一種新的人類溶血相關膜蛋白、其編碼序列、製法及用途的製作方法

2023-06-11 00:04:31

專利名稱：一種新的人類溶血相關膜蛋白、其編碼序列、製法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發明涉及人類溶血相關膜蛋白的cDNA序列以及該序列編碼的多肽。本發明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產方法，以及這些多核苷酸和所述多肽的用途。
溶血按症狀發展速度可分為急性溶血和慢性溶血。急性溶血常起病急驟，短期大量溶血可有嚴重的腰背及四肢酸痛，伴頭疼、嘔吐、寒戰，隨後是高熱、面色蒼白和黃疸。這是由於紅細胞大量破壞，其分解產物對肌體的毒性作用所致，更加嚴重者可有周圍循環衰竭。由於溶血產物引起腎小管細胞壞死和管腔阻塞，最後導致急性腎功能衰竭。慢性溶血起病緩慢，症狀輕微，有貧血、黃疸、肝脾腫大三大特徵。慢性溶血患者由於長期的高膽紅素血症可並發膽石症和肝功能損害等表現。
溶血疾病中最常見的是貧血。由於骨髓血細胞的生成能力較大，具有產生正常紅細胞6～8倍代償能力，如紅細胞的壽命縮短、破壞加速，而骨髓造血仍能代償時，可不出現貧血，稱為溶血性疾患。當平均紅細胞壽命期短於15～20d，紅細胞破壞速度遠遠超過骨髓的代償能力，則將出現貧血。
目前溶血性貧血的治療方法大致有下列幾種方法一、腎上腺糖皮質激素。對免疫性貧血有效，也可應用於陣發性睡眠性血紅蛋白尿，對其他類型溶血基本無效。
二、脾切除術。主要適用於異常紅細胞主要在脾破壞者，如遺傳性球形細胞增多症；需較大劑量腎上腺皮質激素維持的自身免疫性溶血性貧血，以及某些類型的血紅蛋白病。
三、免疫抑制劑。如環孢素A、環磷醯胺等，僅對少數免疫性溶血性貧血有效。
四、輸血。雖可暫時改善病人的症狀，但對某些溶血性貧血反可帶來嚴重反應。如自身免疫性溶血性貧血，由於其自身抗體與輸入紅細胞膜上相應抗原可有強陽性反應，而易引起嚴重醫療性貧血；給陣發性睡眠性血紅蛋白尿者輸血有時也可誘發溶血。
然而，多數溶血性貧血目前尚無根治辦法。隨著分子生物學的發展，人們開始從基因和蛋白水平研究紅細胞代謝調控系統。
本發明的hHR具有溶血素III(Hly-III)家族的典型序列。目前發現的該家族成員不下十幾種，但是本發明的hHR還未曾有人報導。
本發明的另一個目的是提供一種新的轉運蛋白家族成員，該蛋白被命名為(hHR)。
本發明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產所述的(hHR)的方法。
本發明還提供了hHR基因序列和多肽的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有(hHR)蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列有至少90％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ IDNO.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.1中從97-753位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離的hHR蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2胺基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本發明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發明的另一方面，提供了一種產生具有hHR蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有hHR蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成hHR蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列有至少90％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成hHR蛋白的重組細胞；
(c)在適合表達hHR蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有hHR蛋白活性的多肽。
在本發明的一個具體實施方案中，本發明的分離的多核苷酸全長為2013個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位於97-753位核苷酸。
在本發明中，「分離的」、「純化的」或「基本純的」DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語「hHR蛋白(或多肽)編碼序列」指編碼具有hHR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中97-753位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQID NO.1序列的編碼框97-753位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO.1中97-753位核苷酸序列同源性低至約90％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列的同源性至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與(HHR)相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，「基本純的」蛋白質或多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語「hHR蛋白多肽」指具有hHR蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與(hHR)相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N術端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括hHR蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度條件下能與hHR DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗hHR多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含hHR多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括hHR多肽的可溶性片段。通常，該片段具有hHR多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供hHR蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然hHR多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
本發明還包括hHR多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用於抑制細胞內hHR的表達。
本發明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有hHR多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼hHR的核酸分子。
本發明還包括檢測hHR核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於hHR多肽的編碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發明還包括對hHR DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於hHR基因產物或片段。較佳地，指那些能與hHR基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制hHR蛋白的分子，也包括那些並不影響hHR蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的hHR基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab＇或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的hHR基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達hHR或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，2013；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，2013；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷hHR功能的抗體以及不影響hHR功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用hHR基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與hHR基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發明的(hHR)核苷酸序列全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按已知方法製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。當然，通過先合成多個小片段，然後再進行連接而獲得序列很長的片段。
在本發明中，hHR的cDNA核苷酸序列是如此獲得的以人睪丸λgt10cDNA文庫(Clontech公司)為模板，用兩對寡核苷酸為引物A15＇-catcatgt ctggctaccg ccg-3＇為正向引物；寡核苷酸A25＇-CCTTTCA GTCAGTTTGG GAGG-3』為反向引物，進行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環，最後72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，發現所得片段長度為七百個鹼基左右。將上述的擴增產物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然後用PCR對缺失子進行快速鑑定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(EpicentreTechnologies)對依次截短的缺失子進行測序，最後獲得全長cDNA序列，共1780bp，詳細序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位於97-753位核苷酸。根據得到的全長cDNA序列推導出hHR的胺基酸序列，共218個胺基酸殘基，其胺基酸序列詳見SEQ ID NO.2。
通過同源檢索發現，本發明的hHR蛋白質序列中具有結果發現hHR的蛋白質序列中具有溶血素3(Hly-III)家族的典型序列。該家組成員都是內膜蛋白，由於該家族中一個從Bacillus cereus中分離出來的具有溶血素活性的蛋白成員而得名。1995年，Baida GE等人一個從Bacillus cereus VKM-B164分離得到的基因已被克隆到大腸桿菌中並被測序，該溶血素又稱為溶血素III。因此，本發明的hHR可能與凝血過程有關，通過對本發明的深入研究，一定能發現它與許多溶血相關疾病的關係，並最終為解決這些問題開拓新的思維與方法。將本發明(hHR)核酸(編碼序列或反義序列)引入細胞，可以提高(hHR)的表達水平或者抑制(hHR)的過度表達。本發明的(hHR)蛋白或其活性多肽片段也可以施用於病人，以治療或減輕因(hHR)缺失、無功能或異常而導致的有關病症。此外，還可以用基於本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預後判斷。
2.PCR產物的測序將上述的擴增產物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprepPlasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然後用PCR對缺失子進行快速鑑定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最後用電腦軟體拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1780bp，詳細序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位於97-753位核苷酸。根據得到的全長cDNA序列推導出hHR的胺基酸序列，共218個胺基酸殘基，其胺基酸序列詳見SEQ ID NO.2。
實施例2結構分析用hHR的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB資料庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR資料庫中用BLAST進行核酸和蛋白同源檢索。結果發現hHR的蛋白質序列中具有溶血素3(Hly-III)家族的典型序列。
本發明的hHR中符合溶血素III(Hly-III)家族保守序列的部分為SALDCVLSSFQMTNETVNIWTHFLPTWYFLWRLLALAGGPGFRAEPYHWPLLVFLLPACLYPFASCCAHTFSSMSPRMRHICYFLDYGALSLYSLGCAFPYAAYSMPASWLHGHLHQFFVPAAALNSFLCTGLSCYSRFLELESPGLSKVLRTGAFAYPFLFDNLPLFYRLGLCWGRGHGCGQEALSTSHGYHLFCALLTGFL(SEQ ID NO 2中從第9-212位)(http//smart.embl-heidelberg.de/smart/show_motifs.pl)。該家組成員都是內膜蛋白，由於該家族中一個從Bacillus cereus中分離出來的具有溶血素活性的蛋白成員而得名。1995年，BaidaGE等人一個從Bacillus cereus VKM-B164分離得到的基因已被克隆到大腸桿菌中並被測序。由該序列推測得到的胺基酸序列含有219個胺基酸殘基，分子量約為24.4kDa.，該溶血素又稱為溶血素III(Biochim Biophys Acta 1995；1264(2)151-4)。因此，本發明的hHR可能與凝血過程有關，通過對本發明的深入研究，一定能發現它與許多臨床病例的關係，並最終為解決這些問題開拓新的思維與方法。
本發明的hHR除了可作為溶血素III(Hly-III)家族一員用於進一步的功能研究，還可用於與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明的hHR還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。針對本發明hHR的抗體，用於篩選具有類似結構域的其他蛋白，或者用於親和純化相關蛋白。
例如，本發明hHR核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高hHR的表達水平或者抑制hHR的過度表達。本發明的hHR蛋白或其活性多肽片段可以施用於病人，以治療或減輕因hHR缺失、無功能或異常而導致的有關病症。此外，還可以用基於本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預後判斷。
實施例3hHR在大腸桿菌中的表達在該實施例中，用對應於編碼hHR的cDNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得hHR的cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5＇寡核苷酸引物序列為5＇-AGAT GGATCCATGT CTGGCTACCG CCGCC-3＇該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點，接之是hHR編碼序列氨基端的部分核苷酸序列；3＇端引物序列為5』-CAGCAAGCTT GTCAGTTTGG GAGGCGAAG A-3』該引物含有HindIII限制性內切酶的酶切位點，一個翻譯終止子和hHR的編碼序列的部分核苷酸序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌複製起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用BamHI和HindIII消化pQE-9載體以及插入片段，隨後將插入片段連接到pQE-9載體並保持開放讀框在細菌RBS起始。隨後用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物並攜帶卡那黴素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，抽提質粒，並測序驗證hHR的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O/N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，接種到大體積培養基中，培養細胞生長至600光密度(OD600)達0.4-0.6時，加入IPTG(「異丙基硫代-β-D-半乳糖苷」)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞3-4小時，隨後離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞並將細胞沉澱溶於6M的鹽酸胍中。澄清後，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的hHR。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫hHR。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉澱蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白。純化後的蛋白質被結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨後用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最後，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然後將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
此外，用常規方法對表達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.2的序列一致。
實施例4hHR在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，用對應於編碼hHR的cDNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得hHR cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5』寡核苷酸引物序列為5＇-AGAT AAGCTTATGT CTGGCTACCG CCGCC-3＇該引物含有HindIII限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是hHR編碼序列的氨基端部分核苷酸序列；3』端引物序列為5』-CAGCGGATCC GTCAGTTTGG GAGGCGAAG-3』該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和hHR的部分核苷酸序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於CHO細胞表達載體pcDNA3(Invitrogen公司)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體複製起點(fl ori)、一個病毒複製起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用BamHI和HindIII消化pcDNA3載體以及插入片段，隨後將插入片段連接到pcDNA3載體。隨後用連接混合物轉化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質粒，並測序驗證hHR的cDNA片段已正確插入了載體。
質粒轉染CHO細胞是採用脂轉染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進行的。轉染48小時後，經2-3周的持續G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達肽轉運蛋白活力。去G418，連續傳代培養；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規方法大量培養上述陽性亞克隆。48小時後，開始收集細胞及上清。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然後以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最後凍幹保存。
此外，用常規方法對表達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.2的序列一致。
實施例5製備抗體將實施例4和5中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體如下。重組蛋白用層析法進行分離後備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，並用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉澱(hHR)基因翻譯產物的能力加以評估。
實例6基因定位發明蛋白的編碼序列還可用於基因定位。例如，通過螢光原位雜交技術(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進行雜交，可以準確地進行染色體定位。該技術可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長至約2000bp或者更長的cDNA。對於該技術，可參見Verma等人，Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數據相關聯。這些遺傳圖譜數據是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳資料庫(可通過Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在網上獲得)。然後，通過連鎖分析來鑑定基因與已定位於同一染色體區域的疾病之間的相關性。
實例7作為微矩陣的底物微矩陣(Microarrays)，又稱DNA晶片。晶片可通過使用噴墨技術及一系列化學方法如射線、化學、熱力學、機械方法等把樣品固定在底物上得到，形成的元件有點狀、條形等等。一塊典型的晶片通常含有一定數量的元件，可通過手工或用適當的儀器設備製備。雜交反應後，洗去未結合的探針，然後用掃描儀來檢測發生雜交反應的元件及反應的程度。探針與每一個晶片元件的互補性和結合量都可通過對掃描出的圖像的分析來判斷。
全長cDNA、EST、或基因片段都可以作為固定於底物上的樣品。適合於雜交的片段可通過用一些著名的生物軟體(如LASERGENE SOFTWARE(DNASTAR))，來選擇。這些全長cDNA、EST、與本發明的核酸序列相關的片斷、或與這項發明有關的cDNA庫中隨機選出的片段被有序的排列於玻璃等載體上。cDNA固著於玻片的方法是紫外線交聯、熱學、化學處理、乾燥(Schena，M.et al.(1995)Science 270467-470；and Shalon，D.et al.(1996)GenomeRes.6639-645.)等。將探針用螢光標記後，再與固著地反應元件雜交。雜交結果可用於推斷基因功能，理解疾病產生的基因基礎，診斷疾病，並可改進及監測藥劑的活性。
本發明的hHR核苷酸序列或其全長片段可作微矩陣的對象，檢測出基因變異、突變及多態現象，從而對相關疾病的診斷治療起輔助作用。
實施例8試劑盒的製備試劑盒1它含有(1)特異性擴增hHR的引物對，和使用說明。該試劑盒還可含有或不含有將mRNA逆轉錄成cDNA的所需試劑。其中，該特異性引物的序列衍生自SEQ ID NO1的序列，長度為15-35。對逆轉錄成的cDNA進行特異性擴增，以檢測樣品中是否含有hHR的核酸序列。該試劑盒還可含有進行PCR反應所需的其他試劑，例如緩衝液等。
試劑盒2該試劑盒含有針對hHR的特異性的抗體(例如實施例5中製備的多克隆抗體，或者用標準的雜交瘤技術產生的抗hHR的單克隆抗體)，和使用說明。該試劑盒用於直接檢測樣品中是否存在hHR蛋白。先通過特異性免疫反應形成免疫複合物，然後用常規技術檢測免疫複合物。
試劑盒3該試劑盒含有可特異性地與hHR的mRNA雜交的探針。它還可含有或不含有雜交緩衝液。該試劑盒通過核酸分子與hHR特異性探針之間的雜交反應來檢測樣品中是否存在hHR的核酸分子。
試劑盒也可用於檢測出基因變異、突變及多態現象，並檢測出一系列與本發明的hHR相關的基因，從而對相關疾病的診斷、治療起輔助作用。
實施例9製成藥物本發明的hHR蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等可作為藥物，用於診斷和治療與溶血有關的疾病等有重要價值的小分子藥物。
本發明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常為約5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、皮下、皮內、或局部給藥。
此外，本發明hHR核酸(編碼序列或反義序列)可以直接引入細胞，以提高hHR的表達水平或者抑制hHR的過度表達。本發明的hHR蛋白或其活性多肽片段可以施用於病人，以治療或減輕因hHR缺失、無功能或異常而導致的有關病症。此外，還可以用基於本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預後判斷。
當本發明的hHR蛋白多肽被用作藥物時，治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重—約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
序列表21012111780212核苷酸213人類220221編碼序列222(97)..(753)2234001cagcagcctt ggactccgcc cgtggagccc tgggcctgtt gacccaccag cttaggagca 60cccaccaagc tctgggtgtt ctgggaagat ggcatc atg tct ggc tac cgc cgc 114Met Ser Gly Tyr Arg Arg15ccc acc agc tcg gct ttg gac tgt gtc ctc agc tcc ttc cag atg acc 162Pro Thr Ser Ser Ala Leu Asp Cys Val Leu Ser Ser Phe Gln Met Thr10 15 20aac gag acg gtc aac atc tgg act cac ttc ctg ccc acc tgg tac ttc 210Asn Glu Thr Val Asn Ile Trp Thr His Phe Leu Pro Thr Trp Tyr Phe25 30 35ctg tgg cgg ctc ctg gcg ctg gcg ggc ggc ccc ggc ttc cgt gcg gag 258Leu Trp Arg Leu Leu Ala Leu Ala Gly Gly Pro Gly Phe Arg Ala Glu40 4550ccg tac cac tgg ccg ctg ctg gtc ttc ctg ctg ccc gcc tgc ctc tac 306Pro Tyr His Trp Pro Leu Leu Val Phe Leu Leu Pro Ala Cys Leu Tyr55 60 65 70ccc ttc gcg tcg tgc tgc gcg cac acc ttc agc tcc atg tcg ccc cgc 354Pro Phe Ala Ser Cys Cys Ala His Thr Phe Ser Ser Met Ser Pro Arg75 80 85atg cgc cac atc tgc tac ttc ctc gac tac ggc gcg ctc agc ctc tac 402Met Arg His Ile Cys Tyr Phe Leu Asp Tyr Gly Ala Leu Ser Leu Tyr90 95 100agt ctg ggc tgc gcc ttc ccc tat gcc gcc tac tcc atg ccg gcc tcc 450Ser Leu Gly Cys Ala Phe Pro Tyr Ala Ala Tyr Ser Met Pro Ala Ser105 110 115tgg ctg cac ggc cac ctg cac cag ttc ttt gtg cct gcc gcc gca ctc 498Trp Leu His Gly His Leu His Gln Phe Phe Val Pro Ala Ala Ala Leu120 125 130aac tcc ttc ctg tgc acc ggc ctc tcc tgc tac tcc cgt ttc ctg gag 546Asn Ser Phe Leu Cys Thr Gly Leu Ser Cys Tyr Ser Arg Phe Leu Glu135 140 145 150ctg gaa agc cct ggg ctc agt aag gtc ctc cgc aca gga gcc ttc gcc 594Leu Glu Ser Pro Gly Leu Ser Lys Val Leu Arg Thr Gly Ala Phe Ala155 160 165tat cca ttc ctg ttc gac aac ctc cca ctc ttt tat cgg ctc ggg ctg 642Tyr Pro Phe Leu Phe Asp Asn Leu Pro Leu Phe Tyr Arg Leu Gly Leu170 175 180tgc tgg ggc agg ggc cac ggc tgt ggg cag gag gcc ctg agc acc agc 690Cys Trp Gly Arg Gly His Gly Cys Gly Gln Glu Ala Leu Ser Thr Ser185 190 195cat ggc tac cat ctc ttc tgc gcg ctg ctc act ggc ttc ctc ttc gcc 738His Gly Tyr His Leu Phe Cys Ala Leu Leu Thr Gly Phe Leu Phe Ala200 205 210tcc caa act gac tga aaggctggca ccaggacgct ttgattacat cggccacagc 793Ser Gln Thr Asp215caccagttat tccacatctg tgcagtgctg ggcacccact tccagctgga ggcagtgctg853gctgatatgg gatcacgcag agcctggctg gccacacagg aacctgccct gggcctggca913ggcacagtgg ccacactggt cttggctgca gctgggaacc tactcattat tgctgctttc973acagccaccc tgcttcgggc ccccagtaca tgccctctgc tgcagggtgg cccactggag 1033gggggtaccc aggccaaaca acagtgaggc cccatccctg accctgtcct ggagggggca 1093gaggccaggc cccagtgctg acgaggagcc cagatttggg cctaatcagg tggggacgca 1153tctcagcctg gaaccaacag gggctgagga gagagggcac aggagagagg gcagagaaga 1213ggaggggtgt ctagggggac tggcagagtg tgagagggac cgtgaggggg ctcttgatgg 1273gagtggaaga agtgctgagg gtctgagagg ggagatgcat gcgtgtccag gctgaagatg 1333cccctatatt ctgtcaaagg ttggcggggg gaggtgttgg ggtcctttca tctggctccg 1393tttctggtgc ttctggaagt ctctgctcag cacagggaag aactaacacg actaacctag 1453gcctaccctg aatgcttctt gctaaccagg ccgagaggcc acacacttgc ccccccatcc 1513ccacaaacca ggtaatgcca gtttgccagc agctatttgc ctatagagat gagtctgtcc 1573tggtcataac tgtgtgctca aggtgtccag gcttttgggg gtgggcctat ctgggtgcat 1633tatggatggt ttggtggatt gaggtgtggg gaggagggtc ctaggctaga gggggtatcc 1693ctagttagac tttgggaagc caccttcaac gttttctgga acaaggcagg tacaaataaa 1753aaaataaaac tttaaaaaaa aaaaaaa2102211218212蛋白質213人類4002Met Ser Gly Tyr Arg Arg Pro Thr Ser Ser Ala Leu Asp Cys Val Leu1510 15Ser Ser Phe Gln Met Thr Asn Glu Thr Val Asn Ile Trp Thr His Phe2025 30Leu Pro Thr Trp Tyr Phe Leu Trp Arg Leu Leu Ala Leu Ala Gly Gly3540 45Pro Gly Phe Arg Ala Glu Pro Tyr His Trp Pro Leu Leu Val Phe Leu50 55 60Leu Pro Ala Cys Leu Tyr Pro Phe Ala Ser Cys Cys Ala His Thr Phe65 70 7580Ser Ser Met Ser Pro Arg Met Arg His Ile Cys Tyr Phe Leu Asp Tyr85 90 95Gly Ala Leu Ser Leu Tyr Ser Leu Gly Cys Ala Phe Pro Tyr Ala Ala100 105 110Tyr Ser Met Pro Ala Ser Trp Leu His Gly His Leu His Gln Phe Phe115 120 125Val Pro Ala Ala Ala Leu Asn Ser Phe Leu Cys Thr Gly Leu Ser Cys130 135 140Tyr Ser Arg Phe Leu Glu Leu Glu Ser Pro Gly Leu Ser Lys Val Leu145 150 155 160Arg Thr Gly Ala Phe Ala Tyr Pro Phe Leu Phe Asp Ash Leu Pro Leu165 170 175Phe Tyr Arg Leu Gly Leu Cys Trp Gly Arg Gly His Gly Cys Gly Gln180 185 190Glu Ala Leu Ser Thr Ser His Gly Tyr His Leu Phe Cys Ala Leu Leu195 200 205Thr Gly Phe Leu Phe Ala Ser Gln Thr Asp210 21權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特徵在於，它包括編碼具有(hHR)蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，該序列具有SEQ ID NO.1中核苷酸97-753位的序列。
4.一種分離的hHR蛋白多肽，其特徵在於，它包括具有SEQ ID NO.2胺基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是真核細胞。
10.一種產生具有hHR蛋白活性的多肽的方法，其特徵在於，該方法包括(a)將編碼具有hHR蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成hHR蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列有至少90％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成hHR蛋白的重組細胞；(c)在適合表達hHR蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有hHR蛋白活性的多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，該序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位。
12.一種能與權利要求4所述的hHR蛋白多肽特異性結合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特徵在於，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發明涉及人類溶血相關膜蛋白(hHR)的cDNA序列以及該序列編碼的多肽。本發明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產方法，以及這些多核苷酸和所述多肽的用途。
文檔編號C07K14/435GK1390935SQ02112270
公開日2003年1月15日 申請日期2002年6月27日 優先權日2002年6月27日
發明者餘龍, 唐麗莎, 郭金虎 申請人:復旦大學