天花dna疫苗及其引起免疫應答的抗原的製作方法

2023-06-17 11:11:11

專利名稱：天花dna疫苗及其引起免疫應答的抗原的製作方法
技術領域：
本發明涉及天花病毒共有抗原、編碼所述抗原的核酸質粒和由此製備的產生抗天 花病毒的免疫應答的疫苗、以及利用這些產品保護哺乳動物避免天花病毒的方法。
背景技術：
在上世紀最後25年間，幾乎沒有公眾或者學術界的注意力集中於與天花或者天 花疫苗有關的問題上。但是由於當前生物恐怖主義的相關事件，通過故意釋放從而引起天 花爆發的潛在危脅已成為真正的擔憂。有幾種因素使得天花成為恐怖武器的選擇。天花可 以大量產生，在貯存和運輸時穩定，並且可以以浮粒形式產生，在暴露的未免疫個體中具有 30%的致死率。天花的傳染性很高，10-20個或者更多病例可以歸因於起源自一個被感染個 體。相應地，存在巨大擔憂，即如果在恐怖襲擊中釋放天花，許多美國民眾將有感染、患病和 死亡的危險。應用有限的商業許可天花疫苗是經確認的Dryvax疫苗和Acambis疫苗。該惠氏 (Wyeth)生產的疫苗是來源於小牛淋巴之活牛痘病毒(VACV)的凍幹製備品。惠氏在1983 年停止向公眾發售天花疫苗。Acambis疫苗是適於活組織培養的疫苗儲存液，其仍然對人類 有嚴重不利的影響。過去存在對Dryvax相關風險的擔憂。這些擔憂由於最近臨床研究中的 不利事件而加劇。主要的擔憂是存在大量的免疫受損人群(被HIV感染的個體)並且老年 群體比1970年大很多。此外，在北美生活的孕婦、靜脈注射藥物使用者、移植受體和服用免 疫抑制藥物的個體都是潛在的疫苗受種者，並且其處於原始Dryvax和近期Acambis活疫苗 方案的風險增加。在北美，主要擔心的是無法承受之數量的人可能會由於嚴重的併發症而 入院治療。許多人可能僅死於疫苗，或者在利用天花進行生物恐怖襲擊時，由於對疫苗相關 之健康狀況的擔憂，可能存在部署較慢或者不服從的情況。雖然最近的天花疫苗項目旨在 防禦生物恐怖事件，但是對自然發生之痘病毒疾病的擔憂也在不斷增長，因為具有由VACA 所誘導的免疫的人數已經在減少。西多福韋(Cidofovir)，一種用於治療AIDS患者巨細胞病毒性視網膜炎的許可藥 物，具有抵抗幾乎所有DNA病毒的廣譜活性。最近，西多福韋在小鼠中顯示出抵抗包括天花 和猴痘(MPXV)等多種痘病毒的體外活性和體內活性。如果在暴露後幾天內開始進行藥物 治療，那麼單次劑量的西多福韋即顯示出保護小鼠免受致死呼吸感染以及牛痘的高效性。
但是目前的治療也有其局限性。利用目前儲備的疫苗來應對比二十世紀六十年代 明顯高的併發症率很可能是無效的，因為隨著近期天花病毒的進化，其可能已不符合要求 並且藥效降低。免疫受損或者虛弱的人還有前述安全問題的擔憂。DNA疫苗的可行性被認 為是有潛力的疫苗平臺，但是目前還需要在人體中證明其是成功的。此外，由於天花病毒是 高度複雜的DNA病毒，其編碼超過200種基因，具有兩種感染形式，成熟粒子(MV)和包膜粒 子(EV)均有其自身獨特的膜糖蛋白體系和不同的侵入條件，因此用於研發出有效DNA疫苗 的候選抗原難以確定。仍然需要安全並且有效的現有天花疫苗之替代品。此外，需要耐受性良好、可以提 供廣泛免疫保護並且能夠在生物恐怖威脅時及時大量生產的天花疫苗。

發明內容
本發明的一個方面涉及能夠在哺乳動物中產生抗天花病毒的保護性免疫應答的 DNA疫苗。該DNA疫苗包含至少一種能夠表達多種VACVMV抗原的DNA質粒、以及至少一種 能夠表達多種VACV EV抗原的DNA質粒。優選該DNA疫苗還包含能夠表達A4L抗原的DNA 質粒。本發明的另一個方面涉及在哺乳動物中誘導抗天花病毒的、包括中和抗體應答在內 的保護性免疫應答的方法，包括向所述哺乳動物的組織中注射DNA疫苗，所述疫苗包含至 少一種能夠表達多種VACV MV抗原的DNA質粒、至少一種能夠表達多種VACV EV抗原的DNA 質粒以及能夠表達A4L抗原的DNA質粒。優選該方法還包括利用電穿孔量的電能對所述組 織進行電穿孔的步驟。附圖簡述本領域技術人員以附圖作為參考可以更好地理解本發明的多種目的和優勢，其 中

圖1示出多種天花病毒質粒基產品的表格及其物理和化學特性的總結。圖2示出表達A4L抗原的pGX4001質粒圖譜，其中包括共有序列、經人類密碼子優 化的A4L(編碼如SEQ ID NO. 1所示的DNA序列)。圖3示出表達A27L抗原的pGX4002質粒圖譜，其中包括共有序列、經人類密碼子 優化的A27L(編碼如SEQ ID NO. :3所示的DNA序列)。圖4示出表達B5R抗原的pGX4003質粒圖譜，其中包括共有序列、經人類密碼子優 化的B5R(編碼如SEQ ID NO. 5所示的DNA序列)。圖5示出表達A33R抗原的pGX4004質粒圖譜，其中包括共有序列、經人類密碼子 優化的A33R(編碼如SEQ ID NO. :7所示的DNA序列)。圖6示出表達A56R抗原的pGX4005質粒圖譜，其中包括共有序列、經人類密碼子 優化的A56R(編碼如SEQ ID NO. :9所示的DNA序列)。圖7示出表達F9L抗原的pGX4006質粒圖譜，其中包括共有序列、經人類密碼子優 化的F9L(編碼如SEQ ID NO. :11所示的DNA序列)。圖8示出表達H3L抗原的pGX4007質粒圖譜，其中包括共有序列、經人類密碼子優 化的H3L(編碼如SEQ ID NO. :13所示的DNA序列)。圖9示出表達LlR抗原的pGX4008質粒圖譜，其中包括共有序列、經人類密碼子優 化的LlR(編碼如SEQ ID NO. :15所示的DNA序列)。
圖10示出在兔中進行預試驗的事件時間軸。圖11示出3個不同組的兔中B5R抗體應答的柱形圖。圖12示出3個不同組的兔中H3L抗體應答的柱形圖。圖13示出3個不同組的兔中A27L抗體應答的柱形圖。圖14示出3個不同組的兔中LlR抗體應答的柱形圖。圖15示出在食蟹猴(cynomolgus macaques)(非人靈長類動物)中進行預試驗的 事件時間軸。圖16示出3組靈長類動物ELISpot結果的柱形圖。圖17示出在兔中進行皮內(ID)或者肌內(IM)抗原注射之比較性研究的事件時 間軸。圖18示出對A至J組中每隻兔給予多種質粒的電穿孔和遞送條件的表格。圖19示出在多種IM或者ID情況下抗體效價(HA抗原)的柱形圖。圖20示出在多種IM或者ID情況下抗體效價(B5R抗原)的柱形圖。圖21示出在多種IM或者ID情況下抗體效價(A27L抗原)的柱形圖。圖22示出兔IM或者ID疫苗接種方案的時間軸。圖23示出對A至J組中每隻兔給予多種質粒的電穿孔和遞送條件的表格。圖M示出多組兔中A27L抗原之抗體應答的柱形圖。圖25示出多組兔中B5R抗原之抗體應答的柱形圖。圖沈示出多組兔中A4L抗原之抗體應答的柱形圖。圖27示出多組兔中H3L抗原之抗體應答的柱形圖。圖28示出多組兔中A33R抗原之抗體應答的柱形圖。圖四示出多組兔中LlR抗原之抗體應答的柱形圖。圖30示出第42天4種質粒的組合物抗A27L抗原之終點ELISA曲線的線形圖。圖31示出第42天8種質粒的組合物抗A27L抗原之終點ELISA曲線的線形圖。圖32示出第84天4種質粒的組合物抗A27L抗原之終點ELISA曲線的線形圖。圖33示出第84天8種質粒的組合物抗A27L抗原之終點ELISA曲線的線形圖。圖34每次接種中ID和IM遞送後的增強型抗體和細胞應答。在第0J8和56天 對食蟹猴進行接種圖3 示出每種抗原相對於pVAXl對照組之抗體應答的柱形圖；圖34b 示出每次接種中ID和IM遞送後細胞應答的柱形圖(每次接種後從經免疫的食蟹猴個體中 分離PBMC並將其集中。用每種抗原的肽庫刺激PBMC，隨後進行IFN- y ELISPOT試驗)。圖3 示出攻擊後經接種的食蟹猴中病毒血症水平的圖。利用定量TaqMan3』-小 溝結合物(minor groove binder) PCR對每毫升血液中猴痘病毒基因組量進行測定。檢測 的較低限值是5000基因組/毫升血液。示出平均值和士S. Ε. M.。圖35bl示出所示組中一隻猴的手和軀體痘瘡的圖。圖35 示出痘瘡總量的柱形圖，以顯示靜脈攻擊猴痘病毒後痘瘡的發展情況。圖36示出攻擊前和攻擊後經接種的食蟹猴中抗VACV結合抗體的終點效價的圖。 終點效價以具有陽性活性>陰性對照血清平均O.D.值加上3倍S. D.之血清最大稀釋度的 倒數表示。> V表示接種天數；C表示攻擊日。圖37示出猴痘病毒攻擊前和攻擊後中和抗體應答的圖。所示為每個受試組的PRNT50中和抗體效價。V表示接種天數；C表示攻擊天數。圖38示出VACV中和抗體效價與痘瘡最大數量的Spearman等級相關性的圖。圖39示出免疫後抗原特異性T細胞功能的圖。第3次免疫後2周時分離PBMC並 用A27或者B5總肽庫的混合物於體外刺激5小時。對細胞進行染色，以觀察IFN y、TNF α 和IL-2的產生以及CD107a的脫顆粒作用。還檢測了 CD4+(圖39a)和CD8+細胞(圖39b) 的功能性表型。堆疊式柱形圖顯示每個免疫組對A27(灰色)和B5(黑色)之所有功能性 應答的平均數值。圖40示出⑶4+和⑶8+細胞增殖能力的圖。於第3次免疫後4周時分離的新鮮 PBMC用CFSE染色，並用抗原特異性肽於體外刺激5天，以測定抗原特異性(圖40a) CD4+和 (圖40b)⑶8+T細胞的增殖能力。結果以堆疊式組顯示為平均應答士SEM。由於預免疫樣 品中的背景應答很高，對A4L的應答未顯示。發明詳述提供了下列縮寫的或者簡略的定義，用以幫助理解本發明的優選實施方案。此處 所提供的縮寫定義並不完全，也不與本領域所理解的定義或者工具書中的意義相矛盾。此 處提供縮寫定義是為了補充或者更清楚地限定本領域已知的定義。定義本文使用的術語「核酸質粒」是指包含編碼蛋白之核苷酸序列的DNA或者RNA分 子。編碼序列或者「編碼核酸序列」可以包括與調控元件可操作性地連接的起始信號和終 止信號，所述調控元件包括能夠在施用核酸分子的個體細胞中指導表達的啟動子和多聚腺 苷酸信號。本文使用的術語「可表達形式」是指包含與編碼序列(其編碼蛋白)可操作性地 連接之必需調控元件的核酸質粒，當其存在於個體細胞中時，編碼序列將會表達。 本文使用術語「恆定電流」來定義在傳遞至組織的電脈衝持續時間內，由所述組織 或者限定所述組織的細胞接受或者經受的電流。電脈衝從本文所描述的電穿孔設備中發 出並用於本文所描述的質粒和疫苗。該電流在電脈衝周期內於所述組織中保持恆定的電流 強度，因為本文所提供的電穿孔設備具有反饋元件，優選能夠瞬時反饋。該反饋元件可以測 定脈衝持續時間內組織(或者細胞)的電阻並使電穿孔設備改變其電能輸出(例如增加電 壓)，因而使相同組織中的電流在電脈衝內(微秒級)和脈間保持恆定。在一些實施方案 中，該反饋元件包括控制器。術語「反饋」或者「電流反饋」互換使用，是指所提供的電穿孔設備的積極響應，其 包括測定電極間組織中的電流以及為了保持電流處於恆定水平而相應地改變EP設備的能 量輸出。所述恆定水平在脈衝序列或者電處理開始前由使用者預設。優選由電穿孔設備的 電穿孔組件(例如控制器)進行反饋，因為其中的電路能夠持續監測電極間組織中的電流， 將所監測的電流(或者組織中的電流)與預設電流相比較並且能夠持續調節能量輸出以保 持所監測的電流處於預設水平。在一些實施方案中，反饋環路是瞬時的，因為其是模似閉環 反饋。術語「電穿孔」、「電通透」或者「電動力強化」(「EP」)在本文中互換使用，是指利 用跨膜電場脈衝來誘導生物膜中的微觀途徑(孔)；其存在使得生物分子(例如質粒、寡核 苷酸、siRNA)、藥物、離子和/或水能夠穿過細胞膜的一面至另一面。
本文使用術語「分散電流」來定義由本文所描述之電穿孔設備的多個針電極陣列 所發出的電流形式，其中該形式使得經電穿孔之組織的任何區域上出現電穿孔相關之熱應 力的機率最小化或者優選使其消除。本文使用的術語「反饋機制」是指由軟體或者硬體(或者固件)進行的過程，其接 收目標組織的電阻抗(在發出能量脈衝之間、期間和/或之後)，將其與現有數值(優選電 流值)相比較，並且調整所發出的能量脈衝以達到預設值。在一個優選的實施方案中，「反 饋機制」由模擬閉環電路進行。本文使用的術語「佐劑」是指添加到本文所描述的DNA疫苗中的任何分子，用以增 強由DNA質粒和下文所描述之核酸序列編碼的VACV抗原的抗原性。本文使用的術語「保護性免疫應答」是指抗體應答和細胞免疫應答的組合，優選由 免疫本文所描述的DNA疫苗而引起的中和抗體應答。術語「共有」或者「共有序列，，或者「共有抗原」互換使用以描述本發明的優選抗 原，其是指基於特定病毒的現代分離株而產生的合成序列。該共有序列可能在基因上比任 何特定的天然病毒分離株更接近於當前流行的病毒株。但是，由於全球測序一般是利用慢 性感染期取樣的病毒而非急性感染期取樣的病毒進行，因此針對大多數情況下已經逃避的 表位進行開發共有疫苗應答可能是不利的。為了使這種不利最小化，疫苗設計的一個有益 方案是將早期遞質序列考慮在內。共有序列成為了使疾苗株和當前流行的病毒之間序列差 異度最小化的一種有效方法，即製備這些病毒核心的人工序列。一個設計方案是利用共有 序列，其來源於序列比對中每個位置最常見的胺基酸。該共有序列可以隨後刺激產生廣譜 的免疫應答，用以抵抗多種天然病毒分離株以及在任何天然病毒中未發現的多態型。本發明的一個方法包括能夠在哺乳動物中產生抗痘病毒的保護性免疫應答的DNA 疫苗。優選所述痘病毒是天花病毒。該DNA疫苗包含至少一種能夠表達多種VACV MV抗原 的DNA質粒、以及至少一種能夠表達多種VACV EV抗原的DNA質粒。優選該DNA疫苗還包 含一種能夠表達A4L抗原的質粒。所述抗原均可以由單個DNA質粒(包含多個編碼序列) 或者不同的DNA質粒表達。優選不同的抗原均將由不同的DNA質粒表達。VACV MV抗原包 括A27L、F9L、H3L或者L1R，而VACV EV抗原包括A33R、A56R或者B5R。優選DNA質粒均 包含編碼所述抗原的共有DNA序列。編碼VACV MV抗原的共有DNA序列包括SEQ ID NO 3(A27L)、SEQ ID NO 11 (F9L)、SEQ ID NO :13(H3L)或者 SEQ ID NO: 15 (LlR)。編碼 VACV EV 抗原的共有 DNA 序列包括SEQ ID NO :5 (B5R)、SEQ ID NO :7(A33R)或者 SEQ ID NO: 9(A56R)。編碼A4L的共有DNA序列包括SEQ ID NO :1。在一些實施方案中，能夠表達多 種VACV MV抗原的DNA質粒包含編碼包含序列SEQ ID NO :4(A27L)、SEQ ID NO :12(F9L)、 SEQ ID NO :14 (H3L)或者SEQ ID NO 16 (LlR)的蛋白的編碼序列，能夠表達多種VACV MV抗 原的DNA質粒包含編碼包含序列SEQID NO 6 (B5R)、SEQ ID NO :8(A33R)或者SEQ ID NO 10 (A56R)的蛋白的編碼序列，以及能夠表達A4L抗原的DNA質粒包含編碼具有序列SEQ ID NO 2的蛋白的編碼序列。優選DNA疫苗包含多個不同的DNA質粒，所述質粒分別包含SEQ ID NO 1 (A4L)、SEQ ID NO :3 (A27L)、SEQ ID NO :5 (B5R)、SEQ ID NO :7 (A33R)、SEQ ID N0: 9(A56R)、SEQ ID NO 11 (F9L)、SEQ ID NO :13(H3L)以及 SEQ ID NO 15 (LlR)的編碼 DNA 序列。在另一個優選的實施方案中，DNA疫苗包含多個不同的DNA質粒，所述質粒分別包 含編碼具有序歹Ij SEQ ID NO :2(A4L)、SEQID NO :4(A27L)、SEQ ID NO :6(B5R)、SEQ ID NO 8(A33R)、SEQ IDNO 10 (A56R)、SEQ ID NO 12 (F9L)、SEQ ID NO :14(H3L)以及 SEQ ID NO: 16 (LlR)的蛋白的編碼DNA序列。在一些優選的實施方案中，共有編碼序列是經人類密碼子 優化的。在另一個優選的實施方案中，DNA疫苗包含DNA質粒pGX4001、pGX4002、pGX4003、 PGX4004、pGX4005、pGX4006、pGX4007 或者 pGX4008、或其組合。本發明的另一個方面涉及在哺乳動物中誘導抗痘病毒的、包括中和抗體應答在內 的保護性免疫應答的方法，包括向所述哺乳動物的組織中注射DNA疫苗，所述疫苗包含至 少一種能夠表達多種VACV MV抗原的DNA質粒、至少一種能夠表達多種VACV EV抗原的DNA 質粒以及能夠表達A4L抗原的DNA質粒。優選所述痘病毒是天花病毒。在優選的實施方案 中，注射步驟包括皮內注射或者肌內注射。誘導保護性免疫應答的方法還可以包括利用電 穿孔量的電能對所述組織進行電穿孔的步驟。優選電穿孔步驟包括向所述組織遞送恆定電 流。更優選電穿孔步驟包括遞送0.2A的電流。在一些實施方案中，誘導保護性免疫應答的 方法包括重複所述注射步驟。在一個優選的實施方案中，遞送步驟包括遞送8種不同的DNA 質粒。本文所描述的DNA疫苗利用具有高濃度DNA的DNA質粒製劑來配製。高濃度 DNA可以是濃度為5mg/mL或者更多、6mg/mL或者更多、7mg/mL或者更多、8mg/mL或者更 多、9mg/mL或者更多、10mg/mL或者更多、1 lmg/mL或者更多、12mg/mL或者更多、13mg/mL 或者更多、Hmg/mL或者更多、15mg/mL或者更多。在一些實施方案中，質粒DNA可以是 濃度為 5-15mg/mL、5-14mg/mL、5-13mg/mL、5-12mg/mL、5-llmg/mL、5-10mg/mL、5-9mg/mL、 5_8mg/mL,濃度為 6-15mg/mL、6-14mg/mL、6-13mg/mL、6-12mg/mL、6-llmg/mL、6-10mg/mL、
6-9mg/mL、6-8mg/mL，濃度為7-15mg/mL、7-14mg/mL、7-13mg/mL、7-12mg/mL、7-llmg/mL、
7-10mg/mL、7-9mg/mL、8-15mg/mL、8-14mg/mL、8-13mg/mL、8-12mg/mL、8-llmg/mL、8-10mg/ mL、9-15mg/mL、9-14mg/mL、9-13mg/mL、9-12mg/mL、9-1lmg/mL、10-15mg/mL、10-14mg/mL、 10-13mg/mL、10-12mg/mL、11-15mg/mL、11-14mg/mL、11-13mg/mL、12-15mg/mL、12-14mg/mL 或者13-15mg/mL。利用高濃度DNA質粒製劑配製DNA疫苗時，多種不同DNA質粒的混合物中 可以在混合的同時保持每種DNA質粒的高劑量。在一些實施方案中每種不同的DNA質粒以 高劑量存在，所述劑量是大於50 μ g、大於60 μ g、大於70 μ g、大於80 μ g、大於90 μ g、大於 100 μ g、大於 110 μ g、大於 120 μ g、大於 130 μ g、大於 140 μ g、大於 150 μ g、大於 160 μ g、大 於 170 μ g、大於 180 μ g、大於 190 μ g、大於 200 μ g、大於 210 μ g、大於 220 μ g、大於 230 μ g、 大於240 μ g或者大於250 μ g。優選高劑量是大於120 μ g，更優選是大於125 μ g。在一個 優選的實施方案中，DNA病毒包括劑量是125 μ g的DNA質粒。在本發明的一些實施方案中，DNA疫苗還可以包含佐劑。在一些實施方案中，所 述佐劑選自由下列物質組成的組α-幹擾素、Y-幹擾素、血小板衍生生長因子(PDGF)、 TNFa、TNFi3、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK)、上皮性胸 腺表達趨化因子(TECK)、黏膜相關上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL-15、IL-28、MHC、CD80、 CD86、信號序列缺失以及可選地包括IgE信號肽的IL15。可用作佐劑的其他基因包括編碼 下列物質的基因MCP-1、MIP-1 a、MIP_lp、IL_8、RANTES、L_選擇素、P_選擇素、E-選擇素、 CD34、G1yCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、ρ150. 95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、 CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-l、IL-8的突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-l、p55、WSL-l、 DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF, DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、Caspase ICE、Fos、c-jun、Sp-l、Ap-l、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、Inactive NIK、 SAP 1(、5六卩-1、了離、幹擾素應答基因、咿1^、831、11^11^11^11^6(；、11^11^6。01^5、11^11^-1 3、 TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、 NKG2E、NKG2F、TAPU TAP2及其功能性片段。在一些優選的實施方案中，佐劑選自IL-8、 IL-12、IL-15、IL-18、IL-28、MCP-U MIP-U MIP-lp、RANTES, RANK、RANK LIGAND、0x40、 0x40LIGAND、CTACK, TECK 或者 MEC、或其組合。更優選佐劑是 IL-12、IL-15、IL-28 或者 RANTES0痘病毒是痘病毒科中高度複雜的病毒，其包括VACV和天花病毒(天花)。已知4種 痘病毒屬可以感染人類，包括正痘屬、副痘屬、yatapox和molluscipox。原痘屬天花病毒、 vaccinia病毒、牛痘病毒、猴痘病毒、天花病毒(已滅絕)；副痘屬羊痘病毒、偽牛痘病毒、 牛丘疹性口炎病毒；Yatapox 塔納痘病毒、雅巴猴腫瘤病毒；Molluscipox 傳染性軟疣病 毒(MCV)。其他痘病毒包括正痘病毒屬例如駱駝痘病毒、牛痘病毒、小鼠痘病毒、猴痘病毒、 浣熊痘病毒、臭釉痘病毒、大沙鼠痘病毒、fesinGishu病毒、variola病毒、Vol印ox病毒， 副痘病毒屬例如Ausdyk病毒、牛丘疹性口炎病毒、羊痘病毒、偽牛痘病毒、赤鹿病毒、海豹 副痘病毒，羊痘病毒屬例如綿羊痘病毒、山羊痘病毒、疙瘩皮膚病病毒(Iumpyskinvirus)， 豬痘病毒屬例如豬痘病毒，兔痘病毒屬例如粘液瘤病毒、纖維瘤病毒、野兔纖維瘤病毒、松 鼠纖維瘤病毒、西部松鼠纖維瘤病毒，禽痘病毒屬的多個種，Yatapoxvirus例如Tantpox病 毒、Yabapoxvirus，Mulluscipoxvirus例如傳染性軟疣病毒、macropox痘病毒、鱷魚痘病毒 以及其他。除了本文所描述的DNA疫苗對天花病毒的高度交叉反應性(廣譜性保護)以外， 由於痘病毒之間存在高度的一致性，可以預期本發明的DNA病毒還將提供不同痘病毒之間 的交叉保護。施用途徑包括但不限於肌內、鼻內、腹膜內、皮內、皮下、靜脈、動脈、眼內和口服、 以及局部、透過表皮、吸入或者栓劑或者至黏膜組織(例如通過灌注至陰道、直腸、尿道、面 頰和舌下組織)。優選施用途徑包括肌內、腹膜內、皮內和皮下注射。基因質粒的施用方法 包括但不限於傳統注射器、無針注射設備、「微粒轟擊基因槍」或者其他物理學方法，例如電 穿孔(「EP」)、「流體動力學方法」或者超聲波。電穿孔設備和優選用於遞送本發明之DNA疫苗的電穿孔方法的示例包括 Draghia-Akli等的美國專利No. 7，245, 963和Smith等提交的公開號為2005/005^30的美 國專利中所描述的，因此其內容以引用的方式整體併入本文。還優選共同未決申請且共同 擁有的美國專利申請序列No. 11/874072中所描述的電穿孔設備和用於遞送DNA疫苗的電 穿孔方法，該申請於2007年10月17日遞交，根據35U. S.C. § 119 (e)，其要求享有2006年 10月17遞交的美國臨時申請序列No. 60/852，149和2007年10月10日遞交的60/978，982 的優先權，所有這些均以引用的方式整體併入本文。下述是本發明優選實施方案的實例，其在上述參考專利中描述得更為詳細電穿 孔設備可以被配置成能夠遞送能量脈衝至哺乳動物的目標組織，產生與使用者預設電流接 近的恆定電流。電穿孔設備包括電穿孔組件和電極裝置或者把手裝置。所述電穿孔組件可 以包括和包含一個或者多個不同的電穿孔設備元件，包括控制器、電流波形發生器、電阻抗檢測器、波形記錄器、輸入元件、狀況報告元件、通訊埠、記憶元件、電源和電源開關。電 穿孔組件可以具有電穿孔設備之一個元件的功能，其他元件是與電穿孔組件通訊的分離元 件(或者組件)。在一些實施方案中，電穿孔組件可以具有電穿孔設備之多於一個元件的功 能，其可以與與電穿孔組件分離的其他電穿孔設備元件通訊。本發明不限於作為電機或者 機械設備的部分而存在的電穿孔設備元件，因為元件可以具有一個設備或者與另一個元件 通訊之分離元件的作用。電穿孔組件能夠遞送在目標組織中產生恆定電流的電能脈衝，並 且包括反饋機制。電極裝置包括具有空間排列之多個電極的電極陣列，其中電極裝置接收 從電穿孔組件發出的能量脈衝，並通過電極將其遞送至目標組織。在能量脈衝遞送過程中， 多個電極中的至少一個是中央電極，其測定目標組織的電阻抗並且將電阻抗傳送至電穿孔 組件。反饋機制可以接收所測得的電阻抗並且能夠調整電穿孔組件所遞送的能量脈衝，以 保持恆定電流。在一些實施方案中，多個電極可以以分散方式遞送電能脈衝。在一些實施方案中， 多個電極可以通過電極的程式化序列控制以分散方式遞送電能脈衝，所述程式化序列由使 用者輸入至電穿孔組件中。在一些實施方案中，程式化序列包括以序列遞送的多個脈衝，其 中多個脈衝中的每個脈衝由至少兩個有源電極以及一個測定電阻抗的中央電極遞送，其中 多個脈衝中的後續脈衝由至少兩個有源電極中的另外一個以及一個測定電阻抗的中央電 極遞送。在一些實施方案中，反饋機制由硬體或者軟體進行。優選反饋機制由模擬閉環電 路進行。優選所述反饋每50 μ s、20 μ S、10 μ s或者1 μ s發生一次，但是優選是實時反饋或 者瞬時反饋(例如通過利用合適的技術測定響應時間從而確定其基本是瞬時的)。在一些 實施方案中，中央電極測定目標組織中的電阻抗並將其傳送至反饋機制，反饋機制響應於 電阻抗並調整能量脈衝，以保持數值與預設電流接近的恆定電流。在一些實施方案中，反饋 機制在能量脈衝遞送過程中持續地和瞬時地保持恆定電流。藥學上可接受的賦形劑可以包括例如媒介、輔料、載體或者稀釋劑的功能性分 子，其是公眾已知並且可獲得的。優選藥學上可接受的賦形劑是一種輔料或者轉染促進 劑。在一些實施方案中，核酸分子或者DNA質粒與寡核苷酸功能增強子或者基因疫苗促進 劑(或者轉染促進劑)一起遞送至細胞中。寡核苷酸功能增強子描述於美國專利序列號 5，593，972、5，962，428和1994年1月26日遞交的國際申請序列號PCT/US94/00899中， 其併入本文作為參考。基因疫苗促進劑描述於1994年4月1日遞交的美國專利序列號 021，579中，其通過引用的方式併入本文。轉染促進劑可以以與核酸分子混合物的方式與核 酸分子一起施用，或者在核酸分子施用前或者施用後單獨或同時施用。轉染促進劑的示例 包括表面活性劑(例如免疫刺激複合物(ISCOMQ)、Freunds不完全佐劑、LPS類似物(包 括單磷酸類脂A、胞壁肽)、醌類似物和媒介(例如鯊烯)，透明質酸也可以與基因質粒一起 施用。在一些實施方案中，DNA質粒疫苗還可以包括一種轉染促進劑，例如脂類、脂質體(包 括卵磷脂脂質體或者本領域已知的其他脂質體，以DNA-脂質體混合物的形式(例如參見 WO 93M640))、鈣離子、病毒蛋白、多聚陰離子、多聚陽離子或者納米顆粒，或者其他已知的 轉染促進劑。優選轉染促進劑是多聚陰離子、多聚陽離子(包括多聚L-穀氨酸(LGQ)或 者脂類。 在一些優選的實施方案中，DNA質粒與佐劑一起遞送，所述佐劑是編碼進一步增強抗靶蛋白免疫應答的蛋白的基因。該基因的實例是編碼其他細胞因子和淋巴因子的基因， 所述因子例如α -幹擾素、Y-幹擾素、血小板衍生生長因子(PDGF) ,TNFa、TNFi3、GM_CSF、 表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL_18、MHC、CD80、CD86 和 IL-15(包括信號序列缺失以及可選地包含IgE信號肽的ILK)。可用的其他基因包括編碼 下列物質的基因MCP-1、MIP-I a、MIP_lp、IL_8、RANTES、L-選擇素、P-選擇素、E-選擇素、 CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-I、VLA-UMac-I、ρ150· 95、PECAM、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3、 CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、成纖維細胞 生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-l、p55、WSL-l、 DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF, DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、Caspase ICE、Fos、c-jun、Sp-l、Ap-l、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、Inactive NIK、 SAP K、SAP-I、JNK、幹擾素應答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、 TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、 NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2 及其功能性片段。根據本發明的DNA質粒疫苗所包含的DNA量是從大約1微克至大約10毫克、大約 10微克至大約10毫克、大約100微克至大約10毫克、大約200微克至大約10毫克、大約 300微克至大約10毫克、大約400微克至大約10毫克、大約500微克至大約10毫克、大約 1微克至大約1毫克、大約10微克至大約1毫克、大約100微克至大約1毫克、大約200微 克至大約1毫克、大約300微克至大約1毫克、大約400微克至大約1毫克、大約500微克 至大約1毫克、大約100微克至大約1毫克、大約200微克至大約1毫克、大約300微克至 大約1毫克、大約400微克至大約1毫克或者大約500微克至大約1毫克。優選疫苗中的 DNA量是從大約100微克至大約1毫克。根據本發明的DNA質粒疫苗依照所使用的施用形式而製備。當DNA質粒疫苗是可 注射的組合物時，其是無菌的和/或無致熱原的和/或無微粒的。優選使用等滲製劑。一 般來說，用於等滲的添加劑可以包括氯化鈉、右旋葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些 情況下，優選例如磷酸緩衝液的等滲溶液。穩定劑包括凝膠和白蛋白。在一些實施方案中， 向製劑中添加血管收縮劑。在一些實施方案中，向製劑中加入使製劑於室溫或者環境溫度 中在較長時間內保持穩定的穩定劑，例如LGS或者其他多聚陽離子或者多聚陰離子。在一些實施方案中，在哺乳動物中弓丨起抗共有天花病毒抗原的免疫應答的方法包 括誘導黏膜免疫應答的方法。所述方法包括對哺乳動物施用CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC 蛋白以及其功能性片段或者其可表達的編碼序列中的一種或者多種，同時施用包括上述共 有天花病毒抗原的DNA質粒。CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白以及其功能性片段中的一種 或者多種可以在施用本文所提供的DNA質粒天花疫苗之前、同時或者之後施用。在一些實 施方案中，對哺乳動物施用一種核酸分子，其編碼一種或者多種選自由下列物質組成的組 CTACK, TEK、MEC及其功能性片段。
實施例本發明在下列實施例中進一步闡述。應當理解，當描述本發明優選的實施方案時， 這些實施例僅僅是舉例說明。從上面的討論和這些實施例中，本領域技術人員可以確定本 發明的基本特性，並且在不偏離其精神和範圍的前提下可以對本發明進行多種變化和修飾，以使其適於多種用途和情形。因此，除本文所示和所描述的之外，從上面的描述中，本發 明的多種修飾對於本領域技術人員來說將是清楚的。這些修飾也落入所附權利要求的範圍 內。優選本文所描述的肌肉或者皮膚EP設備中所用的DNA製劑具有高濃度DNA，優選 濃度是在向皮膚遞送的最佳小體積(優選小注射體積，優選25-200微升(μ L))中包含微 克至幾十毫克量的DNA，優選毫克量的DNA。在一些實施方案中，DNA製劑具有高濃度DNA， 例如lmg/mL或者更多(mg DNA/體積製劑)。更優選DNA製劑中的DNA濃度是200 μ L配方 中提供公克量的DNA，更優選100 μ L配方中提供公克量的DNA。本發明的EP設備中所用的DNA質粒可以利用已知設備和技術的組合來製備或者 生產，但是優選其利用經優化的質粒製備技術來製備，所述技術描述於2007年5月23日 遞交的共同擁有且共同未決的美國臨時申請美國序列No. 60/939，792中。在一些實施例 中，研究中所用的DNA質粒可以製備為濃度大於或者等於10mg/mL。製備技術還包括或者 包含本領域普通技術人員通常已知的多種設備和步驟，以及美國序列No. 60/939792中所 描述的，包括2007年7月3日公布的共有專利美國專利No. 7，238，522中所描述的。本文 所描述的皮膚EP設備和遞送技術中所用的高濃度質粒使得可以在合理小的體積中向ID/ SC空間內施用質粒，並且有助於增強表達和免疫的效果。共有申請和專利，即美國序列 No. 60/939，792和美國專利No. 7，238，522分別通過引用的方式整體併入。方法下列方法用於以下實施例中，其可應用於實施例中並且特定實施例中未提供另外 的特定方法。DNA 表達質粒的克隆。VACV 基因、A4L、A27L、A33R、A56R、B5R、F9L、H3L 以及 LlR (來 源於Western Reserve株)由合成的寡核苷酸化學合成，經人類密碼子優化並修飾，以使其 在DNA序列的5，端包含Kozak共有序列和IgE前導序列並且3，端包含HA表位標籤。利 用常規克隆技術由GENEART(Burlingame，CA)將每個經修飾的基因盒克隆到真核表達質粒 pVAXl (Invitrogen,Carlsbad,CA)中。每個基因的表達由CMV啟動子調控。合成的A4L和 B5R基因盒克隆到HindIII和BioI位點中，以分別製備表達質粒pGX4001和pGX4003。為 了製備A33R的表達質粒(pGX4004)和A56R的表達質粒(pGX4005)，合成的基因盒克隆到 HindIII和XbaI限制性位點中。pGX4007和pGX4008通過將合成的H3L和LlR基因克隆到 HindIII和BamHI限制性位點中製備。其餘的表達質粒pGX4006和pGX4002通過將合成的 A27L和F9L基因盒分別克隆到KpnIAhoI和EcoRIAbaI限制性位點中製備。克隆後，所有 抗原通過測序驗證。疫苗的製備和免疫。利用Hebel等在US7，238，522中所描述並且經改進的生產 步驟來製備高濃度質粒並且純化。該方法能夠產生無內毒素10EU/mg)並且質粒濃度 非常高的質粒製劑，適用於疫苗的生物製藥學遞送。所有的質粒製備品均在無菌水中用經 HPLC純化的低分子量多聚L-穀氨酸(LGS，平均分子量10，900)以重量/重量配製和制 備。使所有的質粒(PGX4001至pGX4008)組合來製備單個疫苗製備品，其中用於ID施用的 0. ImL總體積中或者用於IM施用的0. 5mL總體積中含有每種質粒125 μ g。用鹽酸克他命(10-30mg/kg)對動物進行肌內麻醉。對大腿部施用疫苗(每個大 腿ι個注射位點，施用ι支疫苗)並且通過ID或者IM以及利用CELLEGTRA 2000設備(批准用於人類的設備；VGX Pharmaceuticals,Blue Bell,PA)進行EP以遞送至半膜肌 中。注射後立即利用恆定電流0. 2A、脈寬52ms和脈間Is的2X2脈衝進行ID施用，以及恆 定電流0. 5A、脈寬52ms和脈間Is的3次脈衝進行IM施用。在第1、觀和56天進行免疫， 並在免疫日收集血清以測定抗體應答。樣品收集和PBMC分離。接種期間每2周和攻擊後每3周對食蟹猴進行採血。 用鹽酸克他命(10-30mg/kg)對動物進行肌內麻醉。血液收集於EDTA管中。利用標準 Ficoll-Hypaque密度梯度離心從全血中分離PBMCs，重懸於完全培養基(含有2mM L-谷 氨醯胺的RPMI1640中添加10%熱滅活FBS、100IU/ml青黴素、100μ g/ml鏈黴素和55 μ M β-疏基乙醇)中。用於抗原特異性ELISA之抗原的製備。利用含有合適的限制性酶切位點的基因特 異性引物從VACV的Wfestern Reserve株中PCR擴增得到每種抗原的開放讀碼框，並將其 克隆到原核表達載體pEt219a(+) (EMDChemicals, Gibbstown, NJ)中。3』端寡核苷酸設計 為可以與pEt219a(+)中的6X組氨酸標籤融合。蛋白利用標準的鎳柱純化方法(Abgent， Inc.，San Diego, CA)進行純化。抗原特異性ELISA。為了測定IgG抗體應答，通過將50ng稀釋於PBS中的經純化 抗原(A4L、A27L、A33R、A56R、B5R、F9L、H3L 或者 LlR)覆蓋於 MaxiSorp Immuno 96 孔板 (Nunc, Rochester, NY)上，進行 ELISA。於 4°C孵育過夜後，用添加了 0. 05% Tween 20 的 PBS(PBS-T)清洗板，隨後用添加了 3% BSA的PBS於室溫封閉1小時。從食蟹猴個體中收 集的血清用添加了 0. 5% BSA和0. 05% Tween 20的PBS稀釋，並與50 μ L經稀釋的血清 於4°C孵育過夜。孔用PBS-T清洗，並隨後與HRP偶聯的並且以1 10，000稀釋於添加了 0.5% BSA和0.05% Tween 20之PBS中的第二抗體羊抗兔IgG (100 μ L/孔)孵育。孔於室 溫孵育1小時並清洗。依照廠商建議(KPL，fetitherSburg，MD)向每孔中加入TMB底物和終 止液。利用Lumistar feilaxy板讀取儀(BMG Labtech)在450nm下測定吸光度。終點效 價以所產生的陽性活性大於陰性對照血清兩倍的血清最大稀釋度的倒數表示。VACA ELISA。經多聚甲醛固定和經蔗糖濃度梯度離心純化的VSCVWR株(Advanced Biotechnologies, Inc.)以0. 6 μ g/mL的濃度覆蓋於微量滴定板上，並於4°C孵育過夜。滴 定板用添加了 5%脫脂奶粉的PBS-T(PBS-TM)於37°C封閉2小時。用PBS-T清洗孔8次， 並且與猴血清的系列稀釋液於37°C孵育2小時。清洗後，細胞與第二抗體即辣根過氧化物 酶偶聯的羊抗猴IgG(KPL)和ABTS底物(Sigma-Aldrich)孵育。加入IOOyL的10% SDS 使反應停止，並利用 Molecular Devices SpectraMax Plus384 在 405nm 下讀數。終點效價以所產生的陽性活性>陰性對照血清平均0. D.值加上3倍S. D.的血清 最大稀釋度的倒數表示。合成的肽。研究中所用的肽來源於VACV WR株A4L、A27L、A33R、A56R、B5R、F9L、 H3L和LlR的編碼區。合成A4L、A27L、A33R、A56R、B5R、F9L、H3L和LlR的總抗原肽文庫。 所有的肽均為15肽，其中有9個胺基酸(對於A27L來說)、11個胺基酸(對於A4L、A33R、 A56R、F9L、H3L和LlR來說)或者6個胺基酸(對於B5R來說)是重疊的。A27L文庫由 hvitrogen 製備。所有其他的文庫由 GeMcript Corporation(Piscataway,NJ)製備。肽 文庫製備為相應的肽庫，其在DMSO中的濃度為10mg/mL。
IFN-γ ELISP0T試驗。進行了非人靈長類動物的ELISpot試驗(參見Boyer， J. D.等.J. Med. Primatol. 34，262-270 (2005))。通過用含有肽的孔中的空斑數量減去陰性 對照孔中的空斑數量，測定抗原特異性應答。結果以3個孔的平均值(空斑/百萬個脾細 胞)表示。羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)的偶聯和PBMCs的流式細胞分析。細胞沉澱 後，用以1 2000稀釋於PBS中的Iml羧基螢光素乙醯乙酸琥珀醯亞胺酯(CFDA-SE) (Molecular Probes, Eugene, OR)重懸。細胞於37°C孵育10分鐘。細胞用完全培養基清 洗，重懸至濃度為1 X IO6個細胞/100 μ L，並且置於含有100 μ L總肽庫的96孔圓底板中。 5 μ g/ml ConcavalinA(陽性)和完全培養基(陰性)用作對照。培養基孵育5天。細胞首 先用Vivid紫色染料(活/死細胞標記物)於37°C染色10分鐘。細胞用PBS清洗一次，隨 後用人 CD3-APC Cy7 抗體(SP34-2 克隆)(BD Pharmingen)、人 CD4_PerCP Cy5. 5 (L200 克 隆)、人⑶8-APC抗體(SKl克隆)於4°C染色1小時。細胞隨後用PBS清洗2次，並用
多聚甲醛固定。利用LSRII流式細胞儀(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)收集數據。 流式細胞數據用Flowjo軟體(Tree Star，Ashland，OR)分析，以CD3+淋巴細胞設門。由於 預免疫樣品中的背景應答很高，對A4L的應答未顯示。細胞內細胞因子染色。抗體試劑直接偶聯的抗體得自下列出處 BDBiosciences(San Jose, CA) :IL-2(PE), CD3 (APC Cy7), CD8 (APC)，IFN-y (Alexa Fluor 700)，以及 TNF- α (ΡΕ Cy7)，CD95 (ΡΕ Cy5)和 CD4 (PerCPCy5. 5)。CD^ (ECD)得自 Beckman Coulter。細胞刺激和染色。將PBMC用完全RPMI重懸至1 X IO6個細胞/100 μ L，並且置於 含有100 μ L以1 200稀釋之A27L和B5R刺激肽的96孔板中。每次試驗中包括未刺激 的對照和陽性對照(葡萄球菌Staphylococcus)腸毒素B，1 μ g/mL ；Sigma-AIdrich)。細 胞於37°C孵育5小時。孵育後，清洗細胞(PBS)並用表面抗體染色。清洗細胞並依照說明 書用 Cytofix/Cytoperm 試劑盒(BD Pharmingen，San Diego, CA)進行固定。固定後，細胞 用perm緩衝液清洗2次，並用抗細胞內標記物的抗體染色。染色後，清洗細胞、固定(含有
多聚甲醛的PBS)並在分析前貯存於4°C。流式細胞術。用經改進的LSR II流式細胞儀(BD ImmunocytometrySystems, San Jose，CA)對細胞進行分析。每個樣品收集5萬個⑶3+細胞。利用Flowjo 8. 6. 3版 (TreeStar, San Carlos, CA)進行數據分析。初始的設門用正向散射區域(FSC-A)對高度 (FSC-H)作圖，以去除雙峰。利用FSC-A對SSC圖對細胞進行淋巴細胞設門。利用活細胞/ 死細胞對⑶3+圖鑑定活的T細胞。隨後相繼進行⑶8+和⑶4_細胞對IFN-γ的設門，以解 釋下調原因。鑑定CD8+T細胞後，利用提供最佳分離效果的組合對每種單獨的功能進行設 門。對每種功能進行設門後，我們利用Boolean設門平臺建立可能之組合的全陣列，當測試 4種功能時等同於15種應答模式。經背景校正後報導數據。由於預免疫應答很高，分析中 未包括1個PVAXl動物(#4384)的應答。病毒的增殖和製備。猴痘病毒Zaire株V79-I-005 (猴痘病毒Master SeedNR-523) 從 National Institutes of Health Biodefense 禾口 Emerging InfectionsResearch Resources Repository獲得。該hire株最初從1979年剛果致死感染的人中獲得(由世 界衛生組織天花病毒和其他痘病毒合作中心(WorldHealth Organization CollaboratingCenter for Smallpox and Other Poxvirus)在美國疾病控制和防禦中心(US Center for Disease Control and Prevention)分離)。通過在雞胚成纖維細胞中對病毒進行傳代並 且利用標準蔗糖濃度梯度離心沉降使其純化，以製備接種物。其在雞胚成纖維細胞中增殖
並純化。猴痘病毒攻擊。最後一次免疫(第91天)後4周，食蟹猴利用本文所描述的方法 麻醉，並利用23號蝶式針通過靜脈注射2 X IO7pFU的猴痘病毒NR-523至隱靜脈中。為了 確定實際遞送劑量，利用標準的空斑試驗技術對攻擊接種物進行回滴定。實時PCR檢測猴痘病毒基因組。利用QIAamp DNA試劑盒Oliagen)從冷凍的血 液樣品中提取DNA。依照廠商說明，用QuantitativePan-orthopox HA PCR試驗(Applied Biosystem)進行實時PCR，其中包括下列用於擴增血球凝集素基因的引物0PHA F89 :5，-ATGTACTATCTCAACGTAGTAG-3』 (SEQ ID NO. :17)和 OPHA R219 :5』 -CTGCAGAACATAAAACTATT AATATG-3，(SEQ ID NO. :18)。TaqMan 探針(0ΡΗΑ P143S-MGB :6FAM AGTGCTTGGTATAAGGAG MGBNFQ(SEQ ID NO. :19和SEQ ID. :20))在5，端具有FAM標記並且包含非螢光淬滅基團。 用LightCycler 1.5 (Roche)進行病毒基因組複製。VACV中和抗體的測定。研究期間收集猴血清，使其熱滅活(56°C 30分鐘)並利用 傳統的空斑減少中和試驗評估VACV中和抗體的存在。每次試驗包括經FDA生物評估和研究
(Center for Biologies Evaluation andResearch at the FDA) ftkif 白勺 FDA 豐示} 照牛痘Ig(Cangene)作為陽性對照。陰性對照包括未經免疫之食蟹猴的血清。在完全培養 基中製備1至4個血清系列稀釋液，並一式三份加入至Vero E6細胞的M孔板中(100%鋪 滿)。M孔板的每個孔中加入4. 5 X IO5PFU W^iire 79株。每孔加入200 μ L預熱的甲基 纖維素半固體覆蓋膜(包含添加了 4% FBS、4mM L-穀氨酸和1 %甲基纖維素的等體積4% MEM)。板於37°C在5% C02下孵育72小時。用250 μ L的0. 結晶紫染色液(於20%乙 醇中製備)對細胞單層進行染色。進行空斑計數並相對於無抗體時的空斑數量計算中和百分比。效價以使空斑數量 減少50%的最大稀釋度的倒數表示。全血細胞計數分析。全血細胞計數(CBC)利用HevaVet 950FSHematology Analyzer (Drew Scientific)進行。在接種過程中每個採血時間點和攻擊的第0、6、12、21 和27天進行CBC。血液學參數包括血細胞比容、血紅蛋白、白細胞總數以及不同淋巴細胞 的數量(嗜中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞)、血小板數量、 血細胞平均體積、血細胞平均血紅蛋白量、平均微粒和血紅蛋白濃度。數據分析。利用Mudent』配對t-test進行所涉及的比較。數據以平均數 士 s. e. m.表示，並且認為P < 0. 05時(雙尾配對T-Test)具有統計學顯著性差異。利用 Spearman等級相關性(非參數的)評估中和抗體效價(通過PRNT試驗測定)和痘瘡數量 之間的相關性。實施例1質粒表達之天花病毒抗原的克隆、體外表達和生產每種基因由GeneArt Inc. (Toronto, ON)從寡核苷酸合成地構建和製備。來源於 天花病毒Western Reserve(WR)株的寡核苷酸經密碼子優化，並且利用標準的克隆方法克 隆至Ij ρVAXl (Invitrogen, Carlsbad, CA)中。分別編碼經優化之A4L和B5R基因的DNA疫苗質粒pGX4001和pGX4003通過將合成地構建的片段克隆到HindIII和BioI限制性位點 中製備。pGX4004 (編碼A33R)和pGX4005 (編碼A56R)通過將DNA片段克隆到HindIII和 XbaI限制性位點中製備。PGX4007和pGX4008通過將分別編碼H3L和LlR的DNA片段克隆 到HindIII和BamHI限制性位點中製備。對於編碼F9L的質粒(pGX4006)和編碼A27L的 質粒(pGX4002)，分別將DNA片段克隆到EcoRlAbaI和KpnlAhoI限制性位點中。為了使 蛋白表達更高效，每個基因的5』端加入Kozak共有序列和IgE前導序列。此外，為了輔助 定位和進行表達分析，基因的3』端加入HA表位標籤。克隆後，所有抗原經測序驗證，並且檢測插入片段的表達。隨後，利用Hebel等在 US7, 238，522中所描述並且經改進的部分生產步驟來生產質粒，使得可以產生質粒濃度較 高、適用於疫苗生物製藥學遞送的質粒製劑(示例性目的參見圖1)。利用此方法，生產出包 含VACV抗原A4L、A27、A33R、A56R、B5R、F9L、H3L和LlR的天花多價DNA疫苗。疫苗產品顯示 出高純度，其中未檢出RNA、蛋白和內毒素，於-80°C貯存1年後的平均濃度為10. 7士0. 7mg/ mL，超螺旋率為94. 5士 1. 1 %。疫苗製備品中的每種抗原在小鼠或者兔中均能夠誘導產生強 效抗體和細胞免疫應答(數據未顯示)。還顯示了編碼天花病毒抗原的一些質粒(圖2-9)。表1.所克隆的疫苗抗原的總結
抗原 大小生物學特性相關感染
(kDa)形式
A4L39合成於感染後晚期的病毒核心蛋白』參與病毒核心蛋白的組裝IMVA27L14.0形成和組裝所需IMVA13L14病毒粒子成熟所需IMVA14L9.9形態發生所需IMVD8L35.3包膜蛋白，結合軟骨素IMVF9L23.8結構上與LlR相關的腹糖蛋白，參與細胞融合/進入IMVH3L37.5C末端跨膜蛋白，形態發生，中和抗體IMVLlR27.3I型膜蛋白，經十四烷基化』中和抗體的靶位IMVA33R20.5II型膜蛋白，肌動蛋白尾部的形成EEVA56R69-85編碼血球凝集素基因』參與細胞融合EEVB5R35.1I型膜蛋白，病毒排出，中和抗體的靶位EEV
在本文所描述的所有實驗中，無內毒素的質粒製備品稀釋於無菌水中，並且依照
之前 Draghia-Akli R, Khan AS, Pope MA, Brown PA. Innovativeelectroporation for therapeutic and vaccination applications. Gene Therapy Molecular Biology ；9 329-38(2005)所描述，用經高效液相色譜(HPLC)純化的低分子量多聚L-穀氨酸(LGS，平 均分子量10，900)以重量/重量配製。
為了使這些基於質粒的治療方法有效地轉用於人類，優選使小製劑體積中(體積 與傳統疫苗的體積接近)含有較大量的質粒。此外，轉基因產品應當由靶器官高效分泌、可 以檢出並且具有活性。實施例2質粒的施用和電穿孔應用於ID的恆定電流電穿孔設備(CELLECTRA , VGXPharmaceuticals, Inc.，Blue Bell, PA)擴展成具有置於可消毒的一次性塑料陣列上的微電極，所述塑料陣 列是與患者皮膚實際接觸的唯一組件(以防止交叉汙染)。將經濃縮、高純度的小體積疫 苗製劑(體積與傳統疫苗的體積接近，例如50和300 μ L，更優選在50-100 μ L之間或者 100-200 μ L之間)遞送至所選區域即靶區域，隨後靶區域被微陣列包圍。微電極插入至皮 膚中。塑料陣列在插入至皮膚中的微電極周圍產生均勻的壓力，有助於EP過程中在靶區域 中產生均勻的電場。實施例3利用天花病毒表汰質粒免疫兔在預實驗中，在兔組中(n = 3/組)分析了對天花病毒抗原的免疫應答，所述抗原 由實施例1的質粒疫苗和體內恆定電流電穿孔遞送(參見圖10的時間軸)。兔隨意餵養食 物和水，並且在Millmeadowdnc. (Sugarland, TX)依照IUCUC標準和操作飼養。施用DNA 疫苗前，刮淨注射位點並徹底清洗，以去除多餘的毛髮和碎片。DNA注射當天，對兔進行稱 重，用克他命/賽拉嗪(xylazine)麻醉，採血，並在處理期間保存於異熒烷(isof luorane) (2% )中。通過單次肌內(IM)注射SOOyg(每次注射每種抗原IOOyg和/或空載體至 800 μ g)的下列組合物來施用質粒第1組兔用表達不同天花病毒抗原(A13L、A14L、A27L、 A33R、B5R、D8L、H3L、L1R)之8種質粒的組合物進行免疫；第2組兔用4種不同抗原(A27L、 B5R、D8L、L1R)的組合物進行免疫；第3組兔用表達單個抗原(B5R)的單個質粒進行免疫。 所有質粒均施用至半膜肌，隨後利用CELLECTRA 設備(VGXPharmaceuticals，Blue
Bell,PA)進行電穿孔，在0. 6安培下進行3次脈衝，5aiiS/脈衝，脈間Is。在不同的時間點 從兔中收集血清，並且通過蛋白ELISA用其測定抗體應答。不論所遞送的抗原數量多少，2個經免疫組中的抗體應答均增強了。還用ELISpot 測定了多種抗原的體液應答:B5R(圖11)、H3L(圖12)、A27L(圖13)、L1R(圖14)。收集每 組動物的血清並以1 50釋釋。第1組和第2組顯示出對A27L和LlR的顯著應答(與第 3組相比*p < 0. 05)，而且當施用4種或者8種抗原時，對單個疫苗的免疫應答未受到影響。實施例4禾U用天花病毒表達Jlif立免疫啡人靈長類雲M勿對少量食蟹猴(6隻)進行初始的預實驗，以檢測DNA注射以及其後的電穿孔(EP) 是否能夠引起強烈的免疫應答。實驗利用CELLECTRA2000 設備進行。2隻猴的組(η =2/組)通過肌內(IM)注射入劑量逐漸增加的質粒，所述質粒編碼1種病毒抗原經優化 的A4L (或者A4Lopt)、A27Lopt和B5Ropt (參見上面實施例1中的質粒)。在第0J8和56天穿過未受痘瘡的皮膚對動物分別注射每種質粒0. 03,0. 1和 0. :3mg (於0. 5mL無菌水+0.01mg/mL LGS中)至半膜肌，並且隨後進行電穿孔，其條件為0. 6安培，脈寬Mms，脈間Is。在第84天，所有動物均進行加強免疫。在基線處、第觀、56、84 和112天時測定細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答(圖16)。如圖16所示，第1次免疫後2 周的ELISpot結果顯示，接受IM注射以及電穿孔組中產生幹擾素-γ (IFNy)的細胞數量 平均是僅接受IM注射組的2. 5倍。實施例5通過測定動物中所產生的抗體應答水平對包含幾種不同天花病毒抗原的聯合疫 苗進行評估，以確定該聯合疫苗的效果。此外，通過將皮內(ID)或者肌內(IM)遞送相比較， 對DNA遞送方法的效果進行評估。DNA利用c^UJEGTRA 恆定電流設備遞送。動物利用ELISA評估紐西蘭白兔(每組中n = 3或者4)的抗體免疫應答。兔隨 意餵養食物和水，並且在Millmeadow，Inc. (Sugarland，TX)依照IUCUC標準和操作飼養。 施用DNA疫苗前，刮淨注射位點並徹底清洗，以去除多餘的毛髮和碎片。DNA注射當天，對兔進行稱重，用克他命/賽拉嗪麻醉，採血，並且在處理期間保存 於異熒烷中。皮內(ID)(IOOyl)或者肌內(IM) (500 μ 1)施用(第0、21和35天) 包含編碼多種天花病毒抗原之質粒的DNA疫苗，對每隻兔施用所包含的全部質粒總量為 Img的每種疫苗。疫苗中所用的質粒組合物包括流感病毒Η5血球凝集素表達質粒(Η5ΗΑ) (用作試驗的陽性對照)以及3種天花病毒抗原的組合物(A4L、A27L和B5R;參見上面實施 例1)。每種DNA疫苗製劑於1% LGS中製備。所有的DNA疫苗施用至半膜肌，隨後利用CELLECTRA 恆定電流設備在如圖 18所示的多種條件下進行電穿孔。A組至D組接受100 μ 1的ID注射，在0. 2安培下進行 電穿孔並且接受2次脈衝(Α組)、3次脈次(B組)、4次脈衝(C組)、6次脈衝(D組)。E 組接受ID注射，但不進行電穿孔。F組、G組和I組以肌內方式(IM)施用500μ1 DNA疫苗 製劑，在0. 5安培下進行電穿孔並且接受3次脈衝，每次脈次分別包含80、4、4和10-15秒 的停滯期。J組不進行電穿孔(ΙΜ，500μ1)。H組接受1000 μ 1的肌內注射，並且進行電穿 ？L，條件為0. 5安培、4秒停滯和3次脈衝。CELLECTRA 恆定電流設備的程序設定為 遞送52ms/脈衝和脈間為Is。在不同的時間點從兔中收集血清，並且通過蛋白ELISA用其 測定抗體應答(結果見圖19-21)。實施例6利用ELISA對8至9周齡的紐西蘭白兔的抗體免疫應答進行評估。兔隨意餵養食 物和水，並且在Millmeadowdnc. (Sugarland, TX)依照IUCUC標準和操作飼養。施用DNA 疫苗前，刮淨注射位點並徹底清洗，以去除多餘的毛髮和碎片。DNA注射當天，對兔進行稱 重，用克他命/賽拉嗪麻醉，採血，並且在處理期間保存於異熒烷(isofluorane) )中。編碼多種天花病毒抗原的質粒(參見上面實施例1)通過皮內(ID)或者肌內(IM) 施用(第0、21、42和84天)，施用體積分別為100μ 1和500μ 1，每隻兔施用的質粒總量為 Img (每次注射每種抗原125 μ g和/或空載體至Img)。圖22和23詳細地顯示了接種方 案和接種參數。利用下列組合進行免疫並隨後進行電穿孔(A組至J組)A組和F組的兔 用表達單個抗原(B5R)的單個質粒進行免疫；B組和G組用4種不同抗原(A27L、B5R、H3L 和LlR)的組合進行免疫；C組和H組用表達多種抗原(A4L、A27L、A33R、A56R、B5R、F9L、 H3L和LlR)之8種質粒的組合進行免疫；D組和I組作為抗體應答的陰性對照，用空載體 PVAXl (Invitrogen, Carlsbad, CA)進行免疫；以及E組和J組接種相同的8種質粒組合，但是不進行電穿孔。每種抗原製劑於LGS中製備。所有質粒施用至半膜肌，並隨後利用GELLEGTRA 恆定電流設備進行電穿孔 (除了第5組)。對於IM注射，電穿孔條件為0. 5安培、3次脈衝、5ans/脈衝、脈間Is ；對 於ID注射，電穿孔條件為0. 2安培、4次脈衝、52ms/脈衝、脈間1 s。在不同的時間點從兔中 收集血清，並且通過蛋白ELISA用其測定抗體應答(圖M至圖33)。ELISA抗原製備用於ELISA的抗原由Abgent，Inc. (San Diego, CA)製備。編碼 基因的ORF利用基因特異性引物經PCR擴增得到，所述引物包含用於克隆的合適的限制性 位點。寡核苷酸的3』端設計為可以與原核表達載體pEt21a(+)中的6X組氨酸標籤融合。 蛋白利用標準的鎳柱純化方法進行純化。ELISA試驗。為了測定IgG應答，通過將50ng稀釋於PBS中的抗原(A4L、A27L、 A33R、B5R、H3L 或者 LlR)覆蓋於 MaxiSorp Immuno 96 孔板(Nunc, Rochester, NY)上，進 行ELISA試驗，並於4°C孵育過夜。用添加了 0. 05% Tween 20的PBS(PBS-T)清洗後，板用 添加了 3% BSA的PBS封閉，並於室溫孵育1小時。兔血清用添加了 0. 5% BSA和0. 05% Tween 20的PBS稀釋，並於4°C孵育(50 μ 1)過夜。用PBS-T清洗後，孔與HRP偶聯的並且 以1 10，000稀釋於添加了 0.5% BSA和0.05% Tween 20之PBS中的第二抗體羊抗兔 IgG(Sigma-Aldrich Jt. Louis,Μ0) (100 μ L/孔)孵育。將孔於室溫孵育1小時並隨後清洗。 依照廠商建議(KPL，Gaithersburg, MD)向每孔中加入TMB底物和終止液。利用Lumistar Galaxy 板讀取儀(BMG Labtech, Durham, NC)在 450nm 下測定吸光度。ELISpot 試驗。MultiScreen -Ip 96 孔板用以 1 100 稀釋於 PBS 中的猴 IFN-γ 單克隆抗體(mAB) (GZ-4)覆蓋，並於4°C孵育過夜。用PBS清洗5次後，板用完全培養基(添 加了 10% 83和1%青黴素/鏈黴素的1 ^1-1640)於室溫封閉2小時。一式三份加入PBMC， 其輸入的細胞數量為100 μ 1完全培養基中的2 X IO5個細胞。肽用完全培養基稀釋至終濃 度為25 μ g/ml，每孔加入100 μ 1稀釋液。伴刀豆球蛋白A(ConA，5 μ g/ml ；Sigma-Aldrich, St. Louis,MO)用作陽性對照，僅重懸於完全培養基的細胞用作陰性對照。於37°C孵育對小 時後，板用PBS清洗5次，隨後與經生物素化並且以1 1000稀釋於PBS中的猴IFN-γ檢 測mAb(7-B6-l) (100μ 1/孔)於4°C孵育過夜。清洗板，加入以1 1000稀釋於PBS中的鏈 黴親和素鹼性磷酸酶(100μ 1/孔)，並於室溫孵育1小時。隨後清洗孔，每孔加入100μ 1底 物液(BCIP/NBT，Sigma-Aldrich)。室溫下10分鐘後，用自來水清洗幾次，使比色反應終止。 使板風乾，並利用自動化ELISpot讀取系統(CTL分析儀，Cleveland，0H)和ImmunoSpOt 軟體對空斑進行計數。3個孔中空斑的平均數調整至IX IO6個脾細胞。ELISpot數據以平 均數士 S.D.表示。用響應於用於刺激的相應肽所形成的空斑數減去對照培養基中的空斑數，來計算 抗原特異性IFN-γ應答。還在利用CD8去除珠(Miltenyi Biotec,Gladbach,Germany)去 除⑶8+淋巴細胞後，進行ELISpot試驗。實施例7兔中皮內接種高濃度多價DNA之電穿孔條件的優化EP條件的優化是蛋白表達的關鍵因素。利用高度濃縮的聯合疫苗在兔中進行了優 化EP條件的實驗。表2顯示了所研究的EP條件。表2兔中B5R、A27L和A4L EP條件的優化和其效價
組Nb伴 滯 時 間安培脈衝HI玫價終點效價 B5R終點效價 A27L終點效價 A4LA440.22190 ±75.51100 士 714.1500 ± 173.2125 ±43.3B440.23120 ±60.02600 ± 600.0650 ± 150.01100±714.1C440.22x2640 ± 320.03200 ± 0.0600 ± 173.21250 ±665.2D440.23x2105 ±71.81662.5 ± 888.23200 ± 0.0400 士 173.2E3NANANA20 ±0.0200 ± 0.0333 ±240.4466.3 ±156.2用陽性對照流感病毒H5血球凝集素表達質粒(HA) (Laddy, D. J. et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenzaviruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. Plos. ONE. 3，e2517 (2008))，以及 B5R、A27L 和 A4L 的組合物在不同 ID-EP 參數下 對動物進行接種。結果顯示，2X2皮下EP脈衝形式提供了較強的應答，其對血球凝集素的 抑制最強，響應於兩種天花病毒抗原的抗體效價最高。第三種天花病毒抗原在3次脈衝形 式下產生了較好的結果。利用「多數決定原則」標準，將2X2EP條件用於隨後的非人靈長 類動物研究中。實施例8用多價疫苗免疫非人靈長類動物DNA多價疫苗引起強烈的抗體應答食蟹猴購自Three Springs Scientif ic (Perkasie, PA)，並放置和飼養於 Southern Research Institute (Birmingham，AL)。總共 M 只猴(14 只雌性和 10 只雄性) 單獨籠養並且基於其體重和性別的相似性分配到每組中。經測試，所有的猴均為SIV、STLV、 SRV和HBV陰性。收到後立即使所有動物隔離，使其適應研究室環境。在隔離和研究期間， 猴餵養Teklad 2050⑶iet。所提供的食物量大約為一勺食物(6至10塊餅乾)，每天兩次。 實驗依照 IACUC of Southern Research Institute, the Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals,7th Edition (Institute of Animal Resources, Commissionon Life Sciences,National Research Council ；National Academy Press ；Washington,DC ； 1996)禾口 the U. S. Department of Agriculture 通過 the Animalffelfare Act (Public Law 99-198)所提出的原則進行設計。用包含8 種 VACV Western Reserve 株基因(A4L、A27L、A33R、A56R、B5R、F9L、 H3L和LlR)的多價DNA疫苗對4組食蟹猴免疫3次。一組(n = 6)通過皮內(ID)途徑接 受高劑量(HD)的DNAQ50yg/抗原)，而另一組(n = 6)以相同途徑接受低劑量(LD)的 DNA(125yg/抗原)。此外，2組猴(n = 4)還通過肌內(IM)途徑用高劑量或者低劑量的疫 苗進行免疫。1組經PVAXl免疫的動物用作陰性對照。第3次免疫後1個月，用致死劑量的 猴痘病毒hire株(通過靜脈遞送，引入2X IO7PFU)攻擊動物。利用ELISA試驗評估多價DNA疫苗中每種抗原的抗體特異性應答(表3a)。表3 的圖表描述可見於圖3 所示的柱形圖中。表3a通過ELISA測定的每種抗原的抗體應答。
權利要求
1.一種能夠在哺乳動物中產生抗痘病毒的保護性免疫應答的DNA疫苗，其包含至少一種能夠表達多種VACV MV抗原的DNA質粒，以及至少一種能夠表達多種VACV EV抗原的DNA質粒。
2.如權利要求1所述的DNA疫苗，還包含能夠表達A4L抗原的DNA質粒。
3.如權利要求1至2中任一項所述的DNA疫苗，其中所述抗原均由不同的DNA質粒表達。
4.如權利要求1至3中任一項所述的DNA疫苗，其中所述VACVMV抗原包括:A27L、 F9L、H3L 或者 L1R。
5.如權利要求1至4中任一項所述的DNA疫苗，其中所述VACVEV抗原包括A33R、 A56R 或者 B5R。
6.如權利要求1至5中任一項所述的DNA疫苗，其中所述DNA質粒包含編碼所述抗原 的共有DNA序列。
7.如權利要求6所述的DNA疫苗，其中所述編碼VACVMV抗原的共有DNA序列包括 SEQ ID NO :3(A27L)、SEQ ID NO :11 (F9L)、SEQID NO :13(H3L)或者 SEQ ID NO: 15 (LlR)。
8.如權利要求1至7中任一項所述的DNA疫苗，其中所述能夠表達多種VACVMV抗原的 DNA 質粒包含編碼包含序列 SEQ ID NO :4 (A27L)、SEQ ID NO 12 (F9L)、SEQ ID NO :14(H3L) 或者SEQ ID NO 16 (LlR)的蛋白的編碼序列。
9.如權利要求6所述的DNA疫苗，其中所述編碼VACVEV抗原的共有DNA序列包括 SEQ ID NO :5(B5R)、SEQ ID NO :7(A33R)或者 SEQ ID N0:9(A56R)。
10.如權利要求1至9中任一項所述的DNA疫苗，其中所述能夠表達多種VACVEV抗 原的DNA質粒包含編碼包含序列SEQ ID NO :6 (B5R)、SEQ ID NO :8(A33R)或者SEQ ID NO: 10(A56R)的蛋白的編碼序列。
11.如權利要求6所述的DNA疫苗，其中所述編碼A4L的共有DNA序列包括SEQID NO 1或者編碼具有序列SEQ ID NO 2的蛋白的DNA序列。
12.如權利要求1至11中任一項所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗包含多個不同的 DNA 質粒，所述質粒分別包含 SEQ ID NO 1 (A4L)、SEQ ID NO :3 (A27L)、SEQ ID N0:5(B5R)、 SEQ ID NO :7(A33R)、SEQ ID NO :9 (A56R)、SEQ ID NO : 11 (F9L)、SEQ ID NO :13(H3L)以及 SEQ ID NO 15 (LlR)的編碼 DNA 序列。
13.如權利要求1至12中任一項所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗包含多個不同的 DNA質粒，所述質粒分別包含編碼具有序列SEQ IDNO :2(A4L)、SEQ ID NO :4 (A27L)、SEQ ID NO 6 (B5R)、SEQ ID NO 8 (A33R)、SEQ ID NO 10 (A56R)、SEQ ID NO 12 (F9L)、SEQ ID NO 14(H3L)以及SEQ ID NO 16 (LlR)的蛋白的編碼DNA序列。
14.如權利要求1至13中任一項所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗包含DNA質粒 pGX4001、pGX4002、pGX4003、pGX4004、pGX4005、pGX4006、pGX4007 或者 pGX4008、或其組合。
15.如權利要求1至14中任一項所述的DNA疫苗，其中所述DNA質粒均以大於50μ g 的劑量存在。
16.如權利要求15所述的DNA疫苗，其中所述DNA質粒均以125μ g的劑量存在。
17.如權利要求1至16中任一項所述的DNA疫苗，還包含佐劑，所述佐劑選自IL-8、 IL-12、IL-15、IL-18、IL-28、MCP-l、MIP-l、MIP-lp、RANTES、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40LIGAND, CTACK, TECK 或者 MEC、或其組合。
18.如權利要求17所述的DNA疫苗，其中所述佐劑是IL-12、IL-15、IL-28或者RANTES。
19.如權利要求1至18中任一項所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗能夠在哺乳動物 中產生抗天花病毒的保護性免疫應答。
20.一種在哺乳動物中誘導抗痘病毒的包括中和抗體應答在內的保護性免疫應答的方 法，其包括向所述哺乳動物的組織中注射DNA疫苗，所述疫苗包含至少一種能夠表達多種VACV MV抗原的DNA質粒、至少一種能夠表達多種VACVEV抗原的DNA質粒、以及能夠表達A4L的 DNA質粒。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述注射步驟包括皮內注射或者肌內注射。
22.如權利要求20至21中任一項所述的方法，還包括利用電穿孔量的電能對所述組織 進行電穿孔的步驟。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述電穿孔步驟包括遞送恆定電流至所述組織。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述電穿孔步驟包括遞送0.2A的電流。
25.如權利要求20至24中任一項所述的方法，還包括重複所述注射步驟。
26.如權利要求20至25中任一項所述的方法，其中所述DNA質粒包含具有序列SEQ ID NO 1 (A4L)、SEQ ID NO :3 (A27L)、SEQ ID NO :5 (B5R)、SEQ ID NO :7 (A33R)、SEQ ID NO: 9(A56R)、SEQ ID NO 11 (F9L)、SEQ ID NO :13(H3L)或者 SEQ ID NO 15 (LlR)的編碼 DNA 序 列。
27.如權利要求20至26中任一項所述的方法，其中所述DNA質粒包含編碼具有序列 SEQ ID NO :2(A4L)、SEQ ID NO :4 (A27L)、SEQ ID NO :6 (B5R)、SEQ ID NO :8 (A33R)、SEQ ID NO :10(A56R)、SEQ ID NO :12(F9L)、SEQ ID NO :14(H3L)或者 SEQ ID NO 16 (LlR)的蛋白 的編碼序列。
28.如權利要求26至27中任一項所述的方法，其中所述遞送步驟包括遞送8種不同的 DNA質粒。
29.如權利要求28所述的方法，其中所述8種不同的DNA質粒包括pGX4001、pGX4002、 PGX4003、pGX4004、pGX4005、pGX4006、pGX4007 以及 pGX4008。
30.如權利要求20至29中任一項所述的方法，其中所述方法在哺乳動物中誘導抗天花 病毒的保護性免疫反應。
全文摘要
本發明涉及能夠在哺乳動物中產生抗天花病毒的保護性免疫應答的DNA疫苗，其包含至少一種能夠表達多種VACV MV抗原的DNA質粒，以及至少一種能夠表達多種VACV EV抗原的DNA質粒。本發明還涉及在哺乳動物中誘導產生抗天花病毒的、包括中和抗體應答在內的保護性免疫應答的方法，其包括向所述哺乳動物的組織中注射所述DNA疫苗。
文檔編號A61P31/20GK102083457SQ200980119927
公開日2011年6月1日 申請日期2009年5月28日 優先權日2008年5月28日
發明者D·B·韋納, J·普裡格, L·A·希勞, R·德拉奇亞-阿科利 申請人:Vgx製藥有限公司, 賓夕法尼亞州立大學託管會