抗衣原體感染的免疫接種的製作方法

2023-05-28 02:39:21 5

專利名稱：抗衣原體感染的免疫接種的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學，特別是涉及使用核酸分子免疫宿主以提供抗衣原體感染的保護。
背景技術：
核酸免疫是一種產生抗傳染性疾病的保護性免疫的方法(參考文獻1-在整個申請中，圓括號中示出引用各種參考文獻以便更充分地描述本發明所屬領域的狀態。(引用的全部著錄信息列於本發明書的結尾處、權利要求之前。這些參考文獻公開的內容在此引入本公開中作為參考)。與基於蛋白或肽的亞單位疫苗不同，核酸或DNA免疫接種通過宿主細胞表達外源蛋白而提供保護性免疫作用，因此允許以更類似於在病毒或細胞內病原體感染期間所發生的方式使抗原呈遞到免疫系統(參考文獻2)。儘管人們對該技術已經相當關注，但是由DNA免疫大多數還是誘導對病毒性疾病的成功免疫(參考文獻3)。由非病毒性病原體導致的結果更多樣，其可能反映病原體的性質、所選擇的免疫抗原以及免疫接種途徑方面的差異(參考文獻4)。DNA接種的進一步發展將取決於闡明基礎免疫學機理進而將其應用擴大到無法用現有的疫苗研製策略解決的其它傳染性疾病。
衣原體屬包括四個種，沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原體(C.pneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)和牲畜衣原體(C.pecorum)。沙眼衣原體是專性細胞內細菌病原體，其通常局限於人類宿主的黏膜上皮表面。衣原體是具有稱作原生小體(EB)的細胞外孢子樣傳遞細胞和稱作網狀體的細胞內複製細胞的雙態性細菌(參考文獻5)。沙眼衣原體是最常見的性傳播病原體之一，並且是全世界防盲的主要目標(參考文獻6)。從公共健康的角度來看，衣原體感染是非常重要的感染，因為它們是不育症、失明的重要原因，並且是便於人類免疫缺陷病毒1型傳播的流行性輔因子(參考文獻7)。沙眼衣原體有導致沙眼、生殖器、呼吸和眼感染的多種血清型。據認為由Th1樣CD4淋巴細胞反應所釋放的細胞因子以及黏膜分泌物中的局部抗體，通過T細胞介導的免疫影響對沙眼衣原體的保護性免疫，並且據認為對沙眼衣原體的保護性免疫是主要針對主要外膜蛋白(MOMP)，其是衣原體細菌細胞上在數量上佔優勢的表面蛋白，具有約40kDa的分子量(參考文獻11)。CD8+T-細胞的作用似乎是次要的。
研製衣原體疫苗的最初努力是基於用整個細菌細胞的非腸道免疫。儘管這種方法在人類試驗中獲得了一些成功，但是其受到限制，因為保護是短暫的，部分的，並且可能是由於對某種衣原體抗原的病理學反應，在後來的感染事件期間接種可能使疾病惡化(參考文獻8)。對衣原體疫苗設計的更近的嘗試是基於使用MOMP蛋白或多肽的亞單位設計(參考文獻9)。這些亞單位疫苗也普遍失敗，可能是因為免疫原沒有誘導由生物體上天然表位所喚起的保護性的細胞和體液免疫反應(參考文獻10)。
在1997年7月11日申請的，轉讓給Manitoba大學的美國專利No.6,235,290中，其所公開的內容在此引入作為參考，描述了使用在質粒中編碼沙眼衣原體MOMP的DNA序列，通過DNA免疫接種產生保護性免疫反應。
最近已經測定了沙眼衣原體(參考文獻14)和鼠沙眼衣原體(C.muridium)(參考文獻15)小鼠肺炎株(MoPn)的整個基因組序列。在2001年3月29日公開的PCT出版物WO01/21803中，公開了肺炎衣原體的mgp002基因。
衣原體感染可用抗生素，如四環素衍生物，尤其是強力黴素，以及大環內酯類或氮環內酯如紅黴素和阿奇黴素治療；然而，感染常常是無症狀的，嚴重的併發症通常表現為感染的首發症狀(參考文獻6)。由於抗生素使用的增加已經導致抗生素抗性微生物的增加，因此化學治療或抗生素治療可能不是長期可行的策略。因此，仍然存在有效預防和治療衣原體感染的需求。
發明概述本發明涉及核酸免疫，具體地是DNA免疫，在宿主中產生對衣原體菌株的Mgp002基因或其截短型的保護性免疫反應。
因此，在一個方面，本發明提供一種核酸分子，其包括編碼選自下列任何一種多肽的核酸序列(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6(d)SEQ ID No8(e)包含來自(a)到(d)多肽的至少12個連續胺基酸的免疫原性片段；和(f)通過保守性胺基酸取代修飾且不喪失免疫原性的(a)、(b)(c)或(d)的多肽，其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)、(b)(c)或(d)的多肽在胺基酸序列上至少75％相同。
在本發明的另一個方面，提供一種核酸分子，其包括編碼選自下列任何一種多肽的核酸序列(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來自(a)到(d)多肽的至少12個連續胺基酸的免疫原性片段；和(f)通過保守性胺基酸取代修飾，不喪失免疫原性的(a)、(b)(c)或(d)的多肽，其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)、(b)(c)或(d)的多肽在胺基酸序列上至少75％相同，其中所述核酸分子有效地結合到用於在施用了所述核酸分子的宿主中表達所述核酸分子的序列。
用於表達的序列可以是巨細胞病毒啟動子，可能包含在人巨細胞病毒主要立即早期啟動子-增強子區。其它合適的啟動子可以是病毒啟動子或者能在靶真核細胞中促進表達的其它哺乳動物啟動子。載體可以是質粒載體，核苷酸序列可以是SEQ ID No1、3、5或7的核苷酸序列。
衣原體菌株可以是包括沙眼衣原體或肺炎衣原體的衣原體株或血清變型。非複製性載體可以是其中插入有核苷酸序列或其衍生物或其修飾的質粒pcDNA3.1。
在本發明的另一個方面，提供在體內施用給宿主用以在宿主中產生對衣原體株的Mgp002基因或其片段的保護性免疫反應的免疫原性組合物，其包括這裡所提供的非複製性載體和藥學上可接受的載體。
在本發明的另一個方面，提供從衣原體株中分離的多核苷酸，其選自包括SEQ ID NO1所示核苷酸序列的多核苷酸；包括SEQ IDNO3所示的核苷酸序列的多核苷酸；包括SEQ ID NO5所示的核苷酸序列的多核苷酸；包括SEQ ID NO7所示的核苷酸序列的多核苷酸；與SEQ ID NO1、3、5或7的核苷酸序列至少95％同源的多核苷酸；以及在42℃，在含有50％甲醯胺的6x SSC的嚴緊雜交條件下，與包括SEQ ID NO1、3、5或7所示的核苷酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸，其中向哺乳動物施用免疫原性有效量的所述分離的多核苷酸，在所述哺乳動物中誘導抗由所述衣原體株感染的免疫反應。
在本發明的另一個方面，提供一種包括載體的疫苗，其中載體包含編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來自(a)到(d)中任何一種多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段；和(f)通過保守性胺基酸取代修飾的(a)到(e)中任何一種的多肽，其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)到(e)中任何一種的多肽在胺基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用於使多肽在哺乳動物或細菌細胞中表達的一種或多種調控序列有效地連接，其中疫苗提供抗衣原體所致疾病的保護性免疫反應。
在本發明的另一個方面，提供一種藥物組合物，其包括適於在疫苗中使用的藥學上可接受的載體或稀釋劑，以及編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ IDNo6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來自(a)到(d)多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段；和(f)通過保守性胺基酸取代修飾，不喪失免疫原性的(a)到(e)中任何一種的多肽；其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)到(e)中任何一種的多肽在胺基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用於使多肽在哺乳動物中表達的一種或多種調控序列有效地連接。
在本發明的另一個方面，提供一種免疫宿主使其抗衣原體菌株感染所致疾病的方法，其包括向所述宿主施用如本發明所提供的有效量的非複製性載體。
可以任何方便的方式，如通過肌肉內或鼻內向宿主，其包括人類宿主施用核酸分子。
在本發明的另一個方面，提供一種預防或治療衣原體感染的方法，其包括施用有效量的編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子的步驟(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)包含來自(a)到(c)多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段；和(d)通過保守性胺基酸取代修飾，不喪失免疫原性的(a)到(c)中任何一種的多肽，其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)到(c)中任何一種的多肽在胺基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用於多肽表達的一種或多種調控序列有效地連接。
可在本發明的這個方面中使用上述所討論的各種選項和可供選擇的選項。
那些本領域技術人員將很容易地理解，本發明不僅提供編碼衣原體多肽的多核苷酸序列，也提供編碼由這些多肽衍生的片段的多核苷酸。此外，本發明應當被理解為提供這些多肽和其衍生片段的突變體和衍生物，其是由於這裡所述的非必需胺基酸的添加、缺失或取代所致。本領域的那些技術人員也將很容易地理解，本發明不僅提供編碼衣原體多肽的多核苷酸序列，而且進一步提供特異性結合這些多肽的單特異性抗體。
本發明具有廣泛的應用，並且包括表達盒、載體和用本發明的多核苷酸轉化的或轉染的細胞。
附圖簡述參考附圖，將從下列描述中進一步理解本發明，其中

圖1顯示鼠衣原體(Chlamydia muridium)(Nigg株)的Mgp002基因的全長核苷酸序列(SEQ ID No1)和推定的全長Mgp002基因產物的胺基酸序列(SEQ ID No2)，以及缺失信號序列的核苷酸序列(在箭頭處開始)(SEQ ID No5)和推定的胺基酸序列(SEQ ID No6)。
圖2顯示沙眼衣原體(血清變型D)的Mgp002基因的全長核苷酸序列(SEQ ID No3)和推定的全長Mgp002基因產物的胺基酸序列(SEQID No4)，以及缺失信號序列的核苷酸序列(在箭頭處開始)(SEQ IDNo7)和推定的胺基酸序列(SEQ ID No8)。
圖3顯示一個用編碼Mgp002基因或其截短型的核酸分子治療衣原體感染的免疫方案的具體實施方式
的圖示。IM指肌肉內免疫，而IN指鼻內免疫。
圖4，包括圖A和B，顯示用克隆到質粒pcDNA3.1中的編碼全長Mgp002基因(圖A)和缺失信號序列的Mgp002基因(圖B)的核酸分子的免疫，與在用傳染性衣原體攻擊免疫的Balb/c小鼠中體重喪失之間的關係。說明EB＝殺死宿主的原生小體，PCACTmgp002＝插入全長Mgp002基因的pcDNA3，PCACTmgp002δ＝缺失信號序列的Mgp002基因， ＝沒有免疫，pAMycHis＝空載體。
圖5，比較圖A和B，顯示用全長Mgp002基因(圖A)和缺失信號序列的Mgp002基因(圖B)免疫以及用傳染性衣原體攻擊的Balb/c小鼠的肺中提高的衣原體的清除率。圖例EB＝殺死宿主的原生小體，PCACTmgp002＝插入全長Mgp002基因的pcDNA3，PCACTmgp002δ＝缺失信號序列的Mgp002基因， ＝沒有免疫，pAMycHis＝空載體。
圖6，圖解說明質粒pET30b(+)mgp002+SP的構建，用於表達含有N末端His-Tag的重組Mgp002蛋白。
圖7，用圖說明在用純化的重組Mgp002蛋白連同ISCOM佐劑免疫的CH3小鼠中，對沙眼衣原體血清變型D的生殖器攻擊的保護。動物用鹽水 Mgp002蛋白(mg002)或衣原體原生小體(EB)皮下免疫，然後用活的沙眼衣原體血清變型D隨後通過陰道內攻擊。測定感染後第3天和第5天的衝洗液中衣原體的感染單位。
發明詳述為了闡明本發明，構建含有編碼沙眼衣原體小鼠肺炎株(MoPn)Mgp002基因的核酸分子的質粒DNA，其是天然的鼠科病原體，在小鼠中進行實驗。已知在小鼠模型中初次感染誘發對再次感染發生強烈的保護性免疫。對於人類免疫，可使用編碼沙眼衣原體的Mgp002基因或其截短型的核酸分子。
可使用任何適當的質粒載體，如pcDNA3.1，真核II可選擇的表達載體(Invitrogen，San Diego，CA，USA)，含有人類巨細胞病毒主要的立即早期啟動子-增強子區或其衍生物，如pCAMycHis。可將編碼Mgp002基因或其片段的核酸分子以任何適當的方式插入到載體中。可使用合適的引物從沙眼衣原體基因組DNA中通過PCR擴增基因，並將PCR產物克隆到載體中。可將攜帶編碼Mgp002基因或其片段的核酸分子的質粒，如通過電穿孔轉移到大腸桿菌或任何適當的宿主中進行複製。可以任何適當的方式從大腸桿菌中提取質粒。
根據本發明的第一個方面，提供編碼衣原體多肽的分離的多核苷酸，在SEQ ID Nos2、4、6和8中顯示其胺基酸序列。
將術語「分離的多核苷酸」定義為離開了其天然存在的環境的多核苷酸。例如，存在於活細菌的基因組中或者作為基因庫一部分的天然存在的DNA分子是未經分離的，但是從細菌基因組的剩餘部分中分離的同樣分子，作為例如克隆事件(擴增)的結果，是分離的。通常，分離的DNA分子是不帶有在天然存在的基因組中該DNA分子5′或3′端緊鄰的DNA區(例如，編碼區)的。這種分離的多核苷酸可以是載體或組合物的一部分，但其仍然被定義為「分離的」，因為這種載體或組合物不是這種多核苷酸的天然環境的一部分。
本發明的多核苷酸是RNA或DNA(cDNA、基因組DNA或合成的DNA)，或者其修飾形式、變體、同系物或片段。DNA是雙鏈或單鏈的，如果是單鏈的，那麼是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。如在SEQ IDNo1、3、5和7中所示，任何一種編碼本發明多肽的序列都是(a)編碼序列，(b)從(a)的轉錄物中衍生的核糖核苷酸序列，或(c)利用遺傳密碼的冗餘性或簡併性編碼同一多肽的編碼序列。「多肽」或「蛋白質」意思是胺基酸的任何鏈，無論長度或翻譯後修飾(例如，糖基化或磷酸化)。兩個術語可在本發明申請中交換使用。
相應於本發明的第一方面，提供與SEQ ID No2、4、6或8同源的胺基酸序列。如這裡所使用的，「同源胺基酸序列」是全部或部分地由在低於臨界解鏈溫度(Tm)25-35℃下與SEQ ID No1、3、5或7所示的核苷酸序列的任何部分雜交的核酸序列所編碼的任何多肽。同源胺基酸序列是由於一個或多個保守性胺基酸取代而與SEQ ID No2、4、6或8所示的胺基酸序列不同的胺基酸序列。這種序列也包括血清型變體(下面所定義的)以及包含缺失或插入的序列，其保留多肽的內在特性如免疫原性。優選地，這種序列與SEQ ID No2、4、6或8至少75％，更優選地80％，最優選地90％到95％相同。
同源性胺基酸序列包括與SEQ ID No2、4、6或8相同或基本上相同的序列。「胺基酸序列基本上相同」意思是與參考的胺基酸序列至少90％，更優選地97％以及最優選地99％相同的序列，優選地由於大多數保守性胺基酸取代而與參考序列不同。
保守性胺基酸取代是在同一類型胺基酸之間的取代。這些類型包括，例如，具有不帶電荷的極性側鏈的胺基酸，如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；具有鹼性側鏈的胺基酸，如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有酸性側鏈的胺基酸，如天冬氨酸和穀氨酸；以及具有非極性側鏈的胺基酸，如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸和半胱氨酸。
通過使用序列分析軟體如威斯康星大學生物技術中心，大學大街1710號，Madison的遺傳學計算機組的序列分析軟體包，WI53705測量同源性。將胺基酸序列排列起來使相同性最大。可向序列中人工引入缺口以獲得適當的序列對比。一旦建立最佳的序列對比，那麼通過記錄兩個序列的胺基酸都相同的所有位置的數量相對於位置的總數，建立同源性的程度。
以類似的方式定義同源性多核苷酸序列。優選地，同源序列是與SEQ ID No1、3、5或7的編碼序列至少45％，更優選地60％，最優選地85％相同。
相應於本發明的第一方面，具有與SEQ ID No2、4、6或8同源序列的多肽包括天然發生的等位基因變體，以及突變體或保留SEQ IDNo2、4、6或8多肽內在特性的任何其它非天然發生的變體。
如在本領域中已知，等位基因變體是多肽的替代型，其特點是具有不改變多肽生物學功能的一個或多個胺基酸的取代、缺失或添加。「生物學功能」意思是指多肽在細胞中自然發生的功能，即使該功能不是細胞生長或存活所必需的。例如，膜孔蛋白的生物學功能是允許細胞外介基中存在的化合物進入細胞。生物學功能與抗原性質不同。多肽可具有一個以上的生物學功能。不同的等位基因變體可具有相似的抗原性質。
等位基因變體在自然界中非常常見。例如，細菌物種如沙眼衣原體通常通過各種血清變型表示，其相互間僅有較小的等位基因變異的差異。事實上，在不同菌株中完成同一生物學功能的多肽可具有在每種菌株中都不同的胺基酸序列(和多核苷酸序列)。儘管有這種差異，但是已經證明了通常針對許多等位基因變體的免疫反應。在衣原體MOMP抗原的研究中，儘管存在菌株和菌株之間的MOMP的胺基酸序列變異，但是出現了交叉株抗體結合，以及傳染性的中和，表明當MOMP用作免疫原時可接受的胺基酸變異。
通過對常規方法提取的細菌基因組DNA進行的聚合酶鏈反應(PCR)擴增，得到編碼同源多肽或等位基因變體的多核苷酸。這涉及使用與編碼區的5′和3′末端的上遊和下遊匹配的合成的寡核苷酸引物。根據在SEQ ID No1、3、5或7中所提供的核苷酸序列信息，設計合適的引物。方法如下選擇由10到40，優選地15到25個核苷酸構成的引物。選擇所含C和G核苷酸的比例足以確保有效雜交的引物是有利的，即，C和G核苷酸的量至少為總核苷酸含量的40％，優選地50％。標準PCR反應通常每100μL含有0.5到5單位的Taq DNA聚合酶，每種脫氧核苷酸20到200μM，優選地以相等的濃度，在總脫氧核苷酸濃度中0.5到2.5mM的鎂，105到106個靶分子以及每種引物大約20pmol。進行大約25到50個PCR循環，退火溫度低於引物的真正Tm 15℃到5℃。更嚴緊的退火溫度提高了對不正確退火引物的排斥並降低了引物3』端不正確核苷酸的摻入。儘管對於富含G+C靶的變性來說，更高的溫度可能是適當的，但是變性溫度一般是95℃到97℃。所進行的循環數取決於靶分子的起始濃度，然而由於非特異性背景產物趨於累積，一般建議不超過40個循環。
獲取編碼同源多肽或等位基因變體的多核苷酸的可選擇的方法是通過DNA或RNA文庫的雜交篩選。雜交方法是本領域熟知的方法。在用於獲得兩個相互分離的互補DNA鏈的上述臨界解鏈溫度的公式中反映優化雜交條件的重要參數。對於大約600個或更多的核苷酸來說，該公式如下Tm 81.5+0.41×(％G+C)+16.6log(陽離子濃度)-0.63×(甲醯胺％)-600/鹼基數。在適當的嚴緊條件下，雜交溫度(Th)是大約低於所計算Tm的20到40℃，20到25℃，或者，優選地30到40℃。本領域的那些技術人員將會理解可很容易地確定最佳溫度和鹽條件。
對於本發明的多核苷酸，預雜交和雜交孵育的嚴緊條件是(i)在42℃，在含有50％甲醯胺的6x SSC中4-16小時，或者(ii)在65℃，在水性6x SSC溶液(1M NaCl、0.1M枸櫞酸鈉(pH 7.0))中4-16小時。通常，雜交實驗在從60到68℃，例如65℃進行。在這種溫度，可在6xSSC，優選地在2xSSC或1x SSC，更優選地在0.5xSSC，0.3xSSC或0.1x SSC(缺乏甲醯胺)中獲得嚴緊雜交條件。1xSSC含有0.15M NaCl和0.015M枸櫞酸鈉。本領域的那些技術人員將會理解，探針核酸序列將與互補的靶核酸序列雜交。
使用已知方法設計非天然存在的有用的同系物和其片段，用於鑑定可能耐受胺基酸序列改變和/或缺失的抗原區。作為實例，比較不同物種的同源多肽；鑑定保守的序列。趨異的序列最有可能耐受序列改變。作為實例，可使用Altschul等(參考文獻12)的BLAST同源性搜索算法，分析序列之間的同源性。可選擇地，基於可能的T或B細胞表位的計算機輔助分析，對序列進行修飾使得它們對T和/或B細胞的反應性更強。然而另一種可選擇的方法是在體外突變多肽內的特定胺基酸殘基或序列，然後根據下面概述的方法篩選突變體多肽預防或治療衣原體感染的能力。
本領域技術人員將會很容易地理解，通過本發明的篩選過程後，將不需要過度的實驗便會確定SEQ ID No.2、4、6或8的特定同系物或免疫原性片段是否可用於預防或治療衣原體感染。篩選方法包括下列步驟(i)用試驗同系物或片段免疫動物，優選小鼠，(ii)用傳染性衣原體接種免疫的動物；和(iii)選擇那些賦予抗衣原體保護的同系物或片段。
「賦予保護」意思是與不用試驗的同系物或片段免疫的對照動物相比，降低任何衣原體感染影響的嚴重性。
相應於本發明的第一方面，提供多肽衍生物，其是SEQ ID No.1、3、5或7的部分核酸序列，與SEQ ID No.2、4、6或8同源的多肽序列的部分序列，通過內部缺失由全長多肽衍生的多肽以及融合蛋白。在免疫學領域中使用蛋白免疫原的片段和變體作為疫苗是一種可接受的實踐，因為所有對誘導對蛋白的免疫反應所必需的是蛋白的小(例如，8到10個胺基酸)免疫原性區。已經證明與在非衣原體病原體的表面所暴露的抗原相對應的各種短合成肽是抗它們各對應病原體的有效疫苗抗原，例如，鼠乳腺腫瘤病毒的11殘基肽(Casey Davidson，Nucl.Acid Res.(1977)41539)、Semliki Forest病毒的16殘基肽(Snijders等，1991.J.Gen.Virol.72557-565)以及均來自狗細小病毒的兩個15殘基的重疊肽(Langeveld等，Vaccine 12(15)1473-1480，1994)。
因此，對於本領域技術人員來說將是顯而易見的是，閱讀本說明書後，SEQ ID No2、4、6或8的部分序列或者它們的同源胺基酸序列是全長序列固有的，並且是經由本發明的教導得出的。這些多肽片段的長度優選地至少為12個胺基酸。有利地是，它們的長度至少為20個胺基酸，優選地至少50個胺基酸，更優選地至少75個胺基酸，最優選地至少100個胺基酸。
使用上述參數以及使用與有待擴增片段的5』和3』端的上遊和下遊序列匹配的引物，通過PCR擴增獲取編碼與SEQ ID No2、4、6或8同源序列的部分序列的30到600個核苷酸的多核苷酸。這種擴增的模板多核苷酸是與SEQ ID No1、3、5或7同源的全長多核苷酸，或者多核苷酸的混合物，如DNA或RNA文庫中所包含的多核苷酸。作為獲取部分序列的可選擇的方法，在上述條件下並且使用計算Tm的公式進行篩選雜交。
如果將要獲取30到600個核苷酸的片段，通過減法修正所計算的Tm(600/多核苷酸鹼基對大小)，通過低於Tm 5到10℃的雜交溫度確定嚴緊條件。如果要獲得比20-30個鹼基更短的寡核苷酸，計算Tm的公式如下Tm＝4×(G+C)+2(A+T)。例如，50％G+C的18個核苷酸片段的Tm大約為54℃。對於是SEQ ID No2、4、6或8的片段或者其同源序列的短肽，通過化學合成法直接獲得。
在整個長度的多肽中存在誘導保護性T細胞依賴性免疫反應的表位。然而，一些表位可能被多肽的二級和三級結構掩蓋。為了顯示這些被掩蓋的表位，建立大量的除去了大部分原始蛋白結構、並暴露被掩蓋表位的內部缺失體。這種內部缺失體有時影響除去菌株之間高度變異性的免疫顯性區的額外優勢。
使用本領域中已知的標準方法構建編碼多肽片段的多核苷酸和具有大量內部缺失的多肽。這種方法包括標準PCR、反向PCR、所克隆DNA分子的限制酶處理。很容易地從各種商業來源如Stratagene中獲得這些方法的成分和它們的使用說明。一旦構建缺失突變體，如上如上所述檢驗它們預防或治療衣原體感染的能力。
如本文所使用的，融合多肽是含有在N或C末端融合了任何其它多肽(這裡及下文稱作肽尾)本發明的多肽或多肽衍生物的多肽。獲得這種融合多肽的簡單方式是通過多核苷酸序列的符合讀框融合，即雜合基因的翻譯。將編碼融合多肽的雜合基因插入到用於轉化或轉染宿主細胞的表達載體中。可選擇地，將編碼多肽或多肽衍生物的多核苷酸序列插入到已存在編碼肽尾的多核苷酸的表達載體中。可買到這種載體和它們的使用說明，例如，從New England Biolabs購買的pMal-c2或pMal-p2系統，其中肽尾是麥芽糖結合蛋白、Pharmacia的穀胱甘肽-S-轉移酶系統或者可從Novagen獲得的His-Tag系統。這些和其它表達系統提供了便於本發明的多肽和衍生物進一步純化的手段。
融合多肽的有利的實例是將本發明的多肽或同系物或片段與具有佐劑活性的多肽融合，如霍亂毒素的B亞基或大腸桿菌熱不穩定毒素的B亞基。另一個有利的融合是將多肽、同系物或片段與強T細胞表位或B-細胞表位融合。這種表位可以是本領域中已知的表位(例如，B型肝炎病毒核心抗原，D.R.Millich等，「Antibody production to thenucleocapsid and envelope of the Hepatitis B virus primed by a singlesynthetic T cell site」，Nature.1987.329547-549)，或者基於可能的T或B細胞表位的計算機輔助分析，已在本發明的另一個多肽中被鑑定的表位。相應於本發明的該方面的是包括SEQ ID No2、4、6或8或其同系物或片段的T或B細胞表位的融合多肽，其中表位來自所述多肽或同系物或片段的多個變體，各變體之間因其表位在多肽內的位置和序列上不同而不同。這種融合在衣原體感染的預防和治療中是有效的，因為其優化了對整個多肽、同系物或片段的T細胞和B細胞反應。
為了實現融合，將本發明的多肽融合到具有佐劑活性或者T或B細胞表位的多肽N末端，或者優選地融合到C末端。可選擇地，將本發明的多肽片段內部地插入到具有佐劑活性的多肽的胺基酸序列內。也可將T或B細胞表位內部地插入到本發明多肽的胺基酸序列內。
相應於第一方面，本發明的多核苷酸也編碼含有異源信號肽的雜前體多肽，其成熟成為本發明的多肽。「異源信號肽」意指不在本發明多肽的天然前體中存在的信號肽。
本發明的多核苷酸分子，其包括RNA、DNA或其修飾或其組合，具有各種應用。例如DNA分子用於，(i)在重組宿主系統中生產所編碼多肽的方法中，(ii)構建疫苗載體如痘病毒，其進一步用於預防和/或治療衣原體感染的方法和組合物，(iii)作為疫苗試劑(以及RNA分子)，以裸露的形式或與遞送載體一起配製以及，(iv)構建減毒衣原體菌株，其可過量表達本發明的多核苷酸或者表達其非毒性，突變型蛋白。
因此，本發明的第二方面包括(i)含有本發明DNA分子的表達盒，其置於表達所需元件，也稱作表達控制序列的控制下或者與其有效連接，特別是位於適當啟動子的控制下；(ii)含有本發明表達盒的表達載體；(iii)用本發明的表達盒和/或載體轉化或轉染的原核或真核細胞，以及(iv)生產由本發明的多核苷酸所編碼的多肽或多肽衍生物的方法，其涉及在可使本發明DNA分子表達的條件下，培養用本發明的表達盒和/或載體轉化或轉染的原核或真核細胞，以及從細胞培養物中回收所編碼的多肽或多肽衍生物。
重組表達系統選自原核和真核宿主。真核宿主包括酵母細胞(例如，釀酒酵母(Saccharonzyces cerevisiae)或畢赤酵母(Pichiapastoris))、哺乳動物細胞(例如，COS1、NIH3T3或JEG3細胞)、節肢動物細胞(例如，草地貪夜蛾(Spodoptera fruglperda)(SF9)細胞)以及植物細胞。優選的表達系統是原核宿主如大腸桿菌。細菌和真核細胞可從許多不同來源中獲得，其包括本領域那些技術人員已知的商業來源，例如，美國典型培養物保藏中心(ATCC；Rockville，Maryland)。用於重組蛋白表達的細胞的商業來源也提供細胞使用的說明。
表達系統的選擇取決於所表達多肽的期望特徵。例如，其可用於生產以特定脂質化(lipidated)型或任何其它型的本發明的多肽。
本領域技術人員將會很容易地理解，雖然並非所有載體和表達控制序列以及宿主都能同等地很好地表達本發明的多核苷酸。但可根據下述指導方針，不需要過度的實驗以及不偏離本發明的範圍選擇載體、表達控制序列和宿主。
相對於選擇載體，必需選擇與將在其中存在和可能複製的載體相容的宿主。要考慮載體的拷貝數、控制拷貝數的能力、其它蛋白如抗生素抗性的表達。在選擇表達控制序列時，要考慮許多變量。在這些重要的變量中要考慮序列的相對強度(例如，在各種條件下驅動表達的能力)、控制序列功能的能力、有待表達的多核苷酸和控制序列之間的相容性(例如，考慮二級結構以避免妨礙有效轉錄的髮夾結構)。在選擇宿主時，選擇單細胞宿主，其與所選載體相容，耐受所表達產物的任何可能的毒性影響，如果這是期望的話，能夠有效地分泌所表達的產物，能夠表達期望構象的產物，能夠很容易地按比例增加，以及能夠很容易地純化終產物。
表達盒的選擇取決於所選的宿主系統以及所表達的多肽的期望特徵。通常，表達盒包括在所選宿主系統中有功能可以是組成型或誘導型的啟動子；核糖體結合位點；如果需要的話，起始密碼子(ATG)；信號肽編碼區，例如脂質化(lipidation)信號肽；本發明的DNA分子；終止密碼子；以及任選地3′終止區(翻譯和/或轉錄終止子)。信號肽編碼區鄰近本發明的多核苷酸並與正確的閱讀框相符。信號肽編碼區與編碼成熟多肽的DNA分子同源或異源，並且與用於表達的宿主的分泌器相容。將由本發明的DNA分子，單獨地或與信號肽一起構成的可讀框置於啟動子的控制下，以便在宿主系統中發生轉錄和翻譯。啟動子和信號肽編碼區對於本領域的那些技術人員來說是廣泛已知和可獲得的，其包括，例如，可由阿拉伯糖誘導(啟動子araB)並且在革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌中有功能的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)(和衍生物)的啟動子(如描述於美國專利No.5,028,530)；編碼噬菌體T7RNA聚合酶基因的啟動子，其在許多表達T7聚合酶的大腸桿菌株中起作用(描述於美國專利No.4,952,496)；OspA脂化信號肽；以及RlpB脂質化信號肽(Takase等，J.Bact.(1987)1695692)。
表達盒一般是表達載體的一部分，選擇能在所選表達系統中複製的表達載體。表達載體(例如，質粒或病毒載體)可選自，例如，在Pouwels等(Cloning VectorsA Laboratory Manual1985，Supp.1987)中所描述的那些。適當的表達載體可購自各種商業來源。
用表達載體轉化/轉染宿主細胞的方法是本領域中熟知的並且視所選宿主系統而定。
一旦表達，本發明的重組多肽(或多肽衍生物)在細胞內的區室中產生並保持，分泌/排洩到細胞外介質或壁膜間隙，或者被包埋在細胞膜中。重組細胞培養物離心後，從細胞提取物或從上清液中回收基本上為純化型的多肽。一般地，重組多肽通過基於抗體的親和純化法或者通過可很容易地由本領域技術人員修改的其它熟知的方法進行純化，如編碼多肽或其衍生物的多核苷酸與低親和結合區的融合。根據下述方法獲得用於通過免疫親和純化本發明多肽的有用的抗體。
本發明的多核苷酸也可用作疫苗。有兩個主要途徑，或者使用病毒的或細菌的或合成的遞送載體(即，活疫苗載體或微粒)或者施用游離型的基因，例如，插入到核酸載體中。根據下述方法評估本發明多核苷酸的治療或預防效能。
本發明的另一個方面提供(i)含有置於表達所需元件的控制下的本發明的DNA分子的疫苗載體如痘病毒；(ii)物質組合物，其包括本發明的疫苗載體，以及稀釋劑或載體；具體地(iii)含有治療或預防有效量的本發明疫苗載體的藥物組合物；(iv)在哺乳動物中誘導抗衣原體的免疫反應的方法(例如，人；可選擇地，可在獸醫應用中用於治療或預防動物，例如，貓或鳥的衣原體感染的方法)，其涉及向哺乳動物施用免疫原性有效量的本發明的疫苗載體以引起對衣原體的保護性或治療性免疫反應；以及特別地，(v)預防和/或治療衣原體(例如，沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體、牲畜衣原體)感染的方法，其涉及向感染的個體施用預防或治療量的本發明的疫苗載體。
另外，本發明的另一個方面包括本發明的疫苗載體在製備預防和/或治療衣原體感染的藥物中的用途。
如本文所使用的，疫苗載體表達一種或幾種本發明的多肽或衍生物。疫苗載體可另外表達增強免疫反應(佐劑效應)的細胞因子，如白介素-2(IL-2)或白介素-12(IL-12)。應當理解的是，將有待表達的各成分置於在哺乳動物細胞中表達所必需元件的控制下。
相應於本發明另一方面的是包括幾種疫苗載體的組合物，其中的每一種都能表達本發明的多肽或衍生物。組合物也可包括能表達另外的衣原體抗原，或者亞基、片段、同系物、突變體或其衍生物，任選地連同或者細胞因子如IL-2或IL-12的疫苗載體。
用於在哺乳動物中治療或預防感染的接種方法包括通過任何常規途徑施用本發明的疫苗載體的用途，特別是通過黏膜(例如，眼、鼻內、口、胃、肺、腸、直腸、陰道或泌尿道)表面或通過非腸道(例如，皮下、真皮內、肌內、靜脈內或腹膜內)途徑。優選的途逕取決於疫苗載體的選擇。治療可以單劑量或每隔一段時間重複完成。適當的劑量取決於技術人員所理解的各種參數，如疫苗載體本身、給藥途徑或被接種的哺乳動物的情況(體重、年齡等)。
本領域中可利用的活疫苗載體包括病毒載體如腺病毒、痘病毒和α病毒，以及細菌載體，例如，志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、卡介苗(Bacille bilie de Calmette-Guerin)(BCG)以及鏈球菌屬(Streptococcus)。
腺病毒載體的實例，以及構建能表達本發明DNA分子的腺病毒載體的方法描述於美國專利No.4,920,209。痘病毒載體包括牛痘和金絲雀痘病毒，分別描述於美國專利No.4,722,848和美國專利No.5,364,773。對於牛痘病毒載體(金絲雀疸)的描述見Taylor等(參考文獻13)。金絲雀痘載體在哺乳動物細胞中具有有限的複製或者不複製。
通常，用於治療或預防用途的疫苗病毒載體的劑量可從每公斤約1×104到約1×1011，有利地從約1×107到約1×1010，優選地從約1×107到約1×109蝕斑形成單位。優選地，通過非腸道途徑施用病毒載體；例如，分3個劑量，相隔四周。優選地避免向含有本發明病毒載體的組合物中添加化學佐劑，因而將對病毒載體本身的免疫反應降到最低。
甲病毒(Alphavirus)載體可包括Simliki Forest病毒載體(參考文獻16)、Sindbis病毒載體(參考文獻17)或Venezuelan馬腦炎病毒載體(參考文獻18)。裸RNA或質粒DNA以及可含有複製缺陷甲病毒的重組顆粒可有效地用於免疫。
用作活的口服疫苗的非產毒霍亂弧菌突變體株是已知的。美國專利No.4,882,278描述了兩個ctxA等位基因中均缺失了大量編碼序列，結果不產生有功能的霍亂毒素的菌株。能表達由本發明DNA分子所編碼的多肽或多肽衍生物的霍亂菌株的有效疫苗劑量在適於所選給藥途徑的體積中含有約1×105到約1×109，優選地約1×106到約1×108的活細菌。優選的給藥途徑包括所有黏膜途徑；最優選地，這些載體通過鼻內或口服給藥。
減毒的鼠傷寒沙門氏菌株，通過基因工程改造以重組表達或不表達異源抗原，以及它們作為口服疫苗的用途描述於1998年12月22日授權的美國專利5,851,519。優選的給藥途徑包括所有黏膜途徑；最優選地，這些載體通過鼻內或口服給藥。
在本發明的上下文中，用作疫苗載體的其它減毒細菌株描述於1997年7月1日授予的美國專利5,643,771。
在細菌載體中，將本發明的多核苷酸插入到細菌基因組中或者作為質粒的一部分保持游離狀態。可使用細菌載體表達衣原體疫苗抗原或者將質粒DNA等表達載體如遞送到宿主細胞中，其隨後在宿主細胞中表達並引發對衣原體抗原的免疫反應。
包括本發明疫苗細菌載體的組合物可進一步含有佐劑。許多佐劑對於本領域的那些技術人員來說是已知的。優選的佐劑包括，但不限於鋁鹽(明礬)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁、水包油乳劑，皂苷佐劑如ISCOMs，細胞因子如白介素、幹擾素、巨噬細胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子。
根據本發明的疫苗或免疫原性組合物可以是預防性的(即，用於預防疾病)或治療性的(即，在感染後用於治療疾病)。用作疫苗的免疫原性組合物包括免疫學有效量的抗原或抗原的免疫原性片段。免疫學有效量意思是作為單劑量或作為系列劑量的一部分向個體施用的對預防或治療有效的量。術語治療有效量指使治療以達到好轉，或防止所關注的疾病或情況，或者顯示可檢測到的治療或預防效果的治療劑的量。對於本發明的目的，有效劑量將從1μg/kg到100μg/kg或者10μg/kg到50μg/kg。
免疫原性組合物和疫苗可通過非腸道施用，通過皮下注射、真皮內或肌內注射。可選擇地，可配製根據本發明所配製的免疫原性組合物並以在黏膜表面引起免疫反應的方式遞送。因此，可通過，例如鼻或口(intagastric)途徑向黏膜表面施用免疫原性組合物。可選擇地，包括栓劑和口服製劑的其它給藥方式也是可行的。對於栓劑，粘合劑和載體可包括，例如，polyalkalene glycois或甘油三酯。這種栓劑可由含有大約10％，優選地大約1到2％的活性免疫原性成分的混合物組成。口服製劑可包括正常所使用的載體，如，藥物級的糖精、纖維素和碳酸鎂。這些組合物可採取溶液、懸液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋劑或粉劑的形式，含有大約1到95％的活性成分，優選地大約20到75％。
因此，本發明的另一個方面提供(i)一種物質組合物，其包括本發明的多核苷酸，連同稀釋劑或載體；(ii)包括治療或預防有效量的本發明多核苷酸的藥物組合物；(iii)在哺乳動物中誘導抗衣原體的免疫反應的方法，通過施用免疫原性有效量的本發明的多核苷酸，引起對衣原體的保護性免疫反應；以及特別地，(iv)預防和/或治療衣原體(例如，沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體或牲畜衣原體)感染的方法，通過向感染個體施用預防或治療量的本發明的多核苷酸。另外，本發明的第四方面包括本發明的多核苷酸在製備用於預防和/或治療衣原體感染的藥物中的用途。優選的用途包括將DNA分子置於用於在哺乳動物細胞中表達的條件下，尤其在不能在哺乳動物細胞中複製並且基本上不能在哺乳動物基因組中整合的質粒中。
本發明的多核苷酸的用途包括它們作為疫苗施用給哺乳動物，用於治療或預防性目的。這種多核苷酸以DNA的形式作為不能在哺乳動物細胞中複製並且不能整合到哺乳動物基因組中的質粒的一部分。一般地，將這種DNA分子置於適於在哺乳動物細胞中表達的啟動子的控制下。啟動子以普遍存在地或組織特異性方式起作用。非組織特異性啟動子的實例包括早期巨細胞病毒(CMV)啟動子(描述於美國專利No.4,168,062)和Rous肉瘤病毒啟動子(描述於Norton Coffin，Molec.Cell Biol.(1985)5281)。組織特異性啟動子的實例是在肌肉細胞中驅動表達的結蛋白啟動子(Li Paulin，J.Biol.Chem.(1993)26810403)。啟動子的使用對於本領域的那些技術人員來說是熟知的。有用的載體描述於許多出版物中，特別是WO 94/21797。
用作疫苗的本發明的多核苷酸編碼對應多肽的前體或成熟型。在前體型中，信號肽可以是同源的或異源的。在後者的情況中，可使用真核前導序列。
如本文所使用的，本發明的組合物含有一種或幾種多核苷酸，任選擇地具有至少一個編碼另一衣原體抗原、或其片段、衍生物、突變體或類似物的額外的多核苷酸。組合物也可含有編碼細胞因子，如白介素-2(IL-2)或白介素-12(IL-12)的額外的多核苷酸以便提高免疫反應。將這些額外的多核苷酸置於用於表達的適當的控制下。有利地是，本發明的DNA分子和/或額外的DNA分子包含在同一組合物中，存在於同一質粒中。
在本發明多核苷酸治療劑的製備中使用製備和純化多核苷酸的標準分子生物學技術。對於作為疫苗的用途，根據下面所概述的各種方法配製本發明的多核苷酸。
一種方法利用裸露型的多核苷酸，無任何遞送載體。將這種多核苷酸在生理學可接受的溶液，如無菌鹽或無菌緩衝鹽，有或沒有載體的溶液中簡單地稀釋。當存在載體時，載體優選地是等滲、低滲或弱高滲的，並且具有相對低的離子強度，如由蔗糖溶液所提供的離子強度，例如，含有20％蔗糖的溶液。
可選擇的方法利用與輔助細胞攝取的試劑結合的多核苷酸。這種試劑的實例是(i)修飾細胞滲透性的化學製劑，如布比卡因(見，例如，WO 94/16737)，(ii)用於包封多核苷酸的脂質體，或(iii)與多核苷酸結合的陽離子脂質或二氧化矽，金或鎢微粒。
陰離子和中性脂質體是本領域中熟知的(見，例如，LiposomesAPractical Approach，RPC New Ed，IRL press(1990)，詳細描述了製備脂質體的方法)並可用於傳遞大範圍的產物，包括多核苷酸。
陽離子脂質在本領域中也是熟知的，通常用於基因傳遞。這種脂質包括也稱為DOTMA(N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨)的LipofectinTM、DOTAP(1，2-雙(油醯氧)-3-(三甲銨)丙烷)、DDAB(二甲基雙十八烷基溴化銨)、DOGS(雙十八烷基醯胺甘氨醯精胺)以及膽固醇衍生物如DC-Chol(3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙基)氨甲醯基-膽固醇)。可在EP 187,702、WO 90/11092、美國專利No.5,283,185、WO91/15501、WO95/26356以及美國專利No.5,527,928中發現這些陽離子脂質的描述。優選地與中性脂質如DOPE(二油醯磷脂醯乙醇胺)結合使用的用於基因傳遞的陽離子脂質，如在WO 90/11092中所描述的作為實例。
含有陽離子脂質體的製劑可任選地含有其它便於轉染的化合物。
如在WO 91/00359、WO 93/17706和Tang等(參考文獻19)中所描述的，使用金或鎢微粒進行基因傳遞。使用無針注射裝置(「基因槍」)通過真皮內或表皮內途徑注射微顆粒包被的多核苷酸，如在美國專利No.4,945,050、美國專利No.5,015,580和WO 94/24263中所描述的那些。
在疫苗接受者中所用的DNA的量取決於，例如，DNA構建體中所用啟動子的強度、所表達的基因產物的免疫原性、有待給藥的哺乳動物的情況(例如，體重、年齡以及哺乳動物的總的健康)、給藥方式以及製劑的類型。一般地，可向成年人施用從大約1μg到大約1mg，優選地，從大約10μg到大約800μg，以及更優選地，從大約25μg到大約250μg的治療或預防有效量。可以單劑量或每隔一段時間重複給藥。
給藥的途徑是疫苗領域中所用的任何常規途徑。作為總的指導，通過黏膜表面施用本發明的多核苷酸，例如，眼、鼻內、肺、口、腸、直腸、陰道以及泌尿道表面；或者通過非腸道途徑，例如，通過靜脈內、皮下、腹膜內、真皮內、表皮內或者肌內途徑。給藥途徑的選擇取決於所選的製劑。將與布比卡因結合配製的多核苷酸有利地施用到肌肉內。當使用中性或陰離子脂質體或陽離子脂質，如DOTMA或DC-Chol時，可通過靜脈內、鼻內(噴霧)、肌內、真皮內以及皮下途徑有利地注射該製劑。可通過肌內、真皮內或皮下途徑有利地施用裸露型的多核苷酸。
儘管不是絕對必需的，但是這種組合物也可含有佐劑。假如這樣的話，為了顯示佐劑的效果，優選不需要伴隨給藥的全身佐劑，如，例如，QS21，其描述於美國專利No.5,057,546。
在本申請中所提供的序列信息能夠設計用於診斷目的的特異性核苷酸探針和引物。因此，本發明的第五方面提供核苷酸探針或引物，其具有在SEQ ID No1或3所示序列中所發現的序列或者具有從SEQID No1或3所示序列的遺傳密碼子的簡併性衍生的序列。
在本申請中所使用的術語「探針」指DNA(優選地單鏈)或RNA分子(或其修飾或其組合)，其在上述所定義的嚴緊條件下與具有SEQID No1的核苷酸分子，或者與SEQ ID No1或3同源的序列，或者與其互補或反義序列雜交。通常，探針顯著短於全長序列。這種探針含有從大約5到大約100個，優選地從大約10到大約80個核苷酸。特別是，探針具有與SEQ ID No1的一部分至少75％，優選地至少85％，更優選地至少95％同源，或者與這些序列互補的序列。探針可含有修飾的鹼基，如肌苷、甲基-5-脫氧胞苷、脫氧尿苷、二甲基氨基-5-脫氧尿苷或者二氨基-2，6-嘌呤。也可修飾或取代糖或磷酸殘基。例如，可用聚醯胺取代脫氧核糖殘基，可用酯基取代磷酸殘基，如二磷酸、烷基、芳基膦酸酯以及硫代磷酸酯。另外，可通過包括烷基的這些基團修飾核糖核苷酸上的2′-羥基。
可在診斷試驗中使用本發明的探針，作為捕獲或檢測探針通過共價方法或者通過被動吸附，直接地或間接地將這種捕獲探針常規地固定到固體支持物上。檢測探針通過選自下列的檢測標記進行標記放射性同位素，酶如過氧化物酶、鹼性磷酸酶以及能水解產色的、螢光的或發光底物的酶，產色的、螢光的或發光的化合物，核苷酸鹼基類似物以及生物素。
本發明的探針用於任何常規的雜交技術，如點印跡、Southern印跡(Southern，J.Mol.Biol.(1975)98503)、northern印跡(除了RNA用作靶外，與Southern印跡相同)、或者夾心技術(Dunn等，Cell(1977)1223)。後者的技術涉及使用相互之間核苷酸序列至少部分不同的特異性捕獲探針和/或特異性檢測探針。
引物是通常大約10到大約40個核苷酸的探針，其用於在擴增過程(例如，PCR)中，在延伸過程中，或者在反轉錄方法中引發DNA的酶促聚合。通過本領域中已知的方法標記在涉及PCR的診斷方法中所用的引物。
如本文所描述的，本發明也包括(i)包括本發明的用於檢測和/或鑑定生物材料中是否存在衣原體的探針的試劑；(ii)用於檢測和/或鑑定生物材料中是否存在衣原體的方法，其中(a)樣本回收自或來自生物材料，(b)從材料中提取DNA或RNA並變性，和(c)在嚴緊雜交條件下暴露於本發明的探針，例如，捕獲、檢測探針或兩者，以便檢測雜交；以及(iii)用於檢測和/或鑑定生物材料中是否存在衣原體的方法，其中(a)樣本回收自或來自生物材料，(b)從其中提取DNA，(c)將所提取的DNA用至少一條，優選地兩條本發明的引物引發並通過聚合酶鏈反應擴增，以及(d)產生所擴增的DNA片段。
很顯然，SEQ ID No1、3、5或7的多核苷酸序列、其同系物和部分序列的公開能夠獲得它們對應的胺基酸序列。因此，本發明的第六方面特徵是具有由本發明多核苷酸編碼的胺基酸序列的基本上純化的多肽或多肽衍生物。
本文所使用的「基本上純化的多肽」定義為從其天然存在的環境中分離的多肽和/或不存在其合成環境中所存在的大多數多肽的多肽。例如，基本上純化的多肽是無胞質多肽。本領域的那些技術人員將很容易地理解，本發明的多肽可從自然來源，即，從衣原體菌株中純化，或者通過重組方法生產。
相應於本發明的第六方面的是經過修飾或處理以提高它們在靶動物中的免疫原性的多肽、同系物或片段，其中多肽、同系物或片段旨在賦予抗衣原體的保護。這種修飾或處理包括用胺基酸衍生物如3-甲基組氨酸、4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸等的胺基酸取代，在多肽、同系物或片段的製備後進行的修飾或缺失，如胺基酸的游離氨基、羧基或羥基側鏈基團的修飾。
通過篩選與引起抗具有SEQ ID No1、3、5或7胺基酸序列的參考多肽的抗血清的交叉反應性，鑑定了具有特異抗原性的由本發明多核苷酸所編碼的同源多肽或多肽衍生物。該方法如下製備抗純化的參考多肽、融合多肽(例如，MBP、GST或His-tag系統的表達產物，在Invitrogen產品手冊中包含pcDNA3.1/Myc-His(+)A、B和C以及XpressTm系統蛋白純化的描述和使用說明)，或預計具有抗原性的合成肽的單特異性超免疫抗血清。對於製備抗融合多肽的抗血清，那麼使用兩個不同的融合系統。可根據許多方法測定特異性抗原性，包括下述Western印跡、點印跡和ELISA。
在Western印跡試驗中，根據Laemmli(Nature(1970)227680)所描述的方法將作為純化製劑或大腸桿菌總提取物的篩選產物進行SDS-Page電泳。轉移到硝酸纖維素膜後，將材料進一步與在從大約1∶5到大約1∶5000，優選地從大約1∶100到大約1∶500的稀釋範圍內稀釋的單特異性超免疫抗血清孵育。一旦與產物對應的條帶在上述範圍內的任何稀釋液中顯示反應性，則表明特異抗原性。
在ELISA試驗中，將要篩選的產物優選地用作包被抗原。儘管也可使用整個細胞提取物，但是優選使用純化的製劑。簡要地，將約10μg蛋白/ml的約100μl製劑分配到96孔聚碳酸酯ELISA平板的孔內。將平板在37℃孵育2小時，然後在4℃過夜。將平板用含0.05％Tween 20的磷酸緩衝鹽(PBS/Tween緩衝液)衝洗。將孔用250μl含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS飽和以防止非特異性抗體結合。在37℃孵育1小時後，將平板用PBS/Tween緩衝液衝洗。將抗血清在含有0.5％BSA的PBS/Tween緩衝液中連續稀釋。每個孔中加入100μl稀釋液。將平板在37℃孵育90分鐘，衝洗並根據標準方法進行評估。例如，當在兔中引起特異性抗體時，向孔中加入山羊抗兔過氧化物酶綴合物。孵育是在37℃進行90分鐘並衝洗平板。反應用適當的底物顯色並通過比色法測量反應(通過分光光度法測量吸光度)。在上述試驗條件下，高於非免疫對照血清的O.D.值，顯示陽性反應。
在點印跡試驗中，儘管也可使用整個細胞提取物，但是優選純化的產物。簡要地，將大約100μg/ml的產物溶液在50mM Tris-HCl(pH7.5)中連續稀釋兩倍。將每種稀釋液100μl應用到裝在96孔點印跡裝置(Biorad)中的0.45μm硝酸纖維素膜上。通過向系統中應用真空除去緩衝液。通過添加50mM Tris-HCl(pH 7.5)衝洗孔並將膜進行風乾。將膜在封閉緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.5)0.15M NaCl，10g/L脫脂乳)中飽和並與從大約1∶50到大約1∶5000，優選地大約1∶500的抗血清稀釋液孵育。根據標準方法顯示反應。例如，當使用兔抗體時，向孔中加入山羊抗兔過氧化物酶綴合物。在37℃孵育90分鐘，並衝洗印跡。反應用適當的底物顯色並終止。通過有色點的外觀目測反應，例如，通過比色法。在上述試驗條件下，一旦有色點與至少約1∶5，優選地至少約1∶500的稀釋液相關，則顯示為陽性反應。
可根據下述方法評估本發明的多肽或衍生物的治療或預防效能。本發明的第七方面提供(i)一種組合物，其包括本發明的多肽，連同稀釋劑或載體；具體地(ii)含有治療或預防有效量的本發明多肽的藥物組合物；(iii)在哺乳動物中誘導抗衣原體的免疫反應的方法，即通過向哺乳動物施用免疫原性有效量的本發明的多肽以引起對衣原體的保護性免疫反應；特別是，(iv)預防和/或治療衣原體(例如，沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體或牲畜衣原體)的方法，即通過向感染的個體施用預防或治療量的本發明的多肽。另外，本發明的第七方面包括本發明的多肽在製備用於預防和/或治療衣原體感染的藥物中的用途。
如在本文所使用的，通過疫苗領域中已知的常規途徑施用本發明的免疫原性組合物，特別是通過黏膜(例如，眼、鼻內、肺、口、胃、腸、直腸、陰道或泌尿道)表面或通過非腸道(例如，皮下、真皮內、肌內、靜脈內或腹膜內)途徑。給藥途徑的選擇取決於許多參數，如與多肽結合的佐劑。如果使用黏膜佐劑，那麼優選鼻內或口服途徑。如果使用脂質製劑或鋁化合物，那麼優選非腸道途徑，最優選皮下或肌內途徑。該選擇也取決於疫苗試劑的性質。例如，最好向黏膜表面施用與CTB或LTB融合的本發明的多肽。
如本文所使用的，本發明的組合物包含一種或幾種本發明的多肽或衍生物。組合物可任選地含有至少一種另外的衣原體抗原，或者其亞基、片段、同系物、突變體或衍生物。
對於在本發明組合物中的用途，將多肽或其衍生物配製成或具有脂質體，優選地中性或陰離子脂質體、微球體、ISCOMS、病毒樣顆粒(VLPs)或細菌菌蛻(EP 1158 966B1)以便於傳遞和/或提高免疫反應。這些化合物對於本領域技術人員來說很容易獲得。
以單劑量或者如果需要，每隔一段時間重複完成治療，這可由本領域技術人員很容易地確定。例如，給予引發劑量後以每周一次或每月一次的時間間隔強化三次。適當的劑量取決於各種參數，包括受體(例如，成體或幼體)、特定的疫苗抗原、給藥的途徑和頻率、佐劑存在/缺乏或者佐劑的類型、以及期望的效果(例如，保護和/或治療)，這可由本領域技術人員決定。一般地，通過黏膜途徑以從大約10μg到大約500μg，優選地從大約1μg到大約200μg的量施用本發明的疫苗抗原。對於非腸道給藥途徑，劑量通常不超過大約1mg，優選地大約100μg。
當用作疫苗試劑時，可將本發明的多核苷酸和多肽按順序地用作多步免疫過程的一部分。例如，哺乳動物最初用本發明的疫苗載體如痘病毒引發，例如，通過非腸道途徑，然後用由疫苗載體所編碼的多肽強化兩次，例如，通過黏膜途徑。在另一個實例中，也使用與本發明的多肽或衍生物結合的脂質體用於引發，使用本發明的可溶的多肽或衍生物，聯合黏膜佐劑(例如，LT)，通過黏膜進行強化。
根據第七方面，本發明的多肽衍生物也用作檢測，例如血液樣本中是否存在抗衣原體抗體的診斷劑。這種多肽長大約5到大約80，優選地大約10到大約50個胺基酸。它們被標記或未被標記，視診斷方法而定。下面描述包括這種試劑的診斷方法。
一旦本發明的DNA分子表達，即可使用已知的實驗室技術生產並純化多肽或多肽衍生物。如上所述，可產生多肽或多肽衍生物，作為含有便於純化的融合尾的融合蛋白。融合產物用於免疫小哺乳動物，例如，小鼠或兔子，以便產生抗多肽或多肽衍生物的抗體(單特異性抗體)。因此，本發明的第八方面提供結合本發明多肽或多肽衍生物的單特異性抗體。
「單特異性抗體」意指能與唯一的天然存在的衣原體多肽反應的抗體。本發明的抗體是多克隆或單克隆抗體。單特異性抗體可以是重組的，例如，嵌合的(例如，由與人恆定區結合的鼠源的可變區構成)、人源化的(人免疫球蛋白恆定區主鏈連同小鼠等動物源的高變異區)、和/或單鏈。多克隆和單特異性抗體也都可以是免疫球蛋白片段的形式，例如F(ab)2或Fab片段。本發明的抗體是任何同種型的抗體，例如，IgG或IgA，多克隆抗體是單同種型抗體或同種型抗體的混合物。
通過用包括所述多肽、同系物或片段的組合物免疫動物產生抗本發明的多肽、同系物或片段的抗體。這種抗體可以是多克隆或單克隆抗體。生產多克隆或單克隆抗體的方法是本領域熟知的。
本發明的抗體，其由本發明的多肽或多肽衍生物引起，並使用標準免疫學試驗進行鑑定，例如，Western印跡分析、點印跡試驗或ELISA。該抗體用於診斷方法中以檢測樣本，如生物樣本中是否存在衣原體抗原。該抗體也用於親和層析中以純化本發明的多肽或多肽衍生物。如在下面進一步討論的，這種抗體可用於預防性和治療性被動免疫方法。
因此，本發明的另一個方面提供(i)用於檢測生物樣本中是否存在衣原體的試劑，其含有本發明的抗體、多肽或多肽衍生物；和(ii)用於檢測生物樣本中是否存在衣原體的診斷方法，即通過將生物樣本與本發明的抗體、多肽或多肽衍生物接觸，以便形成免疫複合體，以及通過檢測這種複合體以表明在樣本或樣本來源的生物體中是否存在衣原體。
本領域的那些技術人員將很容易地理解，無論使用哪一種，在樣本的成分和抗體、多肽或多肽衍生物之間都能形成免疫複合體，並在檢測複合體之前除去任何未結合的材料。應當理解的是，多肽試劑可用於檢測樣本，例如血液樣本中是否存在抗衣原體抗體，而本發明的抗體用於篩選樣本，如胃提取物或活檢中是否存在衣原體多肽。
對於診斷應用，試劑(即，本發明的抗體、多肽或多肽衍生物)以游離狀態或被固定在固體支持物上，如試管、珠或本領域中任何其它常規所用的支持物。使用直接的或間接的方法實現固定。直接的方法包括支持物和試劑之間的被動吸附(非共價結合)或共價結合。「間接方法」意指首先將與試劑相互作用的抗試劑化合物附著到固體支持物上。例如，如果使用多肽試劑，那麼與其結合的抗體可作為抗試劑，只要其結合不參與生物樣本中抗體識別的表位即可。間接方法也可使用配體-受體系統，例如，將分子如維生素移植到多肽試劑上和將對應的受體固定到固相上。這通過生物素-鏈黴抗生物素系統舉例說明。可選擇地，通過化學方法或者通過基因工程方法向試劑添加肽尾，並且通過被動吸附或肽尾的共價鍵固定移植的或融合的產物。
試劑盒中可包括這種診斷試劑，也包括使用說明。用檢測手段標記試劑，當其與靶結合時允許實施試劑的檢測。檢測工具可以是螢光劑，如螢光素異氰酸酯或螢光素異硫氰酸鹽，或者是酶，如辣根過氧化物酶或螢光素酶或鹼性磷酸酶，或者是放射性元素，如125I或51Cr。
因此，本發明的另一個方面提供從生物樣本中純化本發明的多肽或多肽衍生物的方法，其涉及對生物樣本進行基於抗體的親和層析，其中抗體是本發明的單特異性抗體。
對於在本發明純化方法中的用途，抗體是多克隆或單克隆抗體，優選地是IgG型抗體。使用標準方法從抗血清中製備純化的IgG。常規層析支持物以及移植抗體的標準方法描述於，例如，AntibodiesALaboratory Manual，D.Lane，E.Harlow，編(1988)和下面所概述的方法。
簡要地，將生物樣本，如優選地溶於緩衝液中的沙眼衣源體提取物，應用到層析材料上，優選地用稀釋生物樣本所用的緩衝液平衡以便使本發明的多肽或多肽衍生物(即，抗原)吸附到材料上。層析材料，如結合本發明抗體的凝膠或樹脂，是以束或柱的形狀。洗去未結合的成分，然後將抗原用適當的洗脫緩衝液洗脫，如甘氨酸緩衝液或含有離液劑的緩衝液，例如，鹽酸胍或高濃度鹽(例如，3M MgCl2)。回收洗脫的餾分並檢測是否存在抗原，例如，通過在280nm測定吸光度進行檢測。
本發明的另一個方面提供(i)組合物，其包括本發明的單特異性抗體，連同稀釋劑或載體；(ii)包括治療或預防有效量的本發明的單特異性抗體的藥物組合物，以及(iii)治療或預防衣原體(例如，沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體或牲畜衣原體)感染的方法，即通過向感染的個體施用治療或預防量的本發明的單特異性抗體。另外，本發明的第十一方面包括本發明的單特異性抗體在製備用於治療或預防衣原體感染的藥物中的用途。
單特異性抗體是多克隆抗體或單克隆抗體，優選地是IgA同種型抗體(主要地)。在被動免疫中，向哺乳動物的黏膜表面施用抗體，例如，胃黏膜，例如通過口服或通過胃內，有利地，在存在碳酸氫鹽緩衝液時。可選擇地，進行全身給藥時，不需要碳酸氫鹽緩衝液。本發明的單特異性抗體作為單一活性成分或者作為與至少一種對不同的衣原體多肽特異的單特異性抗體的混合物施用。本領域技術人員很容易地確定所用抗體的量和具體的給藥方案。例如，一周內每日施用大約100到1,000μg抗體。
使用本領域中的標準方法評估治療或預防效能，例如，通過測量誘導的黏膜免疫反應或誘導的保護性和/或治療免疫，使用，例如本文所公開的衣原體小鼠模型。本領域的那些技術人員將很容易地認識到，模型中所用的衣原體菌株可用另一種衣原體菌株或血清變型替代。例如，優選地在小鼠模型中使用沙眼衣原體菌株評估沙眼衣原體的DNA分子和多肽的效能。通過將衣原體感染的程度與對照組的程度進行比較，確定保護作用。當與對照組相比感染降低時，證明有保護作用。可使用統計學分析證明與對照組的差異。對本發明的多核苷酸、疫苗載體、多肽及其衍生物以及抗體進行這種評估。
在上述任何一種疫苗組合物中有用的佐劑如下。
用於非腸道施用的佐劑包括鋁化合物，如氫氧化鋁、磷酸鋁以及磷酸氫氧化鋁。根據標準方案將抗原用鋁化合物沉澱或吸附到鋁化合物上。在非腸道施用中使用其它佐劑，如RIBI(ImmunoChem，Hamilton，MT)。
用於黏膜施用的佐劑包括細菌毒素，例如，霍亂毒素(CT)、大腸桿菌熱不穩定毒素(LT)、難辨梭菌(Clostridium difficile)毒素A和百日咳(pertussis)毒素(PT)、或者它們的組合，亞基，類毒素或突變體，如天然霍亂毒素亞單位B(CTB)的純化製劑。片段、同系物、衍生物和與這些毒素中的任何一種的融合也是合適的，只要它們保留佐劑活性即可。優選地，使用毒性降低的突變體。在黏膜施用中也使用其它佐劑，如細菌單磷醯脂質A(MPLA)，例如，大腸桿菌、明尼蘇達沙門氏菌(Salmonella minnesota)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、或者弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)的MPLA；皂苷或聚交酯乙交酯(PLGA)微球體。
既可用於黏膜施用也可用於非腸道施用的佐劑包括聚磷腈(WO95/02415)、DC-chol(3b-(N-(N-N′-二甲基氨基甲烷)-氨基甲醯基)膽固醇)；美國專利No.5,283,185和WO96/14831)和QS-21(WO 88/09336)。
以常規方式生產含有本發明多核苷酸、多肽、多肽衍生物或抗體的本發明的任何藥物組合物。特別是，將其與藥學上可接受的稀釋劑或載體一起配製，例如，水或鹽溶液如磷酸緩衝鹽。一般地說，根據施用的方式和途徑以及標準的藥學實踐，選擇稀釋劑或載體。
這裡所顯示的和下面所詳細描述的數據證明，用編碼Mgp002基因的衣原體核酸分子的核酸免疫引起免疫反應，並且產生對沙眼衣原體MoPn的肺攻擊感染的顯著的保護性免疫。
對於本領域的技術人員來說很顯而易見，本發明的各種實施方案在衣原體感染的接種、診斷和治療領域中具有許多應用。下面進一步介紹這些用途的非限制性討論。
實施例上述公開的內容概括地描述了本發明。通過參考下列具體實施例可獲得更全面的理解。描述這些實施例僅用於說明的目的，並不是為了限制本發明的範圍。認為形式的改變和等同替換如同可建議或提供便於操作的方式的情況也應該包含在本發明的範圍之內。儘管這裡一直使用具體術語，但是這些術語旨在描述性的意思而不用於限制的目的。
實施例1本實施例舉例說明用於免疫的質粒載體的製備。
在含有10％胎牛血清和2mM L-穀氨醯胺的Eagle MEM中的Hela229細胞中培養沙眼衣原體小鼠肺炎(MoPn)分離物。收穫MoPn EBs並通過在4℃以43,000g，梯度密度離心60分鐘的步驟進行純化。將純化的EBs用PBS衝洗兩次，以30,000g離心30分鐘，在蔗糖-磷酸鹽-穀氨酸(SPG)緩衝液中重懸並冷凍在-70℃備用。
將編碼Mgp002基因的核酸分子框內克隆到真核表達質粒pCAMycHis中，Myc-His標籤存在於載體中。該載體是由pcDNA3.1(-)Myc-His C(Invitrogen，San Diego)和質粒VR1012(Vical)構建的。在2000年9月21日公開的PCT公開WO 00/55326中公開了構建的細節。簡要地，質粒pcDNA3.1(-)Myc-His C(Invitrogen)用Spe I和Bam HI消化以除去CMV啟動子並分離剩餘的載體片段。由Spe I/Bam HI片段分離來自質粒VR-1012(Vical)的CMV啟動子和內含子A。將片段連接起來產生質粒pCA/Myc-His。
通過聚合酶鏈反應(PCR)，使用包括NotI位點(有下劃線的)、起始密碼子(粗體)和MoPn的成熟Mgp002基因產物的N末端序列的5′引物(5′ATAAGAATGCGGCCGCCACC ATG GGA TTA TCTCGC CTA ATT 3′-SEQ ID No9)以及包括Kpn I位點(有下劃線的)的3′反向引物(5′GTTGGTACCGAGCTCGCTCCACTATTCTCATTAATAATCC 3′-SEQ 1D No10)從MoPn基因組DNA中擴增全長mgp002基因。反向引物與Mgp002基因的3′端互補，但是不含有終止密碼子。而是插入另外的核苷酸，導致與pCAMycHis的Myc-和His-tags的符合讀框的基因融合。瓊脂糖凝膠電泳後分離PCR產物，用Kpn I和Not I限制性消化並連接到載體pCAMycHis的Kpn I和NotI位點。在氨苄青黴素選擇下，將連接混合物轉化到大腸桿菌DHlOb中。為了證明正確的擴增和克隆，對整個插入片段的DNA進行測序。將所得的質粒命名為pCACTMgp002。PCR產物具有圖1中所示的核酸序列(SEQ ID No1)以及代表全長Mgp002基因的推定的胺基酸序列(SEQ ID No2)。
如上所述，用正向引物5′ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGTGCGACTTCCCCCCCAGT 3′-SEQ ID No11和mgp002反向引物5′GTTGGTACCGAGCTCGCTCCACTATTCTCATTAATAATCC3′SEQ ID No12，也通過聚合酶鏈反應(PCR)從MoPn基因組DNA中擴增缺失信號序列的mgp002基因。將克隆到pCAMycHis中的所得質粒鑑定為pCACTMgp002delta。缺失的推定的信號序列在圖1中用下劃線顯示，缺失信號序列的Mgp002基因具有在圖1中指出的在箭頭處開始的核酸序列(SEQ ID No5)和推定的胺基酸序列(SEQ ID No6)。
類似地，在圖2中顯示沙眼衣原體血清變型D的Mgp002基因的核酸序列(SEQ ID No3)和推定的全長Mgp002基因的蛋白質序列(SEQ ID No4)，或者在圖2箭頭處顯示缺失信號序列的基因的核酸序列(SEQ ID No7)和推定的蛋白質序列(SEQ ID No8)。本領域技術人員能意識到，可使用上面所概述的類似技術獲得任何其它血清變型的任何其它序列。
實施例2本實施例顯示使用核酸載體的免疫研究的結果。
為了研究由核酸免疫所引起的免疫反應是否在功能上有效，根據以前所描述的方法(參考文獻20)評估體內保護效能。簡要地說，雌性Balb/c小鼠(4到5周齡)購自Charles River Canada(St.Constant，Canada)。用根據實施例1中所描述的方法製備的質粒DNA通過肌內和鼻內對小鼠進行免疫，見圖3在0、2和4周的三個時間進行免疫。對於每次免疫，使用27號針將200μl的總計200μg DNA注射到兩個四頭肌內(每個注射部位100μg DNA)。在同一時間，用微量加液器將50μl的50μg DNA輸送到小鼠的鼻孔。液滴隨後被小鼠吸入。
如上所述，最後一次免疫後14天，通過鼻內用2×103IFU的沙眼衣原體MoPn EB攻擊小鼠。簡要地，乙醚麻醉後用微量加液器將25μl含有2×103IFU MoPn接種物的SPG遞送到小鼠的鼻孔上。液滴隨後被小鼠吸入。攻擊感染後每日測量體重，持續10天，作為衣原體誘導的發病率的測量值，見圖4。使用注射鹽水 或空載體(pCAMycHis)的小鼠作為陰性對照。感染後第3天，用Mgp002基因產物或截短型免疫的小鼠，喪失的體重顯著低於陰性對照組(圖4)。
在感染後第10天，處死小鼠並通過無菌方法分離它們的肺，在SPG緩衝液中用研磨機勻漿。將組織懸液在4℃以500g離心10分鐘，除去粗糙的組織和碎屑。將上清液冷凍到-70℃直到組織培養物用於檢驗生物體的定量生長。
對於DNA接種效率的更直接的測量，亞致死性肺感染後評估限制衣原體在體內生長的能力。在該感染模型系統中，攻擊後第10天是高峰生長時間並選作用於比較各組小鼠間的肺滴度。如在圖5中所示，用Mgp002全長基因產物DNA免疫的小鼠，其肺滴度(每200x視野的IFU)顯著低於(p＜0.001)陰性對照組(單獨用pCAMycHis和 鹽水組)。令人驚奇地，用Mgp002基因的截短型免疫的小鼠(圖5，圖B)顯示甚至比全長基因更低的IFUs。
這些數據證明用Mgp002以及甚至該基因的截短型的核酸免疫能引起對沙眼衣原體MoPn的肺攻擊感染的保護性免疫反應。這些數據也證明Mgp002基因中的保護性序列位於該基因的截短型中。
實施例3本實施例舉例說明用於重組mgp002在大腸桿菌中表達的核酸載體的製備。
PCR擴增所需的步驟、通過核酸內切酶和核酸外切酶修飾DNA產生用於DNA克隆的期望末端、連接以及細菌轉化都是本領域熟知的。所使用的標準的分子克隆技術是本領域中熟知的並由Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版；Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spring Harbo，New York以及由Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley-Interscience；1987描述。
細菌在McCoy細胞中傳代後，從沙眼衣原體小鼠肺炎株(MoPn，也稱作鼠衣原體(Chlamydia muridarum))中製備衣原體基因組DNA。
為了表達，從沙眼衣原體MoPn感染的McCoy細胞中收穫的總DNA中，擴增具有其天然信號肽(由前18個密碼子編碼)的mgp002編碼序列，其中使用正向引物MoPn mgp002-F/+SP(5′-GAATTCGGATCCGATGGGATTATCTCGCCTA-3′)SEQ ID No13，以及反向引物MoPn mgp002-R(5′-ATTAAGAATGCGGCCGCTTTATCACTCCACTATTCT-3′)SEQ ID No14以及Advantage-HF2聚合酶混合物(Clontech)。正向引物引入編碼BamHI限制性位點(斜體字)的序列。反向引物引入NotI限制性位點(斜體字)和雙終止密碼子(互補鏈上有下劃線的)。將所得的PCR產物按順序地用BamHI和NotI限制性消化，並插入到pET30b(+)質粒中，其也已經用BamHI和NotI切割。將新的質粒稱作pET30b(+)mgp002+SP。在該構建體中，表達具有N-末端His-Tag的mgp002+SP，其源自pET30b(+)載體內編碼序列的上遊。圖6顯示上述克隆步驟的示意圖。可利用類似的步驟製備沙眼衣原體血清變型D或任何其它血清變型株的MgpO02。除了添加的便於純化的N末端的組氨酸標籤外，胺基酸序列具有與圖1中所示的相同序列(SEQ ID No2)。
為了重組mgp002蛋白的表達，使用含有表達載體pET30b(+)mgpO02+SP#l的大腸桿菌BL21(DE3)的過夜培養物(85ml)接種各含有500ml Luria-Bertani肉湯培養基的燒瓶，在37℃培養到A595達到0.8。通過添加IPTG到終濃度1mM，誘導mgp002表達為組氨酸標記的蛋白，將培養物再培養4小時。然後將過夜表達的重組蛋白在考馬斯藍染色的SDS-PAGE上進行分析，並使用標準條件通過用抗組氨酸標籤的單克隆抗體的免疫染色以證明表達。
實施例4本實施例舉例說明使用固定的金屬親和層析(IMAC)從大腸桿菌中純化組氨酸標記的重組Mgp002蛋白。
將實施例3的表達重組Mgp002的細菌細胞培養物離心以沉澱細胞並與含有0.5％v/v Triton X-100的磷酸緩衝鹽(PBS；10mM磷酸緩衝液，pH 7.5，150mM NaCl)，以大約1g溼重/mL的比例(一般地20-30g/30mL)混合。將含有混合物的試管在冰上冷卻並用Branson超聲波儀以20-30％的輸出功率超聲3次，每次間隔1分鐘，中間冷卻1-2分鐘。將得到的溶液轉移到40mL Beckman離心管中並在BeckmanAvanti J30i離心機上在4℃，以10,000rpm離心15分鐘。將上清液輕輕倒出，將經離心的沉澱在等體積的含有6M鹽酸胍的同一緩衝液中重懸。將混合物如上所述進行超聲並離心，保留含有溶解的mgp002蛋白的上清液作為原料材料。
用於IMAC純化的柱是Amersham XK 50/20型，半徑2.5cm。將其用Amersham Pharmacia鰲合劑瓊脂糖凝膠速流(Fast Flow)填充到10cm高，柱體積(CV)為200ml。如果以前使用過，根據生產商的使用說明使柱再生並消毒；通過7CV的去離子水後，用1CV的0.1MNiCl2使柱帶電荷並用4CV PBS，pH 6.8平衡。
將柱以25mL/分的流速用4CV含有胍的上述緩衝液平衡。將500ml的樣本原料以25mL/分速度上樣，隨後3CV含有50mM咪唑的PBS洗滌。mgp002蛋白的洗脫受流經柱的3CV含有300mM咪唑的PBS影響。保留洗脫餾分用於滲濾。
最後，使用截留10kDa標稱分子量的濾器，將洗脫液用Pall Minum切向流過濾裝置濃縮大約6倍。為了確保產品的可溶性，用大約10體積的含有10mM Tris-HCl，pH 8.5、150mM NaCl、0.8M L-精氨酸以及10mM二硫蘇糖醇的緩衝液將濃縮物在同一裝置中滲濾。這產生了適於配製到含或不含佐劑的免疫原性組合物或疫苗中的純化的重組Mgp002蛋白。
實施例5本實施例舉例說明在免疫的CH3小鼠中對沙眼衣原體血清變型D生殖器攻擊的保護。
將實施例4的純化的重組Mgp002蛋白(20ug/劑量)與2.5ug/免疫劑量的ISCOM佐劑ISCOMATRIX(IMX)一起配製。用血清變型D沙眼衣原體的陰道內攻擊後，通過測定生殖器衝洗液中的細菌負載來測量保護。
簡要地，用每種溶於IMX的試驗抗原免疫CH3雌性小鼠兩次。然後使用孕酮(狄波-普維拉)將動物誘導到動情期樣狀態，接著用沙眼衣原體血清變型D通過陰道內進行攻擊。在感染後的時間點進行衝洗和擦洗並評估培養物中的內含物形成單位(IFU)。任何時間點的陽性培養物表明認為正在研究的動物受到了感染。評估5個時間點以確定發生感染的水平。免疫方案顯示於下列表1中。
表1免疫方案
在第3、5、7、11和14天用2×50μl SPG緩衝液衝洗陰道腔，隨後用試子擦拭。將衝洗液和試子加到含有400μl SPG的試管中並置於冰上，將其冷凍用於後來的檢驗或者立即檢驗。在第34天，採集所有組小鼠的血，並將血清樣本送到Ausra Raudonikiene/KiristinBoehlke(Bld 17，rm 124)，在那裡將樣本旋轉，除去血清並冷凍，直到檢驗。
圖7顯示Mgp002蛋白免疫在第3天能顯著降低生殖道內的細菌負荷，在第5天更少。這些結果證明mgp002的重組型能在攻擊後通過降低細菌負荷提供保護。原生小體(EB)是陽性對照並且也能降低生殖道內的細菌負荷。當與僅給予佐劑和安慰劑的對照組比較時，這些結果具有統計學意義(Wilcoxonp＜0.05)。
實施例6本實施例舉例說明在Mgp002免疫的Balb/c小鼠中對沙眼衣原體MoPn肺攻擊的保護。
根據上述實施例2中所描述的方法進行肺攻擊。同實施例4中所描述的一樣，使用Mgp002蛋白免疫小鼠。簡要地，通過肌內(i.m)三次免疫小鼠(見圖3)，使用與200μg/免疫劑量的DC-Chol佐劑一起配製的實施例4的純化的重組Mgp002蛋白(25ug/劑量)。根據實施例2中所描述的方法，最後一次免疫後14天用2×103IFU的沙眼衣原體MoPn EB通過鼻內攻擊小鼠。
在感染後第10天，處死小鼠並用無菌方法分離它們的肺，用研磨機在SPG緩衝液中勻漿。將組織懸液在4℃以500g離心10分鐘，除去粗糙的組織和碎屑。將上清液在-70℃冷凍，直到組織培養物用於檢驗生物體的定量生長。圖8證明當與非免疫的小鼠相比時，用與另一種佐劑，DC-Chol一起配製的Mgp002重組蛋白免疫的小鼠也顯示顯著降低肺內的衣原體負荷。這些結果在p＜0.05時具有統計學意義。
公開概述在本公開內容的概述中，本發明提供一種用核酸，其包括DNA，免疫宿主，包括人類，抗衣原體菌株，特別是沙眼衣原體感染所致疾病的方法，包括使用含有編碼衣原體菌株Mgp002基因產物的全長或截短型的核苷酸序列以及影響Mgp002基因和截短型在宿主中表達的啟動子的核酸載體，具體地是質粒載體。Mgp002基因的全長和截短型兩者都能在宿主中引起抗活衣原體攻擊的保護性免疫反應。截短型引起甚至高於全長型的保護性反應。在本發明的範圍內可進行修飾。
參考文獻1.M.A.Liu，M.R.Hilleman，R.Kurth，Ann.N.Y.Acad.Sci.772(1995).
2.D.M.Pardoll and A.M.Beckerieg，Immunity3，165(1995).
3.W.M.McDonnell and F.K.Askari，N.Engl.J.Med.334，42(1996).
4.J.B.Ulmer of al.，Science 259，1745(1993).
5.B.Wang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，4156(1993).
6.Schachter J.InChlamydiaIntracellular Biology，Pathogenesis and Immunology，Stephens R(Ed)139-169(1999).
7.G.J.M.Cox，T.J.Zamb，L.A.Babiuk，J.Virol.67，5664(1993).
8.Z.Q.Xiang et al.，Virology 199，132(1994).
9.Igietseme JU and Murdin A.Infect Immun 686798-6806(2000).
10.J.J.Donnelly et al.，J.Infect，Dis.713，314(1996).
11.H.D.Caldwell and Judd R.C.Infect Immun 38960-968(1982)12.Altschul et al.，Nucleic Acids Res.；253389-3402(1997)13.Taylor et al，Vaccine 13539(1995)14.Stephens RS，et al.，Science 282754-759(1998).
15.Read TD et al.，Nucleic Acids Res.281397-1406(2000).
16.Liljestrom P，GaroffH.Biotechnology 9(12)1356-61(1991).
17.Dubensky TW et al.J Virol.70(1)508-19(1996).
18.Pushko P et al.Virology 239(2)389-401(1997).
19.Tang et al.，Nature 356152-154(1992).
20.Zang D-J et al.J Infec Dis 1761035-1040(1997).
序列表110Aventis Pasteur LimitedBrunham，RobertRaudonikiene，AusraGallichan，ScottMurdin，Andrew120抗衣原體感染的免疫接種130APL-03-03PCT15060/481,6901512003-11-2116014170PatentIn version 3.321012111698212DNA213鼠衣原體220
221CDS222(1)..(1698)4001atg gga tta tct cgc cta att tta ttt ggc tta ctt tct tta ccg ctc 48Met Gly Leu Ser Arg Leu Ile Leu Phe Gly Leu Leu Ser Leu Pro Leu1 5 10 15tca gca agc tgc gac ttc ccc ccc agt gtt tcc cag aag ata tta ttc 96Ser Ala Ser Cys Asp Phe Pro Pro Ser Val Ser Gln Lys Ile Leu Phe20 25 30ttg tgt caa aaa tct att cct caa gct ctg gag tcc tat ctt gag gca144Leu Cys Gln Lys Ser Ile Pro Gln Ala Leu Glu Ser Tyr Leu Glu Ala35 40 45tct aca acc tat caa caa cat aac ttt tct ata ttg cgc tta ata gct192Ser Thr Thr Tyr Gln Gln His Asn Phe Ser Ile Leu Arg Leu Ile Ala
50 55 60aag tca tac tta caa caa agt ctc ttt tct gaa gat gct tac gta cgc240Lys Ser Tyr Leu Gln Gln Ser Leu Phe Ser Glu Asp Ala Tyr Val Arg65 70 75 80aaa agc gca att att gga gcg ggg ctt tct ggc tca tct gag act cta288Lys Ser Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Thr Leu85 90 95gat cta ctg tct gaa tcc ata gaa aca cag gat ctt tat gag cag cta336Asp Leu Leu Ser Glu Ser Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu100 105 110ctt att tta aat gct gca ggc aat caa tta ggc aaa act tcc gat cgt384Leu Ile Leu Asn Ala Ala Gly Asn Gln Leu Gly Lys Thr Ser Asp Arg115 120 125ctt tta ttc aaa gga tta aca gca cct cat cct att att cgc ttg gaa432Leu Leu Phe Lys Gly Leu Thr Ala Pro His Pro Ile Ile Arg Leu Glu130 135 140gct gct tac cgt ctg gcc tgt atg aaa aac agt aaa gta agt gac tac480Ala Ala Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr145 150 155 160ctc tat tct ttt atc cac cag ctt cca gaa gaa atc caa aac tta gca528Leu Tyr Ser Phe Ile His Gln Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala165 170 175gca acg att ttt ttg cag ctc gaa acg gaa gaa gca gat gct tat gtt576Ala Thr Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Val180 185 190cat aga ctc ctg tct tct cct aat agt cta aca aga aac tat atg gct624His Arg Leu Leu Ser Ser Pro Asn Ser Leu Thr Arg Asn Tyr Met Ala195 200 205tat cta att gga gaa tat caa cag agg aga ttt ctt cca acg ctc cgc672Tyr Leu Ile Gly Glu Tyr Gln Gln Arg Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg210 215 220tcg ttg ctt acc agc gca gct cct tta gac caa gaa gga tct ttg tat720Ser Leu Leu Thr Ser Ala Ala Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ser Leu Tyr
225 230 235 240gct ata gga aaa tta gaa gat gcc agc agc tat cct aaa atc aaa gca 768Ala Ile Gly Lys Leu Glu Asp Ala Ser Ser Tyr Pro Lys Ile Lys Ala245 250 255tta agc tcc aaa tct aac cct gaa gtg gct ctt gct gct gct cag aca 816Leu Ser Ser Lys Ser Asn Pro Glu Val Ala Leu Ala Ala Ala Gln Thr260 265 270tta tta ttc ttg ggt aaa gaa gat gag gct ctt cct atc cta act act 864Leu Leu Phe Leu Gly Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Thr275 280 285ttt tgc cag caa gag ctt cct cga gct att tat acc tct cgt ttc ctt 912Phe Cys Gln Gln Glu Leu Pro Arg Ala Ile Tyr Thr Ser Arg Phe Leu290 295 300tca tta gaa aaa gga gaa gag ctt ctt tta ccc atc ttt tgt aaa gct 960Ser Leu Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Cys Lys Ala305 310 315 320att aaa gaa gaa att aaa ctg aat gct gct ttg gct ctt gtc cac ttg1008Ile Lys Glu Glu Ile Lys Leu Asn Ala Ala Leu Ala Leu Val His Leu325 330 335gga agc gtt aat cac cta gtg ctt agt tat tta aca gaa ttt tta gaa1056Gly Ser Val Asn His Leu Val Leu Ser Tyr Leu Thr Glu Phe Leu Glu340 345 350aat aaa att ctc cac cgc ata ttt tta ccc acc cat tcg ata gga aaa1104Asn Lys Ile Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Ile Gly Lys355 360 365gcc acg cag ttt tgg aaa gag tgt acg gca ctc cct ctt cta agc cca1152Ala Thr Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Ala Leu Pro Leu Leu Ser Pro370 375 380gaa gaa aaa gca aga gct ttg gca atg tat cgc gca gca gaa gat acg1200Glu Glu Lys Ala Arg Ala Leu Ala Met Tyr Arg Ala Ala Glu Asp Thr385 390 395 400atc ctc tct agt tta tta aaa tta cct aac aat gcc tat ctg cct tat1248Ile Leu Ser Ser Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asn Ala Tyr Leu Pro Tyr
405 410 415ttg gaa cgt att cta act tca caa aaa acc cct cta gca gct aaa gct1296Leu Glu Arg Ile Leu Thr Ser Gln Lys Thr Pro Leu Ala Ala Lys Ala420 425 430att gct ttt tta tca gta aca gct cat cct cag gca ctt tct tta gtc1344Ile Ala Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val435 440 445tcg aaa gca gca cta act cca gga gac cct atc att cgc gct tat gcg1392Ser Lys Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala450 455 460aat tta gct tta tat aca atg acg caa gat cct gaa aag aaa gcc tta1440Asn Leu Ala Leu Tyr Thr Met Thr Gln Asp Pro Glu Lys Lys Ala Leu465 470 475 480tta tat caa tat gcc gaa cag tta ata gga gac acg att ttg ttt aca1488Leu Tyr Gln Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Gly Asp Thr Ile Leu Phe Thr485 490 495gat gag gag aat ccc ctg cct tct ccc cat tct tcc tac ctg cga tat1536Asp Glu Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro His Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr500 505 510caa gtg tcc cca gaa act cgt tct caa ctc atg cta act att tta gaa1584Gln Val Ser Pro Glu Thr Arg Ser Gln Leu Met Leu Thr Ile Leu Glu515 520 525acc cta gtt tct tct aaa act gat gaa gac atc cga gtt ttt ctt tcg1632Thr Leu Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser530 535 540cta atg aaa aaa acc cat tac aaa aat atc ccc atc tta tct gga tta1680Leu Met Lys Lys Thr His Tyr Lys Asn Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu545 550 555 560tta atg aga ata gtg gag1698Leu Met Arg Ile Val Glu5652102
211566212PRT213鼠衣原體4002Met Gly Leu Ser Arg Leu Ile Leu Phe Gly Leu Leu Ser Leu Pro Leu1 5 10 15Ser Ala Ser Cys Asp Phe Pro Pro Ser Val Ser Gln Lys Ile Leu Phe20 25 30Leu Cys Gln Lys Ser Ile Pro Gln Ala Leu Glu Ser Tyr Leu Glu Ala35 40 45Ser Thr Thr Tyr Gln Gln His Asn Phe Ser Ile Leu Arg Leu Ile Ala50 55 60Lys Ser Tyr Leu Gln Gln Ser Leu Phe Ser Glu Asp Ala Tyr Val Arg65 70 75 80Lys Ser Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Thr Leu85 90 95Asp Leu Leu Ser Glu Ser Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu100 105 110Leu Ile Leu Asn Ala Ala Gly Asn Gln Leu Gly Lys Thr Ser Asp Arg115 120 125Leu Leu Phe Lys Gly Leu Thr Ala Pro His Pro Ile Ile Arg Leu Glu130 135 140Ala Ala Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr145 150 155 160
Leu Tyr Ser Phe Ile His Gln Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala165 170 175Ala Thr Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Val180 185 190His Arg Leu Leu Ser Ser Pro Asn Ser Leu Thr Arg Asn Tyr Met Ala195 200 205Tyr Leu Ile Gly Glu Tyr Gln Gln Arg Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg210 215 220Ser Leu Leu Thr Ser Ala Ala Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ser Leu Tyr225 230 235 240Ala Ile Gly Lys Leu Glu Asp Ala Ser Ser Tyr Pro Lys Ilc Lys Ala245 250 255Leu Ser Ser Lys Ser Asn Pro Glu Val Ala Leu Ala Ala Ala Gln Thr260 265 270Leu Leu Phe Leu Gly Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Thr275 280 285Phe Cys Gln Gln Glu Leu Pro Arg Ala Ile Tyr Thr Ser Arg Phe Leu290 295 300Ser Leu Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Cys Lys Ala305 310 315 320Ile Lys Glu Glu Ile Lys Leu Asn Ala Ala Leu Ala Leu Val His Leu325 330 335
Gly Ser Val Asn His Leu Val Leu Ser Tyr Leu Thr Glu Phe Leu Glu340 345 350Asn Lys Ile Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Ile Gly Lys355 360 365Ala Thr Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Ala Leu Pro Leu Leu Ser Pro370 375 380Glu Glu Lys Ala Arg Ala Leu Ala Met Tyr Arg Ala Ala Glu Asp Thr385 390 395 400Ile Leu Ser Ser Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asn Ala Tyr Leu Pro Tyr405 410 415Leu Glu Arg Ile Leu Thr Ser Gln Lys Thr Pro Leu Ala Ala Lys Ala420 425 430Ile Ala Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val435 440 445Ser Lys Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala450 455 460Asn Leu Ala Leu Tyr Thr Met Thr Gln Asp Pro Glu Lys Lys Ala Leu465 470 475 480Leu Tyr Gln Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Gly Asp Thr Ile Leu Phe Thr485 490 495Asp Glu Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro His Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr500 505 510
Gln Val Ser Pro Glu Thr Arg Ser Gln Leu Met Leu Thr Ile Leu Glu515 520 525Thr Leu Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser530 535 540Leu Met Lys Lys Thr His Tyr Lys Asn Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu545 550 555 560Leu Met Arg Ile Val Glu56521032111698212DNA213沙眼衣原體220
221CDS222(1)..(1698)4003atg gga cta tct cgt cta gcc ttc att agt ttc ctc tct ttt aca ctc 48Met Gly Leu Ser Arg Leu Ala Phe Ile Ser Phe Leu Ser Phe Thr Leu1 5 10 15tca gcc agc tgt gat ttt cct tcc tca gtt tct cag aga atc ttg ttt 96Ser Ala Ser Cys Asp Phe Pro Ser Ser Val Ser Gln Arg Ile Leu Phe20 25 30tct tgc cga aaa tca gtc cct caa gct cta gaa gcc tat ctc gaa gct144Ser Cys Arg Lys Ser Val Pro Gln Ala Leu Glu Ala Tyr Leu Glu Ala35 40 45tca gca act tat caa caa cac gat ttc tcc gta tta cgc gta ata gca192Ser Ala Thr Tyr Gln Gln His Asp Phe Ser Val Leu Arg Val Ile Ala50 55 60
gaa tcg tat tta caa caa agc ttt ctc tct gag gac acc tac ata cgt240Glu Ser Tyr Leu Gln Gln Ser Phe Leu Ser Glu Asp Thr Tyr Ile Arg65 70 75 80aaa agt gca att att gga gca ggg cta tct ggt tca tca gaa gct tta288Lys Ser Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Ala Leu85 90 95gag tta ctg tct gag gct ata gaa acg caa gat ctc tat gag caa cta336Glu Leu Leu Ser Glu Ala Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu100 105 110ctc att tta aat gct gca acc agc caa tta agc aaa act tct gac aaa384Leu Ile Leu Asn Ala Ala Thr Ser Gln Leu Ser Lys Thr Ser Asp Lys115 120 125ctt tta ttc aag gga tta aca gct tct cat cct gtc atc cgc tta gaa432Leu Leu Phe Lys Gly Leu Thr Ala Ser His Pro Val Ile Arg Leu Glu130 135 140gct gct tat cgt ctt gcc tgt atg aaa aat agc aag gta agt gat tac480Ala Ala Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr145 150 155 160ctt tat tct ttt atc tac aag tta cca gaa gaa att caa aac cta gcg528Leu Tyr Ser Phe Ile Tyr Lys Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala165 170 175gca act att ttc tta caa ctc gaa aca gaa gaa gct gat gct tat att576Ala Thr Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Ile180 185 190cat cat ttg ctc tct tct ccc aat aac ctg aca aga aae tat gtt gcc624His His Leu Leu Ser Ser Pro Asn Asn Leu Thr Arg Asn Tyr Val Ala195 200 205tat tta att gga gag tac aaa caa aaa aga ttt ctt cca aca cta cgc672Tyr Leu Ile Gly Glu Tyr Lys Gln Lys Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg210 215 220tct tta ctt aca agt gcc tct cct tta gat caa gaa ggc gct ttg tat720Ser Leu Leu Thr Ser Ala Ser Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ala Leu Tyr225 230 235 240
gcg tta ggc aaa ctg gaa gac tct ggt agc tat cct aga att aaa gct 768Ala Leu Gly Lys Leu Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Pro Arg Ile Lys Ala245 250 255cta agc tct aga tcc aat cct gaa gta gta cte gct gca gct cag aca 816Leu Ser Ser Arg Ser Asn Pro Glu Val Val Leu Ala Ala Ala Gln Thr260 265 270tta tta ttc tta gag aaa gaa gaa gaa gct cta ccg atc cta acc aac 864Leu Leu Phe Leu Glu Lys Glu Glu Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Asn275 280 285ctt tgc caa caa aaa ctt ctt cga gcc ctg tat acc gca cgt ttc ctc 912Leu Cys Gln Gln Lys Leu Leu Arg Ala Leu Tyr Thr Ala Arg Phe Leu290 295 300tcg caa gag aag ggt gaa gag ctt ctt ctt cca atc ttt tat aac gca 960Ser Gln Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Tyr Asn Ala305 310 315 320aca caa gaa gaa att aga ctg aat act gct tta gca ctt gtt cat caa1008Thr Gln Glu Glu Ile Arg Leu Asn Thr Ala Leu Ala Leu Val His Gln325 330 335ggg tgt aca gat cct caa gtc ctc cac tat cta aca gaa atc tta gaa1056Gly Cys Thr Asp Pro Gln Val Leu His Tyr Leu Thr Glu Ile Leu Glu340 345 350agt aaa gtt ctc cat cgc ata ttt tta cct act cac tcg aca gga aaa1104Ser Lys Val Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Thr Gly Lys355 360 365gct ata cag ttc tgg aaa gaa tgc acc act ttt cct ctc atg agc caa1152Ala Ile Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Thr Phe Pro Leu Met Ser Gln370 375 380gaa gac aaa atg aga acg ttg gct atg tat cgg gta gcg gaa gat acc1200Glu Asp Lys Met Arg Thr Leu Ala Met Tyr Arg Val Ala Glu Asp Thr385 390 395 400atc ctc tca gcg tta cta aaa tta ccc aat gac gcc tat ctt cct tac1248Ile Leu Ser Ala Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asp Ala Tyr Leu Pro Tyr405 410 415
cta gag cgc atc ctc gcc tca caa aaa act ata cta gca gct aaa gct1296Leu Glu Arg Ile Leu Ala Ser Gln Lys Thr Ile Leu Ala Ala Lys Ala420 425 430att gct ttt tta tcg gta aca gct cat cct cag gca ctt tct tta gtc1344Ile Ala Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val435 440 445tcg aaa gct gca tta act cct gga gac cct atc att cgc gct tac gct1392Ser Lys Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala450 455 460aat cta gct tta tat aca atg acc aaa gat cct gag aaa aaa gct gtg1440Asn Leu Ala Leu Tyr Thr Met Thr Lys Asp Pro Glu Lys Lys Ala Val465 470 475 480cta tac cga tat gct gaa caa tta ata gag gat acc att tta ttc aca1488Leu Tyr Arg Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Glu Asp Thr Ile Leu Phe Thr485 490 495gat gct gaa aat ccg ctt ccc tct cca agc tct tct tat tta cgc tac1536Asp Ala Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr500 505 510caa gta tcc cct gag acc cgc aca caa ctt atg cta gct att ttg gaa1584Gln Val Ser Pro Glu Thr Arg Thr Gln Leu Met Leu Ala Ile Leu Glu515 520 525acc tta gtt tct tcc aaa acg gat gaa gat atc cgc gtt ttt ctt tcc1632Thr Leu Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser530 535 540cta atg aaa aaa acc cat tac aaa aat atc ccg atc tta tca gga ttg1680Leu Met Lys Lys Thr His Tyr Lys Asn Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu545 550 555 560tta atg aga ata gtg gag1698Leu Met Arg Ile Val Glu5652104211566
212PRT213沙眼衣原體4004Met Gly Leu Ser Arg Leu Ala Phe Ile Ser Phe Leu Ser Phe Thr Leu1 5 10 15Ser Ala Ser Cys Asp Phe Pro Ser Ser Val Ser Gln Arg Ile Leu Phe20 25 30Ser Cys Arg Lys Ser Val Pro Gln Ala Leu Glu Ala Tyr Leu Glu Ala35 40 45Ser Ala Thr Tyr Gln Gln His Asp Phe Ser Val Leu Arg Val Ile Ala50 55 60Glu Ser Tyr Leu Gln Gln Ser Phe Leu Ser Glu Asp Thr Tyr Ile Arg65 70 75 80Lys Ser Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Ala Leu85 90 95Glu Leu Leu Ser Glu Ala Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu100 105 110Leu Ile Leu Asn Ala Ala Thr Ser Gln Leu Ser Lys Thr Ser Asp Lys115 120 125Leu Leu Phe Lys Gly Leu Thr Ala Ser His Pro Val Ile Arg Leu Glu130 135 140Ala Ala Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr145 150 155 160
Leu Tyr Ser Phe Ile Tyr Lys Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala165 170 175Ala Thr Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Ile180 185 190His His Leu Leu Ser Ser Pro Asn Asn Leu Thr Arg Asn Tyr Val Ala195 200 205Tyr Leu Ile Gly Glu Tyr Lys Gln Lys Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg210 215 220Ser Leu Leu Thr Ser Ala Ser Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ala Leu Tyr225 230 235 240Ala Leu Gly Lys Leu Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Pro Arg Ile Lys Ala245 250 255Leu Ser Ser Arg Ser Asn Pro Glu Val Val Leu Ala Ala Ala Gln Thr260 265 270Leu Leu Phe Leu Glu Lys Glu Glu Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Asn275 280 285Leu Cys Gln Gln Lys Leu Leu Arg Ala Leu Tyr Thr Ala Arg Phe Leu290 295 300Ser Gln Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Tyr Asn Ala305 310 315 320Thr Gln Glu Glu Ile Arg Leu Asn Thr Ala Leu Ala Leu Val His Gln325 330 335
Gly Cys Thr Asp Pro Gln Val Leu His Tyr Leu Thr Glu Ile Leu Glu340 345 350Ser Lys Val Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Thr Gly Lys355 360 365Ala Ile Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Thr Phe Pro Leu Met Ser Gln370 375 380Glu Asp Lys Met Arg Thr Leu Ala Met Tyr Arg Val Ala Glu Asp Thr385 390 395 400Ile Leu Ser Ala Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asp Ala Tyr Leu Pro Tyr405 410 415Leu Glu Arg Ile Leu Ala Ser Gln Lys Thr Ile Leu Ala Ala Lys Ala420 425 430Ile Ala Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val435 440 445Ser Lys Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala450 455 460Asn Leu Ala Leu Tyr Thr Met Thr Lys Asp Pro Glu Lys Lys Ala Val465 470 475 480Leu Tyr Arg Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Glu Asp Thr Ile Leu Phe Thr485 490 495Asp Ala Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr500 505 510
Gln Val Ser Pro Glu Thr Arg Thr Gln Leu Met Leu Ala Ile Leu Glu515 520 525Thr Leu Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser530 535 540Leu Met Lys Lys Thr His Tyr Lys Asn Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu545 550 555 560Leu Met Arg Ile Val Glu56521052111695212DNA213鼠衣原體220
221CDS222(1)..(1695)4005atg tgc gac ttc ccc ccc agt gtt tcc cag aag ata tta ttc ttg tgt 48Met Cys Asp Phe Pro Pro Ser Val Ser Gln Lys Ile Leu Phe Leu Cys1 5 10 15caa aaa tct att cct caa gct ctg gag tcc tat ctt gag gca tct aca 96Gln Lys Ser Ile Pro Gln Ala Leu Glu Ser Tyr Leu Glu Ala Ser Thr20 25 30acc tat caa caa cat aac ttt tct ata ttg cgc tta ata gct aag tca144Thr Tyr Gln Gln His Asn Phe Ser Ile Leu Arg Leu Ile Ala Lys Ser35 40 45tac tta caa caa agt ctc ttt tct gaa gat gct tac gta cgc aaa agc192Tyr Leu Gln Gln Ser Leu Phe Ser Glu Asp Ala Tyr Val Arg Lys Ser50 55 60
gca att att gga gcg ggg ctt tct ggc tca tct gag act cta gat cta240Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Thr Leu Asp Leu65 70 75 80ctg tct gaa tcc ata gaa aca cag gat ctt tat gag cag cta ctt att288Leu Ser Glu Ser Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Ile85 90 95tta aat gct gca ggc aat caa tta ggc aaa act tcc gat cgt ctt tta336Leu Asn Ala Ala Gly Asn Gln Leu Gly Lys Thr Ser Asp Arg Leu Leu100 105 110ttc aaa gga tta aca gca cct cat cct att att cgc ttg gaa gct gct384Phe Lys Gly Leu Thr Ala Pro His Pro Ile Ile Arg Leu Glu Ala Ala115 120 125tac cgt ctg gcc tgt atg aaa aac agt aaa gta agt gac tac ctc tat432Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr Leu Tyr130 135 140tct ttt atc cac cag ctt cca gaa gaa atc caa aac tta gca gca acg480Ser Phe Ile His Gln Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala Ala Thr145 150 155 160att ttt ttg cag ctc gaa acg gaa gaa gca gat gct tat gtt cat aga528Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Val His Arg165 170 175ctc ctg tct tct cct aat agt cta aca aga aac tat atg gct tat cta576Leu Leu Ser Ser Pro Asn Ser Leu Thr Arg Asn Tyr Met Ala Tyr Leu180 185 190att gga gaa tat caa cag agg aga ttt ctt cca acg ctc cgc tcg ttg624Ile Gly Glu Tyr Gln Gln Arg Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg Ser Leu195 200 205ctt acc agc gca gct cct tta gac caa gaa gga tct ttg tat gct ata672Leu Thr Ser Ala Ala Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ser Leu Tyr Ala Ile210 215 220gga aaa tta gaa gat gcc agc agc tat cct aaa atc aaa gca tta agc720Gly Lys Leu Glu Asp Ala Ser Ser Tyr Pro Lys Ile Lys Ala Leu Ser225 230 235 240
tcc aaa tct aac cct gaa gtg gct ctt gct gct gct cag aca tta tta 768Ser Lys Ser Asn Pro Glu Val Ala Leu Ala Ala Ala Gln Thr Leu Leu245 250 255ttc ttg ggt aaa gaa gat gag gct ctt cct atc cta act act ttt tgc 816Phe Leu Gly Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Thr Phe Cys260 265 270cag caa gag ctt cct cga gct att tat acc tct cgt ttc ctt tca tta 864Gln Gln Glu Leu Pro Arg Ala Ile Tyr Thr Ser Arg Phe Leu Ser Leu275 280 285gaa aaa gga gaa gag ctt ctt tta ccc atc ttt tgt aaa gct att aaa 912Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Cys Lys Ala Ile Lys290 295 300gaa gaa att aaa ctg aat gct gct ttg gct ctt gtc cac ttg gga agc 960Glu Glu Ile Lys Leu Asn Ala Ala Leu Ala Leu Val His Leu Gly Ser305 310 315 320gtt aat cac cta gtg ctt agt tat tta aca gaa ttt tta gaa aat aaa1008Val Asn His Leu Val Leu Ser Tyr Leu Thr Glu Phe Leu Glu Asn Lys325 330 335att ctc cac cgc ata ttt tta ccc acc cat tcg ata gga aaa gcc acg1056Ile Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Ile Gly Lys Ala Thr340 345 350cag ttt tgg aaa gag tgt acg gca ctc cct ctt cta agc cca gaa gaa1104Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Ala Leu Pro Leu Leu Ser Pro Glu Glu355 360 365aaa gca aga gct ttg gca atg tat cgc gca gca gaa gat acg atc ctc1152Lys Ala Arg Ala Leu Ala Met Tyr Arg Ala Ala Glu Asp Thr Ile Leu370 375 380tct agt tta tta aaa tta cct aac aat gcc tat ctg cct tat ttg gaa1200Ser Ser Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asn Ala Tyr Leu Pro Tyr Leu Glu385 390 395 400cgt att cta act tca caa aaa acc cct cta gca gct aaa gct att gct1248Arg Ile Leu Thr Ser Gln Lys Thr Pro Leu Ala Ala Lys Ala Ile Ala405 410 415
ttt tta tca gta aca gct cat cct cag gca ctt tct tta gtc tcg aaa1296Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val Ser Lys420 425 430gca gca cta act cca gga gac cct atc att cgc gct tat gcg aat tta1344Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala Asn Leu435 440 445gct tta tat aca atg acg caa gat cct gaa aag aaa gcc tta tta tat1392Ala Leu Tyr Thr Met Thr Gln Asp Pro Glu Lys Lys Ala Leu Leu Tyr450 455 460caa tat gcc gaa cag tta ata gga gac acg att ttg ttt aca gat gag1440Gln Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Gly Asp Thr Ile Leu Phe Thr Asp Glu465 470 475 480gag aat ccc ctg cct tct ccc cat tct tcc tac ctg cga tat caa gtg1488Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro His Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Val485 490 495tcc cca gaa act cgt tct caa ctc atg cta act att tta gaa acc cta1536Ser Pro Glu Thr Arg Ser Gln Leu Met Leu Thr Ile Leu Glu Thr Leu500 505 510gtt tct tct aaa act gat gaa gac atc cga gtt ttt ctt tcg cta atg1584Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser Leu Met515 520 525aaa aaa acc cat tac aaa aat atc ccc atc tta tct gga tta tta atg1632Lys Lys Thr His Tyr Lys Asn Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu Leu Met530 535 540aga ata gtg gag cga gct cgg tac caa gct tac gta gaa caa aaa ctc1680Arg Ile Val Glu Arg Ala Arg Tyr Gln Ala Tyr Val Glu Gln Lys Leu545 550 555 560atc tca gaa gag gat1695Ile Ser Glu Glu Asp5652106211565212PRT
213鼠衣原體4006Met Cys Asp Phe Pro Pro Ser Val Ser Gln Lys Ile Leu Phe Leu Cys1 5 10 15Gln Lys Ser Ile Pro Gln Ala Leu Glu Ser Tyr Leu Glu Ala Ser Thr20 25 30Thr Tyr Gln Gln His Asn Phe Ser Ile Leu Arg Leu Ile Ala Lys Ser35 40 45Tyr Leu Gln Gln Ser Leu Phe Ser Glu Asp Ala Tyr Val Arg Lys Ser50 55 60Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Thr Leu Asp Leu65 70 75 80Leu Ser Glu Ser Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Ile85 90 95Leu Asn Ala Ala Gly Asn Gln Leu Gly Lys Thr Ser Asp Arg Leu Leu100 105 110Phe Lys Gly Leu Thr Ala Pro His Pro Ile Ile Arg Leu Glu Ala Ala115 120 125Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr Leu Tyr130 135 140Ser Phe Ile His Gln Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala Ala Thr145 150 155 160
Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Val His Arg165 170 175Leu Leu Ser Ser Pro Asn Ser Leu Thr Arg Asn Tyr Met Ala Tyr Leu180 185 190Ile Gly Glu Tyr Gln Gln Arg Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg Ser Leu195 200 205Leu Thr Ser Ala Ala Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ser Leu Tyr Ala Ile210 215 220Gly Lys Leu Glu Asp Ala Ser Ser Tyr Pro Lys Ile Lys Ala Leu Ser225 230 235 240Ser Lys Ser Asn Pro Glu Val Ala Leu Ala Ala Ala Gln Thr Lau Leu245 250 255Phe Leu Gly Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Thr Phe Cys260 265 270Gln Gln Glu Leu Pro Arg Ala Ile Tyr Thr Ser Arg Phe Leu Ser Leu275 280 285Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Cys Lys Ala Ile Lys290 295 300Glu Glu Ile Lys Leu Asn Ala Ala Leu Ala Leu Val His Leu Gly Ser305 310 315 320Val Asn His Leu Val Leu Ser Tyr Leu Thr Glu Phe Leu Glu Asn Lys325 330 335
Ile Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Ile Gly Lys Ala Thr340 345 350Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Ala Leu Pro Leu Leu Ser Pro Glu Glu355 360 365Lys Ala Arg Ala Leu Ala Met Tyr Arg Ala Ala Glu Asp Thr Ile Leu370 375 380Ser Ser Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asn Ala Tyr Leu Pro Tyr Leu Glu385 390 395 400Arg Ile Leu Thr Ser Gln Lys Thr Pro Leu Ala Ala Lys Ala Ile Ala405 410 415Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val Ser Lys420 425 430Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala Asn Leu435 440 445Ala Leu Tyr Thr Met Thr Gln Asp Pro Glu Lys Lys Ala Leu Leu Tyr450 455 460Gln Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Gly Asp Thr Ile Leu Phe Thr Asp Glu465 470 475 480Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro His Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Val485 490 495Ser Pro Glu Thr Arg Ser Gln Leu Met Leu Thr Ile Leu Glu Thr Leu500 505 510
Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser Leu Met515 520 525Lys Lys Thr His Tyr Lys Asn Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu Leu Met530 535 540Arg Ile Val Glu Arg Ala Arg Tyr Gln Ala Tyr Val Glu Gln Lys Leu545 550 555 560Ile Ser Glu Glu Asp56521072111644212DNA213沙眼衣原體220
221CDS222(1)..(1644)4007atg tgt gat ttt cct tcc tca gtt tct cag aga atc ttg ttt tct tgc 48Met Cys Asp Phe Pro Ser Ser Val Ser Gln Arg Ile Leu Phe Ser Cys1 5 10 15cga aaa tca gtc cct caa gct cta gaa gcc tat ctc gaa gct tca gca 96Arg Lys Ser Val Pro Gln Ala Leu Glu Ala Tyr Leu Glu Ala Ser Ala20 25 30act tat caa caa cac gat ttc tcc gta tta cgc gta ata gca gaa tcg144Thr Tyr Gln Gln His Asp Phe Ser Val Leu Arg Val Ile Ala Glu Ser35 40 45tat tta caa caa agc ttt ctc tct gag gac acc tac ata cgt aaa agt192Tyr Leu Gln Gln Ser Phe Leu Ser Glu Asp Thr Tyr Ile Arg Lys Ser50 55 60gca att att gga gca ggg cta tct ggt tca tca gaa gct tta gag tta240
Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Ala Leu Glu Leu65 70 75 80ctg tct gag gct ata gaa acg caa gat ctc tat gag caa cta ctc att288Leu Ser Glu Ala Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Ile85 90 95tta aat gct gca acc agc caa tta agc aaa act tct gac aaa ctt tta336Leu Asn Ala Ala Thr Ser Gln Leu Ser Lys Thr Ser Asp Lys Leu Leu100 105 110ttc aag gga tta aca gct tct cat cct gtc atc cgc tta gaa gct gct384Phe Lys Gly Leu Thr Ala Ser His Pro Val Ile Arg Leu Glu Ala Ala115 120 125tat cgt ctt gcc tgt atg aaa aat agc aag gta agt gat tac ctt tat432Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr Leu Tyr130 135 140tct ttt atc tac aag tta cca gaa gaa att caa aac cta gcg gca act480Ser Phe Ile Tyr Lys Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala Ala Thr145 150 155 160att ttc tta caa ctc gaa aca gaa gaa gct gat gct tat att cat cat528Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Ile His His165 170 175ttg ctc tct tct ccc aat aac ctg aca aga aac tat gtt gcc tat tta576Leu Leu Ser Ser Pro Asn Asn Leu Thr Arg Asn Tyr Val Ala Tyr Leu180 185 190att gga gag tac aaa caa aaa aga ttt ctt cca aca cta cgc tct tta624Ile Gly Glu Tyr Lys Gln Lys Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg Ser Leu195 200 205ctt aca agt gcc tct cct tta gat caa gaa ggc gct ttg tat gcg tta672Leu Thr Ser Ala Ser Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ala Leu Tyr Ala Leu210 215 220ggc aaa ctg gaa gac tct ggt agc tat cct aga att aaa gct cta agc720Gly Lys Leu Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Pro Arg Ile Lys Ala Leu Ser225 230 235 240tct aga tcc aat cct gaa gta gta ctc gct gca gct cag aca tta tta768
Ser Arg Ser Asn Pro Glu Val Val Leu Ala Ala Ala Gln Thr Leu Leu245 250 255ttc tta gag aaa gaa gaa gaa gct cta ccg atc cta acc aac ctt tgc 816Phe Leu Glu Lys Glu Glu Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Asn Leu Cys260 265 270caa caa aaa ctt ctt cga gcc ctg tat acc gca cgt ttc ctc tcg caa 864Gln Gln Lys Leu Leu Arg Ala Leu Tyr Thr Ala Arg Phe Leu Ser Gln275 280 285gag aag ggt gaa gag ctt ctt ctt cca atc ttt tat aac gca aca caa 912Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Tyr Asn Ala Thr Gln290 295 300gaa gaa att aga ctg aat act gct tta gca ctt gtt cat caa ggg tgt 960Glu Glu Ile Arg Leu Asn Thr Ala Leu Ala Leu Val His Gln Gly Cys305 310 315 320aca gat cct caa gtc ctc cac tat cta aca gaa atc tta gaa agt aaa1008Thr Asp Pro Gln Val Leu His Tyr Leu Thr Glu Ile Leu Glu Ser Lys325 330 335gtt ctc cat cgc ata ttt tta cct act cac tcg aca gga aaa gct ata1056Val Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Thr Gly Lys Ala Ile340 345 350cag ttc tgg aaa gaa tgc acc act ttt cct ctc atg agc caa gaa gac1104Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Thr Phe Pro Leu Met Ser Gln Glu Asp355 360 365aaa atg aga acg ttg gct atg tat cgg gta gcg gaa gat acc atc ctc1152Lys Met Arg Thr Leu Ala Met Tyr Arg Val Ala Glu Asp Thr Ile Leu370 375 380tca gcg tta cta aaa tta ccc aat gac gcc tat ctt cct tac cta gag1200Ser Ala Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asp Ala Tyr Leu Pro Tyr Leu Glu385 390 395 400cgc atc ctc gcc tca caa aaa act ata cta gca gct aaa gct att gct1248Arg Ile Leu Ala Ser Gln Lys Thr Ile Leu Ala Ala Lys Ala Ile Ala405 410 415ttt tta tcg gta aca gct cat cct cag gca ctt tct tta gtc tcg aaa1296
Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val Ser Lys420 425 430gct gca tta act cct gga gac cct atc att cgc gct tac gct aat cta1344Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala Ash Leu435 440 445gct tta tat aca atg acc aaa gat cct gag aaa aaa gct gtg cta tac1392Ala Leu Tyr Thr Met Thr Lys Asp Pro Glu Lys Lys Ala Val Leu Tyr450 455 460cga tat gct gaa caa tta ata gag gat acc att tta ttc aca gat gct1440Arg Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Glu Asp Thr Ile Leu Phe Thr Asp Ala465 470 475 480gaa aat ccg ctt ccc tct cca agc tct tct tat tta cgc tac caa gta1488Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Val485 490 495tcc cct gag acc cgc aca caa ctt atg cta gct att ttg gaa acc tta1536Ser Pro Glu Thr Arg Thr Gln Leu Met Leu Ala Ile Leu Glu Thr Leu500 505 510gtt tct tcc aaa acg gat gaa gat atc cgc gtt ttt ctt tcc cta atg1584Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser Leu Met515 520 525aaa aaa acc cat tac aaa aat atc ccg atc tta tca gga ttg tta atg1632Lys Lys Thr His Tyr Lys Ash Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu Leu Met530 535 540aga ata gtg gag1644Arg Ile Val Glu5452108211548212PRT213沙眼衣原體4008Met Cys Asp Phe Pro Ser Ser Val Ser Gln Arg Ile Leu Phe Ser Cys
1 5 10 15Arg Lys Ser Val Pro Gln Ala Leu Glu Ala Tyr Leu Glu Ala Ser Ala20 25 30Thr Tyr Gln Gln His Asp Phe Ser Val Leu Arg Val Ile Ala Glu Ser35 40 45Tyr Leu Gln Gln Ser Phe Leu Ser Glu Asp Thr Tyr Ile Arg Lys Ser50 55 60Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ser Glu Ala Leu Glu Leu65 70 75 80Leu Ser Glu Ala Ile Glu Thr Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Ile85 90 95Leu Asn Ala Ala Thr Ser Gln Leu Ser Lys Thr Ser Asp Lys Leu Leu100 105 110Phe Lys Gly Leu Thr Ala Ser His Pro Val Ile Arg Leu Glu Ala Ala115 120 125Tyr Arg Leu Ala Cys Met Lys Asn Ser Lys Val Ser Asp Tyr Leu Tyr130 135 140Ser Phe Ile Tyr Lys Leu Pro Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ala Ala Thr145 150 155 160Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Glu Ala Asp Ala Tyr Ile His His165 170 175Leu Leu Ser Ser Pro Asn Asn Leu Thr Arg Asn Tyr Val Ala Tyr Leu
180 185 190Ile Gly Glu Tyr Lys Gln Lys Arg Phe Leu Pro Thr Leu Arg Ser Leu195 200 205Leu Thr Ser Ala Ser Pro Leu Asp Gln Glu Gly Ala Leu Tyr Ala Leu210 215 220Gly Lys Leu Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Pro Arg Ile Lys Ala Leu Ser225 230 235 240Ser Arg Ser Asn Pro Glu Val Val Leu Ala Ala Ala Gln Thr Leu Leu245 250 255Phe Leu Glu Lys Glu Glu Glu Ala Leu Pro Ile Leu Thr Asn Leu Cys260 265 270Gln Gln Lys Leu Leu Arg Ala Leu Tyr Thr Ala Arg Phe Leu Ser Gln275 280 285Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Leu Pro Ile Phe Tyr Asn Ala Thr Gln290 295 300Glu Glu Ile Arg Leu Asn Thr Ala Leu Ala Leu Val His Gln Gly Cys305 310 315 320Thr Asp Pro Gln Val Leu His Tyr Leu Thr Glu Ile Leu Glu Ser Lys325 330 335Val Leu His Arg Ile Phe Leu Pro Thr His Ser Thr Gly Lys Ala Ile340 345 350Gln Phe Trp Lys Glu Cys Thr Thr Phe Pro Leu Met Ser Gln Glu Asp
355 360 365Lys Met Arg Thr Leu Ala Met Tyr Arg Val Ala Glu Asp Thr Ile Leu370 375 380Ser Ala Leu Leu Lys Leu Pro Asn Asp Ala Tyr Leu Pro Tyr Leu Glu385 390 395 400Arg Ile Leu Ala Ser Gln Lys Thr Ile Leu Ala Ala Lys Ala Ile Ala405 410 415Phe Leu Ser Val Thr Ala His Pro Gln Ala Leu Ser Leu Val Ser Lys420 425 430Ala Ala Leu Thr Pro Gly Asp Pro Ile Ile Arg Ala Tyr Ala Asn Leu435 440 445Ala Leu Tyr Thr Met Thr Lys Asp Pro Glu Lys Lys Ala Val Leu Tyr450 455 460Arg Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Glu Asp Thr Ile Leu Phe Thr Asp Ala465 470 475 480Glu Asn Pro Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Val485 490 495Ser Pro Glu Thr Arg Thr Gln Leu Met Leu Ala Ile Leu Glu Thr Leu500 505 510Val Ser Ser Lys Thr Asp Glu Asp Ile Arg Val Phe Leu Ser Leu Met515 520 525Lys Lys Thr His Tyr Lys Asn Ile Pro Ile Leu Ser Gly Leu Leu Met
530 535 540Arg Ile Val Glu545210921141212DNA213沙眼衣原體4009ataagaatgc ggccgccacc atgtgcgact tcccccccag t 412101021140212DNA213沙眼衣原體40010gttggtaccg agctcgctcc actattctca ttaataatcc 402101121141212DNA213沙眼衣原體40011ataagaatgc ggccgccacc atgtgcgact tcccccccag t 412101221140212DNA213沙眼衣原體40012gttggtaccg agctcgctcc actattctca ttaataatcc 4021013
21131212DNA213沙眼衣原體40013gaattcggat ccgatgggat tatctcgcct a312101421136212DNA213沙眼衣原體40014attaagaatg cggccgcttt atcactccac tattct 361030
權利要求
1.經分離並純化的核酸分子，其包括編碼選自下列任何一種多肽的核酸序列(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來自(a)到(d)多肽的至少12個連續胺基酸的免疫原性片段；和(f)通過保守性胺基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽，其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)、(b)、(c)或(d)多肽在胺基酸序列上至少75％相同。
2.經分離並純化的核酸分子，其包括選自下列任何一種的核酸序列(a)SEQ ID No1；(b)SEQ ID No3；(c)SEQ ID No5；(d)SEQ ID No7；(e)包含來自(a)到(d)任何一種核酸序列中的至少38個連續核苷酸的序列；和(f)編碼通過保守胺基酸取代修飾而不喪失免疫原性，並且其與SEQ ID No1、3、5或7所編碼的多肽在胺基酸序列上至少75％相同的多肽的序列。
3.經分離並純化的核酸分子，其包括與權利要求1核酸分子中的任何一種互補的核酸序列。
4.核酸分子，其包括編碼融合蛋白的核酸序列，所述的融合蛋白包括根據權利要求1的核酸分子所編碼的多肽以及另外的多肽。
5.權利要求4的核酸分子，其中所述另外的多肽是異源信號肽。
6.權利要求4的核酸分子，其中所述另外的多肽具有佐劑活性。
7.根據權利要求1到6中任何一項的核酸分子，其與一個或多個表達控制序列有效地連接。
8.一種包括載體的疫苗，其中所述載體包含編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來自(a)到(d)中任何一項多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段；和(f)通過保守性胺基酸取代修飾的(a)到(e)中任何一種的多肽；其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)到(e)中任何一種的多肽在胺基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用於使多肽在哺乳動物或細菌細胞中表達的一種或多種控制序列有效地連接；其中疫苗提供抗衣原體所致疾病的保護性免疫反應。
9.權利要求8的疫苗，其中疫苗可任選地包括編碼另外多肽的額外核酸，其可提高對選自(a)到(f)中任何一種多肽的免疫反應。
10.一種藥物組合物，其包括適於在疫苗中使用的藥學上可接受的載體或稀釋劑，以及編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來自(a)到(d)中任何一項多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段；和(f)通過保守性胺基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)到(e)中任何一種的多肽；其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)到(e)中任何一種的多肽在胺基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用於使多肽在哺乳動物細胞中表達的一種或多種控制序列有效地連接。
11.權利要求10的藥物組合物，其包括適於在疫苗中使用的藥學上可接受的載體或稀釋劑，以及編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)包含來自(a)到(d)多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段。
12.權利要求10的藥物組合物，其包括適於在疫苗中使用的藥學上可接受的載體或稀釋劑，以及編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)通過保守性胺基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)到(d)中任何一種的多肽，其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)或(d)中任何一種的多肽在胺基酸序列上至少90％相同。
13.權利要求8的包括疫苗載體的疫苗，其中疫苗載體包括編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；和(d)SEQ ID No8。
14.權利要求8的包括疫苗載體的疫苗，其中疫苗載體包括編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)包含來自(a)到(d)多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段。
15.權利要求8的包括疫苗載體的疫苗，其中疫苗載體包括編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)通過保守性胺基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)到(d)中任何一種的多肽，其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)到(d)中任何一種的多肽在胺基酸序列上至少90％相同。
16.預防或治療衣原體感染的方法，其包括施用有效量的核酸分子的步驟，所述核酸分子編碼選自下列任何一種的多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來自(a)到(d)多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段；和(f)通過保守性胺基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)到(e)中任何一種的多肽，其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)到(e)中任何一種的多肽在胺基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用於多肽表達的一種或多種控制序列有效地連接。
17.權利要求16的用於預防或治療衣原體感染的方法，其包括施用有效量的核酸分子的步驟，所述核酸分子編碼選自下列任何一種多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；和(d)SEQ ID No8。
18.權利要求17的用於預防或治療衣原體感染的方法，其包括施用有效量的核酸分子的步驟，所述核酸分子編碼選自下列任何一種多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)包含來自(a)到(d)多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段。
19.權利要求17的用於預防或治療衣原體感染的方法，其包括施用有效量的核酸分子的步驟，所述核酸分子編碼選自下列任何一種多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)通過保守性胺基酸取代修飾的(a)到(d)中任何一種的多肽，其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)或(d)中任何一種的多肽在胺基酸序列上至少90％相同。
20.用權利要求7的核酸分子轉化的單細胞宿主。
21.5到100個核苷酸的核酸探針，其在嚴緊條件下與SEQ IDNo1、3、5或7的核酸分子，或者其同系物或互補序列或反義序列雜交。
22.10到40個核苷酸的引物，其在嚴緊條件下與SEQ ID No1或3的核酸分子，或者其同系物或互補序列或反義序列雜交。
23.由權利要求1、2和4到7中任何一項的核酸序列所編碼的多肽。
24.生產權利要求7多肽的方法，其包括培養根據權利要求21的單細胞宿主的步驟。
25.抗權利要求24中任何一種多肽的抗體。
26.一種疫苗，其包括至少一種根據權利要求1、4到7中任何一項的第一多肽，以及藥學上可接受的載體，任選地包括提高對第一多肽的免疫反應的第二多肽。
27.權利要求27的疫苗，其中第二多肽包括另外的衣原體多肽。
28.一種藥物組合物，其包括根據權利要求1、4到7中任何一項的多肽以及藥學上可接受的載體。
29.一種藥物組合物，其包括根據權利要求27或28的疫苗以及藥學上可接受的載體。
30.從衣原體菌株中分離的多核苷酸，選自(a)包括SEQ ID NO1的核苷酸序列的多核苷酸；(b)包括SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包括SEQ ID NO5所示的核苷酸序列的多核苷酸；(d)包括SEQ ID NO7的核苷酸序列的多核苷酸；(e)與SEQ ID NO1、3、5或7的核苷酸序列至少95％同源的多核苷酸；和(f)在42℃，含有50％甲醯胺的6xSSC的嚴緊條件下，與包括SEQ ID NO1、3、5或7所示的核苷酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸；其中向哺乳動物施用免疫原性有效量的所述分離的多核苷酸，在所述哺乳動物中誘導抗所述衣原體菌株感染的免疫反應。
31.經分離並純化的多肽分子，其包括選自下列任何一種的多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來自(a)到(d)多肽的至少12個連續胺基酸的免疫原性片段；和(f)通過保守性胺基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽；其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽在胺基酸序列上至少75％相同。
32.權利要求31的多肽分子，進一步包括異源信號肽。
33.一種疫苗，其包括選自下列任何一種的多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來自(a)到(d)中任何一種多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段；和(f)通過保守性胺基酸取代修飾的(a)到(e)中任何一種的多肽，其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)到(e)中任何一種的多肽在胺基酸序列上至少90％相同；其中核酸分子與用於使多肽在哺乳動物或細菌細胞中表達的一種或多種控制序列有效地連接，其中疫苗提供抗衣原體所致疾病的保護性免疫反應。
34.一種藥物組合物，其包括適於在疫苗中使用的藥學上可接受的載體或稀釋劑，以及選自下列任何一種的多肽(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來自(a)到(d)多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段；和；(f)通過保守性胺基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)到(e)中任何一種的多肽；其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)到(e)中任何一種的多肽在胺基酸序列上至少90％相同。
35.權利要求33的疫苗，進一步包括佐劑。
36.權利要求35的疫苗，其中所述佐劑是ISCOM佐劑。
37.權利要求34的藥物組合物，其包括適於在疫苗中使用的藥學上可接受的載體或稀釋劑，以及編碼選自下列任何一種多肽的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；和(e)包含來自(a)到(d)多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段。
38.一種預防或治療衣原體感染的方法，其包括施用有效量的選自下列任何一種多肽的步驟(a)SEQ ID No2；(b)SEQ ID No4；(c)SEQ ID No6；(d)SEQ ID No8；(e)包含來自(a)到(d)多肽的至少100個連續胺基酸的免疫原性片段；和；(f)通過保守性胺基酸取代修飾而不喪失免疫原性的(a)到(e)中任何一種的多肽；其中所述經修飾的的多肽與對應的(a)到(e)中任何一種的多肽在胺基酸序列上至少90％相同。
全文摘要
本發明提供用於一種用核酸，其包括DNA，免疫宿主，包括人類抗由衣原體菌株，特別是沙眼衣原體感染所致疾病方法的核酸、蛋白質和載體。該方法使用含有編碼衣原體菌株Mgp002多肽的核苷酸序列的載體，該核苷酸序列與影響基因產物在宿主中表達的啟動子有效地連接。全長Mgp002基因的截短型是有用的免疫原，用於保護抗衣原體感染所致疾病。本發明進一步提供可用於保護抗由衣原體感染所致疾病的重組Mgp002蛋白。
文檔編號C12P21/02GK1906299SQ200480040817
公開日2007年1月31日 申請日期2004年11月19日 優先權日2003年11月21日
發明者R·C·布倫哈姆, A·勞多尼基尼, S·加利錢, A·穆爾丁 申請人:聖諾菲·帕斯圖爾有限公司