基本上純的螢光素的製作方法

2023-06-04 11:14:06

專利名稱：基本上純的螢光素的製作方法
專利說明基本上純的螢光素 發明領域 本發明涉及包含基本上純的螢光素的組合物，製備基本上純的螢光素的方法，由該方法製備的基本上純的螢光素，測定螢光素純度的分析方法以及用於血管造影術的藥物組合物。

背景技術：
螢光素是橙紅色化合物，C20H12O5，其在鹼性溶液中顯示出強螢光並且例如在醫學中用於診斷目的，在海洋學中用作示蹤劑以及用作紡織染料。
螢光素首先由德國化學家Adolf Von Baeyer於1871年從石油衍生物間苯二酚(1，3-二羥基苯)和鄰苯二甲酸酐合成的。Paul Erlich(德國細菌學家)應用螢光染料(螢光素鈉鹽)(後來被稱為「螢光素鈉」)來示蹤眼中房水的分泌途徑。據說這是螢光染料在體內用於研究生理學的第一個實例。
螢光素血管造影術是重要的診斷工具，它允許研究眼後部的血管病症。這些血管是許多涉及視網膜的疾病的因素。血管造影術是通過將螢光素注射入患者手臂的靜脈來進行的。在很短的時間內(即典型地從幾秒至數秒)，染料通過眼後部的血管，並且當染料在眼血管中循環時，應用配有特別濾光鏡的照相機對染料成像。通過檢查由此產生的影像，可以得出關於任何循環問題的評價，例如血管滲漏、腫脹、異常或新血管等。
螢光素吸收藍光，在465-490nm波長處發生峰吸收和激發。螢光在520-530nm黃綠波長處發生。儘管通常稱為螢光素，但是造影術中所用的染料是螢光素鈉(可溶的螢光素二鈉鹽)。
螢光素靜脈內注射的正常成人劑量是500mg。其典型地以5mL 10％溶液或2mL 25％溶液的劑量包裝。進入循環系統後，約80％的染料分子與血清蛋白結合。當用適合波長的光激發時，剩餘未結合的或游離的螢光素分子發出螢光。染料通過肝代謝形成螢光素單葡糖苷酸，並且在施用後24至36小時內最終通過尿排洩。
已經報導了螢光素配方中的螢光素純度可能與副作用和注射耐受有關。(「Effective differences in the formulation of intravenous fluoresceinand related side effects(靜脈內螢光素配方和相關副作用的有效差異)」，Yannuzi等人，Am.J.Ophthalmol.1974，78(2)，第217-221頁)。因此，消除造影術所用的螢光素組合物中的所有或基本上所有雜質是本發明的主要目的。
將以下出版物可能涉及關於螢光素組合物以及製備和純化螢光素的方法的另外的信息。
德國專利No.136498(Friedrich等人)，標題為「Process for PreparingHighly Purified Fluorescein for Inj ection Purposes(製備用於注射目的的高度純化的螢光素的方法)」，描述了應用吡啶製備螢光素的方法。
美國專利申請公布No.US2006/0106234A1(Tran-Guyon等人)，標題為「High Purity Phthalein Derivatives and Method for Preparing Same(高純度酞衍生物及其製備方法)」，描述了應用無水溶劑製備螢光素的方法。
還參考了以下專利或公布用於進一步的背景美國專利No.5,637,733號(Sujeeth)，標題為「Synthesis of Fluorescein Compounds with ExcessResorcinol as a Solvent(用過量間苯二酚作為溶劑合成螢光素化合物)」，以及美國專利No.1,965,842(Kranz)，標題為「Production ofHydroxybenzene-Phthaleins(羥基苯-酞類的製備)」。
高度純化的螢光素對於製備用於注射目的的溶液是必需的。所用的純化的螢光素理論上應當是(i)無雜質，所述的雜質可能是有毒的和/或缺乏螢光的；(ii)低鹽，所述的鹽可能引起可注射的螢光素產品不可接受的高重量克分子滲透濃度或高張力；並且(iii)顏色淺。某些雜質帶有很強的顏色。因此，在特別的頻率處沒有顏色可以表明此類雜質不存在。因此，螢光素組合物的顏色分布被認為是重要的質量屬性和純度的可視標誌。
需要鑑定並且定量螢光素組合物中可能存在的非常低水平的雜質的方法。該方法應當能夠分離、鑑定並且定量可能存在的那些雜質。
因此，需要的是高純度、顏色淺、氯化鈉含量低的螢光素組合物和不需要應用吡啶或其它非水(和潛在有害的)溶劑來製備該螢光素的方法，以及用於測定該螢光素純度的方法。本發明涉及滿足該需要。
發明概述 本發明涉及包含基本上純的螢光素的組合物，製備純化的螢光素的新的並且改善的方法，以及通過這些方法製備的螢光素組合物。本發明還涉及用於血管造影術包含基本上純的螢光素的藥物組合物，以及測定螢光素組合物純度的方法。通過本發明方法製備的高度純化的螢光素比先前的螢光素組合物具有更低水平的有關物質雜質。通過這些新方法製備的螢光素還比其它已知的組合物顏色淺(在590nm處)，提供了純度的清楚可視的標誌。本發明的螢光素還比其它已知的組合物氯化鈉含量低，因此更易於配製用於藥物用途。本發明的方法對其它已知的方法進行改善在純化過程中不應用吡啶，無需應用無水溶劑，減少了乙醯化粗螢光素所需的乙酸酐的量，以及改善了高度純化的螢光素的產量。通過提供用於分離和定量螢光素組合物中有關物質雜質的可靠方法，從而用於測定螢光素組合物的純度，本發明還促進了技術狀態。
本發明可以在多個申請中體現，包括(但不限於)以下概述的那些 本發明的一個實施方案涉及包含基本上純的螢光素的組合物；更特別的是，螢光素基本上無吡啶。
本發明的另一個實施方案涉及基本上純的螢光素，其不包含濃度大於約0.1％重量、更優選0.01％重量的任何有關物質雜質。
本發明的另一個實施方案涉及具有色數為約0.015至約0.050AUC的基本上純的螢光素。
本發明的另一個實施方案涉及具有殘留氯化物含量小於約0.25％重量的基本上純的螢光素。
本發明的另一個實施方案涉及基本上純的螢光素，其中有關物質雜質的總量小於約0.6％重量、優選小於0.06％重量。
本發明的另一個實施方案涉及製備基本上純的螢光素的方法。該方法包括水解二乙醯基螢光素以形成螢光素，將螢光素用炭處理，過濾，在濾液中加入乙醇，應用酸性溶液調節pH以形成沉澱，過濾並且洗滌。在該實施方案的一個方面中，將pH水平調節至約1.0至約2.5。在另一個方面，當調節pH水平時，將冷卻溫度維持在約20℃至約25℃，並且pH水平調節持續約2至4小時。本發明還涉及由該方法製備的基本上純的螢光素組合物。
本發明的另一個實施方案提供了HPLC方法，該方法用於定量螢光素有關物質雜質的水平。該方法包括獲得組合物的高壓液相色譜圖；確定色譜圖中相應於有關物質雜質的峰並且進行峰面積測量以測定其相對濃度。在該實施方案的一個方面中，峰具有相對HPLC保留時間為約0.75、1.19、1.23、1.68和1.71。另一個實施方案提供了HPLC/MS方法，該方法用於確定螢光素中的有關物質雜質。
本發明優選的實施方案涉及用於血管造影術包含基本上純的螢光素的藥物組合物，更特別的是組合物，其中螢光素是基本上無吡啶的。
本發明另一個優選的實施方案涉及用於血管造影術包含基本上純的螢光素的藥物組合物，其中組合物不包含濃度高於約0.1％重量、更優選0.01％重量的任何有關物質雜質。
本發明另一個優選的實施方案涉及用於血管造影術包含基本上純的螢光素的藥物組合物，其中組合物中存在的有關物質雜質的總量小於約0.6％重量、更優選小於約0.06％重量。
本發明另一個優選的實施方案涉及用於血管造影術包含基本上純的螢光素的藥物組合物，其中螢光素具有色數為約0.015至約0.050AUC。
本發明另一個優選的實施方案涉及用於血管造影術的螢光素的藥物組合物，其中組合物具有殘留氯化物量小於約0.25％重量。
本發明通過以下附圖和詳述進行更全面的討論。
附圖簡述

圖1是螢光素洗滌試驗的試驗設計圖。
圖2是螢光素pH/沉澱試驗的試驗設計圖。
圖3是顯示實施例3中描述的螢光素藥物的顏色強度的UV/VIS光譜圖。
圖4是實施例5中描述的稀釋空白的HPLC色譜圖。
圖5是實施例5中描述的1％USP螢光素參考標準品的HPLC色譜圖。
圖6是實施例5中描述的供應商A螢光素原料的HPLC色譜圖。
圖7是實施例5中描述的添加0.8％間苯二酚的螢光素原料的HPLC色譜圖。
圖8是實施例5和6中描述的螢光素的結構圖和有關物質雜質的可能的結構圖。
圖9是來自LC/MS系統的螢光素的代表性HPLC色譜圖。
圖10是(a)UV檢測的螢光素色譜圖；和(b)在13.65-14.45分鐘取樣的螢光素的HPLC峰的熱噴霧質譜圖。
圖11是(a)應用質譜儀在m/z 259處的質量選擇檢測的螢光素中雜質A的色譜圖；和(b)在11.95-12.05分鐘取樣的雜質A的HPLC峰的熱噴霧質譜圖。
圖12是(a)應用質譜儀在m/z 285處的質量選擇檢測的螢光素中雜質B的色譜圖；和(b)在15.45-15.55分鐘取樣的雜質B的HPLC峰的熱噴霧質譜圖。
圖13是(a)應用質譜儀在m/z 347處的質量選擇檢測的螢光素中雜質C的色譜圖；和(b)在16.10-16.50分鐘取樣的雜質C的HPLC峰的熱噴霧質譜圖。
圖14是(a)應用質譜儀在m/z 347處的質量選擇檢測的螢光素中雜質D的色譜圖；和(b)在18.20-18.65分鐘取樣的雜質D的HPLC峰的熱噴霧質譜圖。
圖15是(a)應用質譜儀在m/z 333處的質量選擇檢測的螢光素中雜質E的色譜圖；(b)在13.23-13.52分鐘取樣的雜質E的HPLC峰的APCI質譜圖；(c)通過220-500nm的總吸收掃描檢測的螢光素中雜質E的色譜圖；和(d)雜質E峰的UV-Vis光譜圖。
圖16是(a)應用質譜儀在m/z 425處的質量選擇檢測的螢光素中雜質F的色譜圖；(b)在19.10-19.32分鐘取樣的雜質F的HPLC峰的APCI質譜圖；(c)通過220-500nm的總吸收掃描檢測的螢光素中雜質F的色譜圖；和(d)雜質F峰的UV-Vis光譜圖。
圖17是(a)應用質譜儀在m/z 375處的質量選擇檢測的螢光素中雜質G的色譜圖；(b)在21.27-21.54分鐘取樣的雜質G的HPLC峰的APCI質譜圖；(c)通過220-500nm的總吸收掃描檢測的螢光素中雜質G的色譜圖；和(d)雜質G峰的UV-Vis光譜圖。
圖18是(a)在51.75-51.85分鐘取樣的雜質H-1的HPLC峰的APCI質譜圖；(b)通過220-500nm的總吸收掃描檢測的螢光素中雜質H-1的色譜圖。
圖19是(a)在52.67-52.79分鐘取樣的雜質H-2的HPLC峰的APCI質譜圖；(b)通過220-500nm的總吸收掃描檢測的螢光素中雜質H-2的色譜圖。
圖20是雜質H-2的UV-Vis吸收掃描。
發明詳述 除非另外說明，本文所用的以下縮略語和術語應當理解為具有以下含義 縮略語「APCI」表示大氣壓化學電離。
縮略語「M/S」或「MS」表示質譜。
縮略語「HPLC」表示高效液相色譜。
縮略語「UV-Vis」表示紫外-可見。
縮略語「LC/MS」表示液相色譜/質譜。
術語「炭」包括有效降低色數的活性炭試劑。示例性試劑包括但不限於

SA Plus和

SX Ultra，從供應商Univar USA，Dallas，Texas可商購獲得。能夠降低色數的炭形式可以通過常規試驗來確定。(已經確定例如另一種可商購獲得的炭形式沒有有效降低色數，即

KB。) 術語「色數」是指在590nm處測量時，在pH9.4的氫氧化鈉和碳酸氫鈉水溶液中製備的1.0％的螢光素原料溶液的吸收。
術語「螢光素藥物」和「螢光素原料」在本文可互換應用。
術語「有關物質雜質」包括螢光素的合成的雜質、異構體、氧化產物、二聚化產物和分解產物和/或螢光素反應物。該有關物質雜質的示例性結構如圖8中所示。
術語「基本上無吡啶」表示螢光素組合物至少99％無吡啶。更優選的是分析純至少99.9％；甚至進一步優選的是螢光素組合物完全無吡啶。
術語「基本上純的螢光素」指的是總體不存在或接近總體不存在雜質、例如有關物質雜質。例如，當螢光素組合物被稱為是基本上純的時，其中或者沒有可檢測到的有關物質雜質，或者如果檢測到單個有關物質雜質，那麼它是以不大於0.1％重量的量存在，或者如果檢測到多個有關物質雜質，那麼它們是以合計不大於0。6％重量的量存在。
本發明的方法製備低有關物質雜質分布的螢光素產物。通常已知即使純化的螢光素物質也可能包含低水平的某些雜質，例如間苯二酚和2-(2』，4』-二羥基苯甲醯基)苯甲酸。但是，先前沒有認識到螢光素商購樣品可能包含除間苯二酚和2-(2』，4』-二羥基苯甲醯基)苯甲酸之外的許多雜質。通過本發明的方法基本上降低了這些潛在的雜質的量。此類雜質在本文統稱為「有關物質雜質」。
進行試驗，通過LC/MS測定這些有關物質雜質的分子量，並且儘管無需結合理論，但是本文的這些雜質的結構是可能的(參見圖8)。以下發現並且詳述了用於分辨和定量甚至在純化的螢光素組合物中可能存在的低水平有關物質雜質的方法。本文發現了本發明的方法提供了高度純化的螢光素，其具有基本上降低的水平的有關物質雜質。這一點可以在本發明的純化的螢光素藥物的雜質分布中觀察到，如下表1所示，相比於來自多個廠商的技術級螢光素的雜質分布，如下表2所示，以及來自多個廠商的螢光素藥物的雜質分布，如下表3至5所示。







本發明涉及的通用方法的示意圖說明如下。將商品級螢光素通過與乙酸酐在回流溫度下反應來二乙醯化。將所產生的二乙醯化的螢光素分離，然後與鹼反應，產生脫乙醯化的螢光素，然後將其用炭處理，產生顏色淺、高純度和氯化物含量低的螢光素。反應流程圖說明如下
製備本發明純的螢光素所用的特別溶劑、反應時間和溫度以及pH值已經基於一系列試驗確定。這些試驗的目的是獲得高純度、顏色淺和鹽含量低的藥物級螢光素，以及避免應用在現有已知方法中所用的有害溶劑，即吡啶。另外的目的是通過例如應用最少量的溶劑或降低必需步驟的反應循環時間使得本方法中涉及的花費和時間最小化。
純化螢光素的方法開始於將螢光素轉化為O，O』-二乙醯基螢光素。對於該目的，將乙酸酐用作溶劑和試劑，完全避免應用吡啶，一種在現有技術方法中所用的有害溶劑。因此，將螢光素和乙酸酐的混合物在回流下攪拌數小時，並且將產生的懸浮液冷卻。進一步冷卻至冰點或剛低於產生完全結晶。收集結晶物質並且先用冷的乙酸酐洗滌，然後用冷的丙酮洗滌。然後將物質再懸浮於丙酮中，同時攪拌並且溫和加熱。冷卻後，收集白色結晶物質，用冷的丙酮洗滌並且空氣乾燥，得到高純度的O，O』-二乙醯基螢光素。
然後，將O，O』-二乙醯基螢光素逆轉化為螢光素，同時形成鈉鹽並且除去最終的雜質。為了完成該轉化，應用苛性溶液將O，O』-二乙醯基螢光素的乙醯基水解。因此，將O，O』-二乙醯基螢光素和甲醇裝入適合的容器中，加入製備的氫氧化鈉的去離子水溶液，並且將混合物加熱至回流，同時攪拌。然後將混合物冷卻，應用助濾劑過濾，然後用甲醇洗滌。然後通過真空蒸餾減少濾液的體積，加入水，並且將反應混合物冷卻。然後將反應混合物的pH調節至8.5至8.7之間。加入適合的炭、例如

SXUltra，同時攪拌1小時。如果需要，重複加入炭的步驟。接下去是關鍵的沉澱步驟。首先，在濾液中加入乙醇，從而獲得2∶1比例的乙醇-水。該比例是基於意外的發現，在沉澱過程中有機溶劑與水的比例越高，產生的螢光素產物中氯化物含量越低。為了明確該作用所進行的試驗在下面進一步描述。然後，為了酸化螢光素，加入稀釋的鹽酸溶液，以便確定校準的pH範圍。該範圍是基於意外的發現，pH越低，提供更需要的顏色的產物。更特別的是，通過試驗確定，濾液最適的pH範圍應當在1.0至2.5之間，並且酸化應當緩慢進行，例如歷經2至4小時進行，從而避免產物的聚集，並且冷卻。進一步攪拌並且冷卻後，將螢光素通過過濾分離。將產物用水和乙醇的溶液洗滌，並且乾燥產物，獲得80-90％產率的非常高質量螢光素。該高純度的螢光素可以用於製備注射用的螢光素。對於該目的，應用氫氧化鈉將螢光素轉化為可溶的二鈉鹽形式，並且裝入安瓿中用於隨後的滅菌。
為了完成本發明方法所進行的試驗的一個實例是校準pH範圍，在該pH範圍內螢光素產物沉澱。部分基於對形成的產物的顏色譜的經驗觀察將該pH範圍從更高調節至更低範圍。因此，確定了最佳的pH範圍是約pH1.0至約pH 2.5，在該pH範圍內螢光素產物應當沉澱，以便實現顏色淺產物的目的。
還意外發現，在沉澱過程中，有機溶劑與水性溶劑的比例越高，產生的螢光素產物中的氯化物含量越低。該結果不是預期的，因為預期的是低的有機物/水性物比例對於降低氯化鈉水平是必需的。更高比例的有機溶劑的應用對改善過濾速率具有額外的益處，從而減少了處理物質所需的時間。
進行進一步的沉澱試驗以開發本發明的方法並且描述如下，並且在圖1和2中顯示。特別的是，進行試驗以通過改變沉澱方法來降低氯化物水平，如下表6所示。
表6沉澱試驗 ＊水∶乙醇，3∶1，2×1體積洗滌 表6顯示了沉澱介質的溶劑比的改變影響存在的氯化物的量。特別的是，增加沉澱介質中乙醇與水的比例產生更低的氯化物含量。試驗A顯示當水∶乙醇(1∶1)沉澱介質的體積由10體積(參考)增加至15體積(參見表6)時，氯化物含量微小降低。試驗B將來自水∶乙醇(1∶1，10體積，參考)的沉澱與來自水∶乙醇(2∶1，15體積)的沉澱進行了比較。試驗結果與直覺相反，因為具有更低水含量和更小體積的參考反應產生更低的氯化物含量。
試驗C將來自水∶乙醇(1∶1，10體積，參考)的沉澱與來自水∶乙醇(1∶2，15體積)的沉澱進行了比較。試驗C的結果顯示更高有機物含量的沉澱介質產生更低的氯化物含量。
沉澱介質中更高有機物含量產生更低的氯化物含量的趨勢在試驗D、E、F和G以及試驗H、I、J和K(對於未洗滌和洗滌的產物)中得到了重現。儘管結果顯示與直覺相反，但是相信(沒有結合理論)更高的有機物含量允許更快和更有效的洗滌產物塊。
所考慮的另一方面是螢光素顏色是否取決於沉澱介質的pH；參見下表7，其中應用2∶1比例的乙醇∶水的沉澱介質。
表7 作為pH函數的螢光素顏色 [乙醇∶水(2∶1)的沉澱介質] 結果表明螢光素顏色對pH變化是敏感的。例如，在pH約3.0時，產物的外觀開始呈現慄色，其被認為是不希望的。
提供以下實施例1-8以進一步說明本發明的某些實施方案。由實施例5、6、7和/或8獲得的代表性數據如圖9至19所示。
圖9-14的數據是由LC/MS獲得的，應用熱噴霧質譜與HPLC連接。峰是通過應用UV檢測器(280nm)和熱噴霧質譜來觀察的。試驗條件儀器＝Vestec Model 201B熱噴霧質譜，連接Waters Model 600 MS HPLC系統和Waters Model 486MS UV檢測器(280nm)；柱＝Waters SymmetryC-8，5μm，3.9×150mm；流動相＝歷經25分鐘由0％B至100％B程序化的線性梯度；流動相A＝在10∶90 V∶V甲醇∶水中的0.1M乙酸銨；流動相B＝在甲醇中的0.1M乙酸銨；流速＝1.0mL/分鐘；樣品濃度＝純的；以及進樣體積＝20μL。
圖15-20的數據是由LC/MS獲得的，應用質譜與HPLC連接。該質譜是應用大氣壓化學電離(APCI)接口，並且質譜是在正離子檢測模式下運行的。峰是通過應用監測220-500nm總吸收的UV-Vis檢測器和質譜來觀察的。應用Waters Symmetry C-8柱(3.9×150mm)，流速0.6mL/分鐘，並且設定程序為歷經30分鐘由0％流動相B至100％流動相B。流動相B是在甲醇中的0.01M乙酸銨，並且流動相A是在10∶90/甲醇∶水中的0.01M乙酸銨。
實施例1 螢光素二乙酸酯的形成
在5升3頸圓底燒瓶中加入螢光素(1000g，3.01mol)和乙酸酐(1622g，15.9mol)。將產生的混合物在回流下攪拌3-5小時並且將產生的懸浮液冷卻至室溫。繼續攪拌，將反應混合物進一步冷卻至-5至3℃，以實現完全結晶。將結晶的物質收集在Buchner過濾器上，用冷的乙酸酐(2×500mL)洗滌，然後用冷的丙酮(1×600mL)洗滌。將物質部分乾燥並且重新懸浮於丙酮(1000mL)中，同時攪拌並且溫和加熱。一旦冷卻，將白色結晶物質收集在過濾器上，用冷的丙酮(2×700mL)洗滌並且空氣乾燥。產率～75％-85％；TLC顯示單點；MP＝203-205.5℃；並且純度99.7％。
實施例2 由二乙醯基螢光素形成螢光素，鈉鹽的形成以及除去最終的雜質
將O，O』-二乙醯基螢光素(1000g)和甲醇(4000mL)裝入適合的反應器中。單獨地，在去離子水(620mL)中製備氫氧化鈉溶液(480g，50％苛性)。將氫氧化鈉溶液裝入包含O，O』-二乙醯基螢光素和甲醇的反應器中。將混合物加熱至回流並且在回流下攪拌90分鐘。將反應混合物冷卻至20℃至25℃之間。應用助濾劑(100g)將混合物過濾，然後用甲醇(500mL)洗滌。將濾液(5000mL)在真空下蒸餾至殘留體積在1400mL至1700mL之間，然後將反應混合物冷卻至20℃至25℃之間。將去離子水(5000mL)加入至蒸餾濃縮物中。單獨地，在去離子水(72g)中製備氫氧化鈉溶液(56g，50％苛性)。將新鮮製備的氫氧化鈉溶液(100mL)用於調節反應的pH至8.5至8.7之間。在室溫下，將Norit SX Ultra(100g)、助濾劑(100g)和去離子水(500mL)加入至反應中，然後將混合物攪拌1小時。將此批過濾並且在室溫下將另外的Norit SX Ultra(100g)和去離子水(500mL)加入至濾液中，然後將混合物攪拌1小時。將此批過濾並且用去離子水(2000mL)洗滌。將乙醇(10000mL)加入至濾液中。單獨地，通過將鹽酸(32％，820g)溶於去離子水(320mL)中製備鹽酸溶液。將稀釋的酸溶液用於調節濾液的pH至1.0至2.5之間，同時將此批的溫度維持在20℃至25℃之間。將此批在20℃至25℃之間攪拌1小時，然後通過過濾分離。將濾餅用(注射用水∶乙醇)(3∶1)溶液(2×1000mL)洗滌。將產物乾燥，得到典型地為80-90％產率的非常高質量的螢光素。
實施例3 螢光素藥物顏色強度 儀器 能夠接受1cm比色杯和從660nm掃描至570nm的分光光度計。
適合波長從660nm至570nm的物質、例如石英的分光光度計比色杯(1cm光程長)。
螢光素藥物的顏色強度如以下描述的測定。該方法用於確定在pH9.4的氫氧化鈉和碳酸氫鈉水溶液中製備的1.0％的螢光素原料溶液的顏色，通過測量其在590nm處的吸收而實現。該數值還可以稱為「色數」。在590nm處測量吸收的增加相應於完成的藥物產品可見的顏色強度的增加。
將螢光素(250mg±5mg，精確稱量)和碳酸氫鈉(50mg)稱重放入25mL燒杯中。加入氫氧化鈉(5mL，1％)。將溶液在攪拌下溫和溫熱。加入氫氧化鈉(1％，至多另外1mL，合計6.0mL)直至所有的物質溶解並且溶液澄清。將反應冷卻至室溫。將pH調節至pH9.4，如果需要，滴加1％氫氧化鈉。如果pH高於9.4，將溶液棄去並且應用更少的氫氧化鈉重新製備。將溶液定量地轉移至容量瓶(25mL)中並且用純水QS至25.0mL。終濃度為10mg/mL或1％。
方法 將分光光度計調零，通過用樣品和參考比色杯中的純水建立空白用戶基線，以100nm/分鐘的速率從660nm掃描至570nm而實現。將螢光素溶液(1％)加入至樣品比色杯中。將樣品溶液以100nm/分鐘的速率從660nm掃描至570nm。吸收讀數在590nm處記錄。一式兩份的測量在分開的等份樣品上進行。表1列出了應用該方法試驗的數個螢光素原料樣品的典型的色數結果。該結果應用以下部分所示的等式校正。圖3顯示了由螢光素原料樣品獲得的典型的光譜。
計算 對於樣品濃度將吸收讀數進行如下校正
樣品螢光素批次的顏色強度測量是如實施例2中描述的那樣獲得的，並且在下表8中列出。
表8
實施例4 應用電位滴定法測量螢光素殘留氯化物 儀器 Brinkman 716 DMS Titrino自動滴定儀或同等物 Brinkman 730樣品轉換器和759擺動頭(Swing Head)自動進樣器或同等物 Ag滴定電極 5-位分析天平或同等物 超聲儀 加熱板 能夠3,000rpm的離心機 培養管，16×125mm，VWR Cat#47729-578或同等物 16mm培養管的白色蓋子，VWR Cat#60828-760或同等物 血清過濾器，6×16mm，VWR Cat#28295-556或同等物 以下方法用於定量螢光素中殘留的氯化物的量，應用電位硝酸銀滴定液、自動滴定儀和銀電極。
(1)試劑溶液的製備，氫氧化銨(5N) 在純水(～600mL)中加入濃氫氧化銨(～338mL)並且用純水稀釋至1000mL。將該溶液用於自動滴定儀衝洗和儲存銀電極。
(2)標準化的溶液製備，硝酸銀，0.10N，水溶液 優選應用具有分析證書的商購的製備的0.10N硝酸銀溶液。但是，如果無法獲得商業證明的硝酸銀溶液，那麼可以將硝酸銀(17.0g)稱重並且溶於純水(1000mL)中並且標準化。將氯化鉀參考標準品(乾燥的，50mg)稱重並且溶於滴定杯中的純水(～30mL)中。將硝酸(1mL)加入至該溶液中。將溶液應用銀棒電極進行電位滴定。每mL的0.10N硝酸銀相當於7.455mg的氯化鉀。應用以下等式計算硝酸銀的當量濃度N AgNO3＝(mg KCl×純度KCl)/(mL AgNO3×74.55)。
(3)樣品製備和滴定 將螢光素原料(2g)稱重至培養管(16×125mm)中。加入純水(熱的，10mL)。加入硝酸(1mL)並且將所有試管蓋好，振搖2分鐘並且超聲15分鐘。將所有試管離心30分鐘(～3,000rpm)。應用血清過濾器將沉澱物從上清液中分離。將溶液倒入滴定杯中。用純水(5mL一份)將血清衝洗並且過濾。將衝洗液倒入滴定杯中。將血清過濾器移走並且丟棄。將上述方法重複第二次，除了將所有試管蓋好並且振搖1分鐘，並且將所有試管離心20分鐘(～3,000rpm)。將第一次和第二次提取物的溶液合併並且將血清過濾器用純水衝洗。將合併的溶液用0.10N AgNO3滴定至其電位終點。滴定參數包括每個樣品之後應用洗滌循環(5N氫氧化銨)和衝洗循環(5N氫氧化銨)。參數清單如下所示。
(4)計算
V＝0.10N AgNO3滴定的體積 N＝AgNO3滴定液的當量濃度 35.453＝氯化物的分子量 W＝所取的螢光素樣品的重量 表9
實施例5 在該方法中，在甲醇中製備螢光素原料溶液並且應用高效液相色譜(HPLC)系統、梯度流動相程序和C-18柱與其有關物質分離。有關物質是對螢光素參考標準品的1％溶液定量的。將紫外HPLC檢測器用於測量280nm處波長處的峰響應。流動相A是0.01M乙酸銨、10％甲醇/90％水和0.5％乙酸。流動相B是0.01M乙酸銨、100％甲醇、0.5％乙酸。參考標準品是0.5mg/mL螢光素的甲醇溶液，在甲醇中稀釋至終濃度為0.005mg/mL，或者類似製備的1％的樣品，最終理論濃度為0.5mg/mL的螢光素。應用能夠程序化梯度操作的高效液相色譜系統，具有HPLC UV/VIS檢測器並且監測280nm的能力。柱3.9×150mm Waters Symmetry C-18柱，5μm(或同等物)，對於螢光素能夠至少20,000塔板/柱。流速0.6mL/分鐘。梯度程度如下 時間(分鐘)％流動相A％流動相B 0 80％ 20％ 6020％ 80％ 柱洗滌 61 0％100％ 66 0％100％ 平衡 67 80％ 20％ 應用峰面積，計算等於或大於0.025％的已知和未知雜質的百分數濃度，如以下計算部分所示。儘管該方法的定量限是0.025％，但是雜質通常是以濃度≥0.05％報導的。在螢光素的分析中發現9種雜質並且它們的分子量是通過LC/MS確定的。它們可能的結構在圖8中呈現。發現雜質H為兩個非對映異構體，H-1和H-2。應用該色譜方法，在該方法中所引用的螢光素批次中鑑定的雜質的典型的相對保留時間(RRT)、容量因子(k』)和洗脫時間的梯度組成(％B)如下 RRT k』 B(％) 雜質A 0.7511.143.0 雜質D 1.1918.256.5 雜質F 1.2318.857.7 雜質H-1 1.6826.071.0 雜質H-2 1.7126.572.0 如果峰的相對保留時間、容量因子和近似的流動相組成相應於上述有關物質，那麼螢光素色譜圖中的峰可以鑑定為有關物質A、D、F、H-1或H-2。但是，色譜系統間每個相對保留時間值可以變化約0.02。色譜系統的修改也可以影響上述值。儘管雜質B、C、E和G沒有在本分析的四個螢光素批次中鑑定出來，但是供應商A螢光素的在先LC/MS分析表明雜質B、C、E和G具有約1.09、1.11、1.20和1.44的RRT’s。RRT’s分別為1.10和1.74的兩個未知雜質存在於本申請報導的四批螢光素原料中。它們的濃度在0.025％至0.05％之間。在RRT＝1.10處的未知峰可能是雜質B或C。螢光素原料樣品的色譜圖如圖6所示。在螢光素藥物中觀察到了二乙醯基螢光素並且出現在相對於螢光素的1.35的保留時間處。
間苯二酚是螢光素的已知常見雜質。間苯二酚在螢光素的合成中用作原料並且是潛在的降解產物。如以上呈現的，發現間苯二酚在RRT為0.14、k』為2.9並且％B為24.6處洗脫。偶爾可以發現間苯二酚作為未分離的雙峰洗脫。包含間苯二酚的螢光素藥物的色譜圖如圖7所示。
鑑定任何非相關的峰(即溶劑前沿、系統峰)加上間苯二酚並且從以下計算中省略。間苯二酚在RRT為約0.14處洗脫(參見圖7)。計算每個有關物質的百分數濃度，如下所示。

％總的有關物質＝∑(單個雜質≥0.025％) 通過將濃度為0.025％或更高的雜質相加來計算總的雜質。
依照下式計算相對保留 ti＝雜質峰的保留時間 tf＝螢光素峰的保留時間 確定該方法的定量限為0.127μg/mL的螢光素(0.025％的樣品製劑濃度)。確定檢測限為0.05μg/mL的螢光素(0.01％的樣品製劑濃度)。
應用該方法分析四批供應商A螢光素原料。檢測出七種雜質並且鑑定出五種雜質(A、D、F、H-1和H-2)。可報告的雜質(≥0.025％)的總百分數範圍為0.2％至0.7％之間。結果列於下表10。
在該方法的可選擇的方法中，將樣品和標準品製劑的稀釋液變成允許同時分析間苯二酚和其它有關物質雜質。為了製備稀釋液，首先將0.77g乙酸銨溶於1000mL水中，用乙酸將pH調節至3.9，然後加入等體積的乙酸銨緩衝液和甲醇。首先以50mg比15mL的比例將螢光素溶於甲醇中，然後如實施例5中描述的方法，將該稀釋液替代甲醇用於稀釋標準品和樣品，同樣將空白由甲醇變成稀釋液。在用稀釋液稀釋後，將螢光素標準品和樣品製劑避光。間苯二酚和鄰苯二甲酸的典型的相對保留時間(RRT)如下 RRT k』 B(％) 間苯二酚0.131.2124.2％ 鄰苯二甲酸 0.161.5324.9％ 還可以將RRF(相對響應因子)添加到雜質的計算中，其中RRF表示相對於螢光素的響應。
雜質RRF1 間苯二酚1.7 鄰苯二甲酸 2.6 雜質A 0.43 雜質D 1.0 雜質F 1.0 雜質H-1 1.0 雜質H-2 1.0 每個有關物質的百分數濃度可以計算如下
1雜質D、F、H-1和H-2的相對響應因子沒有確定。它們的相對響應因子設定為1.0。

實施例6 進行研究以確定螢光素有關物質雜質的鑑定。分析螢光素樣品中雜質的存在和濃度。鑑定分析是通過高效液相色譜/質譜(LC/MS)進行的。
將由LC/MS系統獲得的代表性的HPLC色譜圖進行重複，如圖9所示。螢光素在色譜圖中顯示出主要峰。圖10(b)中所示的螢光素的熱噴霧質譜圖在m/z 333處顯示出M+H分子離子，其與332的分子量一致。
圖11(b)中所示的雜質A的熱噴霧質譜圖在m/z 259處顯示出M+H分子離子，表示258的分子量。圖8中雜質A([2-(2』，4』-二羥基苯甲醯基)苯甲酸])的可能的結構先前作為螢光素製劑中的雜質已經報導。
圖12(b)中所示的雜質B的熱噴霧質譜圖在m/z 285處顯示出M+H分子離子，表明284的分子量。284的分子量可能對應於C15H8O6、C16H12O5和C17H18O4的元素式。圖8中所示的雜質B的可能的結構可能來源於間苯二酚與琥珀酸的反應(在鄰苯二甲酸用於螢光素前體中作為雜質)。
圖13(b)中所示的雜質C的熱噴霧質譜圖在m/z 347處顯示出M+H分子離子。這表示346的分子量，並且對應於比螢光素增加14個質量單位。
圖14(b)中所示的雜質D的熱噴霧質譜圖也在m/z 347處顯示出M+H分子離子，其可能是雜質C的異構體。雜質C和D的可能的結構彼此是互變異構體，它們都是螢光素的奎寧型氧化產物。
圖15(b)中所示的雜質E的APCI在m/z 333處顯示出M+H分子離子，表明332的分子量，以及UVmax在492nm處的UV光譜。因此，這表示雜質E可能是螢光素的位置異構體。
圖16(b)中所示的雜質F的APCI在m/z 425處顯示出M+H分子離子，表明424的分子量，以及UVmax大於400nm。該光譜顯示出與將另外的間苯二酚分子加入至母體化合物中一致。因此，化合物F可能由三個間苯二酚形成，而母體可能由兩個間苯二酚形成。
圖17(b)中所示的雜質G的APCI在m/z 375處顯示出M+H分子離子，表明374的分子量，以及UVmax在484nm處。光譜和親脂性顯示出與螢光素的乙酸酯一致。
圖18(a)和19(a)中所示的雜質H-1和H-2的APCI在m/z 739處顯示出兩個化合物的M+H分子離子，表明每個分子量為738。兩個化合物的UV-Vis吸收光譜是相同的，UVmax在233nm處，並且更弱的吸收最大值在462和488nm處。雜質H-2的吸收光譜如圖20所示。
實施例7 注射用螢光素或25％的螢光素鈉(Fluorescite)的製備 在60％的所需的注射用水的配料罐中，溶解並且稱量所需量的氫氧化鈉。加入並且溶解螢光素。如果溶解所需，加入另外的注射用水，但是體積不超過總體積的90％。攪拌30分鐘後，如果螢光素沒有完全溶解，進行下一步，調節pH。將pH調節至9.4，其用3N氫氧化鈉和/或1N鹽酸完成。將混合物在180 R.P.M.下攪拌30分鐘。重新檢查pH。如果低於9.3或高於9.5，用3N氫氧化鈉和/或1N鹽酸重新調節至9.4。將螢光素鈉溶液用另外的注射用水定容，並且攪拌15分鐘。如上所述重新檢查pH。應用氮氣罐，將溶液加壓過濾通過一系列具有5微米、0.8微米和0.45微米孔徑的三個膜過濾器，過濾至無菌填充罐中。應用上述方法，重新檢查產物的pH。將樣品無菌取出用於試驗室試驗。將產物裝入先前滅菌的安瓿中。在每個安瓿中加入2.15至2.25mL。裝入後立刻將樣品通過標準方法頂封或拉封。在滅菌過程中檢查每個安瓿的封口。取決於批次大小，將安瓿在121℃下高壓滅菌20分鐘或更長。仔細檢查滲漏。在最佳的光學條件下逐個檢查每個安瓿的不溶性微粒。
實施例8 注射用螢光素或10％螢光素鈉的製備 作為製備注射用螢光素的可選擇的方法，在適合的不鏽鋼罐中加入約70％-75％的批量注射用冷水(約30℃)。加入螢光素並且混合直至懸浮液完全。記錄初始pH。加入足量(總體積的約7.5％)的7N氫氧化鈉，然後加入另外量的7 N氫氧化鈉，添加間在等待約15分鐘後重新檢查pH值，直至pH在9.3-9.5之間，目標為pH9.4。如果pH高於9.5，通過加入1N鹽酸調節pH，以獲得pH範圍為9.3-9.5。在pH範圍達到後，繼續混合不少於15分鐘。將該批用注射用水調至最終重量，並且混合不少於30分鐘。測量pH並且用氫氧化鈉或鹽酸調節至所需的。將產物無菌地裝入無菌的小瓶中，根據標準操作方法進一步檢查並且試驗。
本文突出顯示的特別的實施方案不旨在是本發明所有實施方案的目錄。進一步的是，本領域那些技術人員將認識到或能夠確定只是應用常規試驗，本發明實施方案的許多同等物。這些同等物旨在包括在以下權利要求中。
權利要求
1.包含基本上純的螢光素的組合物。
2.權利要求1的組合物，其中組合物是基本上無吡啶的。
3.權利要求1的組合物，其中組合物不包含濃度大於約0.1％重量的任何有關物質雜質。
4.權利要求3的組合物，其中組合物不包含濃度大於約0.01％重量的任何有關物質雜質。
5.權利要求1的組合物，其中組合物中存在的有關物質雜質的總量小於約0.6％重量。
6.權利要求5的組合物，其中組合物中存在的有關物質雜質的總量小於約0.06％重量。
7.權利要求1的組合物，其中基本上純的螢光素具有約0.015至約0.050AUC的色數。
8.權利要求1的組合物，其中組合物中存在的殘留氯化物的量小於約0.25％重量。
9.製備基本上純的螢光素的方法，該方法包括(a)水解二乙醯基螢光素以形成螢光素；(b)將炭加入至螢光素的溶液中以形成螢光素/炭混合物；(c)過濾螢光素/炭混合物；(d)將乙醇加入至濾液中；(e)應用酸性溶液調節pH以形成沉澱；(f)過濾；和(g)洗滌。
10.權利要求9的方法，其中將步驟(e)中的pH調節至約1.0至約2.5的水平。
11.權利要求9的方法，其中步驟(e)是在冷卻下進行的。
12.權利要求9的方法，其中將步驟(e)進行約2至約4小時。
13.通過權利要求9的方法製備的基本上純的螢光素。
14.確定螢光素組合物純度的方法，該方法包括(a)獲得組合物的高壓液相色譜圖；(b)鑑定色譜圖中相應於有關物質雜質的峰；和(c)進行峰面積測量以確定其相對濃度。
15.權利要求14的方法，其中峰具有相對HPLC保留時間為約0.75、1.19、1.23、1.68和1.71。
16.用於血管造影術的藥物組合物，該藥物組合物包含基本上純的螢光素和注射用載體。
17.權利要求16的組合物，其中組合物是基本上無吡啶的。
18.權利要求16的組合物，其中組合物不包含濃度大於約0.1％重量的任何有關物質雜質。
19.權利要求16的組合物，其中組合物中存在的有關物質雜質的總量小於約0.6％重量。
20.權利要求16的組合物，其中基本上純的螢光素具有約0.015至約0.050AUC的色數。
21.權利要求16的組合物，其中組合物中存在的殘留氯化物的量小於約0.25％重量。
22.包含通過權利要求9的方法製備的基本上純的螢光素的組合物。
23.包含通過二乙醯基螢光素的脫乙醯基作用製備的基本上純的螢光素的組合物。
全文摘要
本發明涉及製備基本上純的螢光素的改善的方法，以及由該方法製備的基本上純的螢光素。本發明特別涉及提供用於血管造影術的藥物組合物。由本發明方法製備的基本上純的螢光素顏色淺、氯化鈉含量低並且基本上無吡啶。
文檔編號C07D493/10GK101605796SQ200780045627
公開日2009年12月16日 申請日期2007年12月4日 優先權日2006年12月11日
發明者G·彼得林斯基, G·R·哈裡斯, B·S·斯科特 申請人:愛爾康研究有限公司