與人癌細胞的永生化相關的基因及其應用的製作方法

2023-06-02 08:46:41 3

專利名稱：：與人癌細胞的永生化相關的基因及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及與癌細胞的永生化相關的基因(永生化規定基因)以及對以具有該基因的永生化癌細胞為靶標的選擇性癌治療有用的方法。更具體而言，本發明涉及以永生化規定基因為指標的永生化癌細胞的判斷方法、以及該判斷中使用的試劑。本發明還涉及篩選以永生化癌細胞為靶標的選擇性抗癌劑(永生化癌細胞增殖抑制劑)的有效成分的方法、以及該抗癌劑(永生化癌細胞增殖抑制劑)。
背景技術：
：人實體癌除非進行根治手術，否則就會預後不良，其主要原因是因為目前的化學療法效果並不充分。以往的化學療法藥物以核酸合成過程、DNA、微管為作用點，以抑制從核酸至蛋白質生成過程為基本，因此不僅對癌細胞進行抑制，也無法避免對進行細胞增殖的再生性組織正常細胞的抑制。最近，逐漸鑑定出在癌細胞中特異性表達的分子，以其為靶標的抑制劑能夠使對正常細胞的有害反應止於最小限度，其結果是給藥量也能夠增大。對這樣的分子靶標治療藥也進行了開發，但其最大的缺點是，並非對大多病例有效，而是因各個病例的不同而效果不同，給藥前所進行的預測是不完全的。作為分子靶標治療藥的效果因各個病例而大不相同的原因，可以舉出被作為治療靶標的分子是與癌症發生過程、轉移相關的基因。癌症發生過程不僅因癌類型的不同而不同，即使在同類型癌中也是多種多樣的，因此可以認為，作為靶標的分子與癌增殖相關的程度因各個病例而不同。因此，如果能鑑定出無論癌類型而普遍地發揮核心作用的分子，就可以開發出能夠期待對多種癌症具有普遍效果的分子靶標治療藥。包括人在內的所有脊推動物的染色體的兩末端連續有稱為"TTAGGG，，的簡單重複序列(人中約為10kb，小鼠約為數倍)，在每次伴隨細胞分裂的DNA複製時不能完全複製末端而每次少量(人中約為200鹼基)縮短。該末端結構為"端粒，，，當端粒隨著細胞分裂而縮短至一定(人非癌細胞中約為5kb)以下時，細胞就已經變得無法分裂。如果癌化則能夠繼續分裂，但如果端粒縮短到極限(約2kb),則細胞消亡。通過將該縮短的端粒延長而穩定保持端粒長度能夠延長細胞分裂壽命的是逆轉錄酶"端粒酶，，(參照非專利文獻1)，該端粒酶不在通常的正常體細胞中表達，因此能夠分裂的次數僅限於數十次，而在能夠無限增殖的生殖細胞和永生化癌細胞中高度表達。以往普遍認為癌細胞均永生化，但由如下的情況，即，存在即使是臨床上明顯的癌也未必檢測出端粒酶活性的例子(參照非專利文獻2和3等)；即便使端粒酶成分TERT在非癌細胞中強制表達，也不顯現癌細胞的性狀(參照非專利文獻4)等情況，目前認為癌化與永生化是不同的現象。非專利文獻l:非專利文獻2:非專利文獻3:非專利文獻4:非專利文獻5:非專利文獻6:非專利文獻7:非專利文獻8:非專利文獻9:HarleyCB，MutationRes，256:271-82,1991KimNW等，Science266:2011-5,1994HiyamaK等，JNatlCancerInst87:895-卯2,1995MoralesCP等，NatGenet21:115-8,1999ShayJW,BacchettiS，EurJCancer33:787-91，1997HiyamaK等，JImmunol155:3711-5,1995HiyamaE等，IntJOncol9:453-8,1996ForsythNR等，AgingCell2:235-43,2003BodnarAG等，ExpCellRes228:58-64，1996非專利文獻10:HiyamaK等，IntJOncol27:87-95,200
發明內容本發明涉及永生化癌細胞的判斷方法、以及該判斷中使用的試劑。本發明還涉及篩選具有特異性抑制永生化癌細胞的增殖的作用、且作為選擇性抗癌劑而有用的永生化癌細胞增殖抑制劑的有效成分的方法以及該永生化癌細胞增殖抑制劑。本發明人等致力於能夠期待對癌治療、尤其是普遍對多種癌病例具有效果的分子靶標治療藥的開發，著眼於與癌細胞的癌化(惡性化)性狀不同的另一性狀"永生化"。即，即使體內出現癌細胞，只要抑制無限增殖，則不僅不會增大、轉移直至使宿主死亡，而且還可以期待通過採用通常的化學療法、非根治性手術來減少一定程度殘留的癌細胞數，從而使在其再次增大之前分裂壽命耗盡而自然消亡。由如下的情況等，即，在迄今為止檢測的數千樣本中臨床癌樣本的80%以上表達端粒酶(參照非專利文獻5);在迄今為止檢測的所有癌類型中均確認了端粒酶的表達；來源於人癌的細胞林幾乎全部都表達端粒酶(參照非專利文獻2);一度表達了端粒酶的癌細胞不能自然轉為陰性等情況，從而可以認為，與多種多樣的癌症發生過程不同，該永生化過程是在多數癌細胞中極普遍地共有存在的過程。即，通過將規定永生化的分子作為靶標，能夠期待無論癌類型而普遍對多數病例有效的癌的無限增殖抑制成為可能。在此意義上，也嘗試了以端粒酶本身為靼標的抗癌戰略。然而，本發明人等由如下的情況等，即，已發現即使是正常體細胞，在再生性組織的前體細胞、淋巴細胞中也檢測出了端粒酶活性(參照非專利文獻6和7);而且即便使端粒酶成分TERT在非癌細胞中強制表達，也未必會永生化(參照非專利文獻8);表達端粒酶的正常前體細胞、淋巴細胞也並非永生化，而僅是延長壽命(參照非專利文獻6和9)等情況，從而表明，僅憑端粒酶的表達細胞並不能永生化。即，要使人細胞永生化，延長染色體末端端粒的酶即端粒酶的活化幾乎是必須的，但卻並不充分，除了端粒酶活化之外，還存在永生化所不可或缺的分子，可以設想該分子在癌細胞中特異性地發揮作用。事實上，本發明人等確認，在正常體細胞中導入TERT而使端粒酶強制表達從而永生化的克隆中，特異性地表達變化的基因與已報導的癌細胞中的表達變化完全不同(參照非專利文獻10)。由這樣的事實也可以說與正常細胞的永生化和癌細胞的永生化相關的基因是不同的。如果以端粒酶本身作為靶標，則淋巴細胞、血液前體細胞和消化道黏膜隱窩細胞等的分裂能力受到抑制，作為癌治療的有害現象而致命的免疫功能、造血功能和消化道功能受損害的危險性高，但如果以僅在癌細胞中起作用的永生化規定因子作為靶標，則可以認為能夠在不損害端粒酶活性陽性的正常幹/前體細胞、淋巴細胞等的功能的情況下進行癌細胞特異性無限增殖的抑制。在該見解的基礎上，本發明人等為了發現與人癌細胞的永生化普遍相關的基因進行了悉心研究。其結果是想到，該基因與正常細胞中基於端粒酶活化而延續生命無關，而是對癌細胞的增殖維持起特異性作用，從而特定了該永生化規定基因13個基因(參照表l)。其概要如下。首先，將無論癌類型而普遍表達增強的基因通過基因晶片分析而提取出來，從得到的基因中，選擇如下的13種基因，即，在由永生化的癌細胞構成的臨床癌組織中，比由未永生化的癌細胞構成的癌組織的表達水平表達增強，並且在正常細胞中導入端粒酶而使其表達的細胞中表達未增強的基因。然後，在永生化癌細胞內通過siRNA來抑制得到的13種基因的表達，確認永生化癌細胞的增殖均得到了抑制。本發明人等在上述見解的基礎上進一步進行了反覆研究，結果完成了本發明。即，本發明具有下述方式。第l項.一種用於判斷癌細胞的永生化的基因標記，由多核苷酸構成，該多核苷酸與序列編號1~13中任一個所示的鹼基序列內的至少15個鹼基長的連續鹼基序列特異性雜交、且具有15個鹼基長以上的鹼基序列。第2項.根據第1項所述的用於判斷癌細胞的永生化的基因標記，是探針或引物。第3項.一種永生化癌細胞的判斷方法，包括下述工序(l)~(3):(1)使RNA或該RNA的衍生物與第l或2項中任一項所述的基因標記結合的工序，其中，所述RNA由從被測者採集的能夠含有癌細胞的機體試樣製備；(2)以上述基因標記為指標測定與上述基因標記結合的RNA或其衍生物的量；(3)將上述工序(2)中得到的RNA或該RNA的衍生物的量(以下，將其總稱為"RNA量")與未永生化的正常或癌細胞中相應的RNA或該RNA衍生物的量(以下，將其總稱為"對照RNA量")進行比較的工序。第4項.根據第3項所述的永生化癌細胞的判斷方法，還包括下述工序(4):(4)當工序(2)的RNA量比對照RNA量高時，判斷為被測者的癌細胞永生化，當不高時，判斷為被測者的癌細胞未永生化的工序。第5項.一種抗體，識別由序列編號14~26中任一個所示的胺基酸序列構成的多肽。該抗體優選用於判斷癌細胞的永生化。第6項.一種永生化癌細胞的判斷方法，包括下述工序(l，)~(3，)(1，)使含有多肽的蛋白質含有級分與第5項所述的抗體結合的工序，其中，所述含有多肽的蛋白質含有級分由從被測者採集的能夠含有癌細胞的機體試樣製備；(2，)以該抗體為指標測定與所述抗體結合的多肽的量的工序；(3，)將上述工序(2，)中得到的多肽量與未永生化的正常或癌細胞中相應的多肽量(以下，稱為"對照多肽量")進行比較的工序。第7項.根據第6項所述的永生化癌細胞的判斷方法，還包括下述工序(4，)(4，)當工序(2，)的多肽量比對照多肽量高時，判斷為被測者的癌細胞永生化，當不高時，判斷為被測者的癌細胞未永生化的工序。第8項.一種永生化癌細胞判斷用試劑盒，含有選自第l項所述的基因標記和第5項所述的抗體中的至少1種作為永生化細胞判斷用試劑。第9項.一種抑制永生化癌細胞增殖的物質的篩選方法，包括下述工序(A)~(D):(A)使被測物質與能夠表達由序列編號1~13中任一個所示的鹼基序列構成的基因的細胞接觸的工序；(B)對於與被測物質接觸的細胞，測定由序列編號1~13中任一個所示的鹼基序列構成的基因的表達量的工序；(C)將上述工序(B)中得到的基因的表達量與未與被測物質接觸的對照細胞中相應的基因的表達量進行比較的工序；以及(D)當上述工序(B)中得到的基因的表達量比對照表達量低時，選擇該被測物質作為抑制永生化癌細胞增殖的物質的工序。第10項.一種抑制永生化癌細胞增殖的物質的篩選方法，包括下述工序(A，)~(D，)(A，)使被測物質與由序列編號14~26中任一個所示的胺基酸序列構成的多肽接觸的工序；(B，)測定與被測物質接觸的由序列編號14~26中任一個所示的胺基酸序列構成的多肽的活性的工序；(C，)將上述工序(B，)中得到的多肽的活性與未與被測物質接觸的對照的活性進行比較的工序；(D，)當上述工序(B，)中得到的多肽的活性比對照的活性低時，選擇該被測物質作為抑制永生化癌細胞增殖的物質的工序。第11項.一種永生化癌細胞增殖抑制劑，以多核苷酸作為有效成分，該多核苷酸與序列編號1~13中任一個所示的鹼基序列的至少15個鹼基長以上的連續鹼基序列特異性雜交、且由15個鹼基以上的鹼基序列構成。第12項.根據第11項所述的永生化癌細胞增殖抑制劑，所述多核苷酸是由序列編號27~39中任一個所示的鹼基序列構成的多核苷酸。第13項.一種抗癌療法，具有將第11或12項所述的永生化癌細胞增殖抑制劑導入患者的癌細胞中的工序。第14項.一種多核苷酸在製造永生化癌細胞增殖抑制劑中的應用，該多核苷酸與序列編號1~13中的任一個所示的鹼基序列的至少15個鹼基長以上的連續鹼基序列特異性雜交、且具有15個鹼基以上的鹼基序列。第15項.根據第14項所述的應用，所述多核苷酸是由序列編號27~39中任一個所示的鹼基序列構成的多核普酸。根據本發明，弄清了在多數癌類型中，在永生化癌細胞中特異性地表達增強、且無論癌類型而普遍地控制癌細胞的永生化的基因。根據本發明的永生化癌細胞的判斷方法以及在該判斷方法中使用的試劑，能夠識別該永生化規定基因的表達程度，並由該程度鑑別用通常的病理診斷無法判斷的永生化細胞和有限壽命細胞。而且根據該鑑別，在癌的早期診斷、治療選擇、預後預測中的臨床應用成為可能。根據本發明的以永生化規定基因作為靶標的篩選方法，還能夠得到能夠特異性抑制永生化癌細胞增殖的抗癌劑的有效成分。圖l是表示人細胞的癌化永生化的機制的概略圖。圖2是表示在本發明中進行的靶標基因提取方法的概略圖。圖3表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的UBE2S基因的表達水平。圖4表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的RFC4基因的表達水平。圖5表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的PTGES2基因的表達水平。圖6表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的MAF1基因的表達水平。圖7表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的ACVR2B基因的表達水平。圖8表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的FAM119A基因的表達水平。圖9表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的LTB4DH基因的表達水平。圖10表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的DPM2基因的表達水平。圖11表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的SEPX1基因的表達水平。圖12表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的PSMA3基因的表達水平。圖13表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的CHCHD3基因的表達水平。圖14表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的LSM3基因的表達水平。圖15表示基於寡陣列的各種永生化癌細胞的GTSE1基因的表達水平。圖16表示癌細胞林中基於siRNA的UBE2S基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。圖17表示癌細胞林中基於siRNA的RFC4基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。圖18表示癌細胞林中基於siRNA的PTGES2基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。圖19表示癌細胞林中基於siRNA的MAF1基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。圖20表示癌細胞林中基於siRNA的ACVR2B基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。圖21表示癌細胞林中基於siRNA的FAM119A基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。圖22表示癌細胞林中基於siRNA的LTB4DH基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。圖23表示癌細胞林中基於siRNA的DPM2基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。圖24表示癌細胞林中基於siRNA的SEPX1基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。圖25表示癌細胞林中基於siRNA的PSMA3基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。圖26表示癌細胞林中基於siRNA的CHCHD3基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。圖27表示癌細胞林中基於siRNA的LSM3基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。圖28表示癌細胞林中基於siRNA的GTSE1基因的表達抑制及其增殖抑制效果(實施例2)。序列編號27表示與UBE2S基因相關的siRNA-l(44-64)的有義鏈的威基序列。序列編號28表示與UBE2S基因相關的siRNA-l(146-166)的有義鏈的鹼基序列。序列編號29表示與UBE2S基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號30表示與UBE2S基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。序列編號31表示與RFC4基因相關的siRNA-l(897-917)的有義鏈的鹼基序列。序列編號32表示與RFC4基因相關的siRNA-l(189-209)的有義鏈的鹼基序列。序列編號33表示與RFC4基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號34表示與RFC4基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。序列編號35表示與PTGES2基因相關的siRNA-l(2003-2023)的有義鏈的鹼基序列。序列編號36表示與PTGES2基因相關的siRNA-l(1105-1125)的有義鏈的鹼基序列。序列編號37表示與PTGES2基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號38表示與PTGES2基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。序列編號39表示與MAF1基因相關的siRNA-l(1538-1558)的有義鏈的鹼基序列。序列編號40表示與MAF1基因相關的siRNA-l(1031-1051)的有義鏈的械基序列。序列編號41表示與MAF1基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號42表示與MAF1基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。序列編號43表示與ACVR2B基因相關的siRNA-l(626-646)的有義鏈的鹼基序列。序列編號44表示與ACVR2B基因相關的siRNA-l(208-228)的有義鏈的鹼基序列。序列編號45表示與ACVR2B基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號46表示與ACVR2B基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。序列編號47表示與FAM119A基因相關的siRNA-l(754-774)的有義鏈的鹼基序列。序列編號48表示與FAM119A基因相關的siRNA-l(1068-1088)的有義鏈的鹼基序列。序列編號49表示與FAM119A基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號50表示與FAM119A基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。序列編號51表示與LTB4DH基因相關的siRNA-l(775-795)的有義鏈的鹼基序列。序列編號52表示與LTB4DH基因相關的siRNA-l(658-678)的有義鏈的鹼基序列。序列編號53表示與LTB4DH基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號54表示與LTB4DH基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。序列編號55表示與DPM2基因相關的siRNA-l(145-165)的有義鏈的鹼基序列。序列編號56表示與DPM2基因相關的siRNA-l(84-104)的有義鏈的械基序列。序列編號57表示與DPM2基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號58表示與DPM2基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。序列編號59表示與SEPX1基因相關的siRNA-l(870-8卯)的有義鏈的鹼基序列。序列編號60表示與SEPX1基因相關的siRNA-l(794-814)的有義鏈的鹼基序列。序列編號61表示與SEPX1基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號62表示與SEPX1基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。序列編號63表示與PSMA3基因相關的siRNA-l(853-873)的有義鏈的鹼基序列。序列編號64表示與PSMA3基因相關的siRNA-l(686-706)的有義鏈的鹼基序列。序列編號65表示與PSMA3基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號66表示與PSMA3基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。序列編號67表示與CHCHD3基因相關的siRNA-l(546-566)義鏈的鹼基序列。序列編號68表示與CHCHD3基因相關的siRNA-l(1450-1470)的有義鏈的鹼基序列。序列編號69表示與CHCHD3基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號70表示與CHCHD3基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。序列編號71表示與LSM3基因相關的siRNA-l(540-560)的有義鏈的鹼基序列。序列編號72表示與LSM3基因相關的siRNA-l(37-57)的有義鏈的械基序列。序列編號73表示與LSM3基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號74表示與LSM3基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。序列編號75表示與GTSE1基因相關的siRNA-2的有義鏈的鹼基序列。序列編號76表示與GTSE1基因相關的siRNA-3的有義鏈的鹼基序列。具體實施例方式(1)永生化規定基因本發明中，所謂"未永生化癌細胞"，是指癌細胞中，(l)端粒酶活性為陰性、(2)端粒長度縮短、且(3)不能確認端粒酶蛋白的表達的有限壽命細胞。另一方面，本發明中，所謂"永生化癌細胞"，是指癌細胞中，不具有上述(l)~(3)中的至少一項特徵的細胞，即，是指端粒酶活性為陽性、或者端粒長度延長、或者能夠確認端粒酶蛋白的表達的細胞，是能夠無限地進行細胞增殖的細胞。本發明中，所謂"永生化規定基因"，是指規定癌細胞的永生化的基因。作為本發明對象的癌細胞沒有特別限制，作為其來源，可以列舉例如肺癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、膽嚢、膽管癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮頸癌等。作為永生化規定基因，具體來說，可以列舉(1)UBE2S基因、(2)RFC4基因、(3)PTGES2基因、(4)MAF1基因、(5)ACVR2B基因、(6)FAM119A基因、(7)LTB4DH基因、(8)DPM2基因、(9)SEPX1基因、(10)PSMA3基因、(11)CHCHD3基因、(12)LSM3基因以及(13)GTSE1基因，這些基因的基因庫登記號、正式的基因名、基因符號以及表示這些基因的鹼基序列的序列編號示於下述表l。此外，表中的基因名、基因符號等根據NCBI中網際網路公開(http:y7www.ncbi.nlm.nih.gov/)的數據來記載。tableseeoriginaldocumentpage17如實施例l所示，上述各種永生化規定基因均在來源於肺癌、食道癌和乳癌等多種癌類型的永生化癌細胞中特異性地高度表達。此外，如實施例2所示，在永生化細胞內通過siRNA來抑制這13種基因的表達，則永生化癌細胞的增殖均得到抑制。由這些結果可以認為，上述13種永生化規定基因均為規定癌細胞的永生化的基因(永生化規定基因)。(n)用於判斷癌細胞的永生化的試劑(基因標記)如上所述，由於由序列編號1~13所示的鹼基序列構成的各永生化規定基因((l)~(13))均在來源於多種癌類型的永生化癌細胞中特異性地高度表達，因此通過將其作為指標(標記基因)，可以判斷癌細胞永生化的有無。本發明提供為了判斷所述癌細胞的永生化而優選使用的工具(試劑)，作為永生化規定基因標記(在本發明中，省略稱為"基因標記")。該基因標記以與上述序列編號1~13中任一個所示的永生化規定基因的鹼基序列內的至少15個鹼基長的連續鹼基序列特異性雜交的方式，設計為具有至少15個鹼基長的多核苷酸。此外，本發明的基因標記的方式可以根據目的進行適當設定，可以是單鏈DNA、單鏈RNA、雙鏈DNA、雙鏈RNA和DNA:RNA雜合體中的任一種。該基因標記包括在判斷永生化癌細胞時對檢測癌細胞中的永生化規定基因的表達的有無、其程度(表達量)有用的探針、引物。此外，這些探針、引物在篩選抑制永生化癌細胞的增殖的物質時，作為檢測永生化規定基因的表達變化的工具(檢測試劑)也是有用的。(n-1)探針癌細胞的永生化的判斷通過檢測在永生化癌細胞中特異性地高度表達的上述永生化規定基因[(1)UBE2S基因、(2)RFC4基因、(3)PTGES2基因、(4)MAF1基因、(5)ACVR2B基因、(6)FAM119A基因、(7)LTB4DH基因、(8)DPM2基因、(9)SEPX1基因、(10)PSMA3基因、(11)CHCHD3基因、(12)LSM3基因或(13)GTSE1基因]中的至少任一個來進行。為了檢測出這些永生化規定基因，將與這些各基因的鹼基序列特異性地雜交、而能夠特異性地檢測出該永生化規定基因的多核苷酸作為探針使用。此外，在本發明中，術語"多核普酸，，中還包括由多個鹼基序列構成的寡核苷酸。該多核苷酸以與各永生化規定基因的鹼基序列內的至少15個鹼基長~各永生化規定基因的總鹼基長、優選20個鹼基長~各永生化規定基因的總鹼基長、更優選30個鹼基長各永生化規定基因的總鹼基長的連續鹼基序列特異性雜交的方式，設計為具有與上述對應的鹼基長的多核苷酸。本說明書通篇、及權利要求書中，所謂"特異性雜交"，是指在嚴謹雜交條件下，形成特異性的雜合體，不形成非特異性的雜合體。嚴謹雜交條件可以根據按照常法形成雜合體的核酸的熔解溫度(Tm)等來確定。作為具體的能夠維持雜交狀態的洗淨條件，可以列舉通常為"lxSSC、0.1%SDS、37。C"程度的條件，更嚴格為"0.5xSSC、0.1%SDS、42'C"程度的條件，進一步嚴格為"O.lxSSC、0.1%SDS、65°C"程度的條件。此外，多核苷酸(探針)優選具有與上述永生化規定基因的至少15個鹼基長的連續鹼基序列互補的鹼基序列，但只要能夠進行上述特異性雜交即可，不必完全互補。作為該多核苷酸，優選的是，與由永生化規定基因的鹼基序列中連續的至少15個鹼基以上的鹼基序列構成的多核苷酸或其互補多核苷酸相比，在鹼基序列中具有70%以上、優選80%以上、更優選卯％以上、進一步優選95%以上、特別優選98%以上的同源性的多核苷酸。這裡，鹼基序列的同源性可以用同源性檢索、序列比對程序、BLAST、FASTA、ClustalW等進行計算。作為本發明採用為對象的探針，具體來說，可以列舉與選自下述(1)~(13)中的至少l個多核苷酸(其中，該多核苷酸為RNA時，序列中的鹼基"t"替換為"u")進行雜交、且由15個鹼基長~各永生化規定基因的總鹼基長、優選20個鹼基長~各永生化規定基因的總鹼基長、更優選30個鹼基長各永生化規定基因的總鹼基長的連續鹼基序列構成的寡或多核普酸。(1)由UBE2S基因的鹼基序列(序列編號1)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(2)由RFC4基因的鹼基序列(序列編號2)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(3)由PTGES2基因的鹼基序列(序列編號3)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(4)由MAF1基因的鹼基序列(序列編號4)中15個鹼基長以上19的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(5)由ACVR2B基因的鹼基序列(序列編號5)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(6)由FAM119A基因的鹼基序列(序列編號6)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核普酸、(7)由LTB4DH基因的鹼基序列(序列編號7)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(8)由DPM2基因的鹼基序列(序列編號8)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(9)由SEPX1基因的鹼基序列(序列編號9)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(10)由PSMA3基因的鹼基序列(序列編號10)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(11)由CHCHD3基因的鹼基序列(序列編號11)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(12)由LSM3基因的鹼基序列(序列編號12)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(13)由GTSE1基因的鹼基序列(序列編號13)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸。此外，這些多核苷酸(探針)可以基於各永生化規定基因的鹼基序列，使用例如市售的核苷酸合成機，按照常法進行製備。還可以將永生化規定基因的鹼基序列作為模板，用PCR法進行製備。進而優選的是，為了能夠容易地檢測出各永生化規定基因，該探針可以用放射性物質、螢光物質、化學發光物質、或酶進行標記(詳細內容後述)。此外，這些探針還可以固定化於任意的固相來使用。因此，本發明採用為對象的探針中，還包括將上述多核苷酸固定化於任意的固相的探針(例如將探針固定化的基因晶片、cDNA微陣列、寡DNA陣列、濾膜等)。該探針可以優選作為永生化規定基因檢測用、即永生化癌細胞檢測用的DNA晶片來利用。上述探針(多核苷酸)的固定化中使用的固相，只要能夠將多核苷酸固定化就沒有特別限制，可以列舉例如玻璃板、尼龍膜、微珠、矽片、毛細管或其它基板等。多核苷酸向固相的固定可以是使預先合成的多核苷酸置於固相上的方法，還可以是在固相上合成目標多核苷酸的方法。固定方法，例如為DNA微陣列時，利用市售的點樣儀(COSMOBIO公司制等)等，根據固定化探針的種類而在該
技術領域：
為公知[例如，釆用光刻衝支術(Affymetrix公司)、噴墨技術(RosettaInpharmatics公司)的多核苷酸的原位合成等]。(n-2)引物本發明作為基因標記提供作為用於特異性地擴增各永生化規定基因的鹼基序列區域的引物而^吏用的多核苷酸。作為該多核苷酸，可以列舉如下的多核苷酸，即，與選自下述(i)~(13)中至少1個的多核苷酸(其中，該多核苷酸為RNA時，序列中的鹼基"t，，替換為"u")的一部分特異性地雜交，用於特異性地擴增該多核苷酸或其一部分區域，且由15個鹼基長、優選15100個鹼基長、更優選15~50個鹼基長、進一步優選15-35個鹼基長的連續鹼基序列構成。(1)由UBE2S基因的鹼基序列(序列編號1)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(2)由RFC4基因的鹼基序列(序列編號2)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(3)由PTGES2基因的鹼基序列(序列編號3)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(4)由MAF1基因的鹼基序列(序列編號4)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(5)由ACVR2B基因的鹼基序列(序列編號5)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(6)由FAM119A基因的鹼基序列(序列編號6)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(7)由LTB4DH基因的鹼基序列(序列編號7)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(8)由DPM2基因的鹼基序列(序列編號8)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(9)由SEPX1基因的鹼基序列(序列編號9)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(10)由PSMA3基因的鹼基序列(序列編號10)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(11)由CHCHD3基因的鹼基序列(序列編號11)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(12)由LSM3基因的鹼基序列(序列編號12)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸、(13)由GTSE1基因的鹼基序列(序列編號13)中15個鹼基長以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸。這樣的多核苷酸(引物)與探針同樣，優選具有與上述各永生化規定基因的至少15個鹼基長的連續鹼基序列互補的鹼基序列，但只要能夠進行上述特異性雜交即可，不必完全互補。作為該多核苷酸，優選的是，與具有永生化規定基因的鹼基序列中連續的至少15個鹼基以上的鹼基序列的多核苷酸或其互補多核苷酸相比，在鹼基序列中具有70%以上、優選80%以上、更優選卯％以上、進一步優選95%以上、特別優選98%以上的同源性的多核苷酸。此外，這些多核普酸與探針同樣，可以基於上述各永生化規定基因的鹼基序列，使用市售的核普酸合成機，按照常法進行製備。(n-3)標記物上述本發明的基因標記(探針或引物)中，包括在上述多核苷酸中添加有用於檢測永生化規定基因的適當的標記物，例如螢光色素、酶、蛋白質、放射性同位素、化學發光物質、生物素等的基因標記。例如，作為在本發明中使用的螢光色素、放射性同位素或化學發光物質等標記物，可以優選使用一般標記核苷酸並在核酸的檢測、定量中使用的標記物。例如，作為螢光色素，可以列舉，HEX(4，7,2，，4，，5，，7，畫hexachloro-6-carboxylfluorescein、綠色螢光色素)、螢光素(fluorescein),NED(商品名、AppliedBiosystems乂>司制、黃色螢光色素)、或者6-FAM(商品名、AppliedBiosystems公司制、黃綠色螢光色素)、若丹明(rhodamin)或其衍生物〔例如、四曱基若丹明(TMR)〕，但不限於這些。用螢光色素標記核苷酸的方法可以使用公知的標記法中適當的方法[參照NatureBiotechnology,14,303-308(1996)。此外，還可以4吏用市售的螢光標記試劑盒(例如，AmershamPharmacia公司制寡核香酸ECL3，-oligolabelingsystem等)。以上的基因標記(未標記或標記的探針或引物)可以用作永生化規定基因檢測用試劑，換言之即永生化癌細胞檢測用試劑。(n-4)永生化癌細胞檢測用試劑盒本發明還將上述永生化癌細胞檢測用試劑[基因標記(未標記或標記的探針或引物)]作為試劑盒而提供。該試劑盒作為上述探針或引物使用。含有未標記或標記的多核苷酸(另外它們也可以固定化於固相)中的至少i個。本發明的試劑盒除了上述基因標記(探針或引物)之外，根據需要還可以適當含有雜交用試劑、探針的標記、標記體檢測劑、緩衝液等、實施後述的本發明方法所必須的試劑、器具等。(m)永生化癌細胞的判斷方法(m-i)通過使用上述本發明的基因標記(探針或引物)，可以對從被測者採集的癌細胞測定永生化規定基因(標記基因)的表達量，進而，可以基於該表達量來判斷該癌細胞為"永生化癌細胞"或"未永生化癌細胞"。用以往的病理診斷無法判定永生化癌細胞，但根據本發明的永生化癌細胞的判斷方法，能夠判斷即使是進展前的早期的永生化癌細胞，由此能夠儘早促成適於患者的癌治療。這時，上述本發明的引物用作用於特異性地識別並擴增由上述永生化規定基因的表達而生成的RNA或由其製備的多核苷酸(例如，cDNA)的引物，而本發明的探針用作用於特異性地檢測該RNA或由其衍生的多核苷酸(例如cDNA或由RNA、cDNA擴增的DNA)的探針。即，本發明的基因標記(探針或引物)可以用作用於通過稱為RNA印跡法、RT-PCR法、原位雜交法等的特異性地檢測特定基因的公知方法，來特異性地檢測永生化規定基因的引物和探針。此外，癌細胞中永生化規定基因的表達量可以使用DNA晶片進行檢測或定量。這時，本發明的探針可以作為該DNA晶片的探針來使用。例如，採用RNA印跡法的永生化規定基因的表達量的測定可以通過使用本發明的探針、優選經放射性同位素、螢光物質或化學發光物質等標記物標記的探針來進行。具體來說，將由被測者的癌細胞製備的RNA轉移至尼龍膜等中，使經標記的探針與其雜交。然後，將形成的探針與RNA的雙鏈的量以來源於該探針的標記物的信號進行測定。信號的測定可以根據探針的標記物而採用常法，例如可以用放射性檢測器、螢光檢測器等測定來進行。此外，還可以利用市售的RNA印跡法用試劑盒，按照該試劑盒的方案進行。此外，採用RT-PCR法的永生化規定基因的表達量的測定可以通過使用本發明的引物、優選經放射性同位素、螢光物質或化學發光物質等標記物標記的引物來進行。具體來說，將由被測者的癌細胞製備的RNA所製備的cDNA作為模板，使經標記的一對引物與其雜交，根據常法進行PCR。然後，將得到的擴增雙鏈DNA的量以來源於該引物的標記的信號進行測定。信號的檢測可以採用常法，例如用放射性檢測器、螢光檢測器等測定來進行。此外，還可以利用市售的RT-PCR用試劑盒，按照該試劑盒的方案進行。採用DNA晶片分析的永生化規定基因的表達量的測定，可以通過24使用本發明的探針，優選經放射性同位素、螢光物質等標記物標記的探針來進行。具體來說，首先，準備使經放射性同位素、螢光物質或化學發光物質等標記的探針固定在適當的載體上而成的DNA晶片。然後，使基於由被測者的癌細胞製備的RNA所製備的標記DNA或RNA與該DNA晶片雜交。然後，將形成的探針與標記DNA或RNA的雙鏈的量以來源於該探針的標記物的信號進行測定。信號的檢測可以採用常法，例如用放射性檢測器、螢光檢測器等測定而進行。此外，只要是固定有與本發明的探針相當的DNA的DNA晶片，也可以使用市售的DNA晶片。這些永生化規定基因的表達量的測定基本上具有下述工序(1)和(2)。(1)使由從被測者釆集的能夠含有癌細胞的機體試樣製備的RNA或該RNA的衍生物與本發明的探針或引物結合的工序；(2)以該探針或引物為指標測定與探針或引物結合的RNA或該RNA的衍生物的量的工序。此外，在上述工序(1)中，機體試樣是被測者本身的試樣，只要是有可能含有癌細胞的試樣就沒有特別限制，可以例示體液(血液、尿等)、組織、其提取物和釆集的組織的培養物等。此外，機體試樣的採集方法可以根據機體試樣的種類、癌類型相應的方法來適當進行選擇。由機體試樣製備RNA可以通過常法來進行。此外，本說明書通篇、及權利要求書中，所謂"RNA衍生物"，是指以由機體試樣製備的RNA為原料而製備的物質，包括由RNA轉錄製備的互補多核普酸(cDNA)、以及由該RNA或cDNA通過PCR法而擴增的DNA。cDNA可以通過常法來製備，而上述DNA可以通過對上述各永生化規定基因使用本發明的引物進行PCR來製備。此外，工序(1)中使用的本發明的探針或引物優選經放射性同位素、螢光物質或化學發光物質等標記物進行標記。上述工序(2)中得到的RNA或該RNA的衍生物的量反映被測者的永生化規定基因的表達量。因此，通過將上述工序(2)中得到的RNA或該RNA的衍生物的量(以下，也將這些總稱而簡單地稱為"RNA量")與未永生化的正常或癌細胞中相應的RNA或該RNA的衍生物的量(以下，也將這些總稱而簡單地稱為"對照RNA量，，)進行比較，能夠判斷被測者的癌細胞是否永生化。即，上述工序(2)中得到的被測者的RNA量(永生化規定基因的表達量)比對照RNA量(對照的永生化規定基因的表達量)高時，可以判斷為被測者的癌細胞永生化，不高時可以判斷為被測者的癌細胞未永生化。因此，本發明的永生化癌細胞的判斷方法除了上述工序(1)和(2)之外，還包括下述的工序(3)，更優選包括工序(4)。(3)將上述工序(2)中得到的RNA或該RNA的衍生物的量(RNA量)與未永生化的正常或癌細胞中相應的RNA或該RNA的衍生物的量(對照RNA量)進行比較的工序；(4)工序(2)的RNA量比對照RNA量高時，判斷為被測者的癌細胞永生化，RNA量不比對照RNA量高時，判斷為被測者的癌細胞未7^C生4匕的工序。此外，未永生化的正常或癌細胞中的永生化規定基因的RNA量(對照RNA量)，可以在均一條件下預先測定多個未永生化的正常細胞或癌細胞中的永生化規定基因的RNA量，採用該RNA量的平均值或中間值。(m-2)此外，癌細胞的永生化的判斷可以基於本發明的永生化規定基因的表達產物、即由該基因所編碼的多肽(以下，稱為"永生化規定多肽")的產量來進行。該永生化規定多肽的產量可以通過使用識別該多肽的抗體來進行測定。這裡，作為本發明採用為對象的永生化規定多肽，可以列舉與上述的各種永生化規定基因[(1)~(13)對應的下述多肽。(14)UBE2S多肽由序列編號1所示的鹼基序列構成的UBE2S基因(l)所編碼的多肽，具體為由序列編號14所示的胺基酸序列構成的多肽；(15)RFC4多肽由序列編號2所示的鹼基序列構成的RFC4基因(2)所編碼的多肽，具體為由序列編號15所示的胺基酸序列構成的多肽；(16)PTGES2多肽由序列編號3所示的鹼基序列構成的PTGES2基因(3)所編碼的多肽，具體為由序列編號16所示的胺基酸序列構成的多肽；(17)MAF1多肽由序列編號4所示的鹼基序列構成的MAF1基因(4)所編碼的多肽，具體為由序列編號17所示的胺基酸序列構成的多肽；(18)ACVR2B多肽由序列編號5所示的鹼基序列構成的ACVR2B基因(5)所編碼的多肽，具體為由序列編號18所示的胺基酸序列構成的多肽；(19)FAM119A多肽由序列編號6所示的鹼基序列構成的FAM119A基因(6)所編碼的多肽，具體為由序列編號19所示的胺基酸序列構成的多肽；(20)LTB4DH多肽由序列編號7所示的鹼基序列構成的LTB4DH基因(7)所編碼的多肽，具體為由序列編號20所示的胺基酸序列構成的多肽；(21)DPM2多肽由序列編號8所示的鹼基序列構成的DPM2基因(8)所編碼的多肽，具體為由序列編號21所示的胺基酸序列構成的多肽；(22)SEPX1多肽由序列編號9所示的鹼基序列構成的SEPX1基因(9)所編碼的多肽，具體為由序列編號22所示的胺基酸序列構成的多肽；(23)PSMA3多肽由序列編號10所示的鹼基序列構成的PSMA3基因(10)所編碼的多肽，具體為由序列編號23所示的胺基酸序列構成的多肽；(24)CHCHD3多肽由序列編號11所示的鹼基序列構成的CHCHD3基因(ll)所編碼的多肽，具體為由序列編號24所示的胺基酸序列構成的多肽；(25)LSM3多肽由序列編號12所示的鹼基序列構成的LSM3基因(12)所編碼的多肽，具體為由序列編號25所示的胺基酸序列構成的多肽；(26)GTSE1多肽由序列編號13所示的鹼基序列構成的GTSE1基因(13)所編碼的多肽，具體為由序列編號26所示的胺基酸序列構成的多肽。這裡，(14)UBE2S多肽是^〉知的多肽，其獲得方法也如J.Biol.Chem.267(22),15829-15835(1992)中所記載而>^>知。同樣地，(15)RFC4多肽也如Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(12)，5211-5215(1992)中所記載而公知，以下，(16)PTGES2多肽如Biochem.Biophys.Res.Commun.291(4)，884-889(2002);(18)ACVR2B多肽如Mol.CellBiol.16(3)，1066-1073(1996);(20)LTB4DH多肽如J.Biol.Chem.271(5),2844-2850(1996);(21)DPM2多肽如EMBOJ.19(11)，2475-2482(2000》(22)SEPX1多肽如J.Biol.Chem.274(48),33888-33897(1999);(23)PSMA3多肽如Biochem.Biophys.Res.Commun.207(1),318-323(1995);(25)LSM3多肽如EMBOJ.18(12)，3451-3462(1999)5(26)GTSE1多肽如Gene254(1-2)，229-236(2000)中所記載，均為乂厶知的多肽。此外，這些永生化規定多肽[(14)~(26)I也可以如下進行製備，即，克隆對應的永生化規定基因[(1)~(13)，與細菌質粒進行連接後，向大腸桿菌等宿主細胞進行轉化，培養得到的轉化細胞，從培養物中進行回收。本發明中使用的抗體只要是識別上述永生化規定多肽的抗體就沒有特別限制，可以是單克隆抗體和多克隆抗體中的任一種。此外，抗體可以是以上述永生化規定多肽為免疫抗原而製備的抗體，還可以是對由構成該永生化規定多肽的胺基酸序列中的至少連續8個胺基酸、優選15個胺基酸、更優選20個胺基酸構成的多肽具有抗原結合性的抗體。該多肽可以根據本發明的永生化規定多肽的胺基酸序列、編碼其的鹼基序列，用通常公知的方法進行合成。例如，可以例舉採用胺基酸合成機的化學合成方法、基因工程學的方法。本發明的抗體可以通過常法製造(例如，CurrentprotocolsinMolecularBiologyedit.Ausubeletal.(1987)，Publish.JohnWileyandSons.Section11.12-11.13)。例如，為多克隆抗體時，可以如下得到，即，使用按照常法在大腸桿菌中表達而純化的上述多肽，或者使用按照常法以具有這些的部分胺基酸序列的方式合成的多肽，對實驗動物進行免疫，由該免疫動物的血清按照常法得到。另一方面，例如為單克隆抗體時，可以如下得到，即，使用按照常法在大腸桿菌等中表達而純化的上述多肽，或者使用按照常法以具有這些的部分胺基酸序列的方式合成的多肽，對實驗動物進行免疫，使由該實驗動物得到的脾細胞和骨髓瘤細胞融合而合成雜交瘤細胞，從該細胞中得到。此外，這些抗體還可以含有用於判斷上述癌細胞的永生化的試劑和試劑盒的一成分。永生化癌細胞的判斷具體可以通過下述工序(1，)~(2，)進行。(1，)將由從被測者採集的能夠含有癌細胞的機體試樣製備的含有多肽的蛋白質含有級分和識別本發明的永生化規定多肽的抗體混合的工序；(2，)以該抗體為指標測定與上述抗體結合的多肽的量的工序。此外，上述工序(2，)中得到的多肽的量反映永生化規定多肽的產生量。在上述工序(2，)中，機體試樣是被測者本身的試樣，只要是有可能含有癌細胞的試樣就沒有特別限制，可以例示體液(血液、尿等)、組織、其提取物和採集的組織的培養物等。此外，機體試樣的採集方法可以根據與機體試樣的種類、癌類型相應的方法來適當進行選擇。由機體試樣製備蛋白質含有級分(含有多肽)，可以將公知的分離、純化方法適當組合來進行。在對該蛋白質含有級分進行的例如蛋白質印跡法、酶免疫法(EIA)、放射免疫法(RIA)、螢光免疫法等免疫學的檢測方法時，通過使用上述抗體作為探針，能夠檢測出永生化規定多肽。以使用蛋白質印跡法測定多肽量(永生化規定多肽的產生量)的情況為例，對工序(1，)及(2，)詳細進行說明，首先，將該永生化規定多肽的抗體作為一次抗體，與由被測者的機體試樣製備的蛋白質含有級分混合，與該蛋白質含有級分中含有的永生化規定多肽結合。然後，使經放射性同位素、螢光物質或化學發光物質等標記物標記的二次抗體與一次抗體結合。接著，將永生化規定多肽的量作為來源於二次抗體的標記的信號進行測定。信號的檢測可以採用常法，例如用放射性檢測器、螢光檢測器等測定而進行。通過將上述工序(2，)中得到的被測者中的多肽量(永生化規定多肽的產生量)與未永生化的正常或癌細胞中相應的多肽量(對照多肽量)(即，對照的永生化規定多肽的產生量(對照產生量))進行比較，並識別其程度，從而能夠判斷被測者的癌細胞是否永生化。即，上述工序(2，)中得到的被測者中的多肽量(永生化規定多肽的產生量)比對照多肽量(對照產生量)高時，判斷為被測者的癌細胞永生化，不高時判斷為被測者的癌細胞未永生化。因此，本發明的永生化癌細胞的判斷方法，除了上述工序(1，)和(2，)之外，還包括下述的工序(3),更優選包括工序(4)。(3，)將上述工序(2，)中得到的多肽量與未永生化的正常或癌細胞中相應的多肽量(對照多肽量)進行比較的工序；(4，)上述工序(2，)的多肽量比對照多肽量高時，判斷為被測者的癌細胞永生化，不高時，判斷為被測者的癌細胞未永生化的工序。在此，作為未永生化的正常或癌細胞中的永生化規定多肽的產生量，可以在均一條件下預先測定多個未永生化的正常細胞或癌細胞中的永生化規定多肽的產生量，採用該產生量的平均值或中間值。(IV)永生化癌細胞增殖抑制劑的篩選方法(IV-1)如實施例所示，本發明的永生化規定基因((l)~(13))在永生化癌細胞中特異性地高度表達，而且，通過使用該各永生化規定基因的siRNA來抑制其表達，能夠抑制永生化癌細胞的增殖。這一情況顯示，具有抑制永生化規定基因((l)~(13))的表達的作用的物質，能夠成為永生化癌細胞增殖抑制劑(抗癌劑)。即，通過將上述的永生化規定基因((l)~(13))的表達抑制作為指標，能夠篩選具有抑制永生化癌細胞增殖的作用的物質。因此，本發明提供以上述永生化規定基因((l)~(13))的表達抑制作為指標的永生化癌細胞增殖抑制劑的篩選方法。該方法可以具有下述工序(A)~(D)。(A)使被測物質與能夠表達(1)~(13)中的任一個永生化規定基因的細胞接觸的工序；(B)測定與被測物質接觸的細胞中該永生化規定基因的表達量的工序；(C)將上述工序(B)中得到的永生化規定基因的表達量與未與被測物質接觸的細胞中該永生化規定基因的表達量(對照表達量)進行比較的工序；(D)當上述工序(B)中得到的基因的表達量比對照表達量低時，選擇該被測物質作為抑制永生化癌細胞增殖的物質的工序。本發明中使用的細胞只要能夠表達上述(1)~(13)中的至少任一種永生化規定基因，就可以是來源於任意組織的細胞，作為其來源，可以列舉例如肺、胃、結腸、直腸、肝、膽嚢、膽管、胰腺、腎、膀胱、前列腺、子宮、骨髓、淋巴結、血液等。細胞的來源可以是哺乳類或鳥類中的任一種，更優選哺乳類，進一步優選人。此外，永生化規定基因的表達可以是內原性也可以是外源性。作為被測物質沒有特別限制，可以是核酸(包括多核苷酸)、肽(包括多肽)、有機化合物、無機化合物等中的任一種。篩選可以具體通過使被測物質或含有該被測物質的試樣(被測試樣)與能夠表達上述永生化規定基因的細胞接觸而進行。作為該被測試樣，包括細胞提取液、基因文庫的表達產物、植物或動物的天然物的提取物等。此外，篩選時，使細胞與被測物質接觸的條件只要是細胞不會死亡且在該細胞中永生化規定基因能夠表達的條件就沒有特別限制。上述工序(B)和(C)中永生化規定基因的表達量，可以使用上述的本發明的探針或引物，通過RNA印跡法或RT-PCR法等方法，來測定永生化規定基因的mRNA或由其衍生的cDNA、雙鏈DNA的量。此外，作為上述工序(B)和(C)中的永生化規定基因的表達量，可以採用作為永生化規定基因的表達產物的永生化規定多肽的量。永生化規定多肽的量可以使用上述的永生化規定多肽的抗體，通過進行蛋白質印跡法、酶免疫法(EIA)、放射免疫法(RIA)、螢光免疫法等免疫學的檢測方法來測定。在工序(C)中，通過將上述工序(B)中得到的永生化規定基因的表達量與未使被測物質與細胞接觸時的永生化規定基因的表達量(對照表達量)進行比較，能夠選擇抑制永生化癌細胞增殖的物質。即，當上述工序(B)中得到的永生化規定基因的表達量比對照表達量低時，選擇該被測物質作為抑制永生化癌細胞增殖的物質。(IV-2)永生化癌細胞的增殖抑制劑的篩選還可以通過將作為本發明的永生化規定基因((l)~(13))的表達產物的永生化規定多肽((14)~(26))的活性抑制作為指標來進行。例如，已知(14)UBE2S多肽具有泛素化活性(E2)(J.Biol.Chem.267(22)，15829-15835(1992))。同樣地，分別已知，(16)PTGES2多肽具有將前列腺素H2轉化為前列腺素E2的活性(Biochem.Biophys.Res.Commun.291(4),884-889(2002));(18)ACVR2B多肽為i^膜受體，其細胞內結構域中具有Ser/Thr激酶活性(Mol.CellBiol.16(3),1066-1073(1996));(20)LTB4DH多肽具有將白三烯B4轉化為12-氧-白三烯B4的活性(J.Biol.Chem.271(5),2844-2850(1996));(22)SEPX1多肽具有甲硫氨酸亞碸還原活性(Mol.Biol.Cel115(3),1055-1064(2004))。因此，永生化癌細胞的增殖抑制劑的篩選，特別是可以通過以這些永生化規定多肽的活性抑制為指標來進行。具體來說，通過下述工序(A，)~(D，)，能夠篩選抑制永生化癌細胞增殖的物質。(A，)使被測物質與(14)~(26)中的任一種永生化規定多肽接觸的工序；(B，)測定與被測物質接觸的永生化規定多肽的活性的工序；(C，)將上述工序(B，)中得到的永生化規定多肽的活性與未與被測物質接觸的水溶液、細胞或細胞級分中的細胞中的永生化規定多肽的活性(對照活性)進行比較的工序；(D，)當上述工序(B，)中得到的永生化規定多肽的活性比對照活性低時，選擇該被測物質作為抑制永生化癌細胞增殖的物質的工序。該篩選以永生化規定多肽的活性作為指標，可以將含有(14)~(26)[優選(14)、(16)、(18)、(20)或(22)中的任一種永生化規定多肽、或者能夠含有其的物質作為對象來進行，具體來說，根據永生化規定多肽的功能(活性)，可以列舉含有(14)~(26)[優選(14)、(16)、(18)、(20)或(22)中的任一種永生化規定多肽的水溶液；能夠表達(l)~(13)[優選(1)、(3)、(5)、(7)或(9)中的任一種永生化規定基因的細胞或者由該細胞製備的細胞級分中的任一形式。這裡所謂水溶液，只要含有永生化規定多肽即可，沒有限制，例如，除了通常的水溶液外，還包括細胞溶解液、核提取液、或培養上清液等。此外，作為細胞，可以列舉無論是內原性和外源性等來源，只要處於能夠表達永生化規定基因的狀態的細胞。此外所謂細胞級分，是指來源於該細胞的各種級分，可以列舉例如細胞膜級分、細胞質級分、細胞核級分等。此外，篩選中使用的細胞和作為對象的被測物質可以使用與上述的篩選方法同樣的細胞和被測物質。工序(B，)中的UBE2S多肽(14)的泛素化活性的測定可以通過7>知的方法進行，例如可以如J.Biol.Chem.267(22),15829-15835(1992)所述，通過在含有泛素、泛素活化酶(El)和UBE2S多肽的體系中，進行UBE2S多肽的泛素化反應，測定與UBE2S多肽結合的泛素的量來進行。這裡，泛素量的測定可以用公知的方法進行，例如，可以通過使用經放射性物質、酶等標記的泛素進行上述反應，測定該標記物的量來進行(J.Biol.Chem.267(22)，15829-15835(1992)、J.Biol.Chem.279(51),52970-52977(2004))。此外，還可以通過用抗泛素抗體進行檢測來測定(J.Biol.Chem.279(51)，52970-52977(2004))。泛素和泛素活化酶(El)可以通過公知的蛋白質合成法獲得，還可以使用市售品。工序(B，)中的PTGES2多肽(16)的前列腺素E2合成活性的測定可以用公知的方法進行，例如可以如Biochem.Biophys.Res.Commun.291(4)，884-889(2002)所述，通過在含有PTGES2多肽和前列腺素H2的體系中進行基於PTGES2多肽的前列腺素E2轉化反應，測定產生的前列腺素E2的量來進行。這裡，前列腺素E2的量的測定可以用公知的方法進行，例如，可以通過使用經放射性物質、酶等標記的前列腺素H2進行上述反應，測定產生的前列腺素E2的標記物的量來進行(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(13)，7220-7225(1999))。此外，還可以通過用抗前列腺素E2抗體進行檢測來測定(J.Dairy.Sci.87(7),2197-2210(2004))。前列腺素H2可以通過公知的合成法獲得，還可以使用市售品。工序(B，)中的ACVR2B多肽(18)的Ser/Thr激酶活性的測定可以用7>知的方法進行，例如可以如Mol.CellBiol.16(3)，1066-1073(1996)所述，通過在含有ACVR2B多肽的體系中，在基質和ATP的存在下進行激酶反應，測定基質的磷酸化量來進行。這裡，基質的磷酸化量的測定可以用公知的方法進行，例如可以通過將/2P-ATP或Y33P_ATP作為示蹤物使用來測定放射活性，從而測定磷酸化量(Mol.CellBiol.16(3)，1066-1073(1996))。此外，還可以通過使用經螢光物質、生物素等標記的基質進行磷酸化反應，測定磷酸化標記物的量來進行。作為基質，可以列舉ACVR2B多肽、特異性基質或肽。工序(B，)中的LTB4DH多肽(20)的白三烯B4轉化活性的測定可以用/〉知的方法進行，例如可以如J.Biol.Chem.271(5),2844-2850(1996)所述，通過在含有LTB4DH多肽和白三烯B4的體系中進行基於LTB4DH多肽的白三烯B4轉化反應，測定產生的12-氧-白三烯B4的量來進行。這裡，12-氧-白三烯B4的量的測定可以用公知的方法進行，例如可以通過HPLC等乂^知的方法進行測定。白三烯B4可以通過公知的化學合成法獲得，還可以使用市售品。工序(B，)中的SEPX1多肽(22)的甲硫氨酸亞碸還原活性的測定可以用^^知的方法進行，例如可以如Mol.Biol.Cell15(3)，1055-1064(2004)所述，通過在含有SEPX1多肽和曱硫氨酸亞碸的體系中進行基於SEPX1多肽的甲硫氨酸亞碸還原反應，測定產生的甲硫氨酸的量來進行。這裡，甲硫氨酸的量的測定可以用公知的方法進行，例如可以通過HPLC等公知的方法進行測定。甲硫氨酸亞碸可以通過公知的化學合成法獲得，還可以使用市售品。在工序(C，)和(D，)中，通過將上述工序(B，)中得到的永生化規定多肽的活性與對照活性進行比較，能夠選擇抑制永生化癌細胞增殖的物質。即，當上述工序(B，)中得到的永生化規定多肽的活性比對照活性低時，選擇該被測物質作為抑制永生化癌細胞增殖的物質。如實施例中所說明，表2所示的反義多核苷酸(siRNA)(序列編號27~39)，通過在癌細胞內與本發明的永生化規定基因進行雜交，抑制該永生化規定基因的表達，其結果是抑制永生化癌細胞的增殖。因此，這些反義多核普酸(siRNA)可以作為永生化癌細胞增殖抑制劑使用。因此，本發明提供以該反義多核苷酸作為有效成分的永生化癌細胞增殖抑制劑。該反義多核苷酸由15個鹼基長以上的多核苷酸構成，該多核苷酸與由(1)~(13)的永生化規定基因中的任一鹼基序列的至少15個鹼基以上的連續鹼基序列構成的多核苷酸特異性雜交。較理想的是，該多核苷酸具有與上述(l)~(13)的永生化規定基因中的至少15個鹼基以上的連續鹼基序列互補的鹼基序列，但只要能夠進行上述特異性雜交，且能夠通過與該永生化規定基因雜交來抑制該永生化規定基因的表達即可，不必完全互補。例如，可以是如下的多核苷酸，即，與該永生化規定基因的互補序列相比，在鹼基序列中具有70%以上、優選80%以上、更優選90%以上、進一步優選95%以上、特別優選98%以上的同源性，並且能夠通過與該永生化規定基因的RNA雜交而抑制該永生化規定基因的表達。此外，本發明的反義多核苷酸的鹼基長優選為15~1000個鹼基長，更優選15~500個鹼基長，特別優選16~30個鹼基長。本發明的反義多核苷酸優選為由序列編號27~39中的任一鹼基序列構成的多核苷酸，更優選它們的雙鏈RNA。此外，為了提高穩定性和細胞透過性，本發明的反義多核苷酸可以進行公知的修飾。例如，為了防止因核酸酶等水解酶所致的分解，各核苷酸的磷酸殘基可以取代為硫代磷酸酯、曱基磷酸酯、二硫代磷酸酯等化學修飾磷酸殘基。本發明的反義多核普酸的形式可以是單鏈DNA、單鏈RNA、雙鏈DNA、雙鏈RNA和DNA:RNA雜合體中的任一種。本發明的反義多核苷酸通常可以用公知的方法合成，例如，可以使用合成機來化學合成。本發明的反義多核普酸可以利用逆轉錄病毒栽體、腺病毒載體、腺病毒伴隨病毒載體等病毒載體、脂質體等非病毒載體等，通過回體(exvivo)法、體內(invivo)法等導入患者的癌細胞中，從而可以很好地用於抗癌療法中。因此，本發明中包括抗癌療法，其含有對癌患者給予以該反義多核苷酸為有效成分的永生化癌細胞增殖抑制劑的工序。本發明的永生化癌細胞增殖抑制劑以上述反義多核苷酸為有效成分，在不損害其細胞增殖抑制作用的範圍內可以含有穩定化劑、懸浮劑、冷凍劑、緩沖液、溶劑等。此外，本發明的永生化癌細胞增殖抑制劑對患者的給藥量和給藥計劃可以根據對象患者、患者的年齡、體重等由本領域技術人員來適當設定。作為這樣的給藥計劃，例如，可以舉出以3周為l療程，其中以2~3周連續靜脈給藥210mg/kg/day的上述反義多核苷酸的給藥計劃；以l周為l療程，其中以5天連續靜脈給藥80~120mg/m2/day的上述反義多核苷酸的給藥計劃；以及以4周為1療程，其中以3周連續靜脈給藥80~120mg/m2/day的上述反義多核苷酸的給藥計劃。實施例以下，示出實施例，對本發明進一步詳細進行說明，但本發明的範圍並不受這些實施例的限制。實施例1永生化規定基因的鑑定1.由人組織樣品和人癌細胞林、人非腫瘤性培養細胞製備總RNA使用RNeasyMinikit(Qiagen公司制)，按照附帶的方案從9種肺癌細胞林、21種食道癌細胞林、9種消化器癌、其它各種癌(胃癌、大腸癌、頭頸部癌、白血病)細胞林以及2種非腫瘤性食道上皮細胞、2種正常呼吸道上皮提取總RNA,在-80。C保存。然後，同樣地從ll種乳癌細胞林、IO種卵巢癌細胞林、10種胰腺癌細胞林、1種非肺瘤性永生化乳腺上皮、1種非腫瘤性乳腺上皮、來源於同一胰腺癌患者的胰腺癌組織和非癌部胰腺組織10組、來源於同一非小細胞性肺癌患者的原發灶和3處轉移肺癌組織提取總RNA並保存。總RNA4吏用2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies公司制)和RNALabChip(AgilentTechnologies公司制)確i人18S和28SrRNA的峰鮮明且為高品質後，供微陣列分析。2.微陣列分析使用上述中製備的總RNA,進行釆用微陣列的全基因表達分析。微陣列使用CodeLinkUniSetHuman20KIBioarray(19881探針)，按照(1)由總RNA合成cDNA、(2)由cDNA合成標記化cRNA、(3)標記化cRNA的片斷化、(4)片斷化cRNA和微陣列的雜交、(5)微陣列的染色、(6)微陣列的掃描、(7)基因表達分析的順序進行。(1)由總RNA合成cDNA使用CodeLinkExpressionAssayReagentKit(GEHealthcareBioscience公司制)，按照其方案進行朵一鏈(first-strand)cDNA合成。即，將1中得到的各總RNAljig用無核酸酶的水(Nuclease-freeWater)調整至lO[il，混合該試劑盒中含有的l^ilBacterialControlmRNA稀釋溶液、lulT7Oligo(dT)Primer,將合計12jil在70。C加熱10分鐘後，在水上迅速冷卻3分鐘。在冰上加入該試劑盒—含有的2jil的lOxfirst—strandBuffer、4pl的5mMdNTPMix、ljil的RNaseInhibitor、lfil的ReverseTranscriptase(200U/jil)，將合計20^1在42。C加熱2小時。然後，按照方案分解RNA-DNA雜合體中的RNA，將RNA鏈置換為DNA鏈而合成Second-strandcDNA(雙鏈cDNA)。即，在上述20jil第一鏈cDNA反應液中加入63jil無核酸酶的水、該試劑盒中含有的10xSecond國strandBuffer(lOfil)、5mMdNTPMix(化l)、DNA37PolymeraseMix(2jil:lOU/pl)、l^ilRNaseH，將合計lOOjil混合良好，在16。C加熱2小時。反應結束後，使用QIAquickPCRpurificationKit(QIAGEN公司制)，按照附帶的方案，純化合成的雙鏈cDNA。即，在cDNA溶液lOOpl中添加混合該試劑盒中含有的500^1的BufferPB，添加入安裝於2ml離心管中的QIAquick離心柱中，以13,000rpm離心50秒。除去洗脫液後再次安裝QIAquick離心柱，添加該試劑盒中含有的700jil的BufferPE,以13,000rpm離心1分鐘。除去洗脫液後再次安裝QIAquick離心柱，再次以13，000rpm離心1分鐘而完全除去BufferPE。將QIAquick離心柱安裝於新的1.5ml試管中，將30jil的無核酸酶的7JC直接添加在QIAquick離心柱的膜上，靜置1分鐘後以13，000rpm離心1分鐘，再次重複該操作(合計用60nl洗脫)。用真空乾燥機，將cDNA溶液濃縮至9.5nl以下，用無核酸酶的水定容至9.5nl。(2)由cDNA合成標記化cRNA然後,按照CodeLinkExpressionAssayReagentKit(GEHealthcareBioscience公司制)的方案，在生物素標記核苷酸的存在下進行體外轉錄反應(IVT)反應，合成cRNA。即，將該試劑盒中含有的4.0nl的10xT7ReactionBuffer、4.0^1的T7ATPSolution,4力nl的T7GTPSolution、4.0ji1的T7CTPSolution、3.0jil的T7UTPSolution混合，再加入7.5jd的10mMBiotin-ll-UTP(PerkinElmer公司制)，將合計26.5^1添加入(1)中製備的9.5jilcDNA溶液中。再加入該試劑盒中含有的4.0jil的10xT7EnzymeMix,將合計40.0^1混合良好，在氣相中在37。C加熱14小時。反應結束後，使用RNeasyMiniKit(QIAGEN公司制)，按照附帶方案，純化合成的cRNA。即，;IVT反應液(40^1)中添加60jil的無核酸酶的水，在合計lOOul的溶液中添加該試劑盒中含有的350jil的BufferRLT並混合良好，再添加250^1的100%乙醇並混合良好，將總量(700^1)添加到該試劑盒中含有的RNeasy小型離心柱上，以12，000rpm離心15秒。將RNeasy小型離心柱安裝在新的2ml試管中，將該試劑盒中含有的500^1的BufferRPE添加在柱上，以12，000rpm離心15秒，再次重複該操作。除去洗脫液後，再次將RNeasy小型離心柱安裝在原來的2ml試管中，以12，000rpm離心2分鐘，4吏柱內的膜幹^，將RNeasy小型離心柱轉移至新1.5ml試管中，將50nl的無核酸酶的水直接添加在膜上。在室溫靜置10分鐘後，以12，000rpm離心1分鐘，再次重複該操作(合計用100^1洗脫)。將樣品混合良好，2^1移液用於釆用Agilent2100Bioanalyzer的cRNA品質檢查，2nl用滅菌蒸餾7JC稀釋50倍並移液用於cRNA定量，剩餘在-80'C保存。定量是測定50倍稀釋溶液的260nm和280nm的吸光度，定量cRNA濃度，並確認260nm/280nm的吸光度比在1.8以上。cRNA濃度在0.5jig/nl以下時用真空乾燥機進行濃縮。cRNA的品質檢查使用Agilent2100Bioanalyzer和RNALabChip，按照附帶的方案進行電泳，確認彌散峰的長度為500個威基以上。(3)標記化cRNA的片斷化然後,按照CodeLinkExpressionAssayReagentKit(GEHealthcareBioscience公司制)的方案，將cRNA片斷化為約100200個>5^。即，用無核酸酶的水使lOfig的cRNA定容為20^1，添加該試劑盒中含有的5^1的5xFragmentationBuffer,在94。C加熱20分鐘後，在冰上迅速冷卻。^含有片斷化的lOfig的cRNA的25jil溶液中，加入該試劑盒中含有的78jilHybridizationBufferA、130fdHybridizationBufferB、27jil無核酸酶的水，制"計260^1的雜交溶液。以最高速度渦旋5秒並旋轉減弱後，在卯。C加熱5分鐘，進行cRNA的熱變性，在冰上冷卻。(4)片斷化cRNA和微陣列的雜交寸吏用CodeLinkShakerKit(GEHealthcareBioscience乂i^司制)、CodeLinkINNOVAShaker,按照方案進行雜交。即，將CodeLinkUniSetHuman20KIBioarray安^fr該試劑盒中含有的12SlideShakerTray上。將(3)中製備的雜交溶液以最高速度渦旋5秒並旋轉減弱後，將雜交溶液25(Hil從陣列的密封型腔右下的孔注入，用陣列附帶的Sealingstrip(密封條)將孔密封。將裝載了陣列的ShakerTray設置在CodeLinkINNOVAShaker中，一邊以37。C、300rpm迴旋一邊加熱18小時。(5)微陣列的染色使用CodeLinkParallelProcessingKit(GEHealthcareBioscience公司制)，按照方案進行陣列的染色和洗淨。即，將上述得到的完成雜交的陣列的密封腔剝下，在室溫下充滿13ml的0.75xTNTBuffer(0.1MTris-HCl(pH7.6)、0.15MNaCl、0.05%Tween20)，插入安裝有該試劑盒中含有的BioarrayRack的MediumReagentReservoir的各狹槽中。上下振動Rack數次使殘餘部分的雜交溶液從陣列落下，將保持陣列的BioarrayRack轉移至充滿了加熱至46。C的240ml0.75xTNTBuffer的LargeReagentReservoir中，在46。C加熱1小時。作為染色液，將用無核酸酶的水將每片陣列溶解為1mg/ml而得的Streptavidin-Cy5液6.8ji1，用室溫的3393.2^1的TNBBuffer(0.1MTris-HCl(pH7.6)、0.15MNaCl、0.5%TSABlockingReagent(PerkinElmer公司制)稀釋500倍，將3.4ml充滿該試劑盒中含有的SmallReagentReservoir的狹縫中。將保持陣列的BioarrayRack轉移至該SmallReagentReservoir中，用鋁等遮光並在室溫(23。C士2。C)下染色30分鐘。染色後，將BioarrayRack轉移至充滿了240ml的TNTBuffer(室溫)的LargeReagentReservoir中，上下數次後在室溫放置5分鐘，轉移至充滿了新的TNTBuffer(室溫)的LargeReagentReservoir中上下數次後在室溫放置5分鐘，將該操作重複4次進行洗淨。最後一邊用240ml的0.05%Tween20溶液上下振動5秒一邊進行洗淨，再次重複該操作。將BioarrayRack安裝在乾燥的MediumReagentReservoir中，以600xg、室溫離心3分鐘使其乾燥。(6)微陣列的掃描將染色的各陣列供給AgilentG2565(Agilent公司制)掃描儀，讀取染色蛋白質，^f^為TIFFimage。將TIFFimage用CodeLinkExpressionAnalysis軟體進行處理，將陣列上的各基因點的信號強度數值化。(7)基因表達分析將上述中得到的信號強度數據使用GeneSpringGX(Agilent公司制)微陣列基因表達分析軟體進行標準化分析。即，從點信號中減去背景信號，該值小於0.01則取O.Ol，將除以陣列的全部點信號的中值而得的值作為各個基因的標準化的相對表達量。如下所述選擇該相對表達量與正常細胞(圖l，左上)相比同時在永生化癌細胞眛(圖1，右下)中增加的基因。40可以設想，無論臟器而普遍地表達增強的基因與其說是與正常體細胞(圖1,左上)的癌化(圖l中，向下的藍色箭頭)相關的基因，毋寧為與癌細胞的永生化(圖l中，向右的紅色箭頭)相關的基因。作為在9種肺癌細胞林中的8種以上中，比2種的正常呼吸道上皮的中值高度表達2倍以上；在21種食道癌細胞林中的19種以上中，比2種非腫瘤性食道上皮的中值高度表達2倍以上；並且在9種消化器癌、其它各種癌(胃癌、大腸癌、頭頸部癌、白血病)細胞林中的8種以上中，比上述4種非腫瘤性上皮(2種呼吸道上皮和2種食道上皮)的中值高度表達2倍以上的基因，提取出51個基因(圖2,左上)。另一方面，作為這三組的各臟器癌細胞林的表達水平的平均值分別為作為對照的正常上皮的平均值的2倍以上(其中，基於該平均值而選擇使用的食道癌細1&#為最初進行分析的7種)、並且由永生化肺癌細胞構成的轉移肺癌組織中的表達水平是由同一病例的非永生化肺癌細胞構成的原發組織及轉移組織的平均值的2倍以上的基因，提取出80個基因(圖2，右上)。在這些兩組中提取出的基因中，7個基因為兩組共有而被提取出。癌細胞林均為已永生化的細胞是公知事實，這裡使用的永生化、非永生化肺癌組織，通過端粒酶活性(HiyamaK等、JNatlCancerInst87:895-卯2,1995,CaseG)、端粒長(HiyamaK等、Oncogene10937-44,1995,Case92-D)、及hTERT蛋白原位乂達(HiyamaE等、Neoplasia3:17-26，2001,Fig6A，B)分析，確認同一病例的原發灶(圖3中，"D2Pr，，)和肝轉移灶(圖3中，"D5M3")並未永生化(端粒酶活性陰性、端粒長縮短、未確認hTERT蛋白表達)；淋巴結轉移灶中的一個(圖3中，"D4M2")幾乎僅由永生化細胞構成(高端粒酶活性、端粒長延長、在幾乎全部的細胞中hTERT蛋白表達)，而另一個轉移灶(圖3中，"D3M1")則永生化細胞混在於非永生化細胞之中(低端粒酶活性、hTERT蛋白表達細胞^^於非表達細胞之中)。進而，篩得了在乳癌ll細胞眛、卵巢癌10細胞眛、胰腺癌10細胞林中共同高度表達的基因，最終確認,(1)ubiquitin國conjugatingenzymeE2S(UBE2S)、(2)replicationfactorC(activator1)4,37kDa(RFC4)(3)prostaglandinEsynthase2(PTGES2)、(4)MAF1homolog(S.cerevisiae)(MAF1)、(5)activinAreceptor,typeIIB(ACVR2B)、(6)familywithsequencesimilarity119,memberA(FAM119A)、(7)leukotrieneB412國hydroxydehydrogenase(LTB4DH)、(8)dolichyl國phosphatemaimosyltransferasepolypeptide2,regulatorysubunit(DPM2)、(9)selenoproteinX，1(SEPX1)、(10)proteasome(prosome,macropain)subunit,alphatype,3(PSMA3)、(11)coiled國coil國helix-coiled-coil-helixdomaincontaining3(CHCHD3)、(12)LSM3homolog，U6smallnuclearRNAassociated(S.cerevisiae)(LSM3)、和(13)G陽2andS-phaseexpressed1(GTSE1)合計13個基因，在肺癌細胞昧、食道癌細胞林、消化器癌細胞林、乳癌細胞眛、卵巢癌細胞眛、胰腺癌細胞林、其他的癌細胞林的大部分中，共同地比有限壽命非肺瘤性細胞高度表達，在端粒酶陽性肺癌轉移組織(永生化癌細胞)中比在同一病例的端粒酶陰性肺癌肺癌轉移組織和原發組織(非永生化癌細胞)中高度表達，進而與在混在有未永生化的癌細胞的胰腺癌組織相比，在僅由永生化的細胞構成的胰腺癌細g中高度表達(圖3)。這裡使用的胰腺癌組織，與同一病例的正常胰腺組織相比，編碼端粒酶的基因TERT的全長mRNA表達量高，但與永生化劇腺癌細lfe^目比明顯低，可以認為是混在有未永生化的細胞。如圖315所示，上述的13個基因是如下的基因，即，(1)在永生化細胞(圖3~15塗黑處除MCF-12A、SVlle、SV11-106以外全部為來源於人癌的細胞林)中，與有限壽命的非肺瘤性細胞(圖3~15留白處)相比，表達亢進；(2)來源於人癌的永生化癌細胞(圖3~15除MCF-12A、SVlle、SV11-106以外的塗黑處)中，比有限壽命癌細胞(圖3~15除SV12e、SV12-72以外的斜線)表達亢進；(3)在將正常肺纖維芽細胞中導入編碼端粒酶的基因TERT而得的非腫瘤性端粒酶表ii^命細胞(圖3~15菱形點TERT6e、TERT6-85)中，與親細胞(TIG-1)相比，沒有表達亢進；是特異性地在癌細胞端粒酶陽性永生化細胞中高度表達的基因。由此可以認為，這些基因B定癌細胞的永生化的基因(永生化規定基因)。進而、在將編碼端粒酶的基因TERT和編碼SV40earlyantigen的基因導入正常肺纖維芽細胞中而得的永生化轉化細胞(從圖315SVlle、SV11-106:確i人用軟瓊脂集落形成試驗(colonyformationassaywi仇softagar)製作菌落，而且能夠續代300PDL以上)中、與親細胞(TIG-l)、非腫瘤性延命細胞(TERT6e，TERT6-85:確i人不能用軟瓊脂集落形成試驗製作菌落，且在小於100PDL時細胞增殖停止)相比，除MAF1、LTB4DH以外表達亢進。可以認為，對於這兩個基因，體外轉化的細胞未必與人的癌同一性狀。實施例2利用永生化規定基因的siRNA(smallinterferingRNA)的癌細胞增殖抑制為了分析實施例1申特定的13種永生化規定基因與癌細胞增殖的關聯性，設計、製作各基因序列特異性siRNA後，在3種癌細胞林(HeLa:子宮頸癌、KYSE150:食道癌、HCC50:大腸癌)中導入基因，研究永生化規定基因的mRNA表達抑制以及對導入後96小時後的細胞增殖能力的影響。(1)永生化規定基因序列特異性siRNA(smallinterferingRNA)的設計和製作對於13種各永生化規定基因，設定2種或4種特異性siRNA序列，由有義鏈和反義鏈構成的形成有雙鏈的siRNA從Qiagen公司和JapanBioService公司購得。製成的各siRNA序列中，僅將有義鏈示於表2和表3中。各基因的siRNA-1為2種等摩爾混合。表2tableseeoriginaldocumentpage44表3siRNA-3856-874GCCUUAGCUGGGUGGUGM42皿微s函A-l626-646CAGCUCAUGAAUGACUUUGUA43208-228CACCAUCGAGCUCGUGAAGAA44siRNA-2684-702GGCAGAGUGAACGGGAGAU45siRNA-3840-858GGMCAUCAUCACAUGGAA46,廁說s週A-l754-774AAGGUUCACUACGAUCCUGAA471068-1088UCGAIMJAUGCUAUUUGUGUA48si隨-2201-219GGAAUUUGGG腦CAG磁49siRNA-3810-828CCAGMGGAGGACUUAUAA50siRNA-l775-795CACUGUUAUCGGCCAGAUGAA51658-678UGGA咖GAUGUCGUC鵬M52siRNA-2263-281GCCAAAAGAUUGAAGGAAG53si艦-3725-743CCUGAUGGUUAUGAUUGUU54層js週-1145-165CAGCAUGUCAUCCACAAGUAU5584-104UAGCCUGAUCAUCUUCACCUA56si隱-2116-134GGGUGAUUCUCUUGCCAUU57siRNA-3224-242UGUUUGUGGGACUGUUCAU58siRNA-1870-890CAGACUCUCGUCCUC虹GAA59794-814CUGMUGACG觀CACCCUCA60si咖A-2161-179GGGCGAGGUUUUCCAGAAU61si腿-3179-197UCAC,GMCCUGGCGUU62戶湖JsiRNA-l853-873CCAGUCCAAUGUMCUAUUUA63686-706CUCAGCUGGGUUGGUGAAUUA64siRNA-2291-309UGGCAGAUGCUCGUUCUUU65si艦-3512-530GGUGUUUCAUACGGUUAUU66I郷si艦-1546-566CAGGAUGCAUUCUACAAAGAA671450-1470CUGGAAUAAUG,AUGAUUA68si艦-2374-392CGMGAUCAGAAACGACUA69s酒A-3522-540GAGAAAGACCGAGUGCUAA70ZUsi脆-1540-560UCCAAUMAUAUGACCACCAA7137-57ACGACGMGACCAGCAACMA72si腿-239-57GACGUAGACCAGCAACAAA73siRNA畫3261-279ACGAAACGGAAUAUUCCAA74siRNA-21082-1100GGGCAAAGCUAAAUCAAGU75s遷A-32il6-2134UGACAAACAOJCCAGACAU76452)人癌細胞昧的培養3種癌細JJ&^(HeLa:子宮頸癌、KYSE150:食道癌、HCC50:大腸癌)分別在以下條件下進行培養。HeLa使用含有10%胎牛血清(FetalBovineSerum)(Sigma公司制)和慶大黴素(Sigma公司制)的DMEM培養基(NacalaiTesque公司制)，KYSE150和HCC50使用含有10%胎牛血清和慶大黴素的RPMI1640培養基(NacalaiTesque公司制)進行培養。(3)永生化規定基因序列特異性siRNA向癌細g的基因導入在轉染前一天，將預培養的各癌細胞用胰蛋白酶處理回收，懸浮於(2)中所述的培養基中後，在24孔板的每孔中，以HeLa為1.2xl04個、KYSE150為2xl4個、HCC50為1.5乂104個的細胞數進行接種。轉染當天交換為無血清培養基Opti-MEM(Invitrogen公司制)，使用Oligofectamine(Invitrogen公司制)或Lipofectamine2000(Invitrogen公司制)轉染表2所示的siRNA。此外，轉染時的siRNA的濃度為每孔40nM。作為陰性對照，4吏用Control(non-silencing)siRNA(Qiagen7〉司制)。(4)永生化規定基因的相對mRNA表達量的抑制分析使用RNeasyMini(Qiagen公司制)，按照產品的說明書，從(3)中進行的轉染1天後的各癌細胞林中提取總RNA。使用QuantiTectProbeRT-PCR(Qiagen公司制)和永生化規定基因序列特異性TaqManProbe(ABI公司制)，採用以下M進行定量RT-PCR(使用ABI公司制ABIPRISM7000sequencedetectionsystem)。i)50。C、30分鐘；ii)95。C、15分鐘；iii)94。C、15秒—60。C、1分鐘進4亍35~45循環。作為內標使用P-actin,由各擴增曲線將表達量數值化。作為對照使用導入了NS序列siRNA的細胞的值。此夕卜，永生化規定基因的相對mRNA量的測定，在同一目標基因、同一癌細胞昧中，在相同條件下各進行2次。46將以對照中的各永生化規定基因的mRNA量為100%時導入了各siRNA的細胞中的各永生化規定基因的相對mRNA量，在圖16~28中以mRNA定量l、mRNA定量2示出。在全部目標基因中，確認了由siRNA導致的mRNA表達量的抑制。(5)癌細,的增殖測定癌細胞林的增殖使用活細胞數測定試劑SF(NacalaiTesque公司制)來進行。在(3)中進行的轉染96小時後，每孔添加WST試劑lOjil，在37。C培養3小時後，使用酶標儀(PerkinElmer公司制、WallacARVOMX1420MultilabelCounter)測定450nm和595nm(參考波長)的吸光度。用450nm吸光度-595nm的吸光度-BG(僅培養基)的吸光度進行數值化，求出每3孔的平均值，將NS序列siRNA導入細胞的值作為100%來表示。此外，癌細胞昧的增殖測定，在同一目標基因、同一癌細胞林中，在相同條件下各進行2次。將NS序列siRNA導入時的細胞數作為100%時的各siRNA導入時的細胞數，在圖16~28中以MTTassayl、MTTassay2示出。在全部的目標基因中，均確認了由siRNA所致的3種癌細胞中的增殖抑制，由此顯示，這些13種永生化規定基因能夠成為普遍性地導致永生化癌細胞的增殖抑制的分子靶標。在癌細胞中鑑別永生化和有限壽命，不僅在治療藥的開發中意義重大，作為疾病標記的意義也重大。通常的癌診斷通過病理所見而進行，雖然也能夠診斷分化度、非典型性，但對於該細胞是否永生化、即是否獲得了無限壽命，通過通常的病理分析卻無法判斷。以往，人端粒酶的活化作為永生化的標誌而受到矚目，但如上所述，也已知即^A正常細胞的一部分端粒酶也被活化，僅憑端粒酶的活化細胞也未必永生化。而且，端粒酶的表達量非常低，雖然已確立了免疫組織染色法，但僅在部分研究室中獲得了成功(HiyamaE等，Neoplasia3:17-26,2001)。通過將上述本發明的永生化規定基因的表達作為標記使用，能夠將用通常的病理診斷無法判斷的永生化癌細胞與有限壽命細胞鑑別開來，期待在癌的早期診斷、治療選擇、預後預測中的臨床應用。權利要求1.一種用於判斷癌細胞的永生化的基因標記，由多核苷酸構成，該多核苷酸與序列編號1～13中的任一個所示的鹼基序列內的至少15個鹼基長的連續鹼基序列特異性雜交、且具有15個鹼基長以上的鹼基序列。2.根據權利要求1所述的用於判斷癌細胞的永生化的基因標記，為探針或引物。3.—種永生化癌細胞的判斷方法，包括下述工序(1)~(3):(1)使RNA或該RNA的衍生物與權利要求1或2中任一項所述的基因標記結合的工序，其中，所述RNA由從被測者採集的能夠含有癌細胞的機體試樣製備；(2)以所述基因標記為指標測定與所述基因標記結合的RNA或該RNA的衍生物的量的工序；(3)將所述工序(2)中得到的RNA或其衍生物的量與未永生化的正常或癌細胞中相應的RNA或其衍生物的量進行比較的工序，其中，將所述工序(2)中得到的RNA或其衍生物的量總稱為"RNA量"，將未永生化的正常或癌細胞中相應的RNA或其衍生物的量總稱為"對照RNA量"。4.根據權利要求3所述的永生化癌細胞的判斷方法，還包括下述工序(4):(4)當工序(2)中得到的RNA量比對照RNA量高時，判斷為被測者的癌細胞永生化，當不高時，判斷為被測者的癌細胞未永生化的工序。5.—種抗體，識別由序列編號14~26中任一個所示的胺基酸序列構成的多肽。6.—種永生化癌細胞的判斷方法，包括下述工序(l，)~(3，)(1，)使含有多肽的蛋白質含有級分與權利要求5所述的抗體結合的工序，其中，所述含有多肽的蛋白質含有級分由從被測者釆集的能夠含有癌細胞的機體試樣製備；(2，)以該抗體為指標測定與所述抗體結合的多肽的量的工序；(3，)將所述工序(2，)中得到的多肽量與未永生化的正常或癌細胞中相應的多肽量進行比較的工序，其中，將未永生化的正常或癌細胞中相應的多肽量稱為"對照多肽量"。7.根據權利要求6所述的永生化癌細胞的判斷方法，包括下述工序(4，)(4，)當工序(2，)中得到的多肽量比對照多肽量高時，判斷為被測者的癌細胞永生化，當不高時，判斷為被測者的癌細胞未永生化的工序。8.—種永生化癌細胞判斷用試劑盒，含有選自權利要求l所述的基因標記和權利要求5所述的抗體中的至少l種。9.一種抑制永生化癌細胞增殖的物質的篩選方法，包括下述工序(A)~(D):(A)使被測物質與能夠表達由序列編號1~13中的任一個所示的鹼基序列構成的基因的細胞接觸的工序；(B)對於與被測物質接觸的細胞，測定由序列編號113中任一個所示的鹼基序列構成的基因的表達量的工序；(C)將所述工序(B)中得到的基因的表達量與未與被測物質接觸的對照細胞中相應的基因的表達量進行比較的工序，其中，將未與被測物質接觸的對照細胞中相應的基因的表達量稱為"對照表達量"；(D)當所述工序(B)中得到的基因的表達量比對照表達量低時，選擇該被測物質作為抑制永生化癌細胞增殖的物質的工序。10.—種抑制永生化癌細胞增殖的物質的篩選方法，包括下述工序(A，)~(D，)(A，)使被測物質與由序列編號14~26中任一個所示的胺基酸序列構成的多肽接觸的工序；(B，)測定與被測物質接觸的由序列編號14~26中任一個所示的胺基酸序列構成的多肽的活性的工序；(C，)將所述工序(B，)中得到的多肽的活性與未與被測物質接觸的對照的活性進行比較，識別所述工序(B，)中得到的多肽的活性程度的工序，其中，將未與被測物質接觸的對照的活性稱為"對照活性"；以及(D，)當所述工序(B，)中得到的多肽的活性比對照活性低時，選擇該被測物質作為抑制永生化癌細胞增殖的物質的工序。11.一種永生化癌細胞增殖抑制劑，以多核苷酸作為有效成分，該多核苷酸與序列編號1~13中任一個所示的鹼基序列的至少15個鹼基長以上的連續鹼基序列特異性雜交、且由15個鹼基以上的鹼基序列構成。12.根據權利要求ll所述的永生化癌細胞增殖抑制劑，所述多核苷酸是由序列編號27~39中任一個所示的鹼基序列構成的多核苷酸。13.—種抗癌療法，具有將權利要求11或12所述的永生化癌細胞增殖抑制劑導入患者的癌細胞中的工序。14.一種多核苷酸在製造永生化癌細胞增殖抑制劑中的應用，所述多核苷酸與序列編號1~13中的任一個所示的鹼基序列的至少15個鹼基長以上的連續鹼基序列特異性雜交、且由15個鹼基以上的鹼基序列構成o15.根據權利要求14所述的應用，所述多核苷酸是由序列編號27~39中任一個所示的鹼基序列構成的多核苷酸。全文摘要本發明提供與癌細胞永生化相關的基因(永生化規定基因)以及對將具有該基因的永生化癌細胞作為靶標的選擇性癌治療有用的方法。使用與序列編號1～13中的任一個所示的鹼基序列內的至少15個鹼基長的連續鹼基序列特異性雜交、且具有15個鹼基長以上的鹼基序列的多核苷酸，判斷永生化癌細胞。該多核苷酸在該判斷方法中，作為用於檢測在永生化癌細胞中特異性地高度表達的永生化規定基因的引物、探針來使用。文檔編號C12N15/00GK101495630SQ200780020862公開日2009年7月29日申請日期2007年6月8日優先權日2006年6月9日發明者增子尋郎,檜山桂子,西山正彥,谷本圭司申請人:株式會社益力多本社