以兩親共聚物為基礎的納米粒子的膠體懸液的製作方法

2023-06-02 08:04:06 2

專利名稱：以兩親共聚物為基礎的納米粒子的膠體懸液的製作方法
技術領域：
本發明的領域是向量化納米粒子的領域，它可用於活性成分的給藥。這些活性成分優選是經口或鼻、陰道、眼、皮下、靜脈內、肌內、真皮內、腹膜內、大腦內等路徑給予動物或人體的藥用產品或營養素。根據化學性質，本發明首要關注的活性成分是親水的，例如蛋白質、糖蛋白、肽、多糖、脂多糖或多核苷酸。
本發明更具體地是涉及以聚胺基酸嵌段和例如聚亞烷基二醇(PAG)，優選聚乙二醇(PEG)的類型的親水聚合物為基礎的向量化納米粒子的膠體懸液。
本發明既涉及納米粒子本身，也涉及活性成分向量體系，它是由帶有活性成分的納米粒子組成的。
本發明還涉及含有這些納米粒子的粉狀固體。
本發明還涉及帶有活性成分的粒子的所述膠體懸液的製備方法。
活性成分與納米粒子結合特別是涉及改進它們的作用時間和/或它們運輸到治療位置的時間和/或增加所述活性成分的生物利用率。已經提出了許多結合技術。這些技術首先涉及使活性成分運輸到其治療作用位置，與此同時防止其遭受身體的攻擊(水解、酶消化，等等)，其次，控制活性成分向其作用位置的釋放，以便保持身體可以獲得所需水平的量。運輸和體內停留的變化所涉及的活性成分例如是蛋白質，但是也可以是完全不同的產品，合成或天然源的有機分子。M.J.Humphrey的評論(Delivery system for peptide Drugs，由S.Davis和L.Illum編輯，紐約Plenum出版社1986)呈現了涉及提高活性成分的生物利用率的問題以及向量化和控制釋放的體系的益處。
實際上，兩種主要類型的向量化和控制釋放活性成分的體系加以區別，其特徵在於活性成分和納米粒子的結合模式，即·經吸附結合，如附

圖1所述，和·經包封(或者經塗布)結合，如附圖2所述。
通過自發吸附的活性成分與納米粒子結合是本發明涉及的體系。通常，就活性成分而言，自發吸附技術比經包封結合的技術受到的攻擊小，其中經常使用溶劑和/或表面活性劑，並且還使用易於使活性成分，特別是蛋白質性質的活性成分(保護其天然二級結構)變性的加工步驟(乳化、蒸發、蒸餾)，其中天然二級結構構成了大部分的常規目標活性成分。在經吸附結合的情況下，通過解吸進行釋放。
除了相對於納米粒子的活性成分的結合/釋放模式外，納米粒子的構成材料必須具有特定的工作性質。最後，希望獲得的納米粒子的規格特別苛刻，並且特別是包括以下規格。
1.對納米粒子所需的第一個規格是·首先，納米粒子容易與活性成分結合形成納米粒子-活性成分體系，這樣活性成分在體內能夠持續釋放並持續作用(例如，當活性成分＝胰島素時作用時間是至少24小時)，和·其次，這些納米粒子(可以帶有也可以未帶有活性成分)形成穩定的含水懸液(例如至少幾個月)，不需藉助有機溶劑和/或表面活性劑；即，納米粒子保持在懸液中，不絮凝。
2.納米粒子應由生物相容的(共)聚合物組成，它可以被除去(通過排洩)和/或快速生物降解成對身體無毒的產物。
3.還希望納米粒子具有足夠小的尺寸，以便能夠以液體懸液經受過濾器(孔徑小於或等於O.2μm)的滅菌過濾。
4.對該納米粒子和納米粒子-活性成分體系而言希望能夠經過不使活性成分變性的方法獲得。
5.納米粒子應有益地能夠控制活性成分的釋放速度。
6.另一重要的規格是納米粒子-活性成分體系能夠構成優異的可注射的藥用產品。這種提高的經注射-例如靜脈內或肌內給藥能力-可注射性」的特徵在於(i)減少了注射體積(就給定的治療劑量而言)，(ii)粘度低。
當治療劑量的活性成分與最小量的納米粒子結合時這兩個性能都滿足。換句話說，納米粒子必需有高荷載的活性成分。
7.在可注射的製品中納米粒子的固有成本必需低，並且在這種情況下，納米粒子還應帶有高的活性成分。在最後分析時，小的尺寸和高的荷載是納米粒子所需的主要規格。
8.構成納米粒子的聚合物不誘導免疫反應也是有益的。
9.最後，納米粒子在體內的壽命不低於活性成分所需的釋放時間是有益的。
如下所述，現有技術中(a)與(g)的提議，嘗試，不能滿足所有這些規格。
(a)專利US-A-5 286 495涉及使用帶相反電荷的材料，即藻酸鹽(帶負電)和聚賴氨酸(帶正電)，通過蒸發水相中的蛋白質的包封方法。該加工方法能夠生產大於35μm的粒子。
(b)而且，通常使用乳化技術製備帶有活性成分的微粒。例如，專利申請WO 91/06286、WO 91/06287和WO 89/08449公開了這種乳化技術，其中使用有機溶劑溶解聚合物，例如聚乳酸型的。然而，發現這些溶劑可以使特別是肽或多肽活性成分變性。
(c)已知為類蛋白質的生物相容性納米粒子也為已知，它早在1970由X.Fox和K.Dose描述於「Molecular Evolution and theorigin of Life」，由Marcel Dekker公司出版(1977)。因此，專利申請WO 88/01213提出了一種以合成多肽的混合物為基礎的體系，其溶解度取決於pH。為了獲得所述發明的基質微粒，它們溶解多肽的混合物，然後隨著pH改變，它們使得類蛋白質粒子沉澱。當在有活性成分的情況下發生沉澱時，該活性成分包封在粒子中。
(d)作為剩餘物，專利US 4 351 337也提到，涉及與本發明原有的活性成分向量化不同的領域。所述專利公開了固定並位於體內相當特定的位置的固體植入物。這些植入物是極微小的(160μm，長度等於2000μm)的中空管或膠囊，由共聚(胺基酸)的共聚物-例如聚(穀氨酸-亮氨酸)或聚(穀氨酸苄酯-亮氨酸)組成，它是將胺基酸N-羧酐(NCA)單體共聚合獲得的。通過從聚合物和活性成分的混合物中蒸發溶劑的技術進行包含活性成分。專利US 4 450 150屬於上面研究的專利US 4 35 1337的同族專利，並且基本上具有相同的主題。成分PAAs是聚(穀氨酸-穀氨酸乙酯)。
(e)專利申請PCT/FR WO 97/02810公開了一種控制釋放活性成分的組合物，包括許多可生物降解的聚合物層狀粒子，它至少部分結晶(乳酸聚合物)，並且活性成分吸附在所述粒子上。在這種情況下，通過解吸釋放活性成分。
(f)專利申請PCT WO 96/29991的主題是可用於向量化活性成分如胰島素的聚胺基酸粒子。這些粒子大小在10-500nm之間。
WO 96/29991的這些粒子通過將PAA與水溶液接觸自發形成。PAAs包括一由中性和疏水胺基酸單體OAA(聚亮氨酸)形成的疏水嵌段和由可離子化且親水單體IAA(聚穀氨酸)形成的親水嵌段。
(g)EP 0 583 955公開了能夠物理捕獲疏水活性成分的聚合物膠束。這些膠束由嵌段共聚物組成，所述嵌段共聚物包括由聚乙二醇(PEG)組成的親水嵌段和由聚胺基酸組成的疏水嵌段，例如PEG/聚ONAA(ONAA＝疏水中性胺基酸)。
該ONAA可以是Leu、Val、Phe、Bz-O-Glu或Bz-O-Asp，優選最後一個胺基酸。捕獲在這些PEG/聚ONAA膠束中的疏水活性成分活性成分例如是阿黴素、吲哚美辛、紅必黴素、甲氨喋呤、絲裂黴素。
在該專利申請中，呈現的唯一實例是以PEG/聚Glu-O-Bz為基礎的膠束。現在，已知這些Glu-O-Bz酯不穩定，在含水介質中水解。此外，這些產物的酶水解形成潛在毒性的非天然苯衍生物。而且，在所述文獻中沒有記載該離子物是由PEG/聚ONAA嵌段共聚物組成的，其核芯是由疏水中性聚胺基酸形成的並包括以PEG為基礎的親水外毛，這些離子能夠與親水活性成分結合併在體內釋放它們。
而且已知，PEGs不能生物降解，甚至能夠防止納米粒子的酶降解，因此削弱了納米粒子的體內生物降解性，這是本發明上下文所需的主要特徵之一。
因此從上面的內容得出，上述的現有技術的提議不完全滿足上述的規格，尤其是規格1(釋放的持續時間和體內作用以及納米粒子在含水懸液中的穩定性)，2(生物降解性)，4(不變性生產)，5(控制釋放速度)和8(沒有免疫反應)。
根據這種情況，本發明的主要目的之一是能夠提供新的納米粒子(吸附/解吸型)，它自發形成，不需要藉助表面活性劑或有機溶劑；穩定的納米粒子含水懸液，它適用於向量化活性成分(特別是諸如胰島素的蛋白質)，並且與現有技術中已知以及上面呈現(a-g，參見上面)的向量化體系相比，首先能夠顯著增加活性成分的釋放和在體內作用的時間。
本發明的另一主要目的是以膠體含水懸液形式提供新的納米粒子，它穩定(特別是相對水解)或者為粉狀並以聚亞烷基二醇(PAG)/聚(胺基酸)(PAA)嵌段共聚物為基礎，這些新的納米粒子必需最佳地滿足上面所列規格中的規格1-9。
本發明的另一主要目的是對專利申請EP 0 583 955中公開的粒子的改進。
本發明的另一主要目的是提供一種納米粒子懸液，它儘管有一PEG外殼，然而易於生物降解。
本發明的另一主要目的是提供一種新的納米粒子懸液，其特徵在於完全被控制，特別是在活性成分的攜帶量和控制活性成分釋放動力學方面。
本發明的另一主要目的是提供穩定的藥用納米粒子懸液，它可以給予人或動物，例如經口或非腸道路徑。
本發明的另一主要目的是提供一種含水膠體懸液或一種粉狀固體，包括活性成分的向量化粒子，它滿足上述規格，並且由合適且適用於給予人或動物，例如口服的呈現形式組成。
本發明的另一主要目的是提出一種PAAs粒子(乾燥或者液體懸液)的製備方法，該PAAs粒子尤其可用作活性成分(特別是諸如胰島素的蛋白質)的載體，所述方法能夠更簡單地進行，不使活性成分變性，並且能夠精細地控制所得粒子的平均粒徑。
本發明的另一主要目的是上述粒子以含水懸液或固體形式用於製備藥用產品(例如疫苗)的用途，特別是可以給藥，尤其是經口、鼻、陰道、眼、皮下、靜脈內、肌內、真皮內、腹膜內或大腦內給藥這些藥用產品中的親水活性成分，特別是蛋白質、糖蛋白、肽、多糖、脂多糖、低聚核苷酸和多核苷酸。
本發明的另一目的是提供一種藥用產品，這種類型包括一持續釋放活性成分的體系，容易生產且經濟，並且也能夠生物相容，能夠保證非常高水平的活性成分生物利用率。
本發明的另一主要目的是提供一種疫苗向量化體系，它本身和與一種或多種抗原混合不致免疫。
這些目的(尤其是)是通過涉及以下的本發明實現的首先是一種納米粒子的膠體懸液，它尤其可用於向量化活性成分，這些粒子被個體化超分子排列。該懸液的特定特性是所述粒子·以至少一種包括以下的兩親共聚物為基礎√至少一種聚亞烷基二醇(PAG)型，優選聚乙二醇(PEG)的親水聚合物嵌段；和√至少一種線性兩親共聚胺基酸(PAA)，含有α-肽鏈；和·能夠在膠體懸液中以不溶解的形式與至少一種活性成分結合，並以持續和/或延遲方式釋放所述活性成分，特別是在體內。
這些新型向量化粒子納米粒子，以穩定膠體含水懸液或粉狀固體形式的本發明基礎之一涉及新的選擇一種兩親PAG/PAA共聚物，例如一種[親水聚合物/親水聚胺基酸/疏水聚胺基酸]嵌段三聚物，能夠生產納米大小(10-500nm)的粒子，它形成在涉及水解和絮凝方面都穩定，沒有表面活性劑和/或溶劑，並且能夠通過吸附與活性成分結合併通過解吸釋放這些Aps的水性膠體懸液。在本發明的情況下，當膠體粒子和活性成分在含水介質中接觸時吸附自然並自發地發生。吸附取決於載體(納米粒子)的性質和活性成分可以利用的載體量。
本發明的主要益處之一是獲得一種納米粒子-活性成分體系，與已知體系相比，特別是與專利申請WO 96/29991中所述並包括聚(Glu)/聚Leu納米粒子的體系相比，顯著增加了在體內的作用時間(例如當活性成分＝胰島素時為10小時)。
而且，納米粒子部分由親水聚胺基酸組成的事實提供了能夠易於通過酶水解降解納米粒子的益處，這便於從體內將其除去。
優選，包含這些粒子的兩親共聚胺基酸(PAA)的胺基酸是至少兩種類型 第一種類型，包括至少一種親水胺基酸(IAA)； 第二種類型，包括至少一種疏水胺基酸(OAA)。
事實上，包含粒子的這些兩親共聚胺基酸(PAA)有益地包括至少一種整體上親水的嵌段和至少一種整體上疏水的嵌段。
根據本發明，兩親共聚物的結構以及IAA和OAA胺基酸的性質經過選擇以便·聚合物鏈以小粒子(納米粒子)形狀自發構成，·這些粒子在水中和在生理介質中形成穩定的膠體懸液，·納米粒子在含水介質中(沒有有機溶劑和/或表面活性劑)通過不使活性成分變性的自發機理與蛋白質或其它活性成分結合，·納米粒子在生理條件下，更具體地說在體內，以適用作藥物的藥動學和藥效圖譜從活性成分-納米粒子結合複合物中釋放活性成分；該釋放動力學取決於為納米粒子的前體的PAG/PAA(＝聚IAA/聚OAA)的性質。
因此，通過改變共聚物的特定嵌段結構，結合併釋放活性成分的現象可以動力且定量地控制。
疏水部分聚OAA參與聚合物鏈的聚集，它在形成的納米粒子的中心。
根據本發明的一個優選模式·親水胺基酸(IAA)選自以下 具有一個或多個可離子化鏈的胺基酸，它至少部分被離子化，優選是Glu和/或Asp及其鹽和/或Lys；它們是天然的或非天然的 及其混合物；·並且疏水胺基酸(OAA)選自以下 天然的中性胺基酸，有益地是以下小組Leu、Ile、Val、Ala、Pro、Phe及其混合物； 微量或合成的中性胺基酸，有益地是以下小組正亮氨酸、正纈氨酸及其混合物； 極性胺基酸的衍生物，有益地是以下小組穀氨酸甲酯、穀氨酸乙酯、天冬氨酸苄酯、N-乙醯基賴氨酸及其混合物；和 其混合物。
根據本發明的一個優選實施方式，包含微粒的構成兩親共聚物的兩親共聚胺基酸(PAA)具有一嵌段」結構。
根據一種變體，這些兩親共聚胺基酸(PAA)可以具有「無規」結構，條件是它仍然包括至少一個整體上為親水的嵌段和至少一個整體上為疏水的嵌段，這樣賦予了它兩親性。
優選的「嵌段」兩親PAA有益地包括·至少一個整體上是親水的嵌段，主要由IAA胺基酸組成，並具有大於或等於5個IAA單體的絕對長度，優選大於或等於200個IAA單體，甚至更優選為10-50個IAA單體之間，和·至少一個整體上是疏水的嵌段，主要由OAA胺基酸組成，絕對長度大於或等於5個OAA單體，優選大於或等於10個OAA單體，更優選為10-50個OAA單體之間。
至於親水PAG-優選PEG-它有益地是嵌段的形式，絕對長度大於或等於5個單體，優選在5-120個單體之間，甚至更優選在5-50個單體之間。應注意，該PAG(例如PEG)嵌段可以是均聚物或共聚物，特別優選均聚物。
甚至更優選，申請人慶幸的是作為納米粒子的構成材料，已選擇一特定類的嵌段三聚物親水聚合物/親水聚胺基酸/疏水聚胺基酸，它們是兩親的並且帶電。這種兩親性使其能夠獲得新的且出人意料的性能，特別是上述的那些。因此，本發明的納米粒子在沒有任何表面活性劑和任何有機溶劑的情況下並在生理pH值下形成穩定的含水懸液。而且，根據三嵌段結構的選擇，包括在PAG部分和疏水部分之間以胺基酸為基礎的親水嵌段，這些納米粒子在體內易於通過酶水解反應降解。這是本發明優選實施方式的三聚物體系的關鍵點之一。
此外，該納米粒子-活性成分組合自發形成並且首先能夠在體內長時間釋放並因此作用(例如，就例如胰島素的蛋白質而言為30小時或更長)。因此，活性成分在體內的作用時間長，足夠顯著增加治療範圍並由此改善患者舒適度。
根據本發明的一個具體工作實例，粒子由「線性三嵌段」兩親共聚物PEG/IAA/OAA的鏈組成，優選相應於下式(貼原文第14頁的結構式)其中→R1＝H、直鏈或支鏈C1-C20烷基(取代或未取代的)、芳基，優選苄基(取代或未取代的)；→R2＝NH、CO-NH、CS-NH、R8-(CH2)t-R9，其中R8和R9獨立地選自OCO、OCONH、NHCO、NHCONH、CONH、COO、NH、CO；t＝1-6，[NHCH(R1)CO-]x；→R3＝沿該鏈的相同或不同自由基，選自定義為可離子化親水胺基酸(天然或合成衍生物)的基團，即優選，基團(CH2)pC6H4OM、(CH2)pCO2M、(CH2)pN(HcRld)3X，其中p≥1，優選＝1或2；a和b的值在0-3之間，並且a+b＝3；X優選是氯離子、溴離子、硫酸根離子、硝酸根離子、磷酸氫根離子、乙酸根離子或乳酸根離子；→R4＝沿該鏈的相同或不同自由基，選自H和Me；→R5＝沿該鏈的相同或不同自由基，選自定義為疏水胺基酸(天然或合成衍生物)的基團，即優選基團H、R1、(CH2)qC6H5、(CH2)qC6H4OR1、(CH2)qOR1、(CH2)qCO2R1、(CH2)qCON(R1)2，其中q≥1，優選＝1或2；→R6＝R4；→R7＝H、R1定義如上的R1CO、直鏈或支鏈C1-C20烷基(取代或未取代的)、芳基，優選苄基(取代或未取代的)、C1-C6羥基烷基、H、-(CH2)wOH、-(CH2)wCO2M、-(CH2)w(CHR1)zOH、-(CH2)wNH2、-(CH2)yC6H4OH、(CH2)yCO-N(R1)2；R10＝H、Me、(CH2)vOH，其中w、z和v≥1並且M＝金屬或陽離子，典型地是鹼金屬如Na、Li、或K、或NH4、R1aNHb；→m＞1；n＞3；y≥0；a+b＝4。
根據本發明，在構成納米粒子的共聚物中具有親水聚胺基酸(聚IAA)嵌段是特別有益的排列，這是因為它提高了納米粒子的生物降解性。該聚IAA嵌段優選排在親水聚合物嵌段和疏水聚胺基酸(聚OAA)嵌段之間。
本發明的納米粒子粒子具有10-500nm，優選10-200nm的平均大小。為了本發明的目的，術語「平均大小」和「平均粒徑」意思是平均水力直徑。
本發明的優點之一是能夠非常好地控制這些物質的平均粒徑及其粒徑分布。聚合物鏈的自締合的控制，因此納米粒子大小的控制，是通過聚胺基酸組合物進行的，而且，就相同組合物而言，經過選擇嵌段結構及其生產方法進行控制。以這種方式，粒徑極小，為幾個納米到幾十個納米的數量級。
本發明的懸液含水並且是穩定的。
本發明不僅涉及上面定義的裸露粒子的懸液，而且涉及包括至少一種活性成分活性成分的粒子懸液。
這些粒子，可以與活性成分結合也可以不與活性成分結合，在含水液體中有益地為分散形式，但是也可以為從上述PV懸液中獲得的粉狀固體形式。
因此本發明除了涉及納米粒子的含水膠體懸液之外，還涉及包含納米粒子並由本發明的懸液獲得的粉狀固體。
應注意，疏水基團在聚合物鏈上的分布性質可以通過所選擇的合成路徑控制。在這一點上，有許多反應方案可以產生被選作用於獲得本發明的納米粒子的原料的聚合物。
根據本發明，選擇製備納米粒子懸液的一個特定方式。
因此，本發明的另一主要目的涉及以膠體懸液形式和粉狀固體形式製備所選粒子(如上所述)。考慮的製備方法主要由以下組成
*合成PAG/聚IAA/聚OAA共聚物(為納米粒子的前體)，將它們轉變成結構化納米粒子粒子；*任選，將由此生產的粒子純化；*任選，將這些粒子分離，優選通過濃縮、冷凍乾燥、過濾或乾燥。
更具體地說，該方法首先是一種製備由結構化納米粒子形成的上述粉狀固體的方法，該粒子尤其可用於向量化活性成分，這些粒子被個體化超分子排列·以至少一種兩親共聚物為基礎，包括√至少一種線性聚胺基酸(PAA)疏水嵌段，含有α-肽鏈，製備該PAA嵌段的疏水胺基酸OAA彼此相同或不同；√至少一種線性聚胺基酸(PAA)親水嵌段，含有α-肽鏈，製備該PAA嵌段的疏水胺基酸IAA彼此相同或不同；√至少一種聚亞烷基二醇(PAG)型，優選聚乙二醇(PEG)的親水聚合物嵌段；·能夠在膠體懸液中以不溶解的形式與至少一種活性成分結合，並以持續和/或延遲方式釋放該活性成分，特別是在體內。
本方法特徵在於1)將至少一個PAG嵌段(包括至少一種亞烷基二醇單體)與至少一個親水PAA嵌段(包括至少一種親水胺基酸IAA單體)反應，並與至少一個疏水PAA嵌段(包括至少一種疏水胺基酸OAA單體)反應，這種PAG嵌段和這些嵌段各自包括至少一個反應性官能團，以便獲得PAG/聚IAA/聚OAA「嵌段」兩親共聚物；2)將步驟1中獲得的PAG/聚IAA/聚OAA嵌段兩親共聚物轉移到對兩親共聚物的疏水部分而言非溶劑的介質-優選水中，這樣使得自發形成向量化粒子(納米粒子)；
3)任選，將該反應介質透析以純化該結構化粒子的含水懸液；4)任選，將來自步驟3的懸液濃縮；5)任選，將至少一種活性成分活性成分與步驟2、3或4的粒子混合；6)除去該液體介質，收集包括攜帶或未攜帶粒子的粉狀固體。
為了本發明的目的，術語「非溶劑」意思是討論的兩親共聚物的部分例如在討論的非溶劑介質中25℃下的溶解度小於1g/l。
在步驟2結束時，液體介質不形成均勻溶液，但是分離成分散相(納米粒子)和沒有「嵌段」兩親共聚物的相。
步驟1的PAG嵌段和聚OAA和聚IAA中的反應性官能團可以是胺或羧酸官能團。可以想到，在形成PAG-聚IAA和/或PAG-聚OAA和/或聚IAA-聚OAA連結之前、期間或之後，進行聚合反應獲得PAG嵌段和/或聚IAA親水嵌段和/或聚OAA疏水嵌段。
所有這些變化都在本領域技術人員的能力範圍內。
優選，在步驟1中1.1)在有下列物質的情況下進行由至少兩種不同類型的N-羧基胺基酸(NCA)酐形成的單體(首先NCA-pIAA(「pIAA」是指IAA前體)，其次NCA-OAA)的共聚合反應-至少一種極性溶劑，優選選自N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲亞碸(DMSO)、二甲基乙醯胺(DMAc)、吡咯烷酮；特別優選NMP；和-任選至少一種助溶劑，選自非質子溶劑(優選1，4-二噁烷)和/或質子溶劑(優選吡咯烷酮)和/或水和/或醇，特別優選甲醇；-進行水解，優選酸水解，將粒子的PAA前體共聚物的pIAA重複單元轉變成IAA重複單元，為此將酸性水相加入到上述有機介質中；1.2)使用至少一種聚亞烷基二醇(優選PEG或PPG)的PAG聚合物嵌段或者通過聚合亞烷基二醇單體(優選乙二醇或丙二醇)製備；該PAG嵌段用優選選自以下的反應基團官能化(有益地僅在其一端)胺類(特別是伯胺或仲胺)、醇或硫醇、活化羧酸(通過與二環己基碳二亞胺、羰基二咪唑或本領域技術人員已知的任何其它試劑的在先反應)；1.3)在聚合反應之前、期間或之後，將步驟2的官能化PAG加入到聚合親水聚IAA和疏水聚OAA嵌段用的介質中。
該方法的步驟1.1是受到聚合N-羧基-α-胺基酸(NCA)酐用的已知技術的啟發，例如文章「Biopolymers，15，1869(1976)」和H.R.Kricheldorf的書籍「α-amino acid-N-carboxy-anhydride andrelated heterocycles」Springer Verlag(1987)中所述的。
根據一種變體，在步驟1.1期間，所得聚(OAA)-聚(IAA)共聚物經沉澱-優選在水中-並且收集該沉澱物。該變體相當於製備粒子的間歇模式，其中以形成穩定的中間產物的沉澱物形式分離聚(OAA)-聚(IAA)共聚物。該沉澱物例如可以經過過濾、洗滌和乾燥。
甚至更優選，該NCA-pIAA是0-烷基化穀氨酸或天冬氨酸的NCA，例如NCA-Glu-O-Me、NCA-Glu-O-Et或NCA-Glu-O-Bz(Me＝甲基-Et＝乙基)。
而且，粒子的製備通常可以例如通過將疏水部分的非溶劑加入到溶於溶劑中的兩親共聚物的溶液中，有益地在合成該三聚物之後。將該三聚物的溶液加入到疏水部分的非溶劑中構成該方法的一個變體。該操作優選在於降低疏水部分的溶解度，以便它聚集，這樣做以便形成納米粒子。本領域技術人員能夠發現降低聚合物的疏水部分的溶解度的其它方式，例如通過改變溫度、溶劑和非溶劑的性質、或者通過結合不同技術。
例如，在製備膠體懸液期間，將步驟1的PAG-聚(IAA)-聚(OAA)兩親共聚物放置在含水介質中，其中至少一部分PAG易溶並且至少一部分OAA不易溶。該PAG-聚IAA-聚OAA共聚物以納米粒子的形式存在於該含水介質中。
另一種製備本發明納米粒子懸液的方法在於將上面作為產品的並通過獲得它的方法獲得的所述粉狀固體與含水介質，特別是與水，即對兩親共聚物的疏水部分而言為非溶劑，接觸。
因此，這些納米粒子可以在水中在沒有任何溶劑或表面活性劑的情況下獲得。
優選在聚合反應之前和/或在聚合反應開始時加入官能化PAG嵌段，它優選在正常大氣壓下在20-120℃的溫度下進行。
有益地，步驟1.2的PAGs是可商購獲得的產品(例如PEG)，或者以本身已知的方式通過聚合環氧乙烷獲得。
其它參數，例如聚合物濃度、反應混合物的溫度、親水聚合物的加入方式、使用減壓、反應時間等，根據所需效果調整，並且對本領域技術人員而言是公知的。
上面在呈現這些粒子的上下文中給出的聚合物的特性的描述，可以全部轉移到與本方法有關的本說明書中。因此，按照本發明的方法，重複胺基酸的性質和數量、以及操作條件，可以經過選擇，以便獲得不同類型的具有上述特性的聚合物。
為了將一種或多種活性成分與這些粒子結合(步驟3)，按照本發明可以進行幾種方法。這些方法的非限制性實例列於下面。
按照第一種方法，通過將含有活性成分的液相(含水或不含水)與粒子的膠體懸液接觸將活性成分與這些粒子結合。
按照第二種方法，通過將固態的活性成分與粒子的膠體懸液接觸將該活性成分與這些粒子結合。固態活性成分可以是例如冷凍乾燥物、沉澱物、粉末等的形式。
根據第三種方法，將上面作為產品的並通過其生產特性所述的粉狀固體(PAA)與含有活性成分的液相(含水或不含水)接觸。
按照第四種方法，將上面作為產品並通過其生產特性所述的粉狀固體與固態活性成分接觸。然後將該固體混合物分散到液相，優選水溶液中。
在所有這些方法中，所用的活性成分可以是純或預配的形式。
納米粒子的製備有益地是通過純化步驟進行的，它包括本領域技術人員已知的工藝。在該任選的純化步驟之後，獲得納米粒子的膠體懸液，它可以直接使用，或者可以想到通過本身已知的任何適宜物理方式分離或收集，例如通過過濾、通過濃縮、通過超濾、通過密度梯度分離、通過離心、通過沉澱、任選通過加入鹽、或者通過冷凍乾燥。
根據任選步驟5，通過任何合適的物理分離處理將雜質(鹽)和溶劑除去，例如通過滲濾(滲析)(步驟4)、過濾、pH改變、色譜或蒸餾。這些方法可以除去不想要的鹽或溶劑。
為了濃縮(步驟6)或者為了將所得結構化粒子與其液體懸液介質分離(步驟7)，任選除去水相，例如通過蒸餾、通過乾燥(例如在一爐中)、通過冷凍乾燥或者任何其它合適物理方式超濾、離心。步驟7之後，回收粉狀白色固體。
基於納米大小的粒子，懸液可以通過滅菌過濾器過濾，這樣可以獲得無菌可注射的藥用液體，容易且便宜。憑藉本發明，能夠控制粒子的大小並且獲得25-100nm的水力直徑(Dh)值是一個重要益處。
本發明還涉及上述方法的新的中間產物，特徵在於它們由為粒子前體的PAG-聚IAA-聚OAA共聚物組成。
根據其另一方面，本發明涉及上面定義的和/或通過上面呈現的方法獲得的一種懸液和/或一種粉狀固體，該懸液和該固體包括至少一種優選選自以下的活性成分·疫苗，單獨或與至少一種抗原結合；·蛋白質和/或肽，其中最優選選擇的是血紅蛋白、細胞色素、白蛋白、幹擾素、抗原、抗體、紅細胞生成素、胰島素、生長激素、因子VIII和IX、白介素或其混合物，和造血幹細胞刺激因子；·多糖，特別選擇肝素；·核酸，優選RNA和/或DNA低聚核苷酸；·屬於不同抗癌化學治療類型的非肽-蛋白質分子，特別是蒽環黴素和紫杉烷類；·及其混合物。
最後，本發明涉及一種藥用、營養、植物保護或化妝品專用產品，特徵在於它包括如上面定義的帶有活性成分的懸液和/或粉狀固體。
按照其另一目的，本發明還涉及這些帶有活性成分的納米粒子(以懸液或固態)用於生產例如控制釋放活性成分的體系的類型的藥用產品。
它們例如可以是可以優選經口、鼻、陰道、眼、皮下、靜脈內、肌內、真皮內、腹膜內或大腦內路徑給藥的藥用產品。
可以想到的化妝品應用是例如包括本發明的與納米粒子結合的活性成分的組合物，它們可以透皮使用。
下面涉及通過胰島素形成的親水活性成分的實施例將使本發明能夠在其各種產品/方法/應用方面更清楚地理解。這些實施例描述了任選攜帶有活性成分的聚胺基酸粒子的製備，並且類似地它們具有這些粒子的結構特徵和性能。
附圖簡述圖1-吸附活性成分類型的向量化粒子的方案。
圖2-包封活性成分類型的向量化粒子的方案。
圖3-注射帶有比例為0.6IU/kg的胰島素的納米粒子製劑(實施例5)之後作為時間t(小時)的函數的血糖G的變化(％基礎的平均值)。
圖4-通過透射電子顯微鏡的納米粒子的照片(實施例2)。
圖5-注射帶有比例為0.6IU/kg的胰島素的納米粒子製劑(實施例6)之後，在狗中作為時間t(小時)的函數的血糖G(％基礎的平均值)和平均血胰島素I(MU/1)的變化。
圖6-注射帶有比例為0.6IU/kg的胰島素的納米粒子製劑(實施例9)之後，在狗中作為時間t(小時)的函數的血糖G(％基礎的平均值)和平均血胰島素I(MU/1)的變化。
實施例實施例1聚(亮氨酸)12-嵌段聚(穀氨酸酯)35-(聚乙二醇)113的製備用於將NCA聚合成嵌段或無規結構的聚合物的技術對本領域技術人員為已知並且詳述於H.R.Kricheldorf的書籍「α-Amino Acid-N-Carboxy Anhydrides and Related Heterocycles」，SpringerVerlag(1987)。以下合成詳細說明了其中一種合成。
40℃下將4.96g氨基乙基-PEG(分子量5000；聚合度(DP)113)溶解在120ml NMP中。向其中加入1.4ml MeOH，接著一次加入6.4g NCA-GluOMe。半小時之後，加入1.8g NCA-Leu，並使反應持續2小時。接下來，向反應介質中加入稀鹽酸，在80℃下將所得混合物加熱24小時。50℃下，介質用6N氫氧化鈉中和。將該中間體相對水透析，以除去溶解度小的殘餘物(溶劑、鹽)。將該純化溶液冷凍乾燥得到一白色粉末。80％產率。
實施例2聚(亮氨酸)12-嵌段聚(穀氨酸酯)18-(聚乙二醇)17的製備40℃下將2.01g氨基乙基-PEG(分子量750；DP17)溶解在45ml NMP中。向其中加入1.5ml MeOH，接著一次加入9g NCA-GluOMe。半小時之後，加入5g NCA-Leu，並使反應持續2小時。接下來，向反應介質中加入稀鹽酸，在80℃下將所得混合物加熱24小時。50℃下，介質用6N氫氧化鈉中和。將該中間體相對水透析，以除去溶解度小的殘餘物(溶劑、鹽)。將該純化溶液冷凍乾燥得到一白色粉末。80％產率。
實施例3通過光掃描(LS)和透射式電子顯微鏡(TEM)證實納米粒子將10mg實施例1或2中獲得的共聚物懸浮在10ml水或鹽水溶液中。然後將該溶液加入到Coulter粒度分析儀(或雷射衍射儀)中。測定的不同產品的粒徑分析結果呈現在下表1。
表1-納米粒子粒徑測定
在本實施例中通過將實施例2的兩親共聚物懸浮於水中製備的向量化粒子納米粒子也用透射式電子顯微鏡拍照(附圖4)。
實施例4這些納米粒子與蛋白質(胰島素)結合的試驗用pH7.4的等滲磷酸鹽緩衝液為原料，製備滴定度為1.4mg/ml的人胰島素溶液，相當於40UI/ml。將實施例1或2的10mg兩親共聚物分散到1ml該胰島素溶液中。室溫下培養15小時之後，通過離心(60000×g，1小時)和超濾(過濾閾值300000D)將結合有向量化粒子納米粒子的胰島素和自由胰島素分離。通過高效液相色譜或者通過ELISA測定濾液中回收的自由胰島素並通過之差推斷結合胰島素的量。
下表2收集了對不同納米粒子進行的結合度測定的結果。結合度表示結合的胰島素相對胰島素滴定度為1.4mg/ml且納米粒子為10mg/ml的製品中所用胰島素的百分比。將該值轉變為攜帶度，它表示能夠與100mg納米粒子結合的胰島素的最大量(mg)。
表2-0.14mg胰島素/mg納米粒子混合物的胰島素結合度的測定
按照實施例89中列出的方法，用5-氯噻吩-2-磺醯氯和5-溴噻吩-2-磺醯氯和(S)-(+)-2-苯基甘氨醇、L-亮氨醇、DL-2-氨基-1-己醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、2-氨基-2-乙基-1、3-丙二醇、環亮氨醇、(S)-環己基丙氨醇、L-苯基丙氨醇、L-甲硫氨醇、DL-2-氨基-1-戊醇、L-叔-亮氨醇、氯黴素、(S)-(+)-2-氨基-1-丁醇，(S)-苄基-L-半胱氨醇、苄基-L-蘇氨醇、4-甲基苄基-H-半胱氨醇、苄基-H-酪氨醇和L-蘇氨醇製造了以下化合物(實施例89-117，表12)
表12(LCMS數據分子離子和保留時間)
NMP中。將2g氨基乙基-PEG(Mw5000)的50ml NMP的該5ml溶液一次性加入到該單體中。2小時之後，將該反應介質倒入1L水中。將形成的沉澱物過濾掉，洗滌並乾燥。產率＞95％。
將沉澱物溶解在100ml三氟乙酸中，接著在1小時內向其中加入40ml水。然後用氫氧化鈉將該懸液中和，相對水透析以除去由此形成的鹽，冷凍乾燥獲得一固體產品。
對比實施例7在健康禁食狗中結合有胰島素的納米粒子的藥動學和藥效配製實施例6的納米粒子，然後按照實施例5中給出的方案注射到動物內。下圖5給出的結果顯示低血糖效果(兩隻動物都具有)，這樣在注射之後持續高達20小時。
實施例8製劑穩定性比較按照實施例7配製實施例6的納米粒子、PEG-Leu25。在+4℃下靜置1個月之後，該製劑形成一沉澱物，它在35℃下不溶解，顯示該納米粒子製劑不穩定。
按照實施例7配製實施例1的納米粒子(聚(亮氨酸)12-嵌段-聚(穀氨酸酯)35-聚(乙二醇-)113。在+4℃下靜置1個月之後，該製劑保持透明，不形成沉澱物，顯示該納米粒子製劑穩定，因此PEG-聚IAA-聚OAA三嵌段共聚物比PEG-聚OAA二嵌段共聚物好。
對比實施例9聚(亮氨酸)12-嵌段-(穀氨酸鈉)35聚合物的製備及其藥效分析在以下改動下按照實施例1製備該聚合物，Mw＝5000且DP＝113的氨基乙基-PEG替換為等摩爾量的氨水。將該納米粒子分離，按照上面的實施例(實施例2和5)以50mg納米粒子/100UI胰島素的比例配製和注射。下圖6給出的結果顯示低血糖效果(兩個動物都具有)，並且在注射之後持續高達20小時。注釋表4普通胰島素、現有技術中結合有向量化體系的胰島素(對比實施例6和8)和結合有本發明向量化粒子的胰島素(實施例2)的體內作用時間的對比
由該表顯示，本發明的體系(實施例2)的體內作用時間(大於30小時)顯然比現有技術的體系(WO 96/29991)實施例6和8的長(20小時)。
權利要求
1.一種亞微米粒子的膠體懸液，它尤其可用於向量化活性成分，這些粒子被個體化超分子排列，特徵在於這些粒子·以至少一種包括以下的兩親共聚物為基礎√至少一種聚亞烷基二醇(PAG)型，優選聚乙二醇(PEG)的親水聚合物嵌段；和√至少一種線性兩親共聚胺基酸(PAA)，含有α-肽鏈；和·能夠在膠體懸液中以不溶解的形式與至少一種活性成分結合，並以持續和/或延遲方式釋放所述活性成分，特別是在體內。
2.如權利要求1所述所述的懸液，特徵在於構成這些粒子的兩親共聚胺基酸(PAA(s))的胺基酸是至少兩種類型·第一種類型，包括至少一種親水胺基酸(IAA)，優選選自以下 具有一個或多個可離子化鏈的胺基酸，它至少部分被離子化，優選是Glu和/或Asp及其鹽和/或Lys； 及其混合物；·第二種類型，包括至少一種疏水胺基酸(OAA)，優選選自以下 天然的中性胺基酸，有益地是以下小組Leu、Ile、Val、Ala、Pro、Phe及其混合物； 微量或合成的中性胺基酸，有益地是以下小組正亮氨酸、正纈氨酸及其混合物； 極性胺基酸的衍生物，有益地是以下小組穀氨酸甲酯、穀氨酸乙酯、天冬氨酸苄酯、N-乙醯基賴氨酸及其混合物；和 其混合物。
3.如權利要求1或2所述的懸液，特徵在於構成這些粒子的兩親共聚胺基酸包括至少一種整體上親水的嵌段和至少一種整體上疏水的嵌段。
4.如權利要求1-3任一項所述的懸液，特徵在於構成這些粒子的兩親共聚胺基酸(PAA(s))具有「無規」結構。
5.如權利要求1-3任一項所述的懸液，特徵在於構成這些粒子的兩親共聚胺基酸(PAA(s))具有「嵌段」結構。
6.如權利要求5所述的懸液，特徵在於該「嵌段」兩親PAA有益地包括·至少一個整體上是親水的嵌段，主要由IAA胺基酸組成，並具有大於或等於5個IAA單體的絕對長度，優選大於或等於200個IAA單體，甚至更優選為10-50個IAA單體之間，和·至少一個整體上是疏水的嵌段，主要由OAA胺基酸組成，絕對長度大於或等於5個OAA單體，優選大於或等於10個OAA單體，更優選為10-50個OAA單體之間。
7.如權利要求1-6任一項所述的懸液，特徵在於該親水PAG-優選PEG-有益地為絕對長度大於或等於5個單體，優選為5-120個單體，甚至更優選為5-50個單體之間的嵌段形式。
8.如權利要求1-3和5-7任一項所述的懸液，特徵在於這些粒子由「線性三嵌段」共聚物PEG/IAA/OAA的鏈組成，優選相應於下式(貼原文第35頁的結構式)其中R1＝H、直鏈或支鏈C1-C20烷基(取代或未取代的)、芳基，優選苄基(取代或未取代的)；→R2＝NH、CO-NH、CS-NH、R8-(CH2)t-R9，其中R8和R9獨立地選自OCO、OCONH、NHCO、NHCONH、CONH、COO、NH、CO；t＝1-6，[NHCH(R1)CO-]x；→R3＝沿該鏈的相同或不同自由基，選自定義為可離子化親水胺基酸(天然或合成衍生物)的基團，即優選，基團(CH2)pC6H4OM、(CH2)pCO2M、(CH2)pN(HcRld)3X，其中p≥1，優選＝1或2；a和b的值在0-3之間，並且a+b＝3；X優選是氯離子、溴離子、硫酸根離子、硝酸根離子、磷酸氫根離子、乙酸根離子或乳酸根離子；→R4＝沿該鏈的相同或不同自由基，選自H和Me；→R5＝沿該鏈的相同或不同自由基，選自定義為疏水胺基酸(天然或合成衍生物)的基團，即優選基團H、R1、(CH2)qC6H5、(CH2)qC6H4OR1、(CH2)pOR1、(CH2)pCO2R1、(CH2)pCON(R1)2，其中q≥1，優選＝1或2；→R6＝R4；→R7＝H、R1定義如上的R1CO、直鏈或支鏈C1-C20烷基(取代或未取代的)、芳基，優選苄基(取代或未取代的)、C1-C6羥基烷基、H、-(CH2)wOH、-(CH2)wCO2M、-(CH2)w(CHR1)zOH、-(CH2)wNH2、-(CH2)yC6H4OH、(CH2)yCO-N(R1)2；R10＝H、Me、(CH2)vOH，其中w、z和v≥1並且M＝金屬或陽離子，典型地是鹼金屬如Na、Li、或K、或NH4、RlNH3；→m＞1；n＞3；y≥0。
9.如權利要求1-8任一項所述的懸液，特徵在於向量化粒子(納米粒子)具有10-500nm，優選10-200nm的平均大小。
10.如權利要求1-9任一項所述的懸液，特徵在於向量化粒子(納米粒子)包括至少一種活性成分。
11.如權利要求1-10任一項所述的懸液，特徵在於它是含水的且穩定的。
12.一種粉狀固體，特徵在於它是由權利要求1-11任一項所述的懸液獲得的。
13.一種由權利要求1-3和5-11任一項所述的懸液獲得的粉狀固體的製備方法，特徵在於1)將包括至少一種亞烷基二醇單體的至少一個PAG嵌段與包括至少一種親水胺基酸IAA單體的至少一個親水PAA嵌段反應，並與包括至少一種疏水胺基酸OAA單體的至少一個疏水PAA嵌段反應，這種PAG嵌段和這些嵌段各自包括至少一個反應性官能團，以便獲得PAG/聚IAA/聚OAA「嵌段」兩親共聚物；2)將步驟1中獲得的PAG/聚IAA/聚OAA嵌段兩親共聚物轉移到對兩親共聚物的疏水部分而言非溶劑的介質-優選水中，這樣使得自發形成PA向量化粒子；3)任選，將該反應介質透析以純化該結構化粒子的含水懸液；4)任選，將來自步驟3的懸液濃縮；5)任選，將至少一種活性成分活性成分與步驟2、3或4的粒子混合；6)除去該液體介質，收集包括攜帶或未攜帶粒子的粉狀固體。
14.如權利要求1-11任一項所述的懸液的製備方法，特徵在於將如權利要求12所述的粉狀固體和/或通過如權利要求13所述的方法獲得的粉狀固體與對兩親共聚物的疏水部分為非溶劑的含水介質接觸。
15.如權利要求1-11任一項所述的懸液的製備方法，特徵在於它包括步驟1、2、3、4和任選的如權利要求13所述方法的步驟5。
16.如權利要求10所述的懸液的製備方法，特徵在於通過將含有所述親水活性成分的液相與粒子的膠體懸液接觸來將活性成分與這些粒子結合。
17.如權利要求11所述的懸液的製備方法，特徵在於通過將所述活性成分以固體形式與粒子的膠體懸液接觸來將活性成分與這些粒子結合。
18.如權利要求1-11任一項所述的懸液的製備方法，特徵在於將如權利要求12所述的粉狀固體和/或通過如權利要求13所述的方法獲得的粉狀固體與含有活性成分的液相接觸。
19.如權利要求1-11任一項所述的懸液的製備方法，特徵在於將如權利要求12所述的粉狀固體和/或通過如權利要求13所述的方法獲得的粉狀固體與固態活性成分接觸，並且將該固體混合物分散到液相，優選水溶液中。
20.一種產品，是如權利要求13所述的方法的中間體，特徵在於它由為粒子前體的PAG/聚IAA/聚OAA「嵌段」型，優選PEG/聚Glu或Asp/聚ONAA的兩親PAA共聚物組成。
21.如權利要求1-11任一項所述和/或通過如權利要求13所述的方法獲得的懸液和/或如權利要求12所述的粉狀固體，包括至少一種優選選自以下的活性成分·疫苗，單獨或與至少一種抗原結合；·蛋白質和/或肽，其中最優選選擇的是血紅蛋白、細胞色素、白蛋白、幹擾素、抗原、抗體、紅細胞生成素、胰島素、生長激素、因子VIII和IX、白介素或其混合物，和造血幹細胞刺激因子；·多糖，特別選擇肝素；·核酸，優選RNA和/或DNA低聚核苷酸；·屬於不同抗癌化學治療類型的非肽-蛋白質分子，特別是蒽環黴素和紫杉烷類；·及其混合物。
22.一種藥用、營養、植物保護或化妝品專用產品，特徵在於它包括如權利要求1-11任一項所述和/或通過如權利要求13所述的方法獲得的懸液和/或如權利要求12所述的粉狀固體。
全文摘要
本發明涉及一種在生理介質中穩定的釋放活性成分如胰島素的納米粒子的含水懸液。所得粒子以三嵌段共聚物聚乙二醇/親水聚胺基酸/疏水聚胺基酸為基礎。所述三嵌段共聚物粒子可以與活性成分結合，不會使其變性，並且能夠在體內控制和長時間釋放所述活性成分，由此能夠非常長時間地釋放該活性成分。本發明還涉及由其獲得釋放粒子的粉狀固體以及所述粉狀固體和以三嵌段共聚物為基礎釋放粒子的所述懸液的製備。本發明還涉及由所述填充有活性成分的釋放粒子獲得的藥用特定產品。
文檔編號A61K9/107GK1503664SQ02808639
公開日2004年6月9日 申請日期2002年3月26日 優先權日2001年4月2日
發明者G·蘇拉, G 蘇拉, M·布賴森, 瞪 申請人:弗拉梅技術公司