一種基於肽核酸(pna)鉗制聚合酶鏈反應(pcr)的耳聾突變基因的檢測方法

2023-06-10 20:10:11 2

一種基於肽核酸(pna)鉗制聚合酶鏈反應(pcr)的耳聾突變基因的檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種基於肽核酸(PNA)鉗制聚合酶鏈反應(PCR)的耳聾突變基因的檢測方法，涉及分子生物學遺傳工程核酸檢測【技術領域】。包括如下步驟：(1)設計一種與野生型耳聾基因(含突變位點)雜交的肽核酸PNA；(2)構建和提取突變型及野生型耳聾基因質粒，計算拷貝數；(3)採集待測個體的樣本，提取基因組DNA或線粒體DNA；(4)設計PCR擴增所需的一對上下遊引物和Taqman探針；(5)用上述肽核酸PNA對質粒標準品或待測樣本按照改進PCR反應條件進行檢測，得出擴增曲線；(6)根據所述擴增曲線對照檢測定性基因突變。本發明操作簡便、敏感性高、特異性高，可實時檢測耳聾基因突變量，可用於疾病的早期輔助診斷。
【專利說明】—種基於肽核酸(PNA)鉗制聚合酶鏈反應(PCR)的耳聾突變基因的檢測方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學遺傳工程中核酸檢測【技術領域】，尤其是涉及一種基於肽核酸(PM)鉗制聚合酶鏈反應(PCR)的耳聾突變基因的檢測方法。

【背景技術】
[0002]耳聾是威脅人類健康及致殘的最常見疾病之一，約50%的耳聾患者有遺傳背景。遺傳性耳聾按表型特點不同分為症候群性耳聾(SHL)和非症候群性耳聾(NSHL)。根據遺傳方式不同將遺傳性耳聾分為常染色體顯性遺傳(AD)、常染色體隱性遺傳(AR)、X連鎖遺傳、Y連鎖遺傳及線粒體遺傳五類，其中以AR耳聾最多見，約佔75%?80 %。迄今為止，與非症候群耳聾相關的28個常染色體隱性基因、22個常染色體顯性基因、I個X連鎖基因已被克隆，而每個基因中又有數目眾多的耳聾突變位點，其中以GJB2、SLC26A4基因及線粒體mtDNA的突變最為常見，其它型所佔比例較小。
[0003]國內研究人員針對中國人群耳聾的基因突變類型進行了較大規模的流行病學調查。結果顯示，21%的耳聾患者帶有GJB2基因突變、14.5%的患者帶有SLC26A4基因突變、3.8%和0.6%的患者分別帶有線粒體DNA突變和GJB3基因突變。其中GJB2基因突變熱點為 35delG、235delC、299-300delAT ;SLC26A4 基因突變熱點 IVS7_2A-G、2168A_G ；mtDNA 突變熱點1555A-GU494C-T。這一調查結果確定了 GJB2、SLC26A4、線粒體基因是導致中國大部分遺傳性耳聾發生的最常見的3個基因。此外GJB2基因109位點G-A突變、176-191位點缺失16個鹼基，SLC26A4基因1174位點的A-T突變、1229位點的A-G突變、2027位點的T-A突變也有較高的突變頻率。
[0004]目前，傳統基因突變檢測方法主要有PCR產物直接測序法、單鏈構象多態性分析(SSCP)、PCR-限制性片段長度多態性(RFLP)、變性高效液相色譜(DDHPLC)、實時定量PCR法、擴增阻礙突變系統(ARM/S)法、基因晶片等。
[0005]PCR產物直接測序法被認為是檢測基因突變的金標準，但其靈敏性較差。RFLP法是檢測DNA在限制性內切酶酶切後形成特定的DNA片段，反應DNA分子上不同酶切位點的分布情況，因此DNA序列上微小變化，能引起限制性內切酶的酶切位點丟失或產生，導致酶切產物長度變化，其結果可靠，重複性好，但是經常需要測序法確認，不能確定特殊突變。
[0006]高解析度溶解曲線法(HRM)是通過實時監測升溫過程中雙鏈DNA螢光染料與PCR擴增產物的結合情況。單核苷酸多態性(單個位點突變)位點不匹配會使雙鏈DNA在升溫過程中先解開，螢光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從螢光強度和時間曲線上判斷是否存在SNP。
[0007]上述的方法或者檢測能力有限、或者耗時費力、所需設備和耗材昂貴。因此有必要創立一種高效、快捷、低成本的耳聾基因突變篩查方法，以實現臨床快速檢測或規模化人群篩查。


【發明內容】

[0008]本發明的目的是針對目前中國人群耳聾基因突變的特點，選擇9個突變熱點作為篩查目標，彌補目前現有基因突變篩查方法的不足，提供一種簡單、快捷、高效、低成本的適合中國人群的耳聾基因突變篩查方法。
[0009]本發明的另一個目的是提供該方法所需的與耳聾基因野生型(含突變位點)互補雜交的肽核酸PNA序列、用於定性檢測耳聾基因突變的引物以及構建和提取突變型及野生型耳聾基因質粒。
[0010]本發明技術方案的原理在於採用構建肽核酸PNA阻斷PCR擴增法來檢測樣本，確定是否存在耳聾基因常見突變位點。將肽核酸PNA與實時定量PCR的結合應用於耳聾基因檢測。由於肽核酸PNA能覆蓋耳聾基因突變區域，而任一突變均可導致PNA/DNA的錯配，使得融解溫度發生明顯改變，因此只需設計一種針對野生型的肽核酸PNA，進行一次PCR反應，即可將耳聾基因突變型與野生型區分開。
[0011]實現本發明目的之技術方案如下:一種基於肽核酸PNA鉗制PCR的耳聾突變基因的檢測方法，包括以下步驟:
[0012](I)設計一種與野生型耳聾基因(含突變位點)雜交的肽核酸PNA ；
[0013](2)構建和提取突變型及野生型耳聾基因質粒，計算拷貝數；
[0014](3)採集待測個體的樣本，提取基因組DNA或線粒體DNA ；
[0015](4)設計PCR擴增所需的一對上下遊引物和Taqman探針；
[0016](5)用上述肽核酸PNA對質粒標準品或待測樣本按照改進的PCR反應條件進行檢測，得出擴增曲線；
[0017](6)根據所述擴增曲線對照檢測定性基因突變。
[0018]所述耳聾突變基因的檢測方法，利用耳聾基因9個突變熱點為檢測對象，設計與耳聾基因野生型(含突變位點)互補雜交的肽核酸PNA序列；針對每個位點的突變分別設計出肽核酸PNA和擴增引物，針對各個目的位點分別進行PCR擴增，通過擴增曲線分析，檢測9個耳聾基因突變。
[0019]所述與野生型耳聾基因(含突變位點)雜交的肽核酸PNA ;其肽核酸PNA能覆蓋耳聾基因的突變區域，而任一突變均可導致PNA/DNA的錯配，使得融解溫度發生明顯改變，因此在PCR反應中可封閉野生型耳聾基因，阻止野生型耳聾基因擴增；構成肽核酸PNA阻斷PCR擴增法來檢測樣本。
[0020]所述針對耳聾基因9個突變熱點構建的肽核酸PNA序列，包括GJB2基因35delG突變的PNA序列為GJB2基因的20-45位點、GJB2基因235delC突變的PNA序列為GJB2基因的225-245位點、GJB2基因299_300delAT突變的PNA序列為GJB2基因的290-312位點，其鹼基序列分別如 SEQ ID NO:1 ?SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 ?SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 ?SEQ ID NO:10 所示。
[0021]所述SLC26A4 基因 INS7-2A-G 突變的 PNA 序列為 SLC26A4 基因 22811-22835 位點，SLC26A4基因2168A-G突變的PNA序列為SLC26A4基因49490-49511位點，其鹼基序列分別如 SEQ ID NO:11 ?SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13 ?SEQ ID NO:14 所示。
[0022]所述GJB3基因538C-T，547G-A突變位點接近，選用同一 PNA序列；突變的PNA序列為GJB3基因4111-4130位點，其鹼基序列如SEQ ID NO:15?SEQ ID NO:16所示。
[0023]所述MtDNA基因1555A-G突變的PNA序列為MtDNA基因的1549-1570位點，MtDNA基因1494C-T突變的PNA序列MtDNA基因的1484-1511位點，其鹼基序列分別如SEQ ID NO:17 ?SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19 ?SEQ ID NO:20 所示。
[0024]一種用於定性檢測耳聾基因突變的引物，所述GJB2基因突變位點35delG、235delC、299-300delAT均採用第一對擴增引物，其鹼基序列如SEQ ID NO:2USEQ ID NO:22所示。
[0025]所述SLC26A4基因突變位點INS7-2A-G採用第二對擴增引物，產物長度295bp，SLC26A4基因突變位點2168A-G採用第三對擴增引物，產物長度295bp，其鹼基序列分別如SEQ ID NO:23 ?SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25 ?SEQ ID NO:26 所示。
[0026]所述GJB3基因突變位點538C-T，547G-A，均採用第四對擴增引物，產物長度295bp ；GJB3基因突變位點1555A-G，1494C-T均採用第五對擴增引物，產物長度247bp ;其鹼基序列分別如 SEQ ID NO:27 ?SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29 ?SEQ ID NO:30 所示。
[0027]本發明的創造性在於設計一種與野生型耳聾基因(含突變位點)互補雜交的肽核酸PNA與PCR擴增所需的一對上下遊引物和Taqman探針，按照Taq-PNA-PCR條件擴增構建的突變型及野生型耳聾基因質粒或待測樣本，得出擴增曲線。由於肽核酸PNA與野生型耳聾基因結合後將阻斷PCR擴增，不呈現擴增曲線；而？嫩/1)嫩的錯配將使融解溫度發生明顯改變，PNA脫離突變型耳聾基因，呈現擴增曲線，因而通過擴增曲線檢測判斷耳聾基因的突變型。
[0028]與現有技術比較，本發明的優點與顯著效果如下:
[0029]1、克服了目前現有基因突變篩查方法的不足，提供一種簡單、快捷、高效、低成本的適合中國人群的耳聾基因突變篩查方法。
[0030]2、通過檢測來自患者的待測樣本中是否存在耳聾基因常見突變而判斷該患者的耳聾發生原因及類型，進而為臨床診斷尤其是新生兒先天性耳聾和治療提供參考。
[0031]3、本發明方法操作簡便、敏感性高、特異性高，可實時檢測耳聾基因突變量，並用於疾病的早期輔助診斷。
[0032]4、與傳統的PCR相比檢測時間縮短2個小時，且不做溶解曲線分析，更快、更簡單。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1是本發明所述肽核酸PNA色譜圖。
[0034]圖2是本發明所述肽核酸PNA質譜圖。
[0035]圖3是本發明所述質粒標準品基因PCR擴增曲線圖。
[0036]圖4是本發明所述突變型與野生型質粒Taq-PNA-PCR擴增曲線圖。
[0037]圖5是本發明所說構建質粒獲得的突變型耳聾基因質粒測序圖。
[0038]圖6是本發明所說構建質粒獲得的質粒瓊脂糖電泳圖。
[0039]術語解釋:
[0040]Taq-PNA-PCR:本發明命名簡稱，將Taqman探針和肽核酸PNA運用於改進的實時螢光PCR方法中檢測基因突變的檢測步驟。
[0041]PNA:肽核酸，一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物，是丹麥有機化學家Ole Buchardt和生物化學家Peter Nielsen於20世紀80年代開始潛心研究的一種新的核酸序列特異性試劑。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎上，通過計算機設計構建並最終人工合成的第三代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈醯胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了 DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其餘的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick鹼基配對的形式識別並結合DNA或RNA序列，形成穩定的雙螺旋結構。

【具體實施方式】
[0042]結合附圖對本發明做進一步的具體說明。
[0043]一種基於肽核酸PNA鉗制PCR的耳聾突變基因的檢測方法，包括如下步驟:
[0044](I)設計一種與野生型耳聾基因(含突變位點)雜交的肽核酸PNA ；
[0045](2)構建和提取突變型及野生型耳聾基因質粒，計算拷貝數；
[0046](3)採集待測個體的樣本，提取基因組DNA或線粒體DNA ；
[0047](4)設計PCR擴增所需的一對上下遊引物和Taqman探針；
[0048](5)用上述肽核酸PNA對質粒標準品或待測樣本按照改進的PCR反應條件進行檢測，得出擴增曲線；
[0049](6)根據所述擴增曲線對照檢測定性基因突變。
[0050]本發明利用NCBI基因庫獲得耳聾基因4個，其編號分別是GJB2 Gene ID:2706 ；GJB3Gene ID:2707 ；SLC26A4 Gene ID:5172 ;線粒體 DNA Gene ID:4549? 利用 4 個耳聾基因9個突變熱點為檢測對象設計出與耳聾基因野生型(含突變位點)互補雜交的肽核酸PNA序列，即設計出一段跟野生型互補的PNA序列。針對耳聾基因9個突變熱點構建的肽核酸PNA序列，是正德奧生物科技有限公司合成。參見圖1液相色譜圖、圖2質譜圖；其產品報告顯示，PNA名稱19P，批量號:Η)1210195，分子量M.W.4875.7，純度:98%。設計出的PNA序列，包括GJB2基因35delG突變的PNA序列為GJB2基因的20-45位點、S卩35delG位點前15bp至後10bp，其鹼基序列示例如序列表SEQ ID NO:1?SEQ ID NO:4所示；GJB2基因235delC突變的PNA序列為GJB2基因的225-245位點、即235delC位點前1bp至後10bp，其鹼基序列示例如SEQ ID NO:5?SEQ ID NO:7所示;GJB2基因299_300delAT突變的PNA序列為GJB2基因的290-312位點即299_300delAT位點前1bp至後12bp，其鹼基序列示例分別如SEQ ID NO:8?SEQ ID NO:10所示。
[0051]所述SLC26A4 基因 INS7-2A-G 突變的 PNA 序列為 SLC26A4 基因 22811-22835 位點，即INS7-2A-G位點前1bp至後15bp，其鹼基序列示例如SEQ ID NO: 11?SEQ ID NO: 12所示；SLC26A4 基因 2168A-G 突變的 PNA 序列為 SLC26A4 基因 49490-49511 位點，即 2168A-G位點前1bp至後13bp，其鹼基序列示例如SEQ ID NO:13?SEQ ID NO:14所示。
[0052]所述GJB3基因538C-T，547G-A突變位點接近，選用同一 PNA序列；突變的PNA序列為GJB3基因4111-4130位點，即538C-T突變位點前Ilbp至後10bp，其鹼基序列示例如SEQ ID NO: 15 ?SEQ ID NO:16 所示。
[0053]所述MtDNA基因1555A-G突變的PNA序列為MtDNA基因的1549-1570位點即1555A-G突變位點前7bp至後15bp，其鹼基序列示例如SEQ ID NO: 17?SEQ ID NO:18所示；MtDNA基因1494C-T突變的PNA序列MtDNA基因的1484-1511位點即1494C-T突變位點前1bp至後16bp，其鹼基序列示例如SEQ ID NO:19?SEQ ID NO:20所示。
[0054]所述設計PCR擴增所需的一對上下遊引物和Taqman探針，是針對耳聾基因突變位點附近的編碼區，應用在線引物設計軟體Primer5設計PCR擴增所需的一對上下遊引物和檢測所需的Taqman探針，用於PCR反應擴增；具體步驟如下:
[0055]一種用於定性檢測耳聾基因突變的引物，所述GJB2基因突變位點35delG、235delC、299-300delAT均採用第一對擴增引物，產物長度479bp，其鹼基序列如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22 所示:
[0056]上遊引物I Fl: 5』 - TTGGTGAGGTTGTGTAAGAG-3』 (SEQID NO:21)；
[0057]下遊引物Rl:5』-CTTGATGAACTTCCTCTTCTTC-3』 (SEQID NO:22)；
[0058]所述SLC26A4基因突變位點INS7-2A-G採用第二對擴增引物，產物長度295bp，SLC26A4基因突變位點2168A-G採用第三對擴增引物，產物長度295bp，其鹼基序列分別如SEQ ID NO:23 ?SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25 ?SEQ ID NO:26 所示:
[0059]上遊引物I Fl: 5』 - CTCACCATTGTCGTCTGT-3』 (SEQID NO:23)；
[0060]下遊引物R2:5』-CTAAGAGGAACACCACACT-3』 (SEQID NO:24)；
[0061]上遊引物I Fl: 5』 - TGAGCAATGATGCCACTG-3』 (SEQID NO:25)；
[0062]下遊引物R2:5』-ATGGAACCTTGACCCTCTT-3』 (SEQID NO:26)；
[0063]所述GJB3基因突變位點538C-T，547G-A，均採用第四對擴增引物，產物長度295bp，GJB3基因突變位點1555A-G，1494C-T均採用第五對擴增引物，產物長度247bp，其鹼基序列分別如 SEQ ID NO:27 ?SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29 ?SEQ ID NO:30 所示:
[0064]上遊引物I Fl:5』 -AA CGCAGGCAAG AAGCACGGAG-3』 (SEQID NO:27)；
[0065]下遊引物R2:5』-TTGTTATTGCCTGGGTCTGG-3』 (SEQID NO:28)；
[0066]上遊引物I Fl: 5』 - CGTTAGGTCAAGGTGTAGC-3』 (SEQID NO:29)；
[0067]上遊引物I Fl: 5』 - ATGTTACGACTTGTCTCCTC-3』 (SEQID NO:30)；
[0068]上述PCR引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。
[0069]一種用於定性檢測耳聾基因突變的Taqman探針，所述探針用於檢測耳聾基因靶序列的擴增。
[0070]所述GJB2 基因突變位點 35delG、235delC、299_300delAT 均可採用同一 taqman 探針，其喊基序列如SEQ ID NO:31所不:
[0071]序列為:FAM-CATGTCTCCGGTAGGCCACGTGCATGGCCAC-MGB。(SEQIDNO:31)；
[0072]所述SLC26A4基因突變位點INS7_2A_G可採用一個Taqman探針，其鹼基序列如SEQ ID NO:32 所示:
[0073]序列為:FAM-ACCCCCTTGGGATGGATTTAACAATGCCAGC-MGB。(SEQIDNO:32)；
[0074]所述SLC26A4基因突變位點2168A-G可採用一個Taqman探針，其鹼基序列如SEQID NO:33 所示:
[0075]序列為:FAM-CTTGGTTCTGTAGATAGAGATTAGCATGATGGACCG-MGB。(SEQIDNO:33)；
[0076]所述GJB3基因突變位點538C-T，547G-A，均可採用一個Taqman探針，其鹼基序列如 SEQ ID NO:34 所示:
[0077]序列為:FAM-CCTGTGGTGGACCTACCTGTTCAGCCCTCA-MGB。(SEQIDNO:34)；
[0078]所述GJB3基因突變位點1555A-G，1494C-T均可採用一個Taqman探針，其鹼基序列示如SEQ ID NO:35所示:
[0079]序列為:FAM-CCATGAGGTGGCAAGAAATGGGCTACA-MGB。(SEQIDNO:35)。
[0080]上述taqman探針均由上海生物工程技術服務有限公司合成。由於採用PCR-MGB法進行檢測，MGB探針的淬滅基團採用非螢光淬滅基團，本身不產生螢光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB修飾基團，可以將探針的Tm值提高10°C左右。
[0081]針對每個位點的突變分別設計出肽核酸PNA和擴增引物，針對各個目的位點分別進行PCR擴增，通過擴增曲線分析，檢測9個耳聾基因突變。所述與野生型耳聾基因(含突變位點)雜交的肽核酸PNA ;其肽核酸PNA能覆蓋耳聾基因的突變區域，而任一突變均可導致PNA/DNA的錯配，使得融解溫度發生明顯改變，因此在PCR反應中可封閉野生型耳聾基因，阻止野生型耳聾基因擴增；構成肽核酸PNA阻斷PCR擴增法來檢測樣本。
[0082]所述構建和提取突變型及野生型耳聾基因質粒，計算拷貝數；包括利用PCR方法克隆構建含突變型和野生型檢測靶序列的質粒標準品。具體步驟如下:
[0083](I) IPCR反應液配製
[0084]PCR反應體系包括1XTaq緩衝液2 μ I，dNTP混合液200 μ M，引物選用(SEQ IDNO:21)?(SEQ ID NO: 30)中的一對上下遊引物各0.5 μ M，Taq酶1.25u，DNA模板10ng突變和野生型基因，並用無菌雙蒸水定容至20 μ I。設定純水為陰性對照(NTC)；
[0085](2) PCR 反應
[0086]所用儀器為德國Eppendorf公司5331型Thermal Cycler PCR儀。PCR反應條件:94°C預變性4min，94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸30s，共35個循環，72°C延伸1min ；
[0087](3)電泳；
[0088](4)2.0 %瓊脂糖凝膠電泳確定產物正確性，參見圖6質粒瓊脂糖電泳圖；圖6顯示是瓊脂糖電泳鑑定質粒與基因連接產物，其中1、突變型基因PCR產物，2、Marker，3、質粒與突變型基因連接產物，4、質粒；
[0089](5) PCR產物克隆入質粒；
[0090](6)菌株構建；
[0091]將PCR產物純化後，通過T載體連接，構建出攜帶突變和野生檢測靶序列的質粒，此質粒在E.coli DH5a (說明:該大腸桿菌由本實驗室培養所得)進行大量擴增，並抽提純化獲得，測序正確後作為標準品；
[0092]按以下組成配製T載體連接液:包括滅菌蒸餾水2 μ 1、2χ6接緩衝液5 μ 1、F TA2載體50ng/y 1)1μ 1、T4 DNA連接酶I μ 1、PCR產物I μ 1，共10 μ I。將反應液於室溫15?25°C進行30分鐘反應；
[0093](7)製備感受態細胞，並加入上述連接液，用氯化鈣方法轉化大腸桿菌，並進行X-gal和IPTG篩選。具體方法按照見《分子克隆實驗指南》第三版上冊第96-99、103頁步驟操作；
[0094](8)質粒提取；
[0095]挑取篩選所得的白色菌落，加入5ml預先加入氨苄青黴素100mg/ml的LB培養基中，37°C振搖12?16小時。用Tiangen普通質粒小提試劑盒離心柱型提取質粒；
[0096](9)質粒測序；
[0097]質粒測序由invitrogen公司承接，測序結果正確，參見圖5。TA克隆試劑盒(Target Clone)購買於T0T0B0公司。質粒抽提試劑盒購買於TIANGEN公司。圖5是突變型耳聾基因質粒測序圖，是PTA2載體連接突變型基因後測序，結果顯示突變型基因單點C-T突變。
[0098]所述採集待測個體的樣本，提取基因組DNA或線粒體DNA。
[0099]基因組DNA的提取具體步驟如下:
[0100]提取正常血清及耳聾病人血清中的基因組DNA:採用生工Ezup柱式基因組抽提試劑盒(血液)進行抽提。
[0101]血液DNA抽提方法:1、在1.5ml離心管中加入0.05-0.1ml抗凝血液；2、加入0.1-0.15mlPBS Solut1n 使總體積為 0.2ml ;3、加入 0.02mlProteinaseK,混勻；4、再加入0.2mlBufferCL,振蕩混勻，56 °C水浴1min ;5、加入0.2ml無水乙醇，充分顛倒混勻；6、將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2min, 1000rpm室溫離心Imin,棄穿透液；7、把吸附柱放回收集管，向吸附柱加入
0.5mlCfflSolut1n, 1000rpm室溫離心30s,棄穿透液；8、把吸附柱放回收集管，向吸附柱加入0.5mlCW2Solut1n, 1000rpm室溫離心30s,棄穿透液；9、把吸附柱重新放回收集管中，12000rpm室溫離心Imin,去除殘餘的CW2Solut1n ; 10、將吸附柱套入一個新的1.5ml離心管中，在吸附柱的濾膜中部加入0.05mlCEbuffer，然後室溫放置3min ;11、12000rpm室溫離心2min，管底溶液即使DNA溶液,可即行使用或分裝於_20°C保存。
[0102]線粒體DNA基因的提取具體步驟如下:
[0103](I)提取耳聾病人線粒體DNA，採用GENMED線粒體基因抽提試劑盒(血液)進行抽提。
[0104](2)白細胞分離
[0105]室溫預熱GENMED 血溶液(ReagentA),同時 4°C預冷 GENMED 清理液(ReagentB)。分別移取5ml混勻的EDTA抗凝全血樣品至2個50ml離心管,各加入25ml ReagentA,輕輕上下傾倒離心管5次，確保充分混勻，室溫下孵育4min，離心5min，速度300g，去除上清液，餘留0.5ml液體，以防抽掉白細胞顆粒群，用手指輕彈離心管2-3次，使白細胞顆粒群鬆動，分別加入15ml ReagentB，混勻細胞後合為I管，離心5min，速度300g，去除上清液，重複加入1ml預冷的ReagentB，混勻細胞，離心lOmin，速度300g，小心抽去上清液，確保沒有液體殘留。
[0106](3)白細胞線粒體分離
[0107]取5ml ReagentD和5ml ReagentC至15ml維形離心管，混勻，標記為GENMED裂解工作液，放置備用。在白細胞沉澱中加入GENMED裂解工作液，渦旋震蕩5s，冰浴2min，力口入預冷2.5ml GENMED強化液(ReagentE)，渦旋振蕩5s，充分混勻，冰浴5min，加入預冷的5mlGENMED保存液(ReagentF)，離心lOmin，速度lOOOOg，去除上清液，保留沉澱顆粒。
[0108](4) DNA 提取
[0109]加入2.5mlGENMED破膜液(ReagentG)到線粒體顆粒樣品中，渦旋振蕩15s後轉入1.5ml離心管,冰浴15min,加入0.05mIGENMED酵解液(ReagentH),潤旋振蕩15s,離心5s，速度400g，放入58°C恆溫水槽孵育2h，置於室溫冷卻15min，加入2.5mlGENMED萃取液(ReagentI),潤旋振蕩15s,離心5min。速度16000g,取上清至新1.5ml離心管,加入0.5ml濃縮液(ReagentJ)，加入5ml沉澱液(ReagentK)，振蕩15s,充分混勻，離心15min,速度16000g,去除上清液,加入5ml純化液(ReagentL),離心5min,速度16000g,空氣中晾乾沉澱顆粒群，加入5ml緩衝液(ReagentM)，溶解後放進_20°C長期保持或者進行PCR反應。
[0110]所述用上述肽核酸PNA對質粒標準品或待測樣本按照改進的PCR反應條件進行Taq-PNA-PCR檢測，得出擴增曲線；具體步驟如下:
[0111](I) Taq-PNA-PCR 反應
[0112]在實時定量反應中以Taqman探針進行螢光標記，特異性的結合擴增序列，實時反應擴增動態。實驗中PNA能將野生型基因的擴增進行抑制，因此儀器所檢測的螢光量可反應突變基因的拷貝量。
[0113](2)反應體系及反應條件
[0114]突變型耳聾基因檢測反應體系包括:PCR反應體系包括1XTaq緩衝液2 μ 1，dNTP 混合液 200 μ Μ，引物(SEQ IDNO:21)?(SEQ ID NO: 30)中其中一對各 0.5 μ M，Taq 酶1.25u，PNA為(SEQ IDNO:1?20)中相對應突變點的I條0.25 μ M，Taqman探針選用與引物相對應的一條(SEQ IDNO:31)，?(SEQ ID NO: 35) 0.2 μ M，DNA模板為突變型樣品和野生型質粒標準品，並用無菌雙蒸水定容至20 μ I。設定純水為陰性對照(NTC)。
[0115]所用儀器為德國Eppendorf公司5331型Thermal Cycler PCR儀。所述PCR反應條件:941:預變性41^11，941:變性308，701: PNA 結合 lmin，55°C退火 30s，72°C延伸 30s，共35個循環，72°C延伸1min。比已知的PCR過程改進了進一步的PNA的溫度循環。
[0116](3)擴增曲線繪製
[0117]根據上述步驟檢測的結果繪製出的耳聾基因Taq-PNA-PCR擴增曲線。參見圖3。
[0118]圖3為耳聾基因Taq-PNA-PCR擴增曲線，在該圖中，上升的曲線自左向右依次分別代表不同拷貝數的突變型和野生型耳聾基因質粒標準品。圖3中，橫軸指循環數，縱軸指螢光檢測值。
[0119]所述根據所述擴增曲線對照定性基因突變，即選用同一系列稀釋比例的野生型和突變型質粒標準品，兩組都加入PNA (0.25 μ Μ)，在同一條件下進Taq-PNA-PCR反應，反應結束後，根據耳聾基因擴增曲線，對耳聾基因擴增進行突變位點分析。其中，在反應體系中突變型質粒標準品存在擴增曲線，而野生型質粒標準品無擴增曲線，則表明耳聾基因有相關位點突變，以此檢測定性耳聾基因突變。
[0120]PNA鉗制PCR實時定量檢測耳聾基因突變的應用步驟實施例:
[0121](I)標準品配製；
[0122](2)選取耳聾基因突變型質粒和野生型質粒為標準品模板；
[0123](3)模板拷貝數換算:拷貝數=質量/分子量Χ6.02 X 123 ；
[0124](4)分子量計算:MW= (A鹼基數X 312)+ (C鹼基數X 288)+ (G鹼基數X 328)+ (T鹼基數X 303)-61 ;粗略計算一個單鏈DNA分子的分子量=(鹼基數bp) X (325道爾頓/鹼基)或是使用軟體DNAMAN計算；
[0125](5)本實驗合成的質粒為3215bp，WM^ 1044.88Kda，因此Ipg基因拷貝數約為5.76 X 18 ；
[0126]10D260相當於33ug的寡核苷酸。
[0127](6)將突變型模板和野生型DNA模板倍比稀釋為ΙΟ8、ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、102、11UOtl拷貝，作為質粒標準品模板；
[0128]圖4為耳聾基因擴增曲線，不含PNA的擴增，是個陰性對照，在該圖中，上升的四條曲線自左向右依次分別代表稀釋倍比為106、105、104、103、102、11UO0拷貝的突變型和野生型質粒標準品模板。圖1中，橫軸指循環數，縱軸指螢光檢測值。
[0129](7)選用同一系列稀釋比例的野生型和突變型質粒標準品，兩組都加入PNA(0.25 μ M)，在同一條件下進行Taq-PNA-PCR反應，反應結束後，根據耳聾基因擴增曲線，對耳聾基因擴增進行突變位點分析。
[0130]本發明將PNA及實時定量PCR的結合形成Taq-PNA-PCR反應，應用於耳聾基因檢測。耳聾基因可以是從血液、組織、線粒體中提取的基因。由於本發明的PNA能覆蓋耳聾基因突變區域，而任一突變均可導致PNA/DNA的錯配，我們設計一個鹼基的差異，PNA的溫度會差異很多，使得融解溫度發生明顯改變，這樣會完全阻斷Taq-PNA-PCR反應過程。因此只需設計一種針對野生型的ΡΝΑ，進行一次PCR反應，即可將耳聾基因突變型與野生型區分開。從而實現本發明的目的。
[0131]PNA基因序列表
[0132]四川佳沐生物科技有限公司
[0133]〈120〉一種基於肽核酸PNA鉗制PCR的耳聾突變基因的檢測方法
[0134]〈130〉
[0135]1
[0136]〈210〉
[0137]〈211〉
[0138]ΡΝΑ
[0139]〈213〉人工序列
[0140]〈220〉
[0141]〈223〉
[0142]〈400〉
[0143]GJB2
[0144](l)35delG:PNA 序列為 20-45 位點，
[0145]H2N-TTTGTTGACACCCCCCAGGA-C0N2H(SEQ ID NO:1)；
[0146]H2N-TGTTGACACCCCCCAGGA-C0N2H(SEQ ID NO:2)；
[0147]H2N-TGTTGACACCCCCCAGGATC-C0N2H(SEQ ID NO:3)；
[0148]H2N-TTGACACCCCCCAGGATC-C0N2H(SEQ ID NO:4)；
[0149](2)235delC:PNA 序列為 225-245 位點，
[0150]H2N-AGCTGCAGGGCCCATA-C0N2H(SEQ ID NO:5)；
[0151]H2N-CAGCTGCAGGGCCCATA-C0N2H(SEQ ID NO:6)；
[0152]H2N-AGCTGCAGGGCCCATAG-C0N2H(SEQ ID NO:7)；
[0153](3)299-300delAT:PNA 序列為 290-312 位點，
[0154]H2N-TCTTCTTCTCATGTCTCCGG-C0N2H(SEQ ID NO:8)；
[0155]H2N-CTTCTCATGTCTCCGGTA-C0N2H(SEQ ID NO:9)；
[0156]H2N-CTTCTTCTCATGTCTCC-C0N2H(SEQ ID NO:10)；
[0157]SLC26A4:
[0158](I) INS7-2A-G:PNA 序列為 SLC26A4 基因 22811-22835 位點，
[0159]H2N-GTAGCAATTATCGTCTGAAATAAGT-C0N2H(SEQ ID NO:11)；
[0160]H2N-GCAATTATCGTCTGAAATAAGTA-C0N2H(SEQ ID NO:12)；
[0161](2)2168A-G:PNA 序列為 SLC26A4 基因 49490-49511 位點
[0162]H2N-GTATTAGCATCATGGACCGTC-C0N2H(SEQ ID NO:13)；
[0163]H2N-AGCATCATGGACCGTC-C0N2H(SEQ ID NO:14)；
[0164]GJB3:
[0165]538C-T, 547G-A, PNA 序列為 GJB3 基因 4111-4130 位點，
[0166]H2N-TTCTCGGTAGGTGGGCAA-C0N2H(SEQ ID NO:15)；
[0167]H2N-CTCGGTAGGTGGGCAAT-C0N2H(SEQ ID NO:16)；
[0168]MtDNA:
[0169](I) 1555A-G:PNA 序列為 MtDNA 基因 1555A-G 位點 1549-1570，
[0170]H2N-CCTGTTACGACTTGTCTCCTC-C0N2H(SEQ ID NO:17)；
[0171]H2N-CTGTTACGACTTGTCTCCTCT-C0N2H(SEQ ID NO:18)；
[0172](2) 1494C-T:PNA 序列為 MtDNA 基因 1494C-T 位點 1484-1511，
[0173]H2N-GTATACTTGAGGAGGGTGACG-C0N2H(SEQ ID NO:19)；
[0174]H2N-TACTTGAGGAGGGTGACG-C0N2H(SEQ ID NO:20)。
【權利要求】
1.一種基於肽核酸？嫩鉗制？⑶的耳聾突變基因的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)設計一種與野生型耳聾基因(含突變位點)雜交的肽核酸？嫩； (2)構建和提取突變型及野生型耳聾基因質粒，計算拷貝數； (3)採集待測個體的樣本，提取基因組0嫩或線粒體0嫩； (4)設計擴增所需的一對上下遊引物和化聊磯探針；出擴增曲線； (6)根據所述擴增曲線對照檢測定性基因突變。
2.根據權利要求1所述的一種基於肽核酸？嫩鉗制的耳聾突變基因的檢測方法，其特徵在於，利用耳聾基因9個突變熱點為檢測對象，設計與耳聾基因野生型(含突變位點)互補雜交的肽核酸？嫩序列；針對每個位點的突變分別設計出肽核酸？嫩和擴增引物，針對各個目的位點分別進行9(?擴增，通過擴增曲線分析，檢測9個耳聾基因突變。
3.根據權利要求1或2所述的一種基於肽核酸？嫩鉗制的耳聾突變基因的檢測方法，其特徵在於，所述與野生型耳聾基因(含突變位點)雜交的肽核酸？嫩；其肽核酸？嫩能覆蓋耳聾基因的突變區域，而任一突變均可導致？嫩/0嫩的錯配，使得融解溫度發生明顯改變，因此在反應中可封閉野生型耳聾基因，阻止野生型耳聾基因擴增；構成肽核酸？嫩阻斷擴增法來檢測樣本。
4.根據權利要求2所述的一種基於肽核酸？嫩鉗制的耳聾突變基因的檢測方法，其特徵在於，所述針對耳聾基因9個突變熱點構建的肽核酸？嫩序列，包括082基因35(1616突變的？嫩序列為082基因的20-45位點、6^82基因235(161(:突變的？嫩序列為6182基因的225-245位點、082基因299-300(16141突變的？嫩序列為082基因的290-312位點，其鹼基序列分別如卿10勵:1?卿10:4,820 10勵:5?卿10勵:7、卿10勵:8?3即10勵:10所示。
5.根據權利要求2所述的一種基於肽核酸？嫩鉗制的耳聾突變基因的檢測方法，其特徵在於，所述31X26八4基因1^37-24-(}突變的？嫩序列為31X26八4基因22811-22835位點，31X26八4基因2168八4突變的？嫩序列為31X26八4基因49490-49511位點，其鹼基序列分別如3即10勵:11?3即10勵:12,820 10勵:13?3即10勵:14所示。
6.根據權利要求2所述的一種基於肽核酸？嫩鉗制的耳聾突變基因的檢測方法，其特徵在於，所述083基因53801，5476-^突變位點接近，選用同一 ？嫩序列；突變的？嫩序列為6183基因4111-4130位點，其鹼基序列如卿10勵:15?卿10勵:16所示。
7.根據權利要求2所述的一種基於肽核酸？嫩鉗制的耳聾突變基因的檢測方法，其特徵在於，所述紙0嫩基因1555八4突變的？嫩序列為紙0嫩基因的1549-1570位點，1七0嫩基因149401突變的？嫩序列紙0嫩基因的1484-1511位點，其鹼基序列分別如3即10勵:17?3即10勵:18,820 10勵:19?3即10勵:20所示。
8.一種用於定性檢測耳聾基因突變的引物，其特徵在於:所述(^182基因突變位點35(1611235(161(^299-300(161八I均採用第一對擴增引物，其鹼基序列如3即10勵:21,82010勵:22所示。
9.根據權利要求8所述的一種用於定性檢測耳聾基因突變的引物，其特徵在於，所述31X26八4基因突變位點I吧7-2八4採用第二對擴增引物，31X26八4基因突變位點2168八4採用第三對擴增引物，其鹼基序列分別如3即10勵:23?3即10勵:24、820 10勵:25?卿10勵:26所示。
10.根據權利要求8所述的一種用於定性檢測耳聾基因突變的引物，其特徵在於，所述083基因突變位點53801，547(}-八，均採用第四對擴增引物，083基因突變位點1555八4，149401均採用第五對擴增引物，其鹼基序列分別如3即10勵:27?卿10顯:28、卿10 ^0:29 ?3即 10 ^0:30 所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357569SQ201410628251
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月7日 優先權日:2014年11月7日
【發明者】何靜, 李秋蓮 申請人:成都正德奧生物科技有限公司