、卡氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴素C和順二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環類(例如，道諾紅菌素(曾用名道諾黴素)和阿黴素)、抗生素(例如，放線菌素D(曾用名放線菌素)、博萊黴素、光神黴素和氨茴黴素(AMC))、和抗有絲分裂藥物(例如，長春新鹼和長春鹼)。放射性同位素包括，但不限於I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。本發明的偶聯物可用於修飾給定的生物應答；此類藥物部分不應理解為限制於典型的化學治療劑。例如，此類藥物部分可以是擁有所需生物活性的蛋白質或多肽。這種蛋白質可包括，例如毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質，如腫瘤壞死因子、幹擾素-α、幹擾素-β、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原激活物；或生物應答修飾劑，如淋巴因子、白介素-1(「IL-1」)、白介素-2(「IL-2」)、白介素-6(「IL-6」)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(「GM-CSF」)、粒細胞集落刺激因子(「G-CSF」)或其它生長因子。
將這種治療性部分偶聯於抗體的技術是熟知的。參見，例如《單克隆抗體和癌症治療》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中的Arnon等，(1985)，「癌症治療中用於藥物的免疫靶向的單克隆抗體」(Monoclonal Antibodies forImmunotargeting of Drugs in Cancer Therapy)，Reisfeld等編，(Alan R.Liss，Inc.)，第243-256頁；Hellstrom等，(1987)，《受控藥物遞送》(Controlled Drug Delivery)中的「用於藥物遞送的抗體」(Antidodies for Drug Delivery)，Robinson等編，(第二版；MarcelDekker，Inc.)，第623-653頁；《單克隆抗體』84生物學和臨床應用》(Monoclonal Antibodies′84Biological and Clinical Applications)中的Thorpe，(1985)，「癌症治療中細胞毒性藥物的抗體載體綜述」(Antibodycarriers of Cytoxic Agents in Cancer TherapyA review)，Pinchera等編，第475-506頁，(Editrice Kurtis，Milano，Italy，1985)；《癌症診斷和治療的單克隆抗體》(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy)中的「在癌症治療中治療性應用放射性標記抗體的分析、結果和前景」(Analysis，Results，andFuture Prospective of Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherpy)，Baldwin等編，(Academic Press，New York，1985)，第303-316頁；和Thorpe等，(1982)Immunol.Rev.62119-158。
或者，可將抗體與二抗偶聯形成如美國專利號4,676,980所述的抗體雜合偶聯物。此外，可在標記和本發明的抗體之間使用接頭(參見美國專利號4,831,175)。抗體或其抗原結合片段可用放射性碘、銦、銥或本領域已知的其它放射性顆粒直接標記(美國專利號5,595,721)。治療方案可由同時或依次給予偶聯和非偶聯抗體的組合治療方案構成(WO 00/52031和WO 00/52473)。
拮抗性抗-CD40抗體的變體拮抗性抗-CD40抗體的合適的生物活性變體可用於本發明的方法。這種變體保留了親代拮抗性抗-CD40抗體的所需結合特性。製備抗體變體的方法一般是本領域可用的。
例如，拮抗性抗-CD40抗體，如本文所述的5.9或CHIR-12.12單克隆抗體的胺基酸序列變體可通過突變克隆的編碼感興趣抗體的DNA序列來製備。誘變與核苷酸序列改變的方法是本領域熟知的。例如，參見納入本文作為參考的Walker和Gaastra編，(1983)，《分子生物學技術》(Techniques in MolecularBiology)，(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等，(1987)Methods Enzymol.154367-382；Sambrook等，(1989)，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，(冷泉港，紐約)；美國專利號4,873,192；和本文引用的參考文獻。適當的胺基酸取代而不影響感興趣多肽的生物活性的指南見納入本文作為參考的Dayhoff等，(1978)《蛋白質序列和結構圖》(Atlas of ProtezhSequence and Structure)，(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中的模型。優選保守取代，例如用具有相似特性的另一胺基酸取代一個胺基酸。保守取代的例子包括，但不限於Gly_Ala、Val_Ile_Leu、Asp_Glu、Lys_Arg、Asn_Gln和Phe_Trp_Tyr。
在構建感興趣的拮抗性抗-CD40抗體多肽的變體過程中，進行修飾使變體繼續具有所需活性，即相似的結合親和力並能特異性地結合表達於人細胞表面的人CD40抗原，並且當與人CD40表達細胞上的CD40抗原結合時無明顯的激動活性而顯示拮抗活性。編碼這種變體多肽的DNA中的任何突變顯然無須將其序列置於讀框外並且優選不要生成可能產生二級mRNA結構的互補區。參見歐洲專利公布號75,444。
此外，可以許多方式使拮抗性抗-CD40抗體的恆定區突變而改變其效應器功能。例如，參見美國專利號6,737,056B1和美國專利申請公布號2004/0132101A1所述的優化抗體與Fc受體結合的Fc突變。
參比的拮抗性抗-CD40抗體的變體的胺基酸序列優選與該參比拮抗性抗-CD40抗體分子，例如本文所述的5.9或CHIR-12.12單克隆抗體的胺基酸序列，或與該參比抗體分子的較短部分具有至少70％或75％序列相同性，優選至少80％或85％序列相同性，更優選至少90％、91％、92％、93％、94％或95％序列相同性。這些分子更優選具有至少96％、97％、98％或99％序列相同性。出於本發明的目的，可使用Smith-Waterman同源性檢索算法以相關空格(affinegap)檢索確定序列相同性百分比，所用參數為空格開放罰分12、空格延伸罰分2和BLOSUM矩陣62。Smith-Waterman同源性檢索算法的說明見Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2482-489。例如，變體與參比的抗-CD40抗體有少至1-15個胺基酸殘基、少至1-10個胺基酸殘基，如6-10，少至5個、少至4個、3個、2個、甚至1個胺基酸殘基的不同。
就兩條胺基酸序列的最佳比對而言，與參比胺基酸序列相比，變體胺基酸序列的毗連區段可具有額外的胺基酸殘基或刪除的胺基酸殘基。用於和參比胺基酸序列比較的毗連區段包括至少20個毗連胺基酸殘基，可以是30、40、50或更多個胺基酸殘基。可對與保守殘基取代或空格相關的序列相同性進行校正(參見Smith-Waterman同源性檢索算法)。
能特異性結合CD40並保留拮抗活性的多肽的精確化學結構，特別是當與惡性B細胞上的CD40抗原結合時取決於許多因素。由於分子中存在可電離的氨基和羧基，特定的多肽可以酸性鹽或鹼性鹽，或以中性鹽形式獲得。在合適的環境中可保留它們的生物活性的所有這種製劑包括在本文所用的拮抗性抗-CD40抗體的定義中。此外，可通過使用糖組分衍生(糖基化)或通過其它補充分子，例如脂質、磷酸、乙醯基等增加該多肽的一級胺基酸序列。也可通過和糖偶聯來增加該多肽的一級胺基酸序列。這種增加的某些方面可通過生產宿主的翻譯後加工系統來實現；可在體外引入其它這種修飾。在任何情況中，只要抗-CD40抗體的拮抗特性能未遭破壞，這種修飾就包括在本文所用的抗-CD40抗體的定義中。在各種試驗中，期望這種修飾可通過提高或降低該多肽的活性來定量或定性地影響其活性。此外，可通過氧化、還原或其它衍生方式來修飾鏈中的各個胺基酸殘基，可切割該多肽得到保留活性的片段。這種不破壞拮抗活性的改變未將該多肽序列排除在本文所用感興趣的抗-CD40抗體的定義之外。
本領域為有關多肽變體的製備和使用提供了基本指南。在製備抗-CD40抗體變體過程中，本領域的技術人員易於確定對天然蛋白質的核苷酸或胺基酸序列的哪種修飾將導致適合用作本發明方法藥物組合物中治療性活性組分的變體。
採用本發明的拮抗性抗-CD40抗體的治療方法本發明的方法涉及用拮抗性抗-CD40抗體來治療具有多發性骨髓瘤的對象(即，患者)，其中該癌症的細胞表達CD40抗原。「表達CD40的多發性骨髓瘤細胞」指表達CD40抗原的多發性骨髓瘤細胞。成功地治療多發性骨髓瘤取決於診斷時癌症的發展階段、對象是否以前或即將聯合抗-CD40給藥接受其它治療方法。
許多標準可用於將多發性骨髓瘤分為不同的階段。本發明的方法可用於治療根據Durie-Salmon分類系統分類的包括3個階段的多發性骨髓瘤。根據該分類系統，患有階段I多發性骨髓瘤的對象具有低「M組分」，無貧血或高鈣血症跡象、X-射線未檢測到骨病損或僅有一個病損。「M組分」指一種免疫球蛋白類型的存在過多。隨著多發性骨髓瘤發展，對象產生IgA或IgG抗體的高M組分和低水平的其它免疫球蛋白。階段II表示中級狀況，高於階段I，但仍缺乏階段III的性質。當檢測到以下一種或多種症狀則達到了第三階段高鈣血症、貧血、多發性骨病損或高度M組分。
Durie-Salmon分類系統可聯合對肌酐水平的測量以更精確地鑑定疾病狀態。多發性骨髓瘤對象的肌酐水平分為「A」或「B」，「B」結果表明比「A」更差的預後。「B」表明肌酐水平高和腎功能衰竭。在這種方式中，多發性骨髓瘤的「階段IA」表明無貧血、高鈣血症或其它症狀以及肌酐水平低。作為評價預後的其它方式，上述標準可與監測β-2-微球蛋白的血液水平聯用，所述β-2-微球蛋白由多發性骨髓瘤細胞產生。高水平的該蛋白表明存在大量的癌細胞。
本發明的方法適用於治療根據上述任何標準分類的多發性骨髓瘤。就是因為這些標準可用於鑑定該疾病的發展階段，可監測這些相同的標準，即貧血、高鈣血症、肌酐水平和β-2-微球蛋白水平、骨病損的數量和M組分來評價治療效果。
本文將「治療」定義為將拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段應用於或給予對象，或將拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段應用於或給予對象的分離的組織或細胞系，所述對象患有多發性骨髓瘤，多發性骨髓瘤相關症狀，或多發性骨髓瘤的易感性，給藥的目的是為治癒、治療、緩解、減輕、改變、補救、改善、提高或影響多發性骨髓瘤、多發性骨髓瘤的任何相關症狀、或多發性骨髓瘤的易感性。「治療」也指將含有拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的藥物組合物應用於或給予對象，或將含有拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的藥物組合物應用於或給予對象的分離的組織或細胞系，所述對象患有多發性骨髓瘤，多發性骨髓瘤相關的症狀，或多發性骨髓瘤的易感性，給藥的目的是為治癒、治療、緩解、減輕、改變、補救、改善、提高或影響多發性骨髓瘤、多發性骨髓瘤的任何相關症狀、或多發性骨髓瘤的易感性。
「抗腫瘤活性」指降低惡性的CD40表達細胞增殖或積累的速率從而降低已存在的腫瘤或在治療期間產生的腫瘤的生長速率，和/或破壞已存在的致瘤性(腫瘤)細胞或新形成的致瘤性細胞從而減小治療期間腫瘤的總體積。用至少一種抗-CD40抗體(或其抗原結合片段)治療可導致治療多發性骨髓瘤的有益生理應答，所述疾病包含表達CD40抗原的細胞。應該知道本發明的方法可用於防止多發性骨髓瘤細胞在治療過程中的進一步增殖和過度生長。
根據本發明的方法，至少一種本文它處所定義的拮抗性抗-CD40抗體(或其抗原結合片段)可用於促進對治療和預防多發性骨髓瘤相關的陽性治療性應答。癌症治療相關的「陽性治療性應答」指與這些抗體或其片段的抗腫瘤活性相關疾病的改善，和/或疾病相關症狀的改善。即，可觀察到抗增殖作用、防止腫瘤進一步過度增殖，腫瘤體積減小、腫瘤細胞數量降低、和/或CD40表達細胞激活所介導的一種或多種症狀的減輕。因此，疾病改善的特徵可以是完全的應答。「完全的應答」指任何以前異常的放射顯影研究、骨髓和腦脊髓液(CSF)正常化的臨床上無可檢測的疾病。用本發明的方法治療後這種應答必須維持至少一個月。或者，疾病的改善可歸類為部分應答。「部分應答」指在無新的病損時，所有可檢測的腫瘤負荷(即，對象中腫瘤細胞的數量)至少降低約50％並至少持續一個月。這種應答僅適用於可檢測的腫瘤。
可用以下篩選技術評價腫瘤應答所導致的腫瘤形態(即，總的腫瘤負荷、腫瘤體積等)變化例如磁共振成像(MRI)掃描、x-放射顯影成像、計算機化斷層顯像(CT)掃描、生物發光成像，如螢光素酶成像、骨掃描成像和包括抽取骨髓(BMA)的腫瘤活體組織取樣。除了這些陽性治療性應答以外，用拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段治療的對象可經歷疾病相關症狀改善的有益作用。
「治療有效劑量或量」或「有效量」指給予拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段後，可導致與治療多發性骨髓瘤患者相關的陽性治療性應答的量。在本發明的一些實施方案中，抗-CD40抗體或其片段的治療有效量為約0.01mg/kg-40mg/kg、約0.01mg/kg-30mg/kg、約0.1mg/kg-30mg/kg、約1mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-25mg/kg、約3mg/kg-20mg/kg、約5mg/kg-15mg/kg或約7mg/kg-12mg/kg。應知道該治療方法可包括一次給予或多次給予治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段。
本發明的另一實施方案是將拮抗性抗-CD40抗體用作臨床測試過程的一部分來診斷性監測組織中蛋白質水平，例如用於檢測給定治療方案的有效性。將該抗體與可檢測的物質偶聯有助於檢測。可檢測物質的例子包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質和放射性物質。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適的輔基複合物的例子包括鏈黴抗生物素蛋白/生物素和親和素/生物素；合適的螢光物質的例子包括傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光物質的例子包括魯米諾；生物發光物質的例子包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白；合適的放射性物質的例子包括125I、131I、35S或3H。
拮抗性抗-CD40抗體可與已知的化療聯用、單獨使用或與骨髓移植、化療、類固醇和α-幹擾素聯用來治療多發性骨髓瘤。以此方式，本文所述拮抗性抗-CD40抗體或它們的抗原結合片段與至少一種其它癌症療法聯用，所述其它療法包括，但不限於放療、化療、α-幹擾素療法或類固醇療法，所述其它癌症療法在抗-CD40抗體療法之前、期間或之後給予。因此，當聯合治療包括聯合給予抗-CD40抗體或其抗原結合片段和另一種治療性藥物時，例如與放療、化療或用α-幹擾素和/或類固醇治療聯用，本發明的方法包括以分開的製劑或單一藥物製劑共同給予或以任一順序連續給予，其中優選兩種(或所有)活性物質在某時期內同時施加它們的治療活性。當本發明的方法包括聯合治療方案時，可同時進行這些治療，即抗-CD40抗體或其抗原結合片段同時給予或與其它治療相同的時間範圍內給予(即，同時進行治療，但抗-CD40抗體或其抗原結合片段不是在正好與其它療法相同的時間給予)。或者，本發明的抗-CD40抗體或其抗原結合片段也可在其它療法之前或之後給予。可順序給予不同的療劑而不論受治療的對象是否對第一療程起反應從而降低了病情緩解或復發的可能性。
在本發明的一些實施方案中，本文所述的抗-CD40抗體或其抗原結合片段與化療、任選與自體骨髓移植聯合給予，其中抗體和治療性藥物可以任一順序依次給予或同時給予(即，同時或在相同的時間範圍內給予)。合適的化療藥物包括，但不限於長春新鹼、BCNU、美法侖、環磷醯胺、阿黴素和潑尼松或地塞米松。
因此，例如在一個實施方案中，抗-CD40抗體與美法侖(一種烷化藥物)和類固醇潑尼松(稱為MP)聯合給予。或者，烷化藥物環磷醯胺和瘤可寧可替代美法侖與類固醇和本發明的抗-CD40抗體聯合給予。當對象對MP或其替代品無反應或對象在MP治療後復發時，本發明的抗-CD40抗體可與化療方案聯合給予，所述化療方案包括給予長春新鹼、阿黴素和高劑量的地塞米松(也稱為「VAD」)，還可包括共同給予環磷醯胺。在其它實施方案中，抗-CD40抗體可與具有抗血管生成性能的另一藥物，例如酞咪哌啶酮或α-幹擾素聯合給予。當對象對MP和/或VAD治療耐受時，後面的這些藥物可起作用。在另一個實施方案中，抗-CD40抗體可與蛋白酶體抑制劑，例如硼替佐米(VelcadeTM)聯合給予，其中後者給予應用上述兩種治療方案後復發的和對他們的最後治療方案耐受的對象。或者，抗-CD40抗體可與高劑量的化療聯合給予、單獨給予或與自體骨髓移植聯合給予對象。
本文所述的抗-CD40抗體還可用於提供試劑(regeant)，例如可用於例如鑑定表達CD40的細胞的標記的抗體。這在確定未知樣品的細胞類型時非常有用。可使用多組單克隆抗體來鑑定組織的種類和/或器官類型。這些抗-CD40抗體可以類似的方式用於篩選組織培養細胞中的汙染(即，篩選培養物中是否存在CD40表達細胞和非CD40表達細胞的混合物)。
藥物製劑和給藥方式本發明的拮抗性抗-CD40抗體的給藥濃度可在治療上有效預防或治療多發性骨髓瘤。為實現此目的，可用本領域已知的各種可接受的賦形劑配製此抗體。此抗體一般通過靜脈內或腹膜內注射給藥。實現此種給藥的方法是本領域普通技術人員已知的。也可能獲得可局部或口服給藥，或能透過黏膜輸送的組合物。
取決於所施用的抗-CD40抗體，靜脈內給藥優選通過輸液在約1-10小時期間進行，更優選約1-8小時，甚至更優選約2-7小時、還要優選約4-6小時。該藥物組合物的最初輸液可在約4-6小時期間進行，後續輸液可較快遞送。後續輸液可在約1-6小時期間，例如約1-4小時、約1-3小時或約1-2小時給予。
可將本發明的藥物組合物配製成與其要採用的給藥途徑相容。可能的給藥途徑的例子包括胃腸外(例如，靜脈內(IV)、肌肉內(IM)、真皮內、皮下(SC)或輸液)、口服和肺部(例如，吸入)、鼻、經皮(局部)、經黏膜和直腸給藥。用於胃腸外、真皮內或皮下應用的溶液或混懸液可含有以下組分無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、不易揮發的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌試劑，例如苄醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如維生素C或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用於調整張力的試劑，例如氯化鈉和葡萄糖。可用酸或鹼，例如鹽酸或氫氧化鈉調節pH。胃腸外製劑可包裝在玻璃或塑料製成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
抗-CD40抗體通常用標準技術以藥學上可接受的緩衝劑提供，例如無菌鹽水、無菌緩衝水、丙二醇、上述物質的組合等。納入本文作為參考的《雷明頓藥物科學》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(第18版；Mack PublishingCompany，Eaton，Pennsylvania，1990)描述了製備可胃腸外給予藥物的方法。也參見，例如描述了適用於本發明方法的穩定的抗體藥物製劑的WO98/56418。
本領域的普通技術人員不難確定待給予的至少一種抗-CD40抗體或其片段的量而無需過多實驗。影響給藥方式和至少一種拮抗性抗-CD40抗體(或其片段)的各自用量的因素包括，但不限於所治療的具體疾病、疾病的嚴重性、病史、所治療個體的年齡、身高、體重、健康和身體狀況。類似地，待給予的拮抗性抗-CD40抗體或其片段的用量取決於給藥方式和對象是接受單劑量還是多劑量的該抗腫瘤藥物。隨著所治療患者體重的增加，一般優選較高劑量的抗-CD40抗體或其片段。待給予的抗-CD40抗體或其片段的劑量為約0.003mg/kg-50mg/kg、優選0.01mg/kg-約40mg/kg。因此，例如劑量可以是0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg。
在本發明的另一個實施方案中，該方法包括給予多劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其片段。該方法可包括給予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多次治療有效劑量的含拮抗性抗-CD40抗體或其片段的藥物組合物。本領域技術人員不難確定多劑量的含拮抗性抗-CD40抗體或其片段的藥物組合物的給藥頻率和持續時間而無需過多的實驗。此外，用治療有效量的抗體治療對象包括單次治療，或優選可包括一系列治療。在一優選的實施例中，用拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段以約0.1-20mg/kg體重，每周一次治療約1-10周，優選約2-8周、更優選約3-7周、甚至更優選約4、5或6周。每年進行治療以防復發或根據復發跡象進行治療。也應理解，用於治療的抗體或其抗原結合片段的有效劑量在具體治療期間可增加或降低。根據本文所述診斷試驗的結果決定劑量的變化。因此，在一個實施方案中，給藥方案包括在治療期間的第1、7、14和21天先給予治療有效量的至少一種抗-CD40抗體或其片段。在另一個實施方案中，給藥方案包括在治療期間每周的第1、2、3、4、5、6和7天先給予治療有效量的至少一種抗-CD40抗體或其片段。其它實施方案包括在治療期間每周的第1、3、5和7天先給予治療有效量的至少一種抗-CD40抗體或其片段的給藥方案；包括在治療期間每周的第1和3天先給予治療有效量的至少一種抗-CD40抗體或其片段的給藥方案；和在治療期間每周的第1天先給予治療有效量的至少一種抗-CD40抗體或其片段的優選給藥方案。治療時期可包括1周、2周、3周、1個月、3個月、6個月或1年。治療時期可連續或相互隔開1天、1周、2周、1個月、3個月、6個月或1年。
在一些實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的治療有效劑量是約0.003mg/kg-50mg/kg、約0.01mg/kg-40mg/kg、約0.01mg/kg-30mg/kg、約0.1mg/kg-30mg/kg、約0.5mg/kg-30mg/kg、約1mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-25mg/kg、約3mg/kg-20mg/kg、約5mg/kg-15mg/kg或約7mg/kg-12mg/kg。因此，例如，任何一種拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段，如抗-CD40單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或它們的抗原結合片段的劑量可以是0.003mg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg或在約0.003mg/kg-50mg/kg範圍內的其它這種劑量。在整個抗體給藥的每周可給予相同治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段。或者，可在治療期間採用不同的治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，本文它處定義的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的最初治療有效劑量可在較低的劑量範圍(即，約0.003mg/kg-20mg/kg)內，後續的劑量可在較高的劑量範圍(即，約20mg/kg-50mg/kg)內。
在其它實施方案中，本文它處定義的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的最初治療有效劑量可在較高的劑量範圍(即，約20mg/kg-50mg/kg)內，後續劑量可在較低的劑量範圍(即，約0.003mg/kg-20mg/kg)內。因此，在一個實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的最初治療有效劑量是約20mg/kg-35mg/kg，包括約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg和約35mg/kg，隨後的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的治療有效劑量為約5mg/kg-15mg/kg，包括約5mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、12mg/kg和約15mg/kg。
在本發明的一些實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體治療先是給予需要拮抗性抗-CD40抗體治療的對象以「負荷劑量」的抗體或其抗原結合片段。「負荷劑量」指給予對象的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的初始劑量，其中給予的抗體或其抗原結合片段的劑量在較高的劑量範圍內(即，約20mg/kg-50mg/kg)。只要全部的「負荷劑量」在約24小時期間給予，該「負荷劑量」可以一次給藥，例如該抗體或其抗原結合片段經靜脈內一次輸液；或可以多次給藥，例如該抗體或其抗原結合片段經靜脈內多次輸液。給予「負荷劑量」後，可給予對象一次或多次額外治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段。隨後可按，例如每周給藥時間表、或每兩周一次、每三周一次或每四周一次給予治療有效劑量。在這種實施方案中，後續的治療有效劑量在較低的劑量範圍內(即，0.003mg/kg-約20mg/kg)。
或者，在一些實施方案中，給予「負荷劑量」後，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段按照「維持時間表」給予，其中治療有效劑量的抗體或其抗原結合片段按每月一次、每六周一次、每兩個月一次、每十周一次、每三個月一次、每十四周一次、每四個月一次、每十八周一次、每五個月一次、每二十二周一次、每六個月一次、每七個月一次、每八個月一次、每九個月一次、每十個月一次、每十一個月一次或每十二個月一次給藥。在這種實施方案中，特別是當隨後的劑量以更高頻率的間隔給藥，例如每兩個月一次到每月一次時，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的治療有效劑量在較低劑量範圍內(即，0.003mg/kg-約20mg/kg)；或者特別是當隨後的劑量以更低頻率的間隔給藥，例如約間隔一個月到約十二個月時，治療有效劑量在較高劑量範圍內(即，約20mg/kg-50mg/kg)。
用於本發明方法的本文所述藥物組合物中的拮抗性抗-CD40抗體可以是天然的或通過重組技術獲得，可以是任何來源的，包括哺乳動物來源，例如小鼠、大鼠、家兔、靈長類、豬和人。這種多肽優選得自人來源，更優選得自雜交瘤細胞系的重組人蛋白。
本發明方法所用的藥物組合物包含本發明的拮抗性抗-CD40抗體的生物活性變體。這種變體應該保留天然多肽的生物活性，從而使得當將包含變體多肽的藥物組合物給予對象時具有與包含天然多肽的藥物組合物相同的治療作用。即，該變體抗-CD40抗體可以類似於天然拮抗性抗體，例如分別由雜交瘤細胞系5.9或12.12表達的5.9或CHIR-12.12觀察到的作用方式作為藥物組合物中的治療活性組分。本領域已建立了可用於確定變體抗-CD40抗體是否保留了所需生物活性從而可用作藥物組合物中治療活性組分的方法。可採用為檢測天然拮抗性抗體活性而特別設計的試驗，包括本發明所述的試驗來測定抗體變體的生物活性。
任何包含具有本文所述結合特性的拮抗性抗-CD40抗體作為活性組分的藥物組合物可用於本發明的方法。因此，包含一種或多種本發明的拮抗性抗-CD40抗體的液體、凍幹或噴霧乾燥的組合物可根據本發明的方法製備用作隨後給予對象的水性或非水性溶液或混懸液。這些組合物中的每種包含至少一種本發明的拮抗性抗-CD40抗體作為治療或預防活性組分。「治療或預防活性組分」指特別引入該組合物中的抗-CD40抗體，當將該藥物組合物給予對象時，可產生治療、預防或診斷對象疾病或病症的所需治療性或預防性應答。該藥物組合物優選包含合適的穩定劑、填充劑，或同時包含二者以最大程度降低製備和儲存期間與蛋白質穩定性和生物活性喪失相關的問題。
可在包含本發明的拮抗性抗-CD40抗體的藥物組合物中加入一些製劑(formulant)。這些製劑包括，但不限於油、聚合物、維生素、碳水化合物、胺基酸、鹽、緩衝劑、白蛋白、表面活性劑或填充劑。碳水化合物優選包括糖或糖醇，例如單糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、支鏈澱粉、糊精、α和β環糊精、可溶性澱粉、羥乙基澱粉和羧甲基纖維素或它們的混合物。「糖醇」定義為具有羥基的C4-C8烴，包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨醇、甘油和阿拉伯糖醇。這些糖或糖醇可單獨或組合使用。糖或糖醇的濃度在1.0％和7％w/v之間，更優選在2.0％和6.0％w/v之間。優選的胺基酸包括左旋(L)形式的肉毒鹼、精氨酸和甜菜鹼；然而，也可加入其它胺基酸。優選的聚合物包括平均分子量為2,000和3,000之間的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或平均分子量為3,000和5,000之間的聚乙二醇(PEG)。可加入該製劑的表面活性劑見歐洲專利號270,799和268,110。
此外，可通過例如與聚合物共價偶聯來化學修飾抗體以增加它們的循環半衰期。優選的聚合物和連接肽的方法見全文納入本文作為參考的美國專利號4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546。優選的聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫可溶於水並如通式R(O--CH2--CH2)nO--R所示，其中R可以是氫或保護性基團，如烷基或烷醇基團。保護性基團優選具有1-8個碳原子，更優選是甲基。符號n是優選1-1,000之間，更優選2-500之間的正整數。PEG優選具有平均分子量1,000-40,000、更優選2,000-20,000、最優選3,000-12,000。PEG優選具有至少一個羥基、更優選是末端羥基。優選激活該羥基以和抑制劑上的游離氨基反應。然而，應理解可改變反應基團的類型和數量以獲得共價偶聯的PEG/本發明的抗體。
水溶性聚氧乙基化多元醇也可用於本發明。它們包括聚氧乙基化山梨醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油(POG)。優選POG。原因之一是聚氧乙基化甘油的骨架與例如動物和人的單、二、甘油三酯中天然存在的骨架相同。因此，該分支在體內不會被視作外來物質。POG的優選分子量與PEG的相同。POG的結構見Knauf等，(1988)，J.Bio.Chem.26315064-15070，美國專利號4,766,106描述了POG/IL-2偶聯物，兩篇文獻均全文納入本文作為參考。
另一種增加循環半衰期的藥物遞送系統是脂質體。製備脂質體遞送系統的方法見Gabizon等，(1982)，Cancer Research 424734；Cafiso(1981)，BiochemBiophys Acta 649129和Szoka(1980)，Ann.Rev.Bioplays.Eng.9467所述。本領域已知的其它藥物遞送系統描述見，例如Poznansky等，(1980)，《藥物遞送系統》(Drug Delivery Systems)，(R.L.Juliano編，Oxford，N.Y.)，第253-315頁；Poznansky，(1984)，Pharm Revs 36277。
引入藥物組合物中的製劑應使得拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段穩定。即，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段應保留其物理和/或化學穩定性並具有所需生物活性，即，一種或多種本文以上定義的拮抗活性，包括但不限於抑制T細胞刺激的正常人外周B細胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T細胞刺激的正常人外周B細胞存活和/或增殖；抑制CD40L表達細胞或可溶CD40配體(sCD40L)刺激的正常人外周B細胞存活和/或增殖；抑制sCD40L或固態CD40L刺激的任何細胞中「存活性」抗-凋亡胞內信號；抑制結合sCD40L或固態CD40L後任何細胞中的CD40信號轉導；和抑制本文它處所述人惡性B細胞的增殖。
監測蛋白質穩定性的方法是本領域熟知的。參見，例如Jones，(1993)Adv.Drug Delivery Rev.1029-90；Lee編，(1991)，《肽和蛋白質藥物遞送》(Peptide and Protein Drug Delivery)，(Marcel Dekker，Inc.，紐約，紐約)和本文公開的穩定性試驗。通常在所選擇的溫度下，測定蛋白質在一段特定時期內的穩定性。在優選的實施方案中，當在室溫(約25℃)儲存至少1個月、至少3個月、或至少6個月，和/或在約2-8℃儲存至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月時，穩定的抗體藥物製劑將使得拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段穩定。
當將某種蛋白質，例如抗體配製入藥物組合物時，如果在該藥物組合物中未出現沉澱、凝聚和/或變性的可見跡象(即，變色或澄清度喪失)或可測跡象(例如，採用體積排阻層析(SEC)或紫外光散射法)時，則可認為該蛋白質在給定時間點保留了其物理穩定性。就化學穩定性而言，當將某種蛋白質，例如抗體配製入藥物組合物時，如果化學穩定性的測定顯示該蛋白質(即，抗體)在該藥物組合物中保留了其感興趣的生物活性，則可認為該蛋白質保留了其化學穩定性。測定化學穩定性變化的方法是本領域熟知的，包括但不限於用例如SDS-PAGE、SEC和/或襯質輔助雷射解析與電離-飛行時間質譜檢測因剪切所致蛋白質的化學改變形式的方法；和用例如離子交換色譜檢測與分子荷電改變相關(例如，與脫氨基相關)的降解的方法。參見，例如下文所述的方法。
當將拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段配製入藥物組合物時，如果在給定時間的所需生物活性處於該藥物組合物製備之時用所需生物活性的合適試驗檢測到的所需生物活性的約30％以內，優選約20％以內，則可認為所述拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段在該時間點保留了所需生物活性。檢測拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的所需生物活性的試驗可如本文的實施例所述進行。也參見納入本文作為參考的以下文獻所述的試驗Schutze等，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928200-8204；Denton等，(1998)，PediatrTransplant.26-15；Evans等，(2000)，J.Immunol.164688-697；Noelle，(1998)，Agents Actions Suppl.4917-22；Lederman等，(1996)，CurrOpin.Hematol.377-86；Coligan等，(1991)，Current Protocols in Immunology1312；Kwekkeboom等，(1993)Immunology 79439-444；和美國專利號5,674,492和5,847,082。
在本發明的一些實施方案中，將拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段配製入液體藥物製劑中。拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段可用本領域已知的任何方法，包括上文公開的方法製備。在一個實施方案中，拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段在CHO細胞系中重組產生。
拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段製備和純化後可以本文所述方式配製為液體藥物製劑。當拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段在配製前要保存時，可在，例如≤-20℃冷凍，然後於室溫融化作進一步配製。該液體藥物製劑含有治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段。該製劑中的抗體或其抗原結合片段的用量要考慮給藥途徑和所需劑量體積。
在此方式中，該液體藥物組合物包含以下濃度的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結合片段約0.1mg/ml-50.0mg/ml、約0.5mg/ml-40.0mg/ml、約1.0mg/ml-30.0mg/ml、約5.0mg/ml-25.0mg/ml、約5.0mg/ml-20.0mg/ml或約15.0mg/ml-25.0mg/ml。在一些實施方案中，該液體藥物組合物包含以下濃度的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段約0.1mg/ml-5.0mg/ml、約5.0mg/ml-10.0mg/ml、約10.0mg/ml-15.0mg/ml、約15.0mg/ml-20.0mg/ml、約20.0mg/ml-25.0mg/ml、約25.0mg/ml-30.0mg/ml、約30.0mg/ml-35.0mg/ml、約35.0mg/ml-40.0mg/ml、約40.0mg/ml-45.0mg/ml或約45.0mg/ml-50.0mg/ml。在其它實施方案中，該液體藥物組合物包含以下濃度的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段約15.0mg/ml、約16.0mg/ml、約17.0mg/ml、約18.0mg/ml、約19.0mg/ml、約20.0mg/ml、約21.0mg/ml、約22.0mg/ml、約23.0mg/ml、約24.0mg/ml或約25.0mg/ml。該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結合片段和維持該製劑的pH於約pH5.0-pH 7.0的緩衝劑，所述pH包括約pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0和約pH 5.0-pH 7.0範圍內的其它這種數值。在一些實施方案中，緩衝劑可維持製劑的pH於約pH 5.0-pH 6.5、約pH 5.0-pH 6.0、約pH 5.0-pH 5.5、約pH 5.5-7.0、約pH 5.5-pH 6.5或約pH 5.5-pH 6.0的範圍。
可在該製劑中採用維持液體抗-CD40抗體製劑的pH約pH 5.0-pH 7.0範圍的任何合適緩衝劑，只要所述抗體保留上述理化穩定性和所需生物活性。合成的緩衝劑包括，但不限於常規的酸及它們的鹽，其中反荷離子可以是，例如鈉、鉀、銨、鈣或鎂。用於緩衝該液體藥物製劑的常規酸及它們的鹽的例子包括，但不限於琥珀酸或琥珀酸鹽、檸檬酸或檸檬酸鹽、乙酸或乙酸鹽、酒石酸或酒石酸鹽、磷酸或磷酸鹽、葡糖酸或葡糖酸鹽、穀氨酸或穀氨酸鹽、天冬氨酸或天冬氨酸鹽、馬來酸或馬來酸鹽和蘋果酸或蘋果酸鹽。該製劑中緩衝劑的濃度可以是約1mM-50mM，包括約1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或在約1mM-50mM範圍內的其它這種數值。在一些實施方案中，該製劑中緩衝劑的濃度可以是約5mM-15mM，包括約5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM或在約5mM-15mM範圍內的其它這種數值。
在本發明的一些實施方案中，該液體藥物製劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段和琥珀酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑，所述緩衝劑的濃度可維持該製劑的pH於約pH 5.0-pH 7.0、優選約pH 5.0-pH 6.5。「琥珀酸鹽緩衝劑」或「檸檬酸鹽緩衝劑」指分別含有琥珀酸鹽或檸檬酸鹽的緩衝劑。在一優選的實施方案中，琥珀酸鹽或檸檬酸鹽反荷離子分別是鈉陽離子，因此該緩衝劑分別是琥珀酸鈉或檸檬酸鈉。然而，預計任何陽離子均有效。其它可能的琥珀酸鹽或檸檬酸鹽陽離子包括，但不限於鉀、銨、鈣和鎂。如上所述，該製劑中琥珀酸鹽和檸檬酸鹽緩衝劑的濃度可以是約1mM-50mM，包括約1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或在約1mM-50mM範圍內的其它這種數值。在一些實施方案中，該製劑中緩衝劑的濃度可以是約5mM-15mM，包括約5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或約15mM。在其它實施方案中，液體藥物組合物包含濃度為約0.1mg/ml-50.0mg/ml或約5.0mg/ml-25.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段；和濃度為約1mM-20mM、約5mM-15mM，優選約10mM的琥珀酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑，例如琥珀酸鈉或檸檬酸鈉緩衝劑。
該液體藥物製劑接近等滲是理想的，該液體藥物製劑除了包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段和維持製劑的pH於約pH 5.0-pH 7.0內的緩衝劑外，還可包含其量足以使得該製劑接近等滲的等滲劑。「接近等滲」指水性製劑具有以下重量克分子的滲透濃度約240mmol/kg-360mmol/kg、優選約240-340mmol/kg、更優選約250-330mmol/kg、再要優選約260-320mmol/kg、還要優選約270-310mmol/kg。確定溶液等滲性的方法是本領域技術人員已知的。參見，例如Setnikar等，(1959)，J.Am.Pharm.Assoc.48628。
本領域的技術人員熟悉用於提供藥物組合物等滲性的各種藥學上可接受的溶質。等滲劑可以是能將本發明液體藥物製劑的滲透壓調節至與體液的滲透壓接近等值的任何試劑。使用生理上可接受的等滲劑是理想的。因此，該液體藥物製劑除了包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段和維持製劑的pH於約pH 5.0-pH7.0內的緩衝劑外，還可包含用於提供等滲性的組分，例如氯化鈉；胺基酸，如丙氨酸、纈氨酸和甘氨酸；糖和糖醇(多元醇)包括，但不限於葡萄糖、右旋糖、果糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖、甘油、山梨醇和木糖醇；乙酸，其它有機酸或它們的鹽，和用量相對較少的檸檬酸鹽或磷酸鹽。普通技術人員知道適合提供該液體製劑最佳等滲性的其它試劑。
在一些優選的實施方案中，該液體藥物製劑除了包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段和維持製劑的pH於約pH 5.0-pH 7.0內的緩衝劑外，還可包含作為等滲劑的氯化鈉。製劑中氯化鈉的濃度取決於其它組分對張力的作用。在一些實施方案中，氯化鈉的濃度是約50mM-300mM、約50mM-250mM、約50mM-200mM、約50mM-175mM、約50mM-150mM、約75mM-175mM、約75mM-150mM、約100mM-175mM、約100mM-200mM、約100mM-150mM、約125mM-175mM、約125mM-150mM、約130mM-170mM、約130mM-160mM、約135mM-155mM、約140mM-155mM或約145mM-155mM。在一個這樣的實施方案中，氯化鈉的濃度是約150mM。在其它這樣的實施方案中，氯化鈉的濃度是約150mM，緩衝劑是濃度為約5mM-15mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉緩衝劑，該液體藥物製劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段，該製劑的pH為約pH 5.0-pH 7.0、約pH 5.0-pH 6.0或約pH 5.5-pH 6.5。在其它實施方案中，該液體藥物製劑包含濃度為約0.1mg/ml-50.0mg/ml或約5.0mg/ml-25.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段，約150mM的氯化鈉和約10mM的琥珀酸或檸檬酸鈉，pH為約pH 5.5。
可在製劑中加入表面活性劑以降低溶液-空氣界面的表面張力而抑制本發明液體藥物製劑在加工過程中由於凍融或機械剪切力所導致的蛋白質降解。因此，在一些實施方案中，該液體藥物製劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段，維持製劑的pH於約pH 5.0-pH 7.0內的緩衝劑，還包含表面活性劑。在其它實施方案中，該液體藥物製劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段，維持製劑的pH於約pH 5.0-pH 7.0內的緩衝劑，等滲劑，例如濃度為約50mM-300mM的氯化鈉，還包含表面活性劑。
採用的典型表面活性劑是非離子型表面活性劑，包括聚氧乙烯山梨醇酯，例如聚山梨酸酯80(吐溫80)和聚山梨酸酯20(吐溫20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯，例如Pluronic F68；聚氧乙烯醇，例如Brij 35；二甲矽油；聚乙二醇，例如PEG400；溶血磷脂醯膽鹼；和聚氧乙烯-對-叔-辛酚，例如TritonX-100。表面活性劑或乳化劑經典藥物穩定作用的描述見，例如納入本文作為參考的Levine等，(1991)，J.Parenteral Sci.Technol.45(3)160-165。用於實施本發明的優選表面活性劑是聚山梨酸酯80。當製劑中包含表面活性劑時，一般按以下量加入約0.001％-1.0％(w/v)、約0.001％-0.5％、0.001％-0.4％、約0.001％-0.3％、約0.001％-0.2％、約0.005％-0.5％、約0.005％-0.2％、約0.01％-0.5％、約0.01％-0.2％、約0.03％-0.5％、約0.03％-0.3％、約0.05％-0.5％或約0.05％-0.2％。
因此，在一些實施方案中，該液體藥物製劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段；緩衝劑是濃度為約1mM-50mM、約5mM-25mM或約5mM-15mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉緩衝劑；製劑的pH為約pH 5.0-pH 7.0、約pH 5.0-pH 6.0或約pH 5.5-pH 6.5；該製劑還包含用量為約0.001％-1.0％或約0.001％-0.5％的表面活性劑，例如聚山梨酸酯80。這種製劑任選可包含等滲劑，例如濃度為約50mM-300mM、約50mM-200mM或約50mM-150mM的氯化鈉。在其它實施方案中，該液體藥物製劑包含濃度為約0.1mg/ml-50.0mg/ml或約5.0mg/ml-25.0mg/ml，包括約20.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結合片段；約50mM-200mM的氯化鈉；約5mM-20mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉，包括約10mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉；濃度為約50mM-200mM的氯化鈉；和任選的用量為約0.001％-1.0％，包括約0.001％-0.5％的表面活性劑，例如聚山梨酸酯80；其中液體藥物製劑的pH為約pH 5.0-pH 7.0、約pH 5.0-pH 6.0、約pH5.0-pH 5.5、約pH 5.5-pH 6.5或約pH5.5-pH 6.0。
該液體藥物製劑可基本上不含任何防腐劑和其它載體、賦形劑或本文上述的穩定劑。或者，該製劑可包含一種或多種防腐劑，例如抗細菌劑，藥學上可接受的載體、賦形劑或本文上述的穩定劑，前提是它們對拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的理化穩定性無不利影響。可接受的載體、賦形劑和穩定劑的例子包括，但不限於加入的緩衝試劑，助溶劑，表面活性劑，抗氧化劑，包括維生素C和甲硫氨酸，螯合劑，例如EDTA、金屬複合物(例如，Zn-蛋白質複合物)和生物可降解的聚合物，例如聚酯。關於製劑和選擇藥學上可接受的載體、穩定劑和等滲劑(isomolytes)的詳盡討論見納入本文作為參考的《雷明頓藥物科學》(Remington′s PharmaceuticalSciences)，(第18版；Mack Publishing Company，Eaton，Pennsylvania，1990)。
可凍幹本文所述的液體藥物製劑或其它藥物組合物製備後以防降解。凍幹液體組合物的方法是本領域普通技術人員已知的。使用前，組合物可用含有其它成分的無菌稀釋劑(例如林格溶液、蒸餾水或無菌鹽水)重建。重建後，組合物優選用本領域的技術人員已知的方法給藥。
拮抗性抗-CD40抗體在生產藥物中的應用本發明也提供拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段在生產治療CLL對象的藥物中的應用，其中所述藥物與至少一種其它癌症療法合作起作用。「合作」指所述藥物在用至少一種其它癌症療法治療對象之前、期間或之後使用。其它癌症療法的例子包括，但不限於手術；放療；化療，任選與自體骨髓移植組合，其中合適的化療藥物包括，但不限於氟達拉濱或鹽酸氟達拉濱、瘤可寧、長春新鹼、噴司他丁、2-氯脫氧腺苷(cladribine)、環磷醯胺、阿黴素、潑尼松和它們的組合，例如含有蒽環類的方案，如CAP(環磷醯胺、阿黴素加潑尼松)、CHOP(環磷醯胺、長春新鹼、潑尼松加阿黴素)、VAD(長春新鹼、阿黴素加地塞米松)、MP(美法侖加潑尼松)，和用於化療的其它細胞毒性和/或治療性藥物，如米託蒽醌、道諾紅菌素、依達比星、天冬醯胺酶和抗代謝物，包括但不限於阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪、6-硫代鳥嘌呤、6-巰基嘌呤和奈拉濱；其它抗癌症單克隆抗體療法(例如，阿來組單抗(alemtuzumab)(Campath_)或其它靶向惡性B細胞上CD52細胞表面糖蛋白的抗-CD52抗體；利妥昔單抗(rituximab)(Rituxan_)、完整的人抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、託西莫單抗(tositumomab)/I-131託西莫單抗(Bexxar_)、替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)(Zevalin_)或任何其它靶向惡性B細胞上CD20抗原的治療性抗-CD20抗體；抗-CD19抗體(例如，MT103，雙特異性抗體)；抗-CD22抗體(例如，人源化單克隆抗體epratuzumab)；貝伐單抗(bevacizumab)(Avastinu_)或其它靶向人血管內皮細胞生長因子的抗癌症抗體；靶向惡性B細胞上CD22抗原的抗-CD22抗體(例如，單克隆抗體BL-22，αCD22毒素)；靶向巨噬細胞集落刺激因子的α-M-CSF抗體；靶向多發性骨髓瘤中過度表達的核因子-κB(RANK)及其配體(RANKL)的受體激活劑的抗體；靶向惡性B細胞上CD23抗原的抗-CD23抗體(例如，IDEC-152)；靶向惡性B細胞上CD38抗原的抗-CD38抗體；靶向表達於惡性B細胞上主要組織相容性複合體II類受體的抗體(抗-MHC抗體)；其它靶向惡性B細胞上CD40抗原的抗-CD40抗體(例如，SGN-40)；和靶向表達於許多實體腫瘤和造血來源的腫瘤上腫瘤壞死因子相關促凋亡配體受體1(TRAIL-R1)的抗體(例如，激動性人單克隆抗體HGS-ETR1))；基於小分子的癌症療法，所述小分子包括但不限於微管和/或拓撲異構酶抑制劑(例如，有絲分裂抑制劑多拉斯他汀(dolastatin)和其類似物；微管蛋白結合藥物T900607；XL119；和拓撲異構酶抑制劑氨基喜樹鹼)、SDX-105(鹽酸苯達莫司汀)、ixabepilone(埃坡黴素(epothilone)類似物，也稱為BMS-247550)、蛋白激酶C抑制劑，例如米哚妥林((PKC-412、CGP41251、N-苯甲醯基十字孢鹼)、pixantrone、奧沙利鉑(一種抗腫瘤藥物)、硝酸鎵(硝酸鎵)、Thalomide_(酞咪哌啶酮)、酞咪哌啶酮的免疫調節衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白質激酶C-α的反義抑制劑)、SDX-101(誘導惡性淋巴細胞凋亡的R-依託度酸)、第二代嘌呤核苷類似物，如氯法拉濱、癌細胞產生蛋白質Bcl-2的抑制劑(例如，反義藥物奧利默森和Genasense_)、蛋白酶體抑制劑(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制劑(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制劑(例如，ZD-6474)、熱激蛋白(HSP)90的小分子抑制劑(例如，17-AAG)、組蛋白脫乙醯酶的小分子抑制劑(例如，雜交/極性細胞分化HPC)藥物，如N-辛二醯苯異羥肟酸(SAHA)、和FR-901228)和凋亡藥物，如Trisenox_(三氧化砷)和Xcytrin_(莫特沙芬釓)；基於疫苗/免疫治療的癌症療法，包括但不限於疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、個性化的免疫療法或活性獨特型免疫療法(例如，MyVax_Personalized Immunothcrapy，以前命名為GTOP-99)、Promues_(CpG 7909，一種toll-樣受體9(TLR9)的合成激動劑)、幹擾素-α療法、白介素-2(IL-2)療法、IL-12療法、IL-15療法和IL-21療法；類固醇療法；或其它癌症療法；其中用其它癌症療法治療可在用包含上述拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的藥物治療對象之前、期間或之後給予。
因此，例如在一些實施方案中，本發明提供了單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結合片段在生產治療對象的多發性骨髓瘤的藥物中的應用，所述藥物與化療治療合作起作用，所述化療藥物選自長春新鹼、阿黴素、BCNU、美法侖、環磷醯胺、阿黴素和潑尼松或地塞米松。在一個實施方案中，化療是美法侖加潑尼松；在其它實施方案中，化療是VAD(長春新鹼、阿黴素加地塞米松)。
在其它實施方案中，本發明提供了單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結合片段在生產治療對象的多發性骨髓瘤的藥物中的應用，所述藥物與用至少一種選自以下的其它抗癌症抗體的治療合作起作用完整的人抗體HuMax-CD20、靶向巨噬細胞集落刺激因子的α-M-CSF抗體；靶向多發性骨髓瘤中過度表達的核因子-κB(RANK)及其配體(RANKL)的受體激活劑的抗體；靶向惡性B細胞上CD38抗原的抗-CD38抗體；靶向表達於惡性B細胞上的主要組織相容性複合體II類受體的抗體(抗-MHC抗體)；其它靶向惡性B細胞上CD40抗原的抗-CD40抗體(例如，SGN-40)；靶向表達於許多造血來源的腫瘤上的腫瘤壞死因子相關促凋亡配體受體1(TRAIL-R1)(例如，激動性人單克隆抗體HGS-ETR1)和TRAIL-R2的抗體；和它們的任何組合；其中所述藥物在用其它癌症療法治療對象之前、期間或之後使用；或者就多次組合治療而言，可在用其它癌症療法治療對象之前、期間或之後使用。
在還有其它實施方案中，本發明提供了單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結合片段在生產治療對象的多發性骨髓瘤的藥物中的應用，所述藥物與用至少一種基於選自以下的小分子的癌症療法的治療合作起作用Thalomide_(酞咪哌啶酮)、酞咪哌啶酮的免疫調節衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、蛋白酶體抑制劑(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制劑(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制劑(例如，ZD-6474)、熱激蛋白(HSP)90的小分子抑制劑(例如，17-AAG)、組蛋白脫乙醯酶的小分子抑制劑(例如，雜交/極性細胞分化HPC)藥物，如N-辛二醯苯異羥肟酸(SAHA)、和FR-901228)和凋亡藥物，如Trisenox_(三氧化砷)；和它們的任何組合；其中所述藥物在用其它癌症療法治療對象之前、期間或之後使用；或者就多次組合治療而言，可在用其它癌症療法治療對象之前、期間或之後使用。
本發明也提供拮抗性抗-CD40抗體，例如本文公開的單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結合片段在生產治療對象的多發性骨髓瘤的藥物中的應用，其中所述藥物可用於已預先採用至少一種其它癌症療法治療過的對象。「預先治療過」或「預先治療」指在接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的藥物之前，對象已接受一種或多種其它癌症療法(即，已用至少一種其它癌症療法治療過)。「預先治療過」或「預先治療」包括在用包含拮抗性抗-CD40抗體，例如本文公開的單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結合片段的藥物治療開始前的以下時間內曾採用至少一種其它癌症療法治療過的對象2年、18個月、1年、6個月、2個月、6周、1個月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或甚至1天。對象無需對先前一種或多種癌症療法產生反應。因此，接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的藥物的對象可以對先前癌症療法或一種或多種先前癌症療法(當預先治療由多種療法組成時)產生反應或不產生反應(即，癌症難控制)。對象在接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結合片段的藥物之前可接受的其它癌症療法的例子包括，但不限於手術；放療；化療，任選與自體骨髓移植組合，其中合適的化療藥物包括，但不限於上文所列的藥物；其它抗癌症單克隆抗體療法，包括但不限於上文所列的抗癌症抗體；基於小分子的癌症療法，包括但不限於上文所列的小分子；基於疫苗/免疫治療的癌症療法，包括但不限於上文所列的；類固醇療法；其它癌症療法；或它們的任何組合。
本文將合作使用本文所述的藥物和一種或多種本文定義的其它癌症療法的「治療」定義為將所述藥物或其它癌症療法應用於或給予對象，或將所述藥物或其它癌症療法應用於或給予對象的分離的組織或細胞系，所述對象患有多發性骨髓瘤、具有這種癌症相關的症狀，或患這種癌症的易感性，給藥的目的是為治癒、治療、緩解、減輕、改變、補救、改善、提高或影響癌症、癌症相關症狀、或發生癌症的易感性。
提供以下實施例是為了說明，絕非限制。
實驗導言用於以下實施例的拮抗性抗-CD40抗體是5.9和CHIR-12.12。5.9和CHIR-12.12抗-CD40抗體是通過免疫攜帶人IgG1重鏈基因座和人K輕鏈基因座的轉基因小鼠(XenoMouse_technology(Abgenix；Fremont，California))產生的人IgG1亞型抗-人CD40單克隆抗體(mAb)。表達CD40胞外結構域的SF9昆蟲細胞用作免疫原。
簡言之，如先前de Boer等，(1988)，J.Immunol.Meth.113143所述，用50％聚乙二醇使免疫小鼠的脾細胞與SP2/0或P3×63Ag8.653鼠骨髓瘤細胞以10∶1的比例融合。將融合細胞重懸於添加了次黃嘌呤(0.1mM)、氨基喋呤(0.01mM)、胸苷(0.016mM)和0.5ng/ml hIL-6(Genzyme，Cambridge，Massachusetts)的完全IMDM培養基中。然後將融合細胞分置於96-孔組織培養板的孔中，平均每孔含有一個生長中的雜交瘤(細胞)。
10-14天後，篩選雜交瘤細胞群的上清液看其有無特異性抗體產生。為篩選雜交瘤克隆產生的特異性抗體，合併各孔上清液並先用ELISA檢測抗-CD40特異性活性。然後將陽性(雜交瘤細胞)用標準FACS試驗作EBV-轉化B細胞的螢光細胞染色。通過用含有0.5ng/ml hIL-6的IMDM/FBS作有限稀釋克隆陽性雜交瘤細胞兩次。
總共31個小鼠脾(細胞)與小鼠骨髓瘤SP2/0細胞融合得到895個在ELISA中能識別重組CD40的抗體。使用Abgenix XenoMouse_技術(Abgenix；Fremont，California))產生的雜交瘤細胞平均約10％含有小鼠λ輕鏈替代了人κ鏈。選出含有小鼠輕λ鏈的抗體。選出同樣顯示能與細胞表面CD40結合的260個抗體亞組用於進一步分析。將在一系列亞克隆過程中選出的穩定雜交瘤細胞用於結合和功能試驗作進一步鑑定。該選擇方法的進一步細節，可分別參見2003年11月4日，2003年11月26日和2004年4月27日提交的名為「拮抗性抗-CD40單克隆抗體及它們的用法」的待批臨時申請，和轉讓的美國專利申請號60/517,337(代理人審理號PP20107.001(035784/258442))，60/525,579(代理人審理號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人審理號PP20107.003(035784/277214))，它們的內容均納入本文作為參考。
7個其它雜交瘤的克隆經鑑定具有拮抗活性。根據它們的相對拮抗能力和ADCC活性，選出兩個雜交瘤細胞克隆作進一步評價(下表1)。它們命名為131.2F8.5.9(5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(12.12)。
表1.抗-CD40IgG1抗體5.9和CHIR-12.12的最初一組數據小結
小鼠雜交瘤細胞系131.2F8.5.9(CMCC#；12047)和雜交瘤細胞系153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC#；12056)由美國模式培養物保藏所(ATCC；10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209(USA))分別以專利保藏號PTA-5542和PTA-5543保藏。
將編碼該候選抗體可變區的cDNA經PCR擴增、克隆和測序。CHIR-12.12抗體輕鏈和重鏈的胺基酸序列分別示於圖1A和1B。也參見SEQ ID NO2(mAb CHIR-12.12的輕鏈)和SEQ ID NO4(mAb CHIR-12.12的重鏈)。mAb CHIR-12.12重鏈的變體示於圖1B(也參見SEQ ID NO5)，其與SEQ ID NO4的區別在於SEQ ID NO4的153位用絲氨酸殘基取代了丙氨酸殘基。編碼CHIR-12.12抗體的輕鏈和重鏈的核苷酸序列分別示於圖2A和2B。也參見SEQ ID NO1(mAb CHIR-12.12輕鏈的編碼序列)和SEQID NO3(mAb CHIR-12.12重鏈的編碼序列)。5.9抗體輕鏈和重鏈的胺基酸序列分別示於圖3A和3B。也參見SEQ ID NO6(mAb CHIR-5.9的輕鏈)和SEQ ID NO7(mAb CHIR-5.9的重鏈)。mAb 5.9重鏈的變體示於圖3B(也參見SEQ ID NO8)，其與SEQ ID NO7的區別在於在SEQ ID NO7的158位用絲氨酸殘基取代了丙氨酸殘基。
得自獨立雜交瘤的抗體如預計的那樣在互補決定區(CDR)的核苷酸序列中有本質的改變。據信，VH的CDR3區中的多樣性對決定抗體特異性最重要。
如FACS分析所示，5.9和CHIR-12.12能特異性結合人CD40並阻止CD40-配體結合。這兩種mAb均能競爭去除預先和細胞表面CD40結合的CD40-配體。5.9與人CD40的結合親和力是1.2×10-8M，CHIR-12.12與人CD40的結合親和力是5×10-10M。
CHIR-12.12和5.9單克隆抗體是強拮抗劑，在體外能抑制CD40配體-介導的正常B細胞增殖以及在體外抑制CD40配體-介導的NHL和CLL患者的癌細胞增殖。在體外，兩種抗體通過ADCC殺傷NHL患者的初級(primary)癌細胞。在異種移植人淋巴瘤模型中觀察到劑量依賴的抗腫瘤活性。對這些結果和獲得這些結果所用試驗的更詳細描述可分別參見2003年11月4日，2003年11月26日和2004年4月27日提交的名為「拮抗性抗-CD40單克隆抗體及它們的用法」的待批臨時申請，和轉讓的美國專利申請號60/517,337(代理人審理號PP20107.001(035784/258442))，60/525,579(代理人審理號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人審理號PP20107.003(035784/277214))，它們的內容均全文納入本文作為參考。
進行了一些研究來確定拮抗性抗-CD40mAb 5.9和CHIR-12.12是否顯示以下性能(1)與多發性骨髓瘤患者細胞結合(採用流式細胞術測定)；(2)通過阻斷CD40-配體誘導的存活信號促進多發性骨髓瘤患者細胞的細胞死亡；(3)自身對多發性骨髓瘤(MM)細胞具有刺激/抑制活性；和/或(4)介導ADCC作為一種作用方式。
實施例1mAb 5.9和CHIR-12.12與MM患者的CD40+多發性骨髓瘤(MM)細胞結合FITC標記的抗-CD40 mAb 5.9和CHIR-12.12與對照FITC-標記的人IgG1作多發性骨髓瘤(MM)細胞染色。得自8位患者的CD40+MM細胞與FITC-標記的抗-CD40 mAb 5.9或CHIR-12.12或FITC-標記的人IgG1孵育。用FACSCAN V(Becton Dickinson，San Jose，California)進行流式細胞術分析。
實施例2抗-CD40 mAb 5.9和CHIR-12.12阻斷多發性骨髓瘤(MM)細胞中CD40配體-介導的存活信號得自8位患者的多發性骨髓瘤細胞在以下條件下獨立地與拮抗性抗-CD40 mAb 5.9或CHIR-12.12和對照人IgG1培養
72小時後按照以下步驟分析培養物·通過PI和Annexine V染色計數存活的細胞並測定細胞死亡·用氚化的胸苷脈衝過夜來測定增殖實施例3評價抗-CD40mAb對多發性骨髓瘤(MM)細胞的刺激/抑制活性8位患者的多發性骨髓瘤細胞在存在抗-CD40 mAb CHIR-12.12或5.9時，使用IgG作為對照，按以下條件培養
72小時後按照以下步驟分析培養物·通過PI和Annexine V染色計數存活細胞並測定細胞死亡·用氚化的胸苷脈衝過夜來測定增殖實施例4抗-CD40 mAb CHIR-12.12和5.9通過抗體依賴的細胞毒性(ADCC)裂解患者的多發性骨髓瘤(MM)細胞的能力8位患者的多發性骨髓瘤細胞在以下條件下獨立地與拮抗性抗-CD40mAb 5.9或CHIR-12.12和對照人IgG1培養
4小時後，通過檢測釋放的51Cr或螢光染料的水平計算特異性細胞裂解。
實施例5與15B8相比，5.9和CHIR-12.12和CD40上的不同表位結合候選單克隆抗體5.9和CHIR-12.12能互相競爭與CD40的結合，但不與15B8，一種IgG2抗-CD40 mAb(參見國際公布號WO02/28904)競爭。利用CM5生物傳感器晶片設計了使用Biacore的抗體競爭結合試驗，所述晶片含有經氨基偶聯而固定的蛋白質A用於捕捉抗-CD40、CHIR-12.12或15B8。用不同濃度的CD40-his觀察到正常的締合/解離結合曲線(數據未顯示)。就競爭研究而言，CHIR-12.12或15B8均被捕捉於蛋白質A表面。然後使不同濃度的CD40-his/5.9 Fab複合物(100nM CD401μM 5.9Fab)流過該修飾的表面。就CHIR-12.12而言，未觀察到複合物的締合，表明5.9阻斷了CHIR-12.12與CD40-his的結合。就15B8而言，觀察到Fab 5.9複合物的締合，表明5.9不阻斷15B8與CD40結合位點的結合。然而，該複合物的解離速率(off rate)顯著增加(數據未顯示)。
也證明了15B8和CHIR-12.12不競爭與CD40-his結合。該實驗步驟如下用蛋白質A生物傳感器晶片捕捉CHIR-12.12、用對照IgG1封閉殘留的蛋白質A位點、結合CD40-his然後使15B8流過該修飾的表面。15B8在這些條件下確實有結合，表明CHIR-12.12不阻斷15B8與CD40的結合。
實施例6CHIR-12.12和5.9mAb的結合性能將蛋白質A經氨基偶聯而固定於CM5生物傳感器晶片上。將1.5μg/ml的人抗-CD40單克隆抗體在1.5分鐘內以10μl/分鐘(流過)被捕捉在此修飾的生物傳感器表面上。使不同濃度的重組可溶性CD40-his流過該生物傳感器表面。用0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性劑P20(HBS-EP)稀釋抗體和抗原。用Biaevaluation軟體以1∶1相互作用模型/球形擬合(global fit)測定動力學和親和力常數。
如下表2所示，5.9和CHIR-12.12的解離速率有121倍差異，這導致CHIR-12.12的親和力高24倍。
實施例7單克隆抗體CHIR-12.12和5.9表位的鑑定為確定單克隆抗體CHIR-12.12和5.9識別的CD40表位的位置，進行了SDS-PAGE和Western印跡分析。在還原和非還原條件下在4-12％NUPAGE凝膠上分離純化的CD40(0.5μg)，轉移至PVDF膜上用10μg/ml濃度的單克隆抗體檢測。印跡以鹼性磷酸酶偶聯的抗-人IgG檢測並用鹼性磷酸酶的Western BlueR穩定底物(Promega)顯色。
結果表明抗-CD40單克隆抗體CHIR-12.12同時識別非還原和還原形式CD40上的表位，與非還原形式的CD40結合的強度顯著高於還原形式的CD40(表3；印跡未顯示)。兩種形式的CD40的識別均是陽性表明該抗體能與部分是線性序列的構象表位相互作用。單克隆抗體5.9主要識別非還原形式的CD40，提示該抗體主要與構象表位相互作用(表3；印跡未顯示)。
表3.結構域鑑定
為勘察CD40上的抗原性區域，克隆了CD40的4個胞外結構域並在昆蟲細胞中表達為GST融合蛋白。GP67分泌信號肽保證了這四個結構域的分泌。昆蟲細胞上清液經SDS-PAGE和Western印跡來鑑定到含有表位的結構域。
單克隆抗體CHIR-12.12能在還原和非還原條件下識別結構域2上的一個表位(表4；印跡未顯示)。相反，單克隆抗體5.9顯示對結構域2的識別非常微弱(表4；印跡未顯示)。在該項分析中，這些抗體均不識別結構域1、3或4。
表4.結構域2分析
為精確地確定mAb CHIR-12.12所識別的表位，合成了對應於以下序列的CD40的胞外結構域2的肽PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT(SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示序列的殘基61-104)。製備了含有35個10mer肽和1-胺基酸旁支(offset)的SPOT膜(Sigma)。用mAb CHIR-12.12和抗-人IgGβ-半乳糖苷酶作為二抗進行Western印跡分析。剝下印跡用mAb 5.9再檢測來確定該抗體識別的區域。
用10μg/ml的抗-CD40單克隆抗體CHIR-12.12檢測作SPOT分析，點18-22得到陽性反應。這些肽覆蓋區域的序列示於表5。
表5.用抗-CD40單克隆抗體CHIR-12.12檢測作SPOT分析的結果
這些結果對應於線性表位YCDPNL(SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示序列的殘基82-87)。該表位含有預計參與CD40-CD40配體相互作用的Y82、D84和N86。
用mAb 5.9作SPOT分析顯示，其對表6所示點20-22代表的肽識別弱，提示區域YCDPNLGL(SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示序列的殘基82-89)參與了mAb 5.9與CD40的結合。應注意的是，在BIACORE分析中mAbs CHIR-12.12和5.9可相互競爭與CD40的結合。
表6.用抗-CD40單克隆抗體5.9檢測的SPOT的結果
SPOT分析鑑定到的線性表位位於CD40 B1模塊中。CD40 B1模塊的該序列是HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC(SEQ ID NO10或12的殘基80-103)。
在此線性表位中CHIR-12.12鑑定的是C83。已知該半胱氨酸殘基與C103形成二硫鍵。CHIR-12.12 mAb識別的構象表位可能含有該二硫鍵(C83-C103)和/或構象上接近C103的環繞胺基酸。
實施例8CHIR-12.12阻斷正常人B細胞中CD40L-介導的CD40存活和信號轉導途徑可溶性CD40配體(CD40L)能激活B細胞誘導各種功能性應答，包括提高存活和增殖，激活NFκB、ERK/MAPK、PI3K/Akt，和p38信號轉導途徑。此外，CD40L-介導的CD40刺激通過減少正常B細胞中切割的PARP和誘導抗凋亡蛋白、XIAP和Mcl-1提供存活信號。CD40L-介導的CD40刺激也募集TRAF2和TRAF3結合CD40胞質結構域。
以下研究證明CHIR-12.12能直接抑制對正常B細胞的所有這些作用。例如，CHIR-12.12處理以時間和劑量依賴方式導致胱冬酶-9、胱冬酶-3和PARP切割增加以及XIAP和Mcl-1減少，恢復B細胞凋亡。用CHIR-12.12處理在對CD40L-介導的CD40刺激的反應中也抑制IκB激酶(IKK)α和β(NFκB途徑)、ERK、Akt和p38的磷酸化。此外，發現沒有最初的CD40L-介導的CD40刺激時，CHIR-12.12不激發這些凋亡作用。
CHIR-12.12通過誘導PARP切割抑制CD40配體介導的存活在這些實驗中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106個健康獻血者(donor)的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)。然後加入CHIR-12.12(10μg/ml)和對照IgG。於0、20分鐘、2小時、6小時、18小時和26小時收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中切割的胱冬酶-9、切割的胱冬酶-3、切割的PARP和β肌動蛋白對照。
簡言之，觀察到CD40L-介導的CD40刺激提供了存活信號，因為未導致胱冬酶-9、切割的胱冬酶-3或切割的PARP隨時間而增加，表明細胞未經歷凋亡。然而，用CHIR-12.12處理導致這些切割產物增加，表明CHIR-12.12處理消除了CD40L結合對sCD40L-刺激的正常B細胞中存活信號的轉導，恢復了B細胞凋亡(數據未顯示)。
CHIR-12.12抑制「存活」性抗凋亡蛋白的表達在這些實驗中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)。然後加入CHIR-12.12(10μg/ml)和對照IgG。於0、20分鐘、2小時、6小時、18小時和26小時收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中Mcl-1、XIAP、CD40和β肌動蛋白對照。簡言之，sCD40L刺激導致Mcl-1和XIAP隨時間而持續表達。然而，用CHIR-12.12處理sCD40L-刺激的細胞導致這些蛋白質隨時間表達減少(數據未顯示)。由於Mcl-1和XIAP是能阻斷凋亡途徑的「存活」信號，這些結果證明CHIR-12.12處理消除了sCD40L-刺激的正常B細胞中凋亡的阻斷。
CHIR-12.12處理抑制了正常B細胞中IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser 181)的磷酸化在這些實驗中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激1.0×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)。然後加入CHIR-12.12(10μg/ml)和對照IgG。於0和20分鐘收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中磷酸化的IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser 181)與總的IKKβ對照。
簡言之，sCD40L刺激導致IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser 181)隨時間而磷酸化；然而，用CHIR-12.12處理消除了正常B細胞對sCD40L-刺激的此應答(數據未顯示)。
CHIR-12.12處理以劑量依賴方式抑制CD40配體介導的存活在這些實驗中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)。然後加入CHIR-12.12(0.01、0.1、0.2、0.5、1.0μg/ml)和對照IgG。24小時後收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中切割的PARP和β肌動蛋白對照。
簡言之，CHIR-12.12處理以劑量依賴方式導致sCD40L-刺激的細胞中PARP切割增加，因此消除了sCD40L-刺激的正常B細胞中的存活信號途徑(數據未顯示)。
CHIR-12.12以劑量依賴方式抑制「存活」性抗-凋亡蛋白的表達在這些實驗中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)。然後加入CHIR-12.12(0.5、2和10μg/ml)和對照IgG。22小時後收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中Mcl-1、XIAP、切割的PARP和β肌動蛋白對照。
簡言之，CHIR-12.12處理以劑量依賴方式減少了sCD40L-刺激細胞中的Mcl-1和XIAP表達並增加了切割的PARP表達，因此消除了對sCD40L-刺激的正常B細胞中凋亡途徑的阻斷(數據未顯示)。
在不存在可溶性CD40L信號時，CHIR-12.12不影響抗-凋亡蛋白、切割的PARP和XIAP的表達在這些實驗中，僅用CHIR-12.12(10μg/ml)和對照IgG(即，在加入抗體之前，細胞未用sCD40L預刺激)處理1.0×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)。於0、4、14和16小時收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中XIAP、切割的PARP和β-肌動蛋白對照。
簡言之，這些結果顯示無sCD40L刺激時，IgG處理的對照細胞和CHIR-12.12處理的細胞中，細胞表達的切割的PARP濃度增加，而XIAP表達維持恆定(數據未顯示)。這些數據表明，沒有CD40L刺激時，CHIR-12.12不激發正常人B細胞凋亡。
CHIR-12.12抑制正常B細胞中IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser181)、Akt、ERK和p38的磷酸化在這些實驗中，1.0×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)在含有1％FBS的培養基中血清飢餓(serum starve)並用1μg/mlsCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激。細胞用CHIR-12.12(1和10μg/ml)和對照IgG處理培養物。於0和20分鐘收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中磷酸-IKKα、磷酸-IKKβ、總的IKKβ、磷酸-ERK、總的ERK、磷酸-Akt、總的Akt、磷酸-p38和總的p38。
簡言之，sCD40L刺激導致IKKα/β磷酸化、ERK磷酸化、Akt磷酸化和p38磷酸化增加，導致細胞的存活和增殖。用CHIR-12.12處理細胞消除了正常B細胞中sCD40L-刺激對這些信號轉導途徑的作用(數據未顯示)。
CHIR-12.12抑制多種信號轉導途徑，例如CD40信號級聯反應中的PI3K和MEK/ERK在這些實驗中，1.0×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)在含有1％FBS的培養基中血清飢餓並用1μg/ml sCD40L(AlexisCorp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激。培養物也用CHIR-12.12(1和10μg/ml)、Wortmanin(一種PI3K/Akt抑制劑；1和10μM)、LY 294002(一種PI3K/Akt抑制劑；10和30μM)和PD 98095(一種MEK抑制劑；10和30μg/ml)處理。於0和20分鐘收集細胞。通過Western印跡檢測細胞裂解物中磷酸-ERK、磷酸-Akt、總的Akt、磷酸-IKKα/β和各自總含量。
簡言之，這些結果顯示CHIR-12.12消除了所有這些信號轉導分子的磷酸化，而信號轉導抑制劑顯示只特異性消除信號轉導，表明CHIR-12.12可能抑制CD40L刺激介導的這些信號轉導分子的上遊途徑(數據未顯示)。
CHIR-12.12抑制正常B細胞中信號轉導分子TRAF2和TRAF3與CD40胞質結構域的結合在這些實驗中，4.0×106個健康獻血者的正常人B細胞(純度百分比為85-95％)在含有1％FBS的培養基中血清飢餓並用1μg/ml sCD40L(AlexisCorp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激20分鐘。於0和20分鐘收集細胞。用多克隆抗-CD40(Santa Cruz Biotechnology，CA)免疫沉澱CD40，在Western印跡中用抗-TRAF2 mAb(Santa Cruz Biotechnology，CA)、抗-TRAF3 mAb(Santa Cruz Biotechnology，CA)和抗-CD40 mAb(Santa CruzBiotechnology，CA)檢測。
簡言之，這些結果顯示sCD40L刺激後TRAF2和TRAF3與CD40共同沉澱。相反，用CHIR-12.12處理消除了sCD40L-刺激的正常B細胞中CD40-TRAF2/3信號轉導複合物的形成。CD40的表達沒有變化(數據未顯示)。
不受理論的束縛，這些實驗的結果和上述實施例的結果表明CHIR-12.12抗體是具有獨特組合特性的雙重作用拮抗性抗-CD40單克隆抗體。該完全的人單克隆抗體能阻斷B細胞存活和增殖的CD40L-介導的CD40信號轉導途徑；該拮抗作用最終導致細胞死亡。CHIR-12.12也能介導效應細胞的識別和結合，啟動抗體依賴的細胞毒性(ADCC)。一旦CHIR-12.12與效應細胞結合，釋放溶細胞酶，導致B細胞凋亡和裂解。當在臨床前腫瘤模型中比較時，CHIR-12.12是比利妥昔單抗更有效的抗腫瘤抗體。
實施例9CHIR-12.12在多發性骨髓瘤動物模型中的抗腫瘤活性當CHIR-12.12經腹膜內(i.p.)每周給藥1次，總共3周時，其明顯以劑量依賴方式抑制侵襲性分階段和不非階段的多發性骨髓瘤生長。聯合用硼替佐米(VELCADE_)的抗體治療可進一步提高效力。
IM-9多發性骨髓瘤異種移植模型SCID小鼠以每隻小鼠5×106個細胞皮下接種50％MATRIGELTM配製的IM-9腫瘤細胞(表達CD40和CD20的多發性骨髓瘤細胞系)。在不分階段模型中，在腫瘤植入後一天開始治療。在分階段模型中，當腫瘤體積達到150-200mm3時開始治療。荷瘤小鼠以所示劑量腹膜內(i.p.)每周注射一次抗-CD40 mAb。數據使用對數分級測試來進行分析。
在不分階段的條件化存活模型中，CHIR-12.12明顯以劑量依賴方式延長了荷瘤小鼠的存活時間，在第56天，0.1mg/kg CHIR-12.12處理組中存活率是60％，1和10mg/kg CHIR-12.12處理組中存活率是80％(分別是p＜0.01和p＜0.001)(數據未顯示)。由於腫瘤生長相關的疾病，對照IgG和硼替佐米處理組中所有動物在第18和26天無痛處死。
在分階段的皮下模型中，以0.1、1和10mg/kg每周給藥的CHIR-12.12明顯抑制腫瘤生長，分別將腫瘤體積減小17％(p＞0.05；數據未顯示)、34％(p＜0.01；圖A)和44％(p＜0.001；數據未顯示)。當測試以0.5mg/kg每周給藥兩次時，硼替佐米不抑制腫瘤生長(數據未顯示)。如圖A所示，當以最大耐受劑量(MTD)1mg/kg，每周給藥兩次時，硼替佐米抑制腫瘤生長達30％(p＜0.01)。然而，當CHIR-12.12(1mg/kg)聯合最大耐受劑量的硼替佐米每周給藥1次時，觀察到腫瘤體積減少超過50％(p＜0.001)。
總之，在實驗性多發性骨髓瘤模型中，抗-CD40mAb CHIR-12.12明顯抑制腫瘤生長。此外，CHIR-12.12和硼替佐米聯合治療的效果高於任何單一的治療。這些數據提示抗-CD40mAb CHIR-12.12具有強抗腫瘤活性，單獨使用或和其它化療藥物聯用可臨床有效地治療多發性骨髓瘤。
實施例10用5.9和CHIR-12.12做的臨床研究臨床目標總目標是通過用抗-CD40 IgG1靶向多發性骨髓瘤癌細胞來提供對多發性骨髓瘤的有效療法。雖然可在I期獲得對活性的一些衡量，但這些疾病的信號轉導在II期測定。該藥物首先作為單一藥物進行研究，但在隨後的過程中聯用了其它藥物、化療和放療。
I期·在患多發性骨髓瘤的對象中評價安全性和藥代動力學-劑量遞增。
·根據安全性、耐受性和CD40的血清標記變化選擇劑量。一般尋找MTD，但其它效力指標(CD40+多發性骨髓瘤細胞的消除等)也足夠確定劑量。
·考慮一種以上的劑量，其中一些在II期中可能需要。
·患者每周給藥並進行實時藥代動力學(Pk)取樣。最初的4周周期進行最大給藥。Pk依據所研究的疾病、CD40密度等可能有很大不同。
·該試驗對多發性骨髓瘤患者公開。
·根據安全性、劑量和抗腫瘤活性的初步證據決定終止還是繼續研究。
·在II期測定應答速率所確定的藥物活性。
·鑑定II期的劑量。
II期在多發性骨髓瘤患者中進行幾項試驗。在隨機化的II期方法中可能測試多種劑量或多種給藥時間方案。
·靶向不符合當前當前護理標準的多發性骨髓瘤(患者)群(化療失敗)√根據II期治療概念的證據決定終止還是繼續研究√決定替代標記是否可用作臨床效力的早期指標√鑑定III期的劑量III期III期取決於II期中在何處檢測到信號與何種競爭性療法可認為是標準的。如果信號是在無治療標準的疾病階段，則單臂(single arm)、良好控制的研究可用作關鍵性試驗。如果存在認為是標準的競爭性藥物，則可進行一對一(head-to-head)的研究。
實施例11拮抗性抗-CD40抗體的液體藥物製劑為選擇拮抗性抗-CD40抗體CHIR-12.12的最佳溶液環境，本項研究的目的是通過生物物理和生物化學方法檢測溶液pH對該抗體穩定性的作用。示差掃描量熱法(DSC)結果顯示CHIR-12.12在pH 5.5-6.5的製劑中構象穩定性最佳。基於SDS-PAGE、體積排阻HPLC(SEC-HPLC)和離子交換HPLC(CEX-HPLC)分析的綜合結果，CHIR-12.12在約pH 5.0-5.5時的理化穩定性最佳。鑑於這些結果，含有該抗體的一種推薦的液體藥物製劑是用約10mM琥珀酸鈉、約150mM氯化鈉配製，pH約5.5、含有濃度約20mg/ml的CHIR-12.12的製劑。
材料與方法用於製劑研究的CHIR-12.12抗體是通過CHO細胞培養方法產生的人單克隆抗體。該mAb的分子量為150kDa，由二硫鍵連接的兩條輕鏈和兩條重鏈組成。其靶向表達CD40的細胞，包括正常和惡性B細胞上的CD40細胞表面受體，可治療各種癌症和自身免疫/炎性疾病。
用於本項研究的抗-CD40藥物是散裝的，得自CHO的純化抗-CD40(CHIR-12.12)。該藥物組合物是用10mM琥珀酸鈉、150mM氯化鈉配製，pH約6.5、濃度約9.7mg/ml的CHIR-12.12。該研究的對照樣品是接受的藥物，經≤-60℃凍結後在室溫融化並在預定的時間點連同穩定性樣品一起測試。如表7所示，用不同pH溶液透析該藥物來製備穩定性樣品並用UV280測定各樣品的CHIR-12.12濃度。
表7.CHIR-12.12製劑
使用以下方案測定各種製劑中CHIR-12.12抗體的理化穩定性。
示差掃描量熱法(DSC)用MicroCal VP-DSC按1℃/分鐘速度從15℃加熱至90℃檢測不同製劑樣品的構象穩定性。
SDS-PAGE用4-20％Tris-甘氨酸凝膠在非還原和還原條件下評估斷裂和聚集。通過考馬斯亮藍染色法檢測蛋白質。
體積排阻色譜(SEC-HPLC)也通過Water Alliance HPLC檢測蛋白質的斷裂和聚集，所述HPLC使用Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL柱，100mM磷酸鈉、pH 7.0作為流動相，流速0.7ml/分鐘。
離子交換色譜(CEX-HPLC)用Waters 600s HPLC系統檢測降解相關的荷電變化，所述HPLC系統使用Dionex Propac WCX-10柱，以50mM HEPE，pH 7.3作為流動相A和含有500mM NaCl的50mM HEPE，pH 7.3作為流動相B，流速0.5℃/分鐘進行。
結果與討論構象穩定性研究CHIR-12.12的熱去摺疊表明至少有兩次熱轉換，可能分別代表Fab和Fc結構域的去摺疊解鏈。在較高溫度下，該蛋白質可能凝聚導致DSC信號喪失。出於製劑篩選目的，本項研究中將最低的熱轉換溫度定義為解鏈溫度，Tm。圖6顯示了作為製劑pH函數的熱解鏈溫度。較高的熱解鏈溫度表明pH 5.5-6.5的該製劑使得抗-CD40具有較高的構象穩定性。
SDS-PAGE分析pH 4.5-9.0的CHIR-12.12製劑樣品於40℃孵育2個月，以SDS-PAGE分析(數據未顯示)。在非還原條件下，在pH大於5.5的製劑中觀察到分子量(MW)為23kDa和27kDa的(抗體)種類，在所有製劑中均觀察到MW為51kDa的(抗體)種類，但在pH5.0-5.5的製劑中明顯減少。pH 7.5和pH 9.0的製劑中可見MW為100kDa的(抗體)種類。
在還原條件下，CHIR-12.12還原為MW分別為50kDa和24kDa的游離重鏈和輕鏈。100kDa的(抗體)種類似乎不能完全被還原並隨著溶液pH的增加而增多，提示在這些分子中可能發生非二硫共價鍵結合。由於SDS-PAGE上存在身份未知的其它分子，各製劑的穩定性比較根據CHIR-12.12的剩餘純度。pH 5.0-6.0的製劑為CHIR-12.12提供了更穩定的環境。SDS-PAGE幾乎沒檢測到凝聚(數據未顯示)。
SEC-HPLC分析SEC-HPLC分析檢測到作為主峰(抗體)種類的完整CHIR-12.12，與該主峰分離開的前峰抗體是凝聚的(抗體)種類，大片段(抗體)種類位於主峰後部的肩峰，小片段(抗體)種類在主峰後檢測到。5℃和25℃溫育3個月後，在上述製劑中檢測到其量可忽略不計的蛋白質片段和凝聚物(＜1.0％)，CHIR-12.12主峰抗體純度保持在99％以上(數據未顯示)。然而，儲存於40℃時，蛋白質片段逐步增加，如表8所示，更多的片段在pH 4.5和pH 6.5-9.0時形成。CHIR-12.12製劑40℃溫育3個月後，在pH 7.5和pH 9.0的製劑中檢測到約2-3％的凝聚物，而在其它pH的製劑中檢測到不到1％的凝聚物(數據未顯示)。SEC-HPLC結果表明CHIR-12.12在約pH 5.0-6.0時更穩定。
表8.CHIR-12.12穩定性樣品在實時和加速儲存條件下的SEC-HPLC結果
CEX-HPLC分析CEX-HPLC分析檢測到作為主峰(抗體)種類的完整的CHR-12.12，酸性變體早於主峰(抗體)種類洗脫，C-末端添加了賴氨酸的變體在主峰(抗體)種類之後洗脫。表9顯示剩餘的主峰CHIR-12.12(抗體)種類和酸性變體的百分比取決於溶液的pH。可能由於早期發酵和純化方法所致，對照樣品已經含有高比例的酸性(抗體)種類(約33％)。CHIR-12.12對pH較高的溶液敏感有兩個事實證明。首先，pH 9.0的最初製劑樣品(t＝0)已經比對照多產生了12％的酸性(抗體)種類。其次，隨著pH上升酸性抗體的百分比急劇增加。可能由於脫氨基作用導致荷電變化相關的降解。上述數據表明CHIR-12.12的該類型的降解在約pH 5.0-5.5處最少。
表9.在實時和加速儲存條件下不同pH製劑中CHIR-12.12的CEX-HPLC峰面積百分比
結論pH對CHIR-12.12的構象和理化穩定性有顯著影響。荷電變化相關的降解確定為CHIR-12.12的主要降解途徑，該降解在pH 5.0-5.5時最少。根據總的穩定性數據，一種含有該抗體的推薦的液體藥物製劑是用約10mM琥珀酸鈉、約150mM氯化鈉配製的pH約5.5、含有約20mg/ml的CHIR-12.12的製劑。
本文所述發明所屬領域的技術人員可從本文的描述和相關附圖中獲益進而可對本發明作出許多改進和其它實施方案。因此，應理解本發明不受限於以上公開的具體實施方案，所述改進和其它實施方案均包括在附加權利要求所確定的範圍內和本文所公開的實施方案內。雖然本文使用了特定的術語，但它們僅是一般性和描述性地使用並非出於限制的目的。
說明書中述及的所有出版物和專利申請表明本發明所屬領域技術人員的水平。如同每篇單獨的出版物或專利申請特定且獨立地用作參考一樣，所有出版物和專利申請納入本文作為參考。
關於微生物保藏的說明(細則13之二)
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
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03年-11月-4日來自-智慧財產權部510-654-4873T-197 P 003/003 F-592ATCC10801 大學大道 馬納斯，維吉尼亞 20110-2209；電話700-065-2700；傳真703-365-2745；國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約國際表依照第7.3條頒布的原始保存物的保存證明和依照第10條頒布的存活性證明至(交存人或代理人姓名或地址)希龍公司代理人K V Noto4560 Horton大街艾莫利維爾(Emeryville)，加利福尼亞 94608代表希龍公司保存交存人給的分類號 專利保存號小鼠雜交瘤131.2F8.5.9CMCC#12047 PTA-5542小鼠雜交瘤153.8E2.D10.D6.12.12CMCC#12056 PTA-5543保存物伴有科學描述；給出的以上分類描述。保存物由本國際保存單位於2003年9月17日收到並接受。
根據你方要求×我們通知你方要求保存菌株30年如果籤署布達佩斯條約的專利局證實某人接收的權利，或者如果引用該菌株的美國專利授權，並且ATCC收到美國專利和商標局或教存人的指令來發放所述菌株，則該菌株對公眾可用。
如果在保存的有效時期內培養物死亡或破壞，你方應用相同的活培養物替換它們。
該菌株將自保存之日起維持至少30年，或需要最新的樣品，無論哪個更長。美國和許多其它國家籤署了布達佩斯條約。
上述培養物的活性於2003年9月23日測試。在該日，培養物是存活的。
國家保存單位美國模式培養物保藏所，馬納斯，維吉尼亞20110-2209美國。
有權代表ATCC者的籤名瑪利亞 哈裡斯(Marie Harris)，專利專員，ATCC專利保存 日期2003年10月2日CC利莎 亞歷山大(Lisa Alexander)Ref審理或案件號P20107.0012003年11月3日收到來自510 923 4766 至 智慧財產權 002頁序列表序列表110L.隆(Long，Li)M.盧克曼(Luqman，Mohammad)A.亞巴娜發(Yabannavar，Asha)I.扎羅(Zaror，Isabel)120使用拮抗性抗-CD40單克隆抗體治療多發性骨髓瘤130PP22589.002(282915)15060/565,7091512004-04-2615060/565,7101512004-04-2715060/525,5791512003-11-2615060/517,3371512003-11-0416012170FastSEQ for Windows Version 4.02101211720212DNA213人工序列220
22312.12人抗-CD40抗體的輕鏈的編碼序列221CDS222(1)...(720)4001atg gcg ctc cct gct cag ctc ctg ggg ctg cta atg ctc tgg gtc tct 48Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser1 5 10 15
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22312.12人抗-CD40抗體的輕鏈4002Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser1 5 10 15Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr20 25 30Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser35 40 45Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys50 55 60Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala65 70 75 80Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe85 90 95Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr100 105 110Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys115 120 125Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro130 135 140Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu145 150 155 160Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165 170 175Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp180 185 190Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200 205Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln210 215 220Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 23521032112016212DNA213人工序列220
22312.12人抗-CD40抗體的重鏈的編碼序列(包括內含子)4003atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt taagaggtgt ccagtgtcag 60gtgcagttgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120tgtgcagcct ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tcatatgagg aaagtaatag ataccatgca 240gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagatcac gctgtatctg 300caaatgaaca gcctcagaac tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatgggggt 360atagcagcac ctgggcctga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagca 420agtaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgcccgcta gcaagagcac ctctgggggc 480acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tggtgagagg 720ccagcacagg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc agcgctcctg cctggacgca 780tcccggctat gcagtcccag tccagggcag caaggcaggc cccgtctgcc tcttcacccg 840gaggcctctg cccgccccac tcatgctcag ggagagggtc ttctggcttt ttccccaggc 900tctgggcagg cacaggctag gtgcccctaa cccaggccct gcacacaaag gggcaggtgc 960tgggctcaga cctgccaaga gccatatccg ggaggaccct gcccctgacc taagcccacc 1020ccaaaggcca aactctccac tccctcagct cggacacctt ctctcctccc agattccagt 1080aactcccaat cttctctctg cagagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc 1140gtgcccaggt aagccagccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag 1200agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt 1260cctcagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg 1320acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg 1380
aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga 1440caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc 1500tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc 1560cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccgtggg gtgcgagggc 1620cacatggaca gaggccggct cggcccaccc tctgccctga gagtgaccgc tgtaccaacc 1680tctgtcccta cagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1740gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1800atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1860gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1920tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1980acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 20162104211469212PRT213人工序列220
22312.12人抗-CD40抗體的重鏈4004Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly1 5 10 15Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile85 90 95Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr115 120 125Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly130 135 140Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly145 150 155 160Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val165 170 175Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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220
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305 310 315 320Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu325 330 335Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala340 345 350Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro355 360 365Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln370 375 380Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala385 390 395 400Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr405 410 415Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu420 425 430Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser435 440 445Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser450 455 460Leu Ser Pro Gly Lys4652106211239212PRT213人工序列220
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Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr100 105 110Cys Met Gln Val Thr Gln Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg115 120 125Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro130 135 140Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu145 150 155 160Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp165 170 175Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp180 185 190Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200 205Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln210 215 220Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 2352107211474212PRT213人工序列220
2235.9人抗-CD40抗體的重鏈4007Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly1 5 10 15Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe35 40 45Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser65 70 75 80Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser85 90 95Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp G1y Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135 140Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys145 150 155 160Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr165 170 175Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser180 185 190Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser195 200 205Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr210 215 220Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys225 230 235 240Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys245 250 255Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro260 265 270Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys275 280 285Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp290 295 300Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu305 310 315 320Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu325 330 335His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn340 345 350Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly355 360 365Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu370 375 380Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr385 390 395 400Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn405 410 415Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe420 425 430Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn435 440 445Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr450 455 460Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470
2108211474212PRT213人工序列220
2235.9人抗-CD40抗體的變體的重鏈4008Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly1 5 10 15Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe35 40 45Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser65 70 75 80Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser85 90 95Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr115 120 125Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135 140Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys145 150 155 160Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr165 170 175Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser180 185 190Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser195 200 205Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr210 215 220Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys225 230 235 240Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro260 265 270Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys275 280 285Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp290 295 300Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu305 310 315 320Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu325 330 335His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn340 345 350Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly355 360 365Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu370 375 380Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr385 390 395 400Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn405 410 415Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe420 425 430Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn435 440 445Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr450 455 460Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 4702109211612212DNA213智人(Homo sapiens)220
221CDS222(1)...(612)221misc_feature222(0)...(0)223人CD40的短同種型的編碼序列4009
atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc 48Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr1 5 10 15gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta 96Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu20 25 30ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg144Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val35 40 45agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa192Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu50 55 60agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac240Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His65 70 75 80aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc288Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr85 90 95tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg336Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr100 105 110agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc384Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly115 120 125ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag432Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu130 135 140ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa480Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys145 150 155 160tgt cac cct tgg aca agg tcc cca gga tcg gct gag agc cct ggt ggt528Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly165 170 175
gat ccc cat cat ctt cgg gat cct gtt tgc cat cct ctt ggt gct ggt576Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly180 185 190ctt tat caa aaa ggt ggc caa gaa gcc aac caa taa612Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln *195 20021010211203212PRT213智人(Homo sapiens)40010Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr1 5 10 15Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu20 25 30Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val35 40 45Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu50 55 60Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His65 70 75 80Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr85 90 95Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr100 105 110Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly115 120 125Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu130 135 140Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys145 150 155 160Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly165 170 175Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly180 185 190Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln195 20021011
211834212DNA213智人(Homo sapiens)220
221CDS222(1)...(834)221misc_feature222(0)...(0)223人CD40的長同種型的編碼序列40011atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc 48Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr1 5 10 15gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta 96Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu20 25 30ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg144Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val35 40 45agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa192Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu50 55 60agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac240Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His65 70 75 80aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc288Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr85 90 95tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg336Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr100 105 110agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc384Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly115 120 125
ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag432Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu130 135 140ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa480Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys145 150 155 160tgt cac cct tgg aca agc tgt gag acc aaa gac ctg gtt gtg caa cag528Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln165 170 175gca ggc aca aac aag act gat gtt gtc tgt ggt ccc cag gat cgg ctg576Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu180 185 190aga gcc ctg gtg gtg atc ccc atc atc ttc ggg atc ctg ttt gcc atc624Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile195 200 205ctc ttg gtg ctg gtc ttt atc aaa aag gtg gcc aag aag cca acc aat672Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn210 215 220aag gcc ccc cac ccc aag cag gaa ccc cag gag atc aat ttt ccc gac720Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp225 230 235 240gat ctt cct ggc tcc aac act gct gct cca gtg cag gag act tta cat768Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His245 250 255gga tgc caa ccg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agt cgc atc tca816Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser260 265 270gtg cag gag aga cag tga834Val Gln Glu Arg Gln *27521012211277
212PRT213智人(Homo sapiens)40012Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr1 5 10 15Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu20 25 30Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val35 40 45Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu50 55 60Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His65 70 75 80Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr85 90 95Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr100 105 110Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly115 120 125Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu130 135 140Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys145 150 155 160Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln165 170 175Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu180 185 190Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile195 200 205Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn210 215 220Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp225 230 235 240Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His245 250 255Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser260 265 270Val Gln Glu Arg Gln27權利要求
1.一種治療人對象的多發性骨髓瘤的方法，所述方法包括給予所述對象有效量的能特異性結合表達於人CD40表達細胞表面上的人CD40抗原的人抗-CD40單克隆抗體，所述單克隆抗體無明顯的激動活性，藉此，當所述單克隆抗體結合所述細胞表面表達的CD40抗原時，抑制所述細胞的生長或分化，所述人抗-CD40單克隆抗體選自a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產生的單克隆抗體；c)含有選自以下的胺基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQ ID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示序列，和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；d)含有選自以下的胺基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQ ID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示序列，和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的胺基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列，和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；f)與能結合雜交瘤細胞系5.9或12.12產生的單克隆抗體的表位相結合的單克隆抗體；g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結合的單克隆抗體；h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結合的單克隆抗體；i)在競爭性結合試驗中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；j)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-i)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產生的；和k)為前項a)-j)中任一項所述單克隆抗體的抗原結合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結合所述人CD40抗原的能力。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述單克隆抗體以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結合。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
4.一種治療人對象的多發性骨髓瘤的方法，包括給予所述對象有效量的特異性結合人CD40抗原結構域2的拮抗性抗-CD40單克隆抗體，其中所述抗體當與人CD40抗原結構域2結合時無明顯的激動活性。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述抗體是人抗體。
6.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述抗體具有選自以下的抗體的結合特異性雜交瘤細胞系5.9產生的抗體和雜交瘤細胞系12.12產生的抗體。
7.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述抗體選自專利保藏號為PTA-5542的ATCC保藏的雜交瘤細胞系產生的抗體和專利保藏號為PTA-5543的ATCC保藏的雜交瘤細胞系產生的抗體。
8.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述抗體具有單克隆抗體CHIR-12.12或5.9的結合特異性。
9.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述抗體與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位結合。
10.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述抗體選自a)含有選自以下的胺基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQ ID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示序列，和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；b)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的胺基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQID NO1和SEQ ID NO3所示序列；c)與能結合雜交瘤細胞系12.12產生的單克隆抗體的表位相結合的單克隆抗體；d)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結合的單克隆抗體；e)在競爭性結合試驗中與單克隆抗體CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；f)前項a)-e)中任一項所述單克隆抗體，其中所述抗體是重組產生的；和g)為CHIR-12.12單克隆抗體的抗原結合片段或前項a)-f)中任一項所述單克隆抗體的抗原結合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結合所述人CD40抗原的能力。
11.一種抑制表達CD40抗原的多發性骨髓瘤細胞生長的方法，所述方法包括使所述細胞與有效量的能特異性結合所述CD40抗原的人抗-CD40單克隆抗體接觸，所述單克隆抗體當結合CD40抗原時無明顯的激動活性，所述抗體選自a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；b)雜交瘤細胞系5.9或12.12產生的單克隆抗體；c)含有選自以下的胺基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQ ID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；d)含有選自以下的胺基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQ ID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示序列，和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的胺基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQID NO1和SEQ ID NO3所示序列；f)與能結合雜交瘤細胞系5.9或12.12產生的單克隆抗體的表位相結合的單克隆抗體；g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結合的單克隆抗體；h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結合的單克隆抗體；i)在競爭性結合試驗中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；j)前項a)所述的單克隆抗體或前項c)-i)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產生的；和k)為前項a)-j)中任一項所述單克隆抗體的抗原結合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結合所述人CD40抗原的能力。
12.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述單克隆抗體以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結合。
13.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
14.一種抑制表達CD40抗原的多發性骨髓瘤細胞生長的方法，所述方法包括使所述細胞與有效量的特異性結合人CD40抗原的結構域2的拮抗性抗-CD40單克隆抗體接觸，其中所述抗體當與人CD40抗原的結構域2結合時無明顯的激動活性。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述抗體是人抗體。
16.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述抗體具有選自以下的抗體的結合特異性雜交瘤細胞系5.9產生的抗體和雜交瘤細胞系12.12產生的抗體。
17.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述抗體選自專利保藏號為PTA-5542的ATCC保藏的雜交瘤細胞系產生的抗體和專利保藏號為PTA-5543的ATCC保藏的雜交瘤細胞系產生的抗體。
18.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述抗體具有單克隆抗體CHIR-12.12或5.9的結合特異性。
19.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述抗體與含有SEQ IDNO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位結合。
20.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述抗體選自a)含有選自以下的胺基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQ ID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示序列，和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；b)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的胺基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQID NO1和SEQ ID NO3所示序列；c)與能結合雜交瘤細胞系12.12產生的單克隆抗體的表位相結合的單克隆抗體；d)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結合的單克隆抗體；e)在競爭性結合試驗中與單克隆抗體CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；f)前項a)-e)中任一項所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產生的；和g)為CHIR-12.12單克隆抗體的抗原結合片段或前項a)-f)中任一項所述單克隆抗體的抗原結合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結合所述人CD40抗原的能力。
全文摘要
本發明提供了治療對象的多發性骨髓瘤的方法。所述方法包括將治療有效量的拮抗性抗－CD40抗體或其抗原結合片段給予需要它的患者。當所述抗體結合人CD40表達細胞上的CD40抗原時，所述拮抗性抗－CD40抗體或其抗原結合片段無明顯的激動活性，而顯示拮抗活性。抗－CD40抗體或其抗原結合片段的拮抗活性有益地抑制表達人CD40的多發性骨髓瘤細胞的增殖和/或分化。
文檔編號C07K16/28GK1901937SQ200480039766
公開日2007年1月24日 申請日期2004年11月4日 優先權日2003年11月4日
發明者L·隆, M·盧克曼, A·亞巴娜發, I·扎羅 申請人:希龍公司