偶合到用於成像表達肽酶的組織和器官的肽酶結合部分的放射影像部分的製作方法

2023-06-05 20:19:31 3

專利名稱：偶合到用於成像表達肽酶的組織和器官的肽酶結合部分的放射影像部分的製作方法
偶合到用於成像表達肽酶的組織和器官的肽酶結合部分的放射影像
部分
相關申請的交叉應用
本申請要求2006年8月29日提交的美國臨時申請60/823， 884的優先權，該臨時申請公開的全部內容通過引用全部結合到申請中。
感謝
本項工作得到了全國健康協會(NIH)的撥款支持，即健康和人類服務部門，l-R43-HL075918-01。聯邦政府對本發明有一定的權利。
引言
許多組織(包括血液)和器官表達不同水平的肽酶(也稱為蛋白酶、朊酶和蛋白水解酶)。表達水平根據和組織或器官相關的病理學條件(或缺失病理學條件)也可能不同。例如，已經知道，在心力衰竭受害者的心肌中發現了高水平的血管緊張肽轉化酶(ACE)。
，ft^5資料庫G"tp:/'膨roi,s. s(mw「. m'"ik')是肽,及抑制
肽酶的蛋白質的信息源。i/fiw/^sm據庫也含有所選擇肽酶的小分子
抑制劑的清單。參考Rawlings， N. D. , Morton, F. R. & BarrcU，A. J. (2006)認the peptidase database,船c2eid/c^/ ca、34， D270-D272。該資料庫的內容，特別是7. 5版，通過應用結合到本發明的說明書中。
作為肽酶的抑制劑，這些分子(無論是大分了如蛋白質，或小分子，包括肽酶和現有的藥物或或候選藥物)也結合到肽船上，它們抑制一定的親和力。
ACE:示例的肽酶
儘管降低死亡率的趨勢歸因於缺血性心臟病和中風，但是，在美國，充血性心力衰竭的流行和由此導致的死亡率在過去三十年幾
乎超過了三倍。參考S.Y. Chai， F. A. 0. Mendelsohn, G. Paxinos，7fe〃roscie/7ce， 20: 615-627 (1987)。據估計，在接下來的二十年，由於冠心病導致的心力衰竭將超過所有的傳染病，從而變成世界上造成死亡的主要原因。參考M.R. Cowie， D. A. Wood, A. J. S Coats,S. G. Thompson, P. A. Poole-Wilson， V. Suresh， G. C. Sutton, f〃r.hearty: ， 20: 421-428 (1999)。
因此，需要更新和更好的方法來診斷、治療和監測某些疾病的進展，如心力衰竭。
賴諾普利， 一個示例的肽酶結合部分
賴諾普利， 一種臨床應用的ACE抑制劑，用於治療充血性心力衰竭和高血壓，己經顯示能夠直接對ACE抑制。根據充血性心力衰竭患者的心臟切片的初步放射自顯影的結果，參考V. Dilsizian， J.Shirani， Y. H—C. Lee， D. Kiesewetter， E. M. Jagoda， M丄Loredo，W. C. Eckelman，104:17, 3276 (2001)，發明人確信ACE可能是有吸引力的、用於心力衰竭的診斷、確定和治療的分子靶。類似的，發明人相信，在某些組織和器官中，其它肽酶的過表達可以開發用於診斷、治療和監測多種病理症狀的進展。這些病理症狀包括但不限於心力衰竭、心肌症、肺病、腎功能不全、腎衰竭、炎症、動脈硬化、易損動脈斑塊或腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌，等等。其它的病理症狀包括心臟血管疾病，通常包括糖尿病腎病、過量組織ACE活性、非胰島素依賴糖尿病或高血壓導致的慢性腎病、高血壓外圍血管疾病、肺氣腫(或慢性阻塞型肺氣腫-C0PD)，等等。

發明內容
本發明涉及一系列的偶聯物，該偶聯物將肽酶結合部分(如抑制肽酶的物質)和放射性藥物部分(包括放射性治療和聲像部分)或光學影像部分合併。肽酶包括但不限於外肽酶(如羧肽酶和氨妝酶)和內肽酶(如絲氨酸肽酶、半胱氨酸肽酶、天冬氨酸肽酶和金屬內切肽酶)。"部分"是能夠獨立於另一部分存在的分子。因此，單獨的取代基(如官能團)，如羥基、滷素，等等，在本發明中不是"部分"。
在本發明的具體實施方案中，公開了一系列的偶聯物，該偶聯
物基於金屬螯合物和賴諾普利(二肽羧肽酶的抑制劑，a.k.a.血管
緊張肽轉化酶)的偶聯。因此，對一系列基於賴諾普利的配位體(下
面將進一步敘述)進行了合成和評價，能夠結合金屬物質(如M(CO):,)。合適配位體的實例包括但不限於二-(2-吡啶甲撐基)胺、二-(2-喹啉甲撐基)胺、二-(2-異喹啉)胺及類似物，這些配位體通過脂肪系鏈配位到賴諾普利或其它肽酶結合部分。體外試驗分析證實，增加脂肪系鏈中的甲撐基的數目，導致抑制劑效能的增加。在存在或不存在賴諾普利的情況下，用正常的鼠研究了針對ACE的體內試驗。這些體內試驗研究證實組織內放射指示劑和高含量的ACE—起定位，所述定位用賴諾普利預處理阻斷。
在本發明的另一實施方案中，公開了系列新型的"'"Tc-標記的ACE抑制劑的製備。這些偶聯物具有監測體內ACE表達的能力，可以用於心血管疾病的分級，特別是充血性心力衰竭的分級。令人驚訝的，該系列中最有效的化合物，99l'Tc-D(C8)L，是能忍受最長鏈的化合物。該偶聯物在ACE過表達的動物模型中評價，目的是評價其針對和分級心力衰竭(如通過定量ACE在心肌中的表達)的能力。相應的，表達ACE的組織或器官的成像方法是本發明的一個應用。在ACE表達的一個具體實例中，公開了一種成像肺組織、腎組織、心肌組織、腫瘤組織或這些組織的結合的方法。
本發明也涉及偶聯到肽酶結合部分的光學成像部分(如螢光、化學發光或磷光)，例如，非放射性(及"冷卻的")錸螯合物以二-(2-喹啉甲撐基)胺或二- (2-異喹啉)胺作為螯合配位體，連接到肽酶結合部分。光學成像的應用實例在Wei L， BabichJW， OuellcttcW, ZubietaJ. ，Developing the {M (CO) 3} + core for fluorescenceapplications: Rhenium tricaxbonyl core complexes withbenzimidazole， quinoline, and tryptophan derivatives. InorgChem. 2006 Apr 3 ;45 (7) :3057-66和James S, Maresca KP， BabichJW， Valliant JF， Doering L， Zubieta J. ， Isostructural Re and99mTc complexes of biotin derivatives for fluorescence andradioimaging studies. Bioconjug Chem. 2006
May-Jun;17(3) :590-6中進行了公開。本發明也包括將放射性治療部分作為肽酶結合部分的偶聯劑。術語"放射性治療部分"意指包括放射影像部分、放射治療部分或二者。放射治療部分的實例可能是錸-186或錸-188三(羰基)二_ (2-吡啶甲撐基)胺螯合物。


圖l顯示了偶聯到賴諾普利(L)的二-(2-吡疲甲撐基)胺(D)螯合物製備的合成路線。
圖2顯示的是賴諾普利和D(CJL化合物在體內生化試驗中的劑
量曲線。
圖3顯示的是"'"Tc-D(C5)L在正常和賴諾普利預處理(1 mg/kg,i.v. ) 15分鐘的Sprague Dawley鼠中的組織分布。
圖4顯示的是Sprague Dawley鼠中，'Tc-D (C「、) L的放射成像(左側沒有用賴諾普利預處理；右側用賴諾普利預處理)。
圖5顯示的是配位體和相應的配位體金屬絡合物。配位體和配位體金屬絡合物可以和肽序列的C-端或N-端連接。
圖6顯示的是連接到氨基官能度的配位體和相應的配位體金屬絡合物。
圖7顯示的是連接到羧基官能度的配位體和相應的配位體金屬絡合物。
圖8顯示的是本發明化合物包括螯合步驟的合成路線圖。圖9為對照(A)和，Tc(C0)處)L (MIP-1037)注射10分鐘後賴諾普利預處理的(B)的體內分布所示的整體平面圖的正視圖。圖10顯示的是小動物SPECT/CT圖，該圖顯示的是對照鼠(A)注射""'Tc(C0)3D(")L (MIP-1037)後肺的活性，其中在賴諾普利預處理的(B)中沒有出現。
圖ll顯示的是條形圖中表II的結果。
具體實施例方式
在本發明的優選實施例中，製備了成像ACE表達的探針。賴諾普利("L")， ACE的抑制劑，用作起始藥理學基序。二- (2-吡啶甲基)胺("D")，能夠結合1(0))3+ [M 二 Tc或Re]的配位體，通過在賴諾普利賴氨酸殘基的e -胺處形成的醯胺鍵和賴諾普利結合。配位體包含有脂肪鏈，該脂肪鏈含有不同數目的次甲基間隔斷基團(3、 4、 5和7;分別指定的D(C4)L、 D(Cs)L、 D(CJL和D(C8)L)。參考圖1。
ACE抑制對照使用比色測定的鼠肺ACE在體外評價。用正常的雄性Sprague Dawley鼠在注射後15、 60和120分鐘、通過研究存在& = 6/時點)或不存在(n二4/時點)賴諾普利(l mg/kg i.v.)的組織分布和間隔對ACE的體內特異性進行"7c-D (C。 L測定。
實施例
說明書中引用的文獻的全部內容通過引用結合到本申請中。偶聯物的製備
從LKT實驗室(Saint Paul, MN)屮獲得賴諾普利。根據文獻中公開的方法，進行細微的變化，合成所有的配位體。參考M.K.Levadala, S. R. Banerjee, K. P. Maresca, J. W. Babich, J. Zubicta5>/7^ ew's 11: 1759-1766 (2004); L. Wei, J. Babich, W. C.Eckelman， J. Zubieta, /細？. C/ e瓜，44: 2198-2209 (2005)。用HT實驗室(San Diego， CA)的電噴霧質譜和DesertAnalytics (Tucson, AZ)進行元素分析。
D(C4)L (1):產量二40% (0.68 g) 。 NMR (CDCl.,， ppm) : 8.50(m， 2H), 7.62 (tn 2H) ， 7.43 (m， 2H) ， 7.13 (m， 8H) ， 3.85 (m， 411)，3.69-2.60 (mm, IIH)， 2.26-1.41 (mm, 16H) 。 MS (ESI):歷A 674 (M+ 1)， / A 672 (M— -1)。分析計算的C:,7仏美0,，. 1.5H20: C， 63.50; H，7.35; N， 12.01; 0, 17.15。實測:C' 63.44; H， 7.11; N， 12.24，0, 17, 17. (MIP-1039)
D(C5)L (2):產量二34% (0.61 g). 力NMR (CDC13，卯m) : 8.51(m， 2H)， 7.65 (m2H), 7.51 (m， 2H)， 7.13 (m， 8H)， 3.92 (d， 4H),3.69-2.65 (咖，IIH)， 2.27-1.46 (mm, 18H). MS (ESI): 688(M++1),歷/z686 (M—-1). 分析計算C38H5N6Ofi' H20: C, 64.75; H，7.44; N， 11.92; 0， 15.89。實觀!j: C， 64.77; H， 7,35; N， 11.92;0， 16.07. (MIP-1003)。
D(C6)L (3):產量二13% (0. 23 g). 'H NMR (CDCL， ppm) : 8. 50(m, 2H), 7.64 (m 2H) ， 7.49 (m， 2H) ， 7.15 (m， 8H) ， 3.86 (d， 4H)，
3.68- 2.60 (mm， IIH)， 2.26-1.41 (mm, 20H). MS (ESI):歷/z 702(M++l)，歷/z 700 (M一-l).分析計算C39H52N6(V 2. 5 H20: C, 62.80;H， 7. 7。；N， 11.27;0， 18.23。實測:C， 62.82;H， 7. 47;N， 11.40;0, 17.91。
D(C8)L (4):產量=35°/。 (0.57 g). 'H NMR (CDC1:!， ppm): 8.50(d， 2H), 7.63 (m2H)， 7.50 (m， 2H) ， 7.13 (m， 8H) ， 3.85 (d， 4H)，
3.69- 2.53 (mm, IIH)， 2.23-1.22 (mm, 24H). MS (ESI):歷/z 730(M+ +1)，歷/z 728 (M— -1). 分析計算UH掘,,H": C， 65.93H， 7.83; N, 11.25; 0， 14.99。實領"C， 65.64; H， 8.21; N， 11.20;0, 14.48. (MIP-1037)。
體外分析
根據生產者的說明(Fujirebio)，用商業上獲得的體外生物i式
驗對每個化合物的濃度範圍抑制/7"羥基苯甲醯-甘氨酸L-組気醯基
-L-亮氨酸的ACE分裂的能力進行了檢測。選擇用於分析的ACE酶源為提純的鼠肺ACE (Sigma)， 3.3mU/樣品。賴諾普利在每個試驗中作為陽性對照。圖2顯示的是這種分析產生的數據實例。用鼠肺ACE、賴諾普利、D(CjL、 D(C。L、 D(Ce)L和D(C》L分別得到2. 5 nM、 83. 3 nM和42. 8 nM、 42. 5 nM禾口 19. 5 nM的IC4直。IC"直證實，儘管D(C。L (組織19.5 nM)不是和賴諾普利(組織2.5 nM)—樣有功效，但是和D(C4)L (組織83.3 nM)相比，則更有功效。總之，體外分析證實隨著聯吡啶和核賴諾普利部分之間次甲基數目的增加，活性也在增加。
類似的，可以評價基於偶聯到給定肽酶小分子抑制劑的螯合部分的偶聯能力。表1列出了實例的肽酶數目及其基質。表2列出了所選擇的肽酶的小分子抑制劑的示例數目。參考Moskowitz， D. W.Z^"es :Tec力/ o^j《77 era，^z'cs (2002) 4 (4) : 519-532 ，其中進一步討論了特定疾病狀態及和ACE相關的小分子抑制劑。
體內分析
正常雄性Sprague Dawley鼠分組進行了^Tc-D(C5)L組織分布和間隔的定量分析。在接受測試化合物之前，動物接受1 mg/kg的賴諾普利5分鐘，從而阻斷靶器官的具體吸收，由此證實假設的體內作用機理。在所有測試的組織中檢測""Tc-D(Cs)L，其在整個試驗過程中穩步減少。在肺中觀察到吸收在注射15分鐘後接近0. 75±0. 14Q/oID/g (圖3)。 ""'Tc-D(Cs)L通過腎、肝和腸中化合物的水平證實了腎和肝膽二者的間隔。在注射放射標記的化合物之前，用lmg/kg的賴諾普利預處理5分鐘，降低了肺中化合物吸收和保留(O. 11±0.02%ID/g)，這表示"'"Tc-D (CJ L特別結合體內ACE。
對於成像研究，將動物放置在Y照相機上，得到由5個L分鐘連續圖像組成的基線平面正視圖。當在腸胃道和肝臟屮檢測到一個化合物的強信號，9%'Tc-D(CJL顯示了肺吸收，該吸收被賴諾普利(圖4)預處理阻斷，證實了組織分布研究中的檢測結果。
ACE比色測定試驗報告
根據生產者的說明書，血管緊張素轉換酶(ACE)的活性用ACE彩色套件(Fujirebio)進行測定。ACE作用於；^羥基苯甲醯-廿氨酸L-組氨醯基-L-亮氨酸，產生F羥基苯甲醯-甘氨酸，其通過馬尿酸響:轉化成r羥基苯甲酸。^羥基苯甲酸和氨基安替比林通過偏高碘酸鈉氧化和濃縮生成醌亞胺染料。醌亞胺染料的濃縮通過其在505 nm處的最大吸收進行定量測定。在ACE比色測定中，該試驗用於比較
錸標記的ACE抑制劑的組織和血漿特異性。
嚴虛淳遊吝y備，不用抗凝劑，用注射器和16-規針心臟穿刺從正常鼠
取血，並將其輸送到15 ml的圓錐管中。該管用冰冷卻30分鐘，使血凝結。除去凝結的血，剩下的血清在室溫、5,000 X g分離10分鐘。回收上清液，用0.22微米的過濾器過濾。
^^y虔/備，從Fujirebio購得ACE彩色套件，根據生產者的說明進行試驗用5.6 ml的緩衝液重建基質，用5.6 ml的緩衝液重建對照，用15.5 ml的滴液(stopper solution)重建顯色劑。鼠肺ACE (Sigma A6778)重構成1單位/3 ml水的濃度。
^f^^^法根據下表，將它們分別不同的量加入到樣品或對照試管中，以測定血清和組織ACE的最佳濃度。
0 2. 5 5 10 15 20 uL血淸
5 10 25 50 uL組織ACL:
然後加入基質或對照溶液(125 u L)，在37 °C培養20分鐘。加入顯色劑溶液，在37 °C培養3分鐘。通過在分光光度計上測定505 nM吸光度來測定測試化合物的活性。血清ACE (25 i^L)和組織ACE (3.3 m單位)的最佳量用於測定錸標記的ACE抑制劑的特異性。製備測試化合物，包括賴諾普利和卡託普利(50 uM備料)，並逐次稀釋10倍，最終的濃度範圍為1 uM-0. lnM (10 ixL/試管)。如上所述進行試驗。
表l:選擇的肽酶和肽酶的基質羧肽酶Al基質Bz-Gly-PheDns-Gly-Gly-PheDns-Gly-Gly-TrpDns-Gly-PheDns-Gly-TrpZ-Gly-Gly-LeuZ-Gly-Gly-PheZ-Gly-Gly-Val
羧肽酶A2基質
Z-Gly-Gly-LeuZ-Gly-Gly-PheZ-Gly-Gly-TrpZ-Gly-Trp
羧肽酶B基質
Bz-Gly-Arg Bz-Gly-基s呋喃丙烯醯基-Ala-Arg
肥大細胞羧肽酶A
羧肽酶D基質
丹醯-Phe-Ala-Arg
羧肽酶E
羧肽酶G，羧肽酶Gl，羧肽酶G2基質
葉酸
羧肽酶M
羧肽酶N
羧肽酶Y
基質
Z-Gly-Leu
羧肽酶Z
羧肽酶T
Serine羧肽酶A基質
Bz-Tyr-0Et
丹醯-D-Tyr-Val-NH2
呋喃丙烯醯基-Phe-Phe
Z-Glu-Tyr
Z-Phe-Ala
Z-Phe—Leu
Z-Phe-Phe
表2:所選擇肽酶的小分子抑制劑
141W944-羥基-5， 6-二氫-2-吡喃酮衍生物
ABT-378 ABT-538
Ac-Asp-Glu-Val-Asp-H
Ac-DEVD-CH0
Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-H
Ac-Leu-Leu-Arg-H
Ac-Leu-Leu-Met-H
Ac-Leu-Leu-Nle-H
Ac-PRLNvs
Ac-Pro-Arg-Leu-AsnVS Ac-Trp-Glu-Hi s-Asp-H Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-H Ac-WEHD-CH0 Ac-YVAD-CHO 腦啡肽酶抑制劑(前體)
N-乙醯基-天冬氨醯基-穀氨醯基-異戊氨醯-天冬氨酸甲醛 N-乙醯基-L-亮氨酸-L-亮氨酸-D, L-a精氨酸甲醛 N-乙醯基-色氨醯基-穀氨醯基-組氨酸基-天冬氨酸甲醛 放線醯胺素
Ada-Ahx3-L3VS
AdaAhx(3)L(3)VS
AEBSF
AG-1343
AG7088
安瑞那韋AGM-1470
阿利克侖
ALLM ALLN
allophenylnorstatine-包含抑制齊!j 抑氨肽酶肽 -3-氨基-2-羥基-5-甲基己醯基]-Val-Val-Asp 2-(5-氨基-6-氧-2-苯基-嘧啶-l-基)-N-[1-羥基-3-甲基-l-(5-叔 丁基_1， 3， 4-噁二唑-2-基)丁烷-2-基]乙醯胺
2-氨基-N-[5-(6-二甲基氨基嘌呤-9-基)-4-羥基-2-(羥甲基)草脲 胺-3-基]-3- (4-甲氧苯基)丙醯胺
安普那韋 抗蛋白酶 apstatin
替拉那韋 阿加曲班 奧代美寧A 奧代美寧B
阿扎那韋 azido苯丁抑制素
桿菌肽A
巴馬司他
BB-2516
BB-94
苯甲脒
(1S-苯甲基-4R- [1- (1S-氨基甲醯_2-苯乙基氨基甲醯)-1S-3-丁基氨基甲醯]_21^-羥基-5-苯戊基}氨基甲酸叔丁基酯
甲基苯甲氧羰基羰苯基丙氨醯精氨醯重氮甲烷
苯甲磺醯氟
苯丁抑制素
苯丁抑制素類似物SL-387
苯丁抑制素，含硫類似物
BILN2061
麗S-232632
BMS186716
Boc-lie-Glu-Thr-Asp-H
硼替佐米
貝卡那韋
butabindide
N-[2-[5-(叔丁基)-1，3， 4-噁二唑-2-基]-(IRS)-l-(甲乙基)-2-氧
乙基]-2- (5-氨基-6-氧-2-苯基-6H-嘧啶-1-基)乙醯胺
(2S)-N-[(2S，3R)-4-[(3S, 4aS, 8aS)-3-( 叔 丁 基氨基甲
醯)-3, 4， 4a, 5, 6, 7， 8， 8a-八氫-1H-異喹啉基-2-基]-3-羥基-卜苯基
-丁垸-2-基]-2-(喹啉基-2-羰氨基)丁二醯氨
Bz-Leu-Leu-Leu-COCHO
BzLLLC0CH0
CA074
鈣蛋白酶抑制劑I
鈣蛋白酶抑制劑n 鈣蛋白酶抑制劑m
坎沙曲拉 卡託普利
N- [ (S) -1-羧基-3-苯丙基]-L-Ala-L-Pro組織蛋白酶L抑制劑
CGP-60536
對-氯汞基苯甲酸鹽
糜蛋白酶抑制劑
西司他汀
CKD-731
clasto-乳胞素beta-lactone
CLIK148
CRA-013783
Crixivan
(1S， 4R， 6S， 7Z， 14S， 18R)-14-環苯氧羰氨基-18-[2-(2-異丙氨 基-噻唑-4-基)-7-甲氧喹啉基-4-氧基]-2， 15-二氧-3， 16-二氮雜三 環[14.3.0.04.6 ]十九烷-7-烯-4-羧酸
D-2-甲基-3-巰基丙酸基-L-Pro
D-Phe-Pro-Arg-CH(2)C1
DANLME
DAPT
地瑞拉韋
DCI
DFP
1， 3-二- (N-苄氧羰基-L-亮氨酸-L-亮氨酸)氨基丙酮 重氮乙醯基-D， L-己氨酸甲酯 3，4-二氯異香豆素(DCI)
N-[N-(3， 5-二氟苯乙醯基)-l-丙氨醯]-S-苯甘M酸叔丁酯
二異丙基氟磷酸酯(DFP)
二異丙基氟膦酸
(2S) —N— [ (2S， 4S， 5S) -5- [ [2- (2, 6—二甲基苯氧基)乙醯基]氨基]-'1-羥基-1， 6- di苯基-己烷-2-基]-3-甲基-2-(2-氧-l， 3-二嗪磷-l-基)
丁醯胺
N-[2-[4-(2， 2-二甲基丙酸基)苯磺醯胺基]甘氨酸
4， 6-二氧二環[3. 3. 0]八-8-基[4- [ (4-氨苯基)磺醯基-(2-甲丙基)
氨基]-3-羥基-1-苯基-丁烷-2-基]氨基甲酸
DPC423
DX-9065a
E-64
E64
E64c
E64d
EDTA
Elaspol
彈性(蛋白)酶抑制劑
依那普利
依那普利拉
Ep475
EPNP
1， 2-環氧基-3 (p-硝苯氧基)丙烷 EST
N-(2-乙氧基-5-氧-草脲胺-3-基)-5-異喹啉基-1-基羰氨基-2，6-二
氧-1， 7-二氮雜二環[5. 4. 0]十一垸-8-羰醯胺
1- [2- (l-乙氧羰基-3-苯基-丙基)氨基丙醯基]吡咯烷-2-羧酸
乙基(+) - (2S， 3S) -3-[ (S) -3-甲基-1- (3-甲基丁基氨基甲醯)丁氨蟇
甲醯]-2-環氧乙烷羧酸酯
N-順丁烯二醯亞胺
l-乙基吡咯-2， 5-二酮3- (5-氟-3-吲哚)-2-巰基-(Z) -2-丙烯酸
4- [2-[(4-氟苯基)甲基]-6-甲基-5-(5-甲基噁唑-3-基)羰氨基-4-氧-庚醯] 氨基-5- (2-氧吡咯烷-3-基)-五-2-enoate
N-甲醯-allo-Ile-Thr-Leu-Val-Pip-Leu-Pip N-甲醯-Val-Thr-Leu-Val-Pip-Leu-Pip
2- [2-(甲醯-{同分異構}-異亮氨酸-蘇氨醯-亮氨酸-異戊氨醯)-(六 氫噠嗪-3-羰基)-亮氨酸]-六氫噠嗪-3-羧酸
沙奎那韋
福斯安普那韋(前體) FPRCH2C1 fumagalone 煙麴黴素
Y-分泌酶抑制劑II
GW0385 GW433908 GW433908 (前體)
聽A 聽SA
1R-[1S， 4R， 5S]-1-(1_羥基-2-甲丙基)-4-丙基-6-噁-2-氮雜二環 [3.2. 1.]正庚烷-3， 7-二酮
(3S, 4aS， 8aS) -2- [ (2R， 3R) -2-羥基-3- [ (3-羥基-2-甲基-苯甲醯)氨 基]-4-苯磺醯-丁基]-N-叔丁基-3， 4， 4a， 5， 6， 7， 8， 8a-八氫-1H-異喹 啉基_3-羰醯胺
(4R) -3- [ (2S, 3S) -2-羥基-3- [ [ (2R) -2-[ (2_異喹啉基-5_基氧乙醯基)氨基]-3-甲磺醯-丙醯基]氨基]-4-苯基-丁醯基]-N-叔丁基-噻 唑垸_4-羰醯胺氨基]-1-苯基-丁垸-2-基]氨基甲醯]-2, 2-二 甲基-丙基]氨基甲酸
3_羥基-4- [2- [3-羥基-6-甲基-4- [3-甲基-2- [3-甲基_2_ (3-甲基丁 醯基氮基)丁醯基]氨基-丁醯基]氨基-庚醯]氨基丙醯基氨基]-6-甲 基-庚酸
(2S) -1- [ (2S， 4R) -2-羥基-4- [ [ (1S， 2R) -2-羥基-2， 3_ 二氫-1H-茚 -l-基]氨基甲醯]-5-苯基-pentyl] -4-(吡啶-3-基甲基)-N-叔丁基-哌嗪-2-羰醯胺
N-[3-[(lR)-l-[(6R)-2-羥基-4-氧-6-苯乙基-6-丙基-5H-吡喃-3-基]丙基]苯基]-5- (三氟甲基)吡啶_2-磺醯胺
p-羥基汞苯磺酸酯
P-羥基汞安息香酸酯
IDN-6556
茚地那韋
invirase
碘代乙醯胺
碘代醋酸酯
2-碘代醋酸酯
碘代泰諾司他汀
異戊醯-L-酪氨醯-L-異戊氨醯-DL-酪氨酸 N-異戊醯-酪氨醯-亮氨酸-酪氨酸
認1-272
凱諾司他汀-272L-006235 L-709049 L-735， 524 L685458
乳胞素 LAF237
亮抑酶肽 洛匹那韋 洛伐他汀 LY—570310
馬立馬司他
MD805
MDL28170硼酸MUGB
MUTMAC 麗167
N-[(S)-2-苯甲基-3[(S) (2-氨基-4-甲基硫)丁基二硫]-l-氧丁
基]-L-苯丙氨酸苯甲酯
奈非那韋
腿
Nip-Leu-Leu—LeuVS-Me
硝苯丁抑制素 NLVS Norvir NPGB
NPI-0052
鮮-LAF237
奧馬屈拉 omuralide 0N0-5046 0N0-6818 OP
卵假散囊素
6-氧-5- (3-苯基-2-硫烷基-丙醯基)氨基-2-硫-7-氮雜二環[5. 4. 0 |
十一垸-8-羧酸
6-氧-6-去氧煙黴醇
草脲胺-3-基[4-[(4-氨苯基)磺醯基-(2-甲丙基)氨基]-3-羥基-卜 苯基-丁烷-2-基]氨基甲酸P-硝苯基-P'-胍基安息香酸酯
PCMB
PD150606
PD151746
Pefabloc
抑肽素
抑肽素A
1, 10-鄰二氮雜菲
o-鄰二氮雜菲
苯甲磺醯基氯化物
2-(磷醯甲基)戊二酸
磷醯二肽
派普拉司他汀
派普拉司他汀A
PMPA
PMSF
PNU-140690
普思特司他汀
PPACK
pralnacasan
N-(L-3-順-丙基氨基甲醯環氧乙烷-2-羰基)-L-異亮氨酸-L-脯氨酸
蛋白酶體抑制劑3
蛋白酶體抑制劑III
PS-519
PS341
假-碘代泰諾司他汀
假-泰諾司他汀
PSI-3PSI-III 嘌呤黴素
RB 101 (S)
後-塞奧芬[[[(R)-l-(巰甲基)-2-苯乙基]氨基]-3-氧丙酸] [HSCH2CH(CH2C6H5)NHC0CH2C00H]
利託那韋
RK-805
Ro 31-8959
蘆平曲韋
ruprintrivir
S-PI S17092
salinosporamide A
沙奎那韋
SCH 503034
SCH446211
SCH6
sivelestat
SPP100
SQ14225
SSR69071
他汀類藥物
TBL(4)K
1, 3_噻唑-5-基甲基[[3-羥基-5-[ [3-甲基-2-[[甲基[(2-丙垸-2-基 -1， 3-噻唑-4-基)甲基]氨基甲醯]氨基]-丁醯基]氨基]-l， 6-二苯基-己垸-2-基]氨基]甲酸酯
塞奧芬
塞奧芬[N-[(S)-2-(巰甲基)-l-氧-3-苯丙基]甘氨酸]
tipranavir
TLCK
TMC-95
TMC-95A
TMC-95B
TMC-95C
TMC-95D
TMC114
TNP-470
Tos-基CH(2)Cl (TLCK) Tos-PheCH(2)Cl (TPCK) TPCK
L-順-乙氧基琥珀醯-亮氨酸醯氨基(3甲基)丁烷
L-順-乙氧基琥珀醯-亮氨酸醯氨基(4-胍基)丁烷
硫肽酶素A
硫肽酶素B
泰諾司他汀
泰諾司他汀
Ubenimex UIC-94017 UK-69， 578 UK-73， 967 UK—79, 300Velcade 維格列汀
Virac印t (奈非那韋甲磺酸酯)
VX-740
VX478
VX950
Z-Leu-Leu-leucinal
Z-Leu-LeiH^euVS
(Z-LL)(2)酮
Z-Phe-Arg-重氮甲烷
Z-Val-Phe-H
ZD-8321 (中性粒細胞彈性蛋白酶)
ZL(3)VS
ZL3VS
通過多種方法可以評價其它有意義肽酶潛在的抑制劑。下面提供了 一些示例性的科學試驗計劃。
羧肽酶Al和A2
羧肽酶A (CPA)是一種水解和多肽鏈C-末端相連的肽鍵的胰臟金屬 肽酶。羧肽酶Al (CPA1)和羧肽酶A2 (CPA2)的區別在於針對具體 的肽基質前者(可認定為傳統的A型)對脂肪族和芳香族殘基貧 更好的優勢，而後者對芳香族殘基更苛刻。具有芳香族或支側鏈的 C-末端L-胺基酸優選從肽鏈上分裂。
反應速度取決於Folk和Schirmer (1963)方法。參考Folk, J.和 Schirmer， E. J. Biol. Chem. (1963) 238:3884-94。通過測定在 254 nm處吸收的增加來確定馬尿醯-L-苯丙氨酸(Sigma服875)的水解率。在具體的條件、25 ° C和pH 7. 5下，1單元每分鐘水解1微 摩爾的馬尿醯-L-苯丙氨酸。
基質
1 mM的馬尿醯-L-苯丙氨酸和0. 5M氯化鈉一起溶於pH為7. 5、 25 mM 的甲垸鹽酸鹽中。
酶
可以從Sigma (C5358)購買CPA1。相應的，根據Laethem等人的y4化力 a'oc/ 棚5j'叩/u^ (1996) 332(1) :8-18公開的步驟提純hCPAl。根 據Reverter等人的/ ^'o丄C力e瓜(1998) 273 (6) : 3535-41公開 的步驟提純hCPA2。
將原料CPA溶液溶於10%的氯化鋰中，得到的最終濃度為1-3單位 /mL。 CPA的濃度可以通過測定278 nm (mg/mL 二 A， x 0. 515)處的 吸收率來計算。基質為試驗緩衝液(25 mM甲烷鹽酸鹽，0. 5 M氯 化鈉，pH7. 5)中的馬尿醯-L-苯丙氨酸(lmM)。用移液器吸取2. 0mL 的基質移送到小玻璃管中，於25° C在分光光度計中培育3-4分鐘， 達到溫度平衡，並建立空白速率(如有)。加入O. lmL稀釋的酶，在 3-5分鐘內記錄A^中的增加。從曲線起始的直線部分測定AAw /分 鍾。測試化合物的抑制活性通過測試濃度範圍為1 0. 1 nM的反 應速率來分析。
計算
靴 _ AA254/分鐘
丄Wg = 0.36* xmg酶/ml反應混合物 * 0.36=反應期間形成的馬尿酸的消光係數
採用Worthington Biochem中的試驗。更多參考請參照
li.U !): : ::www.鄰(..).j:丄.h丄.ng.t...o丄)二hi.o(:.h(..:.n.),d丄「..'丄(丄j..丄.1羧肽酶B
羧肽酶B (CPB)催化鹼性胺基酸賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸從多肽的 C-端水解。用Folk和Schirmer (1963)的分光光度方法測定活性， 其中的反應速率通過由馬尿醯-L-精氨酸水解導致在254nm出吸收率 的增加來測定。在具體的條件、25° C和pH 7.65的情況下， 一單 位導致每分鐘1微摩爾的馬尿醯-L-精氨酸水解。
基質
1 mM的馬尿醯-L-精氨酸在含有0. 1 M氯化鈉的25 raM甲烷鹽酸鹽、 pH 7. 65中。
酶
可以通過Sigma (C9584)購買CPB。將原料溶液用反應級的水係數， 濃度達到1-5單位/mL。
用移液器吸取2.9mL的基質移送到小玻璃管中，於25° C在分光光度 計中培育3-4分鐘，達到溫度平衡，並建立空白速率(如有)。加入 0. lmL稀釋的酶，在3-4分鐘內記錄A^中的增加。從曲線起始的直線 部分測定AA^ /分鐘。測試化合物的抑制活性通過測試濃度範圍為 1 iiM-O. 1 nM的反應速率來分析。
計算
始產, AA254/分鐘
早1丄/一/mg
0.349* x mg酶/ml反應混合物 *反應期間形成的馬尿酸的消光係數
採用Worthington Biochem中白勺i式驗。更多夢力昭-夢兕
hp: , Vww, wor.ij...i i 1(￡[丄.0丄二丄>.丄^).1.(^ ('i[h—《 Sigma-Aldrich中的另一替代機理如下http://Ww. sigmaaldri ch. com/img/assets/] 8160/carhoxypc、卩ti(J ase B. pdf#search=%22 carboxypeptidase %2(Mi20assay%22
羧肽酶D
羧肽酶D (CPD)是180-kDa的單鏈醣蛋白，其具有三個一樣的羧肽 酶活性位域和羧基端疏水穿膜標記。其從蛋白質和肽的羧基端分裂 單胺基酸，該蛋白質和肽顯示了對羧基端精氨酸或賴氨酸嚴格特異 性。
基質
CPD基質丹醯-L-丙氨醯-L-精氨酸通過丹醯氯和前述的二肽、丙氨酸 -精氨酸反應進行合成。參考/^oc. tad Sc丄(1982)
79:3886 - 3890; Zi/e 5c丄 (1982) 31:1841 - 1844; #6^/ wfe A/7^t歷o丄(1995) 248:663 - 675。
酶
在MCF-7細胞溶菌液中測定CPD活性。MCF-7細胞[(IO - 20) X IO"]在 0. 1M的乙酸鈉緩衝液(pH5.6)中用21-規的針均質化。製備總的細 胞溶菌液或亞細胞組分，每個組分中加入Triton X-IOO，得到最終 的濃度O. 1% (v/v)。直至進一步的分析，樣品在-20 ° C保存。
步驟
冰冷的酶樣品(在總體積50pL中的60 - 80 ng蛋白質/uL)在 37° C、 150 iiL的0. 1M的乙酸鈉緩衝液(pH 5. 6)預培養5分鐘。通 過加入預平衡的(37。 C)丹醯-L-丙氨醯-L-精氨酸基質(在50 "L 的0. 1 M乙酸鈉緩衝液中，pH 5. 6)啟動試驗。37° C培育(CPD-N經 過6分鐘，CPD經過10分鐘)後，加入150uL的1 M檸檬酸終止反應， 樣品放在冰中。用氯仿萃取，從親水性基質丹醯-L-丙氨醯-L-精氨 酸中分離出丹醯-L-丙氨酸產品。在340nm的激發波長和495nm放射 處，相對於氯仿空白測試了氯仿層中的螢光。使用不同濃度的丹醯-L-丙氨酸 (Tokyo Chemical Industry America, Portland, OR,
U.S.A.),構建每個試驗的標準曲線，以校對萃取效率中的波動。使
用的抑制劑為MGTA (DL-2-巰甲基-3-胍乙基硫代丙酸(Calbiochem,
La Jolla， CA， U.S.A.)和0P (I，IO-鄰二氮雜菲；Sigma) 。 CP的活
性通過存在或不存在10 UMMGTA的活性差異進行測定。SA的具體活
性計算為l (umol/分鐘二單位)每mg蛋白質(即SA二單位/mg蛋白
質)。Km為63uM， Vmax = 27 umol/分鐘。所測試化合物的抑制活性
在濃度範圍0. luM-0. lnM內分析。
參照/ (2005) 390 (Pt 3) :665-73
http:〃ww. pubmedcentral. nih. gv/artic〕 erender, i'cgi( to'i，,
Libmed&pubmedid=15918796
羧肽酶E
羧肽酶E (CPE)是一種處理酶，該酶從內蛋白水解分裂的肽荷爾蒙 的c-端分裂鹼性殘基。該酶不在神經細胞和內分泌細胞中的高爾基 體和分泌顆粒中出現。
基質
Dns-Phe-Ala-Arg可以通過Fricker的7fe〃潛c丄(1995) 23:237-250中的方法製備。
酶
羧肽酶E可以用上述建立的歩驟進行提純和分離。參考
"e瓜(19%) 271 (8) :30619-30624.
對於羧肽酶測定，25叱的酶和50 mM NaAc、 pH 5. 5和200 ,丹醯 -Phe-Ala-Arg基質合併，最終體積為250叱。此外，試管中含有1 mM CoCl2或l幽胍乙基巰基琥珀酸(GEMSA)。樣品和抑制劑在4 。 C下 預培養15分鐘，然後加入基質，試管在37° C下預培養l小時。接著培養60分鐘，加入100叱的0. 5 M HC1和2 mL的氯仿，在試管中 混合，然後在500 X《離心2分鐘。通過氯仿層中測試的螢光(激 發350咖，發射500nm)測定產品的量。金屬羧肽酶活性定義為Co" (CPE的活化劑)存在時的活性和GEMSA (CPE的抑制劑)存在時的活 性之間的差值。對於這些試驗，羧肽酶的活性定義為含有酶的試管 和僅有緩衝液和基質的試管之間的螢光的差值，表示為含有酶、緩 衝液和基質的對照試管的％，但是不含有二價離子或抑制劑。測試 化合物的抑制活性在濃度範圍為luM - 0. 1 nM.之間分析。 參考/Jj.o丄O e瓜(1996) 271(8) :30619-24 http:〃www. jbc. org,/cgi/content/ful 1/271/48/30619' i jkcy-911 4ecbb2b0629a51b4b2c5782deeec9ed63a93t
羧肽酶G
羧肽酶G為溶酶體、硫醇依賴性蛋白質酶，其逐漸分裂g-穀氨醯基 蝶醯基聚-g-穀氨酸酯，得到蝶醯基-a-谷氮酸酯(葉酸)和游離的 穀氨酸。羧肽酶G被認為對g-穀氨醯基鍵高度特異性，但是對分離 基團的C-端胺基酸不是(參考/ C力e瓜(1967) 242:2933)。
基質
可以從Sigma-Aldrich (A7019)購買(+)氨甲喋呤。 酶
羧肽酶G可以從Sigma-Aldrich (C9658)購買。在pH 7.3、 30 。 C 的條件下，一個單位每分鐘從(+)氨甲喋呤水解1. 0微摩爾的穀氨酸。
在pH 7.3、 30 ° C的條件下，將2. 8 mL、 50 mM的Tris HC1緩衝 液和0.1 mM的氯化鋅加入到O. 1 mL 1.8 mM的(+)氨甲喋呤中。倒 轉混合，平衡到30 ° C。檢測A320nm， 直至穩定，用合適的恆溫 器分光光度計。然後加入含有0. 3 - 0. 6單位/mL水的0. lmL酶。立即倒轉混合，用測試和空白的最大線速度記錄A320nm/分鐘的減 少。測試化合物的抑制活性在濃度範圍為1 P M - 0. 1 nM.之間分析。
計算
單份,m,: (AA咖m/分鐘測試-AA,m/分鐘空印(3)(df)
(8.3)(0,1)
3 =測試體積(毫升) df 二稀釋因子
8.3 = 320 nm處基質和產品之間在毫摩爾消光係數中的差值 10.1 =使用的酶體積(毫升) 參考Sigma-Aldrich酶測定
http://www, sigmaaldrich. coin/sigma,/enzyme(免20assay/c965'8ny,.
羧肽酶M
羧肽酶M (CPM)是一種細胞外糖基磷脂醯肌醇標記的膜糖蛋fl。該 蛋白質屬於鋅金屬羧肽酶的CPN/E子類。它具體從含有次末端丙氨 酸的肽上除去C-端鹼性殘基，如賴氨酸和精氨酸。確信的是，該羧 肽酶對控制細胞表面上的肽荷爾蒙和生長因子活性起著重要作HJ ， 以及在細胞外蛋白質(Braz J Med Biol Res 2006 39:211-217)的 膜定位降解中起著重要作用。
基質
通過丹醯化二肽Ala-Arg合成丹醯-Ala-Arg(Methods in Neuroscj ences: Peptide Technology" (P. M. Conn, ed. )，Vo]. 6， p. 373. Academic Press, Orlando, Florida, 1991)。
酶
羧肽酶M根據Tan等人說明的發進行分離、提純(Methods Enzymol 1995 248:663-675)。步驟
加入125uL的緩衝液(O. 2 M HEPES [4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙二酸]， pH 7.0，含有0.2% (v/v) Triton X-100) 、 5-50/uL的酶樣品、0 或25 u L的100uM的MGTA和0-70 u L的水，最終的體積為200 u L。 對於每套反應，準備一個酶空白(沒有基質)和一個基質空白(沒 有酶)。為了確保反應的特異性，樣品可以用與不用2-巰甲基-3-胍 乙基硫代丙酸(MGTA)抑制劑進行預培養。樣品在冰上預培養5-10 分鐘，然後加入50uL的1.0 mM丹醯-Ala-Arg (4.64 mg/10 mL水 或稀釋10mM原料溶液l:10)開始反應。根據活性，在37° C培養樣 品15分鐘到3個小時，燃用加入150uL的停止溶液(用氫氧化鈉調 整為pH為3. 1的1. 0 M檸檬酸)終止反應。每個試管中加入氯仿(1. 0 mL)，激烈混合15秒，萃取丹醯-Ala產品，然後在約800 g時離心 10分鐘，分離相。氯仿層的螢光(底層)相對於氯仿空白在340 nm 的激發波長和495nm的發射波長進行測試。測試化合物的抑制活性 在濃度範圍為1 ii M - 0. 1 nM.之間分析。
計算
羧肽酶活性定義為未抑制樣品和用10 mM MGTA抑制的樣品之間在熒
光中的差值。螢光單位(FU)通過構建FU對丹醯-Ala (Sigma D0125)
濃度的標準曲線轉換為毫微摩爾基質。
參考^7zy/ffW (1995) 248:663-675。
羧肽酶N
羧肽酶N (CPN)為血漿鋅金屬蛋白酶，其由兩個酶活性的小亞組 (CPN1)和防止蛋白質分解的兩個大亞組(CPN2)組成。CPN從血液中發 現的含有次末端丙氨酸的肽上分裂羧基端的精氨酸和賴氨酸，如補 充的過敏毒素、激肽和肌酸激酶MM(CK-MM)。通過除去僅有的一個氨 基酸，CPN有能力改變肽活性和受體結合(船2 T/z2M/朋y (2004) 40:785-93)。基質
呋喃丙烯醯基(FA)-Ala-yls從Sigma (F5882)商業購得。 酶
根據Skidgel的ife^ oA ^>7^ o〗(1995) 248:653-63中的方法提 純羧肽酶N。
加入0. 5 mL含有0. 5M的NaCl緩衝液的0. 1 M HEPES (pH 7. 75)、 0. lmL的5 mM FA-Ala-yls (18. 23 mg/10 mL水)和足夠的水，最終 得到的體積為l.OmL (包括樣品)。在水浴中將混合物溫熱到37。 C， 簡單混合時加入酶樣品，然後將溶液快速輸送到記錄分光光度計的 恆溫器(37° C)中的預熱小槽中。336nm處的吸收變化連續記錄約2-3 分鐘。測試化合物的抑制活性在濃度範圍為1 li M - 0.1 nM.之間分
參考^7zj7z o〗(1995) 248:653-63。 羧肽酶T
發現羧肽酶T (CPT)由普通高溫放線菌分泌。CPT對肽基質的特異 性合併了羧肽酶A和B的特點，g卩，該酶分裂C-端中性基團，優選 為疏水的胺基酸，如羧肽酶A，以及分裂它們側鏈屮產生正離子基團 的精氨酸和賴氨酸殘基。
酶
根據Stepanov的M t力ot/s (1995) 248:675-83中的方法提
純羧肽酶T。
基質
通過前述的步驟完成Dnp-Ala-Ala-Arg-0H的合成。參考foVA力iffl/.ra(1973) 38:790。 步驟
在0. 1 M Tris-HCl緩衝液、pH 7.5、 10-100 yL的酶溶液中加 入1 mL的0. 5 mM基質溶液。混合物在37° C培養10-60分鐘，然 後加入0. 2 mL的50% CH:;COOH中止反應。混合物定量的轉移到含有2 mL的SPS印hadex C-25的微型柱(塞有棉花的Eppendoff自動移液器 的塑料圓錐)中，用1 M的CH3COOH預平衡。柱子用1 M的CH:,C00H清 洗(兩次，lmL)。合併洗液，測定溶液的A360 。為了計算 D叩-Ala-Ala-OH濃度，使用的摩爾消光值(e360)為15,000。 一個活 性單位等於在具體的條件下於1分鐘內水解1 、0l基質的酶的量。 測試化合物的抑制活性在濃度範圍為luM - 0. 1 nM.之間分析。 參考#ez^oofe ^7^Tz o2 (1995) 248:675-683。
羧肽酶Y
羧肽酶Y (CPDY)釀酒酵母中分離的64 kDa絲氨酸羧肽酶，己經發 現該酶能催化多種離去基團的水解反應，如胺基酸、對硝基苯胺和 多種醇。試驗測定了在酶水解苄氧羰基-L-苯基丙氨醯-L-亮氨酸過 程中亮氨酸的離去速度。
基質
苄氧羰基-L-苯基丙氨醯-L-亮氨酸可以從Sigma (C1141)處購買。 注和緩衝液混合前，0.5 mL的DMSO (二甲亞碸)可以用於溶解苄 氧羰基-L-苯基丙氨醯-L-亮氨酸。
羧肽酶Y從Sigma (C3888)購買。用反應級的水製備1 mg/mL的酶 溶液。在50 mM的磷酸鈉、0. 15M氯化鈉和pH為6. 5的基質溶液中加入1. 0 mL的1 mM苄氧羰基-L-苯基丙氨醯-L-亮氨酸。在25 ° C中預培養 10分鐘。加入50uL的酶開始酶反應。反應在25 ° C中反應10分鐘。 加入1. OmL的茚三酮試劑(通過混合50mL在甲基纖維素中的4%的 茚三酮和0.2M的檸檬酸鈉(pH 5.0) -7. ImM的氯化亞錫)。將10 個測試試管中的每一個攪拌15分鐘。將所有的試管放在開水中水浴 15分鐘。從水浴中移走試管，冷卻到低於30 ° C。在每個測試試管 中加入5. OmL、 50%的丙醇溶液，並充分混合。在570nm處讀取所有 試管的光密度。使用不同濃度的亮氨酸，構建每個試驗的標準曲線。 測試化合物的抑制活性在濃度範圍為luM - 0. 1 nM.之間分析。
計算
單位/mh; 光密度-空白
標準曲線的斜率x10分鐘x0.05 單位/ml
單位/mg:
mg/ml樣品
參考Worthington Biochem。請參考
htl:p://www, wor1 hingt(m-bioch(-)m.(、(肌'CY,21 (《au^i Ji1Jni' 羧肽酶Z
羧肽酶Z (CPZ)屬於金屬羧肽酶的羧肽酶E子類。儘管這些Zn依賴酶 通常不是公知的CPZ具體的基質、包含在蛋白質的細胞內處理和細胞 外外處理中，但是其已顯示出分裂C-端精氨酸，以及包含在Wnt信號 通道中。參考"，一細t (2003) 130(21) :5103-11。
基質
丹醯-Phe-Ala-Arg可以通過Fricker的方法進行製備 yVew孺ci. (1995) 23:237—250。
酶
如同以前報導的一樣，通過親合色譜法提純，羧肽酶ZcDNA能夠轉染成AT-20細胞和蛋白質。參考A'oc力effl Aiop/ j^ Om孤(1999) 256:256-8。
CPZ活性在最終體積為250uL、 100 mM、 pH 7.4、 Tris-HCl緩衝液中 用0. 2mM丹醯-Phe-Ala-Arg測定。在37° C中3小時後，反應用100 yL、 0.5 M的HC1終止，然後加入2mL的氯仿。混合後，以300 x g 離心2分鐘，通過測定氯仿相中的螢光測定產品的量。為了檢測抑 製劑的效果，在緩衝液、基質和抑制劑的混合物中加入提純的CPZ， 得到最終濃度為50 mM Tris-Cl， pH 7. 4， 100 uM丹醯-Phe-Ala-Arg 和所示濃度的抑制劑。反應在37° C中培養1小時。培養後，加入 100叱的0. 5 M HC1和2 mL的氯仿，試管混合，然後以500 X g 離心2分鐘。通過測定氯仿層中的螢光(激發350nm、發射500nm) 測定產品的量。進行沒有酶的對照反應。進行大量CPE的反應，以測 定對應於基質完全轉化為產品的螢光。Km值用丹醯-Phe-Ala-Arg和 丹醯-Pro-Ala-Arg測定，使用的濃度範圍為0. 025-1. 6 mM。 參考萬j'oc力evz j'ca7 awt/ Aj'op力j^s"ica7 7fesesrc力 Co/ 朋"/7icat7(9從s' (1999) 256:564 - 568。
絲氨酸羧肽酶A
絲氨酸羧肽酶A也稱之為哺乳動物組織蛋白酶A，溶悔體羧肽ff A 和溶酶體保護性蛋白定義為能在酸性pH '卜水解Z-Glu-Tyr的,。該 酶也顯示了在中性pH中的酯酶和脫醯胺酶的活性。由於組織蛋白酶 A能在體外水解大量合成的生物活性的肽激素，如Z-Phe-Leu、血管 緊縮素II、物質P和內皮素，已經建議組織蛋白酶A可以包含在肽 激素的體內代謝中，儘管對組織蛋白酶A的勝利基質還不清楚。HPLC 分離後，組織蛋白酶A的活性的測定機理基於從基質中酶脫離的 N-DNS-Phe的螢光測定、N-DNS-Phe-Leu。以100， 000 x g離心80分鐘的蔗糖中0. 25M的鼠腎勻漿用於酶源。 基質
根據Wiedmeier的,C/Lromgto^r. (1982) 231:410公開的方法合 成N-DNS-Phe-Leu。
反應混合物包括50 mM的乙酸鈉緩衝液(pH 4.6)、 40 u M的 N-DNS-Phe-Leu和酶、水，總的反應體積為250uL。培養在37° C中 進行，通過在95° C的開水中加熱5分鐘終止反應。離心後，在清 澈的上清液中加入N-DNS-NLeu作為內部標準，得到的等份混合物根 據Chikuma等人的/ C力ro/z Wj'湖e^/ 5"'朋d (1999) 728(1) :59-65進行HPLC分析。測定N-DNS-Phe的峰高，並從 N-DNS-NLeu內部標準的峰高轉化為微微摩爾。 一單位的酶活性定義 為在37° C、l分鐘內將lpmo1的基質轉化為相應產品所需的酶的量。 測試化合物的抑制活性在濃度範圍為luM - 0. 1 nM.之間分析。. 參考/ ".'Sio/sec/. 5"c丄a/ t/^ ;^. (1999) 728 (1) : 59-65。
在含有溶入甲醇(xx mL)的D(a)L (1 eq)的圓底燒瓶屮加入 [Re(C0嵐0):,]Br (1 eq)。反應加熱到80 "C，並攪拌4小時。除去 冷卻的容積後，樣品用HPLC提純。樣品用'H醒R和質譜分析。
Re (CO) 3D (C4) L (5):產量=23% (0. 4 g) 。 'H匿(CDC1:,， ppm): 8.77 (m， 2H)， 7.91 (m 2H) ， 7.61 (m， 2H) ， 7.35 (m， 2H) ， 7.13 (m, 5H)， 5.00 (m， 4H) ， 4.12-2.60 (mm， IIH)， 2.26-1.41 (mm' 16H)。 MS(ESI): / A 944 (M+H"， ffl/z 942 (M-H)+。
Re (CO) :,D (C。 L (6):產量=34% (0. 61 g)。'關MR (CDCl.,, ppm): 8.77 (m， 2H)， 7.91 (m2H)， 7.61 (m， 2H) ， 7.35 (m， 2H) ， 7.13 (m， 5H)， 3.92 (d， 4H) ， 3.69—2.65 (mm， 1111), 2.27—1.46 (mm， 18H)。 MS(ESI): /b/z 688 (M+H) +,歷/z 686 (M-H)+。Re (CO) J) (C8) L (7):產量=55% (0. 40 g) 。 ^ NMR (CDCU ppm): 8.50 (d， 2H)， 7.63 (m2H)， 7.50 (m， 2H) ， 7.13 (m， 8H) ， 3.85 (d, 4H)， 3.69-2.53 (mm， IIH)， 2.23-1.22 (腿，24H) 。 MS (ESI): 歷/z 730 (M+ +H) +. /z /z 728 (M—H)+。
卿7b r^人"《"Z遊一麼,多f
用公開的文獻[6]通過Isolink試劑盒製備[99mTc (CO) 3 (H20) 3]+。為了測 試金屬絡合物的鼠血漿穩定性，分離的9"Tc(C0)J)(Cx)L在37"C、 lmL 的鼠血漿中培養5分鐘、60分鐘和24小時。在所需的時間點，除去 等份的培養混合物(400化)。乙腈(SOO L)的加入產生了沉澱，該 沉澱在15，000 rpm離心5分鐘。除去上清液，在氮氣流中濃縮。剩 下的殘基溶於10%乙醇/鹽水，並用HPLC分析，以測定化合物的穩定 性(圖4)。
沐// /苦絲試##。根據生產者的說明，測試化合物抑制ACE活性 的能力用Fujirebio, Inc.的ACEcolor試劑盒測定。提純的鼠肺ACE 在37 °C和測試化合物一起培養20分鐘，測試化合物在基質溶 液中的濃度為1 M- 0. 1 nM。加入顯影劑溶液，在分光光度計、505nm 讀數前，樣品在37 。C再培養5分鐘。
嵐資織分布。""'Tc (CO) :iD (Ch) L (MIP-1037)的組織分布研究在單獨的 雄性大白鼠(11=5/時間點)組中進行。MIP-1037以50 PCi/kg從尾部 靜脈團注(約IO MCi/rat)，體積恆定為O. lml 。在注射10分鐘、 30分鐘、1小時和2小吋後，用二氧化碳對這些動物進行安樂死。 將組織(血液、心肺、肝臟、朋!、腎、大腸和小腸(含有內容物)、 睪丸、骨骼肌和脂肪)分離、切割、稱溼重，轉移到塑料試管中， 用自動的Y-計數器(LKB Model 1282， Wallac Oy， Finland)計數。 表達為。/。ID/g、 99l"Tc(C0)J)(C8)L (MIP-1037)的組織吋間-放射性水平 通過每分鐘校正計數的衰減轉化為百分比劑量和除以組織或器官樣品的重量來測定。也測定等份的注射劑量，將每個組織樣品中的每 分鐘計數轉化為每個器官中注射劑量的百分比。
成像。用戊巴比妥鈉(50 mg/kg,i.p)對6個大白鼠進行麻醉， 隨意分配到，c (CO) 3D (C8) L (MIP-1037)或賴諾普利/"'"Tc (CO) 3D (C ) L (MIP-1037)治療組(77 = 3/組)。所有的6個動物放在Y -照相機上， 基線平面腹部成像由5個組成，對於單個動物， 一分鐘連續成像用 低能量DSX-LI雙頭Y-照相機、通用瞄準器(SMV America)和迷你 Y-照相機、MGC500 (TeraRecon Inc.)獲得。在使用"'"Tc (CO) 3D (C8) L (MIP-1037)前，對動物(n = 3)使用5分鐘的賴諾普利(0.5 mg/kg， i.v.)。 5分鐘後，對所有的動物(n = 6)靜脈注射5 mCi/kg 99mTc(C0)3D(C8)L (MIP-1037) ， 5個1分鐘平面腹部成像在注射10、 30和60分鐘後獲得。
99mTc(C0)3D(C8)L (MIP-1037)吸收的解剖定位，利用小動物SPECT/CT 也使用了帶有小孔瞄準器的X-SPECT小動物掃描器(Gamma Medica， Inc., Northridge， CA)。單獨用""'Tc (CO) :iD (C8) L (MIP-1037)注射 鼠或用賴諾普利(5分鐘前r"Tc(C0):J)(C》L (MIP-1037))注射治療 組"=2/組)。用異熒垸/氧氣混合物麻醉鼠。麻醉的動物固定在具 體的設備上，以保證後面影像融合所需的完全不動。麻醉的程度通 過用呼吸帶測定呼吸頻率進行監測。體溫用直腸探測器控制，並用 熱電偶和加熱的空氣流保持在37。 C。用生產者軟體獲得和重新構建 SPECT數據。SPECT和CT數據的融合用標準方法處理。 如表I所示，每個錸絡合物的抑制活性對照提純的鼠肺ACE在休外進 行評價，並隨著鏈長(亞甲基間隔單元)直接變化；Re (CO):iD (C ) L (MIP—1037) ; IC50 二 3 nM) ， Re(CO):,D(CjL (MIP—1003) ; IC-' 二 144 nM)，以及Re(CO):,D(d)L (MIP-1039) ; IC50 = 1， 146 nM),和賴諾普 利對比；IG。 = 4 nM。有7個碳亞甲基間隔單元的類似物，MIP-103 顯示的活性等於母分子，賴諾普利。
表I: ，7b&^,/^""/邀錄遊嵐廁^幼妙//劍活絲化合物_0_IC5 (nM)
MIP-1039 3 1146
MIP-1003 4 144
MIP-1037 7 3
賴諾普利 - 4
表II顯示了"7c(C0)3D(C8)L (MIP-1037)的鼠組織分布。在檢查的所 有組織中檢測到不同水平的放射指示劑，並隨著時間穩步減少。在 肺部的吸收最大，具有高ACE表達的組織，注射10分鐘後達到15. 2% ID/g，保持3.93 。MD/g2小時。通過腸內增加的放射性同位素示蹤 證實，間隔主要是通過肝膽路徑。同時注射0.6mg/kg的非放射性 標記的賴諾普利後，MIP-1037的吸收在肺部和其它組織中急劇減少， 證明是特異性結合。鼠血漿的HPLC分析顯示絡合物在24小時內是穩 定的，沒有明顯的分解。
飾Tc ^ 義力《JZ 遊嵐資織分布
10分鐘 30分鐘 1小時 2小時
T均SDT均±SD下均±SD血液0. 150. 010.08土0.020.(M0.020.0'11 0. 01
0. 140. 040.020.010.01±0.01■02± 0. 01
心朋-0. 39±0. 060.210.(M0.150.030.09丄0- 02
0.070, 030.03士0.030.00±0.l0.(J3± . l
w'15. 20土7. 367.05±1.975.911.553.93土 1. 17
0. 17土■ 0.060.03±0.010.040.060.02上0. 01
月T髒0. 82±0. 130.590.180.34±.060.17-1— ■ 3
2. 46土1. 150.29土0.070.15土0.14■08± 0. 01
脾0. 890. 120.65±0.180.01±0.060.19土 0. 03
0. 06±0. 010.01±0.010.000.[U0.03± . 01
1. 21土0. 271.330.461.300.38■化L ■ 11
0. 540, 080.160. 20.130.020.08± .("
人腸0. 18士0. 050.170.160.08±0.020.10土 0.3
0. 04±0. 020.02±0.000.030.030.17± 0. 32
小腸1. 860. 773.411.186.02±0.556.13丄i.:化5.19 ± 2.16 6.99 ± 2.39 6.67 ± 1.94 11.36 ±1.51
骨骼肌 0. 41 ± 0. 07 0. 44 ± 0. 16 0. 36 土 0. 04 0. 28 ± 0. 02
0. 08 ± 0. 05 0. 02 ± 0. 01 0. 02 ± 0. 01 0. (M ± 0. 01
脂肪 0. 24 ± 0. 09 0. 29 ± 0. 09 0. 29 ± 0. 14 0. 32 ± 0. 06
0. 07 ± 0. 02 0. 01 ± 0. 01 0. 01 ± 0. 02 0. 06 ± 0. 03
全體成像用於確定MIP-1037是否能用於非侵入性監測體內ACE 活性。如上所述，用和不用賴諾普利預治療的鼠用於體內成像規則。 在每個動物的成像時間點，劃出肺、肝臟、小腸和背部(軟組織) 的有用區域(ROIs)。每個ROI計數表達，ROIs在相同的時間點正常 化為背景。圖9顯示了注射MIP-1037後10分鐘獲得的體內腹部全 體平面圖像。注射10分鐘後的起始對照圖像顯示了肺、肝、小腸和 膀胱中放射指示劑的吸收，該吸收能通過賴諾普利預治療阻斷。
此外，小動物SPECT/CT (Gamma Medica， Inc., Northridge， CA) 的成像研究定義了放射指示劑的解剖定位。和整體平面成像規則類 似，鼠接受MIP-1037，有和沒有上述的賴諾普利預治療。如圖10所 示，賴諾普利預治療阻斷了突出的肺活性，其表明MIP-1037和組織 (肺)ACE在體內的特異性結合。當對比對照組和預治療組的圖像時， MIP-1037在肺裡的吸收在經過觀察期60分鐘(所有的時間點)大大 降低了，如同ROIs計數的一樣。肺內放射指示劑的吸收幾乎在注射 後60分鐘消失。此外，MIP-1037吸收的大幅降低也在膀胱的10、 30和60分鐘時發現，以及在小腸的30和60分鐘時發現。肝吸收是 短暫的，從該器官清洗非常快，注射後的60分鐘吋幾乎所有的放射 活性消失在腸內。
帶有多個亞甲基基團的D(Cx)L配位體用於形成M(CO):,'絡合物。 最有功效的化合物M(C0):,D(C8)L在體內用99m-Tc測試。組織分布研究 表明在含有ACE表達的器官中有高吸收，如肺。用賴諾普利預治療的 研究表明該化合物事實上是ACE特異性的。平面照相機成像和 PSPECT/CT成像證實了體內的結果。與此對比，高親和性Tc-99i4射己 的ACE抑制劑設計有和賴諾普利類似的功效。生物分布、藥理學阻斷 研究和圖像分析證實體內ACE的具體作用。該試劑能用於監測相關疾病狀態的ACE調節。
上面對本發明進行了說明，並通過說明書和優選實施例進行了 詳細說明。對於本領域普通技術人員來說，不限於優選實施例的其 它實施例也包含在本發明的範圍內。相反，本發明的範圍和下屬權 利要求書所表述的範圍一致。
權利要求
1、一種包含偶聯到放射性藥物部分或光學成像部分的肽酶結合部分的化合物。
2、 權利要求1所述的化合物，其中所述的放射性藥物部分為放射成像部分、放射治療部分，或二者。
3、 權利要求l所述的化合物，其中所述的肽酶結合部分選自外 肽酶或內肽酶抑制劑。
4、 權利要求1所述的化合物，其中所述的肽酶結合部分包含羧 肽酶結合部分，其中依次選自羧肽酶Al、羧肽酶A2、羧肽酶B、 柱狀細胞羧肽酶A、羧肽酶D、羧肽酶E、羧肽酶M、羧肽酶N或 羧肽酶Z的抑制劑。
5、 權利要求4所述的化合物，其中所述的肽酶結合部分包含ACE 結合部分。
6、 權利要求5所述的化合物，其中所述的ACE結合部分選自 阿拉普利、苯那普利、卡託普利、西羅普利、西拉普利、地拉普利、 依那普利、依那普利拉、福辛普利、米卡普利、賴諾普利、莫西普 利、莫維普利、平託普利、培哚普利、奎那普利、雷米普利、倫唑 普利、螺普利、鹽酸替莫普利、群多普利或左芬普利。
7、 權利要求l所述的化合物，其中所述的放射成像部分包含放 射性核種螯合物。
8、 權利要求7所述的化合物，其中所述的放射性核種選自鎝或錸。
9、 權利要求8所述的化合物，其中所述的放射性核種選自鎝 -99m、錸-186或錸-188。
10、 權利要求1所述的化合物，其中所述的放射成像部分包含(鎝 -99m) Tc (CO):或(錸_186/188) Re (C0) :1螯合物。
11、 權利要求5所述的化合物，其中所述的ACE結合部分，和 血清ACE相比，更大程度上抑制組織ACE。
12、 權利要求5所述的化合物，其中ACE的IC,^抑制小於20nM。
13、 權利要求1所述的化合物，其中所述的肽酶結合部分和光 學成像部分通過氨基化合物、酯、胺或醚鍵偶聯。
14、 一種成像哺乳動物的一個或多個器官或組織或二者的方法， 該方法包括給哺乳動物施用有效量的一種化合物，該化合物包含 偶聯到放射成像部分或光學成像部分的肽酶結合部分；以及獲得哺 乳動物的一個或多個器官或組織或二者的圖像。
15、 權利要求14所述的方法，其中所述的化合物靜脈注射施用。
16、 權利要求14所述的方法，其中所述的化合物選自冷的錸標 記或鎝-99m標記的D(C4)L (1)、 D(C5)L (2)、 D(C6)L (3)或D(C8)L (4)。
17、 權利要求14所述的方法，其中所述的一個或多個器官或組 織或二者包括肺組織。
18、 權利要求14所述的方法，其中所述的 織或二者包括腎組織。
19、 權利要求14所述的方法，其中所述的 織或二者包括心臟組織。
20、 權利要求14所述的方法，其中所述的 織或二者包括腫瘤組織。
21、 權利要求14所述的方法，其中所述的 織或二者包括易受傷的斑塊的情況。
22、 權利要求14所述的方法，其中所述的 織或二者包括動脈粥樣化的情況。
23、 權利要求14所述的方法，其中所述的織或二者包括炎症的情況。
24、 一種試劑盒，該試劑盒包括(i)包含偶聯到金屬螯合物部 分的肽酶結合部分的化合物；以及(ii)放射性核種。
25、 權利要求24所述的試劑盒，其中所述的放射性核種選自鎝 -99m、錸-186或錸-188，或其組合。
26、 一種分級和哺乳動物一個或多個器官或組織或二者相關的 病理學症狀的方法，該方法包括(i)給哺乳動物施用有效量的一個或多個器官或組 個或多個器官或組 個或多個器官或組 個或多個器官或組 個或多個器官或組 個或多個器官或組種化合物，該化合物包含偶聯到放射成像部分的肽酶結合部分，(ii) 獲得所述哺乳動物一個或多個器官或組織或二者的圖像，(iii)由所述圖像確定存在於所述哺乳動物一個或多個器官或組織或二者的肽酶，以及(iv)利用確定的量和對照的量達到病理學症狀的階段。
27、 權利要求26所述的方法，其中所述的病理學症狀選自心力 衰竭、心肌症、肺病、腎功能不全、腎衰竭、炎症、動脈硬化、易 損動脈斑塊或腫瘤。
28、 一種監測哺乳動物響應治療和一個或多個器官或組織或二 者相關的病理學症狀的方法，該方法包括(i)給哺乳動物施用有 效量的一種化合物，該化合物包含偶聯到放射成像部分的肽酶結合 部分，(ii)獲得哺乳動物一個或多個器官或組織或二者的圖像，(iii) 由所述圖像確定存在於所述哺乳動物一個或多個器官或組織或二 者，以及(iv)利用確定的量和對照的量以精確計量哺乳動物對治療 的響應，如果有。
29、 權利要求26所述的方法
30、 權利要求26所述的方法 物的一個或多個器官的基線量。
31、 權利要求28所述的方法量。
32、 權利要求28所述的方法 物的一個或多個器官的基線量。
33、 一種在哺乳動物一個或多個器官或組織或二者屮定呈肽, 表達的方法，該方法包括給哺乳動物施用有效量的一種化合物， 該化合物包含偶聯到放射成像部分的肽酶結合部分；以及獲得哺乳 動物的一個或多個器官或組織或二者的圖像；由所述圖像和一系列 標準圖像在哺乳動物一個或多個器官或組織或二者中定量肽酶表 達。
34、 一種對所需哺乳動物進行放射療法的方法，該方法包括給 哺乳動物施用有效量的一種化合物，該化合物包含偶聯到放射治療，其中所述的對照量是組裡的平均 ，其中所述的對照量是所述哺乳動 ，其屮所述的對照貴是組単.的f-均 ，其屮所述的對照量是所述哺乳動部分的肽酶結合部分。
35、 權利要求34所述的方法，其中所述的化合物是靜脈注射施用。
36、 權利要求34所述的方法，其中所述的哺乳動物患有腫瘤症 狀。
37、 一種具有下式的化合物(PBM) n-(LIN)-(CHE), 其中，PBM含有肽酶結合部分， n為1、 2或3，LIN為共價鍵，-CH廠、-NH-，或碳原子為2-20的線性或支鏈， 並且可選擇的結合到或包含在鏈中的是包括氨基、氧、硫、羰基、 尿素的1-6個雜原子，或為氨基化合物、芳香環、環形脂肪環、雜 芳環，或雜環脂肪環，以及共價連接到螯合部分，該螯合部分可以 是能夠結合放射性核種的單配位基、二配位基或多配位基配位體， 以及m為1、 2或3。
38、 權利要求37所述的化合物，其中所述的肽酶結合部分為羧 肽酶Al、羧肽酶A2、羧肽酶B、柱狀細胞羧肽酶A、羧肽酶D、 羧肽酶E、羧肽酶M、羧肽酶N或羧肽酶Z的抑制劑。
39、 權利要求38所述的化合物，其中所述的肽酶結合部分為阿 拉普利、苯那普利、卡託普利、西羅普利、西拉普利、地拉普利、 依那普利、依那普利拉、福辛普利、米卡普利、賴諾普利、莫西普 利、莫維普利、平託普利、培哚普利、奎那普利、雷米普利、倫唑 普利、螺普利、鹽酸替莫普利、群多普利或左芬普利。
40、 權利要求37所述的化合物，其中所述的連接劑為2-15個 原子的鏈，其中1-6個原子的鏈為氨基、氧、硫、羰基、尿素或氨 基化合物，並且鏈中剩下的原子為碳。
41、 權利要求40所述的化合物，其中所述的連接劑包含賴氨酸 或賴氨酸類似物，如圖6或圖7所示的賴氨酸類似物。
42、 權利要求37所述的化合物，其中所述的放射性核種為鎝或錸。
43、 權利要求37所述的化合物，其中所述的CHE部分為吡啶甲 撐基胺、喹啉亞甲基胺、異喹啉胺、吡啶-2-基甲氨基乙酸、異喹啉 基-3-基甲氨基乙酸、噻唑-2-基甲基胺和噻唑-2-基甲氨基乙酸或下 述結構的螯合物，其中顯示和鎝連接Rh逸自0、 H、 0H烷氧基或0-垸基，R9為藥學上可接受的雜環，如含有1-2個氮、氧或硫原子的5 或6元環，Rs選自0、 H、 0H烷氧基或0-垸基，R9為藥學上可接受的雜環，如含有1-2個氮、氧或硫原子的5 或6元環，Ru)和Ru分別單獨為氫、烷基或取代的烷基； Ru選自烷基、芳基或雜環；Rl:,、 R14、 R1S、 R1S、 Rn、 R18、 R19、 R加單獨為氫或甲基' formula see original document page 7image see original document page 8
全文摘要
本發明公開的偶聯物、方法和試劑盒用於成像表達一種或多種肽酶的組織和器官。在本發明的優選實施例中，一系列二-(2-吡啶甲基)胺(D)配位體，其和M(CO)3+[M＝Tc或Re]結合，並和賴諾普利(L)偶合。利用不同亞甲基基團(3、4、5和7；D(C4)L、D(C5)L、D(C6)L和D(C8)L，分別的)數目的脂肪鏈，隨著亞甲基數目的增加，體外抑制活性也增加。觀察到D(C8)L偶聯物比D(C4)L的功效顯著。在組織分布和射線成像研究中研究了ACE的體內特異性，證實有高ACE含量在組織中定位。定位通過賴諾普利的預治療阻斷。
文檔編號A61K51/00GK101594886SQ200780040385
公開日2009年12月2日 申請日期2007年8月29日 優先權日2006年8月29日
發明者C·芮曼, F·J·費米爾, J·W·巴比奇, W·C·埃克爾曼 申請人:分子製藥洞察公司