二氫丁苯那嗪類及包含它們的藥用組合物的製作方法

2023-06-20 03:12:46 4

專利名稱：二氫丁苯那嗪類及包含它們的藥用組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的二氫丁苯那嗪異構體、包含它們的藥用組合物、製備它們的方法及它們的治療用途。
背景技術：
丁苯那嗪(化學名1，3，4，6，7，11b-六氫-9，10-二甲氧基-3-(2-甲丙基)-2H-苯並(a)喹嗪-2-酮)自二十世紀五十年代後期已作為藥物使用。丁苯那嗪最初作為抗精神病藥使用，現在用於治療運動過度的運動失調例如亨廷頓氏病、偏側顫搐(hemiballismus)、老年性舞蹈病、抽搐、遲發性運動障礙和圖雷特氏症候群，參見例如Jankovic等，Am.J.Psychiatry.(1999)Aug；156(8)1279-81和Jankovic等，Neurology(1997)Feb；48(2)358-62。
丁苯那嗪的主要藥理作用是通過抑制人液泡單胺轉運蛋白同工型2(hVMAT2)減少中樞神經系統內單胺(例如多巴胺、血清素和去甲腎上腺素)的供應量。該藥物還阻斷突觸後的多巴胺受體。
丁苯那嗪是治療多種運動過度的運動失調的有效和安全的藥物，並且與經典的抗精神病藥相反，未顯示其導致遲發性運動障礙。然而，丁苯那嗪存在許多與劑量相關的副作用包括引起抑鬱、帕金森氏徵、嗜睡、神經質或焦慮、失眠和在罕見病例中引起抗精神病藥(neuroleptic)的惡性症候群。
丁苯那嗪的中樞作用與利血平的非常類似，但與利血平不同的是其對VMAT1轉運蛋白無活性。對VMAT1轉運蛋白無活性意味著丁苯那嗪與利血平相比外周活性更小，因此不產生與VMAT1-相關的副作用例如低血壓。
丁苯那嗪的化學結構在下

圖1中顯示。
圖1-丁苯那嗪的結構化合物在3和11b碳原子上具有手性中心，因此理論上可存在合計4種異構形式，如圖2顯示。
圖2-可能的丁苯那嗪異構體在圖2中，用Cahn，Ingold和Prelog建立的「R和S」命名法定義每種異構體的立體化學，該命名法參見Jerry March的AdvancedOrganic Chemistry(高級有機化學)，第4版，John Wiley Sons，NewYork，1992，109-114頁。在圖2和本專利申請的其它各處中，按照碳原子位置編號的順序給出「R」或「S」的指示。因此，例如，RS是3R，11bS的速記符號。類似地，當出現3個手性中心時，如在下文描述的二氫丁苯那嗪中，按照碳原子2，3和11b的順序列出「R」或「S」的指示。因此2S，3R，11bR異構體用速記形式表示為SRR等。
市場上可購買的丁苯那嗪是RR和SS異構體的外消旋混合物，將顯示RR和SS異構體(下文個別或全稱為反式丁苯那嗪，因為3和11b位氫原子具有反式的相對取向)是熱力學最穩定的異構體。
丁苯那嗪的生物利用度多少有些低並且多變。丁苯那嗪被首過代謝廣泛地代謝，通常在尿中很少或檢測不到無變化的丁苯那嗪。主要代謝產物是二氫丁苯那嗪(化學名2-羥基-3-(2-甲丙基)-1，3，4，6，7，11b-六氫-9，10-二甲氧基-苯並(a)喹嗪)，其通過還原丁苯那嗪中的2-酮基形成，相信主要負責藥物的活性(參見Mehvar等，DrugMetab.Disp，15，250-255(1987)和J.Pharm.Sci.，76，No.6，461-465(1987))。
目前已鑑定4種二氫丁苯那嗪異構體並對其特徵進行了表徵，它們全部衍生自更穩定的母體丁苯那嗪的RR和SS異構體，在3和11b位氫原子之間具有反式相對取向)(參見Kilbourn等，Chirality，959-62(1997)和Brossi等，Helv.Chim.Acta.，vol.XLI，No.193，pp 1793-1806(1958)。4種異構體是(+)-α-二氫丁苯那嗪、(-)-α-二氫丁苯那嗪、(+)-β-二氫丁苯那嗪和(-)-β-二氫丁苯那嗪。考慮4種已知的二氫丁苯那嗪異構體的結構如圖3顯示。
圖3-已知的二氫丁苯那嗪異構體的結構Kilbourn等(參見Eur.J.Pharmacol.，278249-252(1995)和Med.Chem.Res.，5113-126(1994))研究了清醒大鼠腦內個體放射性標記的二氫丁苯那嗪異構體的特異性結合。他們發現(+)-α-[11C]二氫丁苯那嗪(2R，3R，11bR)異構體蓄積在與高濃度神經元膜多巴胺轉運蛋白(DAT)和液泡單胺轉運蛋白(VMAT2)有關的腦區。然而，基本上無活性的(-)-α-[11C]二氫丁苯那嗪異構體幾乎均勻分布在腦內，提示不存在對DAT和VMAT2的特異性結合。該體內研究與證明(+)-α-[11C]二氫丁苯那嗪異構體對[3H]甲氧基丁苯那嗪的Ki比對(-)-α-[11C]二氫丁苯那嗪異構體的Ki高＞2000倍的體外研究相關。
迄今為止，就本申請人所知，尚未分離出衍生自不穩定的丁苯那嗪RS和SR異構體(下文個別或全稱為順式丁苯那嗪，因為3和11b位氫原子具有順式相對取向)的二氫丁苯那嗪異構體並對其進行特徵鑑定，並且至今未公布這些化合物的生物活性。
發明概述目前已發現衍生自不穩定的丁苯那嗪RS和SR異構體(「順式」異構體)的二氫丁苯那嗪異構體不僅穩定而且具有異常好的生物學特性。特別是，某些異構體具有的受體活性曲線圖提示具有許多優於目前使用的RR/SS丁苯那嗪的優點。例如，幾種異構體雖然對VMAT2具有高度親和力，但對多巴胺受體的結合明顯減少或可忽略不計，提示它們不可能產生遇到丁苯那嗪時的多巴胺能副作用。未顯示異構體抑制多巴胺轉運蛋白(DAT)。此外，在大鼠中對幾種異構體的研究已顯示它們缺乏與丁苯那嗪有關的不需要的鎮靜副作用。鎮靜活性的缺乏可能歸因於一些異構體對腎上腺素能受體的親和力極低。而且，鑑於丁苯那嗪的副作用之一是抑鬱，幾種二氫丁苯那嗪異構體顯示對血清素轉運蛋白(SERT)的親和力，表明它們可具有抗抑鬱活性。
因此，第一方面，本發明提供3，11b-順式-二氫丁苯那嗪。
另一方面，本發明提供包含3，11b-順式-二氫丁苯那嗪和藥學上可接受的載體的藥用組合物。
本發明還提供基本上純形式的3，11b-順式-二氫丁苯那嗪，例如異構純度大於90％，通常大於95％，且更優選大於98％。
術語「異構純度」在本文是指3，11b-順式-二氫丁苯那嗪相對於所有異構形式的二氫丁苯那嗪的總量或濃度所佔的量。例如，如果組合物中90％的總的二氫丁苯那嗪是3，11b-順式-二氫丁苯那嗪，那麼異構純度是90％。
本發明還提供基本上不含3，11b-反式-二氫丁苯那嗪的包含3，11b-順式-二氫丁苯那嗪的組合物，優選含少於5％的3，11b-反式-二氫丁苯那嗪，更優選少於3％的3，11b-反式-二氫丁苯那嗪，且最優選少於1％的3，11b-反式-二氫丁苯那嗪。
另一方面，本發明提供3，11b-順式-二氫丁苯那嗪用於藥物或治療，例如治療運動過度的運動失調例如亨廷頓氏病、偏側顫搐、老年性舞蹈病、抽搐、遲發性運動障礙和圖雷特氏症候群或治療抑鬱。
在還一方面，本發明提供3，11b-順式-二氫丁苯那嗪在製備用於治療運動過度的運動失調(例如亨廷頓氏病、偏側顫搐、老年性舞蹈病、抽搐、遲發性運動障礙和圖雷特氏症候群)或治療抑鬱的藥物中的用途。
在又一方面，本發明提供預防或治療需要這樣的預防或治療的患者運動過度的運動失調(例如亨廷頓氏病、偏側顫搐、老年性舞蹈病、抽搐、遲發性運動障礙和圖雷特氏症候群)或治療抑鬱的方法，該方法包括給予有效預防或治療量3，11b-順式-二氫丁苯那嗪。
在此所用的術語「3，11b-順式-」是指二氫丁苯那嗪結構中3-和11b-位氫原子處於順式相對取向。因此本發明的異構體是式(I)化合物及其對映體(鏡像)。
具有3，11b-順式構型的二氫丁苯那嗪有4種可能的異構體，它們是2S，3S，11bR異構體、2R，3R，11bS異構體、2R，3S，11bR異構體和2S，3R，11bS異構體。本發明已分離和鑑定4種異構體，且另一方面提供3，11b-順式-二氫丁苯那嗪的個體異構體。特別是，本發明提供(a)具有式(Ia)的3，11b-順式-二氫丁苯那嗪的2S，3S，11bR異構體 (b)具有式(Ib)的3，11b-順式-二氫丁苯那嗪的2R，3R，11bS異構體 (c)具有式(Ic)的3，11b-順式-二氫丁苯那嗪的2R，3S，11bR異構體 和(d)具有式(Id)的3，11b-順式-二氫丁苯那嗪的2S，3R，11bS異構體 本發明的個體新異構體的特徵可表現在它們的光譜、光學和色性能。
優選的異構體是右旋(+)異構體。
不意味著任何具體的絕對構型或立體化學，4種新異構體的特徵可以如下異構體AORD(甲醇，21℃)測量的旋光性；左旋(-)IR光譜(KBr固體)，1H-NMR光譜(CDCl3)和13C-NMR光譜(CDCl3)基本上如表1中描述。
異構體BORD(甲醇，21℃)測量的旋光性；右旋(+)IR光譜(KBr固體)，1H-NMR光譜(CDCl3)和13C-NMR光譜(CDCl3)基本上如表1中描述。
異構體CORD(甲醇，21℃)測量的旋光性；右旋(+)IR光譜(KBr固體)，1H-NMR光譜(CDCl3)和13C-NMR光譜(CDCl3)基本上如表2中描述。
異構體DORD(甲醇，21℃)測量的旋光性；左旋(-)IR光譜(KBr固體)，1H-NMR光譜(CDCl3)和13C-NMR光譜(CDCl3)基本上如表2描述。
每種異構體的ORD值在以下實施例中給出，但注意這樣的值是通過實施例給出，並可根據異構體的純度及受其它變量例如溫度波動和殘留溶劑分子作用的影響而改變。
對映體A、B、C和D可各自以基本上對映體的純的形式或作為本發明其它對映體的混合物存在。
術語「對映體純度」和「對映體純」在本文是指給定的3，11b-順式-二氫丁苯那嗪對映體相對於全部對映體和異構體形式的二氫丁苯那嗪總量或濃度佔的量。例如，如果組合物中90％的總二氫丁苯那嗪以單一對映體形式存在，那麼對映體純度是90％。
通過實施例，在本發明各方面和每個實施方案中，每種選自異構體A、B、C和D的單一對映體可以以至少55％(例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％)的對映體純度存在。
本發明的異構體也可以以一種或多種異構體A、B、C和D的混合物形式存在。這樣的混合物可以是外消旋混合物或非外消旋混合物。外消旋混合物的實例包括異構體A和異構體B的外消旋混合物以及異構體C和異構體D的外消旋混合物。
藥學上可接受的鹽除非上下文需要，否則在本申請中涉及二氫丁苯那嗪及其異構體時，包括在其範圍內的不僅包括二氫丁苯那嗪的游離鹼，還包括其鹽，特別是酸加成鹽。
形成酸加成鹽的具體酸包括pKa值小於3.5且更通常小於3的酸。例如，可由pKa範圍從+3.5至-3.5的酸形成酸加成鹽。
優選的酸加成鹽包括那些用磺酸例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、樟腦磺酸和萘磺酸形成的那些酸加成鹽。
可形成酸加成鹽的一種特殊酸是甲磺酸。
可通過本文描述的方法或常規化學方法(例如描述於Pharmaceutical SaltsProperties，Selection，and Use(藥用鹽特性、選擇和用途)，P.Heinrich Stahl(編輯)，Camille G.Wermuth(編輯)，ISBN3-90639-026-8，Hardcover，388頁，2002年8月中的方法)製備酸加成鹽。通常，可通過使化合物的游離鹼形式與適當的鹼或酸在水或有機溶劑或兩者的混合物中反應製備這樣的鹽；通常，用非水介質例如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。
鹽通常是藥學上可接受的鹽。然而，藥學上不可接受的鹽也可製備成中間體形式，其可隨後轉化為藥學上可接受的鹽。這樣的非藥學上可接受的鹽形式也形成本發明的一部分。
製備二氫丁苯那嗪異構體的方法在還一方面，提供製備本發明二氫丁苯那嗪的方法(方法A)，該方法包括使式(II)化合物 與一種或多種適合使式(II)化合物中2，3-雙鍵水合的試劑反應，隨後在需要時分離和分離需要的二氫丁苯那嗪異構體形式。
可用硼烷試劑例如二硼烷或硼烷-醚(例如硼烷-四氫呋喃(THF))，通過硼氫化作用使2，3-雙鍵水合，得到中間體烷基硼烷加合物，接著使烷基硼烷加合物氧化並在鹼存在下水解。硼氫化作用通常在乾燥極性非質子溶劑例如醚(例如THF)中、通常在不提高的溫度例如室溫下進行。通常用氧化劑例如過氧化氫在鹼存在下，使硼烷-烯烴加合物氧化，提供氫氧化物離子例如氫氧化銨或鹼金屬氫氧化物例如氫氧化鉀或氫氧化鈉。通常方法A的硼氫化-氧化-水解反應順序提供二氫丁苯那嗪異構體，其中2-和3-位氫原子具有反式相對取向。
可通過還原丁苯那嗪得到二氫丁苯那嗪，然後使二氫丁苯那嗪脫水製備式(II)化合物。可用氫化鋁試劑例如氫化鋁鋰，或氫硼化物試劑例如氫硼化鈉、氫硼化鉀，或氫硼化物衍生物例如烷基氫硼化物(例如三-仲-丁基氫硼化鋰)還原丁苯那嗪。或者，可採用催化氫化作用例如經過蘭氏鎳或氧化鉑催化劑進行還原步驟。進行還原步驟的合適條件在下文有更詳細的描述，或可在美國2,843,591(Hoffmann-La Roche)和Brossi等，Helv.Chim.Acta.，XLI卷，193期，ppl793-1806(1958)中發現。
因為用作還原反應的起始材料的丁苯那嗪通常是RR和SS異構體(即反式-丁苯那嗪)的混合物，所以由還原步驟形成的二氫丁苯那嗪將在3-和11b位具有相同反式構型，並將採取一種或多種已知的在上文圖3中所示的二氫丁苯那嗪異構體形式。因此方法A可包括採用已知的二氫丁苯那嗪異構體、使它們脫水形成烯烴(II)，然後用產生需要的本發明新的順式二氫丁苯那嗪異構體的條件使烯烴(II)「再脫水」。
可用將醇脫水形成烯烴的多種標準條件將二氫丁苯那嗪脫水為烯烴(II)，參見例如J.March(同前)389-390頁及其中的參考文獻。這樣的條件的實例包括用以磷為基礎的脫水劑例如滷化磷或滷氧化磷(phosphorus oxyhalides)，例如POCl3和PCl5。作為直接脫水的替代，可將二氫丁苯那嗪的羥基轉化為離去基團L例如滷素(例如氯或溴)，然後經歷除去H-L的條件(例如在鹼存在下)。可用化學技術人員熟知的方法將羥基轉化為滷化物，例如通過與四氯化碳或四溴化碳在三烷基或三芳基膦例如三苯基膦或三丁基膦存在下反應。
用作還原反應的起始材料得到二氫丁苯那嗪的丁苯那嗪可從市場上購買或通過描述於美國2,830,993(Hoffmann-La Roche)的方法合成。
本發明還提供製備本發明二氫丁苯那嗪的方法(方法B)，該方法包括使式(III)化合物 經歷將式(III)化合物中的2，3-環氧化物基團的環打開的條件，隨後在需要時分離和分離需要的二氫丁苯那嗪異構體形式。
可根據用於打開過氧化物環的已知方法完成開環。然而，目前打開過氧化物環的優選方法是還原性開環，其可用還原劑例如硼烷-THF完成。通常在環境溫度下，在極性非質子溶劑例如乙醚(例如四氫呋喃)中進行與硼烷-THF的反應，接著將由此形成的硼烷複合物在水和鹼存在下，在溶劑的回流溫度中加熱水解。通常方法B產生二氫丁苯那嗪異構體，其中在2-和3-位的氫原子具有順式相對取向。
可通過上文式(II)烯烴的環氧化作用製備式(III)的環氧化物化合物。可用化學技術人員熟知的條件和試劑進行環氧化反應，參見例如J.March(同前)，826-829頁及其中的參考文獻。通常，可用過酸例如間氯過苯甲酸(MCPBA)或過酸與其它氧化劑例如過氯酸的混合物產生環氧化作用。
當上文方法A和B的起始材料是對映體混合物時，該方法的產物將通常是成對對映體，例如外消旋混合物，可能夾雜非對映異構體雜質。可通過技術例如層析(例如HPLC)除去不需要的非對映異構體並且可通過化學技術人員已知的多種方法分離各對映體。例如，它們可通過以下途徑分離(i)手性層析(在手性載體上的層析)；或(ii)與光學純的手性酸形成鹽，通過分級結晶分離兩種非對映異構體的鹽，然後從鹽中釋放二氫丁苯那嗪；或(iii)與光學純的手性衍化劑(derivatising)(例如酯化劑)形成衍生物(例如酯)，分離生成的差向異構體(例如通過層析)，然後將衍生物轉化為二氫丁苯那嗪。
一種分離從方法A和B各自獲得的成對對映體的方法(已發現其特別有效)是用旋光活性形式的Mosher’s酸(例如以下顯示的R(+)異構體)或其活性形式使二氫丁苯那嗪的羥基酯化 然後可通過層析(例如HPLC)分離生成的二氫丁苯那嗪的兩種對映體的酯，然後在極性溶劑例如甲醇中用鹼例如鹼金屬氫氧化物(例如NaOH)水解分離的酯，得到各二氫丁苯那嗪(dihydrobenazine)異構體。
作為將對映體混合物用作方法A和B中的起始材料，然後分離對映體的替代方法，可用單一對映體起始材料分別進行方法A和B，得到其中以單一對映體為主的產物。可如下製備烯烴(II)的單一對映體用三-仲-丁基氫硼化鋰使RR/SS丁苯那嗪經歷立體選擇還原反應，得到二氫丁苯那嗪的SRR和RSS對映體混合物，分離對映體(例如通過分級結晶)，然後使分離的二氫丁苯那嗪的單一對映體脫水，得到絕大部分的或唯一的式(II)化合物的單一對映體。
方法A和B在方案1和2中各自有更詳細的說明。
方案1
方案1說明具有2S，3S，11bR和2R，3R，11bS構型的各二氫丁苯那嗪異構體的製備，其中連接2-和3-位的氫原子以反式相對取向排列。該反應方案包括上文定義的方法A。
方案1中反應順序的起點是購自市場的丁苯那嗪(IV)，其是丁苯那嗪的RR和SS旋光異構體的外消旋混合物。在每種RR和SS異構體中，3-和11b-位的氫原子都是以反式相對取向排列。作為使用可市售獲得的化合物的代替，可根據描述於美國專利號2,830,993(具體參見實施例11)的步驟合成丁苯那嗪。
用氫硼化物還原劑三-仲-丁基氫硼化鋰(「L-Selectride」)還原RR和SS丁苯那嗪的外消旋混合物得到已知的二氫丁苯那嗪2S，3R，11bR和2R，3S，11bS異構體(V)，其中為簡化只顯示了2S，3R，11bR異構體。通過用更多立體要求的L-Selectride作為氫硼化物還原劑代替氫硼化鈉，使二氫丁苯那嗪的RRR和SSS異構體的形成降至最低或受抑制。
使二氫丁苯那嗪異構體(V)與脫水劑例如五氯化磷在非質子溶劑例如氯化烴(例如氯仿或二氯甲烷，優選二氯甲烷)中反應，形成不飽和化合物(II)，為成對對映體，在方案中只顯示R-對映體。脫水反應通常在低於室溫的溫度例如在約0-5℃進行。
然後將不飽和化合物(II)經歷立體選擇性再水合，得到二氫丁苯那嗪(VI)及其鏡像或對映體(未顯示)，其中3-和11b-位氫原子以順式相對取向排列，且2-和3-位氫原子以反式相對取向排列。立體選擇性再水合作用通過用硼烷-THF在四氫呋喃(THF)中的氫硼化步驟完成，形成中間體硼烷複合物(未顯示)，然後在鹼例如氫氧化鈉存在下用過氧化氫氧化。
然後可進行最初的純化步驟(例如通過HPLC)，得到再水合反應順序的產物(V)，為2S，3S，11bR和2R，3R，11bS異構體混合物，其中方案只顯示2S，3S，11bR異構體。為分離異構體，在二氯甲烷中，在草醯氯和二甲氨基吡啶(DMAP)存在下用R(+)Mosher’s酸處理混合物，得到一對非對映異構酯(VII)(其中只顯示一種非對映異構體)，其接著可用HPLC分離。然後用鹼金屬氫氧化物例如氫氧化鈉水解各種酯，得到單一異構體(VI)。
在方案1顯示的步驟順序的變化中，RR/SS丁苯那嗪還原後，可分離生成的二氫丁苯那嗪的對映體混合物(V)，得到各對映體。可通過用手性酸例如(+)或(-)樟腦磺酸形成鹽進行分離，通過分級結晶分離生成的非對映體，得到單一對映體的鹽，然後從鹽中釋放游離鹼。
可將分離的二氫丁苯那嗪對映體脫水得到烯烴(II)的單一對映體。然後將烯烴(II)再水合得到絕大部分的或唯一的順式-二氫丁苯那嗪(VI)的單一對映體。這種變化的優點是不涉及Mosher’s酸酯的形成，從而避免通常用於分離Mosher’s酸酯的層析分離。
方案2說明具有2R，3S，11bR和2S，3R，11bS構型的各個二氫丁苯那嗪異構體的製備，其中連接於2-和3-位的氫原子以順式相對取向排列。該反應方案包括上文定義的方法B。
方案2 在方案2中，通過還原丁苯那嗪得到二氫丁苯那嗪的2S，3R，11bR和2R，3S，11bS異構體(V)並按上文方案1描述的方法用PCl5脫水產生不飽和化合物(II)。然而，代替化合物(II)經歷氫硼化作用的是，通過與間氯過苯甲酸(MCPBA)和過氯酸反應將2，3-雙鍵轉化為環氧化物。通常在約室溫下，在醇溶劑例如甲醇中很方便進行環氧化反應。
然後用硼烷-THF作為親電子還原劑使環氧化物(VII)經歷還原性開環，得到中間體硼烷複合物(未顯示)，然後在鹼例如氫氧化鈉存在下將其用過氧化氫氧化和裂解，得到二氫丁苯那嗪(VIII)的2R，3S，11bR和2S，3R，11bS異構體混合物，為簡化其中只顯示2R，3S，11bR。在二氯甲烷中，在草醯氯和二甲氨基吡啶(DMAP)存在下，用R(+)Mosher’s酸處理異構體(VIII)混合物，得到一對差向異構體酯(IX)(其中只顯示一種差向異構體)，然後可通過層析分離並按上文描述與方案1有關的方法將其在甲醇中用氫氧化鈉水解。
相信化學中間體(II)和(III)是新的並代表本發明的進一步的方面。
生物學特性和治療用途丁苯那嗪通過抑制腦內液泡單胺轉運蛋白VMAT2和通過抑制突觸前和突觸後多巴胺受體發揮其治療作用。
本發明的新的二氫丁苯那嗪異構體也是VMAT2抑制劑，異構體C和B產生的抑制度最大。與丁苯那嗪相似，本發明化合物對VMAT1(在外周組織和一些內分泌細胞中發現的VMAT同工型)的親和力低，從而提示它們將不產生與利血平有關的副作用。化合物C和B對兒茶酚O-甲基轉移酶(COMT)、單胺氧化酶同工型A和B以及5-羥色胺同工型1d和1b也不產生抑制作用。
令人驚訝的是，雖然異構體C和B對於與VMAT2結合具有高度活性，但它們對VMAT2與對多巴胺受體的活性有明顯分離，兩種化合物對多巴胺受體結合的活性都很弱或不存在，並且缺乏多巴胺轉運蛋白(DAT)結合活性。事實上，無一異構體表現明顯的DAT結合活性。這提示化合物可能缺乏丁苯那嗪產生的多巴胺能副作用。異構體C和B也是腎上腺素能受體的弱活性或無活性抑制劑，這提示化合物可能缺乏常見於丁苯那嗪的腎上腺素能副作用。事實上，在大鼠的運動研究中，丁苯那嗪表現與劑量相關的鎮靜作用，然而在本發明的二氫丁苯那嗪異構體B和C給藥後沒有觀察到鎮靜作用。
而且，異構體C和異構體B都是血清素轉運體蛋白SERT的潛在抑制劑。抑制SERT是抗抑鬱劑例如氟西汀(Prozac)發揮它們的治療作用的一種機制。因此，與抑鬱是丁苯那嗪公認的副作用迥然相反，異構體C和B抑制SERT的能力提示這些異構體可用作抗抑鬱劑。
根據迄今為止已開展的研究，設想本發明的二氫丁苯那嗪化合物將有助於預防或治療目前使用或計劃用丁苯那嗪預防或治療的疾病狀態和病症。因此，通過實施例(但不得限制)，本發明的二氫丁苯那嗪化合物可用於治療運動過度的運動失調，例如亨延頓氏病、偏側顫搐、老年性舞蹈病、抽動障礙、遲發性運動障礙、張力障礙和圖雷特氏症候群。
還設想本發明的二氫丁苯那嗪化合物可有助於治療抑鬱。
通常將化合物給藥於需要這樣給藥的患者，例如人或動物患者，優選人。
通常化合物的給藥量是有助於治療或預防且通常是無毒的。然而，在某些情況下，本發明的二氫丁苯那嗪化合物給藥的優點可超過任何毒性作用或副作用的缺點，在這種情況下可能需要考慮將化合物以與毒性程度相關的量給藥。
化合物的典型日劑量範圍從0.025毫克至5毫克每公斤體重，例如至多3毫克每公斤體重，且更典型為0.15毫克至5毫克每公斤體重，但在需要時給藥劑量可以更高或更低。
通過實施例，可按最初的起始劑量12.5mg每天給藥2至3次。可每3至5天將劑量每天增加12.5mg，直至醫生確定達到個體的最大耐受和有效劑量。最後，化合物的給藥量將與正在治療的疾病或生理狀態的性質相當，醫生將慎重考慮給出的劑量方案產生的治療益處及是否存在副作用。
藥用製劑本發明還提供藥用組合物形式的如上文定義的二氫丁苯那嗪化合物。
藥用組合物可採用任何適合口服、胃腸外、局部、鼻內、支氣管內、眼、耳、直腸、陰道內或經皮給藥的形式。當預期將組合物胃腸外給藥時，可將它們配製用於靜脈內、肌內、腹膜內、皮下給藥或通過注射、灌注或其它釋放途徑直接釋放至靶器官或組織。
適合口服給藥的藥用劑型包括片劑、膠囊、扁囊、丸劑、錠劑、糖漿劑、溶液、噴霧劑、粉劑、粒劑、酏劑和混懸劑、舌下含片、噴霧劑、糯米紙囊劑或貼劑和口腔貼劑。
可根據已知的技術配製含本發明的二氫丁苯那嗪化合物的藥用組合物，參見例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，PA，USA。
因此，片劑組合物可包含單位劑量的活性化合物以及惰性稀釋劑或載體，例如糖或糖醇，例如乳糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇；和/或非糖衍生的稀釋劑例如碳酸鈉、磷酸鈣、滑石、碳酸鈣，或纖維素或其衍生物例如甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素，和澱粉例如玉米澱粉。片劑也可包含這樣的標準成分作為粘合和制粒劑例如聚乙烯吡咯烷酮、崩解劑(例如可膨脹的交聯聚合物例如交聯羧甲基纖維素)、潤滑劑(例如硬脂酸酯)、防腐劑(例如對羥苯甲酸酯)、抗氧化劑(例如BHT)、緩衝劑(例如磷酸鹽或枸櫞酸鹽緩衝液)和發泡劑例如枸櫞酸鹽/碳酸氫鹽混合物。這樣的賦形劑已眾所周知，在此不需要詳細討論。
膠囊製劑可以是硬膠囊或軟膠囊種類，並可包含固體、半固體或液體形式的活性成分。明膠膠囊可用動物明膠或其合成的或植物衍生的同等物形成。
雖然固體劑型(例如片劑、膠囊等)可被包衣或不包衣，但通常具有包衣，例如保護性薄膜包衣(例如蠟或清漆)或釋放控制包衣。可將包衣(例如EudragitTM型聚合物)設計在胃腸道內需要的位置釋放活性成分。因此，可選擇包衣以便在胃腸道內某個pH條件下降解，從而在胃或迴腸或十二指腸內選擇性釋放化合物。
代替包衣或除包衣之外，可使藥物存在於固體基質中，該基質含釋放控制劑，例如可適合在胃腸道內變化的酸鹼度條件下選擇性釋放化合物的釋放延緩劑。或者，基質材料或釋放延緩包衣可採用易蝕聚合物(例如馬來酸酐聚合物)的形式，該形式在劑型通過胃腸道時基本上是被連續腐蝕的。
局部使用的組合物包括軟膏劑、霜劑、噴霧劑、貼劑、凝膠劑、液體滴劑和插入物(例如眼內插入物)。可根據已知的方法配製這樣的組合物。
胃腸外給藥的組合物通常是無菌水或油溶液或精製的懸浮液，或可提供為精細分散的無菌粉末形式，與無菌水臨時配製用於注射。
直腸或陰道內給藥製劑的實例包括陰道栓劑或栓劑，其可用例如含活性化合物的外觀可塑的或蠟質材料形成。
吸入給藥的組合物可採用可吸入粉末組合物或液體或粉末噴霧劑的形式，並可用粉末吸入裝置或氣溶膠分散裝置以標準形式給藥。這樣的裝置時眾所周知的。對於吸入給藥，粉末狀製劑通常包含活性化合物和惰性固體粉末狀稀釋劑例如乳糖。
通常本發明化合物將以單位劑型存在，這樣將通常包含足夠的化合物以提供需要水平的生物活性。例如，預期口服給藥的製劑可包含從2毫克至200毫克活性成分，更通常從10毫克至100毫克，例如12.5毫克、25毫克和50毫克。
活性化合物將以足夠獲得需要的治療效應的量被給藥於有需要的患者(例如人或動物患者)。
實施例以下非限制性實施例說明本發明的二氫丁苯那嗪化合物的合成和特性。
實施例1製備二氫丁苯那嗪的2S，3S，11bR和2R，3R，11bS異構體1A.還原RR/SS丁苯那嗪 在0℃用超過30分鐘將四氫呋喃(135ml，135mmol，2.87當量)中的1M L-Selectride緩慢加入丁苯那嗪RR/SS外消旋化合物(15g，47mmol)在乙醇(75ml)和四氫呋喃(75ml)中的攪拌溶液內。完成添加後在0℃將混合物攪拌30分鐘，然後任其升溫至室溫。
將混合物傾至碎冰(300g)上並加入水(100ml)。用乙醚(2×200ml)提取溶液並用水(100ml)衝洗合併的含醚提取液，用無水碳酸鉀部分乾燥。用無水硫酸鎂完成乾燥，過濾後，減壓除去溶劑(避光，浴溫＜20℃)得到淡黃色固體。
用石油醚(30-40℃)使固體淤漿化並過濾得到白色粉狀固體(12 g，80％)。
1B.將還原的丁苯那嗪脫水
在0℃用超過30分鐘將五氯化磷(32.8g，157.5mmol，2.5當量)分批加入來自實施例1A的還原的丁苯那嗪產物(20g，62.7mmol)在二氯甲烷(200ml)中的攪拌溶液內。完成添加後，在0℃將反應混合物再攪拌30分鐘，將溶液緩慢傾至含碎冰(0℃)的2M碳酸鈉水溶液中。一旦起初的酸性氣體放出停止即用固體碳酸鈉鹼化(約pH12)混合物。
用乙酸乙酯(800ml)提取鹼性溶液並用無水硫酸鎂乾燥合併的有機提取液。過濾後減壓除去溶劑得到褐色油，將其通過柱層析(二氧化矽，乙酸乙酯)純化得到半純化的烯烴(10.87g，58％)，為黃色固體。
1C.將實施例1B的粗品烯烴水合 在室溫下，通過將1M硼烷-THF(155.6ml，155.6mmol，4.30當量)滴加入來自實施例1B的粗品烯烴(10.87g，36.11mmol)在乾燥THF(52ml)中的溶液內來進行處理。攪拌反應物2小時，加入水(20ml)並用30％氫氧化鈉水溶液將溶液鹼化至pH12。
將30％過氧化氫水溶液(30ml)加入攪拌的鹼性反應混合物中，將溶液加熱至回流1小時，然後任其冷卻。加入水(100ml)並用乙酸乙酯(3×250ml)提取混合物。將有機提取液合併，經無水硫酸鎂乾燥，過濾後減壓除去溶劑得到黃色油狀物(9g)。
以350mg每注射液用製備型HPLC(柱Lichrospher Si60，5μm，250×21.20mm，流動相己烷∶乙醇∶二氯甲烷(85∶15∶5)；UV 254nm，流量10ml min-1)純化該油狀物，接著真空濃縮需要的流分。然後使產物油溶於乙醚中並再次真空濃縮，得到上文顯示的二氫丁苯那嗪外消旋物(5.76g，50％)，為黃色泡沫。
1D.製備Mosher’s酯衍生物 將R-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲苯基乙酸(5g，21.35mmol)、草醯氯(2.02ml)和DMF(0.16ml)加入無水二氯甲烷(50ml)並在室溫將溶液攪拌45分鐘。減壓濃縮溶液並用無水二氯甲烷(50ml)再吸收殘留物1次。用冰水浴冷卻生成的溶液，加入二甲氨基吡啶(3.83g，31.34mmol)，接著是實施例1C固體產物(5g，15.6mmol)在無水二氯甲烷中的預乾燥溶液(過4篩網)。在室溫攪拌45分鐘後，加入水(234ml)並用乙醚(2×200ml)提取混合物。將乙醚提取液用無水硫酸鎂乾燥，通過二氧化矽墊，用乙醚洗脫產物。
減壓濃縮收集的乙醚洗脫液得到油狀物，用柱層析(二氧化矽，己烷∶乙醚(10∶1))將其純化。蒸發需要收集的柱流分並減壓除去溶劑得到固體，用柱層析(二氧化矽，己烷∶乙酸乙酯(1∶1))將其進一步純化得到3種主要成分，其部分溶於Mosher’s酯峰1和2。
以300mg裝填3種成分的製備型HPLC(柱2×Lichrospher Si60，5μm，250×21.20mm，流動相己烷∶異丙醇(97∶3)，UV 254nm；流量10ml min-1)，然後真空濃縮需要的流分，得到純化的Mosher’s酯衍生物峰1(3.89g，46.5％)峰2(2.78g，33％)
將對應於兩個峰的流分水解以釋放經鑑定且具有異構體A和B特徵的各二氫丁苯那嗪異構體。相信異構體A和B各自具有一種以下結構 1E.水解峰1得到異構體A將20％氫氧化鈉水溶液(87.5ml)加入Mosher’s酯峰1(3.89g，7.27mmol)的甲醇(260ml)溶液中並將混合物攪拌和加熱至回流150分鐘。冷卻至室溫後加入水(200ml)並用乙醚(600ml)提取溶液，經無水硫酸鎂乾燥，過濾後減壓濃縮。
將殘留物用乙酸乙酯(200ml)溶解，用水(2×50ml)衝洗溶液，將有機相經無水硫酸鎂乾燥，過濾後減壓濃縮得到黃色泡沫。用柱層析(二氧化矽，梯度洗脫為乙酸乙酯∶己烷(1∶1)至乙酸乙酯)純化該物質。合併需要的流分並減壓除去溶劑。在乙醚中吸收殘留物並再次減壓除去溶劑得到異構體A(1.1g，47％)，為灰白色泡沫。
用1H-NMR、13C-NMR、IR、質譜法、手性HPLC和ORD鑑定異構體A的特徵，相信其或者具有2S，3S，11bR，或者具有2R，3R，11bS構型(未確定絕對立體化學)。異構體A的IR、NMR和MS數據在表1中顯示，而手性HPLC和ORD數據在表3中顯示。
1F.水解峰2得到異構體B將20％氫氧化鈉水溶液(62.5ml)加入Mosher’s酯峰2(2.78g，5.19mmol)的甲醇(185ml)溶液中並將混合物攪拌和加熱至回流150分鐘。冷卻至室溫後加入水(142ml)並用乙醚(440ml)提取溶液，經無水硫酸鎂乾燥，過濾後減壓濃縮。
將殘留物用乙酸乙酯(200ml)溶解，用水(2×50ml)衝洗溶液，將有機相經無水硫酸鎂乾燥，過濾後減壓濃縮。將石油醚(30-40℃)加入殘留物中，將溶液再次真空濃縮得到異構體B(1.34g，81％)，為白色泡沫。
用1H-NMR、13C-NMR、IR、質譜法、手性HPLC和ORD鑑定異構體B的特徵，相信其或者具有2S，3S，11bR，或者具有2R，3R，11bS構型(未確定絕對立體化學)。異構體B的IR、NMR和MS數據在表1中顯示而手性HPLC和ORD數據在表3中顯示。
實施例2製備二氫丁苯那嗪的2R，3S，11bR和2S，3R，11bS異構體2A.製備2，3-二氫丁苯那嗪按實施例1A的方法，用L-Selectride使含RR和SS丁苯那嗪對映體外消旋混合物(15g，47mmol)的四氫呋喃溶液還原，得到二氫丁苯那嗪的2S，3R，11bR和2R，3S，11bS對映體混合物(12g，80％)，為白色粉狀固體。然後按實施例1B的方法，用PCl5使部分純化的二氫丁苯那嗪脫水，得到2，3-二氫丁苯那嗪的11bR和11bS異構體(下文未顯示其11bR對映體)的半純化混合物(12.92g，68％)，為黃色固體。
2B.將得自實施例2A的粗品烯烴環氧化
將70％過氯酸(3.70ml，43mmol)的甲醇(215ml)溶液加入來自實施例2A的粗品烯烴(12.92g，42.9mmol)在甲醇(215ml)中的攪拌溶液內。將77％3-氯過氧苯甲酸(15.50g，65mmol)加入反應物中，在室溫將生成的混合物避光攪拌18小時。
將反應混合物傾入飽和亞硫酸鈉水溶液(200ml)中並加入水(200ml)。將氯仿(300ml)加入生成的乳液中並用飽和碳酸氫鈉水溶液(400ml)鹼化混合物。
收集有機層並用另外的氯仿(2×150ml)衝洗水層。將合併的氯仿層用無水硫酸鎂乾燥，過濾後減壓除去溶劑，得到褐色油狀物(14.35g，產率＞100％-產物中可能殘餘溶劑)。該物質無需進一步純化即可使用。
2C.將2B的環氧化物還原性開環 用15分鐘用1M硼烷/THF(184.6ml，184.6mmol)緩慢處理來自實施例2B的粗品環氧化物(14.35g，42.9mmol，假定100％產率)在乾燥THF(80ml)中的攪拌溶液。將反應物攪拌2小時，加入水(65ml)並攪拌，使溶液加熱至回流30分鐘。
冷卻後，將30％氫氧化鈉溶液(97ml)加入反應混合物，然後加入30％過氧化氫溶液(48.6ml)，將反應物攪拌並再加熱至回流1小時。
用乙酸乙酯(500ml)提取冷卻的反應混合物，經無水硫酸鎂乾燥，過濾後減壓除去溶劑得到油狀物。將己烷(230ml)加入油狀物中並再減壓濃縮溶液。
用柱層析(二氧化矽，乙酸乙酯)純化油狀殘留物。將需要的流分合併並減壓除去溶劑。用柱層析(二氧化矽，梯度，己烷至乙醚)再次純化殘留物。將需要的流分合併並減壓蒸發溶劑，得到淡黃色固體(5.18g，38％)。
2D.製備二氫丁苯那嗪的2R，3S，11bR和2S，3R，11bS異構體的Mosher’s酯衍生物 將R-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲苯基乙酸(4.68g，19.98mmol)、草醯氯(1.90ml)和DMF(0.13ml)加入無水二氯甲烷(46ml)中並在室溫將溶液攪拌45分鐘。減壓濃縮溶液並在無水二氯甲烷(40ml)中再次吸收殘留物。用冰水浴冷卻生成的溶液，加入二甲氨基吡啶(3.65g，29.87mmol)，然後加入實施例2C的固體產物(4.68g，14.6mmol)在無水二氯甲烷(20ml)中的預乾燥溶液(過4篩網)。在室溫攪拌45分鐘後，加入水(234ml)並用乙醚(2×200ml)提取混合物。將乙醚提取液經無水硫酸鎂乾燥，通過二氧化矽墊並用乙醚洗脫產物。
減壓濃縮收集的乙醚洗脫液得到油狀物，用柱層析(二氧化矽，己烷∶乙醚(1∶1))將其純化。將需要收集的柱流分蒸發並減壓除去溶劑得到粉紅色固體(6.53g)。
以100mg裝填固體的製備型HPLC(柱2×Lichrospher Si60，5μm，250×21.20mm；流動相己烷∶異丙醇(97∶3)；UV 254nm；流量10mlmin-1)，然後真空濃縮需要的流分得到固體，用石油醚(30-40℃)使其淤漿化並過濾收集得到純化的Mosher’s酯衍生物峰1(2.37g，30％)峰2(2.42g，30％)將對應於兩個峰的流分水解以釋放經鑑定且具有異構體C和D特徵的各二氫丁苯那嗪異構體。相信異構體C和D各自具有一種以下結構 2F.水解峰1得到異構體C將20％氫氧化鈉水溶液(53ml)加入Mosher’s酯峰1(2.37g，4.43mmol)在甲醇(158ml)中的攪拌溶液內並將混合物攪拌回流150分鐘。冷卻後將水(88ml)加入反應混合物並用乙醚(576ml)提取生成的溶液。將有機提取液經無水硫酸鎂乾燥，過濾後減壓除去溶劑。將乙酸乙酯(200ml)加入殘留物，並用水(2×50ml)衝洗溶液。將有機溶液經無水硫酸鎂乾燥，過濾後減壓除去溶劑。
用石油醚(30-40℃)處理殘留物並過濾收集生成的懸浮固體。減壓濃縮濾液並過濾收集第二批懸浮的固體。將兩次收集的固體合併，減壓乾燥得到異構體C(1.0g，70％)。
用1H-NMR、13C-NMR、IR、質譜法、手性HPLC和ORD鑑定異構體C的特徵，相信其或者具有2R，3S，11bR，或者具有2S，3R，11bS構型(未確定絕對立體化學)。異構體C的IR、NMR和MS數據在表2中顯示，而手性HPLC和ORD數據在表4中顯示。
2G.水解峰2得到異構體D將20％氫氧化鈉水溶液(53ml)加入Mosher’s酯峰2(2.42g，4.52mmol)在甲醇(158ml)中的攪拌溶液內並將混合物攪拌回流150分鐘。冷卻後將水(88ml)加入反應混合物並用乙醚(576ml)提取生成的溶液。將有機提取液經無水硫酸鎂乾燥，過濾後減壓除去溶劑。將乙酸乙酯(200ml)加入殘留物中，並用水(2×50ml)衝洗溶液。將有機溶液經無水硫酸鎂乾燥，過濾後減壓除去溶劑。
用石油醚(30-40℃)處理殘留物並過濾收集生成的懸浮橙色固體。使該固體溶於乙酸乙酯∶己烷(15∶85)並用柱層析(二氧化矽，梯度乙酸乙酯∶己烷(15∶85)至乙酸乙酯)純化。合併需要的流分並減壓除去溶劑。用石油醚(30-40℃)使殘留物淤漿化並過濾收集生成的懸浮液。減壓乾燥收集的固體得到異構體D(0.93g，64％)，為白色固體。
用1H-NMR、13C-NMR、IR、質譜法、手性HPLC和ORD鑑定異構體D的特徵，相信其或者具有2R，3S，11bR，或者具有2S，3R，11bS構型(未確定絕對立體化學)。異構體D的IR、NMR和MS數據在表2中顯示，而手性HPLC和ORD數據在表4中顯示。
在表1和2中，用KBr壓片(disc)確定紅外光譜。用Varian GeminiNMR波譜儀(200MHz.)在氘化氯仿溶液中進行1H NMR光譜。用Varian Gemini NMR波譜儀(50MHz)在氘化氯仿溶液中進行13C NMR光譜。用Micromass Platform II(ES+條件)波譜儀獲得質譜。在表3和4中，在24℃下，在甲醇溶液中用Optical Activity PolAAr 2001儀器獲得旋光色散數據。用帶UV檢測器的HP1050 HPLC層析儀測量HPLC保留時間。
表1和2-光譜數據
表3和4-層析和ORD數據
實施例3製備異構體B和製備甲磺酸鹽的替代方法3A.還原RR/SS丁苯那嗪 用30分鐘將四氫呋喃(52ml，52mmol，1.1當量)中的1MSelectride緩慢加入丁苯那嗪外消旋物(15g，47mmol)在四氫呋喃(56ml)中的冷卻(冰浴)、攪拌的溶液內。完成添加後，任由混合物升溫至室溫並再攪拌6小時。TLC分析(二氧化矽，乙酸乙酯)顯示只殘留極少量起始材料。
將混合物傾至碎冰(112g)、水(56ml)和冰醋酸(12.2g)的攪拌的混合物中。用乙醚(2×50ml)衝洗生成的黃色溶液並緩慢加入固體碳酸鈉(約13g)使其鹼化。邊攪拌邊將Pet-醚(30-40℃)(56ml)加入混合物中，過濾收集粗產物β-DHTBZ，為白色固體。
使粗製固體溶於二氯甲烷(約150ml)並用水(40ml)衝洗生成的溶液，用無水硫酸鎂乾燥，過濾並減壓濃縮至約40ml。形成白色固體的稠密懸浮液。加入Pet-醚(30-40℃)(56ml)並在實驗室溫度將懸浮液攪拌15分鐘。過濾收集產物並用pet-醚(30-40℃)(40至60ml)在濾器上衝洗直至雪白，在室溫風乾後得到β-DHTBZ(10.1g，67％)，為白色固體。TLC分析(二氧化矽，乙酸乙酯)顯示只有一種成分。
3B.製備和分級結晶外消旋β-DHTBZ的樟腦磺酸鹽加熱使實施例3A的產物和1當量(S)-(+)-樟腦-10-磺酸溶於最小量甲醇。任由生成的溶液冷卻，然後用乙醚緩慢稀釋直至生成的固體沉澱物的形成結束。過濾收集生成的白色結晶固體並用乙醚衝洗，然後乾燥。
使樟腦磺酸鹽(10g)溶於熱的無水乙醇(170ml)和甲醇(30ml)的混合物中。攪拌生成的溶液並任其冷卻。2小時後過濾收集形成的沉澱物(2.9g)，為白色結晶固體。使結晶材料樣品與過量飽和的碳酸鈉水溶液和二氯甲烷在分液漏鬥中振蕩。將有機相分離，經無水硫酸鎂乾燥，過濾並減壓濃縮。用pet-醚(30-40℃)研磨殘留物並再次濃縮有機溶液。用Chirex(S)-VAL和(R)-NEA 250×4.6mm柱對該鹽進行手性HPLC分析，用己烷∶乙醇(98∶2)洗脫液以1ml/分鐘的流速洗脫，顯示分離的β-DHTBZ濃縮在一種對映體中(對映體過量約80％)。
使濃縮的樟腦磺酸鹽(14g)溶於熱的無水乙醇(140ml)並加入丙-2-醇(420ml)。攪拌生成的溶液，在1分鐘內開始形成沉澱物。任由混合物冷卻至室溫並攪拌1小時。將形成的沉澱物過濾收集，用乙醚衝洗並乾燥得到白色結晶固體(12g)。
使結晶物質與過量的飽和碳酸鈉水溶液和二氯甲烷在分液漏鬥中振蕩。將有機相分離，經無水硫酸鎂乾燥，過濾並減壓濃縮。用pet-醚(30-40℃)研磨殘留物並再次濃縮有機溶液，得到(真空乾燥後)(+)-β-DHTBZ(6.6g，ORD+107.8°)。分離的對映體的對映體過量＞97％。
3C.製備異構體B用超過10分鐘將五氯化磷(4.5g，21.6mmol，1.05當量)的二氯甲烷(55ml)溶液穩定地加入實施例3B的產物(6.6g，20.6mmol)在二氯甲烷(90ml)中的攪拌、冷卻(冰水浴)溶液內。完成添加後，將生成的黃色溶液再攪拌10分鐘，然後傾至碳酸鈉(15g)在水(90ml)和碎冰(90g)中的快速攪拌的混合物內。將混合物再攪拌10分鐘並移至分液漏鬥中。
一旦分離出各相，即將褐色二氯甲烷層除去，經無水硫酸鎂乾燥，過濾並減壓濃縮，得到粗品烯烴(約6.7g)中間體，為褐色油狀物。TLC分析(二氧化矽，乙酸乙酯)顯示粗產物內無(+)-β-DHTBZ殘留。
在無水四氫呋喃(40ml)中吸收粗品烯烴(乾燥的氮氣氣氛)並用超過15分鐘邊攪拌邊加入硼烷的THF(1 M溶液，2.5當量，52ml)溶液。然後在室溫將反應混合物攪拌2小時。TLC分析(二氧化矽，乙酸乙酯)顯示反應混合物中無烯烴中間體殘留。
將氫氧化鈉(3.7g)的水(10ml)溶液、過氧化氫水溶液(50％，約7ml)先後加入正在攪拌的反應混合物中，將形成的兩相混合物攪拌回流1小時。此時有機相的TLC分析(二氧化矽，乙酸乙酯)顯示出現如異構體B預期的Rf的產物。還顯示特徵性非極性成分。
任由反應混合物冷卻至室溫並將其傾入分液漏鬥。將上面的有機層除去並減壓濃縮以除去大部分THF。使殘留物在乙醚(穩定的(BHT)，75ml)中吸收，用水(40ml)衝洗，經無水硫酸鎂乾燥，過濾並減壓濃縮得到淡黃色油狀物(8.1g)。
用柱層析(二氧化矽，乙酸乙酯∶己烷(80∶20)，增加至100％乙酸乙酯)純化黃色油狀物，收集需要的柱流分、合併並減壓濃縮得到蒼白色油，將其用乙醚(穩定的，18ml)處理並減壓濃縮得到異構體B(2.2g)，為淡黃色固體泡沫。
用實施例3B列出的條件進行的手性HPLC證實已經產生的異構體B的對映體過量(e.e.)大於97％。
用Bellingham Stanley ADP220旋光計測量旋光度得到[αD]為+123.5°。
3D.製備異構體B的甲磺酸鹽通過使1當量來自實施例3C的異構體B與1當量甲磺酸的混合物溶於最小量乙醇、然後加入乙醚製備異構體B的甲磺酸鹽。過濾收集形成的生成白色沉澱物並真空乾燥得到甲磺酸鹽，產率約為85％而純度(通過HPLC)約為96％。
實施例4用[3H]二氫丁苯那嗪結合試驗篩選VMAT-2結合活性二氫丁苯那嗪是對VMAT-2非常有效和選擇性的抑制劑，與這種液泡轉運蛋白高親和力(nM範圍)結合。多年來已將[3H]二氫丁苯那嗪作為放射性配體成功用於標記人、牛和齧齒動物腦內的VMAT-2(例如Scherman等J.Neurochem.50，1131-1136(1988)；Near等Mol.Pharmacol.30，252-257(1986)；Kilbourn等Eur.J.Pharmacol.278，249-252(1995)；和Zucker等Life Sci.69，2311-2317(2001))。
用下文描述的試驗測定4種二氫丁苯那嗪異構體A、B、C和D抑制VMAT-2轉運蛋白的能力。
方法和材料成年大鼠(Wistar品系)前腦膜的製備基本上如Chazot等(1993)Biochem.Pharmacol.45，605-610所述。成年大鼠紋狀體液泡膜的製備基本上如於Roland等(2000)，JPET 293，329-335所述。在25℃將10μg膜與[3H]二氫丁苯那嗪(18-20 nM)在50 mM HEPES pH8.0(測試緩衝液)中培養60分鐘，在GF/B玻璃纖維濾器上真空速濾收集結合的放射性配體。在2μM未標記丁苯那嗪的存在下，在並行樣品中確定非特異性結合。在β-計數器的閃爍液中計算放射性。以一式三份測定4種測試化合物(異構體A、B、C和D)的完全濃度範圍(對數和半對數單位)(範圍10-11-10-4M)。使測試化合物和丁苯那嗪以10 mM的貯備濃度溶於DMSO，然後在測試緩衝液中製備稀釋液。對每種化合物都進行3種獨立實驗。用GraphPad Prism 3.2軟體包對數據進行分析和曲線擬合。
結果最初，製備成年大鼠前腦P2膜標本(Chazot等，1993)並按原始的方案中所述測定。這產生極低水平的特異性結合活性。
然後製備成年大鼠紋狀體液泡標本，這產生顯著水平的穩定的特異性[3H]二氫丁苯那嗪結合位點(5-6pmol/mg蛋白)。這與公開的資料(Roland等，2000)非常相符。該製備用於所有後來的測定。
表5-測試化合物的競爭性結合參數
3種獨立實驗的數據以均數±SD表示。KI值的確定以公開的大鼠紋狀體KD值1.2nM(Roland等，2000)為基礎。
根據總KI值的總的藥理學曲線圖是異構體C＞異構體B＞異構體D＞＞異構體A。
值得注意的是，異構體B和異構體A都產生狹窄的競爭曲線，這最適合雙位結合模型。
異構體A具有高親和力(KI＝59nM)和低親和力位點(KI＜5.9μM親和力)，各自促成約50％總位點。這可提示異構體A可以區分不同的紋狀體VMAT-2結合位點。
實施例5VMAT功能測試A.VMAT2功能測試如實施例3中所述。由此，將大鼠紋狀體P2膜標本(Chazot等，1993)再懸浮並在冰冷的蒸餾水中均化。加入25 mMHEPES和100 mM酒石酸鉀(pH7.5，4℃)使滲透性恢復。然後將標本以20,000×g(4℃)離心20分鐘。將生成的S3部分除去，加入硫酸鎂(得到終濃度為1 mM，pH7.5，4℃)，將混合物以100,000×g離心45分鐘。最後的P4部分包含用於測試的突觸泡。
將100μl(約2.5μg蛋白)突觸泡的等分試樣與增加濃度的測試化合物C和B(在10-2M DMSO貯備液中新鮮製備)預溫育30分鐘(濃度範圍10-9M-10-4M)，然後在30℃在測試緩衝液(25mM HEPES，100mM酒石酸鉀，1.7mM抗壞血酸，0.05mM EGTA，0.1mM EDTA，2mM ATP-Mg2+，pH7.5)中，在[3H]多巴胺(30nM終濃度)的存在下溫育3分鐘。然後加入含2mM MgSO4而不是2mM ATP-Mg2+的冰冷的緩衝液測試緩衝液(pH7.5)終止反應，並通過浸在0.5％聚乙烯亞胺中的Whatman濾器速濾。用Brandel Harvester用冷緩衝液衝洗濾器3次。用液體閃爍計數器對截留在濾器上的放射性進行計數，通過在4℃測定吸收的液泡[3H]多巴胺確定非特異性結合。方法的依據描述於Ugarte YV等(2003)Eur.J.Pharmacol.472，165-171中。用10μM丁苯那嗪確定選擇性吸收的VMAT-2。
化合物C(表觀IC50＝18±2 nM)和化合物B(表觀IC50＝30±3 nM)都通過VMAT-2轉運蛋白抑制[3H]多巴胺吸收入大鼠紋狀體液泡，這種功能性親和力(曲線圖C＞B)類似於用[3H]二氫丁苯那嗪結合試驗確定它們各自的結合親和力。
B.VMAT1功能測試與VMAT2分離、單獨具有VMAT1的天然組織非常有限。然而，丁苯那嗪對VMAT2比對VMAT1的親和力高至少200倍，可將這種差別用於阻斷功能測試中VMAT2的影響(Erickson等(1996)PNAS(USA)93，5166-5171)。基本上如Moshharov等(2003)J Neurosci.23，5835-5845中所述，從年輕成年SD大鼠中分離腎上腺嗜鉻細胞。由此，在冰冷的PBS中切開腎上腺，除去腺體的莢膜和皮質，絞碎殘留的髓質。用PBS衝洗多次後，在30℃將組織與無Ca2+膠原酶IA溶液(250U/ml)溫育30分鐘並輕輕攪拌。衝洗消化的組織3次並將分裂的細胞以3000rpm離心得到沉澱物，將其懸浮於PBS中。按對腦標本描述的同一方式分離液泡部分。
將100μl(約2.5μg蛋白)突觸泡與增加濃度的測試化合物(按前文結合試驗所述製備)預培養30分鐘(濃度範圍10-9M-10-4M)。該測試在30℃在[3H]多巴胺(30nM終濃度)存在下，在測試緩衝液(25mMHEPES，100mM酒石酸鉀，1.7mM抗壞血酸，0.05mM EGTA，0.1mMEDTA，2mM ATP-Mg2+，pH7.5)中進行3分鐘。在10μM丁苯那嗪(在該濃度選擇性阻斷VMAT2)存在下測定吸收的[3H]多巴胺。在4℃通過測量吸收的液泡[3H]多巴胺確定非特異性吸收。然後加入含2mMMgSO4而不是2mM ATP-Mg2+的pH7.5的冰冷的緩衝液測試緩衝液終止反應，並通過浸在0.5％聚乙烯亞胺中的Whatman濾器速濾。用Brandel Harvester用冷緩衝液衝洗濾器3次並用液體閃爍計數器對截留在濾器上的放射性進行計數。
在10μM丁苯那嗪存在下，化合物B和化合物C對[3H]多巴胺吸收的抑制都弱，兩種化合物的IC50值都大於10-5M。這說明兩種化合物對VMAT-1的親和力都低。而且，數據顯示兩種化合物對VMAT-2比對VMAT-1的選擇性至少高2個數量級。
實施例6受體和轉運蛋白結合研究對4種二氫丁苯那嗪異構體A、B、C和D進行特異性結合試驗以測定它們結合至下文描述的受體和轉運蛋白的能力。結果在表6列出。
(a)腎上腺素α2A受體參考文獻S.Uhlcn等J.Pharmacol.Exp.Ther.，2711558-1565(1994)來源人重組昆蟲Sf9細胞配體1 nM[3H]MK-912載體1％DMSO培養時間/溫度60分鐘@25℃培養緩衝液75 mM Tris-HCl，pH 7.4，12.5 mM MgCl2，2 mM EDTA非特異性配體10μM WB-4101Kd0.6 nMBmax4.6 pmole/mg蛋白特異性結合95％定量方法放射性配體結合顯著性標準≥50％最大刺激或抑制(b)腎上腺素α2B受體參考文獻S.Uhlen等Eur.J.Pharmacol.，33(1)93-1-1(1998)
來源人重組CHO-K1細胞配體2.5nM[3H]蘿芙素(Rauwolscine)載體1％DMSO培養時間/溫度60分鐘@25℃培養緩衝液50mM Tris-HCl，1mM EDTA，12.5mM MgCl2，pH7.4，0.2％BSA，在25℃非特異性配體10μM哌唑嗪Kd2.1nMBmax2.1pmole/mg蛋白特異性結合90％定量方法放射性配體結合顯著性標準≥50％最大刺激或抑制(c)多巴胺D1受體參考文獻Dearry等，Nature，34772-76(1990)來源人重組CHO細胞配體1.4nM[3H]SCH-23390載體1％DMSO培養時間/溫度2小時@37℃培養緩衝液50mM Tris-HCl，pH7.4，150nM NaCl，1.4nM抗壞血酸，0.001％BSA非特異性配體10μM(+)-布他拉莫Kd1.4nMBmax0.63pmole/mg蛋白特異性結合90％定量方法放射性配體結合顯著性標準≥50％最大刺激或抑制
(d)多巴胺D2L受體參考文獻Bunzo等，Nature，336783-787(1988)來源人重組CHO細胞配體0.16nM[3H]螺哌隆載體1％DMSO培養時間/溫度2小時@25℃培養緩衝液50mM Tris-HCl，pH7.4，150nM NaCl，1.4nM抗壞血酸，0.001％BSA非特異性配體10μM氟哌啶醇Kd0.08nMBmax0.48pmole/mg蛋白特異性結合85％定量方法放射性配體結合顯著性標準≥50％最大刺激或抑制(e)多巴胺D3受體參考文獻Sokoloff等，Nature，347146-151(1990)來源人重組CHO細胞配體0.7nM[3H]螺哌隆載體1％DMSO培養時間/溫度2小時@37℃培養緩衝液50mM Tris-HCl，pH7.4，150nM NaCl，1.4nM抗壞血酸，0.001％BSA非特異性配體25μtM S(-)-舒必利Kd0.36nMBmax1.1pmole/mg蛋白特異性結合85％定量方法放射性配體結合顯著性標準≥50％最大刺激或抑制
(f)咪唑啉I2(中樞)受體參考文獻Brown等，Brit.J.Pharmacol.，99803-809，(1990)來源Wistar大鼠大腦皮質配體2nM[3H]咪唑克生載體1％DMSO培養時間/溫度30分鐘@25℃培養緩衝液50mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH7.4，在25℃非特異性配體1μM咪唑克生Kd4nMBmax0.14pmole/mg蛋白特異性結合85％定量方法放射性配體結合顯著性標準≥50％最大刺激或抑制(g)Sigma σ1受體參考文獻Ganapathy等，Pharmacol.Exp.Ther.，289251-260，(1999)來源人jurkat細胞配體8nM[3H]氟哌啶醇載體1％DMSO培養時間/溫度4小時@25℃培養緩衝液50mM K2HPO4/KH2PO4緩衝液，pH7.5非特異性配體10μM氟哌啶醇Kd5.8nMBmax0.71pmole/mg蛋白特異性結合80％定量方法放射性配體結合顯著性標準≥50％最大刺激或抑制
(h)Sigmaσ2受體參考文獻Hashimoto等，Eur.J.Pharmacol.，236159-163，(1993)來源Wistar大鼠腦配體3nM[3H]艾芬地爾載體1％DMSO培養時間/溫度60分鐘@37℃培養緩衝液50mM Tris-HCl，pH7.4非特異性配體10μM艾芬地爾Kd4.8nMBmax1.3pmole/mg蛋白特異性結合85％定量方法放射性配體結合顯著性標準≥50％最大刺激或抑制(i)血清素轉運蛋白(SERT)參考文獻Gu等，J.Biol.Chem.，269(10)7124-7130，(1994)來源人重組HEK-293細胞配體0.15nM[125I]RTI-55載體1％DMSO培養時間/溫度3小時@4℃培養緩衝液100mM NaCl，50mM Tris-HCl，1μM亮抑酶肽，10μMPMSF，pH7.4非特異性配體10μM丙咪嗪Kd0.17nMBmax0.41pmole/mg蛋白特異性結合95％定量方法放射性配體結合顯著性標準≥50％最大刺激或抑制
(j)多巴胺轉運蛋白(DAT)參考文獻Giros等，Trends Pharmacol.Sci.，1443-49(1993)Gu等，J.Biol.Chem.，269(10)7124-7130(1994)來源人重組CHO細胞配體0.15nM[125I]RTI-55載體1％DMSO培養時間/溫度3小時@4℃培養緩衝液100mM NaCl，50mM Tris-HCl，1μM亮抑酶肽，10μMPMSF，pH7.4非特異性配體10μM諾米芬新Kd0.58nMBmax0.047pmole/mg蛋白特異性結合90％定量方法放射性配體結合顯著性標準≥50％最大刺激或抑制表6
實施例7酶測試測試異構體B和C抑制參與CNS內單胺處理的酶，即兒茶酚O-甲基轉移酶(COMT)、單胺氧化酶A和單胺氧化酶B的能力。使用的測試方法在下文描述而結果在表7列出。
(a)兒茶酚O-甲基轉移酶(COMT)抑制來源豬肝底物3mM兒茶酚+S-腺苷-L-[3H]蛋氨酸載體1％DMSO預培養時間/溫度無培養時間60分鐘@37℃培養緩衝液100mM磷酸鉀，10mM MgCl2，含12單位/ml腺苷脫氨酶的3mM DTT，pH7.4定量方法[3H]guiacol定量顯著性標準≥50％最大刺激或抑制(b)單胺氧化酶MAO-A抑制來源人重組體底物50μM犬尿胺(kynuramine)載體1％DMSO預培養時間/溫度15分鐘@37℃培養時間60分鐘@37℃培養緩衝液100mM KH2PO4，pH7.4定量方法4-羥基喹啉的螢光分光光度計法定量顯著性標準≥50％最大刺激或抑制(c)單胺氧化酶MAO-B抑制來源人重組體底物50μM犬尿胺載體1％DMSO預培養時間/溫度15分鐘@37℃培養時間60分鐘@37℃培養緩衝液100mM KH2PO4，pH7.4定量方法4-羥基喹啉的螢光分光光度計法定量顯著性標準≥50％最大刺激或抑制表7
實施例8細胞測試用以下測試條件測定異構體B和C對人胚腎細胞吸收血清素(5-羥色胺)的抑制能力目標人HEK-293細胞載體0.4％DMSO培養時間/溫度10分鐘@25℃培養緩衝液5mM Tris-HCl，7.5mM HEPES，120mM NaCl，5.4mMKCl，1.2mM CaCl2，1.2mM MgSO4，5mM葡萄糖，1mM抗壞血酸，pH7.1定量方法將吸收的[3H]血清素定量顯著性標準相對於fluxetine反應對[3H]血清素吸收的抑制≥50％
結果顯示化合物B是拮抗劑並在10μM濃度時對血清素吸收的抑制為56％。化合物B的IC50是7.53μM。
還顯示化合物C是拮抗劑並在10μM濃度時對血清素吸收的抑制為86％。化合物B的IC50是1.29μM。
實施例95-HT1D/1B結合測試用根據描述於Millan，MJ等(2002)Pharmacol.Biochem.Behav.71，589-598的測試方法測定化合物B和化合物C結合至5-HT1D/1B受體的能力。用[N-甲基3H]GR-125743作為5-HT1D和5-HT1B受體的放射性配體。將成年SD大鼠前腦P2膜(Chazot等，1993)用於測試。所用的測試緩衝液是室溫下pH7.7的含4 mM氯化鈣、0.1％抗壞血酸和10μM帕吉林的50mM Tris-HCl。用5-HT(10μM)定義非特異性結合。在室溫下與1nM[3H]GR-125743溫育1小時，用預浸在0.1％聚乙烯亞胺中的GF/B濾器的Brandel Harvester速濾終止反應，然後用冰冷的緩衝液(補充0.1％BSA)衝洗3次。使用的10-10-10-4M劑量範圍。用GraphPad Prism 4軟體包分析生成的競爭曲線。
化合物B和C都很少取代[3H][N-甲基]GR-125743結合於大鼠前腦膜(IC50值＞10-4M)，提示B和C對5-HT1D/B受體的親和力都低。
實施例10用Caco-2吸收測試確定二氫丁苯那嗪異構體A、B、C和D的腸內滲透性Caco-2吸收測試是對藥物體內腸道吸收進行體外評估的成熟系統-參見Meunier等，Cell Biology and Toxicology(細胞生物學和毒理學)，11187-194，Wils等，Cell Biology and Toxicology，10393-397，以及Gres等，Pharm Sci，15(5)726-732。
該測試依賴Caco-2細胞在微孔過濾器上培養約21天時分化為腸細胞的能力。在培養期間，Caco-2細胞經歷自發性形態學和生物化學改變，在頂端表面產生邊界清楚的刷狀緣的極化單層，以及緊密的細胞連接。因此，這些細胞可用作分析藥物滲透性的體外模型。
可通過將化合物各自加至頂端或基底外側室從2個方向測定跨Caco-2單層的吸收頂端至基底外側或基底外側至頂端。在不同時間點，從接收室收集樣品，分析吸收率作為測定的跨單層的表觀滲透係數(Papp)。
Papp值反映測試物通過跨細胞(通過細胞膜)和旁細胞(通過細胞間的緊密連接)兩種途徑滲透的綜合。這些途徑的相對作用取決於pKa、分配係數(log D)、分子半徑和在給定pH中測試物的電荷。然後可根據化合物通過Caco-2單層的滲透性用Papp值將化合物分出等級次序。
用Caco-2吸收模型確定4種二氫丁苯那嗪異構體A、B、C和D在50μM的表觀滲透係數(Papp)並參照相對於化合物的低、中和高度滲透性進行分級。將放射性標記的參照標準甘露醇(低)、水楊酸(中)和睪酮(高)用於建立滲透性的等級次序。通過測定1小時後每種二氫丁苯那嗪測試物在供給和接收室中的濃度評估其Papp值。在頂端至基底外側方向，在pH7.4跨細胞單層中確定吸收。使用於評估Papp值的Caco-2細胞在12孔平板中的Transwell插入物上生長26天。通過經上皮的電阻(Ohm-cm2)和螢光黃(Lucifer Yellow)方法在吸收測試之前和之後確定單層完整性。
材料和方法在甲醇中製備50mM的甘露醇、水楊酸和睪酮的貯備液。在測試當天，將參照標準物在pH 7.4的Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)中稀釋，得到終濃度為50μM。然後將放射性標記的14C-甘露醇、3H-睪酮和14C-水楊酸加入它們對應的未標記的介質中，得到最終的比活性為0.35-0.65μCi/mL。在DMSO中製備濃度為50mM的二氫丁苯那嗪異構體樣品。將每種貯備液進一步稀釋在HBSS緩衝液(pH7.4)中，得到50μM的最終工作濃度。
如下製備Caco-2細胞懸浮液。將傳代數為29的一管Caco-2原始細胞(ID號Caco-29-080299)(美國典型培養物保藏中心(VA，USA))解凍並放入含Caco-2培養基的150cm2燒瓶內培養。融合後，除去培養基並用5ml PBS衝洗細胞。加入並與0.25％胰蛋白酶-EDTA(每燒瓶2.0ml)在37℃培養約10分鐘後分離細胞。在顯微鏡下監測細胞分離並加入10mL Caco-2培養基終止分離。通過臺盼藍排除法評估細胞活力和濃度。一旦確定細胞密度和活力，即將Caco-2細胞稀釋在培養基中得到最終的工作濃度為2.0×105細胞/ml。Caco-2培養基包含Dulbecco’s改進的Eagle培養基、10％胎牛血清、100μM非必需胺基酸、100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素。
在5％CO237℃水套培養箱中將Costar聚碳酸酯膜(0.4μm孔徑)與Caco-2培養基預平衡1小時。將頂室內含物除去並用500μl Caco-2細胞懸浮液(200 000細胞/ml)代替。在5％CO237℃水套培養箱中將細胞進一步培養26天。
測定前，將所有單層用HBSS衝洗2次並用Millicell-ERS計量器測量它們經上皮的電阻(TEER)。減去無細胞時獲得的TEER值作為本底信號。只將TEER值超過150 Ohm-cm2的單層用於吸收測試實驗。
所有吸收實驗都在pH7.4平行進行3次。從頂端至基底外側方向評估每種參照標準物和二氫丁苯那嗪測試物的吸收率。在測試開始時留出每種工作溶液(50μM參照標準和測試物)的等分試樣(100μl)用於確定起始濃度(C0)。
吸收實驗從用500μl含測試物或參照化合物的Hanks平衡鹽溶液代替供給室內含物開始。將細胞再送回CO2培養箱進行吸收測試。1小時後從接收和供給室收集100μl樣品並用於確定回收百分數。將放射性標記的參照標準物(甘露醇、水楊酸和睪酮)用作質量控制並作為二氫丁苯那嗪測試物的等級對照。
在吸收實驗結束時，通過監測螢光黃從頂端至基底外側面的洩漏量評估各細胞單層的完整性。從頂端和基底外側室除去所有溶液。用1.5ml新鮮HBSS充滿基底外側室，而用0.5ml 120μg/ml螢光黃溶液充滿頂室。將細胞再送回培養箱1小時，然後收集100μl樣品並用SpectraMax 340PC-讀板器在428nm進行分光光度計定量。
將20μl體積每种放射性標記的樣品加入10ml閃爍合劑(ScintiSafe 30％)中並用液體閃爍分析器計數(1900CA Tri-Carb)至多5分鐘。
用液體層析-串聯/質譜(LC-MS/MS)法分析Caco-2細胞培養物中存在的二氫丁苯那嗪。
用公式Papp＝dQ/dt×1/A×1/C0(cm/sec)計算表觀滲透係數，其中dQ/dt是化合物的彌散率(μg/sec或整合面積/sec)，A是總的細胞膜表面積(cm2)，而C0是起始濃度(μg/mL或整合面積/sec)。
將不同二氫丁苯那嗪測試物的頂端至基底外側的Papp值與參照標準的Papp值比較。結果在表8顯示。二氫丁苯那嗪化合物C、D和A各自的Papp值為21.14×10-6、24.87×10-6和25.52×10-6cm/sec，其可與睪酮參照標準相比。
化合物B的Papp值為11.98×10-6cm/sec，其類似於水楊酸參照標準。
表8
化合物C、D和A的Papp值接近睪酮值，提示這些化合物在caco-2模型中具有高度滲透性，而化合物B的Papp值在水楊酸和睪酮值之間，提示其在Caco-2模型中具有中度滲透性。這些結果提示4種二氫丁苯那嗪異構體應當通過體內腸上皮高度吸收。
實施例11比較丁苯那嗪與二氫丁苯那嗪異構體B和C的鎮靜性能在大鼠中進行一項研究以確定本發明的二氫丁苯那嗪異構體是否具有鎮靜性能。用下文列出的方法將異構體對大鼠自主活動能力的效應與丁苯那嗪和氟哌啶醇產生的效應進行比較。
方法將研究開始時重量為200-250 g的雄性Sprague-Dawley大鼠(查爾斯河實驗室，Saint-Germain/L′Arbresle，法國)用於研究。將大鼠以每籠2或3隻圈養在III型Makrolon籠內，房間內設定以下環境條件溫度20±2 ℃，溼度最低45％，換氣＞12每小時，光/暗循環為12h/12h[在7:00a.m.開始]。開始研究前讓大鼠適應它們的條件至少5天。無限制地為大鼠提供食物(Dietex，Vigny，France，參考811002)和水(水瓶中的自來水)。
在實驗當天新鮮製備各測試化合物的玉米油溶液。將氟哌啶醇製備在羥乙基纖維素中，以0.5％製備在去離子水中。載體或測試化合物以單一劑量(0.3、1、3和10mg/kg，2mL/kg腹腔注射)給藥。參照化合物氟哌啶醇(1mg/kg)是腹腔注射(i.p.)(2mL/kg)給藥。
在低光密度(最大50勒克斯)的房間中，將動物放置於攝像機下的有機玻璃籠子內。給藥後45分鐘和3小時，用視頻圖像分析器(Videotrack，View Point，法國)在20分鐘時間段確定活動能力。給藥後1小時記錄參照組(氟哌啶醇)的活動能力。判斷能走動的運動的數量和持續時間以及不活動的持續時間。活動能力測量結束時(45分鐘和3小時)，將有機玻璃籠子內的眼瞼閉合和喚醒按以下評分眼瞼閉合0(正常)眼瞼廣泛地打開1眼瞼輕度下垂2上瞼下垂，眼瞼下垂約一半3眼瞼完全關閉喚醒1極低，木僵，昏迷，很少或無應答2低，少許木僵，《呆滯》，少許頭部或軀體運動3有些低，輕微木僵，少許探索樣運動，伴有不動期4正常，警覺，探索樣運動/緩慢僵硬5有些高，輕度興奮，緊張，突然疾走或停住6非常高，高度警覺，興奮，突然發作性奔跑或軀體運動在兩個20分鐘時間段(給藥後45分鐘和3小時)用視頻圖像分析器(Videotrack，ViewPoint，Lyon，France)確定能走動(大)的運動的發生次數和持續時間(秒)以及不活動的持續時間(秒)。用放於有機玻璃籠子上的攝像機進行圖像示蹤，記錄所有活動能力。將攝像機記錄的圖像數位化，並用以下方法將數字圖像點的重力中心位移進行示蹤和分析測量點的重力中心的位移速度並設定兩個閾值定義運動類型閾值1(高速)和閾值2(低速)。當動物運動且點(spot)的重力中心的位移速度超過閾值1時，將該運動視為能活動的運動。當動物保持不動時，速度低於閾值2，將該運動視為不活動。
結果的12個單一值以均數±SEMs表示。採用ANOVA(單向)和Dunnett’s t-檢驗，用KruSkal-Wallis非參數檢驗，隨後用Mann Whitney U-檢驗對鎮靜cotation進行統計學分析。p值＜0.05表示具顯著性。
實驗方案組大小n＝12組1參照，氟哌啶醇(1mg/kg腹腔注射)組2載體對照組(2ml/kg腹腔注射)組3丁苯那嗪(0.3mg/kg腹腔注射)組4丁苯那嗪(1mg/kg腹腔注射)組5丁苯那嗪(3mg/kg腹腔注射)組6丁苯那嗪(10mg/kg腹腔注射)組7異構體C(0.3mg/kg腹腔注射)組8異構體C(1mg/kg腹腔注射)組9異構體C(3mg/kg腹腔注射)組10異構體C(10mg/kg腹腔注射)組11異構體B(0.3mg/kg腹腔注射)組12異構體B(1mg/kg腹腔注射)組13異構體B(3mg/kg腹腔注射)組14異構體B(10mg/kg腹腔注射)
結果
**單向ANOVA和Dunnett’s檢驗與載體組顯著差異(p，0.01)。
結果證明給藥後45分鐘和3小時，丁苯那嗪產生劑量依賴的鎮靜效應，而異構體B和異構體C在任何時間都無鎮靜效應，即使異構體C在給藥後3小時顯示輕微且不顯著的運動過度效應。
實施例12藥用組合物(i)片劑製劑-I通過將50mg二氫丁苯那嗪與作為稀釋劑的197mg乳糖(BP)以及作為潤滑劑的3mg硬脂酸鎂混合，並用已知的方法壓緊形成片劑製備含本發明的二氫丁苯那嗪的片劑組合物。
(ii)片劑製劑-II通過將化合物(25mg)與氧化鐵、乳糖、硬脂酸鎂、白色玉米澱粉和滑石混合，並用已知的方法壓緊成片劑製備含本發明的二氫丁苯那嗪的片劑組合物。
(iii)膠囊製劑通過將100mg本發明的二氫丁苯那嗪與100mg乳糖混合併將生成的混合物填充入標準不透光的硬明膠膠囊內製備膠囊製劑。
等價物很容易明白在不脫離本發明的原理下即可對上文描述的本發明的具體實施方案進行許多修飾和改變。所有這樣的修飾和改變都打算包括在本申請書內。
權利要求
1.3，11b-順式-二氫丁苯那嗪。
2.基本純形式的3，11b-順式-二氫丁苯那嗪，例如異構純度大於90％，典型大於95％且更優選大於98％。
3.根據權利要求1或權利要求2的3，11b-順式-二氫丁苯那嗪，其為(+)-異構形式。
4.一種組合物，它包含基本上無3，11b-反式-二氫丁苯那嗪的3，11b-順式-二氫丁苯那嗪。
5.一種組合物，它包含3，11b-順式-二氫丁苯那嗪且含小於5％的3，11b-反式-二氫丁苯那嗪，優選小於3％的3，11b-反式-二氫丁苯那嗪，且更優選小於1％的3，11b-反式-二氫丁苯那嗪。
6.根據權利要求4或權利要求5的組合物，其中3，11b-順式-二氫丁苯那嗪是(+)-異構體。
7.3，11b-順式-二氫丁苯那嗪的2S，3S，11bR異構體，它具有式(Ia)
8.3，11b-順式-二氫丁苯那嗪的2R，3R，11bS異構體，它具有式(Ib)
9.3，11b-順式-二氫丁苯那嗪的2R，3S，11bR異構體，它具有式(Ic)
10.3，11b-順式-二氫丁苯那嗪的2S，3R，11bS異構體，它具有式(Id)
11.一種3，11b-順式-二氫丁苯那嗪異構體，當在21℃甲醇中測定時，它具有-114.6°的ORD[αD]值。
12.一種3，11b-順式-二氫丁苯那嗪異構體，當在21℃甲醇中測定時，它具有約+123°的ORD[αD]值。
13.一種3，11b-順式-二氫丁苯那嗪異構體，當在21℃甲醇中測定時，它具有+150.9°的ORD[αD]值。
14.一種3，11b-順式-二氫丁苯那嗪異構體，當在21℃甲醇中測定時，它具有-145.7°的ORD[αD]值。
15.一種二氫丁苯那嗪異構體，其光譜學特徵在本文表1中列出，而層析和任選的ORD特徵在本文表3中列出。
16.一種二氫丁苯那嗪異構體，其光譜學特徵在本文表2中列出，而層析和任選的ORD特徵在本文表4中列出。
17.二氫丁苯那嗪異構體A，它具有本文表1中列出的光譜學特徵、本文表3中列出的層析特徵並具有左旋的旋光性。
18.二氫丁苯那嗪異構體B，它具有本文表1中列出的光譜學特徵、本文表3中列出的層析特徵並具有右旋的旋光性。
19.二氫丁苯那嗪異構體C，它具有本文表2中列出的光譜學特徵、本文表4中列出的層析特徵並具有右旋的旋光性。
20.二氫丁苯那嗪異構體D，它具有本文表2中列出的光譜學特徵、本文表4中列出的層析特徵並具有左旋的旋光性。
21.前述權利要求中任一項定義的二氫丁苯那嗪，它為游離鹼形式。
22.權利要求1至20中任一項定義的二氫丁苯那嗪，它為酸加成鹽形式。
23.根據權利要求22的二氫丁苯那嗪，其中所述鹽是甲磺酸鹽。
24.前述權利要求中任一項定義的二氫丁苯那嗪，它用於藥物或治療，例如治療運動過度的運動失調例如亨廷頓氏病、偏側顫搐、老年性舞蹈病、抽搐、遲發性運動障礙和圖雷特氏症候群或治療抑鬱。
25.一種藥用組合物，它包含權利要求1至23中任一項定義的二氫丁苯那嗪以及藥學上可接受的載體。
26.權利要求1至23中任一項定義的二氫丁苯那嗪在製備用於治療運動過度的運動失調例如亨廷頓氏病、偏側顫搐、老年性舞蹈病、抽搐、遲發性運動障礙和圖雷特氏症候群或治療抑鬱的藥物中的用途。
27.一種預防或治療需要這樣的預防或治療的患者的運動過度的運動失調例如亨廷頓氏病、偏側顫搐、老年性舞蹈病、抽搐、遲發性運動障礙和圖雷特氏症候群或治療抑鬱的方法，該方法包括給予有效預防或治療量的權利要求1至23中任一項定義的二氫丁苯那嗪。
28.一種製備權利要求1至23中任一項定義的二氫丁苯那嗪的方法，該方法包括使式(II)化合物 與適合將式(II)化合物中的2，3-雙鍵水合的一種或多種試劑反應，其後在需要時分離和離析所需的二氫丁苯那嗪異構體形式。
29.一種製備權利要求1至23中任一項定義的二氫丁苯那嗪的方法，該方法包括使式(III)化合物 經歷用於使式(III)化合物中的2，3-環氧化物基團開環的條件，其後在需要時分離和離析所需的二氫丁苯那嗪異構體形式。
30.一種製備權利要求29定義的式(III)化合物的方法，該方法包括使權利要求27定義的式(II)的烯烴化合物與適合形成環氧化物基團的氧化劑(例如過氧酸)反應。
31.一種製備權利要求28定義的式(II)化合物的方法，該方法包括用脫水劑例如滷化磷或滷氧化磷使3，11-反式-二氫丁苯那嗪脫水。
32.一種式(II)化合物
33.一種式(III)化合物
34.權利要求1至23中任一項定義的化合物的Mosher’s酸酯。
全文摘要
本發明提供二氫丁苯那嗪的新異構體、單一對映體及其混合物，其中二氫丁苯那嗪是3，11b－順式－二氫丁苯那嗪。還提供製備新異構體的方法、包含它們的藥用組合物以及它們在治療運動過度的運動失調例如亨廷頓氏病、偏側顫搐、老年性舞蹈病、抽搐、遲發性運動障礙和圖雷特氏症候群中的用途。
文檔編號A61K31/473GK1980924SQ200580012044
公開日2007年6月13日 申請日期2005年2月11日 優先權日2004年2月11日
發明者I·克拉克, R·特爾特爾, G·約翰斯頓, 羅伯特·特萊德蓋茨 申請人:劍橋實驗室(愛爾蘭)有限公司