結合il-17a和il-17f的抗體分子的製作方法

2023-05-28 10:00:46

專利名稱：結合il-17a和il-17f的抗體分子的製作方法
結合IL-17A和IL-17F的抗體分子
本發明涉及對IL-17A和IL-17F的抗原決定簇具有特異性的抗體 分子。本發明還涉及該抗體分子的治療用途及其生產方法。
白介素17( IL-17)，也稱為CTLA-8或IL-17A，是促炎細胞因子， 其刺激各種非免疫細胞分泌各種各樣的其他細胞因子。IL-17A能夠誘 導粘附細胞，如成纖維細胞、角質細胞、上皮和內皮細胞分泌IL-6、 IL-8、 PGE2、 MCP-1和G-CSF，並且還能夠誘導ICAM-1表面表達、T 細胞增殖，以及在受照射的成纖維細胞存在下共同培養時，誘導CD34+ 人祖細胞的生長並分化成嗜中性白細胞(Fossiez等，1998， Int. Rev. Immunol 16， 541-551 )。 IL-17A主要由激活的記憶T細胞產生並通 過與遍在分布的細胞表面受體(IL-17R)結合而發揮作用 (Yao等， 1997， Cytokine, 9, 794-800 )。它也可以通過結合IL-17RA和IL-17RC 的複合物而發揮作用(Toy等，2006， J. Immunol. 177(11); 36-39 )。 稱為"TH17細胞"的產生IL-17的T細胞涉及某些癌症的發病機理 (Weaver等，2006， Immunity, 24， 677-688; Langowski等，2006， 442， 461-465; Iwakura和Ishigame， 2006， J.CI in.Invest. 116， 5， 1218-1222)。
已經鑑定了多種IL-17的同系物，其在調節炎症反應中具有相似 和不同的作用。對於IL-17細胞因子/受體家族的綜述，參見Dumont， 2003， Expert Opin. Ther. Patents, 13， 287-303。 一種這樣的同 系物是IL-17F，也稱為IL-24和ML-1，其與IL-17A大約55°/。相同， 並且被認為與IL-17A共享相同的受體(Kolls和Linden 2004, Immunity, 21, 467-476; Hymowitz等，2001, EMBO J, 20(19)， 5332-5341; Kuestner爭，2007， Journal of Immunology, 179， 5462-5473)。
IL-17A和IL-17F都可以形成同型二聚體和雜二聚體蛋白，其所有都由激活的人CD4+T細胞產生(Wright等，2007， J Biol Chem. 282 (18)， 13447-13455)。
IL-17可能促進很多由異常免疫反應介導的疾病，如類風溼性關 節炎和呼吸道炎症，以及器官移植排斥和抗腫瘤免疫。IL-17活性抑 製劑是本領域熟知的，例如小鼠IL-17R:人Fc融合蛋白、小鼠可溶性 IL-17R和抗IL-17單克隆抗體已經被用來證明IL-17在各種類風溼性 關節炎模型中的作用(Lubberts等，J. Immunol. 2001 , 167 ， 1004-1013; Chabaud等，Arthritis Res. 2001， 3， 168-177)。此 外，中和多克隆抗體已經被用來減少腹膜粘連的形成(Chung等， 2002， J. Exp. Med, ， 195， 1471-1478 ) 。 WO04/106377中描述了從 大鼠得到的抗人IL-17抗體。WO2006/054059中描述了親和力為大約 220pM的人源化抗IL-17抗體。W02006/013107中描述了親和力為大約 188pM的完全人抗IL-17單克隆抗體。WO2006/088833中描述了結合 IL-17F和IL-17A/IL-17F的抗體。額005/010044中描述了特異性結 合IL-17A/IL-17F雜二聚體的抗體。
IL-17F拮抗作用與對抗哞喘的保護作用相關(Kawaguchi等， 2006, J. Allergy Clin. Immunol. 117(4); 795-801 )，並且認為 IL-17F在關節炎病理學中也起著作用(Lubberts 2003， Current Opinion in Investigational Drugs, 4 (5)， 572-577)。
因此，IL-17A和IL-17F的雙重拮抗劑在治療IL-17介導的疾病 中比單獨的拮抗劑更有效。07年9月20日公開的W02007/106769中 描述了結合IL-17A和IL-17F的抗體。
我們已經能夠證明分離能夠結合IL-17A和IL-17F並且能夠中和 IL-17的兩個同種型的活性的抗體是可能的。因此，本發明提供了能 夠結合IL-17A和IL-17F的抗IL-17抗體。特別地，本發明的抗體能 夠特異性地結合IL-17A和IL-17F，即，該抗體不與IL-17的其他同 種型結合。優選地，本發明的抗體還結合IL-17A/IL-17F雜二聚體。 優選地，本發明的抗體中和IL-17A和IL-17F的活性。在一個實施方 案中，本發明的抗體還中和IL-17A/IL-17F雜二聚體的活性。因此，本發明的抗體具有可以抑制IL-17A和IL-17F的生物活性的有利特性。 因此，本發明還提供了這樣的抗體在治療和/或預防由IL-17A或 IL-17F任一種或兩種介導的疾病，如自體免疫或炎症疾病或癌症中的 用途。
如在此所用的，術語"中和抗體"描述了例如，通過阻斷IL-17A 和IL-17F結合一種或多種受體和通過阻斷IL-17A/IL-17F雜二聚體結 合一種或多種受體，能夠中和IL-17A和IL-17F的生物信號活性的抗 體。將認識到如在此所用的術語"中和"指的是可以部分或完全降低 生物信號活性。此外，將認識到通過抗體中和IL-17A和IL-17F的程 度可以相同或不同。在一個實施方案中，IL-17A/IL-17F雜二聚體活 性的中和程度與IL-17A或IL-17F活性的中和程度相同，可以相同或 不同。
在一個實施方案中，本發明的抗體特異性結合IL-17A和IL-17F。 特異性結合意思是抗體對IL-17A和IL-17F多肽(包括 IL-17A/IL-17F雜二聚體)的親和性比其他多肽高。優選，IL-17A和 IL-17F多肽是人。在一個實施方案中，抗體還結合獼猴IL-17F。
IL-17A或IL-17F多肽或表達一種或兩種所述多肽的兩種細胞混 合物可以用來產生特異性識別多肽的抗體。IL-17多肽(IL-17A和 IL-17F)可以是"成熟"多肽或其生物活性片段或衍生物，優選包括 受體結合位點。優選，IL-17多肽是成熟多肽。可以通過本領域公知 的方法從含有表達系統的遺傳工程宿主細胞來製備IL-17多肽或從天 然生物來源收集。在本發明的應用中，術語"多肽"包括肽、多肽和 蛋白。這些可以互換使用，除非另外指出。在一些情況中，IL-17多 肽可以是較大蛋白如融合蛋白的一部分，例如，與親和性標記物融合。 可以獲得對抗這些多肽產生的抗體，其中動物的免疫是必需的，通過 將多肽給予動物，優選非人動物，使用公知和常規的方案，參見，例 如，Handbook of Experimental Immunology (實驗免疫學手冊)， D. M. Weir (編輯)，Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986。可以將許多溫血動物，如兔子、小鼠、大鼠、綿羊、奶牛或豬免疫。然而，通常優選的是小鼠、兔子、豬和大鼠。
用於本發明的抗體包括完整的抗體及其功能性活性片段或衍生 物，可以是，但不限於，單克隆、多價、多特異性、人源化或嵌合抗
體，結構域抗體，例如，上述任一種的VH、 VL、 VHH、單鏈抗體、Fab 片段、Fab'和F(ab' )2片段和抗原決定部分結合片段。其他抗體片 段包括國際專利申請WO2005003169、 WO2005003170和WO2005003171 中描述的那些。抗體片段及其生產是本領域公知的，參見，例如，Verma 等,1998， Journal of Immunological Methods， 216， 165-181; Adair 和Lawson， 2005. Therapeutic antibodies. Wey/ei^s -
用於本發明中的抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免 疫活性部分，即，含有特異性結合抗原的抗原結合位點的分子。本發 明的免疫球蛋白分子可以是任何種類(例如，IgG、 IgE、 IgM、 IgD和 IgA)或亞類的免疫球蛋白分子。
可以通過本領域已知的任何方法製備單克隆抗體，如雜交瘤技術 (Kohler & Milstein， 1975， Nature, 256:495-497 )、三源雜交瘤 技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等，1983， Immunology Today, 4:72)和EBV雜交瘤技術(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體和癌症治療)，pp77-96, Alan R Liss， Inc. ， 1985 )。
用於本發明的抗體也可以使用單淋巴細胞抗體法來產生，通過由 例如Babcook， J. 等，1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (15): 7843-78481; ,2/02551; WO2004/051268和國際專利申請號 W0 20(H/106377描述的方法克隆和表達由選擇用於生產特異性抗體的 單淋巴細胞產生的免疫球蛋白可變結構域cDNA。
人源化抗體是具有一個或多個來自非人物種的互補決定區(CDR ) 和來自人免疫球蛋白分子的框架區的抗體分子(參見，例如 US5，585，089;窗1/09967 )。
嵌合抗體是已經基因工程化的免疫球蛋白基因編碼的那些抗體，使得輕鏈和重鏈基因由屬於不同物種的免疫球蛋白基因片段組成。這 些嵌合抗體很可能抗原性較低。可以通過本領域已知的方法製得二價
抗體(Milstein等，1983 ， Nature 305:537-539; W0 93/08829 , Traunecker等，1991， EMBO J. 10:3655-3659 )。多價抗體可以包括 多特異性或可以是單特異性的(參見，例如，W092/22853和 WO05/113605)。
用於本發明的抗體還可以使用本領域已知的各種噬菌體展示法生 產，並包括Brinkman等(在J. Immunol. Methods, 1995， 182: 41-50) 、 Ames等(J. Immunol. Methods, 1995， 184:177-186)、 Kettlebo面gh等(Eur. J. Immunol. 1994， 24:952-958 ) 、 Persic 等(Gene, 1997 1879-18) 、 Burton等(Advances in Immunology, 1994， 57: 191-280 )和WO90/02809; ,1/10737; W0 92/01047; W0 92/18619; W0 93/11236; W0 95/15982; W0 95/20401和US 5， 698， 426; 5,223,409; 5, 403, 484; 5,580,717 ; 5, 427, 908; 5, 750,753 ; 5,821, 047; 5,571,698 ; 5， 427， 908; 5,516,637; 5, 780,225; 5,658,727; 5,733, 743和5,969, 108中公開的方法。用於生產單鏈 抗體的技術，如US4， 946，778中所述的那些也適用於產生結合IL-17A 和IL-17F的單鏈抗體。此外，轉基因小鼠，或其他生物體，包括其他 哺乳動物，可以用於表達人源化抗體。
抗體可變結構域中的殘基通常根據Kabat等設計的系統來編號。 這個系統在Kabat 等，1987 ， 在Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫學關注的蛋白的序歹'J ) ， US Department of Health and Human Services, NIH， USA (以下稱作"Kabat等 (上文)")中列出。本說明書中使用這個編號系統，除非另外指出。
Kabat殘基命名並不總是直接對應於胺基酸殘基的線性編號。實 際的線性胺基酸序列可能含有比嚴格的Kabat編號更少或增加的氨基 酸，嚴格的Kabat編號對應於基礎可變結構域結構的結構組分，無論 是框架區還是互補決定區(CDR)的縮短或插入。對於給定的抗體，殘 基的正確Kabat編號可以通過抗體序列與"標準"Kabat編號序列的
10同源性殘基比對來確定。
根據Kabat編號系統，重鏈可變結構域的CDR位於殘基31-35 (CDR-H1)、殘基50-65 (CDR-H2)和殘基95-102 (CDR-H3)。然而， 根據Chothia( Chothia， C.和Lesk， A. M. J. Mol. Biol. ， 196, 901-917 (1987 ))，相當於CDR-H1的環從殘基26延伸至殘基32。因此，按 照Kabat編號系統和Chothia的拓樸環定義聯合所述，如在此所用的 'CDR-Hl，包括殘基26至35。
根據Kabat編號系統，輕鏈可變結構域的CDR位於殘基24-34 (CDR-L1)、殘基50-56 ( CDR-L2 )和殘基89-97 (CDR-L3)。
在本發明的一個實施方案中，提供了對人IL-17A和人IL-17F具 有特異性的中和抗體，其包含重鏈，其中重鏈可變結構域包含至少一 個如下的CDR:具有SEQ ID N0: 1給出的CDR-H1序列的CDR，具有SEQ ID NO: 2給出的CDR-H2序列的CDR和具有SEQ ID NO: 3給出的CDR-H3 序列的CDR。
在本發明的另一個實施方案中，提供了對人IL-17A和人IL-17F 具有特異性的中和抗體，其包含重鏈，其中重鏈可變結構域的CDR-Hl、 CDR-H2和CDR-H3中的至少兩個選自下列序列SEQ ID NO: 1給出的 CDR-H1序列，SEQ ID NO: 2給出的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 3給出 的CDR-H3序列。例如，該抗體可以包含重鏈，其中CDR-Hl具有SEQ ID NO: 1給出的序列而CDR-H2具有SEQ ID N0:2給出的序列。或者，該 抗體可以包含重鏈，其中CDR-Hl具有SEQ ID NO: 1給出的序列而 CDR-H3具有SEQ IDN0:3給出的序列，或該抗體可以包含重鏈，其中 CDR-H2具有SEQ ID NO: 2給出的序列而CDR-H3具有SEQ ID NO: 3給 出的序列。為避免疑惑，應理解包括全部排列。
在本發明的另一個實施方案中，提供了對人IL-17A和IL-17F具 有特異性的中和抗體，其包含重鏈，其中重鏈可變結構域包含SEQ ID NO: 1給出的CDR-Hl序列，SEQ ID NO: 2給出的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 3給出的CDR-H3序列。
在本發明的一個實施方案中，提供了對人IL-17A和IL-17F具有特異性的中和抗體，其包含輕鏈，其中輕鏈可變結構域包含至少一個
如下的CDR:具有SEQ ID NO: 4給出的CDR-L1序列的CDR，具有SEQ ID NO: 5給出的CDR-L2序列的CDR和具有SEQ ID NO: 6給出的CDR-L3序 列的CDR。
在本發明的另一個實施方案中，提供了對人IL-17A和IL-17F具 有特異性的中和抗體，其包含輕鏈，其中輕鏈可變結構域的CDR-L1、 CDR-L2和CDR-U中的至少兩個選自下列序列SEQ ID NO: 4給出的 CDR-L1序列，SEQ ID NO: 5給出的CDR-L2序列和SEQ ID NO: 6給出 的CDR-L3序列。例如，該抗體可以包含輕鏈，其中CDR-L1具有SEQ ID NO: 4給出的序列而CDR-L2具有SEQ ID N0:5給出的序列。或者，該 抗體可以包含輕鏈，其中CDR-L1具有SEQ ID NO: 4給出的序列而 CDR-L3具有SEQ IDN0:6給出的序列，或該抗體可以包含輕鏈，其中 CDR-L2具有SEQ ID NO: 5給出的序列而CDR-L3具有SEQ ID NO: 6給 出的序列。為避免疑惑，應理解包括全部排列。
在本發明的另一個實施方案中，提供了對人IL-17A和IL-17F具 有特異性的中和抗體，其包含輕鏈，其中可變結構域包含SEQ IDN0:4 給出的CDR-L1序列，SEQ ID N0:5給出的CDR-L2序列和SEQ ID NO: 6 給出的CDR-L3序列。
本發明的抗體分子優選分別包含互補輕鏈或互補重鏈。
因此，在一個實施方案中，根據本發明的抗體包含重鏈和輕鏈， 其中重鏈可變結構域包含SEQ IDNO: 1給出的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 2 給出的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 3給出的CDR-H3序列，其士輕々*-^* 變結構域包含SEQ ID NO: 4給出的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5給出的 CDR-L2序列和SEQ ID NO: 6給出的CDR-L3序列。
應認識到可以對本發明提供的CDR進行一個或多個胺基酸置換， 而不顯著改變抗體結合IL-17A和IL-17F以及中和IL-17A和IL-17F 活性的能力。本領域技術人員可以容易地測試任何胺基酸置換對結合 和中和的影響，例如通過使用在此所述的方法。因此，本發明提供了 包含一個或多個選自以下的CDR的抗體CDRH-1 (SEQ ID NO: 1 )、CDRH-2 (SEQ ID NO. 2 ) 、 CDRH-3 (SEQ ID NO: 3 ) 、 CDRL-1 (SEQ ID NO: 4) 、 CDRL-2 (SEQ ID NO: 5 )和CDRL-3 (SEQ ID NO: 6 )，其中 一個或多個CDR中的一個或多個胺基酸已被另一個胺基酸置換。還應 認識到可以改變一個或多個CDR的長度，而不顯著改變抗體結合 IL-17A和IL-17F以及中和IL-17A和IL-17F活性的能力。
在一個實施方案中，本發明的抗體包含重鏈，其中重鏈可變結構 域包含三個CDR，其中CDRH-1的序列與SEQ ID NO: 1給出的序列具有 至少60%的同一性或相似性，CDRH-2與SEQ ID N0:2給出的序列具有 至少60%的同一性或相似性和/或CDRH-3與SEQ ID NO: 3給出的序列 具有至少60%的同一性或相似性。在另一個實施方案中，本發明的抗 體包含重鏈，其中重鏈可變結構域包含三個CDR，其中CDRH-1的序列 與SEQ ID NO: 1給出的序列具有至少70%、 80%、 90%、 95%或98%的同 一性或相似性，CDRH-2與SEQ ID NO: 2給出的序列具有至少70%、 80%、 90%、 95%或98%的同一性或相似性和/或CDRH-3與SEQ ID NO: 3給出 的序列具有至少70%、 80%、 90%、 95%或98%的同一性或相似性。
如在此所用的"同一性"表示比對序列中任何特定位置的胺基酸 殘基在這些序列之間是相同的。如在此所用的"相似性"表示比對序 列中任何特定位置的胺基酸殘基在這些序列之間是相似類型的。例如， 亮氨酸可以取代異亮氨酸或纈氨酸。常常可以彼此取代的其他胺基酸 包括但不限於
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香側鏈的胺基酸)； 一賴氨酸、精氨酸和組氨酸(具有鹼性側鏈的胺基酸)； 一天冬氨酸和穀氨酸(具有酸性側鏈的胺基酸)； -天冬醯胺和穀氨醯胺(具有醯胺側鏈的胺基酸)；和 -半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫側鏈的胺基酸)。 可以容易地計算同 一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology (計算分子生物學)，Lesk， A.M.編輯，Oxford University Press, New York, 1988; Biocomput ing. Informatics and Genome Projects (生物計算信息學和基因組計劃)，Smith, D. W.編輯，Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data (序列數據的計算機分析)，Part 1, Griffin, A. M. 和Griffin, H. G.編輯，Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology (分子生物學中的序歹寸分才斤)，von Heinje， G. ， Academic Press, 1987; 和Sequence Analysis Primer (序歹寸分才斤引物)，Gribskov， M.和Devereux， J.編輯，M Stockton Press, New York, 1991)。
在另一個實施方案中，本發明的抗體包含輕鏈，其中輕鏈可變結 構域包含三個CDR，其中CDRL-1的序列與SEQ ID NO: 4給出的序列具 有至少60%的同一性或相似性，CDRL-2與SEQ ID N0:5給出的序列具 有至少60%的同一性或相似性和/或CDRL-3與SEQ ID NO: 6給出的序 列具有至少60°/。的同一性或相似性。在另一個實施方案中，本發明的 抗體包含輕鏈，其中輕鏈可變結構域包含三個CDR，其中CDRL-1的序 列與SEQ ID NO: 4給出的序列具有至少70°/。、 80%、 90%、 95%或98%的 同一性或相似性，CDRL-2與SEQ ID NO: 5給出的序列具有至少70%、 80%、 90°/。、 95%或98%的同一性或相似性和/或CDRL-3與SEQ ID NO: 6 給出的序列具有至少70%、 80%、 90%、 95%或98%的同一性或相似性。 在一個實施方案中，本發明提供的抗體是單克隆抗體。 在一個實施方案中，本發明提供的抗體是嵌合抗體。 在一個實施方案中，本發明提供的抗體是CDR移植抗體分子，包 含SEQ ID NOS : 1至6提供的一個或多個CDR。如在此所用的，術語 "CDR移植抗體分子"是指其中重鏈和/或輕鏈含有移植入受體抗體 (例如人抗體)的重鏈和/或輕鏈可變結構域框架的來自供體抗體(例 如鼠單克隆抗體)的一個或多個CDR (如果期望，包括一個或多個修 飾的CDR)的抗體分子。對於綜述，參見Vaughan等，Nature Biotechnology, 1^， 535-539， 1998。在一個實施方案中，不是轉移 整個CDR，只有以上描述的任何一個CDR的一個或多個特異性決定殘 基被轉入人抗體框架中(參見，例如Kashmiri等，2005， Methods, 36， 25-34 )。在一個實施方案中，只有以上描述的一個或多個CDR的特異性決定殘基被轉入人抗體框架中。在另一實施方案中，只有以
上描述的每一個CDR的特異性決定殘基被轉入人抗體框架中。
當移植CDR或特異性決定殘基時，考慮產生CDR的供體抗體的類 另iJ/類型後，可以使用任何適當的受體可變結構域框架序列，包括小鼠、 靈長類動物和人框架區。優選，根據本發明的CDR移植抗體具有包含 人受體框架區以及一個或多個如上所述的CDR或特異性決定殘基的可 變結構域。因此， 一個實施方案中，提供了中和CDR移植抗體，其中 可變結構域包含人受體框架區和非人供體CDR。
可用於本發明中的人框架區實例是KOL、 NEWM、 REI、 EU、 TUR、 TEI、 LAY和POM(Kabat等，上文)。例如，KOL和NEWM可用於重鏈， REI可用於輕鏈，而EU、 LAY和POM同時可用於重鏈和輕鏈。或者， 可以Y吏用人種系序列；這些可以從http: 〃vbase， mrc-cpe. ac. uk/獲 得。
在本發明的CDR移植抗體中，受體重鏈和輕鏈不必需來源於相同 抗體，如果期望，可以包含具有來源於不同鏈的框架區的複合鏈。
對於本發明CDR移植抗體的重鏈，優選的框架區來源於人亞組 VH3序列1-3 3-07連同JH4。因此，提供了包含至少一個非人供體CDR 的中和CDR移植抗體，其中重鏈框架區來源於人亞組序列1-3 3-07 連同JH4。人JH4的序列如下:(YFDY)WGQGTLVTVSS。YFDY基序是CDR-H3 的一部分，而不是框架4的一部分(Ravetch， JV.等，1981， Cell, 27， 583-591 )。
對於本發明CDR移植抗體的輕鏈，優選的框架區來源於人種系亞 組VK1序列2-1-(1) L4連同JK1。因此，提供了包含至少一個非人供 體CDR的中和CDR移植抗體，其中輕鏈框架區來源於人亞組序列VK1 2-1-(1) L4連同JK1。 JK1序列如下:(WT) FGQGTKVEIK。 WT基序是 CDR-L3的一部分，而不是框架4的一部分(Hieter， PA.，等，1982， J. Biol. Chem. ， 257， 1516-1522 )。
同樣，在本發明的CDR移植抗體中，框架區也不需要與受體抗體 具有完全相同的序列。例如，可以將不常見的殘基轉變為對於受體鏈類別或類型來說更常見的殘基。或者，可以改變受體框架區中所選擇 的殘基，使得它們對應於供體抗體中相同位置發現的殘基(參見，
Reichmann等，1998， Nature, 332， 323-324 )。這種改變應該保持 在恢復供體抗體親和性所必需的最低限度。W0 91/09967中列出了選 擇可能需要改變的受體框架區中殘基的方案。
優選，在本發明的CDR移植抗體分子中，如杲受體重鏈具有人VH3 序列1-3 3-07連同JH4，那麼除了一個或多個供體CDR外，重鏈的受 體框架區至少在第94位包含供體殘基(根據Kabat等，(上文))。 因此，提供了 CDR移植抗體，其中至少重鏈可變結構域第94位的殘基 是供體殘基。
優選，在根據本發明的CDR移植抗體分子中，如果受體輕鏈具有 人亞組VK1序列2-1-(1) L4連同JK1,那麼不轉移供體殘基，即僅轉 移CDR。因此，提供了CDR移植抗體，其中僅僅將CDR轉入供體框架中。
供體殘基是來自供體抗體的殘基，即，最初產生CDR的抗體。 在一個實施方案中，本發明的抗體包含重鏈，其中重鏈可變結構 域包含SEQ ID N0:9給出的序列(gH9 )。
在另一個實施方案中，本發明的抗體包含重鏈，其中重鏈可變結 構域包含與SEQ ID NO: 9給出的序列具有至少60%同一性或相似性的 序列。在一個實施方案中，本發明的抗體包含重鏈，其中重鏈可變結 構域包含與SEQ ID NO: 9給出的序列具有至少70%, 80%, 90%， 95%或 9 8 %同 一 性或相似性的序列。
在一個實施方案中，本發明的抗體包含輕鏈，其中輕鏈可變結構 域包含SEQ ID N0:7給出的序列(gL7 )。
在另一個實施方案中，本發明的抗體包含輕鏈，其中輕鏈可變結 構域包含與SEQ ID NO: 7給出的序列具有至少60%同一性或相似性的 序列。在一個實施方案中，本發明的抗體包含輕鏈，其中輕鏈可變結 構域包含與SEQ ID N0: 7給出的序列具有至少70%， 80°/。， 90%， 95%或 9 8 %同 一 性或相似性的序列。
16在一個實施方案中，本發明的抗體包舍重鏈和輕鏈，其中重鏈可
變結構域包含SEQ ID NO : 9給出的序列，其中輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO: 7給出的序列。
在本發明的另一個實施方案中，抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈 可變結構域包含與SEQ ID NO: 9給出的序列具有至少60%同一性或相 似性的序列，而輕鏈可變結構域包含與SEQ ID N0:7給出的序列具有 至少60°/。同一性或相似性的序列。優選，該抗體包含重鏈和輕鏈，其 中重鏈可變結構域包含與SEQ ID NO: 9給出的序列具有至少70°/。， 80%, 90%， 95%或98%同一性或相似性的序列，其中輕鏈可變結構域包含與 SEQ ID NO: 7給出的序列具有至少70%， 80%, 90%, 95%或98%同一性 或相似性的序列。
如上所述，本發明的抗體分子可以包含具有全長重鏈和輕鏈的完 整抗體分子或其片段，如結構域抗體，例如，VH、 VL、 VHH、 Fab、修 飾的Fab、 Fab， 、 F(ab， )2、 Fv或scFv片段。
考慮到所提出的該抗體分子的功能，尤其是可能需要的效應功能 後，可以選擇本發明抗體分子的恆定區結構域，如果存在。例如，恆 定區結構域可以是人IgA、 IgD、 IgE、 IgG或IgM結構域。尤其是，當 抗體分子意欲用於治療用途和需要抗體效應功能時，可以使用人IgG 恆定區結構域，特別是IgGl和IgG3同種型。或者，當 抗體分子意欲 用於治療目的且不需要抗體效應功能，例如用於簡單阻斷IL-17活性 時，可以使用IgG2和IgG4同種型。例如，可以使用如Angal等， Molecular Immunology, 1993， 30(1)， 105-108中所述的其中第241 位的絲氨酸已經轉變為脯氨酸的IgG4分子。特別優選的是包含這種改 變的IgG4恆定區結構域。
在一個實施方案中，抗體重鏈包含CH1結構域，抗體輕鏈包含CL 結構域，k或入。
在優選的實施方案中，本發明提供的抗體是對人IL-17A和IL-17F 具有特異性的中和抗體，其中重鏈恆定區包含人IgG4恆定區，其中第 241位絲氨酸已經被脯氨酸取代，如Angal等，上文中所述的。因此，本發明提供了其中重鏈包含SEQ ID NO : 15中給出的序列或由該序列 組成的抗體。
在本發明的一個實施方案中，抗體包含重鏈，其中重鏈可變結構 域包含與SEQ ID N0:15給出的序列具有至少60%同一性或相似性的序 列。優選，抗體包含重鏈，其中重鏈可變結構域包含與SEQ ID NO: 15 給出的序列具有至少70%， 80%， 90%， 95°/。或98%同一性或相似性的序 列。
在一個實施方案中，根據本發明的抗體分子包含輕鏈，該輕鏈包 含SEQ ID NO: 11中給出的序列。
在本發明的一個實施方案中，抗體包含輕鏈，其中輕鏈包含與SEQ ID NO: 11給出的序列具有至少60%同一性或相似性的序列。優選，抗 體包含輕鏈，其中輕鏈包含與SEQ ID NO: 11給出的序列具有至少70%， 80%, 90%, 95%或98%同一性或相似性的序列。
在一個實施方案中，本發明提供了抗體，其中重鏈包含SEQ ID NO: 15給出的序列或由該序列組成，而輕鏈包含SEQ ID NO: 11給出的 序列或由該序列組成。
在本發明的一個實施方案中，抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包 含與SEQ ID NO: 15給出的序列具有至少60%同一性或相似性的序列， 而輕鏈包含與SEQ ID NO: 11給出的序列具有至少60%同一性或相似性 的序列。優選，該抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含與SEQ ID NO: 15 給出的序列具有至少70%, 80%, 90%, 95%或98%同一性或相似性的序 列，其中輕鏈包含與SEQ ID NO: 11給出的序列具有至少70%, 80%, 90%， 95%或98%同一性或相似性的序列。
本發明還提供了人IL-17A的特定區域或表位和/或人IL-17F的特 定區域或表位和/或人IL-17A/F雜二聚體的特定區域或表位，其與本 發明提供的抗體結合，尤其是包含重鏈序列gH9 (SEQ ID NO : 9)和 /或輕鏈序列gL7 (SEQ ID NO: 7)的抗體。
可以通過本領域已知的任何合適的表位作圖方法結合本發明提供 的任何一個抗體來鑑定人IL-17A多肽的特定區域或表位和人IL-17F多肽的特定區域或表位和人IL-17A/F雜二聚體的特定區域或表位。這 種方法的實例包括篩選與本發明抗體結合的來源於IL-17A和IL-17F 的不同長度的肽，最小的片段可以特異性結合含有該抗體識別的表位 序列的抗體。IL-17肽可以合成產生或通過蛋白水解消化合適的IL-17 多肽來製備。可以通過例如質鐠分析來鑑定結合該抗體的肽。在另一 個實例中，可使用NMR核磁共振來鑑定由本發明抗體結合的表位。一 旦得到鑑定，如果需要，則可以使用結合本發明抗體的表位片段，如 果需要，用作免疫原來獲得結合相同表位的其他中和抗體。
交叉阻斷根據本發明的抗體結合的抗體，尤其是包含重鏈序列 gH9 ( SEQ ID NO: 9 )和輕鏈序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 )的抗體，可以類 似地用於中和IL-17A和IL-17F活性。因此，本發明還提供了結合人 IL-17A和人IL-17F的中和抗體，其交叉阻斷如上所述任何一個抗體 與人IL-17A和/或人IL-17F和/或人IL-17A/F雜二聚體的結合和/或 通過那些抗體中的任一種交叉阻斷其與IL-17A和/或IL-17F和/或人 IL-17A/F雜二聚體的結合。在一個實施方案中，這樣的抗體結合如上 所述抗體相同的表位。在另一個實施方案中，交叉阻斷中和抗體結合 由上文中所述抗體結合的表位接近和/或重疊的表位。在另一個實施方
的表位或與所述表位接近和/或重疊的表位。
可以使用本領域中任何合適的方法來鑑定交叉阻斷抗體，例如， 使用竟爭性ELISA或BIAcore，其中交叉阻斷抗體與人IL-17A和/或 人IL-17F的結合阻止了本發明抗體的結合，或反之亦然。
在一個實施方案中，提供了結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗 體，其交叉阻斷重鏈包含序列gH9 (SEQ ID N0 : 9)和輕鏈包含序列 gL7 (SEQ ID NO: 7)的抗體與人IL-17A和人IL-17F的結合。在一個 實施方案中，本發明提供的交叉阻斷抗體抑制包含重鏈序列gH9 (SEQ ID NO: 9 )和輕鏈序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 )的抗體與IL-17A和IL-17F 的結合，對IL-17A的抑制高於80°/。，優選高於85%，更優選高於90%， 甚至更優選高於95%，對IL-17F的抑制高於80%，優選高於85%，更
19優選高於90%，甚至更優選高於95%。
在一個實施方案中，提供了結合人IL-17A和IL-17F的中和抗體， 其交叉阻斷重鏈包含序列gH9(SEQ IDN0: 9)和輕鏈包含序列gL7(SEQ ID NO: 7 )的抗體與人IL-UA、人IL-17F和人IL-17A/F雜二聚體的 結合。在一個實施方案中，本發明提供的交叉阻斷抗體抑制包含重鏈 序列gH9 (SEQ ID NO : 9)和輕鏈序列gL7 (SEQ ID NO: 7 )的抗體 與IL-17A、 IL-17F和IL-17A/F雜二聚體的結合，對IL-17A的抑制高 於80%，優選高於85%,更優選高於90%，甚至更優選高於95%，對IL-17F 的抑制高於80%，優選高於85%，更優選高於90%,甚至更優選高於95%, 對IL-17A/F的抑制高於80%，優選高於85%,更優選高於90%,甚至 更優選高於95%。
在一個實施方案中，提供了結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗 體，其交叉阻斷重鏈包含序列gH9 ( SEQ ID NO: 9 )和輕鏈包含序列gL7 (SEQ ID NO: 7 )的抗體與人IL-17A、或與人IL-17F或人IL-17A/F 雜二聚體的結合。在一個實施方案中，本發明提供的交叉阻斷抗體抑
制包含重鏈序列gH9 ( SEQ ID NO : 9 )和輕鏈序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 ) 的抗體與IL-17A或IL-17F或IL-17A/F的結合，該抑制高於80%，優 選高於85%,更優選高於90%，甚至更優選高於95%。
可替換地或另外地，可以通過包含重鏈序列gH9 (SEQ ID NO: 9) 和輕鏈序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 )的抗體來交叉阻斷根據本發明該方面 的中和抗體與人IL-17A和人IL-7F的結合。因此，還提供了結合人 IL-17A和人IL-17F的中和抗體，通過包含重鏈序列gH9 ( SEQ ID NO: 9 )和輕鏈序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 )的抗體交叉阻斷其與人IL-17A 和人IL-17F的結合。在一個實施方案中，通過包含重鏈序列gH9(SEQ ID NO: 9)和輕鏈序列gL7 (SEQ ID NO: 7 )的抗體抑制了本發明的該 方面提供的中和抗體與人IL-17A和人IL-17F的結合，該抑制高於 80%，優選高於85%，更優選高於90%，甚至更優選高於95%。
在另一個實施方案中，提供了結合人IL-17A和人IL-17F的中和 抗體分子，通過包含重鏈序列gH9(SEQ IDNO: 9)和輕鏈序列gL7 ( SEQID NO: 7)的抗體交叉阻斷了其與人IL-17A、人IL-17F和IL-17A/F 雜二聚體的結合。在一個實施方案中，通過包含重鏈序列gH9(SEQID NO: 9)和輕鏈序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 )的抗體抑制了本發明的該方面 提供的中和抗體與人IL-17A、人IL-17F和人IL-17A/F雜二聚體的結 合，該抑制高於80%，優選高於85%，更優選高於90%，甚至更優選高 於95%。
因此，還提供了結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗體分子，通 過包含重鏈序列gH9 ( SEQ ID NO: 9 )和輕鏈序列gL7 ( SEQ ID NO: 7 ) 的抗體交叉阻斷了其與人IL-17A或人IL-17F或人IL-17A/F雜二聚體 的結合。在一個實施方案中，通過包含重鏈序列gH9 (SEQ ID NO: 9) 和輕鏈序列gL7 (SEQ ID NO: 7)的抗體抑制了本發明的該方面提供的 中和抗體與人IL-17A或人IL-17F或人IL-17A/F雜二聚體的結合，該 抑制高於80%，優選高於85%,更優選高於90%,甚至更優選高於95°/。。
本發明任一方面的抗體分子優選具有高結合親和性，優選納摩爾， 甚至更優選皮摩爾。將認識到根據本發明的抗體對人IL-17A的結合親 和性不同於相同抗體對人IL-17F和/或IL-17A/F雜二聚體的結合親和 性。在一個實例中，本發明的抗體分子對IL-17A的親和性高於對 IL-17F的親和性。在一個實例中，本發明的抗體分子對IL-17A的親 和性是其對IL-17F的結合親和性的至少10倍。在一個實例中，本發 明的抗體分子對IL-17A的親和性是其對IL-17F的結合親和性的至少 50倍。在一個實例中，本發明的抗體分子對IL-17A的親和性是其對 IL-17F的結合親和性的至少100倍。在一個實例中，本發明的抗體分 子對IL-17F的親和性高於對IL-17A的親和性。在一個實例中，本發 明的抗體分子對IL-17A的親和性和對IL-17F的親和性相同。在一個 實例中，本發明的抗體分子對IL-17A具有皮摩爾的親和性，而對 IL-17F具有納摩爾的親和性。在一個實例中，本發明的抗體分子對 IL-17F具有納摩爾的親和性，而對IL-17A具有皮摩爾的親和性。在 一個實例中，本發明的抗體分子對IL-17A和IL-:HF都具有納摩爾的 親和性。在一個實例中，本發明的抗體分子對IL-17A和IL-17F都具有皮摩爾的親和性。
優選，本發明的抗體分子對IL-17A具有優於10nM的結合親和性。 在一個實施方案中，本發明的抗體分子對IL-17A具有優於500pM的親 和性。在一個實施方案中，本發明的抗體分子對IL-17A具有優於100pM 的親和性。在一個實施方案中，本發明的抗體分子對IL-17A具有優於 20pM的親和性。在一個實施方案中，本發明的抗體對IL-17A具有16pM 的親和性。
優選，本發明的抗體分子對IL-17F具有優於10nM的結合親和性。 在一個實施方案中，本發明的抗體分子對IL-17F具有優於2nM的親和 性。在一個實施方案中，本發明的抗體對IL-17F具有1. 75nM的親和 性。
優選，本發明的抗體分子對IL-17A/F雜二聚體具有優於10nM的 結合親和性。在一個實施方案中，本發明的抗體分子對IL-17A/F雜二 聚體具有優於500pM的結合親和性。在一個實施方案中，本發明的抗 體分子對IL-17A/F雜二聚體具有優於150pM的結合親和性。在一個實 施方案中，本發明的抗體分子對IL-17A/F雜二聚體具有116pM的結合 親和性。
在一個實施方案中，本發明的抗體分子對獼猴IL-17F具有優於 2nM的結合親和性。在一個實施方案中，本發明的抗體分子對獼猴 IL-17F具有1. 03nM的結合親和性。
的抗體的親和性。因此，本發明還涉及本發明抗體分子的變體，其對 IL-17A和或IL-17F具有提高的親和性。可以通過很多親和性成熟方 案獲得這種變體，包括使CDR突變(Yang等，J. Mol. Biol. ， ^1， 392-403， 1995 )、鏈改組(Marks等，Bio/Technology， i^， 779-783， 1992 )、使用大腸桿菌突變林(Low等，J. Mol. Biol. ， ， 359-368，
1996 )、 DNA改組(Patten等，Curr. Opin. Biotechnol，多，724-733，
1997 )、噬菌體展示(Thompson等，J. Mol. Biol.，裡，77-88, 1996 )和有性PCR( sexual PCR ) ( Crameri等，Nature,巡，288-291，1998 ) 。 Vaughan等(上文)討論了這些親和性成熟的方法。
在一個實施方案中，本發明的抗體分子中和IL-17A和IL-17F活 性，例如，在實施例中描述的體外試驗中。在一個實施方案中，本發 明提供了對人IL-17A和IL-17F具有特異性的中和抗體，其在小於5nM 的濃度下能夠抑制50% 0. 8nM人IL-17A的活性，在小於12nM的濃度 下能夠抑制50% 4. 2nM人IL-17F的活性，用IL-17A或IL-17F誘導 的從海拉細胞的IL-6釋放來度量所述抑制活性。在一個實施方案中， 抑制50% IL-17A的抗體濃度小於3nM。在一個實施方案中，抑制50% IL-17F的抗體濃度小於llnM。在一個實施方案中，該試驗中使用的人 IL-17A和人IL-17F是重組人IL-17A和IL-17F。在一個實施方案中， 中和抗體是人源化或完全人的抗體。
如果期望，本發明使用的抗體可以綴合一個或多個效應分子。將
分子連接形成可二連接本發明抗體的單;虫部分:'在期望獲得連接效應
分子的抗體片段的情況下，這可以通過標準化學或重組DNA程序來制 備，其中抗體片段直接連接或通過偶聯劑連接效應分子。綴合這樣的 效應分子與抗體的技術是本領域公知的(參見，Hellstrom等， Controlled Drug Delivery (受控藥物傳送)，第2版，Robinson等， 編輯，1987， pp. 623-53; Thorpe等，1982， Immunol. Rev. ， 62: 119-58 和Dubowchik等,1999， Pharmacology and Therapeutics (藥理學 和治療學)，83， 67-123 )。特定的化學方法，包括，例如，W0 93/06231、 W0 92/22583、 W0 89/00195、 W0 89/01476和WO03031581中所述的那 些。或者，在效應分子是蛋白或多肽的情況下，可以使用重組DNA程 序實現連接，例如，如WO 86/01533和EP0392745中所述的。
如在此所用的的術語效應分子包括，例如，抗腫瘤劑、藥物、毒 素、生物活性蛋白，例如酶、其他抗體或抗體片段、合成或天然存在 的聚合物、核酸及其片段，例如DNA、 RNA及其片段、放射性核素，特 別是放射性碘、放射性同位素、螯合金屬、納米顆粒和報告基團，如 焚光化合物或通過NMR或ESR光鐠術可檢測到的化合物。效應分子的實例可以包括細胞毒素或細胞毒劑，包括對細胞有害
(例如，殺滅)的任何試劑。實例包括combrestatins、多拉司他汀、 epothilones、 星形孢菌素、maytansinoids、 spongistatins、 根黴 素、軟海綿素、杆孢菌素、hemiasterlins、紫杉酚、細胞鬆弛素B、 短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、鬼臼亞乙苷、tenoposide、 長春新鹼、長春花鹼、秋水仙素、阿黴素、柔紅黴素、二羥炭疽菌素 二酮、米託蒽醌、光輝黴素、放線菌素D、 l-去氫睪酮、糖皮質激素、 普魯卡因、丁卡因、利多卡因、心得安和嘌呤黴素及其類似物或同系 物。
效應分子還包括但不限於抗代謝物(例如，氨曱蝶呤、6-巰基嘌 呤、6-巰基鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氛烯咪胺)、烷化劑(例 如，二氯甲二乙胺、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亞硝脲氮 芥(BSNU)和環己亞硝脲(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、 鏈脲佐菌素、絲裂黴素C和順二氯化二氨亞鉑(II) (DDP)順鉑)、 蒽環類抗生素(例如，柔紅黴素(daunorubicin )(以前是(daunomycin ) 和阿黴素)、抗生素(例如，放線菌素(dactinomycin )(以前是 actinomycin)、博萊霹素、光輝黴素、氨茴黴素(AMC)、刺孢黴素 或多卡米星)和抗有絲分裂劑(例如，長春新鹼和長春花鹼)。
其他效應分子可以包括螯合放射性核素，如min和，、Lu177、鉍 213、鉲252 、銥192和鴒187錸188;或藥物，如但不限於，烷基磷酸膽鹼、 拓樸異構酶I抑制劑、紫杉烷和蘇拉明。
其他效應分子包括蛋白、肽和酶。感興趣的酶包括但不限於蛋白 水解酶、水解酶、裂解酶、異構酶、轉移酶。感興趣的蛋白、多肽和 肽包括但不限於免疫球蛋白，毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒A、假 單胞菌外毒素或白喉毒素，蛋白，如胰島素、腫瘤壞死因子、cc-幹擾 素、p-幹擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子或組織纖溶酶原 激活物、血松形成劑或抗血管生成劑，例如，制管張素或內皮抑制素， 或生物反應調節物，如淋巴因子、白細胞間介素-1 (IL-1)、白細胞 間介素-2 (IL-2)、白細胞間介素-6 (IL-6)、粒細胞巨噬細胞集落
24刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、神經生長因子
(NGF)或其他生長因子和免疫球蛋白。
其他效應分子可以包括例如用於診斷中的可檢測物質。可檢測物 質的實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、 放射性核素、正電子放射金屬(用於正電子發射層析成像)和非放射 性順磁性金屬離子。關於可以綴合抗體用作診斷的金屬離子，通常參 見美國專利No. 4， 741， 900。合適的酶包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、
P -半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適的輔基包括鏈黴抗生物素蛋白、 抗生物素蛋白和生物素；合適的螢光物質包括傘形酮、螢光素、異硫 氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯和藻紅蛋白； 合適的發光物質包括魯米諾；合適的生物發光物質包括螢光素酶、瑩 光素和水母發光蛋白；和合適的放射性核素包括125I、 131I、 mIn和"Tc。
在另一個實例中，效應分子可以提高抗體在體內的半衰期和/或降 低抗體的免疫原性和/或提高抗體穿過上皮屏障遞送到免疫系統。該類 型合適的效應分子實例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結合蛋白或白蛋 白結合化合物，如W005/117984中描述的那些。
在效應分子是聚合物的情況下，它通常可以是合成的或天然存在 的聚合物，例如，任選取代的直鏈或支鏈聚烷撐、聚亞烷基或聚乙二 醇聚合物或分支或不分支的多糖，例如，同型或異型多糖。
可以存在於上述合成聚合物上的特定的任選取代基包括一個或多 個羥基、曱基或甲氧基。
合成聚合物的特定實例包括任選取代的直鏈或支鏈聚(乙二醇)、 聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，特別是任選取代的聚(乙二醇)， 如單甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
特定的天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、葡聚糖、糖原或 其衍生物。
在此所用的"衍生物"意欲包括反應性的衍生物，例如，巰基-選擇性的活性基團，如馬來醯亞胺等。反應性基團可以直接連接或通 過銜接片段連接聚合物。將認識到這種基團的殘基在有些情況下會作為抗體片段和聚合物之間的連接基形成產物的一部分。
聚合物的大小可以根據需要而變化，但是平均分子量通常為
500Da至50000Da，優選5000至40000Da，更優選20000至40000Da。
尤其可以基於產品的預定用途來選擇的聚合物大小，例如，局限於特 定組織如腫瘤的能力或延長循環半衰期的能力(對於綜述，參見 Chapman, 2002， Advanced Drug Del ivery Reviews， 54， 531-545 )。 因此，例如，在產物意欲離開循環並穿過組織，例如用於治療腫瘤的 情況下，使用小分子量聚合物可能是有利的，例如，大約5000Da的分 子量。對於產物保留在循環中的應用，使用較高分子量的聚合物可能 是有利的，例如，具有20000Da至40000Da範圍的分子量。
特別優選的聚合物包括聚烷撐聚合物，如聚(乙二醇)，或尤其是 甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且特別具有約15000Da至約40000Da 範圍的分子量。
在一個實例中，將本發明中使用的抗體與聚(乙二醇)(PEG)部分連 接。在一個特別的實例中，該抗體是抗體片段並可以通過位於抗體片 段中的任何可利用胺基酸側鏈或末端胺基酸官能團例如任何游離氨 基、亞氨基、硫醇基、羥基或羧基與PEG分子連接。這種胺基酸可以 天然存在於抗體片段中或可以使用重組DM方法而工程化至片段中 (參見，例如，US 5， 219， 996; US 5, 667,425; W098/25971 )。在一 個實例中，本發明的抗體分子是修飾的Fab片段，其中修飾是將一個 或多個胺基酸添加至其重鏈C末端以允許連接效應分子。優選，另外 的胺基酸形成修飾的絞鏈區，該區含有可以連接效應分子的一個或多 個半胱氨酸殘基。多個位點可用於連接兩個或多個PEG分子。
優選通過位於抗體中的至少一個半胱氨酸殘基的硫醇基共價連接 PEG分子。與修飾的抗體片段連接的每個聚合物分子可以與位於片段 中的半胱氨酸殘基的硫原子共價連接。共價鍵通常將是二硫鍵或尤其 是硫-碳鍵。在硫醇基用作適當激活效應分子的連結點的情況下，例如， 可以使用疏醇選擇性衍生物，如馬來醯亞胺和半胱氨酸衍生物。激活 的聚合物可以用作製備如上所述的聚合物修飾的抗體片段的原料。激活的聚合物可以是含有硫醇反應性基團的任何聚合物，如a -卣素羧酸 或酯，例如，碘乙醯胺，醯亞胺，例如，馬來醯亞胺，乙烯基碸或二 石充化物。這種原料可購得(例如從Nektar，以前的Shearwater Polymers Inc., Himtsville， AL， USA)或可以從可購得的原料^f吏用 常規化學步驟製備。特定的PEG分子包括2OK甲氧基-PEG-胺(可從 Nektar, 以前的Shearwater; Rapp Polymere; 和SunBio獲得)和 M-PEG-SPA (可從Nektar，以前的Shearwater獲得)。
在一個實施方案中，該抗體是PEG化的修飾Fab片段，即，具有 與其共價連接的PEG (聚(乙二醇))，例如根據EP 0948544中公開 的方法[請參閱 "Poly (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications"(聚(乙二醇)化學，生物技術和 生物藥物應用，1992， J. Milton Harris (編輯)，Plenum Press, New York," Poly (ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications"(聚(乙二醇)化學和生物應用)，1997, J. Milton Harris和S. Zalipsky (編輯)，American Chemical Society, Washington DC和"Bioconjugation Protein Coupl ing Techniques for the Biomedical Sciences"(用於生物藥物科學的生物綴合蛋白連接 技術)，1998， M. Aslam和A. Dent, Grove Publishers， New York, Chapman, A. 2002， Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]。在一個實例中，PEG與絞鏈區的半胱氨酸連接。在一個 實例中，PEG修飾的Fab片段具有與修飾絞鏈區中單個硫醇基共價連 接的馬來醯亞胺基團。賴氨酸殘基可以與馬來醯亞胺基團共價連接， 並且賴氨酸殘基上的每個胺基可以連接分子量為大約20， 000 Da的甲 氧基聚(乙二醇)聚合物。因此與Fab片段連接的PEG的總分子量可以 是大約40， 000 Da。
在一個實施方案中，本發明提供了對人IL-17A和IL-17F具有特 異性的中和抗體，其是修飾的Fab片段，具有包含SEQ ID NO: 9給出 序列的重鏈和包含SEQ ID NO. 7給出序列的輕鏈，並且在其重鏈C末 端具有含與效應分子連接的至少 一個半胱氨酸殘基的修飾絞鏈區。優
27選，效應分子是PEG和使用(W098/25971和W02004072116 )中所述的 方法連接，由此賴氨醯馬來醯亞胺基與重鏈C末端的半胱氨酸殘基連 接，並且賴氨醯殘基的每個氨基與分子量約20， 000 Da的甲氧基聚(乙 二醇)殘基共價連接。因此與抗體連接的PEG的總分子量可以是大約 40， OOODa。
在另一個實例中，效應分子可以與抗體片段連接，使用國際專利 申請WO 2005/003169、 WO 2005/003170和WO 2005/003171中描述的 方法。
本發明還提供了編碼本發明抗體分子的重鏈和/或輕鏈的分離 DNA序列。優選，該DNA序列編碼本發明抗體分子的重鏈或輕鏈。本 發明的DNA序列可以包括合成的DNA,例如化學方法生產的，cDM、 基因組DNA或其任何組合。
編碼本發明抗體分子的DNA序列可以通過本領域技術人員公知的 方法獲得。例如，可以按照需要從確定的DNA序列或基於相應的氨基 酸序列來合成編碼部分或全部抗體重鏈和輕鏈的DNA序列。
編碼受體框架序列的DNA是本領域技術人員普遍可獲得的並且可 以根據它們的已知胺基酸序列容易地合成。
DNA序列。可以使用寡核苷酸合成技術完全或部分地合成所需的DNA 序列。如果需要，可以使用定點誘變和聚合酶鏈式反應(PCR)技術。
SEQIDN0:8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18中提供了合適序列的實例。SEQ ID NO: 18 中的核苷酸1-57個SEQ ID NO: 14中的核苷酸1-60編碼來自鼠抗體 B72. 3的信號肽序列 (Whittle等，1987， Protein Eng. 1(6) 499-505 )，將其分裂來產生本發明的中和抗體分子。
本發明還涉及含有本發明的一個或多個DNA序列的克隆或表達載 體。因此，提供了包含編碼本發明抗體的一個或多個DNA序列的克隆 或表達栽體。優選，克隆或表達載體分別包含編碼本發明抗體分子輕 鏈和重鏈的兩個DNA序列。優選，根據本發明的載體包含SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 18給出的序列。SEQ ID NO: 18中的核苷酸1-57和SEQ ID NO: 14中的核苷酸1-60編碼來自小鼠抗體B72. 3的信號肽序列 (分別是SEQ ID NO: 16中的殘基1-19和SEQ ID NO: 12中的1-20)， 最優選將其分裂來獲得本發明的中和抗體分子。
可以構建栽體的一般方法、轉染方法和培養方法是本領域技術人 員公知的。在這方面，參考 "Current Protocols in Molecular Biology"(分子生物學中的通用方案)，1999， F. M. Ausubel (編 輯)，Wiley Interscience ， New York 和 Cold Spring Harbor Publishing生產的Maniatis Manual。
還提供了包含一個或多個克隆或表達栽體的宿主細胞，該載體包 含編碼本發明抗體的一個或多個DNA序列。任何合適的宿主細胞/載體 系統可以用於表達編碼本發明抗體分子的DNA序列。可以使用細菌， 例如，大腸桿菌，和其他微生物系統，或也可以使用真核生物例如哺 乳動物宿主細胞表達系統。合適的哺乳動物宿主細胞包括CH0、骨髓 瘤或雜交瘤細胞。
本發明還提供了生產根據本發明的抗體分子的方法，包括在適於 引起從編碼本發明抗體分子的DNA表達蛋白的條件下培養含有本發明 栽體的宿主細胞，和分離該抗體分子。
該抗體分子可以只包舍重鏈或輕鏈多肽，而在這樣情況下，只需 要重鏈或輕鏈多肽編碼序列來用於轉染宿主細胞。對於包含重鏈和輕 鏈的產物的生產，可以用兩個載體轉染細胞系，第一個載體編碼輕鏈 多肽，而第二個載體編碼重鏈多肽。或者，可以使用單個載體，該栽 體包含編碼輕鏈和重鏈多肽的序列。
由於本發明抗體可用於治療和/或預防病理情況，本發明還提供了 包含本發明抗體分子並結合一種或多種藥物學上可接受的賦形劑、稀 釋劑或栽體的藥物或診斷組合物。因此，提供了根據本發明的抗體用 於製備藥物的用途。該組合物通常以無菌藥物組合物的一部分提供， 該藥物組合物通常包括藥物學上可接受的栽體。本發明的藥物組合物 可以另外包含藥物學上可接受的佐劑。本發明還提供了製備藥物或診斷組合物的方法，包括將本發明的 抗體分子連同一種或多種藥物學上可接受的賦形劑、稀釋劑或栽體一 起添加和混合。
抗體分子可以是藥物或診斷組合物中唯一的活性成分或可以伴有
其他活性成分，包括其他抗體成分，例如抗TNF、抗IL-1P、抗T細 胞、抗IFNy或抗LPS抗體，或非抗體成分，如黃噤呤。
該藥物組合物優選包含治療有效量的本發明抗體。如在此所用的 術語"治療有效量"是指治療、改善或預防目標疾病或病情所需，或 呈現出可檢測的治療或預防作用所需的治療劑量。對於任何抗體，可 以在細胞培養試驗或在動物模型中初步估計治療有效量，通常在齧齒 類、兔、狗、豬或靈長類動物中。該動物模型也可以用於測定合適的 濃度範圍和給藥途徑。然後這種信息可用於確定在人類中的有效劑量 和給藥途徑。
對於人患者的精確治療有效量將取決於疾病狀況的嚴重性、患者 的一般健康狀況、患者的年齡、體重和性別、飲食、給藥的時間和頻 率、藥物聯合、對治療的反應敏感性和耐受度/反應。該含量可以通過 常規實驗確定並且在臨床醫師的判斷之內。通常，治療有效量為 0. 01mg/kg至50mg/kg，優選0. lmg/kg至20mg/kg。藥物組合物可以 方便地以每劑含有預定量本發明活性劑的單位劑型存在。
該組合物可以單獨給予患者或可以聯合其他試劑、藥物和激素給 予(例如同時、按序或分開)。
本發明抗體分子給予的劑量取決於所治療病情的性質、存在的炎 症程度和取決於該抗體分子是用於預防還是治療現有的病情。
劑量的次數將取決於抗體分子的半衰期及其作用的持續時間。如 果抗體分子具有短半衰期(例如2至10小時)，需要每天給予一劑或 多劑。或者，如果抗體分子具有半長衰期(例如2至15天)，僅需要 給予每天一次、每周一次乃至每1個月或2個月一次的劑量。
藥物學上可接受的栽體本身不應該誘導產生對接受該組合物的個 體有害的抗體並且不應該有毒。合適的載體可以是大的、緩慢代謝的大分子，如蛋白質、多肽、脂質體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨 基酸、胺基酸共聚物和無活性的病毒顆粒。
可以使用藥物學上可接受的鹽，例如無機酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴 酸鹽、磷酸鹽和疏酸鹽，或有機酸鹽，如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽 和苯甲酸鹽。
治療組合物中的藥物學上可接受的載體可以另外含有液體，如水、
鹽水、甘油和乙醇。另外，輔料，如潤溼劑或乳化劑或pH緩衝劑可以 存在於這樣的組合物中。這樣的載體能使該藥物組合物配製成片劑、 丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液和懸浮液，用於由患 者攝取。
優選的給藥形式包括適於非腸道給藥的形式，例如通過注射或輸 注，例如通過快速濃注或連續輸注。在產品用於注射或輸注的情況下， 可以釆用含油或含水載體中的懸浮液、溶液或乳濁液的形式，並且可 以含有配製劑，如懸浮劑、防腐劑、穩定劑和/或分散劑。或者，抗體 分子可以是乾燥形式，在使用前用合適的無菌液體重建。
一旦配製，本發明的組合物可以直接給予患者。待治療的患者可 以是動物。然而，優選該組合物適於給予人患者。
本發明的藥物組合物可以通過許多途徑給予，包括但不限於口腔、 靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、透皮、經皮下(例如， 參見W0 98/20734 )、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰 道內或直腸途徑。也可以使用無痛皮下噴射器給予本發明的藥物組合 物。通常，治療組合物可以製備成可注射的，液體溶液或懸浮液。也 可以製成適於注射前以溶於或懸浮於液體栽體的固體形式。
通常通過注射、皮下、腹膜內、靜脈內或肌內注射或遞送至組織 間隙來實現組合物的直接遞送。還可以將組合物給予受損處。劑量治 療可以是單劑量方案或多劑量方案。
將認識到組合物中的活性成分將是抗體分子。正因為如此，它在 胃腸道易於降解。因此，如果組合物通過胃腸道途徑給予，該組合物 將需要含有保護抗體不被降解的試劑，但其一旦被胃腸道吸收則釋放該抗體。
藥物學上可接受栽體的深入討論可在 Remington's Pharmaceutical Sciences (雷明頓氏藥物科學)(Mack Publishing Company, N. J. 1991 )中獲得。
還設想了通過使用基因治療給予本發明的抗體。為了實現這一點， 將在合適的DNA成分控制下的編碼抗體分子的重鏈和輕鏈的DNA序列 導入患者種，使得從DNA序列表達該抗體鏈並在原位裝配。
本發明還提供了用於控制炎性疾病的抗體分子。優選，該抗體分 子可用於減輕炎性過程或預防炎性過程。
本發明還提供了用於治療或預防由IL-17A和/或IL-17F介導的或 與升高的IL-17A和/或IL-17F水平相關的病理失調的本發明的抗體分 子。優選，病理情況選自感染(病毒、細菌、真菌和寄生蟲性的)、 與感染相關的內毒素性休克、關節炎、類風溼性關節炎、津喘、盆腔 炎、阿爾茨海默氏病、克羅恩氏病、炎症性腸病、潰瘍性結腸炎、 Peyronie氏疾病、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛病、腹膜炎、4艮屑病、脈 管炎、手術粘連、中風、I型糖尿病、萊姆關節炎、腦膜腦炎、免疫 介導的中樞和外周神經系統的炎性障礙，如多發性硬化和吉-巴綜合 徵、其他自體免疫障礙、胰腺炎、外傷(手術)、移植抗宿主疾病、 移植排斥、癌症(實體腫瘤，如黑素瘤、肝胚細胞瘤、肉瘤、鱗狀細 胞癌、移行細胞癌、卵巢癌和血液系統惡性腫瘤，尤其是急性髄性白 血病、慢性粒性白血病、胃癌和結腸癌)、心臟病，包括缺血性疾病， 如心肌梗塞以及動脈粥樣硬化、血管內凝血、骨吸收、骨質疏鬆症、 骨關節炎、牙周炎和胃酸過少。
本發明還提供了用於治療或預防疼痛的根據本發明的抗體分子。
本發明進一步提供了根據本發明的抗體分子用於製造治療或預防 由IL-17A和/或IL-17F介導的或與升高的IL-17A和/或IL-17F水平 相關的病理失調的藥物的用途。優選病理失調是類風溼性關節炎或多 發性硬化。
本發明進一步提供了根據本發明的抗體分子在製備治療或預防疼痛的藥物中的用途。
本發明的抗體分子可以用於期望降低IL-17A和/或IL-17F在人或 動物體中的作用的任何療法中。IL-17A和/或IL-17F可以在體內循環 或可以以出乎意料的高水平局部存在於體內的特定部位，例如炎症部 位。
優選根據本發明的抗體分子用於控制炎性疾病、自體免疫疾病或 癌症。
本發明還提供了治療患有由IL-17A和/或IL-17F介導的疾病或處 於這種風險中的人或動物患者的方法，該方法包括將有效量的本發明 的抗體分子給予患者。
根據本發明的抗體分子也可以用於診斷，例如涉及IL-17A和/或 IL-17F的病況的體內診斷和成像。
在下面參照附圖的實施例中，僅通過說明進一步描述了本發明，
其中-.


圖1:
a )抗體CA028 —0496的輕鏈V區(SEQ ID NO: 7 ) b )抗體CA028-0496的重鏈V區(SEQ ID NO: 9 ) c)抗體CA028-496的CDRHl( SEQ ID NO: 1 )， C醒2( SEQ ID NO: 2)，
C麵3 ( SEQ ID NO: 3 ) ， CDRL1 ( SEQ ID NO: 4 ) ， CDRL2 ( SEQ ID NO: 5 )，
CDRL3 ( SEQ ID NO: 6 )。
d )抗體CA028-496的輕鏈(SEQ ID NO: 11 )。 e )抗體CA028 — 496的重鏈(SEQ ID NO: 15 )。 f )編碼抗體CA028-496的輕鏈並包括信號序列的DNA (SEQ ID
NO: 14 )。
g)編碼抗體CA028 — 496的重鏈並包括信號序列的DNA (SEQ ID NO: 18)。
圖2
a )抗體CA028 — 0496 (圖例中稱為Ab#496 )對人IL-17A誘導的從海拉細胞產生IL-6的作用。
b)抗體CA028-0496 (圖例中稱為Ab#496 )對人IL-17F誘導的從 海拉細胞產生IL-6的作用。
Z W橫斧#一妓才法
使用大腸桿菌菌林INVaP ( Invitrogen)轉化和常規培養生長。 DM限制和修飾酶得自Roche Diagnostics Ltd.和New England Biolabs。使用Maxi質粒純化試劑盒(QIAGEN，目錄號12165)進行 質粒製備。使用ABI Prism Big Dye終止測序試劑盒(目錄號4304149 ) 進行DNA測序反應並在ABI 3100自動測序儀(Applied Biosystems) 上運行。使用AutoAssembler程序(Appl ied Biosystems)分析數據。 寡核苷酸得自Invitrogen。使用IgG裝配ELISA確定IgG的濃度。
重組IL-17A和IL-17F購自R&D Systems。
通過使用GS連接物連接IL-17A和IL-17F來產生重組IL-17A/F
雜二聚體。雜二聚體具有以下序列(SEQ ID NO: 19)。
MGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKIISSDYYNRSTSPWNLHRN PVPGGSMKLDIGIINENQRVSMSRN正SRSTSPWNYTVTWDPNRYPSEWQAQCRNL
Q
重組獼猴IL-17F (SEQ ID NO: 20)
CVTPV工HHVQ
通過Entelechon GmbH化學合成編碼IL-17A/F雜二聚體的DNA 序列，並在Ndel/Xhol位點亞克隆至pET43. la中。使用引入NdeI和Xhol限制位點的引物通過PCR擴增編碼cyno IL-17F的DNA序列。將 PCR產物與pCR4Blunt-T0P0連接並且在消化和在Ndel/Xho1位點上與 pET43. la連接之前驗證序列。
使用編碼IL-17同種型的pET43. la DNA來轉染BL21 (DE3)細胞 並將選擇的羧節青黴素抗性克隆在含有2%葡萄糖和50pg/ml羧千青 黴素的2TY培養液中在37C下生長過夜。然後將培養物稀釋並在相同 的培養基中生長至0. 5-0. 7的OD綱，用lmM IPTG誘導並在37C下再 生長4-5小時。
通過離心收集細胞並從細胞製得包含體。將包含體溶解於50mM Tris-HCl、 5M鹽酸胍、50mMNaCl、 lmM EDTA、 2mM還原型穀胱甘肽、 0. 2mM氧化型穀胱苷肽(pH8. 5)中。通過將溶解的蛋白質逐滴加入上 述不含鹽酸胍的緩衝液中使IL-17蛋白重摺疊，使用強烈攪拌。選擇 最終的體積，使得最終的蛋白濃度不超過0. lmg/ml。
如果需要，用10mMMES pH6進行緩衝液交換之前，將重摺疊的蛋 白溶液濃縮。然後將蛋白施加至用20mMMES pH6平衡的Sepharose SP HP柱上。用超過10柱體積的MESpH6中的0-500mM線性梯度NaCl洗 脫蛋白。對於IL-17F，梯度延伸至600mM NaCl。為了進一步純化IL-17， 收集來自Sepharose SP HP柱的相關級分，濃縮並用20mM CAPSO (pHIO)稀釋，並施加至用20mM CAPSO平衡的Mono Q柱上。用超過 20柱體積的20mM CAPSO中的0-250mM線性梯度NaCl洗脫蛋白。收集 含有IL-17的級分並使用1M MES pH6中和。
實施例1:中和抗IL-17抗體的產生
用重組人IL-17 (購自R&D systems)免疫雌性Sprague Dawly 大鼠。大鼠接受100 弗氏佐劑中20 IL-17的四次免疫。使用 WO04/051268中所述的方法分離結合人IL-17的抗體225。分離抗體 225重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)的基因並且通過 逆轉錄PCR克隆後測序。
使用人V區受體框架並通過改變該框架區的供體殘基數量來設計一系列的人源化VL和VH區。設計八個移植VL區(gLl-8 )和9個移 植VH區(gHl-9),並通過寡核苷酸裝配和PCR誘變構建基因。
將輕鏈移植序列亞克隆至人輕鍊表達載體pKH10, 1中，其含有編 碼人C-k恆定區(Km3同種異型)的DNA。將重鏈移植序列亞克隆至 人Y -4表達栽體pVhg4P FL中，其含有編碼含鉸鏈穩定突變S241P的 人Y-4恆定區的DNA (Angal等，上文)。將質粒共轉染至CH0細 胞中，並且在IL-17結合和中和測試中篩選所產生抗體的活性。根據 製造商的說明書使用Lipofectamine 2000程序(InVUrogen，目錄 號11668 )進行CH0細胞的轉染。
基於表達、親和性和中和潛能選擇了最佳的移植物(gL7gH9)， 並命名為CA028-0496。該抗體的V區序列對於輕鏈(gL7 )和重鏈(gH9 ) 各自顯示於圖1 (a)和(b),以及SEQ ID NO: 7和9中。
重鏈受體框架是人種系序列VH3 1-3 3-07，框架4來自人JH區 種系JH4的這個部分。輕鏈受體框架是人種系序列VK1 2-l-(l)L4， 框架4來自人JK區種系JK1的這個部分。
實施例2:抗體CA028-0496中和IL-17、 IL-17F和IL-17A/F雜 二聚體
海拉細胞
測試了抗體CA028 —0496對抗海拉細胞中人重組IL-17和人重組 IL-17F的潛能，並與抗體CDP435相比較(W006/054059 )。海拉細胞 獲自ATCC的細胞庫(ATCCCCL-2)。將細胞生長於補充10%胎牛血清、 青黴素、慶大黴素和穀氨醯胺的Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM) 中。將lxl(T個細胞塗布於96孔平底組織培養平板中。將細胞孵育 過夜並在測試緩衝液中洗滌一次。在固定濃度的人TNF-oc存在下孵育 人IL-17A ( 25ng ml—1)或人IL-17F ( 125ng m1—1)，用抗體CA028一0496 或抗體CDP435預先孵育該混合物。然後將細胞因子加抗體加入孵育過 夜的海拉細胞中。細胞培養物上清液中IL-6的產生與加入細胞中的 IL-17A/IL-17F含量成比例。通過ELISA測量人IL-6水平並通過與已知的人IL-6標準濃度相比較來定量。
數據(圖2a和2b)表明抗體CA028-0496有效地中和了人重組 IL-17A，並且對人IL-17F具有一定的活性。來自這些實驗的數據表明 抗體CA028 — 0496對人重組IL-17( 25ng m1—1 )產生了 43/ng/ml的IC5。, 對重組IL-17F ( 125ng mr1)產生了 1477ng/ml的IC5。。
因此，抗體CA028 — 0496在該測試中對人重組IL-17 (0.78nM)產 生了 0. 29M的IC5。，對人重組IL-17F( 4. 16nM)產生了 10. 18nM的IC5。 (計算基於每個IgG，假定145，000的分子量為平均的IgG4，並假定 IL-17A和IL-17F是二聚體)。
人小膠質細胞
將人小膠質細胞(TCS Cellworks )塗布於平底96-孔平板中5， 000 個細胞/孔，總體積為100jil，並且放置24小時，使其連接塑料。在 該，在10ng/ml人重組TNFa存在和不存在下，將滴定度(5、 1、 0.2 和0. 04 ia g/ml )的人重組IL-17A、人重組IL-17F、獼猴重組IL-17F 和人重組IL-17A/F雜二聚體加入孔中，重複三份。對照孔不含有刺激 物，含有單獨的IL-17A ( 100ng/ml )、單獨的TNF ot以及IL-17A和 TNFa—起。以110p l/孔的總體積將所有細胞因子加入，使總的孔體 積為210ja 1。在涉及抗體的實驗中，以相同的方式塗布細胞。24小時 後，在相同的時間加入抗體和細胞因子，以獲得總的200 ^ 1終體積中 所述的終濃度。
在37t:再孵育24小時後，收集上清液並在-20iC冷凍直至分析。 為了分析，將上清液稀釋1/10，並根據製造商的說明使用人IL-6MSD 試劑盒測量IL-6。
發現測試的所有IL-17同種型在該測試中是有活性的，特別是在 TNFa的存在下。
在TNFa存在下測試抗體CA028-0496對抗人小膠質細胞中的人重 組IL-17A、人重組IL-17F、獼猴重組IL-17F和人重組IL-17A/F雜二 聚體的潛能，並使用上述方法與對照抗體和IL-17A特異性抗體相比
37較。
對照抗體對任一種所測試的細胞因子的活性沒有作用。
抗體CA028 —0496具有對抗所有三種細胞因子IL-17、 IL-17F和 IL-17A/F的抑制活性，包括獼猴IL-17F,而IL-17A特異性抗體只具 有對抗IL-17A和IL-17A/F雜二聚體的抑制活性。
實施例3:抗體CA028-0496(人IgG4恆定區)對IL-17A和IL-17F 的親和性
<吏用BIAcore 3000 ( BIAcore AB )進4亍BIA ( Biamolecular Interaction Analysis )。所有實驗均在25匸下進行。Fc片段特異性 的Affinipure Fc片段山羊抗人IgG (Jackson ImmunoResearch )通 過胺類偶聯化學作用以"6000反應單位UU)的捕獲水平固定在CM5 探測晶片上。HBS-EP緩衝液(10mM HEPES pH 7. 4， 0. 15MNaCl， 3 mM EDTA， 0. 005%表面活性劑P20， BIAcore AB)用作運行緩衝液，流速 10jiL/分鐘。注射10 抗體CA028-0496 ( 1. 81mg/ml )用於由固定 的抗人IgG-Fc捕獲。在以30 p L/min流速從50nM至nM以下的雙倍稀 釋，對捕獲的CA028-0496滴定人IL-17A和IL-17同種型。通過注射 30)aL 40 mM HC1，接著一次5 |i L 5mM NaOH,重新產生表面。
使用BIAevaluation軟體(3. 2版本)按照標準程序雙重參照和 分析背景扣除結合曲線。從擬合算法測定動力參數。
對抗體CA028 — 0496結合IL-17A測定的親和值為16pM。對IL-17F 為1750pM。抗體CA028-0496不結合其他IL-17同種型(IL-17B、 C、 D和E)。因此，抗體CA028-0496特異性地結合IL-17A和IL-17F。
實施例4:抗體CA028-0496 (鼠IgGl恆定區)對IL-17A、獼猴 IL-17F和IL-17A/F雜二聚體的親和性
使用BIAcore 3000 (BIAcore AB )進行BIA (Biamolecular Interaction Analysis)。
所有實驗在25t:進行。Fc片段特異性的Affinipure F(ab， )2片段山羊抗鼠IgG (Jackson ImraunoResearch)通過胺類偶聯化學作用 以《 6000反應單位(RU )的捕獲水平固定在CM5探測晶片上(Biacore AB) 。 HBS-EP緩衝液(10mM HEPES pH 7. 4, 0. 15MNaCl， 3 mM EDTA， 0. 005%表面活性劑P20, BIAcore AB)用作運行緩衝液，流速10uL/ 分鐘。注射10 n L 4 iu g/mL抗體CA028 —0496用於由固定的抗鼠IgG-Fc。 在以30juL/分鐘流速從25nM至nM以下的雙倍稀釋，對捕獲的 CA028-0496滴定人IL-17A、 cyno IL-17F和雜二聚體A/F。通過以10 pL/分鐘的速率注射10jaL 40 mM HC1，接著注射5 |u L 5mM NaOH，重 新產生表面。
使用BIAevaluation軟體(3.2版本)按照標準程序分析雙重參 照的背景扣除結合曲線。由擬合算法確定動力學參數。
抗體CA028一0496對IL-17A具有21pM的親和性，IL-17A/F雜二 聚體為116pM。對獼猴IL-17F為1030pM。
當然能理解僅通過實施例描述了本發明，決不意味著限制本發明， 並且在以下權利要求範圍內可以進行細節的改動。本發明的每個實施 方案的優選特徵也針對加以必要的變化的每個其他實施方案。將本說 明書中引用的全部出版物，包括但不限於專利和專利申請，在此引入 本文作為參考，如同每個單獨出版物具體和單獨指出被引入本文作為 參考，如同充分闡明一樣。
權利要求
1.結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗體。
2. 根據權利要求1的中和抗體，其還結合人IL-17A/F雜二聚體。
3. 根據權利要求1或權利要求2的中和抗體，其對IL-17F具有 優於2nM的結合親和性。
4. 根據權利要求l-3任一項的中和抗體，其對IL-17A的結合親 和性是其對IL-17F的結合親和性的至少10倍。
5. 根據權利要求l-4任一項的中和抗體，其對IL-17A具有優於 100pM的結合親和性。
6. 根據權利要求1至5任一項的中和抗體，其在小於5nM的濃度 下能夠抑制50%的0. 8nM人IL-17A的活性，在小於12nM的濃度下能 夠抑制50%的4. 2nM IL-17F的活性，用IL-17A或IL-17F誘導的從海 拉細胞的IL-6釋放來度量所述抑制活性。
7. 結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗體，其包含重鏈，其中重 鏈的可變結構域包含如下CDR中的至少一個具有SEQ ID NO: 1給出 的CDR-HI序列的CDR，具有SEQ ID NO: 2給出的CDR-H2序列的CDR 和具有SEQ ID NO: 3給出的CDR-H3序列的CDR。
8. 根據權利要求7的中和抗體，其中重鏈的可變結構域包含SEQ ID NO: 1給出的CDR-H1序列，SEQ ID NO: 2給出的CDR-H2序列和SEQ ID NO: 3給出的CDR-H3序列。
9. 結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗體，其包含輕鏈，其中輕 鏈的可變結構域包含如下CDR中的至少一個具有SEQ ID NO: 4給出 的CDR-Ll序列的CDR，具有SEQ ID NO: 5給出的CDR-L2序列的CDR 和具有SEQ ID NO: 6給出的CDR-L3序列的CDR。
10. 根據權利要求7或權利要求8的中和抗體，另外包含輕鏈， 其中輕鏈的可變結構域包含如下CDR中的至少一個具有SEQ ID NO: 4 給出的CDR-L1序列的CDR，具有SEQ ID NO: 5給出的CDR-L2序列的 CDR和具有SEQ ID NO: 6給出的CDR-L3序列的CDR。
11. 根據權利要求9或權利要求10的中和抗體，其中輕鏈的可變 結構域包含SEQ ID NO: 4給出的CDR-L1序列，SEQ ID NO: 5給出的 CDR-L2序列和SEQ ID NO: 6給出的CDR-L3序列。
12. 結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗體，其中重鏈的可變結 構域包含三個CDR,並且CDRH-1的序列與SEQ ID NO: 1給出的序列具 有至少60%的同一性或相似性，CDRH-2的序列與SEQ ID N0:2給出的 序列具有至少60%的同一性或相似性和CDRH-3的序列與SEQ ID NO: 3 給出的序列具有至少60%的同一性或相似性。
13. 根據權利要求12的中和抗體，另外包含輕鏈，其中輕鏈的可 變結構域包含三個CDR，並且CDRL-1的序列與SEQ ID N0:4給出的序 列具有至少60%的同一性或相似性，CDRL-2的序列與SEQ ID NO: 5給 出的序列具有至少60%的同一性或相似性和CDRL-3的序列與SEQ ID NO: 6給出的序列具有至少60%的同 一性或相似性。
14. 根據權利要求7至11任一項的抗體，其中重鏈包含SEQ ID NO: 9給出的序列。
15. 根據權利要求7至11任一項的抗體，其中輕鏈包含SEQ ID NO: 7給出的序列。
16. 結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗體，具有包含SEQ ID NO: 9 給出的序列的重鏈和包含SEQ ID NO: 7給出的序列的輕鏈。
17. 結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗體，其中輕鏈的可變結 構域包含與權利要求16抗體的輕鏈可變結構域具有至少80%同一性或 相似性的序列，並且其中重鏈的可變結構域包含與權利要求16村體的 重鏈可變結構域具有至少80%同一性或相似性的序列。
18. 結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗體，具有包含SEQ ID N0:15給出的序列的重鏈和包含SEQ ID NO: 11給出的序列的輕鏈。
19. 結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗體，其中重鏈和輕鏈與 權利要求18抗體的相應重鏈和輕鏈至少80%相同或相似。
20. 結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗體，其結合人IL-17A 和/或人IL-17F和/或IL-17A/F雜二聚體上與權利要求16的抗體相同的表位。
21. 結合人IL-17A和人IL-17F的中和抗體，其交叉阻斷權利要 求16的抗體與人IL-17A和/或人IL-17F和/或IL-17A/F雜二聚體的 結合和/或由權利要求16的抗體交叉阻斷其與人IL-17A和/或人 IL-17F和/或IL-17A/F雜二聚體的結合。
22. 根據權利要求1-21任一項的抗體，其中抗體是完整的抗體或 其功能活性片段或衍生物。
23. 根據權利要求22的抗體，其中抗體片段是結構域抗體，Fab， Fab， ， F(ab， )2， scFv或其表位結合片段。
24. 根據權利要求23的抗體，其中抗體或其片段是CDR-移植抗 體或完全人抗體。
25. 根據權利要求l-24任一項的抗體，其中抗體或其片段與一個 或多個效應分子綴合。
26. 由權利要求16的抗體結合的人IL-17A上的表位。
27. 由權利要求16的抗體結合的人IL-17F上的表位。
28. 由權利要求16的抗體結合的人IL-17A/F雜二聚體上的表位。
29. 編碼根據權利要求1至24任一項的抗體的重鏈和/或輕鏈的 分離DNA序列。
30. 含有根據權利要求29的一個或多個DNA序列的克隆或表達載體。
31. 根據權利要求30的載體，其中該載體含有SEQ ID N0:14和 SEQ ID NO: 18給出的序列。
32. 包含一個或多個根據權利要求30或權利要求31的克隆或表 達載體的宿主細胞。
33. 用於產生權利要求1至24任一項的抗體的方法，包括培養權 利要求32的宿主細胞和分離抗體。
34. 包含根據權利要求1至24任一項的抗體，並結合藥物學上可 接受的賦形劑、稀釋劑或栽體中的一種或多種的藥物組合物。
35. 根據權利要求34的藥物組合物，另外含有其他活性成分。
36. 根據權利要求1至24任一項的抗體或根據權利要求34或權 利要求35的藥物組合物，用於治療或預防由IL-17A和/或IL-17F介 導的病理失調，或與IL-17A或IL-17F升高的水平相關的病理失調。
37. 根據權利要求1至24任一項的抗體在製造用於治療或預防由 IL-17A和/或IL-17F介導的病理失調，或與IL-17A或IL-17F升高的 水平相關的病理失調的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及對IL-17A和IL-17F的抗原決定簇具有特異性的抗體分子，抗體分子的治療用途和產生所述抗體分子的方法。
文檔編號A61P37/06GK101589061SQ200780043116
公開日2009年11月25日 申請日期2007年10月18日 優先權日2006年10月18日
發明者A·G·波普爾韋爾, R·亞當斯, S·E·拉佩奇 申請人:Ucb醫藥有限公司