利用具有反式剪接功能的蛋白質內含子製備重組多肽的製作方法

2023-06-02 14:05:01 2

專利名稱：利用具有反式剪接功能的蛋白質內含子製備重組多肽的製作方法
技術領域：
本發明屬於重組多肽製備領域。利用具有反式剪切活性的蛋白質內含子的N-端 剪接結構域和C端剪接結構域之間的特異性相互作用，親和純化含有目標多肽的融合蛋 白，通過改變洗滌液的PH、鹽濃度、溫度、或者加入含巰基基團的化學試劑，誘導蛋白質內含 子的反式剪切使目標多肽從融合蛋白中釋放出來，得到純化。
背景技術：
隨著基因組學和蛋白質組學的深入研究，越來越多的蛋白被發現。為了研究這些 蛋白質的生物功能，首先必須獲得足夠量的高活性、高純度的樣品。由於生物組織中的蛋白 成分非常複雜，而目標蛋白往往在組織中的含量很少，因此目前人們普遍採用基因工程而 很少採用組織提取的方法製備目標多肽[1]。為了方便從宿主細胞或其培養液中將目標蛋白純化，人們往往在目標蛋白的 N-端或C-端加上親和純化的標籤。由於大多數的活性小肽在宿主細胞中的表達效率低、穩 定性差[2]，通常必須採用和載體蛋白融合表達的方法來製備低分子量小肽[3，4]。但這些 親和純化標籤以及載體蛋白往往影響目標蛋白或小肽的生物活性，必須經過蛋白水解酶或 化學裂解試劑處理，才能使目標蛋白或小肽與親和標籤或載體蛋白分開。其中蛋白水解酶 的專一性較高，但缺點是酶製劑的價格非常昂貴，且有時也會出現非特性酶解作用[5，6]； 化學裂解試劑雖然價廉，但存在裂解條件比較劇烈，容易使目標蛋白失去活性的缺陷[7， 8]。近年來，人們利用攜帶了親和純化標籤的蛋白質內含子作為載體蛋白，來表達純 化目標蛋白[9，10]。蛋白質內含子(intein)是指前體蛋白中的一段插入序列，在蛋白質 翻譯後的成熟過程中它能自我催化蛋白質的剪接作用(protein splicing)，使自身從前體 蛋白中切除，並將其兩側稱為蛋白外顯子(extein)的多肽片段以正常的肽鍵連接形成有 功能的成熟蛋白[11，12]。蛋白質內含子和蛋白質外顯子位於同一多肽鏈時產生的剪接作 用稱為順式剪接(cis-splicing)。蛋白質內含子通常含有N-端和C-端兩個剪切結構域 (splicing domain)。一方面，蛋白質內含子N-端和C-端剪接區的功能具有相對獨立性，當N-端的 Ser, Cys或Thr突變後，N-端的剪切功能喪失，但C-端的剪切功能仍保留；同樣，當C-端 的Asn突變後，N-端的剪切功能仍然存在。另一方面，蛋白質內含子N-端和C-端剪接結構域的功能又相互依賴，只有在 C-端結構域存在時(即使該結構域C端Asn發生突變而喪失C-端剪接功能)，N-端結構域 才具有(N-端)剪接活性。同樣，只有在N-端結構域存在時(即使該結構域N端Cys、Ser 或Thr發生突變而喪失了 N-端剪接功能)，C-端結構域才具有(C-端)剪接活性。基於蛋白質內含子的上述特性，人們通過定點突變，選擇性地保留其N-端或C-端 剪接功能，成功地將蛋白質內含子融合表達系統用於目標蛋白的表達、純化[13]。圖1顯示 了將目標蛋白與攜帶了幾丁質結合(CBD-tag)親和純化標籤的蛋白質內含子的N-端融合表達，通過改變洗滌液的PH、溫度、或者加入含巰基基團的化學試劑，使目標多肽從融合蛋 白中釋放出來，從而避免使用昂貴的蛋白水解酶。但從大腸桿菌中純化重組蛋白時，該方法 仍然存在一些缺點，主要包括(1)必須使用完整的蛋白質內含子作為載體蛋白。載體蛋白 分子越大、結構越複雜，往往影響融合蛋白的表達效率，減少目標多肽在融合蛋白中所佔的 比例，降低融合蛋白復性加工的產率。(2)蛋白質內含子的突變體通常仍然存在本底水平的 剪接活性。該活性降低了目標多肽的回收率。特別是當目標蛋白對宿主細胞具有毒性時， 蛋白質內含子本底水平的剪接活性將影響宿主細胞的生長。(3)蛋白質內含子本身不能用 作親和純化的配基。為了提高融合蛋白的純化效率，必須在蛋白質內含子的N-端或C-端 附加親和純化標籤，這進一步降低了目標多肽在融合蛋白中所佔的比例。除具有順式剪接功能的蛋白質內含子外，人們還發現了具有反式剪切活性的蛋 白質內含子[14，15]。反式剪切蛋白質內含子的N-端和C-端剪接結構域分別位於不 同的多肽鏈，當兩個剪接結構域結合後仍能介導肽鍵的剪接，該剪接作用稱為反式剪接 (trans-splicing) 0具有反式剪接功能的蛋白質內含子的一個重要結構特徵是其N-端和 C-端剪接結構域之間具有一定的親和力，能夠形成穩定的複合物，有的甚至對高溫、高鹽及 變性劑(如尿素)具有一定的耐受性。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的基因工程融合蛋白表達、純化、加工系統。本發明根據具有反式剪接功能的蛋白質內含子的特性，利用其N-端和C-端剪接 結構域之間的特異性親和力來建立一個新的基因工程融合蛋白表達、親和純化系統；利用 N-端和C-端剪接結構域相互獨立而又相互依賴的剪切活性建立一個新的基因工程融合蛋 白切割、加工系統。我們以具有反式剪接功能的蛋白質內含子dnaE為例，用圖2來對本發明的技術措 施進行說明。將失去剪接功能的dnaE蛋白質內含子的C-端結構域作為親和層析的配基， 通過與S印harose交聯製備親和層析柱，用來純化與dnaE蛋白質內含子的N-端剪接結構 域融合表達的目標多肽。利用高鹽濃度的洗滌緩衝液去除雜蛋白後，通過加巰基試劑或改 變層析柱內的PH及溫度，誘導N-端結構域的剪接活性，使目標多肽從融合蛋白中釋放出來 並得到純化。在該表達系統中，蛋白質內含子起到了載體蛋白、親和純化、肽鍵特異性裂解 三重功能，極大地方便了目標多肽的製備。與其它融合蛋白的表達、純化方法相比，本發明採用反式剪接蛋白質內含子製備 目標多肽的方法具有多種優點。採用蛋白水解酶裂解載體蛋白和目標多肽之間肽鍵(使目 標多肽從融合蛋白中釋放出來)的方法通常具有一定的局限性，包括製備的目標多肽不能 是該蛋白水解酶的抑制劑，以及蛋白水解酶價格比較昂貴，有時存在非特異性水解等。本發 明在採用反式剪接蛋白內含子製備目標多肽過程中，不需要使用蛋白水解酶，因此可用於 製備各種蛋白水解酶抑制劑。與完整的蛋白質內含子相比，其N-端或C-端結構域分子較 小、結構較簡單，因此用作載體蛋白時一般不影響融合蛋白的表達效率，並可提高目標多肽 在融合蛋白中所佔的比例，增加融合蛋白復性加工的產率。順式剪接蛋白質內含子在細胞 內由於存在本底水平的剪切活性，因此往往不能用於製備對宿主細胞毒性較強的目標多肽 或蛋白。由於反式剪接蛋白質內含子的N-端剪接結構域和C-端剪接結構域分別在不同的細胞內表達，因而目標多肽與N-端或C-端結構域組成的融合蛋白在細胞內完全不具備剪 切活性(不存在本底水平的剪接作用，不會產生游離的目標多肽)，所以可用於製備對宿主 細胞毒性較強的多肽樣品。當順式剪接蛋白質內含子作為載體蛋白時，其本身不能用作親 和純化的配基，必須另外在蛋白質內含子的N-端或C-端附加親和純化標籤，從而降低了 目標多肽在融合蛋白中所佔的比例。由於反式剪接蛋白質內含子的N-端和C-端剪接結構 域的結合具有特異性，且形成的複合物是非共價鍵的，可通過改變PH(大於11或小於3)而 解離。因此當採用C-端剪接結構域作為載體蛋白時，N-端結構域就可用作親和層析的配 基，並且交聯了 N-端結構域的S印harose可以反覆使用。此外，N-端和C-端剪接結構域 之間的結合通常不受目標多肽的影響。因此，與反式剪接蛋白質內含子N-端結構域交聯的 S印harose可用於純化製備與對應的C-端結構域融合表達的任何目標多肽。上述方法同樣 適用於將失去剪接功能的蛋白質內含子的C-端結構域與Sepharose交聯後，用來純化製備 與N-端剪接結構域融合表達的目標多肽。本發明的有益效果本發明創建了一種新的基因工程融合蛋白的親和純化系統，發明一種新的融合蛋 白特異性切割的方法；此方法能夠特異性的純化含有intein C-端剪接結構域(或N-端剪 接結構域)的融合蛋白，所發明的親和純化填料能夠被重複使用；此方法使用的親和標籤 也能與傳統的其他親和標籤如組氨酸標籤聯合使用；此系統中對融合蛋白的純化與切割可 直接在親和柱上一步完成，且無需加入其它的蛋白水解酶，從而可降低成本並防止蛋白酶 汙染。本發明還具有下列特點1.創造了一類新的用於基因工程融合蛋白純化的親和標籤以及與之相應的新的 親和純化配基，該親和純化系統尚未見有人報導。目前使用的基於intein的蛋白純化與切 割方法與本發明有很大不同，已有的方法是將親和標籤與完整的intein和目標蛋白融合 表達，通過其中的親和標籤來純化，再利用intein的順式拼接活性把目標蛋白切割下來。 而本發明中的純化方法依靠的是intein的兩個剪接結構域之間的親和力完成的，肽鍵的 切割是依靠兩個剪接結構域的反式剪接活性。2.此系統對融合蛋白的切割無需任何蛋白酶參與，依靠intein本身的切割能力 完成；省去了蛋白水解酶的使用以及最後產品中蛋白水解酶去除的步驟，既降低成本又可 防止對目的蛋白的酶汙染。3.此系統可以把對目的蛋白的純化及從融合蛋白中的切割反應在同一根親合柱 上完成，而且切割反應過程容易可控；通常在pH 10時，intein的反式剪接活 性很弱，樣品在此條件下上樣和洗滌不會造成目標蛋白的損失。當雜蛋白洗滌去除後，換成 PH中性並含有EDTA的切割緩衝液後即可發揮intein反式拼接活性，將目標蛋白從融合蛋 白中釋放。4.親合標籤僅為intein的N-端或C-端剪接結構域，通常小於完整的intein以 及常用的載體蛋白(如GST，Trx，MBP)等，因而本系統可以相應提高目的蛋白的產量。5.已有的基於蛋白內含子的切割系統是依靠intein的順式剪接作用，需要把完 整intein與目標蛋白融合，在菌體內表達過程中即可發生切割作用而導致目標蛋白損失。 而本發明只把intein單獨的C-端剪接結構域(或N-端剪接結構域)與目標蛋白融合，在另一個端剪接結構域不存在時，無拼接活性產生，目標蛋白不會有損失。此外，該系統還可 用於製備對宿主細胞有毒性的多肽。6.本課題製造的新親合基質可以被重複使用，純化方法簡單，易於放大，能夠用於 融合蛋白的規模化製備。本發明使用的材料和試劑1.菌株大腸桿菌DH5 α和BL21購自Novagen公司。2.質粒pET28a與pET30a購自Novagen公司，質粒pTwinl購自NEB公司。3.其它試劑質粒提取和DNA片段回收試劑盒為Qiagen公司產品；Ni-S印harose _自 Pharmacia Biotech, chitin—sepharose _ 自 Pharmacia Biotech。4. PCR 引物由 Invitrogen 公司合成。本發明涉及的名詞術語的說明說明1:大腸桿菌DH5ci為常用的克隆菌，BL21為常用的表達菌。(詳見《生物 化學與分子生物學實驗常用數據手冊》吳冠芸等主編，科學出版社1998，p426)。說明2 雙鏈DNA(是由兩條核苷酸鏈依靠彼此鹼基之間形成的氫鍵作用而配對形 成的雙螺旋結構。詳見《生物化學》第三版上冊王鏡巖朱聖庚徐長法主編，高等教育出版社 2002，p486-487)。說明3 =PCR擴增(PCR 聚合酶鏈式反應。詳見 <> 第三版上 冊J.薩姆布魯克D. W.拉塞爾著，科學出版社2002，p611-612)。說明4 質粒(質粒是染色體外的DNA分子，其大小範圍在1Kb至200Kb以上不等。 大多數來自細菌的質粒是雙鏈、共價閉合的環狀分子，以超螺旋形式存在。詳見 << 分子克 隆實驗指南》第三版上冊J.薩姆布魯克D. W.拉塞爾著，科學出版社2002，p2-3)。說明5 連接(連接是指在一定條件下，由DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段相鄰 的5 『端磷酸與3』端羥基之間形成磷酸二酯鍵的過程。詳見 <> 谷 志遠著，人民軍醫出版社1998，ρ 198)。說明6 轉化(轉化是指重組DNA分子導入受體細胞的過程。詳見 << 現代醫學分 子生物學》谷志遠著，人民軍醫出版社1998，P204-206)。說明7 感受態細胞(感受態細胞是指處於容易接受外源DNA狀態的細菌細胞。詳 見 << 現代醫學分子生物學》谷志遠著，人民軍醫出版社1998，p204)。說明8 質粒序列測定(質粒序列測定是指將基因和基因組轉化為具有明確結構 的化學物質的過程。詳見《分子克隆實驗指南》第三版下冊J.薩姆布魯克D. W.拉塞爾 著，科學出版社2002，p981)。說明9 引物(引物是指與模板DNA待擴增區兩側的鹼基相互補的短核苷酸鏈。詳 見 << 現代醫學分子生物學》谷志遠著，人民軍醫出版社1998，p238)。說明10 模板(模板是指PCR擴增時的DNA或RNA核苷酸鏈。詳見 <> 谷志遠著，人民軍醫出版社1998，p240)。說明11 幾丁質結合結構域(chitin binding domain)，簡稱 CBD,與 chitin 很 強的結合力，對高鹽和一定濃度的表面活性劑和以及變性劑穩定，帶有CBD的蛋白可用 chitin柱子純化。詳見NEW ENGLAND Biolabs的IMPACT-TWIN蛋白純化系統。說明12 =LB培養基(1升LB培養基其成分為胰蛋白腖10g、酵母提取物5g、NaClIOg,詳見 <> 第二版金冬雁校P908)。說明13 :IPTG(IPTG是異丙基硫代半乳糖苷。詳見 <> 谷 志遠著，人民軍醫出版社1998，pl30)。說明14 =SDS-PAGE (SDS-PAGE為十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳。<< 精編 分子生物學實驗指南》奧斯伯等著，金冬雁校科學出版社1998，P336-337)。說明15 16% Tricine SDS-PAGE(是一種用於分離肽類物質的凝膠電泳，配方 詳見 <> 吳冠芸等主編，科學出版社1998， pl92)。說明16 質譜分析(詳見下文「質譜聯用技術在生物大分子分析中的應用」龍耀 庭，陸妙琴。化學進展，1994，6 (3) 244-248)。
四

圖1.蛋白質內含子的N-端切割和目標蛋白的純化。圖2.用Siipharose交聯的C-端剪切結構域純化製備與N-端剪切結構域融合表 達的目標多肽。圖3. His-inteinN的表達和純化。1 標準分子量蛋白；2 :非誘導菌裂解液；3 :誘導表達的菌裂解液；4 Ni-Sepharose 1^MkM His—inteinN。圖4. inteinC-ETI融合蛋白的表達。1 標準分子量蛋白；2 非誘導菌裂解液；3 誘導表達的菌裂解液。圖5.用inteinN-S印harose親和柱對inteinC-ETI融合蛋白的純化。1 標準分子量蛋白；2 :inteinC-ETI包涵體；3 :inteinC_ETI復性樣品上樣後的 穿過液；4 洗滌組分；5 直接用洗脫緩衝液洗脫的inteinC-ETI融合蛋白。圖6. inteinC-ETI融合蛋白在inteinN-S印harose親和柱的裂解。1 標準分子量蛋白；2 :inteinC-ETI融合蛋白；3 :inteinC-ETI融合蛋白的切割； 4 裂解反應後穿過液中的目標蛋白ΕΤΙ。圖7.用質譜測定ETI樣品的分子量。圖8. inteinN-S印harose誘導inteinC融合蛋白切割的重複使用性。1 完整的融合蛋白(inteinC-ETI)對照；2 第1次使用；3 第2次使用；4 第3次 使用；5 第4次使用；6 第5次使用；7 第7次使用；8 第9次使用；9 第11次使用。
五具體實施例方式重組刺桐胰蛋白酶抑制劑(ETI)的製備l、pET28a/His-inteinN 和 pET28a/inteinC_ETI 表達質粒的構建pET28a/His-inteinN表達質粒的構建以pTwinl質粒為模板，用PCR擴增編碼 Ssp DnaB蛋白質內含子N-端剪接結構域的基因序列(inteinN)。PCR擴增條件為5. Ofmol pTwinl質粒，50pmol的上遊引物和下遊引物，0. 25U pyrobest酶，94°C變性2min後進行以 下26個循環94°C、30s ；55°C、Imin ；72°C、60s，PCR產物經瓊脂糖電泳純化後用DNA片段 回收試劑盒回收，用Ndel/Xhol雙酶切，回收大片段(約550bp)，與經過Ndel/Xhol消化的表達質粒pET28a混合，加入T4DNA連接酶，用連接產物轉化E. coli DH5 α感受態細胞，用 NdeI/XhoI雙酶切鑑定陽性克隆，對pET28a/HiS-inteinN表達質粒進行序列測定。pET28a/inteinC-ETI表達質粒的構建以pTwinl質粒為模板，用PCR擴增編碼 Ssp DnaB蛋白質內含子C-端剪接結構域的基因序列(inteinC)。PCR擴增條件為5. Ofmol pTwinl質粒，50pmol的上遊引物和下遊引物，0. 25U pyrobest酶，94°C變性2min後進行以 下26個循環94°C、30s ；55°CUmin ；72°C、60s，PCR產物經瓊脂糖電泳純化後用DNA片段回 收試劑盒回收(約150bp)。通過PCR擴增ETI基因，擴增方法與上相同，模板為本實驗室保存的質粒。PCR產 物經瓊脂糖電泳後純化回收。將回收的inteinC和ETI基因通過重疊PCR相連，ETI作為目標蛋白連接在 inteinC基因的3』端，且處於同一閱讀框。用NdeI和XhoI雙酶切處理PCR產物，經瓊脂糖 電泳純化後與pET28a載體連接，用連接產物轉化E. coli DH5 α感受態細胞，用Ndel/Xhol 雙酶切鑑定陽性克隆，並進一步進行序列測定。2,His-inteinN融合蛋白的表達、純化、復性及固相化(1). His-inteinN 融合蛋白的表達用 pET28a/His_inteinN 質粒轉化 E. coli BL2KDE3)感受態細胞，挑取單菌落接種至含卡那黴素(50yg/mL)的LB培養基，置37°C振 搖過夜。過夜菌按2% (ν/ν)接種於新鮮1^培養基(含卡那黴素5(^8/!^)，371、2001·/ min振搖培養至OD600值為0. 6 0. 8，加入終濃度為0. 5mmol/L IPTG誘導3. 5hr，離心 (8000rpm, IOmin, 4°C )並收集菌體。(2). His-inteinN融合蛋白的純化按每克菌體加入7. 5mL裂解緩衝液(20mmol/ LTris-HCl,0. 5mol/L NaCl，6M 鹽酸胍，IOmM β -巰基乙醇，pH7. 9)的比例，在 4°C用超聲 破菌，將裂解的菌液用20000r/min，4°C離心30min，收集上清。上清液上樣至預先用平衡緩 衝液(6M 鹽酸胍，20mmol/L Tris-HCl，0. 5mol/L NaCl，ΙΟπιΜβ -巰基乙醇，5mmol/L 咪唑， pH7. 9)平衡的Ni-S印harose層析柱(2. 5cmX5. 0cm)，用洗滌緩衝液(8M尿素，25mmol/ LTris-HCl, 0. 5mol/L NaCl，，IOmMβ -巰基乙醇，5mmol/L 咪唑，pH7. 9)充分洗滌，再用洗脫 緩衝液(8M尿素，25mmol/L Tris_HCl，0. 5mol/L NaCl，ΙΟπιΜβ -巰基乙醇，300mmol/L 咪唑， pH7. 9)洗脫。收集His-inteinN，用SDS-PAGE檢測其純度。(3). His-inteinN的復性及固相化將His-inteinN樣品滴入到100倍體積的復 性緩衝液(25mmol/L Tris-HCl，2M尿素，2mM β -巰基乙醇，pH8. 0)中，4°C靜置過夜。復 性樣品對5mM NH4HCO3充分透析，10000r/min，4°C離心30min，收集上清液，冷凍乾燥。將 His-inteinN樣品溶於0. IM NaHCO3, pH 8. 3緩衝液中，加入用溴化氰活化的S印harose 4B， 置4°C混合過夜。加入0. 2M，pH8. 2的甘氨酸，置室溫混合2小時。用0. 5M NaCl充分洗滌 His-inteinN-Sepharose.3、inteinC-ETI融合蛋白的表達和純化(1). inteinC-ETI融合蛋白的表達和復性方法與His-inteinN相同。(2). inteinC-ETI融合蛋白的純化、裂解和ETI的回收inteinC_ETI復性樣品中 加入 lmmol/L ZnSO4 後上樣至預先用緩衝液(20mmol/L NaAc, 0. lmol/L NaCl，pH5. 0)平衡 的inteinN-S印harsee親和柱上。用20倍柱體積的洗滌緩衝液(20mmol/L NaAc,0. 5mol/ L NaCl,0. 1% Tween 20，pH5. 0)充分洗滌去除雜蛋白。通常情況下，融合蛋白不直接用洗脫緩衝液(0. lmol/L Glycine-NaOH, 0. 2mol/L NaCl,pH10)洗脫，而是用3倍柱體積的切割 緩衝液(50mmol/L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，0. 2mol/L NaCl,5mmol/L EDTA，pH6. 5)快速洗 滌柱床，待液面略高於填料柱面時關閉柱子並堵上柱帽，室溫放置24小時。次日再用3倍 柱體積同樣的切割緩衝液洗滌柱床，分管接收穿過液。融合蛋白切割產生的ETI主要分布 於穿過液中，可用SDS-PAGE鑑定穿過液中目標蛋白的純度。(3). inteinN-Sepharose親和柱的再生目標蛋白ETI洗脫完畢後，再用10倍體 積的洗脫緩衝液(0. lmol/L Glycine-NaOH, 0. 2mol/L NaCl,pH10)洗滌柱床，去除仍然結合 在柱子上的蛋白(主要組分為未被切割的融合蛋白和切割產生的inteinC片段)。用pH6. 5 的20mmol/L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩衝液平衡親和層析柱，加入疊氮鈉，置4°C保存。4、重組ETI的性質鑑定將純化的ETI樣品對5mmol/L NH4HCO3充分透析後，冷凍乾燥。用質譜鑑定ETI的
分子量。5、inteinN-Sepharose親和柱的可重複使用性用1毫升inteinN-S印harose填料裝柱，將過量的inteinC-ETI融合蛋白上樣至 層析柱，使親和填料達到飽和吸附。上樣完畢，用10倍柱床體積的洗滌緩衝液洗滌柱子，然 後加入2倍柱床體積的切割緩衝液平衡層析柱，待液面接近柱床表面時堵上柱帽，室溫靜 置切割24小時。次日首先用切割緩衝液洗柱，收集含有蛋白吸收的洗脫組分。待流出液的 OD28tl回到基線後，再加入洗脫緩衝液，收集含有蛋白吸收的洗脫組分，該組分中含有未被切 割的融合蛋白和切割產生的inteinC片段。通過SDS-PAGE比較切割釋放的ETI和未被切 割的融合蛋白的量即可得到切割效率以及吸附容量。每次實驗完畢後，用洗脫緩衝液進一 步衝洗層析柱，使親和層析填料再生。重複上述實驗操作10次。根據比較每次洗脫組分的蛋白總量，來確定親和層析柱 載樣量的變化，並通過SDS-PAGE對親和層析柱每次的切割效率進行比較。6、本發明的實驗數據(l)pET28a/His-inteinN, pET28a/inteinC-ETI 表達質粒的構建DNA序列測定結果表明，上述兩個表達質粒的核酸序列完全正確。(2)His_inteinN融合蛋白的表達、純化以及inteinN-S印harose親和填料的制 備用pET28a/His_inteinN表達質粒轉化E. coli BL21，挑取單菌落接種於含卡那黴 素(SOyg/mL)的LB培養基，經IPTG誘導後，His-inteinN的表達量佔菌體總蛋白的18%。 His-inteinN融合蛋白經Ni-S印harose純化後，純度可達85% (見圖3)。從每升細菌培養 液，最終可獲得His-inteinN融合蛋白38mg。His-inteinN可有效地與經溴化氰活化的S印harose 4B交聯，交聯容量約為每毫 升填料2. 7毫克蛋白。(3) inteinC-ETI融合蛋白的表達、純化用pET28a/inteinC-ETI 表達質粒轉化E. coli BL21，經 IPTG誘導後，inteinC-ETI 的表達量佔菌體總蛋白的20% (圖4)。inteinC-ETI包涵體的復性效率達72%左右。在低 溫(40C )以及pH低於5. 0的條件下，inteinN和inteinC的結合作用不受影響，而inteinN 誘導的inteinC的C-端切割活性很低。因此在純化inteinC-ETI時，採用在低溫及低pH條件下上樣。InteinC-ETI融合蛋白復性產物經inteinN-S印harose親和柱純化後，其純度 約為90% (圖5)。(4) inteinC-ETI融合蛋白的切割結合到inteinN-S印harose親和柱上的inteinC-ETI融合蛋白可以在層析柱上直 接切割。當大腸桿菌中的雜蛋白被充分洗滌去除後，在層析柱中加入切割緩衝液(50mmol/ L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，0. 2mol/L NaCl,5mmol/L EDTA，pH6. 5)，室溫放置過夜，誘導 inteinN和inteinC的反式剪切。用切割緩衝液洗滌層析柱時，切割產生的游離ETI因不能 與inteinN結合而隨緩衝液流出。切割產生的inteinC以及未發生切割反應的融合蛋白則 仍然吸附在柱上，須用洗脫緩衝液才能洗脫。經SDS-凝膠電泳鑑定，inteinC-ETI融合蛋 白的切割效率達90 %，ETI的純度超過85 % (圖6)。(5) ETI的性質鑑定用質譜測定ETI的分子量為12973(圖7)，與理論計算值相同，說明了 inteinN誘 導inteinC的C-端切割位點的專一性。(6) inteinN-S印harose親和柱的使用重複性新製備的inteinN-S印harose親和層析填料對inteinC-ETI融合蛋白的吸附容 量約為2. 3切割效率達90%左右。反覆使用10次後，親和填料的吸附容量約為2. Omg/ ml，切割效率超過80% (圖8)。該結果表明，inteinN是一種穩定的親和層析配基， inteinN-S印harose填料可以反覆使用。參考文獻1. G. Hanning, and S. C. Makrides, Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. , Thends Biotechnol. 16(1998)54-60.2. S. Gottesman, Genetics of proteolysis in Escherichia coli., Annu. Rev. Genet. 23(1989) 163-198.3. J. Nilsson, S. Stahl, J. Lundeberg, M. Uhlen, and P. A. Nygren, Affinity fusion strategies fordetection, purification, and immobilization of recombinant proteins, Protein Expression and Purification 11(1997) 1-16.4. E. R. Lavallie, and J. M. McCoy, Gene fusion expression systems in Escherichia coli. , Curr.Opin.Biotechnol.6 (1995)501-506.5. S. Chong, G. E. Montello, A. Zhang, E. J. Cantor, W. Liao, M. Xu, and J. Benner, Utilizing the C—terminal cleavage activity of a protein splicing element to purify recombinant proteins in a single chromatographic step, Nucleic Acids Research 26(1998)5109-5115.6. P. Lepage, C. Heckel, S. Humbert, S. Stahl, and G. Rautmann, Recombinant techbology as an alternative to chemical peptide synthesis -Expression and characreization of HIV-I Rev recombinant peptides,Anal. Biochem. 213(1993)40-48.7. P. A. Nygren, S. Stahl, and M. Uhlen, Engineering proteins to facilitate bioprocessiong, Trends Biotechnol. 12 (1994) 184-188.8. S. Mathys, T. C. Evans, I. C. Chute, H. Wu, S. Chong, J. Benner, X. Liu, and M. Xu, Characterization of a self-splicing mini—intein and its conversion intoautocatalytic N_and C—terminal cleavage elements :facile production of protein building blocks for protein ligation,Gene.231 (1999) 1-13.9. Ziyong Sun，Junyong Chen，Hongwei Yao, Lili Liu, Jing Wang，Jing Zhang and Jianning Liu, Use of Ssp dnaB derived mini—intein as a fusion partner for production of recombinant human brain natriuretic peptide in Escherichia coli.， Protein Expr Purif. 43 (2005) 26-32.10. R. S. Esipov，V. N. Stepanenko , L. A. Chupova，U. A. Boyar ski kh , M.L. Filipenko, and A. I. Miroshnikov, Production of recombinant human epidermnal growth factor using Ssp dnaB mini-intein system, Protein Expr Purif. 61(2008) 1-6.11. IR. Cottinghan，A. Millar，E. Emslie，A. CoIman，A. E. Schhieke，and C. A. McKee,Method for the amidation of recombinant peptides expressed as intein fusion proteins in Escherichia coli, Nat Biotechnol. 19(2001)974-7.12. C. Morassutti, D. F. Amicis, B. Skerlavaj, M. Zanetti, and S. Marchetti, Production of a recombinant antimicrobial peptide in transgenic plants using a modified VMA intein expression system, FEBS Lett. 519(2002) 141-6.13. M. Xu, H. Paulus, and S. Chong, Fusions to self-splicing inteins for protein purification, Methods in Enzymology 362 (2000)376-418.14. H. Wu, M. Q. Xu, and X. Q. Liu, Protein trans-splicing and functional mini-inteins of a cyanobacterial dnaB intein，Biochim Biophys Acta. 1387(1998)
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15. H. ffu, Z. Hu and X. Q. Liu, Protein trans-splicing bya split inteinencodedin a split DnaEgene of Synechocystis sp. PCC6803,Proc Natl Acad SciU SA. 95(1998) :9226-31.
序列表
南京大學
利用具有反式剪接功能的蛋白質內含子製備重組多肽
6
1
318
DNA
人工序列

微型蛋白內含子Ssp DnaB N-端剪接結構域的基因序列
1
gctatctctg gcgatagtct gatcagcctg gctagcacag gaaaaagagtttctattaaa60
gatttgttag atgaaaaaga ttttgaaata tgggcaatta atgaacagacgatgaagcta120
gaatcagcta aagttagtcg tgtattttgta ctggcaaaa agctagttta ￡Ι 0 ￡1￡1￡1￡1180
actcgactag gtagaactat caaggcaacag caaatcata gatttttaactattgatggt240
110121]tggaaaagattagatgagct atctttaaaa gagcatattgctctaccccgtaaactagaa0122]agctcctctttacaattg0123]20124]1060125]PRT0126]人工序列0127]0128]微型蛋白內含子SspDnab N-端剪接結構域胺基酸序列0129]20130]Ala lie SerGlyAspSerLeu IleSerLeuAlaSerThrGlyLys0131]1510150132]Arg Val SerIleLysAspLeu LeuAspGluLysAspPheGluIle0133]2025300134]Trp Ala IleAsnGluGlnThr MetLysLeuGluSerAlaLysVal0135]3540450136]Ser Arg ValPheCysThrGly LysLysLeuValTyrIleLeuLys0137]5055600138]Thr Arg LeuGlyArgThrlie LysAlaThrAlaAsnHisArgPhe0139]6570750140]Leu Thr IleAspGlyTrpLys ArgLeuAspGluLeuSerLeuLys0141]8085900142]Glu His IleAlaLeuProArg LysLeuGluSerSerSerLeuGln0143]951001050144]Leu0145]1060146]30147]1430148]DNA0149]人工序列0150]0151]微型蛋白內含子SspDnab C-端剪接結構域的基因0152]30153]tcaccagaaatagaaaagtt gtctcagagt gatatttactgggactccatogtttctatt0154]acggagactggagtcgagag gtttttgatt tgactgtgccaggaccacataactttgtcg0155]cgaatgacatcattgtacac aac0156]40157]480158]PRT0159]人工序列
318
143

微型蛋白內含子Ssp Dnab C-端剪接結構域的胺基酸序列
4
Ser Pro GluIleGlu Lys Leu SerGln Ser Asplie Tyr Trp Asp
151015
Ser lie ValSerlie Thr Glu ThrGly Val GluGlu Val Phe Asp
202530
Leu Thr ValProGly Pro His AsnPhe Val AlaAsn Asp lie Ile
354045
Val His Asn
48
5
522
DNA
人工序列

刺桐胰蛋白酶抑制劑的基因序列
5
ggatcctcattgttagacgg taacggcgaagtggtgcagaacggtggcgc ctattatctg60
ctgccgcaggtgtgggcaca gggtggtggcgtgcagctggcgaaaaccgg cgaagaaacc120
tgcccgctgaccgtggtgca gagcccgaacgaactgagcgatggcaaacc gattcgtatt180
gaaagccgtctgcgtagcgc gtttattccggatgacgataaagtgcgtat tggctttgcg240
tatgcgccgaaatgcgcacc gagcccatggtggaccgtggtggaagatga acaggaaggc300
ctgagcgtgaaactgagcga agatgaaagcacccagtttgattatccgtt taaatttgaa360
caggtgagcgatcagctgca tagctataaactgctgtattgcgaaggcaa gcatgagaaa420
tgcgcgagcattggcattaa ccgtgatcagaaaggctatcgtcgtctggt ggtgaccgaa480
gattatccgctgaccgtggt gctgaaaaaggatgaaagcagc522
6
174
PRT
人工序列

刺桐胰蛋白酶抑制劑的胺基酸序列
6
Gly Ser SerLeuLeu Asp Gly AsnGly Glu ValVal Gln Asn Gly
151015
Gly Ala TyrTyrLeu Leu Pro GlnVal Trp AlaGln Gly Gly Gly
202530
Val Gln LeuAlaLys Thr Gly GluGlu Thr CysPro Leu Thr Val





Val Gln Ser Pro Glu Ser Arg Leu Arg Trp
Ser Gln Gly Lys Val
Ile Thr Glu Val Lys Gly Val
Arg Gly Val Asp Ser His Tyr Leu
Phe Val Glu Asp Glu Arg Lys
35 Asn 50 Arg 65 Ala 80 Glu 95 Ser 110 Gln 125 Lys 140 Arg 155 Lys 170
Glu Leu Ser
Ser Tyr Asp Thr
Ala Phe Ala Pro Glu Gln
Gln Phe
Leu His Ser Cys Ala Ser Leu Val Val Asp Glu Ser
Asp
lie
Lys
Glu
Asp
Tyr
lie
Thr
Ser 174
4045
Gly Lys Pro lie Arg lie 5560
Pro Asp Asp Asp Lys Val 7075
Cys Ala Pro Ser Pro Trp 8590
Gly Leu Ser Val Lys Leu 100105
Tyr Pro Phe Lys Phe Glu 115120
Lys Leu Leu Tyr Cys Glu 130135
Gly lie Asn Arg Asp Gln 145150
Glu Asp Tyr Pro Leu Thr 160165
1權利要求
用具有反式剪接功能的蛋白質內含子的N-端剪接結構域肽段作為親和層析的配基與固相支持介質交聯，製備親和層析填料。
2.利用權利要求1所述的親和層析填料純化與C-端剪接結構域融合表達的目標多肽。
3.在權利要求2所述的親和純化過程中，通過改變層析柱洗滌溶液的組成誘導蛋白質 內含子的反式剪切，使目標多肽從融合蛋白中釋放出來並得到純化。其中層析柱洗滌溶液 組成的改變包括PH和離子強度的改變以及加入含游離巰基功能團的化合物。
4.用具有反式剪接功能的蛋白質內含子的C-端剪接結構域肽段作為親和層析的配基 與固相支持介質交聯，製備親和層析填料。
5.利用權利要求4所述的親和層析填料純化與N-端剪接結構域融合表達的目標多肽。
6.在權利要求5所述的親和純化過程中，通過改變層析柱洗滌溶液的組成誘導蛋白質 內含子的反式剪切，使目標多肽從融合蛋白中釋放出來並得到純化。其中層析柱洗滌溶液 組成的改變包括PH和離子強度的改變以及加入含游離巰基功能團的化合物。
全文摘要
具有反式剪切活性的蛋白質內含子的N-端剪接結構域和C-端剪接結構域之間能夠特異性結合。本發明用蛋白質內含子的一個剪接結構域(N-或C-端剪接結構域)作為載體蛋白與目標多肽融合表達；將另一個剪接結構域(C-或N-端剪接結構域)與支持介質交聯，製備親和柱，用來吸附並純化上述含有目標多肽的融合蛋白。通過增加親和層析柱洗滌液中的鹽濃度，去除融合蛋白樣品中的雜質；通過改變層析柱的pH、溫度、或者加入含巰基基團的化學試劑，誘導蛋白質內含子的反式剪切，使目標多肽從融合蛋白中釋放出來，並同時獲得純化。
文檔編號C07K1/22GK101884910SQ20091002656
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月12日 優先權日2009年5月12日
發明者劉建寧, 孫自勇, 陸嵬 申請人:南京大學