用於乙醇生產的可利用木糖的發酵單胞菌的木糖醇合成突變體的製作方法

2023-06-04 04:07:56 1

專利名稱：用於乙醇生產的可利用木糖的發酵單胞菌的木糖醇合成突變體的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物及基因工程領域。更具體地，開發了一株對葡萄糖-果糖氧化 還原酶基因進行了遺傳修飾的、可利用木糖的發酵單胞菌。該菌株在發酵及乙醇生產期間 木糖代謝中的有害的副產物——木糖醇的產量降低了。
背景技術：
通過微生物來生產乙醇可為化石燃料提供替代的能源來源，因而是目前研究中 的一個重要領域。運動發酵單胞菌是一種可生長在葡萄糖、果糖、及蔗糖上、通過恩杜糖 解途徑將這些糖類代謝為co2和乙醇的產乙醇細菌。儘管野生型菌株不能以木糖為碳源， 但已構造了可生長在這種糖上的重組運動發酵單胞菌菌株(US 5514583，US5712133，W0 95/28476, Feldmann et al. (1992)Appl MicrobiolBiotechnol 38 :354-361, Zhang et al. (1995) Science 267:240-243)。木糖是可水解的木質纖維素原料中主要的戊糖，因此可在發酵中提供充足的、低 廉的可用碳源。已對運動發酵單胞菌改造使其表達木糖代謝所需的四種酶1)木糖異構 酶，催化木糖向木酮糖的轉化；2)木酮糖激酶，將木酮糖磷酸化形成木酮糖5-磷酸；3) 轉酮醇酶及 4)轉酸醇酶(US 5514583，US 6566107 ；Zhang et al. (1995) Science267 240-243)。通過這四種酶的聯合作用以及細胞正常的代謝機制，三分子的木糖被轉化為二 分子的葡萄糖6-磷酸及一分子的甘油醛3-磷酸，隨後在葡萄糖一側的途徑中被轉化為乙 醇和C02(參見

圖1)。儘管已經成功構建了用於木糖代謝的運動發酵單胞菌菌株，但這些菌株不能如利 用葡萄糖那樣，利用木糖生長並產生乙醇。導致利用木糖生長不良的一個因素是產生了 作為木糖代謝副產物的木糖醇(Feldmann et al.同上；Kim et al. (2000)Applied and EnvironmentalMicrobiology 66 :186-193)。木糖醇通過木酮糖激酶被磷酸化，產生木糖醇 5_磷酸，它在細胞中累積並抑制細菌生長。木糖醇的合成也降低了乙醇產量，因為可利用木 糖的重組運動發酵單胞菌菌株不能將木糖醇轉化為乙醇。此外，木糖醇也是木糖異構酶的 潛在抑制劑(Smith etal. (1991) Biochem J. 277 :255_261)，該酶可催化工程菌木糖代謝途 徑中利用木糖的第一個步驟。參見圖2表示木糖醇合成及作用的圖表。尚未確定在體內與木糖醇合成有關的生理途徑及酶。不過，已表明來自野生型 運動發酵單胞菌的無細胞提取物在添加了 NADPH時可還原木糖生成木糖醇(Feldmann et al.，同上)，並且該反應是由NADPH依賴的醛糖還原酶來催化的。也表明了運動發酵
3單胞菌的無細胞提取物可在沒有添加NADPH的情況下將少量的木糖轉化為木糖醇，而且 在這些條件下當還向反應混合物中加入了純化的木糖異構酶時木糖醇產量增加了 3-4倍 (Danielson,2001, University of Colorado MastersThesis)。由於木糖異構酶能夠將木 糖轉化為木酮糖，近來實驗的合理推論是運動發酵單胞菌中的酶——葡萄糖_果糖氧化還 原酶(GF0R)可以利用木糖作為電子供體、木酮糖作為電子接納體來生成木糖醇，這些將在 下文進行更為詳盡的討論。因此，基於體外實驗，在運動發酵單胞菌中至少存在兩條木糖醇 產生途徑，但是它們在生理條件下對木糖醇形成的貢獻程度仍待確定。為了高水平地生產乙醇，在可能導致滲透壓休克的高濃度可發酵碳源中培養運 動發酵單胞菌。當將野生型菌株轉移到含> 200g/L葡萄糖和果糖或者> 360g/L蔗糖的 液體培養基中時，在開始生長前的長時間的延遲期即為滲透壓休克(Loos et al. (1994)J Bacterioll76 =7688-7693)。此外，當將野生型菌株轉移到高濃度的這些糖類中時，向培養 基中添加山梨糖醇可減少延遲期(Wiegert et al. (1996)ArchMicrobiol 166 :32_41，Loos et al同上)。也表明了當在濃縮的葡萄糖與果糖混合物(Loos et al.同上)或者濃縮的蔗糖 溶液(_，Weigert et al同上，Loos et al同上)中培養野生型運動發酵單胞菌時，周質 酶——葡萄糖-果糖氧化還原酶(GF0R)在滲透壓平衡中發揮重要作用。簡而言之，GF0R與 其緊密結合的輔助因子以如圖表1中所示的典型的桌球機制來催化葡萄糖到葡糖酸內酯 的氧化以及後來的果糖到山梨糖醇的還原。在周質空間產生的山梨糖醇逆濃度梯度轉運到 細胞內，在那裡它由於不發生進一步的代謝而累積到很高水平。細胞內高濃度的山梨糖醇 會消除質膜內外的滲透壓差異，恢復滲透壓平衡。當在低濃度蔗糖(< 150g/L)中進行培養時，一株不能產生山梨糖醇的野生型運 動發酵單胞菌的自發突變株可比野生型細胞生產出更高水平的乙醇，但該菌株不能在高濃 度蔗糖中生長(Kirk and Doelle (1993) Biotechnol. Letters 15:985-990)。後來發現該 突變株缺少葡萄糖-果糖氧化還原酶(GF0R)的表達，這使得它不能將任何蔗糖來源的果糖 轉化為多餘的副產物山梨糖醇(Wiegert et al.同上)。也表明可通過向培養基中添加山 梨糖醇的方式來恢復山梨糖醇缺陷的突變株在高濃度蔗糖中的生長(Wiegert et al.，同 上)。因此，當在濃縮的葡萄糖與果糖混合物中或者濃縮的可被宿主細胞轉化酶水解為葡萄 糖與果糖的蔗糖中培養運動發酵單胞菌時，GF0R通過合成山梨糖醇在滲透壓平衡中發揮著 至關重要的作用。
葡萄糖 + GFOR-NADP+ 葡糖酸內酯 + GFOR-NADPH GFOR-NADPH + 果糖 - 山梨糖酵 + GFOR-NADP+圖表 ICN1600850 (A)描述了一株具有失活的GF0R基因從而不能利用木糖的運動發酵單 胞菌突變株，以及使用該菌株來進行乙醇生產。當葡萄糖、果糖和蔗糖用作碳源時，該菌株 中沒有山梨糖醇的產生會導致更高水平的乙醇。在改造後的、利用木糖及葡萄糖混合物(沒有添加蔗糖或果糖)生長的、可利用木 糖的運動發酵單胞菌菌株中降低或消除了葡萄糖-果糖氧化還原酶酶活的效應仍是未知的。對於當在含木糖的培養基上進行培養時能夠產生更多量乙醇的、可利用木糖的運 動發酵單胞菌菌株仍有需求。申請人已經通過確定體內木糖醇產生的主要途徑、並利用基 因失活消除了與其形成有關的酶的活性、進而生成了具有更高乙醇產量的運動發酵單胞菌 菌株，從而解決了該問題。發明概述本發明涉及諸如運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)這樣的發酵單胞菌菌株， 當在存在木糖的情況下進行培養時，其木糖醇產量降低了，而乙醇產量增高了。申請人已 發現在可代謝木糖的運動發酵單胞菌中木糖醇產量主要是由葡萄糖-果糖氧化還原酶 (GF0R)這個酶來介導的。構建了不表達GF0R的遺傳改良菌株(譬如敲除GF0R的突變株)， 發現當利用含有木糖的糖類混合物上培養，木糖醇的產量降低了。當利用存在山梨醇的高 糖混合物培養時，GF0R敲除突變株還可以比表達GF0R的親代菌株消耗更多的木糖並產生 更高濃度的乙醇。此外，GF0R敲除突變株的乙醇產量(消耗每克糖產生的乙醇量)有了顯 著增高。因此，本發明提供了能夠通過在糖類培養基中發酵，利用木糖來生產乙醇的發酵 單胞菌屬的重組微生物，所述微生物含有至少一種可降低葡萄糖_果糖氧化還原酶酶活的 遺傳修飾。本發明包括能夠利用木糖產生乙醇的發酵單胞菌菌株，它由於GF0R基因的遺傳 改造而表現出GF0R活性的降低。任何GF0R活性的降低均在本發明範疇內，包括完全失活 針對GF0R活性的基因和/或完全敲除GF0R酶活的突變。此外，本發明提供了生成GF0R活性有所降低的發酵單胞菌菌株的方法，其包括a)提供能夠在適當條件下利用木糖產生乙醇的重組發酵單胞菌菌株；及b)向(a)中的重組發酵單胞菌菌株引入至少一種遺傳修飾，其中所述修飾可降低 葡萄糖_果糖氧化還原酶活性。附圖、生物保藏及序列描述的簡要說明可通過下述詳細描述、附圖及作為本發明一部分的附加的序列描述來更為充分地 了解本發明。圖1所示的是用於改造運動發酵單胞菌以利用木糖的四種酶(框內)以及使用木 糖進行乙醇生產的生化途徑的示意圖。圖2所示的是改造後木糖途徑的前兩個步驟(框內)、木糖醇合成、木糖醇5-磷酸 形成(一種毒性削弱的中間物)及木糖醇對木糖異構酶的抑制的示意圖。圖3所示的是對轉酮醇酶(A)、轉醛醇酶(B)、木糖異構酶(C)和木酮糖激酶(D) 進行酶測定的策略。圖4所示的是pMODPgaptaltktCm的質粒圖譜。圖5所示的是pMODPgapxylABCm的質粒圖譜。圖6所示的是在用PgapxylAB轉化的T2C、T3C、T4C和T5C譜系中木糖異構酶(XI) 和木酮糖激酶(XK)活性的圖。圖7所示的是在用PgapxylAB轉化的T2C、T3C、T4C和T5C譜系中轉醛醇酶(TAL) 和轉酮醇酶(TKT)活性的圖。圖8所示的是所選擇的適於利用木糖的菌株菌落的％理論乙醇產量及％理論木糖利用圖。圖9所示的是適應利用木糖的菌株在含5%葡萄糖的RM(RMG)中培養50代之前或 之後於含5%木糖(RMX5%)的RM(豐富培養基)上培養70小時時的生長圖。圖10所示的是所選擇的菌株——ZW658與對照菌株——8b相比較，在RM+10%葡 萄糖(RMG10% ) (A、B)及RM+8%木糖(RMX8% ) (C、D)中的生長、葡萄糖或木糖利用及乙醇
與木糖醇產量圖。圖11所示的是所選擇的菌株——ZW658與對照菌株——8b相比較，在不含醋酸鹽 (A、B)或含有 0.6% 醋酸鹽(C、D)的、RM+10% 葡萄糖(RMG10% )及 RM+8% 木糖(RMX8% ) 中的生長、葡萄糖或木糖利用及乙醇與木糖醇產量圖。圖12所示的是在為了對GF0R基因進行插入失活而構建自殺構建體時所製備的質 粒、以及終產物GF0RSp-9ffff的圖譜。圖13所示的是用來構建木糖異構酶表達質粒——pZB 188/Kan-XylA而製備的載 體的圖譜，以及用於該構建體的大腸桿菌木糖異構酶表達盒的圖表(框內)圖14所示的是在存在或者沒有木糖異構酶表達時，具有或者不具有GF0R基因失 活的ZW1菌株的木糖醇與木酮糖產量圖。圖15所示的是利用總計為97g/L木糖+葡萄糖培養沒有(A)或者具有(B)GFOR基 因失活的可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株時，其生長、葡萄糖或木糖利用及乙醇產量圖。圖16所示的是利用總計為188g/L木糖+葡萄糖培養沒有(A)或者具有(B)GFOR 基因失活的可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株時，其生長、葡萄糖或木糖利用及乙醇產量 圖。圖17所示的是在存在不同濃度山梨糖醇時具有GF0R基因失活的、可利用木糖的 運動發酵單胞菌菌株的生長圖。圖18所示的是在沒有(A、B)或存在(C、D)醋酸鹽、利用總計為174g/L木糖+葡 萄糖培養沒有(A、C)或者具有(B、D)GF0R基因失活的可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株 時，其木糖利用、乙醇產量及木糖醇產量圖。圖19所示的是在沒有(A、B)或存在(C、D)醋酸鹽、利用總計為203g/L木糖+葡 萄糖培養沒有(A、C)或者具有(B、D)GF0R基因失活的可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株 時，其木糖利用、乙醇產量及木糖醇產量圖。圖20所示的是在添加了用於增加緩衝能力的碳酸氫鉀的、沒有(A、B)或存在(C、 D)醋酸鹽、利用總計為203g/L木糖+葡萄糖培養沒有(A、C)或者具有(B、D)GF0R基因失 活的可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株時，其木糖利用、乙醇產量及木糖醇產量圖。圖21所示的是在進行可控pH的發酵中，在存在醋酸鹽、利用總計為189g/L木糖 +葡萄糖培養具有GF0R基因失活的可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株時，其木糖與葡萄糖 利用、乙醇產量及木糖醇產量圖。圖22所示的是pZB 188/Kan以及可在運動發酵單胞菌中複製的Cre表達載體pZB 188/kan-Cre的質粒圖譜。圖23A所示的是在可控pH條件下，在含有醋酸鹽的高葡萄糖+木糖中ZW801-4與 ZW800生長的比較。圖23B所示的是ZW801-4相對於ZW800的葡萄糖與木糖利用及乙醇產量圖。
圖24所示的是ZW801-4中翻譯後的突變序列與野生型GF0P蛋白的比對。可通過下述詳細描述以及作為本申請一部分的附加序列描述來更為充分地理解 本發明。下列序列符合37C. F. R. 1. 821-1. 825 (「對含核苷酸序列和/或胺基酸序列事項的 專利申請的要求_序列規則」)，並與世界智慧財產權組織(WIP0)標準ST. 25 (1998)、EP0及 PCT的序列列表要求(規則5. 2及49. 5 (a-bis)、以及行政指導208項與附錄C)相一致。核 苷酸及胺基酸序列數據中所用的符號和格式符合37C. F. R. § 1. 822中給出的規則。在此用光碟來提供序列列表。因此根據37CFR 1. 52 (e)通過參考的方式將含有序 列列表的光碟的內容併入本申請。光碟以一式兩份的形式來提交，彼此間相互一致。光碟 標記為「拷貝1-序列列表」和「拷貝2-序列列表」。光碟含有下列文件CL3604seq list. ST25。SEQ ID N0s:l和2是用於從pZB4中擴增含甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子 (Pgap)的DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 3和4是用於從pZB4中擴增含tal編碼區的DNA片段的引物的核苷 酸序列。SEQ ID NOs 5和6是用於從Pgap及tal片段中擴增含Pgaptal的DNA片段的引物 的核苷酸序列。SEQ ID NOs 7和8是用於從pZB186中擴增含loxP: :Cm的DNA片段的引物的核
苷酸序列。SEQ ID NO :9是pM0DPgaptaltktCm質粒的完整核苷酸序列。SEQ ID NOs 10和11是用於在具有pM0DPgaptaltktCm的轉化子中擴增含tal及 tkt編碼區的3kb DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 12是pM0DPgapxylABCm質粒的完整核苷酸序列。SEQ ID NOs 13 和 14 是用於從具有 pM0DPgapxylABCm 的 T2C、T3C、T4C 及 T5C 整合 子中擴增1.6kb PgapxylA DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 15 和 16 是用於從具有 pM0DPgapxylABCm 的 T2C、T3C、T4C 及 T5C 整合 子中擴增1.3kb xylB DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 17和18是用於從含pgm基因的3，末端部分、ldh基因及adhl基因 的5，末端部分的運動發酵單胞菌W1基因組DNA中擴增2268bp DNA片段的引物的核苷酸 序列。SEQ ID NOs 19和20是用於從pACYC184中擴增四環素抗性盒的引物的核苷酸序 列。SEQ ID NOs 21和22是用於生成loxP位點的寡聚核苷酸序列。SEQ ID NOs 23和24是用於生成loxP位點的寡聚核苷酸序列。SEQ ID NOs 25和26是用於從pHP 15578中擴增Specr盒的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs :27和28是用於從ZW1基因組DNA中擴增3' GF0R側翼DNA的引物 的核苷酸序列。SEQ ID NOs :29和30是用於從ZW1基因組DNA中擴增5' GF0R側翼DNA的引物 的核苷酸序列。
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SEQ ID NO :31 是 pGF0RSp-9ffff 質粒的核苷酸序列。SEQ ID NOs 32和33是用於從pET_24a中擴增Karf-盒的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 34是來源於pZB4的大腸桿菌xylA表達盒的核苷酸序列。SEQ ID NOs 35和36是用於擴增Cre_表達盒的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 37是ZW801-4中被破壞的GF0R編碼區的完整的核苷酸序列(從起始 密碼子到原有的終止密碼子)。EQ ID NO 38是野生型GF0R編碼區的完整的核苷酸序列(從原有的起始密碼子 到原有的終止密碼子)。申請人:根據國際承認的用於專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約將下述 生物學保藏物保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 發明詳述本發明描述了通過修飾內源葡萄糖-果糖氧化還原酶(GF0R)基因進行了改造的 可利用木糖的重組發酵單胞菌菌株，以及製備GF0R被修飾的發酵單胞菌菌株的方法。本文 所述的方法包括任何可消除或減少GF0R酶活性的遺傳修飾，它可在木糖代謝期間導致木 糖醇產量的降低並增加乙醇產量。經遺傳修飾後的、GF0R酶活性降低的、可利用木糖的發 酵單胞菌可用於通過發酵來生產乙醇的方法。通過全新的發酵單胞菌菌株所生產的乙醇可 用作化石燃料的替代能源。下述縮寫及定義將用於闡明本發明及權利要求。「葡萄糖-果糖氧化還原酶〃縮寫為GF0R。RM是豐富培養基。RMG5 % 是 RM+5 % 葡萄糖。RMG10% 是 RM+10% 葡萄糖。RMX8 % 是 RM+8 % 木糖。RMX2 % 是 RM+2 % 木糖。RMX5 % 是 RM+5 % 木糖。RMGX10% 8%是 RM+10%葡萄糖和 8%木糖。RMGX5% 8%是冊+5%葡萄糖和8%木糖。「基因」是指包括編碼序列之前(5』非編碼序列)或之後(3』非編碼序列)的調控 序列在內的可表達特定蛋白的核酸片段。「天然基因」或「野生型基因」是指與其自身調控序 列以天然狀態存在的基因。「嵌合基因」是指任何非天然基因的基因，含有不會同時以天然 狀態存在的調控序列及編碼序列。因此，嵌合基因可含有來自不同來源的調控序列及編碼 序列，或者來自相同來源的調控序列與編碼序列以與天然狀態不同的方式排列在一起。「內
8源基因」是指在生物基因組中位於其天然位置的天然基因。「外源」基因是指在宿主生物中 通常不存在的基因，但是通過轉基因方式導入到宿主生物中。外源基因可包括插入到非天 然生物體內的天然基因，或者嵌合基因。術語「基因構建體」是指編碼用於表達一種或多種特定蛋白的核酸片段。在基因 構建體中，基因在性質上可以是天然的、嵌合的或者外源的。典型地，基因構建體會含有「編 碼序列」。「編碼序列」是指編碼特定胺基酸序列的DNA序列。「啟動子」或「起始控制區」是指能夠控制編碼序列表達的DNA序列或者有功能的 RNA。通常，編碼序列位於啟動子序列的3』端。啟動子可以全部來自天然基因，或者由來自 天然存在的不同啟動子的不同元件組成，或者還可以含有合成的DNA片段。本領域的技術 人員知道在不同的組織或者細胞類群中、或在不同的發育階段、或為了對不同的環境條件 做出應答，可使用不同的啟動子來指導基因表達。在絕大多數細胞類群中可在大部分時間 使基因進行表達的啟動子通常稱之為「組成型啟動子」。本申請中所用術語「表達」是指來源於某個基因的正義(mRNA)或反義RNA的轉錄 及穩定累積。表達也可以指將mRNA翻譯為多肽。「反義抑制」是指產生的反義RNA轉錄物 能夠抑制靶蛋白的表達。「過表達」是指在轉基因生物中基因產物的產量超過了正常的或非 轉化生物中的產量水平。「共抑制」是指正義RNA轉錄物或片段的產生能夠抑制相同的或者 基本上相似的外源或內源基因的表達(U. S. 5，231，020)。本申請中所用術語「信使RNA (mRNA) 」是指沒有內含子並可由細胞翻譯為蛋白的 RNA。本申請中所用術語「非功能基因」是指不表達所編碼蛋白的基因——該基因在野 生型菌株中通常是內源的。可在任何水平上——譬如轉錄、RNA加工或翻譯水平上破壞非 功能基因的表達。典型地，非功能基因極少或者不表達所編碼的蛋白。然而，它仍可編碼比 野生型蛋白具有更低酶活性的修飾蛋白。本申請中所用術語「轉化」是指將核酸片段轉入到宿主生物中，並可穩定遺傳。轉 入的核酸可以是可在宿主細胞中維持的質粒的形式，或者某些轉入的核酸也可以整合到宿 主細胞的基因組中。含有轉化核酸片段的宿主生物被稱為「轉基因」或「重組」或者「轉化」 生物。本申請中所用術語「質粒」及「載體」是指通常攜帶不參與細胞核心代謝的基因的 額外的染色體元件，一般以環狀雙鏈DNA分子的形式存在。這些元件可以是來自任何來源 的自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性或環狀、單鏈或雙鏈DNA或 RNA，其中一些核苷酸序列連接起來或者重構成為獨特的構建體，它可將啟動子片段、產生 所需基因產物的DNA序列以及合適的3』非翻譯序列轉入到細胞中。術語「可操作連接到」是指將核酸序列連接到單個核酸片段上，從而使其中某個的 功能受到另一個的影響。例如，啟動子當能夠影響編碼序列的表達時，它可操作連接到編碼 序列上(即，編碼序列處於啟動子的轉錄控制下)。編碼序列可以正義方向或反義方向可操 作連接到調控序列上。術語「選擇標記」是指某種鑑定因子，通常是能夠根據標記基因的效果——例如對 抗生素的抗性來進行選擇的抗生素或化學抗性基因，其中上述效果用於追蹤目標核酸的遺 傳和/或鑑定繼承了目標核酸的細胞或生物。
術語「基本上消除了」木糖醇產生及「基本上沒有」副產物木糖醇是指使用典型的 實驗室分析所檢測木糖醇的量接近或者近似為0的情形。術語「高濃度的混合糖類」是指在培養基中的總糖濃度能使可利用木糖的運動發 酵單胞菌的GF0R突變株的生長受到抑制。儘管確切濃度會隨培養基中的其它組分有很大 變化，典型地，它高於約100g/L。術語「可發酵的糖」是指在發酵過程中可用作微生物的碳源的寡糖與單糖。術語「木質纖維」是指同時含有木質素及纖維素的組分。木質纖維原料也可含有 半纖維素。術語「纖維質」是指含有纖維素及包括半纖維素在內的其它成分的組分。術語「糖化作用」是指從多糖中產生可發酵的糖類。術語「預處理的生物量」是指在糖化作用前進行過預處理的生物量。「生物量」是指任意的纖維質或木質纖維原料，並包括含有纖維素、優選地進一步 含有半纖維素、木質素、澱粉、多糖和/或單糖的原料。生物量也可以含有其它組分，譬如蛋 白和/或脂類。生物量可以是單一來源，或者生物量可包括來自一種來源以上的混合物； 例如，生物量可以包括玉米棒子及玉米乾草的混合物，或者草及葉子的混合物。生物量包括 單不限定於，生物能源作物、農作物剩餘物、城市生活垃圾、工業固體廢物、來自造紙廠的淤 泥、庭園垃圾、木材及林業垃圾。生物量的實施例，包括但不限定於，玉米粒、玉米棒子、諸 如玉米殼這樣的作物剩餘物、玉米秸稈、草、小麥、小麥杆、大麥、大麥杆、秸稈、水稻杆、柳枝 稷、廢紙、甘蔗渣、高梁、大豆、從磨碎的穀子、樹木、枝條、根、葉片、木片、鋸屑、灌木和矮樹 中獲得的組分、蔬菜、水果、花及動物肥料。「生物量水解產物」是指由生物量糖化作用獲得的產物。生物量也可以在糖化作用 前進行預處理。本文所用的標準重組DNA及分子克隆技術在本領域是周知的，在Sambrook,J. ,Fritsch,E. F. and Maniatis,T. Molecular Cloning :A Laboratory Manual，2nd ed. ；Cold Spring Harbor Laboratory :ColdSpring Harbor，New York， 1989 (在下文 為 『『Maniatis，，)；and bySilhavy, T. J.，Bennan，M. L and Enquist， L. W. Experiments withGene Fusions ；Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor，New York，1984 ；and by Ausubel，F.M. et al.，In Current Protocolsin Molecular Biology, published by Greene Publishing and Wiley-Interscience，1987， 中有描述。本發明涉及增加乙醇生產的、可利用木糖的發酵單胞菌的改造菌株。通過可利用 木糖的運動發酵單胞菌來提高乙醇產量的挑戰在於減少或消除木糖醇的合成，這(a)意味 著不會對碳吸(carbon sink)收造成增值；(b)抑制木糖利用的第一個步驟；及(c)可被磷 酸化成抑制細菌生長的毒性削弱的中間物。申請人已發現內源GF0R酶主要負責體內木糖 醇的合成，通過減少或消除GF0R酶活，可提高從木糖到乙醇的生產(速度、產量及滴度)。可利用木糖的發酵單胞菌宿主菌株任何能夠利用木糖作為碳源的發酵單胞菌菌株均可用作製備本發明菌株的宿主。 發酵單胞菌菌株，譬如已經對木糖發酵成乙醇進行了改造的運動發酵單胞菌是更為有用 的。內源基因可提供部分代謝途徑，或可通過任意已知的遺傳操作技術來進行改變以提供對木糖代謝有用的具有酶活性的蛋白。例如，內源轉酮醇酶可與其它導入的酶活性相互補 產生木糖利用途徑。典型地，如通過參考整合到本申請中的US 5514583所述，將4個基因導 入到運動發酵單胞菌中用來表達參與木糖代謝的4個酶(圖1)。它們包括編碼催化木糖轉 化為木酮糖的木糖異構酶、及將木酮糖磷酸化以形成木酮糖5-磷酸的木酮糖激酶的基因。 此外，戊糖磷酸化途徑中的兩個酶——轉酮醇酶和轉醛醇酶，能將木酮糖5-磷酸轉化為可 將戊糖代謝與糖酵解中恩杜糖解途徑相關聯的中間物，可使木糖代謝為乙醇。編碼這些酶 的DNA序列可從諸如腸道細菌及某些酵母與真菌這樣的能代謝木糖的眾多微生物中的任 一一種來獲得。編碼區的來源包括黃單胞菌(Xanthomonas)、克雷伯氏桿菌(Klebsiella)、 埃希氏菌(Escherichia)、紅細菌(Rhodobacter)、黃桿菌(Flavobacterium)、醋 木幹胃(Acetobacter)、罾 || 木幹胃(Gluconobacter)、卞艮；^ 胃(Rhizobium)、 ± ■木幹胃 (Agrobacterium)、沙門氏菌(Salmonella)、假單胞菌(Pseudomonads)及發酵單胞菌 (Zymomonas)。特別有用的是大腸桿菌的編碼區。編碼DNA序列可操作地連接到諸如運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動 子(GAP啟動子)，及運動發酵單胞菌烯醇化酶啟動子(EN0啟動子)這樣的、可在運動發 酵單胞菌細胞中表達的啟動子上。編碼區可單獨通過啟動子來表達，或者兩個或多個編 碼區連接成一個用同一個啟動子進行表達的操縱子。得到的嵌合基因可導入到發酵單 胞菌中並維持在質粒上，或使用譬如同源重組、定點整合或隨機整合的方式整合到基因 組中。具體所用的可利用木糖的菌株包括CP4(pZB5) (US 5514583)、ATCC31821/pZB5 (US 6566107)、8b(US20030162271 ；Mohagheghi et al.，(2004)Biotechnol. Left. 25 ；321-325) 及ZW658 (在本文中進行描述；保藏，ATTCC#PTA-7858)。也可在本發明過程中使用進行了其它改造以利用不屬於天然底物的、與木糖類似 的其它糖類的發酵單胞菌菌株。在us 5843760中描述了改造後可利用阿拉伯糖的運動發 酵單胞菌菌株的實施例，通過參考的方式併入到本申請中。發現由GF0R進行的木糖醇合成由可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株合成的有害副產物——木糖醇，會降低乙醇 的產量並導致可抑制細菌生長的毒性組分——木糖醇-5-磷酸的形成(參見圖2)。此外， 木糖醇是在改造後木糖利用途徑中的第一個酶——木糖異構酶的有效抑制物，它的合成會 降低細胞代謝木糖的能力。儘管體外實驗已表明在運動發酵單胞菌中至少有兩個木糖醇形 成的途徑(Feldmann et al.同上，Danielson et al.同上)，申請人發現生理產生的大部 分木糖醇是GF0R酶活的結果。如本文所述，現在已發現由在含有木糖的培養基上培養的可 利用木糖(或野生型運動發酵單胞菌的木酮糖合成的衍生物)的運動發酵單胞菌菌株合成 的木糖醇的量在缺少GF0R酶活時明顯降低了。申請人已發現木糖到木酮糖的轉化是體內 GF0R介導的木糖醇產生的先決條件，該反應僅發生在可表達木糖異構酶的運動發酵單胞菌 菌株中。因此，認為改造後可利用木糖生長的運動發酵單胞菌菌株中木糖醇的主要生理性 來源是由GF0R通過圖表II和III中描述的其中一個或兩個反應來合成的。
木糖 +GFOR-NADP+木糖酸 +GFOR-NADPH
GFOR-NADPH + 未酮糖 ^~~ 木糖醇 + GFOR-NADP+
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圖表 II 需注意在兩個圖表中，木酮糖作為GF0R專性的電子接納體，並且該化合物被還原 成木糖醇，作為對比，在已知利用果糖的反應中會產生山梨糖醇(圖表I)。儘管GF0R對葡萄 糖和果糖十分具有特異性，但已表明它也可以使用其它糖類作為電子供體和電子接納體， 雖然相當稀少(Zachariou and Scopes (1986) Journal of Bacteriologyl67 :863_869)。 因此，當將木糖和果糖與純化後的蛋白一起溫育時，可觀察到山梨糖醇的產生，但同使用葡 萄糖的對照反應相比，GF0R酶活約降低了 12倍。在同一篇論文中，表明了木酮糖可以替代 果糖作為電子接納體，該反應生成了如圖表III中所述的木糖醇。然而，使用該底物組合， GF0R的酶活性降低了約14倍。除了這些觀察資料外，還表明當向提供木酮糖來源的反應 混合物中加入純化的木糖異構酶時，從野生型運動發酵單胞菌製備的無細胞提取物能夠從 木糖生成木糖醇(Danielson同上)，因此表明了 GF0R也能夠催化圖表II所述的反應。不 過，無論在活細胞中是否發生了這些GF0R介導的反應、如果發生了它們對體內木糖醇的形 成又有多大程度的影響，在申請人的發現之前仍有待確定。同樣不確定的還有也存在於野 生型運動發酵單胞菌無細胞提取物中的能夠直接將木糖轉化為木糖醇的NADPH依賴的醛 糖還原酶活性(Feldmarm et al.同上)。實際上，沒有一個利用無細胞提取物的實驗關注 過上述關於GF0R與NADPH依賴的醛糖還原酶對體外木糖醇形成的相對貢獻，更不用說在經 過相關條件下的體內實驗了。因此，申請人關於在改造後可利用木糖生長的運動發酵單胞 菌，於生理條件下，在含木糖培養基中主要是由GF0R來負責木糖醇的產生的這個發現是令 人震驚的，不能通過以前的技術進行預測。改變GF0R基因表達對本發明中可利用木糖的發酵單胞菌進行改造，使其GF0R編碼基因的表達降低 或者不表達，從而減少木糖醇的合成。本領域技術人員所知的、任何可減少有功能的酶的 遺傳修飾方法均可用來改變GF0R的表達。方法包括但不限制於，刪除編碼GF0R的基因的 整個基因或其一部分、將一段DNA片段插入到GF0R基因(在啟動子或者編碼區內)中從 而不表達蛋白或者在更低水平進行表達、向GF0R編碼區引入可增加終止密碼子或移碼的 突變從而不表達有功能的蛋白、以及向GF0R編碼區引入一個或多個突變以改變胺基酸從 而表達的是無功能的或者只有較低酶活性的蛋白。此外，可通過表達反義RNA或幹擾RNA 來封閉GF0R的表達，可引入能夠產生共抑制的構建體。本領域技術人員利用編碼GF0R酶 的已知序列(SEQ ID NO :3)可以很容易地實現所有這些方法。在某些修飾過程中，GF0R 編碼序列周圍的DNA序列也是有用的，其可由運動發酵單胞菌完整基因組序列(GenBank Accession#AE008692)中獲得。如本申請實施例3和5中所示，一種特別合適的用來產生遺傳修飾的GF0R菌株的 方法是，使用通過結合有壯觀黴素抗性基因或者其它選擇標記的GF0R側翼DNA序列介導的 同源重組，將選擇標記插入到GF0R編碼區從而不會表達有功能的GF0R酶。此外，選擇標記也可以有位點特異性的重組位點，通過接下來表達相應的位點特異性的重組酶，可在不回 復GF0R基因活性的情況下將抗性基因從GF0R基因上切除。位點特異性重組會留下一個重 組位點，它會破壞GF0R酶的表達。如本領域技術人員所周知，可構建同源重組載體，在切除 選擇標記後同樣可在GF0R基因中產生缺失。優選地，應徹底消除GF0R的表達，不過，GF0R表達的顯著降低也是本發明的體現。 在此情況下，無功能的GF0R基因是指不以正常方式發揮功能，從而低於GF0R酶的正常水 平。某些基因失活的方法可導致仍有某些殘留的低水平表達，譬如共抑制。本文中，修飾的 GF0R菌株是指具有較少或者沒有GF0R酶活性的遺傳修飾菌株。GF0R修飾菌株的生長和乙 醇生成在缺少或者存在其它糖類(「混合糖類」)的情況下，於含木糖的培養基中培養本發 明中GF0R修飾的、可利用木糖的發酵單胞菌。混合糖類含有至少一種除木糖之外的其它糖 類。任何可為發酵單胞菌細胞代謝提供能量來源的糖類、或者任何存在於含有木糖的混合 物中的糖類均可包括在內。希望能夠利用由生物量糖化作用(biomasssaccharification) 產生的糖類培養GF0R修飾的、可利用木糖的運動發酵單胞菌細胞。典型地，例如專利申請 W02004/081185以及共有且共同未決的美國專利申請60/670437中所述那樣，生物量是經 過預處理的，然後如 Lynd，L. R.，et al. (Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2002)66:506-577)所 綜述用糖化作用的酶進行處理。生物量糖化作用產生的糖類，典型地含有木糖與葡萄糖、果 糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖和/或阿拉伯糖的混合物。優選地，混合糖類組分中含有木糖與葡 萄糖，其中也可以有其它糖類。混合物中不同糖類的比例可以有很大差異，典型地，木糖至少為總糖量的約10%。 優選地，木糖為約40%至約60%之間。在糖類中存在由某些生物量譬如甘蔗渣的糖化作用 所產生的果糖，可替代一部分木糖或者葡萄糖，這樣木糖至少佔糖類混合物的約10%。此 外，阿拉伯糖來源於半纖維素，並且是來源於含半纖維素的糖化生物量的混合糖類中的典 型成分。在不屬於GF0R修飾菌株的、可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株不會產生木糖醇 的發酵條件下，本發明中GF0R修飾的可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株可生長並產生與 非GF0R修飾菌株等量的乙醇。例如，在譬如約100g/L的混合糖類、其中葡萄糖與木糖的 比為5 4的低糖培養基中，GF0R修飾的、可利用木糖的運動發酵單胞菌細胞表現得與非 GF0R修飾菌株很相似。為了在發酵時獲得最大的乙醇產量及效率，希望可在含包括木糖在內的高水平糖 類的培養基中培養可利用木糖的產乙醇生物。為了培養本發明的運動發酵單胞菌菌株，可 在培養基中使用高濃度的混合糖類。這樣可以直接使用生物量糖化作用的糖類，或者略加 稀釋後使用，從而減少發酵物體積——這在商業規模的乙醇生產中是很受歡迎的。使用高 糖濃度可產生更高濃度的乙醇。在發酵培養基中混合糖類的濃度典型地為至少約120g/L 直至約300g/L。特別有用的是濃度在約150g/L到約235g/L之間的高濃度混合糖類。在期望生產乙醇的高濃度混合糖類條件下，GF0R修飾的可利用木糖的運動發酵單 胞菌所用的發酵培養基中含有山梨糖醇。申請人驚奇地發現向高混合糖類培養基中添加山 梨糖醇可使GF0R修飾的、可利用木糖的運動發酵單胞菌生長很好，而未加入山梨糖醇的、 GF0R修飾的、可利用木糖的運動發酵單胞菌極少生長或不生長。這與可產生GF0R的菌株明顯相反，後者在延遲期12-36小時後不添加山梨糖醇的情況下能夠適應濃縮的糖類混合 物。在缺少果糖或蔗糖(作為果糖來源)的培養基中，認為GF0R不會合成山梨糖醇或者在 滲透適應中發揮作用。當生長培養基中沒有果糖時，如圖表I所示的GF0R在山梨糖醇合成 中的已知反應無法繼續。具有正常GF0R酶活性的、可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株能夠 在濃縮的葡萄糖和木糖混合物中生長的能力——儘管有一個長的延遲期，表明了通過GF0R 進行的山梨糖醇合成對於滲透適應不是必需的，因為沒有果糖，GF0R不會合成山梨糖醇。因 而在缺少果糖的生長培養基中，消除GF0R酶活性不會對山梨糖醇產生水平有什麼影響，在 濃縮的葡萄糖和木糖混合物中，GF0R修飾的、可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株生長對山 梨糖醇的需求是完全未料到的。在培養基中可含有濃度在約2mM到200mM之間的山梨糖醇(D-山梨糖醇和/或 L-山梨糖醇)。在培養基中更為適合的終濃度為濃度在約2mM到lOOmM之間，濃度在5mM 到20mM之間是優選的。在培養基中也可使用甘露醇來替代山梨糖醇，或與山梨糖醇一起使 用。在通過參考併入本申請的共有且共同未決的美國申請#60/847997中，發現甘露醇具有 與山梨糖醇相似的效應。此外，發現半乳糖醇和/或核糖醇可用來替代山梨糖醇或甘露醇 或者與其一起使用。山梨糖醇、甘露醇、半乳糖醇、核糖醇或其組合均可以以同關於山梨糖 醇的描述中相同的濃度來應用。在不屬於GF0R修飾菌株的、可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株能夠產生木糖醇 的發酵條件下，譬如在存在或缺少諸如乙酸鹽這樣的抑制物的高糖培養基中，本發明的 GF0R修飾的、可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株表現得要優於GF0R未修飾的菌株。申請人 發現所消耗的木糖總量與最終乙醇滴度在GF0R修飾菌株中均大於未修飾的菌株。此外，在 相應處理條件下，GF0R修飾的、可利用木糖的運動發酵單胞菌在發酵中沒有產生木糖醇，盡 管在本文實施例6中所示的特定環境中通過非GF0R機制可能會有少量合成。木糖利用及乙醇生產中的改進在不同的發酵條件下會有所變化。在GF0R未被 修飾的、可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株可產生高水平木糖醇的條件下，缺少木糖醇合 成對GF0R突變體會產生更大影響。例如，當在培養基中存在諸如乙酸鹽這樣的抑制物時， GF0R未修飾的菌株產生了更多量的木糖醇。這種木糖醇的產生可通過GF0R突變來徹底消 除，該突變會使得木糖利用及乙醇產生比在不使用GF0R突變體來產生少量木糖醇的條件 下有更大增加。由於在處理後的纖維質生物量中特別存在乙酸鹽，希望利用來源於處理後 的纖維質生物量的碳源生長的、產乙醇生物對乙酸鹽具有更低的敏感性。因此，當在發酵中 使用生物量水解物時，利用GF0R修飾的、可利用木糖的運動發酵單胞菌菌株進行的發酵會 特別有益。生產乙醇的發酵對於乙醇生產，將重組的GF0R修飾的、可利用木糖的運動發酵單胞菌接種到含包 括木糖在內的混合糖類的培養基上。當混合糖類的濃度高到可抑制生長時，培養基含有山 梨糖醇、甘露醇或其混合物。半乳糖醇或核糖醇可以替代山梨糖醇或甘露糖醇，或與它們組 合使用。在可進行發酵並產生乙醇的培養基上培養運動發酵單胞菌。發酵在無需補充空氣、 氧氣或其它氣體的條件下進行(它包括諸如厭氧、微需氧或者微好氧發酵這樣的條件)至 少約24小時，也可進行30小時或以上。到達最大乙醇產量的時間是不同的，依賴於發酵條 件。典型地，如果在培養基中存在抑制物，則需要有更長的發酵周期。發酵可以在約30°C到約37°C之間的溫度下於約4. 5到約7. 5的pH值下進行。在實驗室規模的發酵中，以及在可產生商品化用量的乙醇的規模放大的發酵中， 可在含包括木糖在內的混合糖類的培養基中培養GF0R修飾的、可利用木糖的運動發酵單 胞菌，當希望獲得商品化產量的乙醇時，可應用不同的培養方法。例如，可通過批式培養及 持續培養方法從GF0R修飾的、可利用木糖的運動發酵單胞菌進行大規模產物的生產。典型 的批式培養法是一個封閉的體系，其中在培養開始時設定好培養基的組分，在培養過程中 不進行人為改變。這樣，在培養過程開始時，將培養基與期望的生物一起溫育，不需向體系 中加入什麼即可進行生長並有代謝活性。不過典型地，「批式」培養根據加入的碳源來分批， 通常嘗試去控制諸如pH及氧濃度這樣的因素。在批式體系中，系統的代謝物及生物量組分 持續改變直至培養結束。在批式培養中細胞平和地通過靜態延遲期到高速生長的對數期， 最終到達生長速率降低或終止的穩定期。如果不經處理，穩定期的細胞終將死亡。在某些 體系中，終產物或中間產物產量中的大多數通常是由對數期的細胞產生的。在其它體系中 可獲得穩定期或者對數後期的產量。標準批式體系的一個變型是補料批式體系。對於GF0R修飾的、可利用木糖的運 動發酵單胞菌，補料批式培養過程也是適用的，它包括一個典型的批式體系，只是在培養過 程中將底物以增量形式加入。當分解代謝抑制會抑制細胞的代謝並且希望培養基中只有 有限量的底物時可使用補料批式體系。在補料批式體系中測定實際底物濃度是困難的， 因此可基於諸如PH以及廢氣例如C02分壓這樣的可測定因素的改變來進行估算。批式及 補料批式培養方法在本領域中是常見的並且是周知的，可在Biotechnology :A Textbook of IndustrialMicrobiology, Crueger, Crueger, and Brock, Second Edition(1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, or Deshpande, Mukund V. , Appl. Biochem. Biotechnol. ,36,227, (1992)中找到示例，此處通過參考的方式併入本申請。商品化的乙醇生產也可通過持續培養來完成。持續培養是開放體系，其中向生物 反應器中持續加入給定的培養基，並同時移走等量的條件培養基。持續培養通常使細胞維 持在一個恆定的高液相密度，其中細胞主要處於對數期生長之中。或者，可通過固定細胞來 實現持續培養，其中持續加入碳源和營養物，並從細胞團中持續移走有價值的產物、副產物 或廢物。可使用許多由本領域技術人員已知的天然和/或合成材料組成的固相支持物來進 行細胞固定。持續或半持續培養允許調節可影響細胞生長或終產物濃度的某個因素或多個因 素。例如，某個方法可以以固定速率來維持，諸如碳源或氮源水平這樣的限制性養分，同時 調整所有其它參數。在其它體系中，當通過培養基濁度來測定的細胞濃度保持恆定時，可持 續改變許多影響生長的因素。持續體系試圖維持穩定狀態的生長條件，從而由於移走培養 基造成的細胞損失與培養基中細胞生長速率是相平衡的。在持續培養過程中調節養分及生 長因素從而使產物形成速率最大化的方法以及技術在工業微生物領域是周知的，Brock,同 上，詳細描述了多種方法。特別適合乙醇生產的發酵形式如下所述。在搖瓶的半複合培養基中，於約30°C 到約37°C以約150rpm的速度在定軌搖床中培養所需的GF0R修飾的、可利用木糖的運動 發酵單胞菌菌株，然後轉移到含有相似培養基的10L種子發酵罐中。在種子發酵罐中無氧 培養種子培養物直至0D_在3到6之間，此時將其轉移到產物發酵罐，在這裡對發酵參數進行優化以生產乙醇。從種子罐中轉入到的產物罐中典型的接種物體積範圍從約2%到約20% ν/ν。典型的發酵培養基含有諸如磷酸鉀(1. 0-10. Og/Ι)、硫酸銨(0-2. Og/Ι)、硫酸鎂 (0-5. Og/Ι)、複合氮源，例如酵母提取物或大豆鹼性產物(0-10g/l)這樣的基本培養基組 分。在培養基中存在終濃度為約5mM的山梨糖醇或甘露醇。將提供碳源的包括木糖及至少 一種其它糖類，譬如葡萄糖(或蔗糖)在內的混合糖類，持續加入到培養罐中彌補最初批次 碳源(50-200g/l)的損耗以最大化乙醇產率及滴度。可動態調節碳源補給速率，以確保培 養物不會過量累積葡萄糖，這會導致諸如乙酸這樣的有毒副產物的增加。為了從所利用的 底物來實現乙醇產量的最大化，生物量生長受批式起始時或發酵過程中加入的磷酸鹽的量 的控制。使用苛性溶液(譬如氫氧化銨、氫氧化鉀或氫氧化鈉)及硫酸或磷酸將PH值控制 在5. 0-6.0。將發酵溫度控制在30°C-35°C。為了使泡沫最小化，如有需要則向罐中加入防 沫劑(任何種類——基於矽樹脂、基於有機物等)。可選擇性地使用諸如卡那黴素這樣的抗 生素——菌株中存在該種抗生素的抗性基因，以使汙染最小化。任何上述條件及本領域技術人員已知的這些條件的其它改變，均是由可利用木糖 的重組發酵單胞菌菌株來生產乙醇的合適條件。實施例本發明通過以下實施例進行進一步詳細說明。應理解這些描述本發明的優選實施 方案的實施例僅起示例性作用。通過以上討論及這些實施例，本領域的技術人員可了解本 發明的基本特徵，而且在不偏離其主旨和範圍的情況下，可對本發明進行各種改變和修改 以使其滿足不同用途和情形。常規方法此處所用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域已知的，在Sambrook，J.， Fritsch,Ε. F. and Maniatis,Τ· ,Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd ed. ,Cold Spring Harbor Laboratory :ColdSpring Harbor, NY(1989)(在下文中為「Maniatis，，)； and by Silhavy, T. J. , Bennan,M. L. and Enquist, L. W. ,Experiments with GeneFusions, Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor, NY(1984) ；and by Ausubel, F. M. et al·,Current Protocols in MolecularBiology,published by Greene Publishing Assoc. and ffiley-Interscience, Hoboken, NJ(1987)中有描述。縮寫的含義如下」kb」是指千鹼基，「bp」是指鹼基對，「nt」是指核苷酸，」hr」是 指小時，「min」是指分鐘，"sec"是指秒，「d」是指天，「L」是指升，「ml」是指毫升，「 μ L」是 指微升，「 μ g」是指微克，「ng」是指納克，「mM」是指毫摩爾，「 μ Μ」是指微摩爾，「nm」是指納 米，「ymol」是指微摩爾，「pmol」是指皮摩爾，「Cm」是指氯黴素，"Cnf 「是指氯黴素抗性， 「Cms」是指氯黴素敏感，「Sf 「是指壯觀黴素抗性，「Sps」是指壯觀黴素敏感，「XI」是木糖異 構酶，「XK」是木酮糖激酶，「TAL」是轉醛醇酶，「TKT」是轉酮醇酶，「EFT」是指經過的發酵時 間，「冊」是指含10g/L酵母提取物及2g/L KH2PO4的豐富培養基，「匪」是指含10g/L酵母提 取物、5g/L 胰蛋白腖、2. 5g/L (NH4)2SO4 和 0. 2g/L KH2PO4 的接合培養基(mating medium)。製備用於酶活測定的發酵單胞菌的無細胞提取物將細胞在50ml RM+2%葡萄糖中，30°C培養過夜至OD6tltl為1. 0-1. 2。於4500rpm， 4°C離心10分鐘收穫細胞。除去上清，並用25ml冰冷的超聲緩衝液(IOmM Tris, pH 7. 6， IOmM MgCl2)洗滌細胞沉澱，然後在4500rpm離心10分鐘。將細胞沉澱重懸在2. 0-2. 5ml補加ImM 二硫蘇糖醇的超聲緩衝液中。以每份500 μ 1的量在Eppendorf離心機中於4°C離心1分鐘。除去大部分上清液，剩餘約10-20 μ 1以防止沉澱乾燥。將細胞冷凍並儲存 在_80°C，以備檢測。在檢測前，將細胞融化，並用500 μ 1補加ImM 二硫蘇糖醇的超聲緩衝 液重懸。將混合物用Branson超聲儀450在62%佔空比(duty cycle)，輸出控制為2的條 件下超聲2次，每次45秒，在兩次超聲之間保持樣品冷凍3-5分鐘。將樣品用Beckman離 心機，於14，000rpm，4°C離心60分鐘。將上清轉移到新管中，並保持在4°C。使用Pierce BCA檢測法測定蛋白濃度。通常首先進行轉酮醇酶(TKT)檢測，因為該酶比其它酶更不穩定。TKT檢測的圖如 圖3A所示。在微孔板檢測中，於30°C下，將20μ 1無細胞提取物加入到各孔中、包含下述組分 的反應混合物中，所述反應混合物包括以下終濃度的組分0. 37mM NADP、50mM TrisHCl pH 7. 5,8. 4mM Mg Cl2,0. ImM TPP (焦磷酸硫胺素氯化物)、0· 6福E4P (赤蘚糖-4-磷酸)、4mM BHP (β羥基丙酮酸)、4U/ml PGI (磷酸葡萄糖異構酶)、及4U/ml G6PD (葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶)。在微孔板讀數儀上讀取A34(i3-5分鐘。TKT活性計算如下1單位相當於在30°C下形成1 μ mol D-果糖_6_磷酸/分鐘。U(微摩爾/分鐘)=斜率(dA340/分鐘)*反應體積(μ L)/6220/0. 55cm(NADP — NADPH的摩爾數是在Icm比色皿中每摩爾每L 6220A340)。(微孔板中每孔200 μ 1 光程長(pathlength) = 0. 55cm)比活性(ymole/min-mg) = μ mole/min/蛋白濃度(mg)轉醛醇酶(TAL)檢測的基礎如圖3B所示。在微孔板檢測中，在30°C下，將20 μ 1 無細胞提取物加入到各孔中、包含下述組分的反應混合物中，所述反應混合物包括以下終 濃度的組分0. 38mMNADH、87mM 三乙醇胺、17mM EDTA、33mM F6P(果糖-6-磷酸)、1. 2mM E4P (赤蘚糖-4-磷酸)、2. OU/ml GDH (甘油-3-磷酸脫氫酶)和20U/ml TPI (丙糖磷酸異 構酶)。將板溫育5分鐘。然後讀取~4(|3-5分鐘。TAL活性計算如下1單位相當於在30°C 下每分鐘形成lymol D-甘油醛。U (微摩爾/分鐘)=斜率(dA340/分鐘)*反應體積(μ L) /6220/0. 55cm(NADH — NAD的摩爾數是在Icm比色皿中每摩爾每L 6220A340)。(微孔板中每孔200μ 1光程長=0. 55cm)比活性(μ mole/min-mg) = μ mole/min/蛋白木糖異構酶(XI)檢測的基礎如圖3C所示。在微孔板檢測中，在30°C下，將20 μ 1 無細胞提取物加入到各孔中、包含下述組分的反應混合物中，所述反應混合物包括以下終 濃度的組分0. 256mMNADH、50mM木糖、IOmM MgSO4、IOmM三乙醇胺和lU/ml SDH (山梨糖醇 脫氫酶)。在微孔板讀數儀上讀取^4(|3-5分鐘。XI活性計算如下1單位相當於在30°C 下每分鐘形成lymol D-木酮糖。U(微摩爾/分鐘)=斜率(dA34(/分鐘)*反應體積 (μ L)/6220/0. 55cm(NADHP — NAD的摩爾數是在Icm比色皿中每摩爾每L 6220A340)。(微孔板中每孔200μ 1光程長=0. 55cm)比活性(μ mole/min-mg) = μ mole/min/蛋白濃度(mg)木酮糖激酶(XK)檢測的基礎如圖3D所示。在微孔板檢測中，在30°C下，將20 μ 1無細胞提取物加入到各孔中、包含下述組分的反應混合物中，所述反應混合物包括以下 終濃度的組分0. 2mM NADH、50mM Tris HCl pH 7. 5,2. Omm MgCl2_6H20、2. OM ATP 0. 2M PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)、8. 5mM D-木酮糖、5U/ml PK (丙酮酸激酶)和5U/ml LDH(乳酸 脫氫酶)。在微孔板讀數儀上讀取A34(i3-5分鐘。XI活性計算如下
1單位相當於在30°C下每分鐘1 μ mol D-木酮糖轉變為D-木酮糖_5_磷酸。U (微摩爾/分鐘)=斜率(dA340/分鐘)*反應體積(μ L) /6220/0. 55cm(NADH — NAD的摩爾數是在Icm比色皿中每摩爾每L 6220A340)。(微孔板中每孔200μ 1光程長=0. 55cm)比活性(ymole/min-mg)= μ mole/min/蛋白濃度(mg)HPLC 方法用Agilent 1100 系列 HPLC 和 Agilent ChemStation 軟體進行 LC3D 分析。柱 子用的是帶有 BioRad Micro-Guard Cartridge Cation-H(125_0129)的 BioRad Aminex HPX-87H(HPLC有機分析柱125-0140)。操作條件如下流速 0. 6mL/min溶劑(XOlNH2SO4停止時間 25min注射體積 5yL自動進樣溫度控制@10°C或4°C柱溫55 °C檢測器折射係數(40°C)使用外部標準校準曲線實施例1構建可發酵木糖的運動發酵單胞菌菌株ZTO58通過一系列轉座事件將兩個包含編碼木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛醇酶和轉酮 醇酶的四個木糖利用基因的操縱子PgapXylAB和Pgaptaltkt整合到ZWl (ATCC#31821)基因組 中，然後在含木糖的選擇培養基上適應而構建ZW658。如美國專利申請20030162271所述， 以前已通過向運動發酵單胞菌5C的基因組進行同源重組及轉座方法而整合了兩個操縱子 PgapxylAxylB和Pen。taltkt及選擇性抗生素標記，然後通過適應和NTG突變構建了命名為8b 的、可發酵木糖的運動發酵單胞菌。在製備ZW658時，使用了轉座(Epicentre' s EZ::Tn 體外轉座系統)，因為該方法相對於位點特異的同源重組的優勢在於，整合位點具有多種選 擇，而且插入頻率相對較高。將編碼木糖利用的酶的四個基因排列並克隆在兩個獨立的操 縱子PgapXylAB和Pyaptaltkt中以用於整合。將抗生素抗性標記——旁側為兩個Pl噬菌體 Cre重組酶識別序列(IoxP)的氯黴素抗性(Cnf)基因克隆到每個操縱子中用於整合子的篩 選。兩個操縱子的整合通過Pgaptaltkt，然後是PyapXylAB的兩步連續方式完成。在兩個整 合事件中均使用Cm抗性選擇，因為它可通過質粒上的Cre重組酶的表達，然後在每次整合 後通過消除質粒而除去。該過程可允許用相同的抗生素標記進行多次篩選。更重要的是， 它允許去除引入的用於篩選整合的操縱子的抗生素標記。該過程消除了抗生素抗性基因對 商用發酵菌株的負面影響。構建用於轉座的PM0DPgaptaltkfCm如美國專利申請20030162271 (本文實施例9)所述，從pUCtaltkt (美國專利申請20030162271)中通過Bglll/Xbal消化分離出2. 2kb含大腸桿菌轉酮醇酶(tkt)編碼區的 DNA 片段，並克隆到用 BamHl/Xbal 消化的 pMOD (Epicentre Biotechnologies,Madison, WI) 載體中，得到pMODtkt。通過將運動發酵單胞菌gap基因的啟動子區(Pgap ；甘油醛-3-磷 酸脫氫酶)與大腸桿菌轉醛醇酶編碼區(tal)進行如下融合而得到命名為Pgaptal的PCR 片段。用描述在US 5514583(實施例3)中的構建體pZB4通過引物SEQ ID NOs :1和2擴 增Pgap片段。pZB4含有Pgap-XylA/XylB操縱子和PEN<rtal/tkt操縱子。tal編碼區片段用 引物SEQ ID NOs 3和4從pZB4擴增。以Pgap和tal片段為模板，通過引物SEQ ID NOs 5 和6擴增Pgaptal片段。該片段用Xbal消化並克隆到質粒pMODtkt的tkt編碼區上遊。用 Cmlox (F, sf i)和 Cmlox (R，sf i)引物(SEQ ID NOs :7 和 8)，以 pZB186 為模板，通過 PCR 產 生IoxP Cm片段。pZB186是運動發酵單胞菌天然質粒和pACYC184的組合，如US514583 (實 施例 3)和 Zhang et al. ((1995) Science 267:240-243)所述。最後，將 loxP::Cm PCR 片 段插入到含Pgaptaltkt的質粒的Sfil位點，形成整合型質粒pM0DPgaptaltktCm(圖4)。在 該質粒中，PgaptaltktloXP: :Cm片段插入到pMOD載體的兩個嵌合末端(轉座酶結合位點)。 pM0DPgaptaltktCm質粒的完整核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示。pM0DPgaptaltktCm 在 ZWl中的轉座和轉化由於質粒pMOD是基於pUC的載體，因此在發酵單胞菌中是非複製型載體。將質粒 PM0DPgaptaltktCm用轉座酶在存在Mg2+時，室溫下處理1小時，並通過電穿孔轉化ZWl細胞 (使用BioRad GenePulser，設置為200ohms，25 μ F和16kV/cm)。將電穿孔的細胞在含IOg/ L酵母提取物、5g/L胰蛋白腖、2. 5g/L (NH4)2SO4^O. 2g/LK2HP04)，並補加50g/L葡萄糖和ImM MgSO4的結合培養基(MM)中，30°C溫育6小時。將轉化混合物塗布在補加50g/L葡萄糖和 120 μ g/mL氯黴素，並含15g/L Bacto瓊脂的匪瓊脂平板上，在30°C厭氧培養。約2天後 可見轉化子。轉化/轉座頻率約為3x107 μ g DNA。共獲得39個Cnf轉化子克隆。挑取21個克隆，並進一步通過PCR和酶活性檢測法 進行分析。用引物SEQ ID NOs 10和11通過PCR驗證在轉化子中確實存在含tal和tkt 編碼區的3kb DNA片段。用來自21個整合子克隆的質粒DNA進行回復轉化，沒有在大腸杆 菌中產生回復轉化子，這表明tal和tkt整合到ZWl的基因組中。用修改的微孔板方法對 這些整合子檢測其轉醛醇酶和轉酮醇酶活性(一般方法)。用Pierce BCA蛋白檢測法測 定蛋白濃度。將轉化子在含2% (w/v)葡萄糖，並補加120 μ g/ml氯黴素的RM培養基，在 50ml錐形離心管中30°C培養。對照菌株8b與ZWl進行同樣培養(ZWl用補加2%葡萄糖的 RM)用於酶活性檢測。當OD6tltl達到1. O時收穫細胞。將細胞洗滌1次並重懸在超聲緩衝液 (IOmM Tris-HCl, pH 7. 6和IOmM MgCl2)中。酶活性檢測如美國專利申請20030162271所 述。單位定義為mole/min-mg。除1株外，所有樣品均具有轉醛醇酶和轉酮醇酶活性。用tkt探針對用Pstl消化的、選擇的整合子基因組和質粒DNA進行Southern雜 交。ZWl DNA不與tkt探針雜交。在所有整合子基因組DNA樣品中可見1條共同的1.5kb 帶，它是tkt的Pstl位點和tal的Pstl位點之間預期的DNA片段。第二個可見的高分子 量(6kb或更大)的帶是獨立株系T2、T3、T4和T5特有的，表明在每個株系中具有獨立的基 因組整合位點。有趣的是，Τ5的質粒和基因組DNA均與tkt探針雜交，表明在Τ5的天然質 粒中也整合了 Pgaptaltkt。選擇這4個菌株(T2、T3、T4和T5)進行進一步的Cre處理，以 除去Cnf標記。Cre處理以從tal tkt整合子中除去Cnf標記
為了從染色體中除去Cnf，用pZB 188/Spec-Cre轉化T2、T3、T4和T5。該質粒是 發酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體 pZB188 [Zhang et al. (1995) Science 267 240-243 ；US 5514583]的衍生物，其包含Cre重組酶表達盒。除了用壯觀黴素抗性基因代替卡那黴素抗 性基因，pZB188/Spec-Cre與實施例10中描述的Cre表達載體(pZB188/Kan_Cre)相同。在 含2%葡萄糖和200 μ g/ml壯觀黴素的MM瓊脂培養基上篩選轉化子。將Splr抗性克隆挑取 到補加2%葡萄糖和200 μ g/ml壯觀黴素的RM瓊脂平板上，RM瓊脂平板補加2%葡萄糖和 120 μ g/mL Cm。挑取的克隆100%是Cms，這表明通過Cre高效去除Cnf。將SplrCms轉化子培 養在補加2%葡萄糖的RM中，37°C進行2到5次轉移，以去除pZB188aadACreF。在每次轉 移中，將細胞稀釋並鋪在補加2%葡萄糖的RM瓊脂平板上，以挑取到有或無200μ g/ml Sp 的相同培養基的其它平板上。通過PCR分析Sps克隆，以確定pZBlSSaadACreF丟失。消除 質粒的整合子後代命名為T2C、T3C、T4C和T5C。為了檢測這些轉座整合子是否是穩定的， 將這4個菌株培養在補加2%葡萄糖的RM中，然後轉移到IOml相同培養基中，37°C平行培 養2個檢測管。將細胞每天進行轉移，共進行10天，或約100代。在第1次和第10次轉移 後將克隆稀釋並鋪在RMG平板上進行克隆分離。共12個來自每個菌株每次轉移的克隆通 過5' Pgap和3' tkt引物(SEQ ID NOs 1和11)進行的檢測Pgaptaltkt存在的克隆PCR檢 測為陽性。也檢測了第1次和第10次轉移後的分離株的轉醛醇酶和轉酮醇酶活性(如一 般方法所述)。所有這4個整合子在非選擇性培養基中轉移100代後均具有相似的TAL和 TKT活性水平，這表明這些整合子是遺傳穩定的。 構建用於轉座的pM0DPgapxylABCm下一步是進一步將PgapxyIABloxP Cm操縱子整合到ZWl Pgaptaltkt整合 子(T2C、T3C、T4C和T5C)中。基於質粒pMODPgaptaltktCm(圖4)構建整合型質粒 pM0DPgapxylABCm(圖5)。通過Sacl/Sfil消化除去PgaptaltktDNA片段。通過連接引入含 Sacl、Notl和Sfil限制性位點的接頭片段。然後將從pZB4(US 5514583)分離的PgapXylAB 的Notl片段克隆到接頭的Notl位點。木糖異構酶(XI)由xylA編碼，木酮糖激酶(XK)由 xylB編碼。pM0DPgapxylABCm質粒的完整序列如SEQ ID N0:12所示。pM0DPgapxyIABCm 在 T2C、T3C、T4C 和 T5C 中的轉座和轉化通過與PgaptaltktCm整合相似的方法，用轉座酶處理的pM0DPgapXylABCm(如上所 述)轉化/轉座T2C、T3C、T4C和T5C。在2次轉化/轉座實驗中通過Cm篩選後獲得6個 整合子(T3CCmXl、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmXl、T5CCmXl、T5CCmX2)。所有整合子均通過 PCR 用兩組引物SEQ ID NOs :13和14及SEQ IDNOs 15和16驗證xylAB的存在，除了 T2CcmXl 和T2CcmX6用引物SEQ ID NOs 13和14沒有檢測到PCR片段。對包括2個PCR陰性的株系在內的整合子均檢測XI、XK、TAL和TKT活性(一般方 法)。如圖6和7所示的結果表明，6個xylAB整合子T3CCmXl、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmXl、 T5CCmXl和T5CCmX2均具有XI、XK、TAL和TKT活性。與陰性親本對照(圖6)相比較，XI禾口 XK活性是新獲得的。TAL和TKT活性維持在親本對照水平。所有這些結果表明產生了蛋白 並具有功能。酶活性水平具有差異，TI和XK活性與用相同質粒轉化/轉座的ZWl的整合 子的活性相似。XI、XK、TAL和TKT的活性水平比菌株8b的活性低。通過Southern雜交驗證xylAB操縱子的整合。將6個株系的基因組和質粒DNA 用Sphl消化，並與地高辛標記的xylB探針雜交。在所有基因組DNA樣品中均存在一條約3kb的共同條帶，它是由xylB的Sphl位點和pMOD載體臨近克隆位點的另一個Sphl位點 產生的，另外，基因組DNA樣品中更高分子量的雜交帶表明PgapXylAB操縱子在染色體上有 4個整合位點。T3CCmXl和T3CCmX2具有相同的整合位點，T3CCmX3和T4CCmXl可能具有相 同的整合位點，T5CCmXl和T5CCmX2每個具有單獨的整合位點。用PstI消化相同的DNA，然 後用tkt探針進行Southern雜交，表明每個整合子均具有與其各自親本相同的雜交模式。Zffl :PgaptaltktPgapxylAB Cm整合子在木糖培養基上的適應 儘管存在所有四種木糖利用的酶活性，但以前的觀察(美國專利申請 20030162271)表明整合子可能不立即在木糖上生長。在木糖上的生長可通過在木糖培養基 (或者在試管中，或者在平板上)上延長培養而發生，這個過程稱為適應。將菌株進行如下適應。將ZWl::PgaptaltktPgapXylABCm整合子菌株接種到含 RMX(含 10g/l 酵母提取物、2g/l KH2P04、20g/l 或2% (w/v)木糖)及RMGX(含有0. 025% (w/ ν)葡萄糖和4% (w/v)木糖的)的試管或平板上。低水平的葡萄糖用於支持最初的生長，以 增加在適應中的突變機會。在至少5次培養基和平板的木糖適應試驗中有1次是成功的。 在30°C厭氧培養10天後，用T3CCmXl和T3CCmX2細胞鋪板的MMGX上分別可見17和19個克 隆。克隆在平板上較小，而且看起來不健康(透明)。將12個克隆(4個來自T3CCmXl平板 T3CCmXll、T3CCmX12、T3CCmX13 和 T3CCmX110 ；8 個來自 T3CCmX2 平板T3CCmX24、T3CCmX25、 T3CCmX26、T3CCmX27、T3CCmX28、T3CCmX29、T3CCmX211 和 T3CCmX212)接種到 RMGCml20 中， 並轉移到3ml RMX中進行進一步適應，以獲得能在木糖上快速生長的株系。在含3ml RMX的試管中的整合子的適應在30°C進行。不斷用Spectronic 601分 光光度計監測OD6tltl。當達到中期生長階段(mid-logphase)時，將培養物轉移到新鮮RMX試 管中。該過程進行7次轉移。在轉移後生長速度和最終ODs (非線性讀數)均有提高。在第6次轉移時，將培養物在RMX平板上劃線以分離單克隆。有3個整合子 T3CCmX13、T3CCmX26和T3CCmX27在RMX劃線平板上長的比其它更快，它們在表中和以下討 論中被稱為X13、X26和X27。為了篩選最好的木糖生長株，分別將TX13、X26和Χ27的4個 大(L1-4)和4個小(S1-4)克隆在RMX試管中篩選和培養，對其生長、糖利用和乙醇的產生 進行監測。將克隆在30°C培養過夜，然後接種0D_ = 0.05到2個3ml RMX試管中。X27在 RMG中比其它培養物生長更慢，因此在6. 5小時後再次接種。69小時(對X27為62. 5小時) 後，對樣品進行HPLC分析(一般方法)。圖8列出培養物在69小時(對所有X27培養物為 62. 5小時)後培養物的平均乙醇產量(理論產量的％)和木糖利用(％)。大克隆和小克隆 之間沒有顯著差異。雖然X27在木糖上的性能比X26好，但它在葡萄糖上生長更慢。因此， 選擇最好的株系X13(X13L3)和X26(X26L1)的大克隆在pH控制的發酵中進行進一步評估。 在37°C，在RMG(6%葡萄糖)、RMX(6%木糖)和RMGX(8% 4%;葡萄糖木糖)中對菌株 X13L3和X26L1及對照菌株8b進行發酵。生長在RMG(6%)和RMGX(8% 4% )中的X13L3 和X26L1對葡萄糖的發酵進行的較快。X13L3和X26L1在RMGX(8% 4%)中對木糖的發酵 均比菌株8b更慢。另外，在37°C，在RMX(6% )中，X13L3和X26L1的生長均發生長時間延遲。 在冊乂(6%)發酵中有幾個分離株乂1313 413(3和乂13 1^發生回復。對這些分離株和原始菌株 X13a(X13L3的分離株)如本實施例前述進行Cre處理，以從ZWl :PgaptaltktPgapxylABCm菌 株中除去Cnf標記。得到的Cre處理的無Cnf的整合子命名為X13aC、X13bC、X13cC、X13FLC 和X26C。整合子通過在RMX(5% )中，37°C的系列轉移而在木糖培養基中的適應
如前所述，最初ZWl: :PgaptaltktPgapxylABCm菌株在RMX中，在30°C的適應極大提 高了菌株在這些條件下的生長。但適應的菌株在RMX(6%)中，在37°C生長和發酵時有長時 間延遲。為了進一步提高整合子在包括更高糖濃度和溫度的優選過程條件下的木糖發酵， 在RMX(5%)中，在37°C繼續進行演化或適應過程。進行系列轉移並篩選生長株。在本過程 中所用的整合子包括X13aC、X13bC、X13cC、X26C和X13FLC。這5個菌株在轉移到RMX (5 % ) 中，在37°C進行另外5到16次轉移前，在RMX中30°C培養並進行6次轉移。在所有轉移中 和轉移後，將培養物在RMX平板上劃線，並在37°C培養以分離單克隆。將大克隆在RMX平板 上進一步劃線3到4次，並在37°C培養，以純化克隆。最後將大克隆在RMX(5% )，37°C培養 進行篩選。對來自RMX (5% )培養基，37°C適應的菌株的評估 最初將系列轉移後適應的18個分離克隆在RMX(5% )試管中，在37°C進行檢測。 選擇12個菌株進行第二次試管評估。在所有評估中均包括菌株8b進行比較。將18個克 隆在RMG中，37°C培養過夜，離心，並將細胞接種到4ml RMX(5% )中，37°C，在試管中靜置培 養以進行第一次評估。基於生長((0D_，非線性)和終點HPLC結果(低殘留木糖和高產量 乙醇)，篩選12個菌株進行第二次評估。第二次評估的目標之一是檢測這些菌株在木糖上生長和木糖利用能力的穩定性。 所有這12個菌株均進行穩定性研究，以檢測適應的菌株是否在非選擇培養基上在37°C系 列轉移50代後是穩定的。將RMG(5%)轉移前後的培養物接種到RMX(5% )試管中，37°C 培養進行評估。通過在Spectronic 601分光光度計直接讀取試管來監測非線性ODs。在 RMG培養50代前和後在RMX (5 % )中第70個小時生長的ODs描繪在圖9中。結果表明多 數菌株在RMG中37°C培養50代後仍是穩定的。也通過HPLC分析終點(靜止期)上清的木 糖和乙醇濃度。在這些培養物中的低殘留木糖和高乙醇濃度支持菌株在木糖上很好生長和 發酵的事實。基於以上試管評估結果(低殘留木糖，高乙醇濃度和更高0D)和以下通過高濃度 葡萄糖和/或木糖(大於20% )及葡萄糖和木糖與乙酸鹽的混合物的微滴定板生長篩選 在高糖和有乙酸鹽時生長更好的菌株，例如命名為ZW658的菌株#26，它具有最好的綜合性 能。實施例2^h 37°CX寸用提高Jl多的If株的發Hi平估以下實施例描述木糖利用提高的發酵單胞菌菌株ZW658在模擬預期的生物量水 解產物的糖濃度和乙酸鹽水平的發酵條件下的發酵性能。將菌株ZW658接種到含分別補加 10%葡萄糖(RMG10% )、8%木糖(RMX8% )、10%葡萄糖木糖(RMGX10% 8% )和 10% 葡萄糖+8%木糖+0.6%乙酸鹽(RMGXAc 10% 8% 0.6% )的RM培養基的發酵罐中。所有 的發酵在含300ml培養基的Sixfors中，150rpm，pH5. 5，37°C進行。對發酵罐中的培養基 過夜排除氮氣，並在接種前停止。在發酵時不排除氮氣。用於發酵的接種物是通過將工作 儲液在RMG5%中復甦後，用RMGX(10%，4%)，在燒瓶中(150rpm) 37°C培養而製備的。菌株 8b在相同條件下作為對照。如圖10所示，ZW658與8b相比較，在RMGlO%中長的更慢(A 和B)，在RMX8%中與8b生長的速率相同(C和D)。儘管生長速度較慢，但圖10表明ZW658 的乙醇產量(93% )與8b在葡萄糖培養基的終點發酵時相同。在RMX8%培養基中，ZW658的乙醇產量(0. 46g乙醇/g糖)高於8b (0. 44g乙醇/g糖)。在RMX8 %中，ZW658比8b多 產生4g/l乙醇。有趣的是，在RMX8%的發酵終點，ZW658不產生任何木糖醇，而8b產生低 水平木糖醇(0. 7g/l)。如圖11的數據表明ZW658比8b在發酵含(C、D)和不含(A、B)乙 酸鹽(acetate)的10%葡萄糖+8%木糖中發酵的更好，具有更多的葡萄糖和木糖消耗、更 少的木糖醇產量和更多的乙醇產量。對兩個菌株在RMG10% X8%中，37°C，pH5.5時，在發 酵終點大部分葡萄糖均被利用，而大部分木糖仍殘留，儘管ZW658比8b多利用了約8g/l木 糖。在RMG10% X8%中，37°C，pH5. 5發酵，在發酵終點ZW658的木糖醇產量(4. 9g/l)顯著 低於8b(8.2g/l)。在存在乙酸鹽(6g/l)時，兩個菌株的細胞生長均顯著降低，從而在葡萄 糖和木糖中均表現出較差的發酵性能，雖然ZW658在更多的葡萄糖和木糖消耗、更少的木 糖醇產量和更多的乙醇產量上表現出略好的發酵性能。不象在RMX8%中一樣，兩個菌株在 有或無乙酸鹽的RMGlO % X8%中均產生副產物木糖醇，雖然與8b相比較，ZW658產生更少 的木糖醇。兩個菌株的發酵性能總結在表1中。總的來說，ZW658比8b在純的糖發酵中表 現更好。如實施例1所述，ZW658沒有抗生素選擇標記，這對商業應用的發酵微生物是一個 有價值的特性。 表1. ZW658和8b乙醇產生的發酵性能總結.
8b (GIuXyIAc) 0.46 0.67 48 136 ZW658 (Glu Xyl Ac)_047_1 4_50_90CPI是細胞產率係數g乙醇/g細胞乾重實施例3製備自殺型構建體用於在ZWl和ZTO58中進行葡萄糖_果糖氧化還原酶(GFOR) 基因的插入失活用於在ZWl和ZW658中敲除編碼葡萄糖-果糖氧化還原酶基因的自殺型構建 體(〃 GF0RSp-9ffff")來源於另一個以前通過宿主介導的雙交換同源重組，並以壯觀黴 素抗性為選擇性標記對運動發酵單胞菌D-乳酸脫氫酶基因插入失活的自殺型構建體 (「pLDHSp-9ffff〃)。pLDHSp-9ffff也來源於多種以前產生的構建體。下面對所有這些構建 體的最初前體是質粒載體pNEB193(NEB#N3051S ；New EnglandBiolabs)。選擇該質粒是因 為它可在大腸桿菌中複製，但不能在運動發酵單胞菌中複製。所有參與產生GFOR敲除構建 體的步驟和中間體從質粒PNEB193開始按時間順序進行描述。pLDH193 的構建將pNEB 193用Sbfl和Ascl雙消化，用於插入到如下所述的DNA片段中。這兩個限制性位點是唯一的，位於質粒的多克隆區。用Qiagen' s QIAQuick純化試劑盒(貨號 #28104)根據說明書純化Sbfl/Ascl-線性化的pNEB193質粒DNA片段。克隆到pNEB193中 的DNA片段是從用Qiagen' s Blood & Cell Culture Maxi試劑盒(貨號#13362)分離的 菌株ZW1的運動發酵單胞菌基因組DNA通過PCR擴增獲得的長2268bp的片段。用於該片 段PCR擴增的合成寡核苷酸是引物1和2 引物 1(SEQ ID NO :17)CTACTCATTTcctRcaRRTGGTAACTCATTGCGCGCTC引物 2(SEQ ID NO :18)CATCTTACTrrcrcrccAAAAATCTGCGGCTGACATAC引物1 (正向引物)的下劃線鹼基與GenBank登錄號AE008692的核苷酸 1262739-1262720在編碼磷酸甘油酸變位酶(pgm)的開放閱讀框的3』末端雜交，而小寫字 母對應於添加到引物5』末端的Sbfl位點。引物2(反向引物)的下劃線鹼基與GenBank 登錄號AE008692的核苷酸1260490-1260472雜交，其正處於編碼乙醇脫氫酶(adhl)的開 放閱讀框的上遊，而小寫字母對應於添加到引物5』末端的Ascl位點。因此，作為PCR擴增 靶的2268bp DNA片段由以下元件組成，起始於Sbfl位點，終止於Ascl位點(a)pgm基因 3』末端；(b)編碼D-乳酸脫氫酶的完整的ldh基因，和(c)adhl基因的5』非編碼區。用 Sbfl和Ascl切割PCR產物，將得到的DNA片段連接到前述Sbfl/Ascl-線性化的pNEB 193 載體中。用連接反應混合物轉化大腸桿菌JM 110，並將轉化的細胞塗布在含氨苄青黴素 (100ug/ml)的LB培養基上。最初用重懸克隆和引物1和2通過PCR( 「克隆PCR」)來鑑 定含具有正確大小插入的質粒的氨苄青黴素抗性轉化子。然後用Sbfl和Ascl限制性消化 分析來驗證陽性克隆，並對用氨苄青黴素抗性轉化子進行克隆PCR產生的2268bp片段進行 DNA序列分析。選擇進行進一步操作的質粒以下命名為PLDH193。pLDHTcl39#7 的構建質粒pLDH193具有唯一的Ncol位點，臨近於ldh開放閱讀框的中部。該位點 用於插入賦予四環素抗性的DNA片段。本操作所用的四環素抗性盒(IV-盒)以質粒 pACYC 184 (GenBank登錄號X06403)為DNA模板，引物3和4為PCR引物，通過PCR產生。引物 3(SEQ ID N0 :19)ACTCATTTccatRRCGATCGCACTATRCRRccRcAATGTAGCACCTGAAGTCAGCC引物 4(SEQ ID NO :20)ATCTCACTccatRRCCGGCCAACTAttaattaaGAATTGATTGGCTCCAATTCTTG引物3(正向引物)的粗體下劃線鹼基與四環素抗性基因上遊雜交。引物3的5』 末端也具有3個限制性位點(Ncol、AsiSl和Notl)。Ncol位點是小寫字母。AsiSl位點 是細下劃線。Notl位點是斜體小寫字母。引物4(反向引物)的粗體下劃線鹼基與四環素 抗性基因終止密碼子下遊雜交，該引物也具有添加到其5』末端的3個限制性位點(Ncol、 Fsel和Pacl)。與上面標記相同，Ncol位點是小寫字母，Fsel位點是細下劃線，Pad位點 是斜體小寫字母。用Ncol切割通過引物3和4產生的1448bp的IV-盒，並通過製備型凝 膠電泳進行純化。然後將得到的DNA片段連接到質粒PLDH193的ldh開放閱讀框的唯一的 Ncol位點中。為了使沒有插入片段的載體的自環化可能性最小，在連接前將Ncol-消化的 PNEB193用小牛腸鹼性磷酸酶進行去磷酸化。將連接反應混合物引入到大腸桿菌JM110中，並將轉化的細胞塗布含20ii g/ml四環素的LB平板。用Ncol、AsiSl、Notl、Fsel和Pacl限 制性消化分析來鑑定含具有正確大小插入的質粒的四環素抗性轉化子，並用合適的引物通 過PCR分析來驗證IV-盒的方向。篩選進行進一步操作的質粒(pLDHTc 139#7)的環狀圖 譜如圖12所示。在此處未描述的實驗中，該自殺型構建體用於在ZW1中通過宿主介導的、雙 交換同源重組，並在四環素上生長作為篩選而進行D-乳酸脫氫酶基因的插入失活(即「破 壞」或「敲除」)。pLDHTc 139#7-9ffff 的構建已證明pLDHTcl39#7可在ZW1中用於「敲除」D_乳酸脫氫酶基因，因此下一步是 修飾該構建體，使其可在基因破壞後，通過Cre重組酶從染色體中除去篩選標記。為了達到 該目標，利用IV-盒旁側的4個限制性位點，即5』末端的AsiSl和Notl和3』末端的Pacl 和Fsel將兩個野生型loxP位點(Lee and Saito, 1998)添加到pLDHTcl39#7中。在用兩 個酶切割構建體並純化得到的大DNA片段後，第一個loxP位點插入到質粒pLDHTcl39#7的 AsiSl和Notl位點之間。插入到該位置的loxP位點用兩個合成的、5』末端磷酸化的寡核 苷酸5和6 (SEQID NOs 21和22)產生。寡核苷酸5(SEQ ID NO 21)；cgcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATgc寡核苷酸6(SEQ ID NO 22)ggccgcATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATgcgat這些寡核苷酸相互補，退火後形成全長雙鏈野生型loxP位點，在兩端有單鏈突 出，從而使DNA片段連接到pLDHTcl39#7的AsiSl和Notl位點。寡核苷酸的大寫字母對應 於全長野生型loxP位點，而小寫字母表示用於連接雙鏈DNA片段到pLDHTcl39#7的AsiSl 和Notl位點的核苷酸。用連接反應混合物轉化大腸桿菌DH10B，並在含20y g/ml四環素的LB平板上塗布 轉化細胞。通過限制性消化分析、克隆PCR和相關區域的DNA序列分析來鑑定含具有正確 插入到pLDHTcl39#7的AsiSl和Notl位點的loxP位點的質粒的四環素抗性轉化子。選擇 進行進一步操作的質粒以下命名為pLDHTcl39#7-9W。然後在用酶切割質粒並純化得到的大載體片段後，將第二個野生型loxP位點插 入到pLDHTc 139#7_9W的IV-盒另一端的Pacl和Fsel位點之間。插入到該位置的loxP位 點用兩個合成的、5，末端磷酸化的寡核苷酸7和8(SEQ ID NOs 23和24)產生。寡核苷酸7(SEQ ID NO 23)taaATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATggccgg寡核苷酸8(SEQ ID NO 24)ccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATttaat寡核苷酸7和8相互互補，退火後形成全長雙鏈野生型loxP位點，在兩端有單鏈 突出，從而使DNA片段連接到pLDHTc 139#7-9W的Pacl和Fsel位點。寡核苷酸的大寫字母 對應於全長野生型loxP位點，而小寫字母表示用於連接雙鏈DNA片段到pLDHTc 139#7-9W 的Pacl和Fsel位點的核苷酸。用連接反應混合物轉化大腸桿菌DH10B，並在含20 u g/ml四環素的LB平板上塗布 轉化細胞。通過限制性消化分析、克隆PCR和相關區域的DNA序列分析來鑑定含具有正確插入到pLDHTcl39#7-9W的Pacl和Fsel位點的loxP位點的質粒的四環素抗性轉化子。選 擇進行進一步操作的質粒以下命名為pLDHTcl39#7-9ffff。該構建體的環狀圖譜如圖12所不。pLDHSp-9ffff 的構建pLDHSp-9ffff與pLDHTcl39#7-9ffff相同，但後一個構建體的四環素抗性盒被賦予壯 觀黴素抗性的DNA片段(即Spec-盒)代替。後者以質粒pHP15578(Cahoon et al，2003) 為模板，用引物9和10通過PCR產生。PHP15578含Sped-盒及其啟動子的完整核苷酸序 列，它基於轉座子Tn7編碼3' (9)-0-核苷酸轉移酶的aadA基因的公開序列(GenBank登 錄號 X03403)。引物 9(SEQ ID NO :25)ATAAAAgcggccgcAGCACAGGATGA引物 10(SEQ ID NO :26)GGCGttaattaaGGCAGGTCAGCAAG引物9(正向引物)的下劃線鹼基與Spec1-盒啟動子上遊(GenBank登錄號 X03043 nts6-17)雜交，而小寫字母對應於添加到引物5，末端的Notl位點。引物10(反 向引物)的下劃線鹼基與Sped-盒終止密碼子下遊約130鹼基處(GenBank登錄號X03043 ntsl006-1019)雜交，而小寫字母對應於添加到引物5，末端的Pacl位點。將1040bp PCR-產生的Sped-盒用Notl和Pacl雙消化，通過瓊脂糖凝膠電泳純化DNA片段。將質粒 pLDHTcl39#7-9ffff也用相同的兩個限制性酶切割以除去IV-盒，並將得到的大載體片段通 過瓊脂糖凝膠電泳純化。然後將兩個目的DNA片段連接在一起，並將轉化反應混合物通過 電穿孔引入大腸桿菌DH10B中。將轉化子塗布在含壯觀黴素(200i!g/ml)的LB培養基上， 並在37°C培養。通過Notl和Pacl的限制性消化分析鑑定含具有正確大小插入片段的質 粒的壯觀黴素抗性轉化子，選擇進一步操作的質粒以下命名為pLDHSp-9ffff ；該構建體的環 狀圖譜如圖12所示。在此處未描述的實驗中，在ZW1中用pLDHSp-9ffff通過對壯觀黴素抗 性為選擇標記敲除D-乳酸脫氫酶基因。用自殺型構建體進行的基因失活通過宿主介導的 雙交換同源重組發生(W0 01/83784A2)，這使得旁側為兩個野生型loxP位點的ldh開放閱 讀框中部插入選擇性標記(Sped-盒)。雙交換事件通過pLDHSp-9ffff中Sped-盒旁側的 兩個DNA片段定位於ldh基因。這些片段其中之一(以下指5，ldh旁側DNA)在Sped-盒 上遊，位於Sbfl和AsiSl位點之間。這一約1100bp的DNA片段的核苷酸序列與編碼pgm 基因3，末端及ldh開放閱讀框約前一半的ZW1染色體DNA相同。另一 DNA片段(以下指 3' ldh旁側DNA)位於Fsel和Ascl位點之間的Sped-盒的反向末端。3' ldh旁側DNA 的核苷酸序列(也為約1100bp)與編碼ldh基因另一半和部分adhl基因5'非翻譯區的染 色體DNA相同。當5'和3' ldh旁側DNA片段與其染色體互補部分相互作用並進行同源 重組時發生雙交換事件。該現象基本不可逆，完全由宿主酶系統介導，可通過在開放閱讀框 中間插入Sped-盒而使染色體ldh基因失活。由於構建體不能在運動發酵單胞菌中複製， 使其成為自殺型構建體，因此用pLDHSp-9ffff產生穩定的壯觀黴素抗性克隆的唯一方法是 通過同源重組發生的雙交換事件(除了在極低頻率發生的自發藥物抗性突變體)。需要注 意的是通過雙交換事件插入到染色體中的Sped-盒仍然夾在存在於自殺型構建體中的兩 個野生型loxP位點之間。由於這種安排易於通過實施例10所述的Cre表達載體從D-乳酸脫氫酶基因中除去選擇標記，但不重新激活該基因。pGF0RSp-9ffff 的構建將pLDHSp-9ffff在如下所述的2步流程中轉變為用於運動發酵單胞菌葡萄糖-果 糖氧化還原酶(GF0R)基因失活的自殺型構建體。第一步是除去3' ldh旁側DNA，並用將 質粒定位到編碼GF0R的染色體基因的類似DNA片段代替。後一個DNA片段(以下稱為 3' GF0R旁側DNA)以ZW1基因組DNA為模板，用引物11和12為PCR引物通過PCR產生。引物 11(SEQ ID NO :27)CTACTCATRRCCRRCCTCAGAACGATCCTGCACAGC引物 12(SEQ ID NO :28)CATCTTACTrrcrcrccGGACGAGGTTCATCATCAGG引物11 (正向引物)的下劃線鹼基與對應於GF0R開放閱讀框中部的GenBank登 錄號為AE008692的核苷酸684324-684305雜交，而小寫字母對應於添加於引物5，末端的 Fsel位點。引物12 (反向引物)的下劃線鹼基與對應於GF0R終止密碼子下遊約625bp的 GenBank登錄號為AE008692的核苷酸683124-683143雜交，而小寫字母對應於添加到引物 5』末端的Ascl位點。用Fsel和Ascl切割1234bp PCR片段。也用相同的限制性酶切割 pLDHSp-9ffff,以除去3' ldh旁側DNA，並通過瓊脂糖凝膠電泳純化該操作中獲得的大載體 片段。然後將PCR-產生的3' GF0R旁側DNA連接在上述凝膠純化的大載體片段的Fsel 和Ascl位點，並將一份連接反應混合物通過電穿孔轉化到大腸桿菌DH10B中。將轉化的細 胞塗布在含200 u g/ml壯觀黴素的LB培養基上，並將平板在37°C培養。通過克隆PCR和 Fsel和Ascl的限制性消化分析鑑定含具有正確大小插入片段的質粒的壯觀黴素抗性轉化 子，選擇進一步操作的質粒以下命名為pLDH/GF0RSp-9ffff。下一步是從pLDH/GF0RSp-9ffff中除去5 『 ldh旁側DNA，並用5 『 GF0R旁側DNA替 代，從而在選擇破壞GF0R開放閱讀框的染色體靶處發生雙交換事件。以ZW1基因組DNA為 模板，引物13和14為PCR引物，通過PCR產生5' GF0R旁側DNA片段。引物 13(SEQ ID NO :29) CTACTCATatgcatGTCCAGAAAAGACAGCATTCC引物 14(SEQ ID NO 30)CATCTTACTgcgatcgcTGCACGGTTCATTGGAT引物13(正向引物)的下劃線鹼基與對應於GF0R起始密碼子上遊約520bp的 GenBank登錄號為AE008692的核苷酸685584-685564雜交，而小寫字母對應於添加到引物 5』末端的Nsil位點。引物14(反向引物)的下劃線鹼基與對應於臨近GF0R開放閱讀框中 部及引物11結合位點上遊的、GenBank登錄號為AE008692的核苷酸684396-684415雜交， 而小寫字母對應於添加到引物5』末端的AsiSl位點。用Nsil和AsiSl切割1217bp PCR產 物，也用Sbf 1和AsiSl雙消化pLDH/GF0RSp-9ffff，以除去5 『 ldh旁側DNA ；並通過瓊脂糖凝 膠電泳純化該操作中獲得的大載體片段。然後將PCR產生的5' GF0R旁側DNA連接在上述 凝膠純化的大載體片段的Sbfl和AsiSl位點間，並將一份連接反應混合物通過電穿孔轉化 到大腸桿菌SCSI 10 (它是dcnT和danT)中，以獲得非甲基化的質粒DNA進行ZW1和ZW658的 後續轉化，在以下實施例5和7中詳細描述。值得注意的是將非甲基化質粒DNA用於來源於 ZW4的運動發酵單胞菌的轉化對成功非常關鍵，因為從野生型大腸桿菌菌株，例如DH10B中分離的甲基化質粒DNA易於被宿主的限制/修飾系統破壞(如US 6566107B1所述)。另外 值得注意的是Nsil和Sbfl具有互補的粘性末端，但當它們連接後，則兩個位點均被破壞。 將轉化子塗布在含lOOy g/ml壯觀黴素的LB培養基上，並將平板在37°C培養。通過克隆 PCR和限制性消化分析鑑定含具有正確大小插入片段的質粒的壯觀黴素抗性轉化子。得到 的用於在ZW1和ZW658中敲除GF0R基因的自殺型構建體以下命名為pGF0RSp-9ffff。該質粒 的環狀圖譜如圖12所示，其完整核苷酸序列如SEQ ID N0:31中所示。需要注意的是該自 殺型構建體和運動發酵單胞菌染色體GR0R基因之間的雙交換事件會導致插入兩個野生型 loxP位點旁側的Sped-盒，與上述pLDH-Spec-9ffff的情況類似。實施例4牛成針對運動發酵單胞菌的大腸桿菌木糖異構酶表汰載體如下所述，以大腸桿菌/運動發酵單胞菌穿梭載體(PZB188)為起始材料構建在運 動發酵單胞菌中表達大腸桿菌木糖異構酶的質粒構建體(pZB188/Kan-XylA)(圖13)。參與 構建pZB188的步驟描述在US 5，514，583中。簡言之，該7008bp質粒可在大腸桿菌和運動 發酵單胞菌中複製，因為它具有兩個不同的複製原點，分別針對每個細菌種類。PZB188也 包含賦予四環素抗性的DNA片段(即IV-盒)。構建pZB188/Kan-XylA的第一步是從pZB 188中除去IV-盒，並用賦予卡那黴素抗性的DNA片段(即Kan1-盒)代替。為了從pZB188 中除去IV-盒，將質粒用Xbal和BssHll切割，並通過瓊脂糖凝膠電泳純化得到的大載體片 段。以質粒pET-24a(NOVagen)為模板，通過引物15和16進行PCR擴增以產生Karf-盒。 pET-24a含有Karf基因的完整開放閱讀框及其相關啟動子。引物 15(SEQ ID NO 32) :GCtctagaGCAGCAGATTACGCGC引物 16 (SEQ ID NO 33) :ACATTGgcgcgcTTAGAAAAACTCATC弓丨物15(正向引物)的下劃線鹼基與對應於pET_24a的Karf基因起始密碼子上 遊約160bp處雜交，而小寫字母對應於添加到引物5』末端的Xbal位點。引物16 (反向引 物)的下劃線鹼基與對應於Karf基因包括終止密碼子的開放閱讀框另一端雜交，而小寫字 母對應於添加到引物5，末端的BssHll位點。用Xbal和Bsshll切割991bp PCR產生的 Kanr-盒，並通過瓊脂糖凝膠電泳進行純化。然後通過標準連接反應將得到的DNA片段插入到上述PZB188DNA片段的Xbal和 BssHll位點。通過電穿孔將轉化反應混合物引入大腸桿菌DH10B中，將細胞塗布在含卡那 黴素(50i!g/ml)的LB培養基上；並在37°C培養。從卡那黴素抗性轉化子中分離質粒DNA， 並將得到的構建體以下命名為pZB188/Kan ；該穿梭載體的環狀圖譜如圖13所示。在下一步中，將大腸桿菌木糖異構酶表達盒插入到用Ncol和Acll雙酶切的質粒 pZB188/Kan的Ncol和Acll位點之間，通過瓊脂糖凝膠電泳純化的大載體片段。作為大腸 桿菌木糖異構酶表達盒的約2KbpDNA片段來源於用Ncol和Clal切割並通過瓊脂糖凝膠電 泳純化相關DNA片段的質粒pZB4。質粒pZB4在US 5514583中有詳細描述，大腸桿菌表達 盒PgapxylA(SEQ ID NO 34)的示意圖如圖13框出的圖譜所示。Ncol和Clal位點分別位於大腸桿菌木糖異構酶表達盒的5'和3'末端。如US 5514583所述，該片段包含強的組成型運動發酵單胞菌甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAP)啟動子， 它是恰好與編碼木糖異構酶的大腸桿菌xylA基因的完整開放閱讀框融合在一起的。它在 緊鄰木糖異構酶終止密碼子處也包含小的莖環區。通過標準連接反應將大腸桿菌木糖異構
28酶表達盒插入到pZB188/Kan的Ncol和Acll位點之間。需要注意的是Clal和Acll產生 互補的「粘性末端」，但它們連接後則兩個位點均被破壞。然後將連接反應混合物通過電穿 孔轉化到大腸桿菌SSC110(dGnT，dam!中，以獲得非甲基化質粒DNA進行以下實施例6所 述的運動發酵單胞菌的轉化，並將轉化的細胞塗布在含卡那黴素(50i!g/ml)的LB培養基 上，37°C培養。通過限制性消化分析和克隆PCR鑑定含具有正確大小插入片段的質粒的卡 那黴素抗性轉化子。用於在運動發酵單胞菌中表達大腸桿菌木糖異構酶的質粒以下命名為 「pZB188/Kan-XylA」，該構建體的環狀圖譜如圖13所示。實施例5產牛ZW1GF0R敲除突變體為了在ZW1 (衍生ZW658的野生型菌株)中除去GF0R酶活性，使用了在實施例3中 詳細描述的自殺型構建體pGF0RSp-9ffff。將非複製型質粒DNA通過電穿孔引入到細菌宿主 中，基本如US 5514583所述。簡言之，DNA轉化反應包括50 yl含約101CI細胞/ml的10% (v/v)甘油和約0. 9ug如實施例3所述從大腸桿菌SSC110分離的非甲基化質粒DNA。對照 反應進行相同處理，只是不加入任何質粒DNA。電穿孔儀設置為16kv/cm、200 Q、25 y F，電 轉杯的缺口寬度為0. 1cm。電穿孔後，將轉化反應物用1. 0ml MMG培養基(50g/L葡萄糖、 10g/L 酵母提取物、5g/L 胰蛋白腖、2. 5g/L(NH4)2S04、0. 2g/L K2HP04 和 ImM MgS04)稀釋，並 將細胞在30°C復甦約5小時。然後在無菌1. 5-ml離心管中通過室溫下離心(13，000X g， 5min)收穫細胞，並小心除去上清。將細胞沉澱重懸在150 u 1液體MMG培養基中，用50和 100 u 1細胞懸浮液塗布含1. 5%瓊脂和200 u g/ml壯觀黴素的MMG培養基上。將平板在厭 氧培養箱30°C培養，在2到3天後在實驗平板上出現50到150個克隆。這時在對照平板上 沒有壯觀黴素抗性克隆，雖然在另外48小時培養時間後會出現少許克隆。選擇從轉化中得 到的2個具有GF0R敲除構建體的壯觀黴素抗性克隆用於以下進一步的操作。以前用運動發酵單胞菌和與pGF0RSp-9ffff類似的自殺型構建體進行的實驗表明， 最初染色體和質粒DNA的整合是在兩個靶位點之一的單交換事件，單交換事件最後發展為 雙交換事件。雙交換事件的轉變通常在含針對自殺型構建體的選擇性試劑的液體培養基中 進行一系列轉移後很快發生。為了利於兩個選擇的ZW1轉化子發生由GF0R敲除構建體介 導的雙交換事件，將細胞接種到10ml含100g/L葡萄糖和200 u g/ml壯觀黴素的RM培養基 (10g/L酵母提取物和2g/LKH2P04)中。在30°C培養24小時後，兩個培養物均達到靜止期。 然後，用10 yl第一代培養物接種10ml相同的生長培養基，在30°C培養24小時後，兩個培 養物也均達到靜止期。最後，用10 yl第二代培養物接種10ml相同的生長培養基，並在30°C 再培養24小時。在液體培養基中進行最後一次轉移後，將第三代培養物稀釋並塗布在含壯 觀黴素(200 y g/ml)的MMG培養基上以獲得單克隆，平板在30°C厭氧條件下培養48小時。用3對不同的引物通過克隆PCR實驗驗證雙交換事件確實發生。第一對PCR引 物僅擴增自殺型構建體的5' GF0R旁側DNA與其染色體互補區進行單交換事件而產生正 確大小的DNA片段。同樣，第二對PCR引物僅擴增自殺型構建體的3' GF0R旁側DNA與其 染色體互補區進行單交換事件而產生正確大小的DNA片段。最後，第三對PCR引物僅擴增 發生雙交換事件，並排除單和雙交換事件混合群體而產生正確大小的DNA片段。用於本分 析中的兩個壯觀黴素抗性克隆來源於兩個不同的具有自殺型構建體的ZW1電穿孔反應的 原始轉化子，在液體培養基中轉移3次，塗布以獲得上述單克隆，本實驗的對照是親本菌株ZW1。由於兩個轉化子用3對不同的引物對均產生陽性結果，因此只選擇其中一個進行以下 分析。該菌株(ZW1GF0R敲除突變體)以下命名為ZW1-AGF0R。實施例6在牛理條件下葡萄糖_果糖氧化還原酶是木糖醇形成的主要貢獻者用ZW1GF0R敲除突變體(ZW1_ A GF0R)檢測假說在利用木糖的運動發酵單胞菌重 組菌株中木糖醇的形成至少部分由周質空間的酶GF0R，或其也具有酶活性的更大分子量的 胞質前體介導(Loos etal.，同上)。如實施例2(圖11)所示，木糖醇是利用木糖的菌株8b 和ZW658的主要副產物，但它僅在生長培養基中存在木糖時形成。雖然野生型運動發酵單 胞菌菌株，例如CP4具有可直接還原木糖為木糖醇的NADPH依賴的醛糖還原酶(Feldmarm et al,同上)，但可能在生長培養基中含有木糖或葡萄糖和木糖混合物時，GF0R也在體內參 與木糖醇的形成，如圖表II和III所示。但對這些發生的任何一個反應，酶都需要接近木酮 糖，因為該化合物是GF0R介導的木糖醇產生的專性(obligatory)電子接納體，如體外GF0R 酶性狀檢測(Zachariou and Scopes,同上)和用粗無細胞提取物進行的實驗(Danielson 同上)所示。在構建的利用木糖生長的運動發酵單胞菌中，木糖醇合成必需的木酮糖可通 過催化木糖代謝(圖1)第一個步驟的木糖異構酶產生，該酶在野生型菌株，例如ZW1中不 存在。為了檢測在生長培養基中存在木糖和葡萄糖時GF0R產生木糖醇的可能性，將如 實施例4所述的大腸桿菌木糖異構酶表達載體(pZB188/Kan-XylA)導入ZW1和ZW1-AGF0R 中。其策略是在不能利用這些糖生長的兩個菌株中提供從木糖轉變為木酮糖的途徑，並測 定GF0R是否可產生木糖醇。用於轉化的電穿孔流程基本如實施例5所述，但在復甦階段後 將轉化的細胞塗布在含300 u g/ml卡那黴素的MMG培養基上。將ZW1和ZW1- A GF0R也用 與pZB188/Kan-XylA相同但不含大腸桿菌木糖異構酶表達盒的pZB188/Kan(圖13)轉化， 作為本實驗的對照。通過克隆PCR鑑定含pZB188/Kan-XylA或對照質粒的卡那黴素抗性 克隆，並隨機選擇每個轉化反應的代表性克隆進行如圖14所示的實驗。這4個含質粒的 菌株以下命名為 ZW1 (pZB188/Kan)、Zffl (pZB188/Kan-XylA)、Zff 1- A GF0R (pZB188/Kan)和 Zffl-AGF0R(pZB 188/Kan-XylA)。將在30°C下，過夜培養物培養在含5ml 60g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L KH2P04、2g/L(NH4)2S04、lg/L MgS02(7H20)和 300 u g/ml 卡那黴素的 15ml 帶蓋試管中。然後 用每份過夜培養物接種含相同生長培養基，存在或不存在20g/L木糖的20ml培養物(在 50-ml帶蓋試管中)中。在30°C輕輕振蕩培養，最初0D_值為 0. 1。培養0、24、48和120 小時後除去1.0ml培養物，用具有折光率檢測器(Hewlett-Packard，Palo Alto, CA)的HP 1100進行HPLC分析，以檢測發酵液中存在的木糖、木酮糖和木糖醇濃度。在進行HPLC分析 前，通過離心除去細胞，並將上清通過0. 22 y m醋酸纖維素Spin-X離心管過濾器(Costar， catalog number 8160)以除去小顆粒。在 AminexHPX_87H 柱(Bio-Rad)上，在 55°C，無梯 度條件下以流速0. 6ml/min, 0. 01N H2S04為流動相分離化合物。用已知濃度的標準品定量 目標峰，所有結果表示為g/L。結果表明，當具有「空」載體的對照菌株ZW1 (pZB188/Kan)在存在葡萄糖和木糖的 條件下進行培養時，在120小時培養時間後，生長培養基中僅有小量木糖醇積累(圖14A)。 該菌株木糖醇的最大量為<0.5g/L。相反，當ZWl(pZB188/Kan)生長在相同濃度的葡萄糖但沒有木糖的條件下，則沒有木糖醇產生，對其它3個菌株也是這樣。因此，只有在存在葡 萄糖和木糖時進行的實驗如圖14所示。顯然，大腸桿菌木糖異構酶在ZW1中的表達極大增 加了發酵液中木糖醇的量，到120小時，Zffl (pZB188/Kan-XylA)比ZW1 (pZB188/Kan)多產 生5倍的該化合物(圖14B)。如預期一樣，木糖異構酶在ZW1中的表達也導致木酮糖的產 生，因為木糖異構酶催化木糖到木酮糖的異構化。需注意的是在本實驗中，加到生長培養基 中約16%的總木糖轉變為木酮糖或木糖醇。另外值得注意的是在這兩個化合物之間存在明 顯的前體/產物的關係(木酮糖降低，則木糖醇增加)，這與在培養基中存在葡萄糖和木糖 時，GF0R在生理條件下可將木酮糖轉變為木糖醇的假說相一致。與ZW1相似，ZW1-AGF0R在沒有木糖異構酶表達載體時產生極少的木糖醇(圖 14C)。在這些條件下形成的小量木糖醇可能來自NADPH依賴的醛糖還原酶，如Feldmarm et al. (1992同上)所述。令人驚訝的是，與用ZW1 (pZB188/Kan-XylA)獲得的結果相比 較，當木糖異構酶在ZW1GF0R敲除突變體中表達時，沒有額外的木糖醇產生(圖14D)。 Zffl-AGF0R(pZB 188/Kan-XylA)確實產生了大量木酮糖，形成的該化合物的量與由相應 ZW1菌株(即ZW1 (pZB188/Kan-XylA)產生的木酮糖和木糖醇的總量一樣。這些實驗清楚表 明，當酶接近木酮糖時，GF0R在體內參與木糖醇的形成，這種情況在葡萄糖和木糖混合物中 培養的、利用木糖的運動發酵單胞菌重組菌株中確實發生。這些結果進一步表明當運動發 酵單胞菌重組菌株在含木糖的培養基生長時，NADPH-依賴的醛糖還原酶對木糖醇的產生不 具有重要作用，這與文獻(Feldmarm et al，同上；Kim et al，同上)的預期相矛盾。實施例7ZW658GF0R敲除突變體的產生及該菌株不產生功能性GF0R酶的驗證在ZW658中，在存在葡萄糖和木糖醇時，在生理條件下，編碼如實施例6所述的、參 與運動發酵單胞菌中木糖醇形成的GF0R基因通過自殺型構建體pGF0RSp-9ffff(如實施例3 所述)進行插入失活。該流程中的所有步驟與實施例5中所述的ZW1GF0R敲除突變體相同， 包括用3組PCR引物驗證雙交換事件。選擇進行進一步所述實驗的ZW658敲除突變體以下 命名為ZW800。為了驗證ZW800不產生在生理反應中由GF0R催化的、從葡萄糖和果糖產生山梨糖 醇的酶，進行了以下實驗。將1. 5毫升ZW800和親本ZW658培養物在30°C，在10ml帶蓋試 管中的含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2P04和lg/L MgS04的液體 培養基中培養到早期靜止期。當培養物達到0D_約5. 5時，通過離心收穫細胞，仔細除去上 清並拋棄。然後將細胞沉澱重懸在5ml含以下組分的新鮮生長培養基中110g/L葡萄糖、 110g/L果糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2P04、lg/L MgS04和4g/L KHC03。以上所有步驟在 無菌條件下進行，生長培養基的最初PH在細胞重懸前用濃磷酸調整到5. 8。然後將得到的 培養物在30°C培養，並輕輕振蕩(150rpm)，在如表2所示的時間點除去樣品，並用如實施例 6所述的相同流程進行發酵液的HPLC分析。本實驗的目標峰是葡萄糖、果糖、山梨糖醇和乙 醇，用已知量的標準品計算離心除去細胞後它們在發酵液中的濃度；表2的所有濃度表示 為 g/L0表2ZW658和ZW800中山梨糖醇的產生——體外測定 如表2所示，ZW658培養物在23小時後消耗了幾乎所有葡萄糖和約一半的果糖， 並產生相當量的山梨糖醇和乙醇為主要產物；後兩個化合物的值在第一個時間點分別為 45. 99g/L和49. 36g/L。因此，在ZW658培養物中，最初的果糖有40%以上通過GF0R轉變為 山梨糖醇。顯著不同的是，在23小時培養後，在ZW800培養物的發酵液中沒有檢測到山梨 糖醇，而葡萄糖和果糖幾乎定量轉變為乙醇，這與消耗每克糖產生0. 51克乙醇的理論值相 近。值得注意的是在另外24小時培養後，ZW658培養物中的山梨糖醇的量沒有進一步增加。 這與預期相符，因為幾乎所有的葡萄糖已在早期被消耗，而用果糖進行GF0R反應沒有電子 供體。有趣的是，在47小時的時間點，ZW800培養物的發酵液中有小量山梨糖醇(10.21g/ L)，這可能是由NADPH依賴的醛糖還原酶(Feldmarm et al.，同上)或其它仍未闡明的酶產 生。但上述結果表明插入到ZW800中的GF0R開放閱讀框中部的Sped-盒即使不完全，也 極大地破壞了 GF0R酶活性。該結論的進一步支持來自用ZW1、ZW658和ZW800製備的無細胞提取物的體外實 驗。其目標是確定是否ZW658可在沒有添加其它的底物或輔因子的情況下將木糖轉變為木 糖醇，並研究是否ZW800由於GF0R失活而喪失進行該反應的能力。用運動發酵單胞菌無細 胞提取物中GF0R介導的木糖醇產生有3個條件1)可還原GF0R緊密結合輔因子的糖電子 供體，例如葡萄糖或木糖，2)木酮糖作為電子接納體，因為它是酶實際將其還原為木糖醇的 化合物，及3)功能性GF0R酶。如果不向反應混合物中加入木酮糖，則無細胞提取物也必需 含有木糖異構酶將木糖轉變為木酮糖。用100ml在33 °C，培養在含10g/L酵母提取物、2g/L KH2P04和50g/L葡萄糖的 250ml錐形瓶中的培養物製備無細胞提取物。在0D_為2-3時通過離心收穫細胞，並用冰 50mM Tris-HCl (pH 7. 0)，1. OmM MgCl2，ImM 二硫蘇糖醇洗滌2次。將最終沉澱重懸在1. 0ml 相同緩衝液中，並通過超聲破碎細胞。通過4°C離心(16，000x g,60min)除去細胞碎片，並 立即用無細胞提取物進行如下所述的木糖醇產生的檢測。在聚丙烯微離心管中進行500 yl 反應，管中含具有以下終濃度的組分50mM Tris-HCl (pH 7. 0), 1. OmM MgCl2，ImM 二硫蘇糖 醇，66mM木糖和0. 32-0. 35mg無細胞提取物蛋白；通過BCA蛋白檢測法(Pierce)測定蛋白 濃度，以牛血清白蛋白為標準。在40°C溫育15小時後，用終濃度為30mM新戊酸終止反應，並 取一份用SH1011柱(Showdex)進行HPLC分析，以0. 01N硫酸為流動相。柱溫維持在50°C，
32流速為l.Oml/min。本實驗對照不加入無細胞提取物，但其它處理相同。如表3所示，當將ZW1無細胞提取物加入到反應混合物中，在15小時的溫育時 間內木糖不能轉變為木酮糖或木糖醇。如已提及的，該結果與預期相符，因為與ZW658和 ZW800相比較而言，ZW1是野生型菌株，不表達大腸桿菌木糖異構酶。相反，當使用ZW658無 細胞提取物時則產生大量木酮糖和木糖醇，因為它含有這兩種化合物形成所必需的酶。在 這種情況下，約8%最初的66mM木糖用於木糖醇的產生，因為當加入到反應混合物中的木 糖為GFOR的唯一底物時，每產生1個分子木糖醇需消耗兩分子木糖。最後，最重要的是， ZW800無細胞提取物僅能將木糖轉變為木酮糖，因為雖然它含有木糖異構酶活性，但它缺失 GFOR酶活性。這些結果進一步表明，ZW800不產生功能性GFOR酶，而且進一步證明該蛋白 以木糖為電子供體，將木酮糖還原為木糖醇，如以前用加入了純化的木糖異構酶的野生型 無細胞提取物所示的結果一樣(Danielson同上)。表3. GF0R介導的、由木糖生成木糖醇也需要木酮糖——體外測定 實施例8在濃縮的葡萄糖和木糖混合物中山梨糖醇是ZW800生長所必需的檢測ZW800在濃縮的葡萄糖和木糖混合物中產生乙醇的發酵性能。該實驗在 PH-控制的發酵罐中進行，使用總糖為97g/L或188g/L，葡萄糖和木糖的固定比例為 5 4。將ZW658和ZW800的種子培養物在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取 物、10g/L KH2P04,2g/L(NH4)2S04 ^P lg/LMgS04的液體培養基的搖瓶中，37°C下培養；最初pH 用4N K0H調整為5. 5。當0D_達到 5. 0時，用50ml種子培養物接種含450ml生長培養 基的 1 升發酵罐(BIOSTAT B-DCU system, Sartorius BBISystem Inc.，Bethlehem, Pennsylvania, USA)。最終 500ml 培養物含 5g/L 酵母提取物、2g/L KH2P04、2g/L (NH4) 2S04、 lg/L MgS04及低濃度糖(54g/L 43g/L木糖)或高濃度糖(104g/L葡萄糖、84g/L木糖)。 在33°C培養，通過自動加入4N K0H維持pH5. 5。混合速度設置為150rpm。在多個時間點， 取出1份發酵液用與實施例6所述相同流程和條件進行HPLC分析。本實驗的目標化合物 是葡萄糖、木糖和乙醇，用已知濃度的標準品定量色譜峰。也用設定光密度為600nm的分光 光度計通過以下濁度變化監測細胞生長，並將得到的0D_做圖。如圖15所示，當發酵罐含低濃度糖(54g/L葡萄糖、43g/L木糖)時，GF0R失活對 生長、糖消耗或乙醇滴度沒有影響。但如圖16所示，當總糖濃度增加約2倍時，則發酵性能 有很大差異。ZW658的延遲期約30小時，這對利用木糖的運動發酵單胞菌重組菌株從葡萄糖和木糖稀釋混合物轉移到總糖超過180g/L的相同糖的濃縮混合物時是典型現象。在延 遲期後，細胞開始生長並消耗培養物中的所有葡萄糖和約75%木糖，因此得到最終乙醇滴 度為 73g/L(圖16A)。相比之下，ZW800培養物甚至在130小時培養時間後不從延遲期復 蘇(圖16B)，該結果在兩個獨立的情況下獲得。如圖15所示，由於ZW800在葡萄糖和木糖稀釋混合物中生長很好，因此該菌株不 能在高糖混合物中復甦可能與滲透壓力相關。當野生型運動發酵單胞菌轉移到葡萄糖和果 糖混合物，或通過轉化酶可產生葡萄糖和果糖的高濃度蔗糖中時，GF0R確實通過產生山梨 糖醇而在維持滲透平衡方面具有重要作用(Loos et al.，同上)。由GF0R在周質空間產生 的山梨糖醇逆濃度梯度進入細胞內，由於不進行進一步代謝而高水平積累。從而消除跨質 膜的滲透壓差異，並保持滲透平衡(Wiegert et al.，同上)。但GF0R介導的山梨糖醇產生 的前提是同時存在葡萄糖和果糖，在缺少果糖的培養基中不發生該反應。由於山梨糖醇是 GF0R的生理性重要的產物，但該酶在ZW800中失活，因此在以下實驗中檢測了向濃縮的葡 萄糖和木糖混合物中增加山梨糖醇的效果。在高濃度混合物中培養 70小時後(時間點由圖16的垂直箭頭指定)，從發酵 罐中除去5份4. 5ml延遲的(stalled) ZW800培養物並轉移到15ml帶蓋的試管中。然後向 4個試管補加0-20mM山梨糖醇(終濃度)，而且在所有情況下，將培養物的總體積用去離子 水調整為5.0ml ；本實驗所用的山梨糖醇儲液也由水配製。當向10%稀釋的生長培養基中 加入水和山梨糖醇時，對第五個培養物不做任何添加，作為對照。然後將所有培養物在33°C 輕輕振蕩(200rpm)培養，並用分光光度計監測生長。如圖17所示，當向生長培養基中加入 山梨糖醇後，細胞幾乎立即開始生長，甚至在最低檢測濃度時(5mM)也是如此。而且發現不 加入山梨糖醇，但用水將培養物稀釋10%，將總糖濃度從188g/L降低到169g/L時也刺激生 長。但山梨糖醇對生長的刺激作用大大強於稀釋的作用。通過山梨糖醇得到的ZW800生長的拯救(rescue)完全在意料之外，因為ZW658在 葡萄糖和果糖混合物，而沒有已知來源的果糖中從延遲期復甦，並生長很好。由於後一化合 物是GF0R介導的山梨糖醇產生的專性電子接納體，GF0R在含高濃度葡萄糖和木糖的培養 基中能合成山梨糖醇或在滲透平衡方面起重要作用並不明顯。因此不能表明山梨糖醇是 ZW658或ZW800在濃縮的葡萄糖和木糖混合物中的生長的重要因子。實施例9GF0R失活可在處理相關條件(process relevant conditions)下提高從木糖到乙
醇的產量對ZW658和ZW800在濃縮的葡萄糖和木糖混合物中的發酵性能在處理相關條件下 以並行方式進行比較，以測定GF0R失活是否是有利的或有害的代謝工程策略。由於在這些 實驗中使用高濃度葡萄糖和木糖，因此向培養基中加入山梨糖醇以使ZW800生長。在此處 未描述的實驗中，也發現山梨糖醇消除了 ZW658的延遲期。因此，對生長培養基補充山梨糖 醇可提供理想的在處理相關條件下來比較這兩個菌株的方式。用兩種總糖濃度，存在和不存在乙酸鹽下，將ZW658和ZW800在6個不同條件下 進行比較，對更濃縮的糖混合物，檢測了兩種不同的緩衝能力。這些實驗用20ml培養物在 30°C，在50ml試管中輕輕振蕩(150rpm)培養進行。不控制pH，但最初生長培養基中的pH 用濃磷酸在用種子培養物接種前調整到5. 8。基本生長培養基含10g/L酵母提取物、2g/LKH2P04、lg/L MgS04、5mM 山梨糖醇和或者 4g/L(圖 18 和 19)或者 8g/L(圖 20)KHC03。所有 以上和以下的值是加入種子培養物後的終濃度。用KHC03增加生長培養基的緩衝能力，以 使在細菌生長時通常發生的PH降低最小。所有這些實驗的碳源是兩種不同總糖濃度的葡 萄糖和木糖混合物，其與預處理的玉米秸水解物中的這兩種糖的比例相似。葡萄糖和木糖 的最初濃度分別為或者92g/L和82g/L(圖18)或者107g/L和96g/L(圖19和20)。其中 也存在6g/L of乙酸鹽(預處理玉米秸水解物中存在的抑制劑)。將種子培養物在30°C， 在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2P04、lg/L MgS04的液體培養基 中培養到0D_為 5. 0，並用1/10體積接種實驗培養物。在不同時間點，除去1份發酵液 如前實施例6所述進行HPLC分析。本實驗的目標化合物是葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇，所 有的值以g/L計。由於實際上所有的葡萄糖在第一個採樣時間點均被消耗，因此該糖的值 不在圖中畫出。從如圖18-20所示的實驗表明，ZW800在所有檢測的條件下均優於ZW658，根據兩 個不同的標準進行判定(a)在實驗過程中消耗的木糖的總量，及(b)達到的最大乙醇滴 度。而且從該數據也表明，當遇到最脅迫的條件(即所有的葡萄糖被消耗完，而且乙醇濃度 開始達到毒性水平)時，GF0R失活起到極大的有利作用。事實上，當生長培養基中存在將 產生額外的脅迫的、抑制濃度的乙酸鹽時觀察到兩個菌株最大的差異。在三組實驗條件下， ZW800在存在乙酸鹽時的乙醇滴度平均增加量是10. 2%，其值在4. 4%到13. 7%。ZW800 在三個實驗中，在沒有乙酸鹽時產生的乙醇也比ZW658多，在這種情況下的平均增加量是 3. 2%。與預期一樣，ZW658將木糖轉變為大量的不期望的副產物木糖醇，當條件最脅迫(即 在發酵最後階段，當生長培養基中存在乙酸鹽時)時，該化合物達到最高水平。例如，在如 圖18-20所示的有乙酸鹽的實驗中，ZW658將消耗的總木糖的8. 1%、8.3%和9. 9%轉變為 木糖醇。相反，ZW800培養物在任何檢測條件下都沒有木糖醇的產生。這些結果清楚地表 明，GF0R失活利於在處理相關條件下代謝木糖產生乙醇，特別是在存在抑制濃度的乙酸鹽 時。如圖18和19所示的試管實驗進行了兩次，確實獲得相同的結果。另一個用ZW800和ZW658在pH控制的發酵罐中，在含乙酸鹽的濃縮葡萄糖和木糖 混合物中進行了並行實驗。由運動發酵單胞菌產生的代謝副產物例如有機酸和二氧化碳 降低生長培養基的PH，這可增加乙酸和乙酸鹽的比例，而已知質子化物質是實際上抑制細 菌生長的化合物(Kim et al, (2000)Applied Biochemistry and Biotechnology,84-86 357-370)。因此，在大規模發酵中，pH是非常重要的，因為pH從5. 8降低到5.0將使乙酸 的濃度增加5倍。將ZW800和ZW658種子培養物在搖瓶中，37 °C，在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、 10g/L酵母提取物、10g/L KH2P04、2g/L(NH4)2S04* lg/L MgS04的液體培養基中培養；起始 pH用4N K0H調整為5. 5。當0D_達到 5. 0時，用50ml種子培養物接種到含450ml生長 培養基的 1 升發酵罐(BI0STAT0 B-DCU system, Sartorius BBISystem Inc.，Bethlehem, Pennsylvania, USA)中。最終500ml培養物含92g/L葡萄糖、97g/L木糖、lOg/L酵母提取 物、2g/L KH2P04、10mM山梨糖醇和7. 2g/L乙酸鹽。在33°C培養，通過自動加入4N K0H維 持pH在5. 5，混合速度為150rpm。在不同時間點，取出1份發酵液用實施例6所述相同流 程對其進行HPLC分析。本實驗的目標化合物是葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇，也對細胞生長 (0D_)進行監測。圖21所示的是用ZW800培養物的整個時間段的發酵罐運行的參數，表4總結了兩個菌株木糖、乙醇和木糖醇的終點值。表4. ZW800和ZW658在pH控制的發酵罐中的木糖、乙醇和木糖醇的終點值 與有乙酸鹽的試管結果(圖18-20)相同，ZW800比ZW658在pH_控制的發酵罐中 多消耗14%的木糖，而且多產生9. 6%的乙醇(圖21)。由於ZW800不產生任何可檢測到 的木糖醇，因此該菌株乙醇的產量高約5%。相比之下，木糖醇在ZW658發酵液中的終濃度 為3. 92g/L，代表在實驗過程中消耗的總木糖的約6. 5 %。這些實驗對GF0R失活可通過去 除木糖醇形成而提高由木糖產生的乙醇產量提供了另外的證據。如已知的，不期望的副產 物木糖醇以至少兩個不同的方式幹擾木糖代謝並抑制細菌生長，其導致低水平的ATP。因 此，當GF0R產生木糖醇時，它降低了運動發酵單胞菌應對所有其它通常在從木質纖維素貯 存物發酵產生乙醇的過程中遇到的能量消耗脅迫的能力。與ZW658相比，由於ZW800不需 要與木糖醇相關的脅迫相競爭，因此它可在發酵後期階段產生最高水平脅迫時消耗更多的 木糖，產生更多的ATP和更多的乙醇。實施例10從ZW800中去除選擇性標記及獲得的菌株ZW801-4的特徵Cre表達構建體 pZB188~Kan/Cre 的產生如實施例3所述，插入到ZW800的GF0R開放閱讀框中的Sped盒夾在兩個 野生型loxP位點之間。這種排列易於從染色體中通過Cre重組酶(Sternberg and Hamilton (1981)J. Mol. Biol. 150 467-486 ；Leeand Saito 同上，Trinh et al (2000) Journal of Immunological Methods244(2) :185_193)除去選擇性標記。但為了達到該目 的，首先需要產生可在運動發酵單胞菌中複製的Cre表達載體(圖22)。Cre表達載體的前 體是如實施例4詳細描述的pZB188/Kan。簡言之，pZB188/Kan是可在大腸桿菌和運動發酵 單胞菌中複製的穿梭載體，因為它具有兩個細菌種的複製原點。它也含有賦予卡那黴素抗 性的DNA片段(即Kar/盒)。用Ncol和Notl對pZB 188/Kan進行雙消化，並通過瓊脂糖 凝膠電泳純化大載體片段。下一步是通過PCR用引物17和18產生Cre表達盒。擴增Cre 表達盒所用的DNA模板是含噬菌體PICre重組酶整個基因及其啟動子的質粒(Sternberg et al (1986) J. Mol. Biol. 187(2) :197_212)。引物 17(SEQ ID NO :35)CTACTCATccatRRCATCTTGAGCTTGAGAAAAACC引物 18(SEQ ID NO :36)CATCTTACTrcrrccrcTTAATGGCTAATCGCCATCTTC
引物17 (正向引物)的下劃線鹼基與對應於Cre起始密碼子上遊200bp處GenBank 登錄號為X03453的序列的nt 286-307雜交，而小寫字母對應於添加到引物5，末端的Ncol 位點。引物18 (反向引物)的下劃線鹼基與Cre開放閱讀框另一端GenBank登錄號為X03453 的序列的nt 1523-1503結合，而小寫字母對應於添加到引物5』末端的Notl位點。用Ncol 和Notl雙消化1238bp PCR產物，並通過瓊脂糖凝膠電泳純化得到的含Cre重組酶完整開 放閱讀框及其推測的啟動子的DNA片段(Sternberg et al，1986同上)。然後通過標準連 接反應將Cre-表達盒插入到上述pZB188/Kan DNA片段的Ncol和Notl位點。將連接反 應混合物電轉入大腸桿菌DH10B，並將轉化的細胞塗布在含卡那黴素(50i!g/ml)的LB培 養基上；37°C培養。從卡那黴素抗性轉化子中分離質粒DNA，然後將該製備物導入大腸桿菌 JM110(dCm_，dam_)以獲得非甲基化的質粒DNA進行後續的運動發酵單胞菌轉化(參見以下 描述)。Cre表達載體pZB188/Kan-Cre的質粒圖譜如圖22所示。Cre處理以從ZW800染色體中除去選擇性標記並消除Cre表達載體噬菌體P1的Cre重組酶(Cre)可識別特異的34bp的DNA序列——「loxP位點」， 該位點在8bp的非對稱核心旁側含有兩個13bp反向重複(Sternberg and Hamilton, 1981， 同上；Lee and Saito，同上；Trinh et al，同上)。Cre也可以切割任何位於兩個相同的loxP 位點之間的幹擾DNA片段，而且切割反應非常快。為了從GF0R開放閱讀框中除去Sped盒， 將 Cre 表達載體(pZB188/Kan-Cre)導入 ZW800 中。轉化流程基本如實施例5所述，但在復甦階段後，將細胞塗布在含350 u g/ml作為 Cre表達載體選擇試劑的卡那黴素MMG培養基上。從該過程復甦的原代轉化子對壯觀黴素 不再有抗性，因為通過Cre從染色體除去的Sped盒是在運動發酵單胞菌中不能複製的環 狀DNA片段。在30°C，在厭氧條件下培養48小時後，將兩個Kan7Specs原代轉化子進行Cre 質粒消除過程。雖然PZBISS/Kan-Cre可在運動發酵單胞菌中複製，但在不合卡那黴素的培 養基上培養細胞很容易使該質粒丟失。為了在本發明中消除Cre表達載體，將細胞在升高 的溫度(37°C )下，在不含卡那黴素的液體培養基中培養；每隔24-36小時將細胞轉移到含 相同組分的新鮮生長培養基中。在進行至少50代後，在MMG平板上分離單克隆，並從兩個 原始的原代轉化子中隨機選擇5個克隆進行進一步分析。與預期一致，這些克隆都不能在 含卡那黴素(350 y g/ml)或壯觀黴素(200 y g/ml)的MMG平板上生長。雖然不能在卡那黴 素上生長是質粒消除過程成功的很好提示，但該結論也用與Cre表達盒雜交的引物通過克 隆PCR進行驗證。基於這些實驗，選擇3個Cre處理的、質粒消除的ZW800衍生物進行進一 步分析，這些菌株以下命名為ZW801-4、ZW801-5和ZW801-6。為了研究這些菌株在葡萄糖和木糖濃縮混合物中，在存在抑制濃度的乙酸鹽時表 現如何，進行了搖瓶實驗。在本分析中也包括ZW658和ZW800。將種子培養物在30°C，在含 75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2P04、lg/L MgS04的液體培養基中培 養至0D_ 3. 0，用10%接種物作為15ml的實驗培養物。將後者在50ml試管中，在30°C 振蕩(150rpm)培養。生長培養基含10g/L酵母提取物、2g/L KH2P04、lg/L MgS04、5mM山梨 糖醇、40mMKHC03、95g/L葡萄糖、90g/L木糖和7. 7g/L乙酸鹽；最初pH用濃磷酸調整為5. 8。 在不同時間點，除去1份培養物進行如前實施例6所述的發酵液HPLC分析。本實驗的目標 化合物是葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇，所有值以g/L計。如表5所示，ZW658產生66. 35g/L乙醇，並留下40. 6g/L殘餘的木糖。ZW658由於具有功能性GF0R酶，因此也產生3. 19g/L不期望的副產物木糖醇。與以前其它並行實驗所 觀察到的一樣，ZW800比ZW658多消耗17%的木糖，多產生6. 2%的乙醇，而且不產生任何 可檢測的木糖醇。雖然用ZW801-4和ZW801-6獲得的結果略好一些，但這些差異可能在實 驗誤差範圍內，不是統計學顯著的。本實驗中觀察到的ZW801-5相對較差的性能難以理解， 不再進一步研究。基於這些結果，選擇菌株ZW801-4進行進一步分析。表5. ZW658、ZW800、ZW801-4、ZW801-4 和 ZW801-5 在高糖醋酸下的搖瓶實驗為了驗證搖瓶實驗表明ZW 801-4至少與ZW800表現一樣的結果，將這兩個菌株在 PH控制的條件下進行比較。將種子培養物在30。C，在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵 母提取物、2g/L KH2P04、lg/L MgS04的培養基中培養。當0D6(1(1達到 4. 6時，用17ml種子 培養物接種含153ml生長培養基的pH控制的生物反應器中。最終170ml培養物中含105g/ L葡萄糖、100g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/LKH2P04、lg/L MgS04、5mM山梨糖醇和7. 2g/L 乙酸鹽。在33°C培養，通過自動加入4N K0H將pH維持在5. 5 ；攪拌速度為 150rpm。在不 同時間點，從生物反應器中取出1份培養物進行如上所述的發酵液HPLC分析，並對0D,進 行監測。在這些實驗條件下，ZW800和ZW 801-4的生長曲線幾乎重疊(圖23A)。葡萄糖和 木糖消耗的時間段也基本上一樣，而且兩個菌株產生具有相同動力學的相同量的乙醇(圖 23B)。另外，這兩個菌株均不產生任何可檢測的木糖醇。基於這些結果，我們認為從GF0R開 放閱讀框中除去Sped-盒不能使GF0R酶活性恢復或部分恢復，而且該操作對發酵性能沒 有壞的影響。雖然ZW800和ZW801-4都比具有功能性GF0R酶的親本菌株(ZW658)表現好， 但優選的用於商業用途的菌株是ZW801-4，因為它不含有對抗生素賦予抗性的外源基因。來自ZW801-4的基因組DNA的序列分析提供了確實發生正確的Cre切除事件的明 確證據。ZW801-4中被破壞的GF0R開放閱讀框的完整核苷酸序列(從原始起始密碼子到原 始終止密碼子)如SEQ IDN0 37所示，圖24所示的是翻譯的突變序列與野生型GF0R蛋白 的比對；後者由GenBank登錄號AE008692的核苷酸683751-685052的反向互補序列編碼。 與預期一樣，Specr盒的Cre切割在GF0R開放閱讀框中間留下1個野生型loxP位點，該插 入事件產生成熟前截短蛋白的同框終止密碼子；「lox瘢痕」由灰色高亮殘基表示。作為自 殺型構建體設計的結果，突變的核苷酸序列也在相同位置缺失 72bp的原始野生型GF0R 核苷酸序列。
權利要求
能夠利用木糖產生乙醇的重組發酵單胞菌(Zymomonas)菌株，其包含至少一種可降低葡萄糖-果糖氧化還原酶活性的遺傳修飾。
2.權利要求1所述的重組發酵單胞菌菌株，其中，降低葡萄糖_果糖氧化還原酶活性的 遺傳修飾選自插入、缺失、突變、共抑制和反義RNA表達。
3.權利要求1所述的重組發酵單胞菌菌株，其中降低葡萄糖_果糖氧化還原酶活性的 遺傳修飾是通過同源重組引入到所述菌株的葡萄糖_果糖氧化還原酶基因中的插入。
4.權利要求1所述的發酵單胞菌菌株，其為選自ZW800、ZW801-4和ZW801-6的菌株。
5.權利要求1所述的發酵單胞菌菌株，其中，與沒有通過遺傳修飾降低葡萄糖_果糖氧 化還原酶活性的菌株相比，所述菌株產生更少量的木糖醇。
6.權利要求5所述的發酵單胞菌菌株，其中，所述菌株基本上不產生木糖醇。
7.生產能夠利用木糖來產生乙醇、且具有降低的GF0R活性的發酵單胞菌菌株的方法， 包括a)提供能夠在合適條件下利用木糖產生乙醇的重組發酵單胞菌菌株；及 b)向(a)中的、能夠利用木糖產生乙醇的重組發酵單胞菌菌株中引入至少一種遺傳修 飾，所述修飾可降低葡萄糖_果糖氧化還原酶活性。
8.權利要求7所述的方法，其中，(a)中的、能夠利用木糖產生乙醇的重組發酵單胞菌 菌株選自ATCC31821/pZB5、運動發酵單胞菌(Z. mobilis) 8b、ZW658、ZM4 (pZB5)和運動發酵 單胞菌CP4:pZB5。
9.權利要求8所述的方法，其中，所述的遺傳修飾選自插入、缺失、突變、共抑制和反義 RNA表達。
全文摘要
通過對葡萄糖-果糖氧化還原酶基因進行遺傳修飾以降低GFOR酶表達活性，從而構建了可利用木糖的發酵單胞菌。該工程菌表現為降低木糖代謝中有害副產物木糖醇的產量。它也可在處理相關的條件下，在混合糖發酵過程中消耗更多的木糖，產生更多的乙醇。
文檔編號C12P7/10GK101861385SQ200780036026
公開日2010年10月13日 申請日期2007年9月28日 優先權日2006年9月28日
發明者C·M·麥卡欽, M·張, P·V·維塔寧, Y·-C·仇 申請人:納幕爾杜邦公司;可持續能源聯盟有限責任公司