納米纖維結構及其合成方法和用途與流程

2023-06-05 23:52:46 3

本申請根據35u.s.c.§119(e)要求於2014年9月29日遞交的us臨時專利申請號62/056,899的優先權。上述申請通過引用併入本文。

本發明是在政府支持下由國家健康研究院授予的授權號2p20gm103480做出的。政府對本發明具有一定的權利。

發明領域

本發明涉及納米纖維和納米纖維結構領域。更具體地，本發明提供了用於增加納米纖維結構的厚度和/或孔隙率的方法。

背景技術：

在整個說明書中引用了若干出版物和專利文獻，以便描述本發明所屬領域的技術狀態。這些引文的每一篇通過引用併入本文，如同完全闡述一樣。

再生醫學是包含三個主要元素的多學科主題：細胞、支架(scaffold)和信號分子(khademhosseini等人(2006)proc.natl.acad.sci.，103：2480-2487)。支架起重要作用，因為它們不僅提供用於細胞粘附和增殖的基底，而且還可以遞送多種線索以調節用於組織再生的細胞反應(grafahrend等人(2011)nat.mater.，10:67-73)。已經開發了用於製造支架的多種微製造技術(derby，b.(2012)science338:921-926；moutos等人(2007)nat.mater.，6:162-167；wegst等人)nat.mater.，14:23-36)。電紡納米纖維由於其對細胞外基質(ecm)的結構和ecm膠原纖維的尺寸的生物模擬已顯示出作為用於再生醫學的支架的巨大希望(xie等人(2008)macromol.rapidcommun.，29:1775-1792；liu等人(2012)adv.healthcaremater.，1:10-25)。傳統的靜電紡絲通常產生不受控制的和密集堆積的纖維，然而，導致緊湊的二維(2d)納米纖維墊/膜和阻礙貫穿納米纖維支架的細胞浸潤和生長。因此，傳統的2d納米纖維墊被限制為用於其在再生醫學和工程化三維(3d)組織模型中的應用的理想底物(bhardwaj等人(2010)biotechnol.adv.，28:325-347)。

為了克服這個巨大的障礙，已經進行了許多嘗試來開發可以增強細胞向內生長的3d電紡納米纖維支架(blakeney等人(2011)biomaterials，32:1583-1590；lee等人(2011)tissueeng.，parta，17:2695-2702；cai等人(2013)langmuir29：2311-2318；sheikh等人(2014)nanomedicine11:681-691；jeong等人(2014)j.mater.chem.b，2:8116-8122)。不幸的是，大多數方法局限於製造由無規取向的納米纖維和/或某些材料(例如，具有添加劑)組成的3d納米纖維支架(jin等人，(2015)angew.chem.，int.ed.，54:7587-7591)。這些方法通常導致不足的厚度和/或受限的幾何形狀和/或不受控制的孔隙率。此外，獲得的先前的3d支架與無序結構和缺乏對於有組織的組織例如腱、神經和肌肉的再生至關重要的納米形貌線索相關聯(liu等人(2012)adv.healthcaremater.，1:10-25；ma等人(2013)nanomedicine8:1459-1481)。或者，其他研究已經致力於使用具有大得多的直徑(≈幾至幾十μm)的電紡纖維，以便增強細胞浸潤(fong等(2013)proc.natl.acad.sci.，110:6500-6505；soliman等人(2011)j.biomed.mater.res.，parta，96a:566-574)。這種微纖維缺乏仿生性質和納米形態線索，導致與使用納米纖維相比不同的細胞應答。作為顯著的實例，與膜和微纖維支架相比，納米纖維支架可以最小化炎症反應(saino等人(2011)biomacromolecules12:1900-1911)。此外，浸潤的細胞仍然主要分布在微纖維支架的表面部分(fong等人(2013)proc.natl.acad.sci.，110:6500-6505)。期望保持特定的納米形貌線索，例如由用於3d電紡支架的排列的納米纖維提供的各向異性特性。這樣的納米形貌線索可以用作細胞行為的調節劑(例如，促進細胞骨架重組和人間充質幹細胞的細胞和核伸長，引導和增強人皮膚成纖細胞遷移和軸突生長，以及調節腱幹細胞分化)用於受歡迎的組織再生(dang等人(2007)adv.mater.，19:2775-2779；patel等人(2007)nanolett.，7:2122-2128；yin等人(2010)biomaterials31:2163-2175)。因此，必須開發簡單、可控和有效的方法以生成3d電紡納米纖維支架，其能夠以在細胞接種和增殖後具有高度有序的結構和均勻的細胞分布支持細胞浸潤和組織。

技術實現要素：

根據本發明，提供了用於生產具有增加的孔隙率和/或厚度的納米纖維結構的方法。該方法包括將包含多個納米纖維的納米纖維結構(例如，墊)暴露於氣泡。氣泡可以通過化學反應和/或物理手段產生。在具體實施方案中，氣泡作為化學反應(例如硼氫化鈉的水解)的產物產生。該方法還可包括在暴露於氣泡之前製備包含多個納米纖維(例如，單軸排列的、無規的、纏結的和/或電紡纖維)的納米纖維結構。該方法還可以包括在暴露於氣泡之後洗滌納米纖維結構，去除捕獲在納米纖維結構內的氣泡，和/或凍幹所產生的納米纖維結構。

根據本發明的另一方面，提供了具有增加的厚度和/或孔隙率的三維納米纖維結構。

附圖說明

圖1a、1b和1c顯示了排列的納米纖維支架的膨脹和表徵。圖1a:用1mnabh4處理0分鐘、20分鐘和24小時的排列的pcl纖維墊的照片。插圖顯示了相應的原理圖。圖1b:在浸入水、0.01m、0.1m、1mnabh4中20分鐘、1小時、2小時、4小時和24小時後測量排列的pcl纖維墊的厚度。圖1c：在浸入水、0.01m、0.1m、1mnabh4中20分鐘、1小時、2小時、4小時和24小時後估計排列的pcl纖維墊的相應孔隙率。

圖2a、2b和2c顯示了排列的納米纖維支架的形態和微觀結構。圖2a:sem圖像顯示在1mnabh4溶液中膨脹20分鐘和24小時之前和之後的排列的pcl纖維墊的橫截面形態。比例尺為20μm。圖2b:在膨脹20分鐘和24小時後，納米纖維支架的相鄰層之間的間隙距離的分布。圖2c：膨脹20分鐘和24小時後納米纖維支架的層厚度的分布。通過imagej軟體基於sem圖像測量間隙距離和層厚度。

圖3a、3b、3c、3d、3e和3f顯示了無規納米纖維支架的膨脹和表徵。圖3a:顯示無規pcl納米纖維墊在用1m的nabh4水溶液處理前和處理20分鐘和24小時後的照片。圖3b:sem圖像顯示pcl纖維墊在用1mnabh4水溶液處理前和處理20分鐘和24小時後的橫截面形態。圖3c：無規納米纖維墊在用1m的nabh4水溶液處理前和處理不同時間後的厚度。圖3d：估計無規納米纖維墊在用1m的nabh4水溶液處理前和處理不同時間後的孔隙率。比例尺為20μm。圖3e：在膨脹20分鐘和24小時後，無規納米纖維支架的相鄰層之間的間隙距離的分布。圖3f：膨脹20分鐘和24小時後無規納米纖維支架的層厚度的分布。通過imagej軟體基於sem圖像測量間隙距離和層厚度。

圖4a、4b、4c和4d顯示了管狀納米纖維支架的膨脹和表徵。圖4a:顯示了在用1mnabh4處理1小時和24小時之前和之後，由外層中的無規納米纖維和在內層(rla)中縱向排列的納米纖維製成的管狀支架的照片。圖4b:顯示了在用1mnabh4處理1小時和24小時之前和之後，由外層中的無規納米纖維和在內層(rca)中周向排列的納米纖維製成的管狀支架的照片。圖4c：用1mnabh4溶液處理不同時間後的管狀支架(rla)的內徑和外徑的變化。圖4d：用1mnabh4溶液處理不同時間之前和之後的管狀支架(rca)的內徑和外徑的變化。

圖5顯示了管狀納米纖維支架的形態。sem圖像顯示在1mnabh4溶液中膨脹24小時之前和之後的管狀納米纖維支架(rla和rca)的橫截面形態。管狀納米纖維支架在膨脹後形成層狀結構。

圖6a和6b顯示了在孵育1天(圖6a)和7天(圖6b)之後接種nih3t3成纖細胞的排列的pcl納米纖維支架(未膨脹vs.膨脹的)的蘇木精-伊紅染色。將支架以1mm的厚度切片用於蘇木精-伊紅染色。細胞分布在傳統納米纖維支架表面。相比之下，細胞分布在整個膨脹的支架。

圖7a和7b示出了圖6a和6b的高度放大圖像。在孵育1天(圖7a)和7天(圖7b)之後接種nih3t3成纖細胞的排列的pcl納米纖維支架(未膨脹vs.膨脹的)的蘇木精-伊紅染色。將支架以1mm的厚度切片用於蘇木精-伊紅染色。細胞分布在傳統納米纖維支架表面上。相比之下，細胞分布在整個膨脹的支架。

圖8a和8b顯示氣泡形成。光學顯微鏡圖像顯示在不存在(圖8a)和存在(圖8b)電紡納米纖維支架的情況下在nabh4溶液中的氣泡形成。

圖9提供了說明納米纖維支架在nabh4溶液中的膨脹過程的示意圖：(i)由毛細作用驅動的nabh4水溶液快速滲透到排列的納米纖維支架中；(ii)在納米纖維的表面上或在不完全排列的納米纖維的交叉處氣泡的異相成核；(iii)在持續產生越來越多的氫的情況下成核氣泡的生長；(iv)相鄰氣泡的聚結；和(v)由於氣泡的進一步生長和聚結而形成「氣泡層」。

圖10a和10b顯示了納米纖維支架的形態。顯示在膨脹之前(圖10a)和之後(圖10b)的排列的納米纖維支架的照片。圖10b中的支架交替浸泡在1mnahco3和1mhcl溶液中數輪。

圖11提供了納米纖維膜的兩個圖像，其中每個圖像中右側的樣品在膨脹之前，和每個圖像中左側的樣品在液體co2中膨脹之後。

具體實施方式

由於其生物模擬，電紡納米纖維已經顯示出作為用於再生醫學的支架的巨大潛力。然而，傳統的二維電紡納米纖維墊抑制了它們的應用，因為其緻密的結構和缺乏有效的細胞浸潤以及缺乏氧和營養物擴散。這裡，提供了一種在第三維中膨脹電紡納米纖維墊的新方法，特別是使用改進的氣體成泡技術。所得納米纖維支架顯示具有可控間隙寬度和微米級的層厚度的層狀結構。膨脹納米纖維支架具有比傳統的二維納米纖維膜顯著更高的孔隙率，同時保持納米形貌線索。間隙寬度和層厚度的分布直接取決於納米纖維墊在氣泡形成溶液內的處理時間。與在傳統納米纖維墊表面上的有限細胞增殖相比，體外試驗顯示出在膨脹的納米纖維支架內強健的細胞浸潤和增殖。重要的是，在孵育7天後，在整個膨脹和排列的納米纖維支架中觀察到細胞排列。所提出的方法進一步應用於製造由膨脹納米纖維組成的管狀支架。共同地，這種新型的支架在再生醫學和建立用於藥物篩選和生物學研究的3d體外組織模型的應用中具有重要的前景。

用於增加納米纖維支架的孔隙率的先前方法主要包括超聲波處理、增加纖維直徑和選擇性去除犧牲纖維(lee等人(2011)tissueeng.parta.,17:2695-702；pham等人(2006)biomacromolecules7:2796-805；baeretal.(2008)biomaterials29:2348-58；kidoaki等人(2005)biomaterials26:37-46；yang等人(2009)tissueeng.a.,15:945-56；zhou等人(2006)polymer47:7497-505；brown等人(2011)adv.mater.,23:5651-7；bkakeney等人(2011)biomaterials32(6):1583-90；zhang等人(2007)adv.mater.,19:3664-7；xie等人(2011)small7:293-7；thandayamoorthy等人(2006)j.appl.polym.sci.,101:3121-4；yan等人(2011)langmuir27:4285-9；xie等人(2012)adv.healthcaremater.,1:674-8；lee等人(2010)tissueeng.c.methods17:651-61)。然而，這些技術仍然與有限的孔隙率、生產中的低效率、複雜的方法、耗時的工藝以及對特別昂貴的設備的需求相關聯。本發明的優點包括但不限於：1)孔隙率的範圍大於目前可用的技術；2)常規纖維製作後不需要特殊設備；3)適用於大多數聚合物纖維；(4)該技術可以容易地擴展至製造用於再生神經和腸組織和血管的其它醫療裝置，以及(5)該方法簡單且易於工業化。

氣體成泡技術通常包括三個基本步驟：(1)聚合物/氣體溶液形成，(2)氣泡(孔)成核和(3)氣泡(孔)生長和體積膨脹(park等人(1995)polym.eng.sci.，35：432-440)。氣泡/成泡方法在材料科學(例如，製造泡沫和中空金屬球)、環境管理(例如水處理)、醫學(例如醫學成像、治療學和用於氣體、藥物和基因的載體)和食品工業(例如，食品混合和增強質地)的領域中具有多種應用(rodriguez-rodriguez等人(2015)annu.rev.fluidmech.,47:405-429；lindner等人(2004)nat.rev.drugdiscovery3:527-533；lee等人(2015)softmatter11:2067-2079；sirsi等人(2009)bubblesci.,eng.,technol.,1:3-17)。雖然氣體成泡可以用於製造具有高孔隙率的海綿支架用於組織工程中的應用，但是它沒有用於膨脹電紡納米纖維墊(nam等人(2000)j.biomed.mater.res.，53:1-7)。

本發明涉及新的微纖維(直徑>1μm)和納米纖維(直徑<1μm)結構(例如墊)以及以後處理方式將微纖維或納米纖維結構(例如墊)的第三維度擴展以增加結構的孔隙率。儘管本申請通常描述了納米纖維結構的改性和三維納米纖維結構的合成，但是本發明還包括微纖維結構的改性和三維微纖維結構的合成。所述方法可以利用化學反應和/或物理手段來產生氣泡形成。本發明的纖維可以通過任何方法製造，然後可以放置在其中產生氣泡不同時間量的條件下(例如，浸沒或浸泡在液體中)。

電紡納米纖維通常沉積在基底上以形成納米纖維墊。然而，由於其固有的缺點，纖維墊通常是緻密的並且難以實現用於細胞浸潤的合適的孔隙率。本發明提供了通過利用氣泡(例如，通過在水溶液中的化學反應產生的)來膨脹納米纖維墊的第三維度的簡單方法。例如，可以使用氣體生產化學反應；通過在高壓和/或低溫下在液體中的溶解氣體；加壓氣體(例如，co2)液體；和/或物理手段(例如，雷射(例如，脈衝雷射)、聲誘導或流動誘導)，但不限於此，來產生氣泡。本發明的方法還可以用於擴大其它類型的纖維材料(即，不限於電紡納米纖維)的孔隙率。獲得的支架可以模擬細胞外基質的結構。所獲得的支架也可以具有大的孔隙率，從而允許細胞容易地浸潤。通過本發明的方法產生的納米纖維支架可用於組織再生(例如骨、腱、軟骨、皮膚、神經和/或血管)。與細胞組合，可以容易地形成三維組織構建體以修復受損的組織或器官。

鹽浸提/氣體成泡方法已經用於生產雙孔納米纖維支架(lee等人(2005)biomaterials26:3165-3172)。使用碳酸氫銨作為氣體成泡劑。然而，該方法與使用相對高的溫度(90℃)用於浸出nh4hco3顆粒和在固化的聚合物基質內產生氣態氨和二氧化碳相關。此外，沒有提出層狀結構和納米形貌線索的維護。另一項研究僅使用氣體成泡技術研究了無規纖維膜(joshi等人(2015)chem.eng.j.，275:79-88)。

本文中，提供了利用改進的氣體成泡技術，任選地，然後冷凍乾燥用於三維膨脹納米纖維墊(例如，電紡納米纖維墊；例如包含聚(ε-己內酯)(pcl，fda批准的、生物相容性和生物可降解的聚合物)的墊)的新方法。證明了該方法可靠地產生具有高度有序架構的3d納米纖維支架的能力，其理想地用於支持和組織浸潤和增殖細胞。

根據本發明，提供了用於生產三維納米纖維(或微纖維)結構的方法。換句話說，該方法增加納米纖維(或微纖維)結構(例如，包括多個納米纖維(或微纖維)(例如，單軸排列、無規、纏結和/或電紡絲))的厚度和/或孔隙率。該方法包括將納米纖維(或微纖維)結構(例如，墊)暴露於氣泡。如本文所解釋的，氣泡可以通過化學反應或物理操作產生。例如，納米纖維結構可以浸沒或浸入氣泡/氣體產生化學反應或物理操作中。通常，暴露於氣泡的時間越長，納米纖維結構的厚度和孔隙率增加越大。納米纖維結構還可在模具(例如，金屬、塑料或在氣泡存在下不膨脹的其它材料)中膨脹，使得膨脹的納米纖維結構形成所需形狀(例如管)。納米纖維結構可以在暴露於氣泡之前用空氣等離子體處理(例如，以增加親水性)。

在暴露於氣泡之後，納米纖維結構可以在水和/或期望的載體或緩衝液(例如，藥學或生物學可接受的載體)中洗滌或漂洗。可以通過對納米纖維結構施加真空來去除捕獲的氣泡。例如，膨脹的納米纖維結構可以浸沒或浸入在液體(例如水和/或期望的載體或緩衝液)中，並且可以施加真空以快速除去氣泡。在膨脹之後(例如，在漂洗和去除捕獲的氣體之後)，納米纖維結構可以被凍幹和/或冷凍乾燥。

本發明的方法還可以包括在暴露於氣泡之前合成納米纖維結構(例如，墊)。在具體實施方案中，使用電紡絲合成納米纖維結構。在一個具體實施方案中，納米纖維結構包括單軸排列的纖維、無規纖維和/或纏結纖維。納米纖維結構可以在膨脹之前切割或成形。

本發明的氣泡可以通過本領域已知的任何方法製備。氣泡可以例如通過化學反應或通過物理方法產生。在一個具體實施方案中，化學反應或物理操作不損傷或改變或基本上不損壞或改變納米纖維(例如，納米纖維在化學反應中是惰性的，而不是化學改性的)。如上所述，納米纖維結構可以浸沒或浸入在包含產生氣泡的化學反應的試劑的液體中。產生氣泡的化學反應的實例包括但不限於：

nabh4+2h2o＝nabo2+4h2

nabh4+4h2o＝4h2(g)+h3bo3+naoh

hco3-+h+＝co2+h2o

nh4++no2-＝n2+2h2o

h2co3＝h2o+co2

2h++s2-＝h2s

2h2o2＝o2+2h2o

3hno2＝2no+hno3+h2o

ho2cch2coch2co2h＝2co2+ch3coch3

2h2o2＝2h2+o2

cac2+h2o＝c2h2

zn+2hcl＝h2+zncl2

2kmno4+16hcl＝2kcl+2mncl2+h2o+5cl2

在一個特別的實施方案中，化學反應是nabh4的水解反應(例如nabh4+2h2o＝nabo2+4h2)。在一個具體實施方案中，co2氣泡(化學或物理產生(見下文))用於親水性聚合物。

用於產生本發明的氣泡的物理方法的實例包括但不限於：1)在密封室中產生高壓(填充氣體)/熱量，並突然降低壓力；2)在高壓下將氣體溶解在液體/水中，並降低壓力以釋放氣泡；3)使用超臨界流體(減壓)如超臨界co2；4)使用氣體液體(然後降低壓力)(例如，液體co2、液體丙烷和異丁烷)；5)流體流；6)將聲能或超聲應用於液體/水；7)施加雷射(例如，到液體或水)；8)沸騰；9)降低壓力沸騰(例如，用乙醇)；和10)施加輻射(例如，在液體或水上的電離輻射)。納米纖維結構可以浸沒或浸入在產生氣泡的物理操作的液體中。

本發明的納米纖維可以包含任何聚合物。在具體實施方案中，聚合物是生物相容的和/或可生物降解的。聚合物可以是疏水的、親水的或兩親的。在一個具體實施方案中，聚合物是疏水性的。聚合物可以是例如均聚物、無規共聚物、共混聚合物、共聚物或嵌段共聚物。嵌段共聚物最簡單地定義為至少兩種不同聚合物片段的共軛物。聚合物可以是例如線性、星狀、接枝、支化、基於樹枝狀的或超支化的(例如至少兩個支化點)。本發明的聚合物可具有約2至約10,000、約2至約1000、約2至約500、約2至約250或約2至約100個重複單元或單體。本發明的聚合物可以包含封端末端。

疏水性聚合物的實例包括但不限於：聚乙烯醇(pva)、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(n-異丙基丙烯醯胺)、聚乳酸(pla(或pdla))、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plg)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)、聚乙交酯或聚乙醇酸(pga)、聚己內酯(pcl)、聚天冬氨酸、聚噁唑啉(例如丁基、丙基、戊基、壬基或苯基聚(2-噁唑啉))、聚氧丙烯、聚穀氨酸、聚富馬酸丙二酯(ppf)、聚碳酸三亞甲基酯、聚氰基丙烯酸酯、聚氨酯、聚原酸酯(poe)、聚酐、聚酯、聚環氧丙烷、聚己內酯富馬酸酯、聚1,2-環氧丁烷、聚正環氧丁烷、聚乙烯亞胺、聚四氫呋喃、乙基纖維素、聚二吡咯/二卡巴唑、澱粉，聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚二噁烷酮(pdo)、聚醚聚氨酯脲(peuu)、醋酸纖維素、聚丙烯(pp)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)、尼龍(例如尼龍6)、聚己內醯胺、pla/pcl、聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基戊酸酯)(phbv)、pcl/碳酸鈣和/或聚(苯乙烯)。

親水性聚合物的實例包括但不限於：聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇和聚環氧乙烷(peo)、殼聚糖、膠原、硫酸軟骨素、藻酸鈉、明膠、彈性蛋白、透明質酸、絲纖蛋白，藻酸鈉/peo、絲/peo、絲纖蛋白/殼聚糖、透明質酸/明膠、膠原/殼聚糖、硫酸軟骨素/膠原和殼聚糖/peo。兩親性共聚物可包含來自上文列出的那些(例如明膠/pva、pcl/膠原、殼聚糖/pva、明膠/彈性蛋白/plga、pdo/彈性蛋白、phbv/膠原、pla/透明質酸、plga/透明質酸、pcl/透明質酸、pcl/膠原/透明質酸、明膠/矽氧烷、plla/mwnt/透明質酸)的親水性聚合物(例如片段)和疏水性聚合物(例如片段)。

xie等人提供了特別用於靜電紡絲的聚合物的實例(macromol.rapidcommun.(2008)29：1775-1792；通過引用併入本文；參見例如表1)。用於本發明的纖維，特別是用於電紡納米纖維的化合物或聚合物的實例包括但不限於：天然聚合物(例如殼聚糖、明膠、i型、ii型和/或iii型膠原、彈性蛋白、透明質酸、纖維素、絲纖蛋白、磷脂(卵磷脂)、纖維蛋白原、血紅蛋白、纖維小牛胸腺na-dna、病毒m13病毒)、合成聚合物(例如plga、pla、pcl、phbv、pdo、pga、plcl、plla-dla、peuu、乙酸纖維素、peg-b-pla、evoh、pva、peo、pvp)、共混的(例如pla/pcl、明膠/pva、pcl/膠原、藻酸鈉/peo、殼聚糖/peo、殼聚糖/pva、明膠/彈性蛋白/plga、絲/peo、絲纖蛋白/殼聚糖、pdo/彈性蛋白、phbv/膠原、透明質酸/明膠、膠原/硫酸軟骨素、膠原/殼聚糖)和複合材料(例如pdla/ha、pcl/caco3、pcl/ha、plla/ha、明膠/ha、pcl/膠原/ha、膠原/ha、明膠/矽氧烷、plla/mwnts/ha、plga/ha)。

根據本發明，提供了三維納米纖維結構。在一個具體實施方案中，通過本發明的方法產生納米纖維結構。納米纖維結構可以包含在水或生物學和/或藥學上可接受的載體中。納米纖維結構可以是用於生物醫學研究的支架，例如再生醫學或組織模型。納米纖維結構的應用在xie等人中提供(macromol.rapidcommun.(2008)29:1775-1792；通過引用併入本文)。在具體實施方案中，納米纖維結構包含或包封至少一種試劑(例如治療劑、生長因子、信號分子、細胞因子、抗生素等)。在具體實施方案中，本發明的納米纖維(在合成方法或最終產物中)，使用表面軛合/包被和/或包封(例如，以調節細胞應答和/或促進組織再生)，用至少一種試劑或化合物(例如治療劑、治療劑、生長因子、信號分子、細胞因子、抗生素等)標記或修飾。

定義

單數形式「一個(a)」、「一種(an)」和「所述(the)」包括多數的引用，除非上下文中另外有明確說明。

如本文所使用的，術語「電紡絲」是指使用流體動力學和帶電錶面之間的相互作用從溶液或熔體製造纖維(即電紡絲纖維)，特別是微米或納米尺寸的纖維(例如，通過響應於電場使溶液或熔體流動通過孔)。電紡納米纖維的形式包括但不限於支化納米纖維、管、帶和分裂納米纖維、納米纖維紗、表面塗覆的納米纖維(例如，具有碳、金屬等)、在真空中產生的納米纖維等。電紡纖維的生產描述於例如gibson等人(1999)alchej.，45:190-195。

「藥學上可接受的」表示由聯邦或州政府的管理機構批准或在美國藥典或其它公認的藥典中列出的用於動物，更特別是用於人的。

「載體」是指與本發明的活性劑一起施用的例如稀釋劑、佐劑、防腐劑(例如，thimersol、苄醇)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、增溶劑(例如聚山梨酯80)、乳化劑、緩衝劑(例如，trishcl、乙酸鹽、磷酸鹽)、水、水溶液、油、填充物質(例如乳糖、甘露醇)、賦形劑、助劑或載具(vehicle)。合適的藥物載體描述在e.w.martin的「remington'spharmaceuticalsciences」(mackpublishingco.,easton,pa)；gennaro,a.r.,remington:thescienceandpracticeofpharmacy,(lippincott,williamsandwilkins)；liberman等人,eds.,pharmaceuticaldosageforms,marceldecker,newyork,n.y.；andkibbe等人,eds.,handbookofpharmaceuticalexcipients(3rded.),americanpharmaceuticalassociation,washington。

如本文所用，術語「聚合物」表示由兩個或更多個重複單元或單體化學連接形成的分子。術語「嵌段共聚物」最簡單地是指至少兩種不同聚合物片段的共軛物，其中每個聚合物片段包含兩個或更多個相同類型的相鄰單元。

「疏水性」表示優選非極性環境(例如，疏水性物質或結構部分與水相比更容易溶解在非極性溶劑例如烴中，或被其潤溼)。在具體實施方案中，疏水性聚合物可具有在37℃下小於約1重量％的水溶解度。在具體實施方案中，在雙蒸水中的1％溶液中具有低於約37℃，特別是低於約34℃的濁點的聚合物可以被認為是疏水的。

如本文所用，術語「親水性」是指溶於水的能力。在具體實施方案中，在雙蒸水中的1％溶液中具有高於約37℃，特別是高於約40℃的濁點的聚合物可以被認為是親水性的。

如本文所用，術語「兩親性」是指既溶於水又溶於脂質/非極性環境中的能力。通常，兩親化合物包含親水部分和疏水部分。

提供以下實施例以說明本發明的某些實施方案。它們不打算以任何方式限制本發明。

實施例1

材料和方法

電紡納米纖維支架的製造

納米纖維是使用標準靜電紡絲裝置根據已建立的方案生產的(xie等人(2009)biomaterials30:354-362；xie等人(2013)actabiomater.,9:5698-5707；jiang等人(2015)pharm.res.,32:2851-2862)。將pcl(mw＝80kda)以10％(w/v)的濃度溶解在由具有4:1(v/v)比例的二氯甲烷(dcm)和n,n-二甲基甲醯胺(dmf)組成的溶劑混合物中。使用注射泵以0.8ml/小時的流速泵送pcl溶液，同時在噴絲頭(22號針)和距離噴絲頭20cm的接地收集器之間施加15kv的電勢。在分別以2000和100rpm的速度旋轉的滾筒上收集1mm厚的排列的和無規的納米纖維墊。在液氮中切割納米纖維墊以避免邊緣上的變形。通過沉積1mm厚的排列的納米纖維層，隨後沉積50μm厚的無規納米纖維層來製造管狀納米纖維支架。為了製造由外層中的無規納米纖維和縱向排列的納米纖維製成的管狀支架，將所獲得的纖維墊在兩個不同方向(平行和垂直)上手動翻轉，並用30％pcldcm溶液密封邊緣以形成雙層管狀納米纖維支架，其由外層中的無規納米纖維和內層中的縱向或周向排列的納米纖維組成。為了在溶液中產生氣泡，選擇以下化學反應用於「概念驗證」：

nabh4+2h2o→nabo2+4h2↑

由於其相對高的氫含量(10.9％)和可控的水解反應，nabh4已經被廣泛研究用於h2儲存和生成(ye等人(2007)j.powersources164:544-548；liu等人(2009)j.powersources187:527-534)。pcl納米纖維墊(1cm×1cm×1mm)用於研究膨脹過程的影響。將pcl納米纖維墊浸入40ml新鮮製備的nabh4溶液中並在21℃下以50rpm搖動不同的時間長度(0分鐘、20分鐘、1小時、2小時、4小時和24小時)。在0.01m、0.1m和1m下製備nabh4溶液。使用遊標卡尺在0分鐘、20分鐘、1小時、2小時、4小時和24小時測量樣品厚度，同時通過數位相機記錄樣品形態。膨脹後，棄去nabh4溶液，將膨脹的pcl納米纖維支架輕輕轉移到燒杯中，用去離子水漂洗三次。為了除去捕獲的氣泡，將膨脹的支架浸入水中並暴露於真空(～200pa)3秒。最後，用去離子水將膨脹的納米纖維支架再漂洗三次。

納米纖維支架的表徵

管狀納米纖維支架由外層中的無規纖維和內層中的排列纖維製成，如上所述。管狀支架在1mnabh4溶液中膨脹，類似於平面納米纖維墊。使用遊標卡尺測量管狀支架的內徑和外徑，並在0分鐘、20分鐘、1小時、2小時、4小時和24小時獲取數字照片。sem用於檢查在膨脹程序之前和之後管狀支架的橫截面上的纖維結構。在至少三個獨立實驗中報導了納米纖維墊的平均厚度和管狀支架的直徑。根據納米纖維支架在膨脹前和膨脹後的體積變化計算納米纖維支架的孔隙率。使用以下等式計算孔隙率

ε＝[(v-v0)/v]100％

其中ε是孔隙率，v＝l(長度)×w(寬度)×t(厚度)是pcl納米纖維支架的體積，v0＝((m0)/(ρ0))是堆積pcl材料的計算體積，m0是堆積pcl材料的質量，ρ0是堆積pcl材料的密度。

將pcl納米纖維墊嵌入去離子水中並在-20℃下在膨脹前和膨脹後冷凍。使用低溫恆溫器獲得冷凍納米纖維支架的橫截面並冷凍乾燥。sem(fei，quanta200，oregon)用於表徵支架橫截面內的納米纖維形態和結構。為了避免充電，將納米纖維樣品固定在具有雙面導電帶的金屬柱上並在10ma的電流強度下在真空下用鉑濺射塗覆4分鐘。在30kv的加速電壓下獲取sem圖像。基於sem圖像通過imagej軟體測量在納米纖維支架中在使用1mnabh4膨脹20分鐘和24小時之前和之後觀察到的間隙距離和層厚度。已經分析了至少250個間隙或層。

測量納米纖維支架膨脹前(1cm×1cm×1mm)和膨脹後(1cm×1cm×1cm)的機械性能。將納米纖維樣品安裝在兩個鋼把手和兩個1.5cm直徑的玻璃蓋玻片之間，以分別測量拉伸和壓縮模量。平衡後，拉伸和壓縮試驗的觸發器和速率設置為750μn和5.0×10-3s-1。通過加載單元和數字數據採集系統記錄所得力(f)和長度變化(δl)。通過將所得力(f)和長度變化(δl)除以橫截面積(a)和初始長度(l0)來計算工程應力(σ＝f/a)和工程應變(ε＝δl/l0)。楊氏模量由e＝σ/ε給出。當最大力達到500mn或樣品斷裂時，測試停止。平行於纖維排列軸(y軸)和與纖維排列軸正交的方向(z軸)完成膨脹後的排列pcl納米纖維支架的測試，包括最大應力、極限拉伸應力和極限拉伸應變。在與纖維排列軸正交的方向(z軸)完成膨脹後的無規pcl納米纖維支架的測試，包括最大應力、極限拉伸應力和極限拉伸應變。每種材料/條件對至少五個獨立樣品進行機械測試。

體外細胞培養

將膨脹的pcl納米纖維支架(1cm×5mm×1cm)和未膨脹的納米纖維墊(1cm×5mm×1mm)在70％乙醇中滅菌過夜，並用pbs衝洗3次。在細胞培養之前，將樣品浸入培養基中24小時。然後將未膨脹和膨脹的納米纖維支架置於24孔板中。將1×106個nih3t3細胞接種在每個納米纖維樣品上並孵育3小時。然後翻轉樣品，將等量的細胞接種在另一側，並孵育3小時。然後將樣品從24孔板轉移到含有25ml完全dmem培養基的錐形試管中。

組織學染色

在細胞接種後1天或7天收穫培養物。將pcl納米纖維墊和膨脹的支架都用pbs漂洗三次，並在室溫下在4％多聚甲醛中固定30分鐘。將所有樣品包埋在冷凍培養基中。使用低溫恆溫器切割，並且在整個冷凍塊中每隔1mm收集20μm厚的切片。將切片在50℃下烘烤過夜。根據製造商的說明應用蘇木精和曙紅(h&e)染色，以將細胞與納米纖維支架區分，其中細胞核染成藍色，細胞質和ecm染成粉紅色(fischer等人(2008)coldspringharbprotoc.，pdb.prot4986)。簡言之，在將蘇木精mayer's溶液施用5分鐘之前，使切片在蒸餾水中水合。將載玻片用蒸餾水徹底衝洗。應用足夠的藍色試劑以完全覆蓋切片並孵育10-15秒。載玻片用蒸餾水漂洗2次，然後浸在無水乙醇中。然後施加足夠的曙紅y溶液並孵育2-3分鐘。然後使用無水乙醇漂洗載玻片，並用無水乙醇脫水。然後將載玻片安裝在合成樹脂中。從三個獨立實驗獲得體外實驗數據。圖像由ventana的coreoau載玻片掃描儀捕獲。對每個納米纖維材料和加工條件評價三個切片。

結果

電紡納米纖維墊在用nabh4水溶液處理後成功地在第三維上膨脹(圖1a)。處理的納米纖維墊的末端厚度隨著在溶液中的時間增加和隨著nabh4濃度的增加而增加(圖1b)。令人驚訝的是，在用1mnabh4水溶液處理僅僅24小時後，納米纖維墊的厚度從1mm增加到35.6mm。類似地，排列的pcl納米纖維支架的孔隙率隨著反應時間的增加和nabh4的濃度增加而增加，這與厚度的趨勢一致(圖1c)。起始納米纖維墊的基線孔隙率為83.6％，用1mnabh4水溶液處理24小時後，支架孔隙率增加至99.2％。

為了在膨脹後保持納米纖維支架的完整性，使用冷凍乾燥器將支架冷凍乾燥。然後沿著兩個不同的平面(x-y，y-z)切割納米纖維支架，並通過掃描電子顯微鏡(sem)檢查以顯示支架的詳細纖維結構。在膨脹之前，排列的電紡pcl納米纖維墊由緻密填充的原纖維結構構成(圖2a)。相比之下，膨脹了20分鐘和24小時的納米纖維支架顯示層狀結構，具有由排列的納米纖維賦予的保留的納米形貌線索(圖2a)。注意間隙距離隨著反應時間增加而增加(圖2b)。相比之下，隨著反應時間的增加，層厚度從約15μm減小到5μm(圖2c)。也比較了膨脹前後排列的納米纖維支架的機械性能。由於膨脹納米纖維材料的層狀結構和高孔隙率，沿著平行於和垂直於纖維排列方向的拉伸模量與膨脹前的納米纖維墊相比較低(表1)。與在膨脹之前的納米纖維墊相比，沿著x、y和z方向測量的排列的納米纖維支架的壓縮楊氏模量在膨脹後較低(表1)。無規取向的pcl納米纖維墊顯示類似於用nabh4水溶液處理後的排列的納米纖維墊的結果，除了與排列墊相比，無規墊的膨脹程度略小外(圖3)。在膨脹後無規取向的納米纖維支架中的拉伸模量和楊氏模量類似地降低(表2)。在表1和2中缺少在x和y方向上的極限拉伸應力、極限拉伸應變、最大應力、斷裂應力和斷裂應變的值，因為所有樣品在最大拉伸力(500mn)下沿x和y方向沒有斷裂。該膨脹導致納米纖維支架沿z方向的層狀結構。由於層狀結構，在沿著z方向的拉伸強度測試期間，膨脹後的支架可以容易地在層之間分裂。因此，膨脹後的支架沿z方向的拉伸性能未示於表1和表2。

表1:排列pcl納米纖維支架膨脹前和膨脹後的機械性能。對納米纖維支架給出的範圍包括所有實驗組。

表2:無規pcl納米纖維支架膨脹前和膨脹後的機械性能。對無規pcl納米纖維支架給出的範圍包括所有實驗組。

將本發明的膨脹方法應用於非平面納米纖維支架，以形成對於再生組織化組織如神經、血管和腱而言理想的管狀支架(panseri等人(2008)bmcbiotechnol.,8:39；hashi等人(2007)proc.natl.acad.sci.,104:11915-11920；hogan等人(2011)j.am.acad.orthop.surg.,19:134-142)。已經顯示了由無規取向的電紡納米纖維的外層和縱向排列的電紡納米纖維的內層組成的雙層納米纖維導管的成功製造(xie等人(2014)acsappl.mater.interfaces6:9472-9480；xie等人(2010)nanoscale2:35-44)。儘管具有獨特的多腔設計，但是製造的導管在導管的內腔內不包含支架材料。另外的研究嘗試在納米纖維導管的內腔內遞送縱向排列的納米纖維薄膜，以增強神經再生(clements等人(2009)biomaterials30:3834-3846；mukhatyar等人(2014)ann.biomed.eng.42:1436-1455)。無規和排列的納米纖維的順序沉積，隨後手工纏繞在管狀心軸周圍，產生由無規取向的納米纖維的外層和縱向排列的納米纖維的內層組成的雙層納米纖維導管(圖4a)。觀察到用1mnabh4的水溶液處理雙層納米纖維導管以使納米纖維材料膨脹並填充管的整個內腔(圖4a)。對於由無規取向的納米纖維的外層和周向排列的納米纖維的內層組成的雙層納米纖維導管觀察到類似的結果(圖4b)。納米纖維管的內徑和外徑也在水性介質中膨脹期間。在用1mnabh4的水溶液處理24小時後，由無規取向的納米纖維的外層和縱向排列的納米纖維的內層組成的雙層導管的內徑接近零，其中膨脹纖維佔據了管的整個內腔(圖4c)。相比之下，由無規取向的納米纖維的外層和周向排列的納米纖維的內層組成的雙層納米纖維管的內徑在用1mnabh4溶液處理僅4小時後接近零(圖4d)。類似於平面納米纖維材料，膨脹的管狀支架形成層狀納米纖維結構，其在同軸的圓周層中取向，延伸了構建體的長度(圖5)。重要的是，管狀納米纖維支架維持納米纖維的內層中的各向異性性質(圖5)。在各種再生醫學應用中，維持膨脹後的纖維排列是重要的，其中形貌線索是組織細胞群體和組織再生的關鍵。具體地，由排列纖維組成的膨脹構建體理想地適於提供在神經修復/再生期間增強和指導細胞遷移和軸突生長所必需的接觸導向線索(bellamkonda，rv(2006)biomaterials27:3515-3518；patel等人2007)nanolett.，7:2122-2128)。

為了產生3d組織構建體，支架本身起重要作用，因為它不僅提供了仿生結構，而且提供了與某些線索一起支持細胞粘附和生長的底物，以調節細胞行為(murphy等(2014)nat.mater.13:547-557)。在本研究中，nih3t3成纖維細胞接種到由在膨脹前(1mm厚)和膨脹後(1cm厚)的排列納米纖維組成的平面電紡支架上，並孵育1天和7天。選擇成纖維細胞作為細胞培養的模型細胞，以便在接種和增殖後顯示細胞浸潤和分布。此外，成纖維細胞與腱和韌帶組織再生有關。細胞接種的支架的蘇木精-曙紅(h&e)染色表明細胞成功浸潤和增殖遍及整個的膨脹納米纖維支架(圖6)。相比之下，細胞沒有穿透未膨脹的納米纖維支架並且僅在材料的表面上增殖(圖7)。甚至在培養7天後，在未膨脹的納米纖維支架的表面上僅觀察到幾個細胞層，並且在支架的主體內沒有觀察到細胞浸潤(圖7)。重要的是，細胞形態在膨脹和未膨脹支架之間是一致的，因為細胞沿纖維排列的方向顯示長形的形狀。這種觀察表明膨脹的支架保持由排列的納米纖維賦予的形貌線索。

本文中已經顯示，從nabh4水解反應產生的氫氣氣泡在第三維中膨脹排列的電紡納米纖維墊，導致形成分層結構並同時維持所賦予的各向異性線索。在存在和不存在電紡納米纖維支架的情況下觀察到在1mnabh4溶液中的氣泡形成(圖8)。基於這些觀察並且不受理論束縛，膨脹過程據稱通過以下步驟發生：(i)由毛細作用驅動的nabh4水溶液快速滲透到排列的納米纖維支架中；(ii)在納米纖維的表面上或在不完全排列的納米纖維的交叉處氣泡的異相成核；(iii)在持續產生氫氣的情況下成核氣泡的生長；(iv)相鄰氣泡的聚結；和(v)在氣泡的進一步生長和聚結後，形成「氣泡層」。

在膨脹期間，觀察到氣泡從納米纖維基質的表面逸出到溶液中和大氣中。預期無規納米纖維支架的膨脹遵循類似的過程，除了由於增加的納米纖維纏結，水溶液更慢地滲透到無規取向的納米纖維支架中可能導致更慢的膨脹率(圖3)。類似地，因為纏結的納米纖維之間的強相互作用，無規取向的納米纖維支架的最大膨脹與排列的支架的最大膨脹相比可能減小。

雖然幾項研究已經調查了製造3d電紡納米纖維支架的手段，但很少有研究集中於由單軸排列的納米纖維製成的各向異性支架的製造(blakeney等人(2011)biomaterials32:1583-1590；lee等人(2011)tissueeng.,parta,17:2695-2702；cai等人(2013)langmuir29:2311-2318；sheikh等人(2014)nanomedicine11:681-691；jeong等人(2014)j.mater.chem.b2:8116-8122)。本發明的方法允許使用由nabh4水解產生的氣泡在第三維中在單軸排列和無規取向的納米纖維支架中進行膨脹。雖然本研究使用水溶液來在納米纖維墊內主要地引發氣泡產生，但是可以成功地應用多種氣體生產方法以實現相同的效果(例如，溶解的氣體、高壓氣體液體/流體和聲感應)(leongdengren等人(2011)acoust.ads.，39：54-63)。pcl納米纖維墊的膨脹也在將其浸入1mnahco3和1mhcl溶液中交替地進行數輪後實現(圖10)。此外，納米纖維膜也使用由液體co2產生的氣泡進行膨脹(圖11)。

以前的研究表明單軸排列的納米纖維可以提供指引和增強細胞遷移、細胞排列、肌管形成、軸突生長和傷口癒合的接觸導向(murphy等人(2014)nat.mater.,13:547-557；choi等人(2008)biomaterials29:2899-2906；huang等人(2006)nanolett.,6:537-542；xie等人(2009)acsnano3:1151-1159)。此外，排列的納米纖維已經被證明提供了用於調節幹細胞分化的指導性微環境(yin等人(2010)biomaterials31:2163-2175；xie等人(2009)biomaterials30:354-362；ren等人(2013)actabiomater.,9:7727-7736)。雖然成功了，這些研究限於使用2d納米纖維墊。

本文中，成功地形成了大規模的3d納米纖維支架，同時保持由對於有組織的組織如神經、肌肉和腱的再生關鍵的單軸排列的納米纖維賦予的納米形貌線索。利用這種方法，可以順序地沉積和膨脹不同順序/排列的納米纖維材料，以便重現複雜的組織結構和解剖結構，例如胃腸道結構或纖維環(bitar等人(2014)gastroenterology146：1614-1624；nerurkar等人(2009)nat.mater.，8:986-992)。此外，本發明的方法允許通過用各種水凝膠或生物基質填充纖維層之間的空間來形成3d、複合的或混合的支架。納米纖維也可以使用表面軛合/包被或包封用另外的信號分子標記或修飾，以進一步調節細胞響應並促進組織再生(wegst等(2015)nat.mater.，14:23-36)。這些新穎的特徵清楚地區分了本發明的膨脹納米纖維膜的方法和來自先前報導的所得3d電紡納米纖維支架。

總之，已經提供了用於在第三維中膨脹電紡納米纖維墊/膜，同時保留賦予的各向異性特徵和線索的可控方法。使用這種方法形成的3d支架支持在整個材料本體中強健的細胞浸潤和增殖。本技術可用於合成用於再生醫學和用於藥物篩選和生物學研究的工程化3d組織模型中的支架和構建體。這種新穎的處理技術還可以應用於用於各種醫療應用的先進納米纖維支架的製造。

雖然上面已經描述和具體例示了本發明的某些優選實施方案，但是並不意味著本發明限於這樣的實施方案。在不脫離如所附權利要求中闡述的本發明的範圍和精神的情況下，可以對其進行各種修改。