含低糖‑甘氨酸的穩定因子VIII製劑的製作方法

2023-05-28 15:57:31 4

該申請基於2014年4月1日提交的61/973,281，並要求其優先權。

技術領域

該申請總體上涉及藥學製劑，特別是涉及穩定化的因子VIII(FVIII)的凍幹製劑，其在高離子強度基質中含有低量的作為蛋白穩定劑的糖和甘氨酸，但是不含白蛋白(無白蛋白)。

背景技術：

在市場上有很多無白蛋白的重組FVIII(rFVIII)製劑，其使用穩定和配製基質的賦形劑，例如氯化鈉、甘氨酸、甘露醇、蔗糖、海藻糖、組氨酸、以及氯化鈣。因子VIII的無白蛋白製劑被認為在大量結晶的賦形劑存在下需要用於蛋白的無定形基質以提供精緻的糕體結構(cake structure)。因此，已以高鹽製劑、高甘氨酸、以及高甘露醇製劑配製因子VIII，其中在凍幹的冷凍階段中通過使冷凍的基質退火至結晶賦形劑的共晶結晶溫度而對這些賦形劑刻意進行結晶。將少量的穩定劑，優選蔗糖或海藻糖添加至製劑以保護和穩定在凍乾物的無定形基質中的因子VIII。

技術實現要素：

在高鹽、低蔗糖和低甘氨酸基質中的因子VIII的無白蛋白製劑為凍幹製劑，所述凍幹製劑為藥學上可接受的適於治療血友病的藥物產品。將少量甘氨酸添加至製劑預料不到地引起良好的糕體結構、經過凍幹FVIII活性的高回收率、以及與在高鹽基質中僅含有蔗糖的製劑相似的穩定性曲線。少量甘氨酸(3至6mg/ml，40至80mM)的添加也預料不到地將冷凍的基質的初始玻璃化轉變溫度從-45℃增加至-38℃，從而使得製劑更易於凍幹。因為因子VIII喜歡含高NaCl的環境，所以蔗糖/甘氨酸的冷凍基質似乎也比單獨的蔗糖基質具有更高的NaCl含量。該預料不到的觀察結果還可支持對於凍幹的因子VIII製劑來說增強的穩定性。

本發明提供穩定、無白蛋白的凍幹FVIII製劑，當在水中進行重構時，其包含：至多約300至320mM的NaCl；至多約50mM的緩衝劑，優選組氨酸，其能夠提供約6.5至約7.5的pH；至多約1至5mM的CaCl2；至多約10至25mM的二糖，優選蔗糖或海藻糖；至多約20至80mM的甘氨酸；以及至多每毫升約50至2000IU的因子VIII。此外，組合物還可包含非離子表面活性劑，優選Tween-20(聚山梨醇酯20)或Tween-80(聚山梨醇酯80)，其量為在臨界膠束濃度以上，優選在50至150ppm之間的濃度。優選的FVIII為B-結構域缺失的rFVIII，其具有隨顯色測定所確定的每毫克在8000和15000IU之間的比活性(specific activity)。

優選的穩定、無白蛋白的凍乾重組FVIII製劑，當在水中進行重構時，其包含：至多約308mM的NaCl；至多約50mM的組氨酸，其能夠提供6.5至7.5的pH；至多約1至5mM的CaCl2；至多約10至25mM的蔗糖或海藻糖；至多約40至80mM的甘氨酸；以及至多約50至3000IU的B結構域缺失的重組因子VIII。

附圖說明

圖1示出用差示掃描量熱法(DSC)所獲得的FVIII製劑的升溫熱譜圖，所述FVIII製劑包含18mg/ml NaCl和6mg/ml蔗糖，並且不含甘氨酸。Y軸是熱流量(mW)；以及x軸是以攝氏度計的溫度。兩個主要的熱事件標示為「A」和「B」。初始玻璃化轉變(Tg′)標示為「A」，其具有Tg′為-45.5℃的中點。事件「B」示出在冷凍的基質中結晶的NaCl在-21.8℃下共晶熔化。NaCl熔化的熱焓為12焦耳每克(J/g)。

圖2示出用差示掃描量熱法(DSC)所獲得的FVIII製劑的升溫熱譜圖，所述FVIII製劑包含18mg/ml NaCl和6mg/ml蔗糖以及6mg/ml甘氨酸。Y軸是熱流量(mW)；以及x軸是以攝氏度計的溫度。兩個主要的熱事件標示為「A」和「B」。初始玻璃化轉變(Tg′)標示為「A」，其具有Tg′為-38.3℃的中點。事件「B」示出在冷凍的基質中結晶的NaCl在-23.4℃下共晶熔化。NaCl熔化的熱焓為6.4J/g。

圖3是關於經過凍幹因子VIII活性的回收率的響應曲面圖。響應曲面的曲線示出低量的蔗糖和甘氨酸在FVIII的高鹽製劑中的相互作用，所述相互作用引起經過冷凍-乾燥的高回收率，如由圓圈所示。以mM計的糖(蔗糖)濃度在x軸上；以mM計的甘氨酸濃度在y軸上；垂直的z軸為關於初始因子VIII活性量(IU/ml)的回收率的量。響應曲面表示包含208mM NaCl而不含甘露醇的所有製劑。陰影區域表示具有經過冷凍的高回收率的設計空間。

圖4是關於隨著凍幹的糕體外觀的響應曲面圖。以mM計的糖(蔗糖)濃度在x軸上；以mM計的甘氨酸濃度在y軸上。垂直的z軸為糕體結構的定性外觀，其中5是優良的糕體外觀，而1是不好/坍塌的糕體外觀。響應曲面表示包含248mM NaCl而不含甘露醇的所有製劑。複合響應曲面示出低量的蔗糖和甘氨酸在FVIII的高鹽製劑中的相互作用，所述相互作用引起經過冷凍-乾燥的良好糕體結構，如由陰影圈所示。

圖5是示出低量的蔗糖和甘氨酸在FVIII的高鹽製劑中的相互作用的輪廓曲面圖，所述相互作用引起FVIII活性大於初始活性的90％的優良穩定性，如由陰影圈所示。響應曲面表示包含228mM NaCl而不含甘露醇的所有製劑。以mM計的甘氨酸濃度在x軸上；以mM計的糖(蔗糖)濃度在y軸上。輪廓線表示因子VIII活性(IU/ml)相對於初始值(在時間＝零時)的比值的量。例如，0.90輪廓線表示在40℃下儲存8周之後初始效能的90％。在粗線內的區域表示所測試的製劑的實際設計空間，而外面的區域表示從實驗設計嘗試的統計學分析所預測的值。

圖6示出FVIII的製劑在25℃下儲存12周的穩定性，所述FVIII的製劑包含308mM NaCl和低量的蔗糖(6mg/ml)(用實心菱形的線)以及和低量的蔗糖(6mg/ml)及甘氨酸(3mg/ml)(用實心方塊的虛線)。在x軸上以周計示出在25℃下的儲存時間；在y軸上示出初始FVIII活性的百分數。

圖7示出FVIII的製劑在40℃下儲存12周的穩定性，所述FVIII的製劑包含308mM NaCl和低量的蔗糖(6mg/ml)(用實心菱形的線)以及和低量的蔗糖(6mg/ml)及甘氨酸(3mg/ml)(用實心方塊的虛線)。在x軸上以周計示出在40℃下的儲存時間；在y軸上示出初始FVIII活性的百分數。

圖8示出當為在5℃下的儲存進行測試時，以兩種不同劑量形式的凍幹B結構域缺失的重組FVIII(BDDrFVIII)製劑中蔗糖配製和蔗糖/甘氨酸配製的穩定性。圖A(頂部)示出2000IU劑量形式；圖B示出250IU劑量形式。有點的條是包含308mM NaCl和低量的蔗糖(6mg/ml)的FVIII的製劑，而含水平線的條是包含308mM NaCl和低量的蔗糖(6mg/ml)及甘氨酸(3mg/ml)的FVIII的製劑。X軸示出在5℃下以周計的儲存時間；y軸示出效能(初始的百分數)。誤差棒是來自一式三份小瓶的標準差。

圖9示出當為在25℃下的儲存進行測試時，以兩種不同劑量形式的凍幹B結構域缺失的rFVIII製劑中蔗糖配製和蔗糖/甘氨酸配製的穩定性。圖A(頂部)示出2000IU劑量形式；圖B示出250IU劑量形式。有點的條是包含308mM NaCl和低量的蔗糖(6mg/ml)的FVIII的製劑，而含水平線的條是包含308mM NaCl和低量的蔗糖(6mg/ml)及甘氨酸(3mg/ml)的FVIII的製劑。X軸示出在25℃下以周計的儲存時間；y軸示出效能(初始的百分數)。誤差棒是來自一式三份小瓶的標準差。

圖10示出當為在加速的溫度40℃下的儲存進行測試時，以兩種不同劑量形式的凍幹B結構域缺失的rFVIII製劑中蔗糖配製和蔗糖/甘氨酸配製的穩定性。圖A(頂部)示出2000IU劑量形式；圖B示出250IU劑量形式。有點的條是包含308mM NaCl和低量的蔗糖(6mg/ml)的FVIII的製劑，而含水平線的條是包含308mM NaCl和低量的蔗糖(6mg/ml)及甘氨酸(3mg/ml)的FVIII的製劑。X軸示出在40℃下以周計的儲存時間；y軸示出效能(初始的百分數)。誤差棒是來自一式三份小瓶的標準差。

具體實施方式

目的

該工作的目的是為了提供在藥學上可接受的因子VIII的製劑，其在白蛋白不存在下是穩定的。FVIII優選為重組FVIII(rFVIII)，最優選為B結構域缺失的rFVIII(BDDrFVIII)。我們發現在凍幹之後糖，優選二糖，最優選蔗糖或海藻糖與甘氨酸的結合使用提供這樣的穩定性並提供良好的糕體構造。優選的糖濃度為10至25mM。

特別地，本發明包含少量的甘氨酸，20至80mM，優選40至80mM，0.3至0.6wt％，將其添加至包含約250至400mM NaCl，優選250至320mM NaCl，最優選308mM(18mg/ml)的高離子強度製劑。甘氨酸的添加預料不到地似乎防止NaCl在冷凍過程中結晶並因此為FVIII提供穩定無定形的鹽/蔗糖/甘氨酸基質。

將甘氨酸添加至製劑使製劑基質的初始玻璃化轉變溫度增加近乎7℃，因此使得製劑在初始乾燥過程中於較高擱板溫度下更易於凍幹。少量的甘氨酸還引起使該製劑產生良好的糕體結構，而其並不構成凍乾產品的整體穩定性。NaCl/蔗糖製劑和NaCl/蔗糖/甘氨酸製劑均具有相似的穩定性曲線。

可添加其它成分，例如能夠提供約6.5至約7.5pH的緩衝劑。優選的緩衝劑為組氨酸。還可以以在臨界膠束濃度以上的濃度添加非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯80(Tween 80)或聚山梨醇酯20(Tween 20)。此外，還可將濃度為1至5mM的CaCl2添加至優選的製劑中。

具體實施方案

實施例1

通過差示掃描量熱法(DSC)表徵在高離子強度下僅包含蔗糖的FVIII製劑和以蔗糖/甘氨酸的FVIII製劑的熱性能。如在圖1和圖2中所示，低量甘氨酸的添加預料不到地引起使製劑基質的初始玻璃化轉變增加近乎7℃。如通過NaCl在-21℃至-23℃下共晶熔化的熱焓能所示，在蔗糖/甘氨酸基質中結晶的NaCl的量為在僅蔗糖的製劑中結晶的幾乎一半。這些結果有力地表明蔗糖/甘氨酸基質包含明顯更高量的無定形NaCl。

實施例2

在FVIII製劑上進行多變量試驗設計(DOE)來評價多重賦形劑對凍幹製劑的影響。在加速條件下(在40℃下儲存8周)評價參數例如經過凍幹FVIII活性的回收率、糕體結構的外觀以及穩定性。

圖3至圖5示出這些製劑的DOE分析。在圖3中，圖上的陰影區域示出經過凍幹的高回收率區域。通過從1至5的定性分級系統來評價良好的糕體結構，其中5為良好的立體糕體(solid cake)而1為坍塌的糕體。圖4示出糕體結構的DOE結果。在鹽濃度下，在製劑具有低量蔗糖和甘氨酸的陰影圈中觀察到優良的糕體結構。圖5示出穩定性數據，如由圖上陰影圈區域所示在具有低量蔗糖和甘氨酸的製劑中觀察到良好的穩定性。

結果共同表明在加速的溫度(40℃)下通過8周的儲存期，具有低量蔗糖和甘氨酸的製劑給出經過凍幹的高回收率、良好的糕體結構以及優良的穩定性。

實施例3

在2-8℃下以及在加速的溫度40℃下儲存12周，對在高鹽(308mM)和低量蔗糖(18mM)(在圖6和圖7中的實線)或低量蔗糖(6mg/ml，18mM)及甘氨酸(3mg/ml，80mM)(在圖6和圖7中的實線)的製劑中的FVIII穩定性進行評價。圖6示出2-8℃穩定性數據，圖7示出40℃穩定性數據。對於通過12周研究的兩種製劑來說，該兩種製劑均顯示相似的穩定性曲線。

實施例4

在圖8、圖9和圖10中示出在不同的儲存條件下，在高劑量形式2000IU/小瓶的製劑和低劑量形式250IU/小瓶的製劑中的FVIII穩定性。在2-8℃下儲存16周以及在加速的溫度25℃和40℃下儲存12周，對包含高鹽308mM)和低量蔗糖(18mM)(在圖8、圖9和圖10中含點的條)或包含高鹽(308mM)和低量蔗糖(6mg/ml，18mM)及甘氨酸(3mg/ml，80mM)(在圖8、圖9和圖10中含水平線的條)的兩種製劑進行評價。對於通過12周研究的兩種製劑來說，該兩種製劑均顯示相似的穩定性曲線。

以上實施例旨在說明本發明，可認為的是本領域技術人員會想到變體形式。因此，本發明的範圍意在應由以下權利要求書所限定。