抑制發動蛋白依賴性的細胞內攝作用的方法和藥劑的製作方法

2023-06-02 17:14:06 2

專利名稱：抑制發動蛋白依賴性的細胞內攝作用的方法和藥劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於抑制發動蛋白依賴性的細胞內攝作用的藥劑，以及預防或治療由發動蛋白依賴性細胞內攝作用介導的疾病或病症的方法。
背景技術：
哺乳動物的細胞從細胞外吸收養分，並通過細胞內攝作用使細胞膜再循環，其中包括在胞漿膜內形成大量的小囊泡。小囊泡大小不一，大到大的吞噬體，其次是包涵素包裹的囊泡，小到微小的突觸囊泡(SV)。細胞內攝的機理對許多細胞功能的發揮都有幫助，包括對細胞外營養物質的攝取，細胞表面受體表達和信號發送的調節，抗原表達和突觸傳遞的維持。
細胞內攝途徑有兩個具有顯著的生物化學特徵。第一是快速突觸囊泡內攝作用(SVE)，其是在囊泡在神經末梢的細胞外排之後。SVE並不是特異地與受體活性相聯繫的，其作用於空的SVs之後再填充的恢復，並需要發動蛋白I的酶的活性。第二是受體介導的細胞內攝作用(RME)，起始於與細胞表面受體相結合的配體，並經所有細胞的包涵素包裹的凹點發生，包括神經末梢。RME提供了主要的為胞漿膜成分(例如受體-配體複合物和細胞膜脂質體)或細胞外液體進入細胞的入口並涉及發動蛋白II的活性。RME和SVE作用於相同的神經元，但作用機理卻不同。
雖然它們有類似的基礎蛋白結構，但RME和SVE卻屬相同蛋白的不同異構。RME和SVE都存在多個亞型。例如，表皮生長因子受體(EGFR)和轉鐵蛋白受體的細胞內化作用是通過RME介導的，並依賴於發動蛋白的活性，但是只有前者是對酪氨酸激酶(TK)抑制劑敏感，說明了對兩種活性受體的RME的不同的生化需求。細胞內攝作用在人類包括神經疾病的病理情況中起著多重作用，更好地理解如何控制細胞內攝作用在臨床上是非常重要的。
發動蛋白是介導細胞內攝作用終末期的關鍵酶(Brodin等人，2000)。除發動蛋白外，細胞內攝作用的分子學機制包括許多蛋白質和脂類輔助因子，其導致發動蛋白的聚集和激活(Cousin和Robinson.，2001)。內攝的蛋白質在細胞內攝作用中連續發揮作用，有至少4個形態學和生化學上分類的分期，儘管一些蛋白在傳遞途徑中涉及多個期。這些形態學和生化學的分類包括1.成核期在SV上的突觸前末梢突觸結合蛋白發揮作為細胞外排和細胞內攝的聯繫功能，方式是補充AP-2銜接蛋白複合物外排的成核位置上。AP-2補充包涵素以形成囊泡包衣和隨後的amphiphysin。
2.內陷期Amphiphysin是一種對接分子，其能夠補充剩餘的大多數內攝蛋白(發動蛋白、內韌蛋白和synaptojanin)，是囊泡內陷所需要的。
3.分裂期發動蛋白、amphiphysin和/或內韌蛋白裝配成環，形成如螺旋狀的內陷囊泡頸部的領圈。所有這三個蛋白都能夠在體外自我裝配成環。囊泡頸部的分裂導致囊泡的釋放，需要發動蛋白的GTP酶的活性。GTP水解引起螺旋結構的突然膨脹，引起胞漿膜的囊泡的擠出，或者引起環狀縮窄。在果蠅種族shibire中，發動蛋白GTP酶區域的突變(不阻斷GTP的結合但阻斷GTP的水解)使得發動蛋白螺旋結構的裝配而在其形成後阻斷SV的分裂(Koenig和Ikeda.，1989)。這可以鑑別發動蛋白環反應的GTP結合和GTP水解的步驟，並說明表示GTP的水解，即GTP酶活性，是囊泡分裂前的最後的步驟。發動蛋白GTP酶的缺損的突變體的過度表達抑制了RME和SVE(Brodin等人，2000)。
4.脫殼SV脫殼並在外排之前填充神經遞質。
因此，發動蛋白是一種在外排之後回復突觸囊泡的GTP酶，具有通過刺激在突觸囊泡凹陷頸部的螺旋結構的裝配的功能(Brodin等人，2000；Cousin和Robinson.，2001)。發動蛋白還是一種磷蛋白，可以被蛋白激酶C(PKC)在體外磷酸化，和被細胞周期素依賴蛋白激酶(Cdk5)在體內磷酸化。它很快地被神經鈣蛋白通過去極化作用和鈣內流刺激細胞內攝而去磷酸化，並且阻斷脫磷酸會防止神經末梢的細胞內攝。在多數囊泡的細胞內攝期間保持著去磷酸作用並在細胞內攝完成後重新磷酸化。因此，發動蛋白的去磷酸化不在細胞內攝中起作用，但是可能是細胞內攝前的啟動步驟。
發動蛋白I有三個發動蛋白基因在神經元中表達，而發動蛋白II則在所有位置表達。發動蛋白III在神經元中表達並大量存在於睪丸中。所有發動蛋白都有四個主要的區域，稱作GTP酶區域，普列克底物蛋白(pleckstrin)同源(PH)區域，GTP酶效應器區域(GED)，和富含脯氨酸區域(PRD)。
GTP酶區域有顯著低的對GTP的親和力(10-25μm)並且相比於其它GTP酶有非常高的更新速率。它是囊泡分裂所需要的。來自Dictyostelium基因的發動蛋白該區域的晶型結構近來被發現(Niemann等人，2001)。該球狀結構包含G-蛋白核心摺疊，其正常的六線片層通過插入單獨的55個胺基酸延伸至八線結構。
普列克底物蛋白同源(PH)區域既是靶向區域，也是可能的GTP酶抑制作用的因素，是內攝作用所需要的。發動蛋白與脂類經該區域相互作用，並且與含有二磷酸化的磷脂醯肌醇(PtdIns(4，5)P2)的nanotubules結合的發動蛋白明顯地刺激了GTP酶的活性(Stowell等人，1999)。PH區域不需要自裝配或具有GTP酶活性，除去它(delta-PH區域)會很大程度地增加內在的GTP酶活性。
GTP酶效應器區域(GED)控制發動蛋白之間的相互作用並把發動蛋白裝配成四聚體構型。大約28-32四聚體聯合自我裝配為單環或含有PtdIns(4，5)P2的脂類混合物周邊的螺旋結構。GED說明了結合GTP酶區域的四聚體自聯作用。GED的變異影響細胞內攝作用，部分降低，而部分(令人驚奇地)增加了內攝作用。GED的作用就象刺激GTP酶活性的GTP酶效應蛋白。
在發動蛋白C末端的富含脯氨酸區域(PRD)和多數含有蛋白和神經鈣蛋白的SH3區域相互作用，其是體內發動蛋白磷酸化的位置。
多種細胞內攝抑制劑和細胞內攝作用的抑制方法都存在，如陽離子兩性藥物(例如氯丙嗪)，刀豆素A，氧化苯砷，丹磺醯戊二胺，細胞內鉀缺乏，細胞內酸化和介質溫度降低至4℃。每種特異性都較弱，作用有限。雖然如此，它們還是對細胞內攝有些作用。部分證明了可阻斷細胞內攝作用的已經用於人類的臨床上了(Atwood，2001)。
發明概述本發明的一個或多個具體實施方式
涉及能夠抑制發動蛋白的GTP酶活性的化合物，以及這些化合物在抑制發動蛋白依賴性細胞內攝作用中的用途。特別地，至少發現有一些二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑(tyrphostin)能夠抑制由發動蛋白介導的細胞內攝作用。
因此，本發明的一個方面是提供一種抑制細胞內發動蛋白依賴性細胞內攝作用的方法，該方法包括用有效量的通式I的化合物，或其生理上可接受的鹽處理細胞，其中通式I為M-Sp-M』通式I其中M和M』分別獨立為通式II所示的結構部分，可以相同或不同，Sp為一間隔區； 其中V是C或CH；W是CH或一連接基團；並Y是氫、氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫(sulfur)、未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或
W、V和Y與Z基團稠合形成取代或未取代的5員或6員雜環，或是碳環，其中雜環包括1至3個選自O、N和S的雜原子，如果雜環或碳環有取代基，取代基是選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫、或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團的至少一種，其中的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X是O或S；X′是氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；R′是連接在間隔區上的NH、O或S；和Z是選自(a)非取代的含有一個或兩個獨立的5員或6員環的雜環，有不超過3個的選自O、N和S的雜原子；(b)非取代的含有一個或兩個獨立的5員或6員環的碳環；(c)含有一個或兩個獨立的5員或6員環的雜環，有不超過3個的選自O、N和S的雜原子，其中雜環有一個或多個取代基，所述取代基獨立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代基、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團，被至少一個選自硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基的基團取代；和(d)含有一個或兩個獨立的5員或6員環的碳環，在W是CH或一連接基團時，或W、V和Y形成非取代的碳環時有至少兩個取代基，或者在W、V和Y形成雜環時，有至少一個取代基，所述取代基獨立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團，有至少一個選自硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代基、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基的取代基；其中當M或M′中的一個Z選自(b)時，而另一個M或M′中的Z選自(a)、(c)和(d)。
優選的是，通式I的化合物是二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑。
本發明還涉及通過抑制發動蛋白依賴的細胞內攝作用來預防或治療相關的疾病或病症的方法。因此，本發明的另一方面提供了一種預防或治療哺乳動物中由發動蛋白依賴的細胞內攝作用介導的疾病或病症的方法，該方法包括給予哺乳動物有效量的通式I的化合物，或其生理上可接受的鹽或前藥。
本發明的另一方面是提供一種預防或治療哺乳動物中由發動蛋白蛋白依賴性細胞內攝作用介導的疾病或病症，該方法包括給予哺乳動物有效量的能夠結合發動蛋白並因此抑制發動蛋白的GTP酶活性的二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其生理上可接受的鹽，或其類似物，或其前藥。
用通式I的化合物，或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物處理細胞或哺乳動物，是指給予在體內可以二聚化產生通式I的化合物，或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物，它們在體內能夠結合發動蛋白，抑制其蛋白GTP酶的活性，和在體內能夠生成具有結合發動蛋白，抑制其蛋白GTP酶的活性的通式I的化合物或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物的前藥。
在本發明進一步的方面是提供通式I的化合物或其生理上可接受的鹽在製備用於預防或治療由發動蛋白依賴性的細胞內攝作用介導的哺乳動物的疾病或病症的藥物的用途。
本發明的另一方面，則是提供二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑，其生理可接受的鹽，或其類似物，或其前藥在製備用於預防或治療由發動蛋白依賴性的細胞內攝作用介導的哺乳動物的疾病或病症的藥物的用途，所述的二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或類似物能夠結合發動蛋白並抑制發動蛋白的GTP酶活性。
本發明的另一方面是提供如通式III的化合物或其生理可接受的鹽，其中M-Sp-M』 通式III其中M和M』分別獨立為通式IV所示的結構部分，可以相同或不同，Sp為一間隔區； 其中V是C或CH；W是CH或一連接基團；並Y是氫、氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫、未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y與Z基團稠合形成取代或未取代的5員或6員雜環，或是碳環，其中雜環包括1至3個選自O、N和S的雜原子，如果雜環或碳環有取代基，取代基是選自氰基、NH、硝基、氨基、氧代基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫、或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團的至少一種，其中的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X是O或S；X′是氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；R′是連接在間隔區上的NH、O或S；和
Z是選自(a)非取代的含有一個或兩個獨立的5員或6員環的雜環，有不超過3個的選自O、N和S的雜原子；(b)非取代的含有一個或兩個獨立的5員或6員環的碳環；(c)含有一個或兩個獨立的5員或6員環的雜環，有不超過3個的選自O、N和S的雜原子，其中雜環有一個或多個取代基，所述取代基獨立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團，被至少一個選自硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代基、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基的基團取代；和(d)含有一個或兩個獨立的5員或6員環的碳環，在W是CH或一連接基團時，或W、V和Y形成非取代的碳環時有至少兩個取代基，或者在W、V和Y形成雜環時，有至少一個取代基，所述取代基獨立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團，有至少一個選自硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基的取代基；其中當M或M′中的一個Z選自(b)時，而另一個M或M′中的Z選自(a)、(c)和(d)，並且條件是當R是CXR』，X是O，R』是鍵合在間隔區上的NH，V是C，W是CH，Y是氰基時，M和M′中至少一個的Z不是如通式IVa所示的苄基基團，
R1、R2和R5是H，R3和R4是羥基；或者當Sp是C2-C4的烷基間隔時，R1和R5是H，R2至R4是羥基；其中Z』是與W基團相連接的碳原子。
優選的是，當本發明或根據本發明給藥的化合物的M或M′的一個Y取代基是氫時，M或M′的另一個取代基則不是氫。典型的是，M和M′的至少一個的Z不是2，3-二取代的羧酸環基團。優選的是，M和M′的至少一個的Z包括當Z選自(d)且W是CH或C1-C3的連接基團時，至少有兩個鄰位取代基；或當Z是選自(c)的雜環時，該取代基或取代基之一在與該雜原子或雜原子之一相鄰的碳原子上；或當W、V和Y形成與Z稠合的雜環時，在碳原子上的該取代基或取代基之一與雜環至少有一個鍵長。
本發明的另一方面是提供通式I或通式III的化合物的前藥。
本發明的另一方面是提供含有通式III化合物，或其生理可接受鹽，或其前藥以及生理可接受的賦形劑、載體或稀釋劑的藥物組合物。
本發明的另一方面是提供篩選具有結合發動蛋白及抑制發動蛋白GTP酶活性能力的二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物的方法，該方法包括將發動蛋白或具有發動蛋白GTP酶活性的物質與二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物一起培養以提供檢測數據；並在這些數據的基礎上確定這些二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物是否具有抑制發動蛋白GTP酶活性。
具有發動蛋白GTP酶活性的分子可以是發動蛋白的一個片段，該片段能夠保持GTP酶的活性，或者是，例如發動蛋白的同系物、衍生物或類似物，它們在檢測中作為發動蛋白的替代物。
在本說明書中的所有提及的出版物都引用於此作為參考。在本發明的說明書中，任何對文獻、所用物質、設備、物品等的討論都僅僅是為了對本發明的目的的說明。所有這些形成了部分現有技術的基礎或是與本發明相關的公知常識，即如同它們在本申請優先權日之前在澳大利亞或其它地域已經存在，並不需要許可。
在本說明書中，術語「包括」應當理解為是對一定的要素、整體或步驟，或要素、整體或步驟的組合的包含，但並不排除其它要素、整體或步驟，或要素、整體或步驟的組合。
本發明的特徵和優點將在以下本發明的優選實施方式和附圖中更為詳細地加以說明。
附圖簡要說明附

圖1顯示二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47(a，b)抑制發動蛋白I和發動蛋白II的GTP酶的活性的圖表。0.2μg發動蛋白I(c，d)和發動蛋白II(e，f)的GTP酶活性的測量是使用1.3Ci 在存在或不存在二-酪氨酸磷酸化抑制劑(c，e)或酪氨酸磷酸化抑制劑A47(d，f)的情況下進行。基本活性(開環)和磷脂-應激活性(固環)進行比較；附圖2硝基纖維素膜的自動射線相片，說明結合在發動蛋白I和發動蛋白II上的[α-32P]-GTP不受加入的二-酪氨酸磷酸化抑制劑或酪氨酸磷酸化抑制劑A47(a，b)的影響。數據在表(c)和(d)上顯示；附圖3(a)圖表顯示二-酪氨酸磷酸化抑制劑沒有在發動蛋白I的PH區域發揮作用，因為化合物依然抑制缺少這一區域(″發動蛋白I-Delta PH″)的重組發動蛋白突變體GTP酶活性；(b)考馬斯藍染色的SDS凝膠照片，其顯示二-酪氨酸磷酸化抑制劑不阻斷髮動蛋白結合到脂類，發動蛋白保留在藥丸(P)中而不是在上清液(S)中；附圖4在分離的神經末梢(突觸體)進行的細胞外攝(a，c)和細胞內攝(b，d)的螢光檢測顯示二-酪氨酸磷酸化抑制劑而不是酪氨酸磷酸化抑制劑A47特別能夠降低細胞內攝作用。回收效能是相對於前面的外排量細胞內攝的更精確量度，二-酪氨酸磷酸化抑制劑對回收效能(e)有明顯的阻斷作用。
附圖5分離的大鼠腦神經末梢(突觸體)的電子顯微照片顯示在加入二-酪氨酸磷酸化抑制劑後，通過去極化刺激(a，b)和囊泡捲曲凹陷(c-h)的積累，突觸囊泡在末梢的缺失；和附圖6圖表顯示德克薩斯紅標記的鐵傳遞蛋白進入Swiss 3T3細胞(a-d)或HER14細胞的內化作用(e-h)在用100μM二-酪氨酸磷酸化抑制劑預孵化處理15分鐘後受到抑制。DAPI(藍)染色的部分是細胞核。
本發明優選實施方式的詳細說明術語「烷基」包含直鏈或支鏈飽和脂肪基團。術語「C1-C2的烷基」意思是烷基鏈的長度。這樣的烷基基團包括甲基、乙基、1-甲基-乙基和1，1-二甲基-乙基基團。
術語「C1-C2的基團」或「C1-C3的基團」包括具有一定數量碳原子的飽和或不飽和的脂肪族基團，可以是有支鏈的，也可以是沒有支鏈的。這樣的基團包括烷基和烯基基團。烯基基團包括至少一個雙鍵。C1-C3的基團的例子包括甲基、乙基、丙基、異丙基、1，3-二甲基丙基、1-甲基-3-乙基丙基、乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基和2-甲基-1-丙烯基。
術語「C1-C2」烯基基團包括通過雙鍵與Z的雜環或碳環基團相連接的C1基團。
術語「C1-C2的烷氧基」包括由一定數量碳原子組成的一定長度的烷氧基基團。烷氧基基團可以含有一個碳碳雙鍵。
術語「碳環基團」包括由碳原子組成的一個或多個環基團。碳環或環中的至少一個含有一個或多個多重鍵。在W、V和Y在通式I或通式III中成環時，形成的碳環優選含有一個或多個雙鍵。
術語「雜環基團」包括含有一個或多個環的基團，其中至少一個環存在雜原子，選自O、N和S。至少一個環可以含有一個或多個多重鍵。
術語「二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑」表示包含兩個酪氨酸磷酸化抑制劑部分的化合物，這兩個部分通過一個間隔區相連接，兩個酪氨酸磷酸化抑制劑部分可以相同或不同。典型的是，酪氨酸磷酸化抑制劑部分是相同的。最優選的是，酪氨酸磷酸化抑制劑部分是benzylidenemalonitrile基團。二-酪氨酸磷酸化抑制劑是一種二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑，令人驚奇地發現它能夠結合發動蛋白並抑制該蛋白的GTP酶的活性。
優選的是，通式I或通式III的化合物中的M和M′分別獨立為通式V表示的基團。
其中V是C；W是CH；Y是氫、氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、或未取代的C1-C2的基團或取代的C1-C2的基團，其中的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y與Z稠合形成5員或6員的取代或非取代的雜環，或碳環，其中雜環包括1至3個選自O、N和S的雜原子，並且如果碳環或雜環有取代的話，至少有一個取代基，選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫、或未取代的C1-C2的基團或取代的C1-C2的基團，其中的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X is O或S；和X′是氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、或未取代的C1-C2的基團或取代的C1-C2的基團，其中的取代基獨立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫；並R′是鍵合至間隔區的NH、O或S；並Z是如通式II中說明的基團。
優選的是，當W、V和Y不環合時，Y是氰基、硝基、氨基、羥基、羧基或硫代羧基。最優選的是，Y是氰基。
優選的是，R是CXR′，其中X是O或S，並R′是NH、O或S。更優選的是，X是O或S，並R′是NH。
當Z是碳環基團時，它可以含有一個或多個雙鍵。碳環基團可以是例如，環烷基基團，芳基基團如苯基或萘基，或聚苯基團如聯苯基。當碳環基團包含兩個環時，直接連在W上的環優選含有所有的取代基，或在W是CH或連接基團時，有至少兩個取代基，或在W、V和Y成環時，有至少一個取代基。優選的是，Z是選自如下基團(i)含有一或兩個獨立為5員或6員的雜環，包括不多於3個的獨立選自O、N和S的雜原子；(ii)含有一或兩個獨立為5員或6員的雜環，包括不多於3個的獨立選自O、N和S的雜原子，其中雜環含有一個或多個取代基，所述的取代基獨立選自硝基、NH、滷素、氰基、氨基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基；和(iii)含有一或兩個獨立為5員或6員環的碳環，含有至少兩個取代基，獨立選自硝基、NH、氨基、滷素、氰基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
優選的是，當Z基團是碳環並有滷素、氰基、C1-C2的烷氧基或C1-C2的醯基取代基時，Z基團通常還含有至少兩個其它取代基，優選獨立選自硝基、NH、氨基、羥基、羧基、氧代和硫，最優選為硝基、NH、氨基、羥基和羧基。優選的是，碳環基團是芳基基團，最優選的是，取代的苄基基團。
優選的是，當Z基團是雜環時，它有一個或兩個獨立為5員或6員的環，雜原子數不超過3個，選自O和N，其中雜環有一個或多個取代基，獨立選自硝基、NH、氨基、滷素、羥基、羧基和氧代，或是一個芳基基團，具有一個5或6員的單環，並至少兩個取代基獨立選自硝基、氨基、滷素、羥基和羧基。優選的是，芳基基團是取代的苯基基團。
優選的是，雜環是取代或未取代的imadazolyl、吡喃基、異苄基呋喃基、呋喃基、苯並吡喃基、吡咯基、2H-吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、中氮茚基、異吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、pthalazinyl、萘啶基、喹噁啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、噻吩基、或苯並噻吩基。最優選的是，雜環基團是取代的上述基團。
在W、V和Y形成與Z稠合的5或6員雜環的情況下，所得與Z結合的基團典型地是取代或未取代的兩個環的雜環基團。所得基團可以是例如取代或未取代的雜環基團，選自imadazolyl、苯並吡喃基、中氮茚基、異吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、pthalazinyl、萘啶基、喹噁啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、苯並噻吩基，和異苯並呋喃基。優選的是，所得基團是取代或未取代的苯並吡喃基、吲哚基或異喹啉基。再者，由W、V和Y環合形成的雜環基團優選是取代的基團。
最優選的是，本發明的化合物或根據本發明的方法給予哺乳動物的化合物是下述化合物，其中M和M′分別獨立是通式VI所述的化合物，它們可以相同或不同，並 X是O或S；Y是氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基或硫代羧基；或
R1和Y形成5或6員的取代或未取代的雜環或碳環，其中雜環含有1或2個選自O、N和S的雜原子，並且無論是雜環還是碳環，至少一個取代基是選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫；並且R2至R5獨立為氫或某取代基，所述取代基獨立選自硝基、氨基、滷素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、C1-C2的烷氧基或C1-C2的醯基；或R1至R5獨立為氫或某取代基，所述取代基獨立選自硝基、氨基、滷素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、C1-C2的烷氧基或C1-C2的醯基；或R是與Sp間隔區連接的NH、O和S；並其中至少M和M′中的一個特徵如下R1至R5的至少兩個不是氫，且當R1至R2不是氫時，R3至R5也不是氫，或者當R1和Y形成未取代的碳環時，R2至R5的至少兩個不是氫，當Y與R1形成雜環時，R2至R5的至少一個不是氫。
最優選的是，當Y與R1不環合併且R1和R2不是氫時，R3也不是氫。典型的是，R1-R5的至少兩個是鄰位取代。當化合物有三個取代基時，優選取代基彼此相鄰。優選的是，在這種情況下，R1-R3均不為氫，或R2-R5均不是氫。
當R1-R5或R2-R5中的至少一個是滷素、C1-C2的烷氧基或C1-C2的醯基，另外的取代基的至少一個選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，R1和Y形成雜環，或者至少兩個其它取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基而R1和Y不成環或形成未取代的碳環。
滷素的取代典型的是選自氟、氯、溴和碘。優選的是，滷素的取代選自氟和氯。
優選的是，通式I或通式III的連接基團包含單個原子或不超過3個原子長度的鏈，其中一個或多個原子是除碳原子外的其它原子，如N、O或S。優選的是，連接基團是C1-C3的基團。連接基團可以是取代或未取代的，可包括一個或多個雙鍵。取代基可選自羥基、氨基、滷素、硝基或其它不會影響化合物活性的基團。最優選的是，連接基團是未取代的。
優選的是，本發明或根據本發明對哺乳動物給藥的化合物的間隔區部分Sp允許化合物形成髮夾結構。最優選的是，間隔區部分是取代或未取代的1-7個原子的鏈，其可以包含一個或多個非碳原子，如N、O或S，以及一個或多個雙鍵。然而，任何適當的間隔區都應該保證化合物的發動蛋白依賴性細胞內攝作用的抑制性能。間隔區可以被一個或多個基團取代，所述取代基選自羥基、氨基、滷素和硝基，或其它不影響分子鏈的構象和彈性的基團。最優選的是，間隔區部分是取代或未取代的烷烴鏈。典型的是，該間隔區是具有下述結構的非取代烷烴鏈-CH2(CH2)nCH2-其中n是1-5的整數，通常是2或3。
適當的藥學可接受的鹽包括酸加成鹽和胺基酸加成鹽，酯和醯胺，在合理的收益/風險比例範圍內，具有藥學上的效果，與動物組織接觸不存在毒性、刺激性、過敏性反應。代表性的鹽包括鹽酸鹽、硫酸鹽、重硫酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、草酸鹽和硼酸鹽。這些鹽可以通過例如是將相應的酸與通式I的化合物，或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物混和而製備。該鹽可以包括鹼金屬或鹼土金屬陽離子例如鈉、鈣、鎂和鉀，以及銨鹽和胺陽離子。適當的藥學可接受的鹽的例子在下述文獻中有記載S.M Berge等人的J.PharmaceuticalSciences(1997)，661-19，其內容全文引用於此作為參考。有代表性的酯包括C1-C7的烷基酯、苯基酯和苯基(C1-6)烷基酯。優選的酯包括甲酯。
通式I和通式III的化合物，或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑及其類似物的前藥，包括那些選自碳酸鹽、氨基甲酸酯、醯胺和烷基酯的組，其共價的與化合物、二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑及其類似物的自由氨基、醯氨基、羥基或羧基基團相連接。適宜的前藥還包括磷酸鹽衍生物如酸、酸的鹽或酯，通過磷氧鍵與自由羥基或其它通式I或通式III的化合物，或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑及其類似物相連接。前藥在施用時可以是非活化的，其在體內通過修飾成為能夠結合發動蛋白而產生活性的化合物，如抑制蛋白的GTP酶活性，方式可以是在施用後鍵的裂解或水解，或其它的方式。優選的是，活性化合物的前藥形式具有比活性化合物更強的細胞膜滲透性能，能夠增強活性化合物的效能。前藥還可能設計成體內水解時在細胞外部避免過早發生效力的形式，如為達到最佳細胞作用效果及化合物的全身性應用的適當的細胞膜滲透性能。
細胞內攝作用是各種人群疾病的直接或主要的原因。一類特定的小囊泡運輸性疾病已經公布，參見Aridor and Hannan 2000，Traffic1836-851 and Aridor and Hannan 2002，3781-790，這些文獻全文引用於此作為參考。因此，本發明的方法能夠用於預防或治療癌症、眼科疾病、免疫缺陷病、胃腸道疾病、病毒及細菌感染、其它致病性感染、神經變性疾病、神經系統的疾病和腎病和病症，以及其它涉及發動蛋白依賴性細胞內攝作用的疾病，或對發動蛋白依賴性細胞內攝作用的抑制作用敏感的疾病。
例如，眾所周知，人類多瘤病毒JCV是進行性多灶性白質腦病的致病體，該病是一種致命的中樞神經系統(CNS)脫髓鞘疾病，該致病體對神經元的入侵，由細胞內攝作用抑制劑所阻斷，此種抑制劑的例子如氯丙嗪(Atwood W.，2001)。類似地，HIV感染(Wyss S.et al.，2001)，流感病毒(Roy A.，et al.2000)以及腺伴隨病毒(Duan D.etal.，1999)是通過細胞內攝作用起效的，其對細胞內攝作用抑制劑敏感。
另外，生長因子受體(如E(GF-R)需要發動蛋白進行細胞內化並維持通過指令的細胞生長(Seto E.et al.，2002)。通過阻斷髮動蛋白的細胞內攝作用來阻止細胞增殖有許多實例(Grieb T.etal.，2000)並且提供了證據，即發動蛋白II(非神經元形式)抑制劑具備抗癌活性。Dent′s疾病(多囊性腎病)也涉及C1C-5氯化物途徑的細胞內攝作用，並且細胞內攝作用阻斷劑阻止細胞內攝(Schwake M.etal.，2001)。
發動蛋白是所有從細胞表面、高爾基體、內含體和線粒體進行內攝運輸的核心。一些神經變性疾病與這些運輸通道有關。兩個涉及到β-澱粉狀蛋白的產生的形式被稱為內攝作用和分泌途徑(AridorHannan 2000)。在腦部，細胞內攝作用扮演重要角色的疾病和病症包括阿爾茨海默病、亨廷頓氏病(HD)、僵直性症候群、Lewy體病和Niemann-Pick細胞C型病(Cateldo et al.，2001；Metzler et al，2001；Ong et al.，2001；Smith et al.，2000)。
在阿爾茨海默病中β-澱粉狀蛋白的前體蛋白(APP)從軸突細胞表面內攝至包涵素包裹的小囊泡中並在再循環的突觸泡中分揀，轉運至內含體和細胞質中(Marquez-Sterling N.etal.，1997)。內含體是APP或ApoE內攝後發動蛋白依賴性細胞內攝通道的第一個隔室(Smythies J.，2000)並且在阿爾茨海默病病人的腦中的錐形神經元中有明顯的改變(Cataldo A.et al.，1997)。在APP存在下和β-澱粉狀蛋白形成時細胞內攝途徑的活性顯著，並且是一些阿爾茨海默病患者腦部易損區域神經元的早期特徵(Cataldo A.et al.，2001)。
亨廷頓氏病(HD)是一種神經變性疾病，主要影響紋狀體神經元，雖然突變體基因產物亨廷頓不是腦中特有的物質。亨廷頓強烈作用於亨廷頓作用蛋白1(HIP1)的同族成員。亨廷頓-HIP1的相互作用受到腦的限制，並其影響與亨廷頓的聚穀氨醯胺長度成反比。正常亨廷頓-HIP1的缺失會導致腦中膜細胞支架的完整性的缺損。HIP1是發動蛋白介導的細胞內攝裝置的基本組成(Metzler M.et al.，2001)。因此，大量的報導都是關於細胞內攝異常的HD神經缺損的(Aridor Hannan，2000；Metzler M.etal.，2001)。
另一個例子是突觸前瘢痕形成蛋白(synuclein protein)，該蛋白是Lewy體病病因的笫一候選因素，包括帕金森氏病、Lewy體痴呆和Lewy體AD變異。外源性瘢痕形成由於細胞內攝作用和胞漿內包涵物的形成而引起神經細胞死亡。細胞死亡和α-瘢痕聚集是人成神經細胞瘤細胞內攝作用的直接結果(Sung J.et al.，2001)。細胞內攝作用還涉及到癲癇的發生。例如，靶向斷裂雙側內攝蛋白synaptojanin(SJ)及兩棲植物內攝蛋白的大鼠降低了SVE並死於癲癇的發作(DiPaolo et al.，2002)，顯示其在神經元興奮性上的作用並與癲癇有關聯。
細胞內攝的途徑也會被病毒、毒素和共生的微生物所利用以進入細胞。例如，肉毒桿菌神經毒素和破傷風神經毒素都是細菌蛋白，能夠抑制特異突觸的遞質釋放，並引起兩種嚴重的神經性麻痺疾病，破傷風和肉素桿菌申毒。它們的行為依賴於其向神經末梢的細胞內攝作用(Humeau et al.，2000)。因此，靶向的細胞內攝作用的抑制可用於臨床。
因此，本發明的方法應用的預防或治療的特定疾病包括但不限於多灶性白質腦病、多囊性腎病、β-澱粉樣蛋白相關的疾病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、僵直症候群、Lewy體病、Lewy體衰(dimentias)、帕金森氏病、癲癇、破傷風、肉毒桿菌中毒、HIV感染、流行性感冒和粘脂病。
優選的是，本發明施用於哺乳動物的通式I的化合物是二聚的benzylidenemalonitrile酪氨酸磷酸化抑制劑或其前藥。最優選的是，二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑是二-酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物。已知二-酪氨酸磷酸化抑制劑或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑的特徵和/或基團能夠提供結合發動蛋白的能力並抑制發動蛋白的活性，其類似物更具體地說模擬物可以設計成結構不同，而活性能夠保留。本文所述方法中二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑類似物和特定的二-酪氨酸磷酸化抑制劑類似物的應用也包括在本發明當中。
術語「類似物」包括分子結構不同於二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑但保持了一個或多個二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑的生物學性能或活性特徵的相似。類似物具有基本上與二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑完全相似的結構特徵，或包括一個或多個二聚酪氨酸磷酸化抑制劑提供生物學性能或活性特徵的區域，或其另涉及提供生物學性能或活性。二-酪氨酸磷酸化抑制劑的類似物可以通過在化合物的一個或兩個芳香基團上以其它適當的基團或許多不同的合適基團取代一個或兩個羥基取代基而得到。另外，化合物的一個或多個基團也可以被消去、修飾或替換。
類似物的設計典型的包括確定原始化合物的物理性質，如分子大小、電荷分布和三級結構和/或鑑定化合物是否保留結合發動蛋白的能力。特別是，原始的化合物要考慮其立體化學結構和利用x-射線衍射、核磁共振以及商購計算機設計軟體確定的物理性質。優選的是，模型應考慮化合物與發動蛋白的相互作用，由於相互作用引起的構象的任何變化都應當在類似物設計時加以考慮。這樣的模型設計技術是公知的技術，是在普通技術人員能夠知曉的範圍內。適宜的模擬技術包括Accelrys Catalyse_Pharmacore Development和AccelrysCerius 4.8 LigandFit_ protocols(Accelrys Inc.，San Diego，California，USA)的應用。更為適宜的模擬技術包括MacSpartan ProVersion 1.1 protocols(Wave Function Inc，Irvine，California，USA)的應用。
類似物還可以選擇或衍生自模板分子，其上含有化學基團，可提供分子所需的物理化學性質，或者是為得到所需的物理化學性質便利的化學反應。模板分子和化學基團的選擇是基於化學合成的容易程度，在體內降解的潛在危險，穩定性和在施用後保持生物學活性的能力。技術人員容易理解的是，藥學上可接受性等也同樣在設計中加以考慮。
根據本發明施用的化合物可以和一種或多種其它化合物或藥用一同施用。例如，一個化合物可以與化學療法藥物聯合或結合共同給予哺乳動物，所述化學療法藥物是常規的用於預防或治療特定的哺乳動物疾病或病症的藥物。術語「共同給予」意思是以同樣的劑型或兩種不同的劑型以相同或不相同的途徑同時給藥，或以相同或不相同的途徑順序給藥。術語「順序給藥」意思是在一定的時間間隔內化合物和其它藥物順序給予，時間間隔從很短的時間至幾個小時或是幾天。
適宜的藥物組合物包括適於注射的溶液劑。這樣的可注射的組合物是具有注射能力的流體，典型的是在生產後能夠至少貯存幾個月保持穩定。載體可以是溶劑或分散介質，包括一種或多種表面活性劑、生理鹽水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態聚乙二醇等等)、植物油和它們的混和物。
對於口服給藥，化合物可以加入適於口服的惰性稀釋劑、可同化的食用載體配製，或者例如包封於硬制或軟制的明膠膠囊中。可選擇的，可以直接加入到食物當中。而且，化合物可以與一種或多種賦形劑、崩解劑共同給予，賦形劑的例子是磷酸二鈣，崩解劑的例子是玉米澱粉、土豆澱粉或海藻酸，劑型可以是可吸收的片劑、口含片、糖錠、膠囊、酏劑、混懸劑和糖漿劑。
片劑、丸劑等還可以含有一種或多種粘合劑、潤滑劑、甜味劑和芳香劑，粘合劑的例子是西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠，潤滑劑的例子是硬脂酸鎂，甜味劑的例子是蔗糖、乳糖、糖精。當劑型是膠囊時，除了一種或多種上述成分還可以含有液體載體。多種其它成分可以存在於包衣中。另外，化合物可以存在於任何適當的持續釋放的劑型當中。
化合物可以典型的配製成為特定個體給藥的含有藥學可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。任何確信的常規載體稀釋劑和賦形劑都可以使用。適宜的藥學可接受的載體和賦形劑包括公知的溶劑、分散介質和等滲溶液。這些成分和介質的藥用是公知的。典型的是，本發明的組合物還可以結合一種或多種防腐劑，如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸和thimersal。用於本發明組合物的適當的藥學可接受載體和製劑的例子在常規的手冊或教科書當中都有描述，例如「RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy(MackPublishing Co.，1995)」，該文獻的內容全文引用於此作為參考。
特別優選的劑型是單元劑型的非胃腸道組合物，其容易給藥且劑量均勻。這裡的單元劑型指的是給予患者適度的單元劑量，每一單元含有預定量的經計算能夠產生需要的預防或治療效果的活性物質，和選擇的載體和/或賦形劑。
化合物的劑量依賴於許多因素，包括化合物的預防或治療目的、給藥的條件、病症的嚴重程度、患者的年齡以及其它一些相關因素，比如體重和一般由醫師和護理人員按通常的原則確定的健康狀況。例如，可以在最初給予低劑量，而後在評估患者的反應後再逐漸增加。類似地，給藥的頻率也可以用相同的方法確定，即在每次給藥之間連續監測患者的反應，如果需要的話，可增加給藥的頻率，或減低給藥的頻率。
藥物組合物給藥途徑也依賴於將給予組合物的疾病或病症的本質。適當的給藥途徑包括但不限於呼吸系統、氣管內、鼻腔內、靜脈、腹膜內、皮下、真皮內、肌內、輸注、口服、經直腸、局部及緩釋植入。對於靜脈給藥途徑，特別適合的是注射入腫瘤或特定治療的器官的血管內。化合物還可以釋放至體腔中，例如胸膜腔或腹膜腔內，或直接注射至腫瘤或患病組織中。
為了更好地理解本發明，將藉助以下非限定性的實施例描述本發明的優選形式。
實施例1發動蛋白GTP酶活性的酪氨酸磷酸化抑制劑的抑制作用的鑑定1.1材料和方法磷脂醯絲氨酸、1，2-甘油二油酸酯、鈣調節素、ATP、GTP、亮肽酶素、苯甲基磺醯氟化物、吐溫80、二(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸鹽(BS3)和穀胱甘肽瓊脂糖得自Sigma。木瓜蛋白酶和抗痛素二鹽酸化物得自Boehringer Mannheim(德意志聯邦共和國)。凝膠電泳試劑和裝置來源於Bio-Rad。 (3000 Ci/mmol)和 (25μCi/mmol)得自Amersham plc，UK。蛋白質分子量標記器和色譜樹脂來源於Pharmacia。所有其它試劑都是分析純級或更好的。
1.1.1蛋白質的製備GST-Amph2-SH3(肌肉Amph2)(Butler et al.，1997)的質粒由Pieto DeCamilli，Yale，Conneticut，USA提供，置於pGEX2T載體中。質粒在大腸桿菌中生長，GST-Amph2-SH3融合蛋白在穀胱甘肽(GSH)-瓊脂糖中通過洗脫進行純化，洗脫液為10mM還原型GSH的20mM Tris-HCl溶液，pH7.5，在不含有GSH的相同緩衝液中透析，並在4℃保存。從綿羊腦中純化發動蛋白，方法是從整個腦的周邊膜部分進行提取(Robinson et al.，1993)並如先前所述的在GST-Amph2-SH3-瓊脂糖進行純化(Marks and McMahon.，1998)，從250g綿羊腦中得到8mg蛋白質。重組發動蛋白II在昆蟲細胞中表達，並得自Dr Sandra Schmid(Scripps，San Diego，CA)。缺少PH區域的重組發動蛋白I(發動蛋白PH，得自Robin Scaife)通過顆粒病毒感染在昆蟲細胞中表達(Salim et al.，1996)。
1.1.2 GTP酶的檢測發動蛋白GTP酶的活性是通過水解 確定的，方法基本是先前所描述的方法(Robinson et al.，1993)。簡單地說，純化的發動蛋白I或發動蛋白II(0.2μg/管)在GTP酶緩衝液(10mM Tris，10mM NaCl，2mM Mg2+，0.05％吐溫80，pH7.4，1μg/ml亮肽酶素和0.1mM PMSF)和含有0.3mM GTP和1.3 Ci 尾酒中在30℃下培養10分鐘，條件是含或不含不同濃度的抑制劑或DMSO介質。最終檢測體積為40μl。發動蛋白活性在基線及加入5μg/ml的L-磷脂醯絲氨酸的磷脂應激下測定。反應用100μl的GTP酶終止緩衝液(2％甲酸，8％乙酸，pH1.9)終止，而後加入600μl酸洗過的炭溶液(7％炭的酸性溶液(w/v))和100μl BSA(5mg/ml)。離心分離5分鐘後，(室溫下13,000rpm)，上層液取200μl在計數器中計數，計數從 的釋放的32Pi。
1.1.3[α-32P]-GTP結合的檢測[α-32P]-GTP結合的檢測是在96-孔微板上完成的。發動蛋白(O.2μg/孔)加入到GTP酶緩衝液中，在4℃下黑暗處培養10分鐘。[α-32P]-GTP(2μCi/管)隨後加入到反應體系中，在4℃下黑暗處進一步培養10分鐘。微板隨後用短波長的紫外燈在315nm下照射30分鐘，照射範圍為8cm。照相標識的專屬性通過比較存在或不存在1mM冷的GTP的標識加以確定。樣品隨即用抽吸法通過24孔板施用於硝基纖維素膜上。硝基纖維素用PBS洗三遍，乾燥。聯合核苷酸通過磷光計加以測定(分子動力學)。
1.1.4磷脂結合和螺旋組合純化於綿羊全腦的發動蛋白I(50μg/ml)與磷脂醯絲氨酸脂質體(80μg/ml，在30mM Tris/HCl pH7.4中聲處理)一起在100μl組裝緩衝液(1mM EGTA，30mM Tris，100mM NaCl，1mM DTT，1mMPMSF，和完全蛋白酶抑制劑雞尾酒片劑(Roche))中培養，條件是存在或不存在1mM Mg/GTP，溫度25℃，時間一小時。樣品在14,000rpm離心處理15分鐘以分離脂類物質結合(P)和游離(S)的發動蛋白以及用凝膠電泳在12％SDS聚丙烯醯胺凝膠下分析的餾分。存在時，藥物(10μM和100μM)與磷脂在與發動蛋白I培養之前預混。
1.1.5德克薩斯紅-鐵傳遞蛋白在細胞中的攝取鐵傳遞蛋白(Tf)的攝取通過用先前描述過的方法(van derBliek et al.，1993)在Swiss 3T3和HER14細胞上加以分析。簡單地說，細胞置於在DMEM介質中加入10％胎牛血清中，有60％的融合，細胞首先在不含胎牛血清的DMEM培養過夜(8-10小時)。德克薩斯紅-鐵傳遞蛋白(Tf-TxR，Molecular Probes，Oregon)加入得到最終濃度為5μg/ml，細胞在37℃下培養10分鐘。細胞表面的染色通過將細胞在冰浴酸洗的溶液(0.2 M乙酸+0.5M NaCl，pH2.8)中培養15分鐘後去除。細胞快速地用4％的低聚甲醛固定10分鐘，用PBS洗三次。細胞核用DAPI(Molecular Probes，Oregon)染色。用DABCO裝載玻片，用Leica DMLB明視野顯微鏡和SPOT數字式照相機檢測螢光。在用抑制劑的實驗中，在加入Tf-TxR的15或60分鐘前，用DMEM補充二-酪氨酸磷酸化抑制劑。
1.1.6細胞內攝作用分離的神經末梢(突觸體)通過間斷矽石膠懸浮液梯度離心分離(Dunkley et al.，1986)得自大鼠的大腦皮層。餾份3和4混合併用於所有的實驗。應用先前描述的攝取螢光染料FM2-10的方法(Cousin and Robinson 2000a)測定細胞內攝作用。突觸體(0.6mg/2ml)在37℃下加或不加Ca2+Krebs氏溶液的情況下進行培養5分鐘。在用30mM KCl(S1)刺激的前1分鐘加入FM2-10(100M)。在FM2-10被囊泡經內攝作用在S1刺激期內攝取時，突觸體在該期間與拮抗劑一起培養。特別地，突觸體和酪氨酸磷酸化抑制劑A47或二-酪氨酸磷酸化抑制劑在刺激前一起培養5分鐘。刺激後2分鐘，突觸體加入含有1mg/ml的胎牛血清的Ca2+溶液洗兩遍。洗滌步驟去除了沒有攝取的FM2-10和酪氨酸磷酸化抑制劑。洗滌過的突觸體加入Ca2+溶液在37℃下再懸浮，轉移至螢光容器中並用標準的30mM KCl(S2)激活。標準的S2激活釋放全部聚積的FM2-10，並通過染料釋放進入溶液而導致的FM2-10螢光的減少測定內攝作用(激發在488nm，發射在540nm)。
細胞內攝作用的計算是通過用30mM KCl在S2期間螢光應激的減少完成的。顯示的標記表示FM2-10從突觸體釋放的平均值減去不含Ca2+的FM2-10的突觸體背景標記的值。回收效能由於考慮到外排作用而能進行更精確的對細胞內攝進行測量。回收效能的計算為內攝/外排，其中內攝作用的定義同上，外排作用是在應激後2分鐘Ca2+依賴的穀氨酸的釋放。回收效能值對30 mM KCl規格化為比率1.0。
1.1.7穀氨酸釋放檢測穀氨酸釋放檢測是應用穀氨酸釋放的酶聯螢光檢測(Cousin andRobinson.，2000a，b)完成的。簡言之，突觸體(0.6mg/2ml)在37℃下加(1.2mM CaCl2)或不加(1mM EGTA)Ca2+Krebs氏溶液(118.5mM NaCl，4.7mM KCl，1.18mM MgCl2，0.1mM Na2HPO4，20mM Hepes，10mM葡萄糖，pH 7.4)的情況下進行再懸浮。實驗是在加入1mM NADP+後開始的。1分鐘後加入50U穀氨酸脫氫酶，突觸體懸浮液4分鐘後用30mM KCl激活。由於產生NADPH而導致螢光的增加通過Perkin-Elmer LS-50B螢光分光光度計在340nm激活和460nm發射的條件下加以測定。實驗通過加入4nmol穀氨酸標準化。數據表示Ca2+-依賴性穀氨酸的釋放，通過在相同應激條件下加或不加Ca2+溶液的差異計算。在使用抑制劑的實驗中，在用KCl應激前突觸體和酪氨酸磷酸化抑制劑A47或二-酪氨酸磷酸化抑制劑預孵化5分鐘。
1.1.8電子顯微鏡檢查突觸體在包括1.2mM Ca2+的Krebs氏溶液中培養5分鐘，然後用30mM KCl刺激2分鐘。突觸體用100μM二-酪氨酸磷酸化抑制劑預孵化5分鐘，在加入KCl前。刺激後，突觸體在微真菌中丸化1分鐘，條件是在室溫，然後在冰浴的含有5％的戊二醛的磷酸緩衝鹽下再懸浮加以固定。1小時後，在室溫下低速(2500rpm)離心5分鐘使突觸體小丸鬆散。小丸用MOPs緩衝液以低速旋轉(2500rpm)方式7分鐘共洗滌三次，然後在10％牛血清白蛋白(BSA)的水溶液中再懸浮，在室溫下穩定20分鐘。突觸體然後再在低速下(2500rpm)離心7分鐘，用Karnovsky′s固定劑覆蓋並在4℃下培養過夜。小丸隨即漂洗，並在四氧化鋨緩衝溶液中固定3小時。突觸體然後再漂洗，並在2％的水性乙酸雙氧鈾中染色1小時，之前連續洗滌10分鐘並乾燥，所用的溶液是50％乙醇加0.1％NaCl；70％乙醇加0.1％NaCl；95％乙醇加0.1％NaCl，100％乙醇加0.1％NaCl兩次及100％丙酮兩次。然後用丙酮/樹脂混和液(1∶1)浸潤1小時，在70℃下用10分鐘時間用Spur′s環氧樹脂洗滌3次，再植入裝填Spur′s環氧樹脂的器皿中在70℃下保持10小時。
超薄切片機Ultracut-E(Reichert，Germany)用於得到0.5m的環氧樹脂。切割使用金剛石刀具(Diatome，Switzerland)，在水滴中懸浮，置於電子顯微鏡網格並雙重染色先用2％乙酸雙氧鈾的乙醇溶液15分鐘，再在Reynold′s檸檬酸鉛中4分鐘。網格用水洗滌，用濾紙吸乾，並保存至電子顯微分析開始時。分析是在Phillips1L-BioTwin(Einhoven，Netherlands)電子顯微鏡上進行的，圖片印製在電子顯微鏡平板膠片上(Kodak，4489，8.3cm×10.2cm)。
1.2結果1.2.1二-酪氨酸磷酸化抑制劑抑制發動蛋白I和發動蛋白II的GTP酶的活性發動蛋白GTP酶活性在細胞內攝作用中從原生質膜生成囊泡的過程中起著十分重要的作用。為最初找到神經特異性發動蛋白I抑制劑，許多蛋白激酶抑制劑和一些具有高的ATP酶活性位置抑制性能的脂質激酶抑制劑都進行了檢測。這些化合物的選擇是基於一種假設，即ATP酶活性位點類似於GTP酶的活性位點，一些ATP酶抑制劑還可以靶向發動蛋白。所得結果表明具有較低的發動蛋白I GTP酶活性抑制能力的抑制劑可以使用。
一系列酪氨酸磷酸化抑制劑隨即進行評估，其中發現兩個具有抑制能力，一個是酪氨酸磷酸化抑制劑A47(IC50＝100μM)，而最具潛力的抑制劑是二-酪氨酸磷酸化抑制劑，其IC50是2μM(參見附圖1c和1d)。
酪氨酸磷酸化抑制劑A47和二-酪氨酸磷酸化抑制劑進行了測試，以評估其是否特別抑制發動蛋白I，或是還可以影響普遍存在的發動蛋白II。兩藥證明都對發動蛋白II更有效力參見附圖1e和1f)。更為特別地是，酪氨酸磷酸化抑制劑A47顯示對發動蛋白II的IC50為9M而二-酪氨酸磷酸化抑制劑的IC50僅為0.5μM。這說明藥物特別作用於發動蛋白基因產物，可以對細胞內攝作用的藥理控制進行設計。
1.2.2二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47不能阻止發動蛋白I或發動蛋白II與GTP結合為評估二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47在阻止發動蛋白的GTP的水解，對藥物進行檢測，以看其是否能夠對發動蛋白上的GTP活性位點進行競爭。[α-32P]-GTP結合的檢測是通過可見光電子標記的與發動蛋白結合的GTP完成的，其過程含或不含二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47或BIM I(附圖2a-d)。對照組(不含藥物)顯示[α-32P]-GTP結合發動蛋白。在存在藥物二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47，GTP的結合未見減少，但是，在高濃度時，則有明顯增加。特別是酪氨酸磷酸化抑制劑A47，在高濃度時對發動蛋白II的GTP結合有很大的增加。TGP酶抑制劑BIM I還發現能夠競爭結合發動蛋白的GTP，發現了[α-32P]-GTP結合的減少。
這些藥物對GTP在4個小G蛋白(Rab3A，Ras，Arf2，RalA)的活性位點競爭也進行檢測。發現藥物都不影響[α-32P]-GTP對蛋白的結合(沒有顯示數據)。這表明二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47是對發動蛋白的活性特異的，且不對其它同樣存在於神經末梢或細胞中的G蛋白特異。
1.2.3二-酪氨酸磷酸化抑制劑不在發動蛋白I的PH區域起作用為證實二-酪氨酸磷酸化抑制劑是否是經PH區域抑制發動蛋白I的，用缺乏PH區域的重組二-酪氨酸磷酸化抑制劑(ΔPH，發動蛋白I的區域)作對比實驗(附圖3a)。發動蛋白I的PH區域相當於GTP酶活性的負性調節區域，ΔPH區域的發動蛋白I有基本的活性且不受磷脂的影響。結果顯示二-酪氨酸磷酸化抑制劑仍能抑制ΔPH區域的發動蛋白I的超過50％的水解，大約為10μM。說明PH區域不是二-酪氨酸磷酸化抑制劑對發動蛋白I的活性位點，說明二-酪氨酸磷酸化抑制劑一定是對發動蛋白I分子變構位點起抑制作用。然而，BIM I則失去了對缺失PH區域的發動蛋白I的GTP酶活性的抑制作用，說明該藥物是通過PH區域阻止GTP水解的。
發動蛋白與磷脂的相互作用通過誘導相關的發動蛋白螺旋結構的裝配刺激了GTP酶的活性。裝配好的發動蛋白容易地使用簡單的沉澱方法進行檢測，該特徵可用於確定二-酪氨酸磷酸化抑制劑是否調節發動蛋白螺旋裝配或磷脂的相互作用。單獨發動蛋白在檢測中不形成沉澱，保留在上層清液中(附圖3b，行1-2)，但在PS脂質體(行3-4)存在時則大量存在於沉澱顆粒中。有磷脂的結合，發動蛋白螺旋結構的裝配成功，則完全不受10或100μM二-酪氨酸磷酸化抑制劑(行5-12)。加入Mg/GTP進行檢測但不能改變結果。這說明二-酪氨酸磷酸化抑制劑不能阻止與磷脂有關的發動蛋白。因此，二-酪氨酸磷酸化抑制劑對任何變構的位點都抑制發動蛋白GTP酶活性，它還可以在螺旋裝配形成後具有抑制作用。
1.2.4二-酪氨酸磷酸化抑制劑，而不是酪氨酸磷酸化抑制劑A47，能夠抑制發動蛋白I介導的突觸囊泡復原，並在此過程形成發動蛋白I的環螢光測定法用於確定二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47對OVE在群體大鼠的腦神經末梢的影響(突觸體，附圖4)。二-酪氨酸磷酸化抑制劑和A47對細胞外攝作用沒有影響(Ca2+-依賴性穀氨酸的釋放，附圖4a和4b)。二-酪氨酸磷酸化抑制劑(100μM，10分鐘)顯著抑制SVE，而酪氨酸磷酸化抑制劑A47(100μM)則不能(附圖4c和d)。在該檢測中SVE的值取決於先前外排的程度，細胞內攝的抑制可通過計算回收效能加以定量。該參數是細胞內攝的量值除以外排的值的比率(Cousin et al.，2001)。回收效能1表示藥物對細胞內攝沒有影響。酪氨酸磷酸化抑制劑A47的回收效能值為0.95(±0.05)，而二-酪氨酸磷酸化抑制劑是0.7(±0.05，附圖4e)。這說明用二-酪氨酸磷酸化抑制劑能顯著降低SVE。
由於二-酪氨酸磷酸化抑制劑抑制發動蛋白I的GTP酶活性(附圖1)，但不與GTP結合(附圖2)，於是進行研究以確定二-酪氨酸磷酸化抑制劑是否也能在SVE的特定期間捕獲發動蛋白，其中發動蛋白是在突觸囊泡生成的環結構中。休眠狀態的突觸體或在41mM KCl(S1)中10秒一次去極化的突觸體顯示了在電子顯微(EM)下的正常的形態學(附圖5a-b)。神經末梢的特徵為i)平滑的密封的胞漿膜，ii)完全填充小的突觸囊泡中，和iii)總是包含一至三個正常線粒體並偶爾含有突觸體，並與突觸體密度相關。當未刺激的突觸體用二-酪氨酸磷酸化抑制劑處理後，沒有顯示對形態學的任何影響(附圖5a)。然而，對於去極化的，有大量的囊泡的損耗(附圖5b)。一小部分胞漿膜凹陷也進行檢測(附圖5e-f)，說明沒有細胞內攝作用。阻礙TGP水解但不阻礙GTP結合GTP的預測，一定量的捲曲的核出現，囊泡的頸部清晰地被濃厚的頸圈環繞著(附圖5c，d，g和h)。
1.2.5二-酪氨酸磷酸化抑制劑阻斷髮動蛋白II介導的受體介導的向Swiss 3T3和HER14細胞的轉鐵蛋白的細胞內攝作用轉鐵蛋白通過受體介導的細胞內攝過程轉運至細胞內，該過程是由發動蛋白II介導的。檢測二-酪氨酸磷酸化抑制和酪氨酸磷酸化抑制劑A47對轉鐵蛋白內攝至非神經細胞的影響(附圖6)。對照細胞顯示大比例的細胞質染色(表a和e)，這表明轉鐵蛋白內攝進入了細胞。細胞核用DAPI染成藍色，表示了細胞體的位置(表b，d，f和h)。加入二-酪氨酸磷酸化抑制劑，會觀察到大量的轉鐵蛋白染色的減少。酪氨酸磷酸化抑制劑A47也會有這樣的效果，雖然不是象二-酪氨酸磷酸化抑制劑那樣顯著(未顯示)。還發現抑制作用是濃度依賴性的。介質DMSO對轉鐵蛋白內攝沒有作用。
1.3討論由於首先證明了果蠅突變體染色shibire，阻斷髮動蛋白以及神經末梢細胞內攝作用導致了多數SVs的耗損。由於大量的SVs具有神經末梢的形態學特徵，其損耗是很明顯的。而且，胞漿膜的形態眾所周知可提供明顯的證明說明細胞內攝的阻斷確實發生了。二-酪氨酸磷酸化抑制劑減少了多數SVs的神經末梢並產生少量的胞漿膜上的凹陷的囊泡，帶有清晰的發動蛋白的圈或環。這樣的結果顯示環修飾且開環之前的二-酪氨酸磷酸化抑制劑的活性位點。但是，令人驚奇的是，發動蛋白頸圈是很少見的。這種複雜的情形說明二-酪氨酸磷酸化抑制劑阻斷的是另一個位點，提示發動蛋白GTP酶的活性在SVE的機理中存在兩個顯著不同的位點。
三個發動蛋白基因產物可以介導至少三種形式的細胞內攝作用。發動蛋白I介導SVE，發動蛋白II介導RME，發動蛋白III介導後突觸脊柱處的細胞內攝(Gray et al.，2003)。進一步的作用機理已知公知。發動蛋白這種有差異的抑制作用給了這些細胞功能的鑑別能力。特別是，選擇性抑制劑是非常重要的識別不同類型的細胞內攝作用的工具，並對基於不同形式的細胞內攝作用的病理靶向具有臨床意義。
該結果進一步說明二-酪氨酸磷酸化抑制劑(BisT或AG537)抑制發動蛋白I和II的GTP酶活性，並均阻斷神經末梢(突觸體)的SVE以及轉鐵蛋白向3T3或HER14細胞的內攝的RME。其活性位點不是GTP結合位點，也不是PH區域，所以它是變構體的抑制劑。由於它不影響GTP的結合，故也不影響發動蛋白裝配成環。這便形成了裝配後靶向的發動蛋白的獨特工具。二-酪氨酸磷酸化抑制劑原先發現能夠抑制EGFR-TK(IC50＝0.4M)和EGF-依賴性細胞增殖(IC50＝3M)(Gazit etal.，1996)。因此，可設計保持發動蛋白抑制活性但失去對EGFR酪氨酸激酶作用的類似物(由於酪氨酸激酶的特定決定因素已是公知，Gazit et al.，1996)。
實施例2酪氨酸磷酸化抑制劑類似物的研製 二-酪氨酸磷酸化抑制劑(1)和酪氨酸磷酸化抑制劑A47(2)2.1類似物的研製二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47的結構如上所示。這些3，4-二羥基苯的化合物結構的相似性及氨腈或硫代醯胺結構的存在說明這些基團對於發動蛋白抑制作用非常重要。這些特徵可以解決程序庫研製合成的問題，並有兩個程序庫用於確定決定活性的芳香取代基的類型和數量，對稱合成(1vs2)的需要以及位於二-酪氨酸磷酸化抑制劑的兩個氨基部分間的中心烷烴間隔長度的重要性這些程序庫稱為程序庫1(二聚化合物)和程序庫2(非對稱單聚化合物)。
2.2程序庫類似物的合成Knoevenagel化學的簡單應用和一系列適當的α，w-二胺快速地以很好的收率給予所需要的程序庫(方案1)產品。
方案1程序庫1的合成。R1-R5取代基和烷基間隔n如下表2中所定義這種應用可以依據烷基間隔的n＝1-5快速生成程序庫1的5個產物。發動蛋白I的GTP酶活性的最初的生物學篩選是在100μM下進行的。更多的類似物隨後在一定範圍的濃度下進行篩選，以確定它們的IC50值(表2)。在合成的80個類似物中發現小於等於100μM的IC50值的物質有顯著的抑制作用。R1-R5取代基的定義如下表1中所述。
2.3二聚酪氨酸磷酸化抑制劑的合成2.3.1一般介紹所有原料購自Aldrich Chemical Company和LancasterSynthesis。1H和13C色譜在Bruker Advance AMX 300 MHz分光計上分別在300.1315和75.4762MHz下記錄。相對於TMS的化學位移作為內標。
2.3.2合成方法化合物5a2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-乙基]-乙醯胺乙二胺(3a)(1.5g，25mmol)和甲基氰基乙酸鹽(5g，50mmol)在室溫下攪拌兩個小時。得到的白色固體隨即與10ml乙醇混合，過濾收集。用乙醇重結晶得到白色固體，6.3g(81％)。mp 182℃(Lit 183℃)29。
1H NMR(DMSO)8.25(2H，t，J＝5.5Hz)，3.56(4H，s)，3.13(4H，br s)。
13C NMR(DMSO)162.31，115.96，38.41，25.25。
化合物5b2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-丙基]-乙醯胺丙基二胺(3b)(2.2g，30mmol)和甲基氰基乙酸鹽(6.4g，65mmol)在室溫下攪拌兩個小時。得到的白色固體與20ml乙醇混合。過濾收集。用乙醇重結晶得到4.995g白色固體(81％)。mp146℃(Lit148℃)29。
1H NMR(DMSO)8.21(2H，t，J＝5.5Hz)，3.59(4H，s)，3.07(4H，q，J＝6.7Hz)，1.53(2H，quin，＝6.7Hz)。
13C NMR(DMSO)162.45，116.64，39.28，28.90，25.67。
化合物5c2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-丁基]-乙醯胺1，4-二氨基丁烷(3c)(3g，34mmol)和甲基氰基乙酸鹽(7g，70mmol)在室溫下攪拌兩個小時得到白色固體。固體與乙醇(10ml)混合，過濾收集固體。用乙醇重結晶得到白色固體，5.995g(78％)。mp145℃(Lit 145℃)。
1H NMR(DMSO)8.15(2H，t，J＝5.5Hz)，3.56(4H，s)，3.05(4H，br s)，1.38(4H，br s)。
13C NMR(DMSO)161.84，116.09，38.63，26.07，25.17。
化合物5d2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-戊基]-乙醯胺1，5-二氨基戊烷(3d)(2g，20mmol)和甲基氰基乙酸鹽(3.9g，40mmol)在室溫下攪拌兩個小時，得到白色固體。固體與乙醇(10ml)混合，過濾收集。用乙醇重結晶得到白色固體，4.62g(98％)。mp 125℃(Lit 125℃)1H NMR(DMSO)8.14(2H，t，J＝5.4Hz)，3.55(s，4H)，3.03(4H，q，J＝6.4Hz)，1.39(4H，quin，J＝7Hz)，1.23(2H，quin，＝7Hz)。
13C NMR(DMSO)161.79，116.11，38.84，28.26，25.17，23.43。
化合物5e2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-己基]-乙醯胺1，6-二氨基己烷(3e)(3g，26mmol)和甲基氰基乙酸鹽(6g，60mmol)在室溫下攪拌兩個小時，得到白色固體。固體與乙醇(10ml)混合，過濾收集。用乙醇重結晶得到白色固體，6.2g(95％)。mp141℃(Lit 140℃)1HNMR(DMSO)8.15(2H，t，J＝5.5Hz)，3.56(4H，s)，3.04(4H，q，J＝6.1Hz)，1.37(4H，quin，J＝5.9Hz)，1.24(4H，brs)。
13C NMR(DMSO)161.76，116.12，38.85，28.58，25. 82，25.16。
化合物92-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基苯基)丙烯醯氨基]-乙基}-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基-乙醯氨基)-乙基]-乙醯胺(5a)(0.3g，1.5mmol)，3，4-二羥基苯甲醛(0.42g，3mmol)，3滴哌啶和乙醇(10ml)回流2小時。冷卻，過濾並用冷的乙醚(10ml)洗滌，得到黃綠色固體，0.54g(81％)。mp290℃(Lit 295℃)1H NMR(DMSO)8.32(2H，t，J＝5.5Hz)，7.92(2H，s)，7.53(2H，d，J＝2.1 Hz)，7.25(2H，dd，J＝8.2，2.1Hz)，6.85(2H，d，J＝2.1Hz)，3.45(4H，brs)。
13C NMR(DMSO)162.50，151.63，161.61，146.22，125.76，123.45，117.65，116.53，116.31，100.85，39.60。
化合物102-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯醯氨基]-乙基]-3-(3 4，5-三羥基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基-乙醯氨基)-乙基]-乙醯胺(5a)(0.056g，0.3mmol)，3，4，5-三羥基苯甲醛(0.1g，0.65mmol)和1滴哌啶和乙醇(2mL)回流1小時。冷卻，過濾並用冷的乙醇(10mL)洗滌，得到桔黃色固體，0.11g(82％)。mp＞300℃1H NMR(DMSO)8.29(2H，t，J＝5.5 Hz)，7.79(2H，s)，6.99(4H，s)，3.32(4H，brs).
13C NMR(DMSO)162.15，150.7，145.96，140.24，121.26，117.30，109.97，99.76，39.40.
化合物112-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基-4-甲氧基苯基)-丙烯醯氨基]-乙基-3-(3，4二羥基-5-甲氧苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基-乙醯氨基)-乙基]-乙醯胺(5a)(0.06g，3mmol)，3，4-二羥基-5-甲氧基苯甲醛(0.1g，0.6mmol)，1滴哌啶和2mL乙醇回流2小時。冷卻，過濾並用冷的乙醇(5mL)洗滌，得到桔黃色固體，0.101g(66％)。mp 274℃1H NMR(DMSO)8.34(2H，t，J＝5.5Hz)，7.93(1H，s)，7.20(2H，d，J＝1.92Hz)，7.13(2H，d，J＝1.92Hz)，3.77(6H，s)，3.35(4H，br s).
13C NMR(DMSO)161.90，150.85，148.03，145.83，139.90，121.76，117.20，111.09，107.20，100.83.
化合物222-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯醯氨基]-丙基}-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-丙基]-乙醯胺(5b)(0.3g1.4mmol)，(0.4g，2.8mmol)3，4-二羥基苯甲醛，3滴哌啶和10mL乙醇回流兩個小時。冷卻，過濾並用冷的乙醚(10mL)洗滌，得到黃綠色固體，0.55g(85％)。mp 274℃(Lit 277℃)1H NMR(DMSO)8.24(2H，t，J＝5.5Hz)，7.92(s，2H)，7.52(2H，d，J＝2.1Hz)，7.26(2H，dd，J＝8.2，2.1Hz)，6.85(2H，d，J＝8.2Hz)，3.23(4H，q，J＝6Hz)，1.70(2H，quin，J＝6.7Hz).
13C NMR(DMSO)161.50，150.60，150.50，125.10，123.21，117.10，116.00，115.80，100.50，37.27，28.82.
化合物232-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯醯氨基]-丙基}-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-丙基]-乙醯胺(5b)(0.06g0.29mmol)，3，4，5-三羥基苯甲醛(0.1g，0.58mmol)，1滴哌啶和乙醇(10mL)回流2小時。冷卻，過濾並用冷的乙醇(10mL)洗滌，得到桔黃色固體，0.097g(70％).Mp＞300℃(Lit＞300℃)1H NMR(DMSO)8.18(2H，t，J＝5.5Hz)，7.78(2H，s)，6.99(4H，s)，3.21(4H，q，J＝6.8Hz)，1.68(2H，quin，J＝6.8Hz).
13C NMR(DMSO)161.80，150.70，145.95，140.30，121.22，117.30，109.90，99.50，38.20，28.90.
化合物242-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基-5-甲氧基苯基)-丙烯醯氨基]-丙基}-3-(3，4-二羥基-5-甲氧基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-丙基]-乙醯胺(5b)(0.3g 1.4mmol)，0.44g3，4-二羥基-4-甲氧基苯甲醛，3滴哌啶和乙醇(10mL)回流兩個小時。冷卻，過濾並用冷的乙醇(5mL)洗滌得到桔黃色固體，0.31g(42％).mp＞300℃1H NMR(DMSO)8.35(2H，t，J＝5.4Hz)，7.95(2H，s)，7.21(2H，d，J＝1.9Hz)，7.12(2H，d，J＝1.9Hz)，3.21(4H，q，J＝6.8Hz)，1.71(2H，quin，J＝6.8Hz).
13C NMR(DMSO)161.30，150.61，147.20，145.30，121.04，117.60，110.60，107.65，98.71，38.35，28.88.
化合物352-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯醯氨基]-丁基}-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-丁基]-乙醯胺(5c)(0.3g，1.35mmol)，3，4-二羥基苯甲醛(0.37g，2.7mmol)，3滴哌啶和乙醇(10mL)回流兩個小時。冷卻，過濾並用冷的乙醚(10mL)洗滌，得到黃色固體，0.61g(97％)。mp 281℃(Lit 283℃)1H NMR(DMSO)8.25(2H，t，J＝5.5Hz)，7.91(2H，s)，7.53(2H，d，J＝1.9Hz)，7.26(2H，dd，J＝8.3，1.9Hz)，6.85(2H，d，J＝8.3Hz)，3.20(4H，br s)，1.49(4H，br s).
13C NMR(DMSO)161.52，150.86，150.42，145.65，125.23，123.09，117.20，115.81，100.51，39.31.
化合物362-氰基-N{3-[2-氰基-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯醯氨基]-丁基}-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-丁基]-乙醯胺(5c)(0.065g，0.3mmol)，3，4，5-三羥基苯甲醛(0.1g，0.6mmol)，1滴哌啶和乙醇(2mL)回流1小時。冷卻，過濾並用冷的乙醚(5mL)洗滌，得到黃色固體，0.121g(82％)。mp＞300℃(Lit＞310℃)291H NMR(DMSO)8.16(2H，t，J＝5.5Hz)，7.78(2H，s)，6.98(4H，s)，3.19(4H，br s)，1.48(4H，br s).
13C NMR(DMSO)161.70，150.56，145.90，140.20，121.30，117.30，109.90，99.80，39.26，26.37.
化合物372-氰基-N{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基-5-甲氧苯基)-丙烯醯氨基]-丁基}-3-(3，4-二羥基-5-甲氧苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-丁基]-乙醯胺(5c)(0.065g，0.3mmol)，3，4-二羥基-5-甲氧基苯甲醛(0.1g，0.6mmol)，1滴哌啶和乙醇(2mL)回流1小時。冷卻，過濾並用冷的乙醚(5mL)洗滌，得到黃色固體，0.110g(70％)。mp＞300℃1H NMR(DMSO)8.09(2H，t，J＝5.5Hz)，7.86(2H，s)，7.18(2H，d，J＝1.9Hz)，7.10(2H，d，J＝1.9Hz)，3.75(6H，s)，3.19(4H，br s)，1.48(4H，br s)。
13C NMR(DMSO)161.71，150.23，148.70，146.24，120.25，117.51，109.50，106.80，98.81，55.76，39.31，26.64.
化合物482-氰基-N{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯醯氨基]-丁基}-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-戊基]-乙醯胺(5d)(0.2g，0.85mmol)，3，4-二羥基苯甲醛(0.23g，1.7mmol)，3滴哌啶和7mL乙醇回流兩個小時。冷卻，過濾並用冷的乙醚(10mL)洗滌，得到黃色固體，0.36g(90％)。mp 252℃(Lit 248℃)29
1H NMR(DMSO)8.15(2H，t，J＝5.5Hz)，7.85(2H，s)，7.50(2H，d，J＝2.1Hz)，7.20(2H，dd，J＝8.5Hz，2Hz)，6.75(2H，d，J＝8.5Hz)，3.16(4H，q，J＝6.2Hz)，1.50(4H，quin，J＝7.1Hz)，1.28(2H，quin，J＝6.9Hz)。
13C NMR(DMSO)161.85，153.88，150.34，146.28，126.16，121.47，117.70，115.71，114.65，98.40，39.46，28.63，23.73.
化合物492-氰基-N{3-[2-氰基-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯醯氨基]-丁基}-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-戊基]-乙醯胺(5d)(0.068g，0.29mmol)，(0.1g，058mmol)3，4，5-三羥基苯甲醛(0.1g，0.58mmol)，1滴哌啶和2mL乙醇回流1小時。冷卻，過濾並用冷的乙醚(5mL)洗滌，得到黃色固體，0.123g(83％)。mp＞300℃321H NMR(DMSO)8.12(2H，t，J＝5.5Hz)，7.76(2H，s)，6.98(4H，s)，3.16(4H，br s)，1.50(4H，quin，J＝6.8Hz)，1.28(2H，quin，J＝6.7Hz).
13C NMR(DMSO)161.80，150.49，146.11，146.01，141.25，120.69，117.53，109.90，99.12，39.47，28.62，22.30.
化合物502-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基-5-甲氧基苯基)-丙烯醯氨基]-戊基}-3-(3，4-二羥基-5-甲氧基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-戊基]-乙醯胺(5d)(0.069g，0.29mmol)，3，4-二羥基-5-甲氧基苯甲醛(0.1g，0.58mmol)，1滴哌啶和乙醇(2mL)回流一小時。冷卻，過濾並用冷的乙醚(5mL)洗滌，得到黃色固體，0.126g(81％)。mp256℃1H NMR(DMSO)8.09(2H，t，J＝5.5Hz)，7.86(2H，s)，7.18(2H，d，J＝2Hz)，7.10(2H，d，J＝2Hz)3.75(6H，s)，3.17(4H，br s)，1.50(4H，quin，J＝6.8Hz)，1.28(4H，quin，J＝6.9Hz)。
13C NMR(DMSO)161.81，150.50，148.00，146.20，120.05，117.81，110.50，107.80，98.71，55.71，39.41，28.64，22.47。
化合物612-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯醯氨基]-己基}-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-己基]-乙醯胺(5e)(0.3g，1.2mmol)，3，4-二羥基苯甲醛(0.33g，2.4mmol)，3滴哌啶和10mL乙醇回流兩小時。冷卻，過濾並用冷的乙醚(10mL)洗滌，得到黃色固體，0.52g(89％)。mp 263℃(Lit 260℃)1H NMR(DMSO)8.18(2H，t，J＝5.5Hz)，7.89(2H，s)，7.51(2H，d，J＝2Hz)，7.24(2H，dd，J＝2Hz，8.3Hz)，6.83(2H，d，J＝8.3Hz)，3.17(4H，q，J＝6.1Hz)，1.47(4H，quin，J＝6.1Hz)，1.28(4H，br s).
13C NMR(DMSO)161.52，151.18，150.30，145.72，125.22，122.91，117.24，115.80，115.72，100.38，39.48，28.78，25.98.
化合物622-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯醯氨基]-己基}-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-己基]-乙醯胺(5e)(0.073g，0.29mmol)，3，4，5-三羥基苯甲醛(0.1g，0.58mmol)，1滴哌啶和乙醇(2mL)一起回流1小時。冷卻，過濾並用冷的乙醚(5mL)洗滌，得到黃色固體，0.1g(67％)。mp＞300℃1H NMR(DMSO)8.11(2H，t，J＝5.5Hz)，7.76(2H，s)，6.98(4H，s)，3.16(4H，br s)，1.47(4H，quin，J＝6.1Hz)，1.28(4H，br s).
13C NMR(DMSO)161.80，150.46，145.99，141.19，120.71，117.53，109.89，99.15，39.68，28.84，26.01.
化合物632-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基-5-甲氧基苯基)-丙烯醯氨基]-己基}-3-(3，4-二羥基-5-甲氧基苯基)-丙烯醯胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙醯氨基)-己基]-乙醯胺(5e)(0.069g，0.28mmol)，3，4-二羥基-5-甲氧基苯甲醛(0.1g，0.56mmol)，1滴哌啶和乙醇(2mL)回流一小時。冷卻，過濾並用冷的乙醚(5mL)洗滌，得到黃色固體。0.132g(86％)。mp 243℃1H NMR(DMSO)8.17(2H，t，J＝5.5Hz)，7.89(2H，s)，7.19(2H，d，J＝1.6Hz)，7.13(2H，d，J＝1.6Hz)，3.77(6H，s)，3.17(4H，br s)，1.48(4H，quin，J＝6.1Hz)，1.29(4H，br s).
13C NMR(DMSO)161.80，150.49，146.11，146.01，141.25，120.69，117.53，109.90，99.12，39.47，28.62，22.30。
2.3.2二聚酪氨酸磷酸化抑制劑的活性表1程序庫1(二聚物)的化合物對發動蛋白I的GTP酶活性的影響
單取代的芳香化合物不含取代基，或只含有單取代基，如單-OH(例如，R1或R2是OH)，-Cl(R2或R4是Cl)，-OMe(R2或R3是OMe)，或-COOH(R3是COOH)，這樣的化合物不顯示發動蛋白抑制能力。而引入了第二個有抗氧能力的取代基後就具備了顯著的效果。3，4-二-OH(11，IC50＝5.1±0.6μM)物就顯示了類似化合物1的能力，被稱作二-酪氨酸磷酸化抑制劑(2，3-二-OH)。3，4，5-三-取代的芳香化合物(10)也有等同於化合物1的能力。同樣的情況也在不同鏈長的化合物中存在。
烷基間隔鏈的延伸在n＞3時會對效能有一點影響。例如，鏈延長類似物9(n＝0)，22(n＝1)，35(n＝2)，48(n＝3)，和61(n＝4)的IC50值分另別為5.1±0.6，1.7±0.2，3.2±1，5±1.4和26±1.5μM。本質上說，酪氨酸激酶抑制方面原先則有相反的報導。對抗EGF受體酪氨酸激酶的聚GAT酶底物(Gazit等人)的檢測化合物具有抑制作用，並不依賴於鏈的長度(Gazit等人，1996)。
R1和被氰基基團(CN)佔據的位置環合形成的類似物也可以使用。例如，當R1是羥基時，羥基基團能和氰基反應形成imminochromene，如以下方案2所示。
方案2二-酪氨酸磷酸化抑制劑的imminochromene類似物的合成為解釋鏈延長的類似物9在抑制值上的類似性，對所有5個烷烴間隔區類似物的模型進行分析並顯示以下的MacSpartanPro低能量構象異構體的結果。如我們所見，所有5個類似物的低能量構象異構體都有髮夾的構象，達到末端苯環的pi-pi相互作用的最大值。因此，增加間隔區的長度會限制效果直到內攝作用開始形成於相對穩定的髮夾構型(n≥5)。這與二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑對保留了延長的構型的酪氨酸激酶的效果進行對比，並因此使它們適合於EGFR酪氨酸激酶的二聚中間體。
在表2中，二-酪氨酸磷酸化抑制劑如化合物9樣鑑定，其根據流程1合成。因此化合物1和9相同。
為研究潛在的H-結合的與1相關技術效果，化合物71得以研製。該化合物有相對堅固的與1的大小類似的哌嗪連接。但是，它顯示在≤100μM時缺乏發動蛋白抑制作用。類似地，在N-甲基化1的烷基間隔區得到N-甲基化的類似物72後也沒有觀察到抑制作用。這些觀察表明二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑的髮夾結構對抑制作用是可取的，支持模型觀察(髮夾結構而不是延長鏈結構)，並且醯胺基取代基也在發動蛋白結合中扮演重要角色。
成功開發了基於二-酪氨酸磷酸化抑制劑的一些μM有效的對稱類似物，研究了一個芳香核的修飾用於測定其在抑制發動蛋白中的作用。因此，另一個基於酪氨酸磷酸化抑制劑A47(2)的化合物庫得以開發，如方案3所示，並檢查了該類似物抑制發動蛋白I的GTP酶活性的能力。
方案3.庫2的合成令人驚奇的是，庫2化合物的篩選沒有顯示任何的發動蛋白抑制≤100μM。更驚奇的是最初篩選的數據顯示酪氨酸磷酸化抑制劑A47(2)表明的發動蛋白IC50＝70μM。
更進一步的對酪氨酸磷酸化抑制劑A47的檢測給出了未檢測到庫2的化合物抑制活性的一個可能的解釋，即單-S可能有效的用於溶液中氧化成相應二聚結構。氧化後簡單的互變異構體產生相應的二硫化物(121)(參見方案4)。2的新製備的溶液沒有顯示出抑制能力，而在室溫下保存24小時後則有弱的抑制能力。當還原劑二硫蘇糖醇(2mM)存在於發動蛋白檢測介質中時，121的IC50值減至＞300μM。單獨應用二硫蘇糖醇時，則缺乏發動蛋白GTP酶活性(數據未顯示)。二聚的121在原位的生成給予類似的低能量構象保有所需要的適當布置的主要功能基團，確保較好的發動蛋白抑制作用。對於硫代吲哚一些類似的結果也被觀察到，它們是EGFR酪氨酸激酶抑制劑，顯示對氧化的增加活性(Thompson等人，1993)。
方案42.4討論對抗GTP酶發動蛋白的二聚酪氨酸磷酸化抑制劑的結構-活性關係通過基於先導化合物二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47經合成和篩選庫化合物而加以評估。從所得的結果看出，含有在3，4位有羥基取代的兩個芳環的二聚酪氨酸磷酸化抑制劑化合物具有強抑制活性。對這些化合物的修飾可以通過改變功能基團用於形成間隔區而容易完成。
實施例3前藥的開發二-酪氨酸磷酸化抑制劑的前藥及其類似物被開發以增加細胞膜的通透性能並因此增加藥物在細胞中的效能。提供二聚酪氨酸磷酸化抑制劑化合物前藥的適宜的反應在方案5中有說明。二-酪氨酸磷酸化抑制劑是起始反應劑的例子。二聚酪氨酸磷酸化抑制劑化合物與適當的酸酐或醯氯(摩爾數過量)在吡啶/N，N-二甲基甲醯胺(DMF)溶液中一起攪拌，並存在適當的催化劑如二甲基氨基吡啶(DMAP)。在某些情況下，溶液需要回流以使反應完全。反應完全後，酯化產物通過重結晶或色譜進行純化。開發的前藥的例子如表2和表3中所示。
方案5.前藥的合成表2二-酪氨酸磷酸化抑制劑的前藥
表3二聚酪氨酸磷酸化抑制劑的前藥形式
前藥Pro-BisT有4乙醯基酯基團取代二-酪氨酸磷酸化抑制劑的4羥基基團，並且評價其通過細胞的外細胞膜的能力。Pro-BisT在細胞內轉變成為活性物質二-酪氨酸磷酸化抑制劑，其然後能夠結合發動蛋白並因此抑制細胞內攝作用。發現Pro-BisT抑制受體介導的細胞系Hela，HER14，COS7，Swiss 3T3，A431，B104和B35的轉鐵蛋白或EGF的細胞內攝作用(RME)。Pro-BisT比二-酪氨酸磷酸化抑制劑有更顯著的效能(-30x)，能夠有效地阻斷所試驗細胞系的RME，濃度為10-20μM下檢測，顯示較二-酪氨酸磷酸化抑制劑有相大改善的穿透細胞的能力。
前藥80-1在類似於Pro-BisT濃度(10-20μM)抑制RME，被開發用於降低該前藥在細胞外環境中進入細胞前過早的水解。該前藥以粉末形式貯存時比較Pro-BisT有改善的貨架壽命。
本領域普通技術人員應能夠理解各種對本發明的變化和/或修飾，而不背離本發明的精神或範圍。本發明的具體實施方式
是用於說明而不是限制本發明。
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權利要求
1.一種抑制細胞內發動蛋白依賴性的細胞內攝作用的方法，該方法包括用有效量的通式I的化合物，或其生理上可接受的鹽處理所述細胞，其中M-Sp-M』 通式I其中M和M』分別獨立為通式II所示的結構部分，可以相同或不同，Sp為一間隔區； 其中V是C或CH；W是CH或一連接基團；並Y是氫、氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫，或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y形成與Z基團稠合的取代或未取代的5員或6員雜環或碳環，其中雜環包括1至3個選自O、N和S的雜原子，雜環或碳環如果有取代基，取代基是選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫，或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團的至少一種，其中的取代C1-C3的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X是O或S；X′是氰基、硝基、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；R′是連接在間隔區上的NH、O或S；和Z是選自(a)非取代的由一個或兩個獨立的5員或6員環組成的雜環，有不超過3個的選自O、N和S的雜原子；(b)非取代的由一個或兩個獨立的5員或6員環組成的碳環；(c)由一個或兩個獨立的5員或6員環組成的雜環，有不超過3個的選自O、N和S的雜原子，其中雜環有一個或多個取代基，所述取代基獨立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團，被至少一個選自硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基的基團取代；和(d)由一個或兩個獨立的5員或6員環組成的碳環，在W是CH或一連接基團時，或W、V和Y形成非取代的碳環時至少兩個取代基，或者在W、V和Y形成雜環時，至少一個取代基，獨立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團，有至少一個選自硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基的取代基；其中當M或M′中一個的Z選自(b)時，而M或M′中其它的Z選自(a)、(c)或(d)。
2.如權利要求1所述的方法，其中V是C；W是CH；Y是氫、氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C2的基團或取代的C1-C2的基團，其中的取代基獨立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y形成5員或6員的取代或非取代的與Z稠合的雜環或碳環，其中雜環包括1至3個選自O、N和S的雜原子，並且碳環或雜環如果有取代的話，至少有一個取代基，選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫，或未取代的C1-C2的基團或取代的C1-C2的基團，其中的取代C1-C2基團的取代基獨立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X is O或S；和X′是氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C2的基團或取代的C1-C2的基團，其中的取代C1-C2基團的取代基獨立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種。
3.如權利要求2所述的方法，其中Y是氰基、硝基、氨基、羧基、羥基、巰基、硫代羧基、取代的C1-C2的基團，其中的取代基獨立選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基、硫代羧基；W、V和Y形成5員或6員的取代或非取代的與Z稠合的雜環或碳環，其中雜環含有1至3個選自O、N和S的雜原子，並且如果雜環或碳環有取代的話，含有至少一個取代基，所述取代基選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基和硫代羧基，或取代的C1-C2基團，取代C1-C2基團的取代基選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基和硫代羧基；並且R是CXR′。
4.權利要求1-3任一項所述的方法，其中Z是選自(i)由一或兩個獨立為5員或6員環組成的雜環，包括不多於3個的獨立選自O、N和S的雜原子；(ii)由一或兩個獨立為5員或6員環組成的雜環，包括不多於3個的獨立選自O、N和S的雜原子，其中雜環含有一個或多個取代基，所述的取代基獨立選自硝基、NH、滷素、氰基、氨基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基；和(iii)由一或兩個獨立為5員或6員環組成的碳環，含有至少兩個取代基，選自硝基、NH、氨基、滷素、氰基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
5.如權利要求1-4任一項的方法，其中M和M′中至少一個的Z不是2，3-二取代的碳環基團。
6.如權利要求1-5任一項的方法，其中M和M′中至少一個的Z包括當Z選自(d)且W是CH或C1-C3的連接基團時，至少兩個取代基相互鄰位或在相鄰的取代位置；或當Z是選自(c)的雜環時，碳原子上所述取代基或之一與雜原子或其之一相鄰；或當W、V和Y環化形成與Z稠合的雜環時，在碳原子上的取代基或其之一與雜環至少有一個鍵長間隔。
7.如權利要求1-6任一項的方法，其中M和M′中一個的Y取代基是氫，M和M′的另外一個的Y取代基則不是氫。
8.如權利要求1-7任一項的方法，其中W、V和Y形成5員或6員與Z稠合的雜環。
9.如權利要求8所述的方法，其中與Z稠合的雜環形成兩環雜環基團。
10.如權利要求1-8任一項的方法，其中包括芳基基團，由一個或兩個環組成，所述環獨立為5或6員環，和至少兩個取代基，獨立選自硝基、NH、氨基、滷素、氰基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
11.如權利要求10所述的方法，其中Z包括由一個6員環組成的芳基基團和至少兩個取代基，所述取代基獨立選自硝基、氨基、滷素、氰基、羥基、羧基和C1-C2烷氧基。
12.如權利要求11所述的方法，其中芳基基團至少有兩個取代基，獨立選自硝基、氨基和羥基。
13.如權利要求1-8任一項的方法，其中Z含有雜環基團，所述雜環包括一個或兩個獨立的5或6員環，含有不超過3個的選自O、N和S的雜原子，其中所述雜環含有一個或多個取代基，獨立選自硝基、NH、滷素、氰基、氨基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
14.如權利要求13所述的方法，其中雜環基團含有一個或多個取代基，獨立選自硝基、氨基和羥基。
15.如權利要求1-5任一項的方法，其中M和M′分別獨立為下述基團部分 其中X是O或S；Y是氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基或硫代羧基；或R1和Y環化形成5或6員的取代或未取代的雜環或碳環，其中雜環含有1或2個選自O、N和S的雜原子，並且當取代時雜環或碳環具有至少一個選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫的取代基；並且R2至R5獨立為氫或某取代基，所述取代基獨立選自硝基、氨基、滷素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；或R1至R5獨立為氫或某取代基，所述取代基獨立選自硝基、氨基、滷素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、滷素、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；和R是連到間隔基Sp上的NH、O或S；並其中M和M′中的至少一個特徵在於R1至R5的至少兩個不是氫，且當R1至R2不是氫時，R3至R5中至少一個也不是氫，或者當R1和Y環化形成未取代的碳環時，R2至R5的至少兩個不是氫，或者當R1與Y環化形成雜環時，R2至R5的至少一個不是氫。
16.如權利要求15所述的方法，其中R1-R3不是氫。
17.如權利要求15所述的方法，其中R1-R5的至少兩個在鄰位。
18.如權利要求15所述的方法，其中M和M′中至少一個有三個取代基，並且取代基是相鄰的。
19.如權利要求18所述的方法，其中R1-R3不是氫，或R2-R5不是氫。
20.如權利要求15所述的方法，其中當R1-R5或R2-R5中的至少一個是滷素、C1-C2的烷氧基或C1-C2的醯基時，至少一個另外的取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，當R1和Y環化並形成雜環時，或者至少兩個其它取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，當R1和Y不成環或形成未取代的碳環。
21.如權利要求15-20任一項所述的方法，其中Y是氰基，X是O並且R是NH。
22.如權利要求1-21任一項所述的方法，其中M和M′是相同的。
23.如權利要求1-22任一項所述的方法，其中間隔區Sp允許是髮夾結構的化合物。
24.如權利要求1-23任一項所述的方法，其中間隔區Sp包括未取代的烷烴鏈，結構如下-CH2(CH2)nCH2-其中n是1-5的整數。
25.如權利要求1-24任一項所述的方法，其中所述通式I的化合物是二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑。
26.一種預防或治療哺乳動物中由發動蛋白依賴的細胞內攝作用介導的疾病或病症的方法，該方法包括給予哺乳動物有效量的通式I的化合物，或其生理上可接受的鹽或前藥，通式I的結構為M-Sp-M』通式I其中M和M』分別獨立為通式II所示的結構部分，可以相同或不同，Sp為一間隔區； 其中V是C或CH；W是CH或一連接基團；並Y是氫、氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫，或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y形成與Z基團稠合的取代或未取代的5員或6員雜環或碳環，其中雜環包括1至3個選自O、N和S的雜原子，如果雜環或碳環有取代基，取代基是選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫，或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團，其中的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X是O或S；X′是氰基、硝基、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；R′是連接在間隔區上的NH、O或S；和Z是選自(a)非取代的由一個或兩個獨立的5員或6員環組成的雜環，有不超過3個的選自O、N和S的雜原子；(b)非取代的由一個或兩個獨立的5員或6員環組成的碳環；(c)由一個或兩個獨立的5員或6員環組成的雜環，有不超過3個的選自O、N和S的雜原子，其中雜環有一個或多個取代基，所述取代基獨立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團，被至少一個選自硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基的基團取代；和(d)由一個或兩個獨立的5員或6員環組成的碳環，在W是CH或一連接基團時，或W、V和Y形成非取代的碳環時至少兩個取代基，或者在W、V和Y形成雜環時，至少一個取代基，獨立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團，有至少一個選自硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基的取代基；其中當M或M′中一個的Z選自(b)時，而M或M′中其它的Z選自(a)、(c)或(d)。
27.如權利要求26所述的方法，其中V是C；W是CH；Y是氫、氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C2的基團或取代的C1-C2的基團，其中的取代基獨立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y形成5員或6員的取代或非取代的與Z稠合的雜環或碳環，其中雜環包括1至3個選自O、N和S的雜原子，並且如果碳環或雜環有取代的話，至少有一個取代基，選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫，或未取代的C1-C2的基團或取代的C1-C2的基團，其中的取代基獨立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X is O或S；和X′是氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C2的基團或取代的C1-C2的基團，其中的取代基獨立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫；並R′是鍵合到間隔區上的NH、O或S。
28.如權利要求27所述的方法，其中Y是氰基、硝基、氨基、羧基、羥基、巰基、硫代羧基、取代的C1-C2的基團，其中的取代基獨立選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基、硫代羧基；W、V和Y形成5員或6員的取代或非取代的與Z稠合的雜環或碳環，其中雜環含有1至3個選自O、N和S的雜原子，並且如果雜環或碳環有取代的話，含有至少一個取代基，所述取代基選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基和硫代羧基，或取代的C1-C2基團，取代基選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基和硫代羧基；並且R是CXR′。
29.如權利要求26-28任一項所述的方法，其中M和M′中至少一個的Z不是2，3-二取代的碳環基團。
30.如權利要求26-29任一項所述的方法，其中M和M′中至少一個的Z包括當Z選自(d)且W是CH或C1-C3的連接基團時，至少有兩個鄰位取代基；或當Z是選自(c)的雜環時，該取代基或取代基之一在與該雜原子或雜原子之一相鄰的碳原子上；或當W、V和Y環化形成與Z稠合雜環時，在Z的碳原子上的該取代基或取代基之一與雜環至少有一個鍵長。
31.如權利要求26-30任一項所述的方法，其中一個M或M』的Y取代基是氫，而其它的M或M』的Y取代基不是氫。
32.如權利要求26-31任一項所述的方法，其中M和M』獨立選自下述的基團部分 其中X是O或S；Y是氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基或硫代羧基；或R1和Y環化形成5或6員的取代或未取代的雜環或碳環，其中雜環含有1或2個選自O、N和S的雜原子，並且當取代時雜環或碳環具有至少一個選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫的取代基；並且R2至R5獨立為氫或某取代基，所述取代基獨立選自硝基、氨基、滷素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、C1-C2的烷氧基或C1-C2的醯基；或R1至R5獨立為氫或某取代基，所述取代基獨立選自硝基、氨基、滷素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、滷素、C1-C2的烷氧基或C1-C2的醯基；和R是連到間隔基Sp上的NH、O和S；並其中M和M′中的至少一個特徵在於R1至R5的至少兩個不是氫，且當R1至R2不是氫時，R3至R5中至少一個也不是氫，或者當R1和Y環化形成未取代的碳環時，R2至R5的至少兩個不是氫，或者當R1與Y形成雜環時，R2至R5的至少一個不是氫。
33.如權利要求32所述的方法，其中R1-R3不是氫。
34.如權利要求26-31任一項所述的方法，其中R1-R5的至少兩個是鄰位取代。
35.如權利要求26-31任一項所述的方法，其中M和M′至少一個有三個取代基，並且取代基是相鄰的。
36.如權利要求33所述的方法，其中R1-R3均不為氫，或R2-R5均不是氫。
37.如權利要求26-32任一項所述的方法，其中當R1-R5或R2-R5中的至少一個是滷素、C1-C2的烷氧基或C1-C2的醯基時，至少一個另外的取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，當R1和Y環化並形成雜環時，或者至少兩個其它取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，當R1和Y不成環或形成未取代的碳環。
38.如權利要求26-37任一項所述的方法，其中Y是氰基，X是O並且R是NH。
39.如權利要求26-38任一項所述的方法，其中M和M′是相同的。
40.如權利要求26-39任一項所述的方法，其中間隔區Sp允許是髮夾結構的化合物。
41.如權利要求26-40任一項所述的方法，其中通式I的化合物是二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑。
42.如權利要求26-41任一項所述的方法，其中所述疾病或病症選自癌症、眼科疾病、免疫缺陷病、胃腸道疾病、病原性感染、腎病、癲癇及神經疾病、神經變性疾病和神經系統的疾病和病症。
43.如權利要求42所述的方法，其中神經疾病、神經變性疾病和神經系統疾病和病症選自脫髓鞘疾病、阿爾茨海默病、亨廷頓氏病、帕金森氏病和Lewy體病。
44.如權利要求42所述的方法，其中疾病或病症是癲癇。
45.一種預防或治療哺乳動物由發動蛋白依賴性細胞內攝作用介導的疾病或病症的方法，該方法包括給予哺乳動物有效量的抑制發動蛋白GTP酶活性的二聚酪氨酸磷酸化抑制劑，或該二聚酪氨酸磷酸化抑制劑的類似物、生理可接受的鹽，或前藥。
46.如權利要求45所述的方法，其中二聚酪氨酸磷酸化抑制劑包括兩個酪氨酸磷酸化抑制劑的結構部分，其通過一間隔部分相連，其中至少一個酪氨酸磷酸化抑制劑部分是亞苄基丙二腈部分。
47.如權利要求46所述的方法，其中兩個酪氨酸磷酸化抑制劑部分均是亞苄基丙二腈部分。
48.權利要求46或47所述的方法，其中酪氨酸磷酸化抑制劑部分是相同的。
49.如權利要求45-48任一項所述的方法，其中二聚酪氨酸磷酸化抑制劑包括二-酪氨酸磷酸化抑制劑。
50.如權利要求45-49任一項所述的方法，其中所述的疾病或病症選自癌症、眼科疾病、免疫缺陷病、胃腸道疾病、病原性感染、腎病、癲癇及神經疾病、神經變性疾病和神經系統疾病的疾病和病症。
51.如權利要求50所述的方法，其中神經疾病、神經變性疾病和神經系統疾病和病症選自脫髓鞘疾病、阿爾茨海默病、亨廷頓氏病、帕金森氏病和Lewy體病。
52.如權利要求50所述的方法，其中所述疾病或病症是癲癇。
53.一種鑑別二聚酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物具有抑制發動蛋白GTP酶活性能力的方法，該方法包括將二聚酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物與發動蛋白或具有發動蛋白GTP酶活性的分子一起培養得到檢測數據；並在此檢測數據的基礎上，確定二聚酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物是否具有抑制發動蛋白的GTP酶活性的作用。
54.通過權利要求53所述的方法鑑定的二聚酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物在抑制細胞內發動蛋白依賴性的細胞內攝作用中的應用。
55.如下通式III所述的化合物或其生理上可接受的鹽，或前藥，其中M-Sp-M』通式III其中M和M』分別獨立為通式IV所示的結構部分，可以相同或不同，Sp為一間隔區； 其中V是C或CH；W是CH或一連接基團；並Y是氫、氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫，或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團，所述取代基獨立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y形成與Z基團稠合的取代或未取代的5員或6員雜環或碳環，其中雜環包括1至3個選自O、N和S的雜原子，雜環或碳環如果有取代基，取代基是選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫，或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團，其中取代C1-C3基團的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X是O或S；X′是氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C3的基團或取代的C1-C3的基團，所述取代基獨立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；R′是連接在間隔區上的NH、O或S；和Z是選自(a)非取代的由一個或兩個獨立的5員或6員環組成的雜環，有不超過3個的選自O、N和S的雜原子；(b)非取代的由一個或兩個獨立的5員或6員環組成的碳環；(c)由一個或兩個獨立的5員或6員環組成的雜環，有不超過3個的選自O、N和S的雜原子，其中雜環有一個或多個取代基，所述取代基獨立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團，被至少一個選自硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基的基團取代；和(d)由一個或兩個獨立的5員或6員環組成的碳環，在W是CH或一連接基團時，或W、V和Y形成非取代的碳環時至少兩個取代基，或者在W、V和Y形成雜環時，至少一個取代基，獨立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團，有至少一個選自硝基、NH、氨基、氰基、滷素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基的取代基；其中當M或M′中一個的Z選自(b)時，而M或M′中其它的Z選自(a)、(c)或(d)。並且條件是當R是CXR』，X是O，R』是鍵合在間隔上的NH，V是C，W是CH，Y是氰基且R1、R2和R5是H，R3和R4是羥基時，至少M和M′中一個的Z不是如通式IVa所示的苄基基團， 或者當Sp是C2-C4的烷基間隔時，R1和R5是H，R2至R4是羥基；並且其中Z』是與W基團相連接的碳原子。
56.如權利要求55的化合物，其中V是C；W是CH；Y是氫、氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C2的基團或取代的C1-C2的基團，其中的取代基獨立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y形成5員或6員的取代或非取代的與Z稠合的雜環或碳環，其中雜環包括1至3個選自O、N和S的雜原子，並且碳環或雜環如果有取代的話，至少有一個取代基，選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫，或未取代的C1-C2的基團或取代的C1-C2的基團，其中取代C1-C2基團的取代基獨立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X is O或S；和X′是氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C2的基團或取代的C1-C2的基團，其中取代C1-C2基團的取代基獨立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫。
57.如權利要求56的化合物，其中Y是氰基、硝基、氨基、羧基、羥基、巰基、硫代羧基、取代的C1-C2的基團，其中的取代基獨立選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基、硫代羧基；W、V和Y形成5員或6員的取代或非取代的與Z稠合的雜環或碳環，其中雜環含有1至3個選自O、N和S的雜原子，並且如果雜環或碳環有取代的話，含有至少一個取代基，所述取代基選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基和硫代羧基，或取代的C1-C2基團，取代C1-C2基團取代基選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基和硫代羧基；並且R是CXR′。
58.如權利要求55-57任一項所述的化合物，其中Z選自(i)由一或兩個獨立為5員或6員環組成的雜環，包括不多於3個的選自O、N和S的雜原子；(ii)由一或兩個獨立為5員或6員環組成的雜環，包括不多於3個的選自O、N和S的雜原子，其中雜環含有一個或多個取代基，所述的取代基獨立選自硝基、NH、滷素、氰基、氨基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基；和(iii)由一或兩個獨立為5員或6員環組成的碳環，含有至少兩個取代基，選自硝基、NH、氨基、滷素、氰基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
59.如權利要求55-58任一項所述的化合物，其中M和M′中至少一個的Z不是2，3-二取代的碳環基團。
60.如權利要求55-59任一項的化合物，其中M和M′中至少一個的Z包括當Z選自(d)且W是CH或C1-C3的連接基團時，至少有兩個鄰位取代基；或當Z是選自(c)的雜環時，該取代基或取代基之一在與該雜原子或雜原子之一相鄰的碳原子上；或當W、V和Y環化形成與Z稠合雜環時，在碳原子上的該取代基或取代基之一與雜環至少有一個鍵長。
61.如權利要求55-60任一項的化合物，其中M和M′中一個的Y取代基是氫，另外一個的Y取代基則不是氫。
62.如權利要求55-61任一項的化合物，其中W、V和Y形成與Z稠合的5員或6員的雜環。
63.如權利要求62所述的化合物，其中與Z形成的稠合雜環形成兩個環的雜環基團。
64.如權利要求55-63任一項的化合物，其中Z包括芳基基團，所述芳基由一個或兩個環組成，所述環獨立為5或6員環，和至少有兩個取代基，獨立選自硝基、NH、氨基、滷素、氰基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
65.如權利要求64所述的化合物，其中Z包括6員的芳基基團，和至少有兩個取代基，獨立選自硝基、氨基、滷素、氰基、羥基、羧基和C1-C2的烷氧基。
66.如權利要求65所述的化合物，其中芳基基團至少有兩個取代基，獨立選自硝基、氨基和羥基。
67.如權利要求55-62任一項的化合物，其中Z含有雜環基團，所述雜環包括一個或兩個獨立的5或6員環，含有不超過3個的選自O、N和S的雜原子，其中所述雜環含有一個或多個取代基，獨立選自硝基、NH、滷素、氰基、氨基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
68.如權利要求67所述的化合物，其中雜環基團含有一個或多個取代基，獨立選自硝基、氨基和羥基。
69.如權利要求55-59任一項的化合物，其中M和M′分別獨立為下述基團部分 其中X是O或S；Y是氰基、硝基、氨基、滷素、羥基、巰基、羧基或硫代羧基；或R1和Y環化形成5或6員的取代或未取代的雜環或碳環，其中雜環含有1或2個選自O、N和S的雜原子，並且當取代時雜環或碳環具有至少一個選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、滷素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫的取代基；並且R2至R5獨立為氫或某取代基，所述取代基獨立選自硝基、氨基、滷素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；或R1至R5獨立為氫或某取代基，所述取代基獨立選自硝基、氨基、滷素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、滷素、C1-C2的烷氧基和C1-C2的醯基；和R是連到間隔基Sp上的NH、O或S；並其中M和M′中的至少一個特徵在於R1至R5的至少兩個不是氫，且當R1至R2不是氫時，R3至R5中至少一個也不是氫，或者當R1和Y環化形成未取代的碳環時，R2至R5的至少兩個不是氫，或者當R1與Y環化形成雜環時，R2至R5的至少一個不是氫。
70.如權利要求69所述的化合物，其中R1-R3不是氫。
71.如權利要求69所述的化合物，其中R1-R5的至少兩個相互在鄰位。
72.如權利要求69所述的化合物，其中M和M′中至少一個有三個取代基，並且取代基是相鄰的。
73.如權利要求72所述的化合物，其中R1-R3不是氫，或R2-R5不是氫。
74.如權利要求69所述的化合物，其中當R1-R5或R2-R5中的至少一個是滷素、C1-C2的烷氧基或C1-C2的醯基時，至少一個另外的取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，當R1和Y環化形成雜環時，或者至少兩個其它取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，當R1和Y不成環或形成未取代的碳環時。
75.如權利要求69-74任一項所述的化合物，其中Y是氰基，X是O並且R是NH。
76.如權利要求55-75任一項所述的化合物，其中M和M′是相同的。
77.如權利要求55-76任一項所述的化合物，其中間隔區Sp允許是髮夾結構的化合物。
78.如權利要求55-77任一項所述的化合物，其中間隔區Sp包括未取代的烷烴鏈，結構如下-CH2(CH2)nCH2-其中n是1-5的整數。
79.根據權利要求1-78中的任一化合物，其中所述通式III的化合物是二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑。
80.一種藥物組合物，該組合物包含如權利要求55-58任一項權利要求所定義的化合物，以及生理上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
全文摘要
本發明披露了抑制細胞內發動蛋白依賴性的細胞內攝作用的方法，該方法包括用有效量的通式I的化合物，或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑，其生上可接受的鹽或前藥處理所述細胞。本發明還提供了在該方法中應用的化合物。所述發動蛋白依賴性的細胞內攝的抑制作用可用於癲癇及神經性疾病或病症的治療。
文檔編號C07C255/34GK1938013SQ200480039977
公開日2007年3月28日 申請日期2004年11月22日 優先權日2003年11月21日
發明者A·麥克拉斯基, P·J·魯賓遜, T·A·希爾 申請人:紐卡斯爾大學研究協會有限公司, 兒童醫學研究所