編碼抗體的副粘病毒載體及其應用的製作方法

2023-05-27 11:29:41

專利名稱：編碼抗體的副粘病毒載體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼多肽的副粘病毒載體及其應用，所述多肽包含抗體可變區。
背景技術：
單克隆抗體作為藥物的有效性已被廣泛認識，目前有不下10種單克隆抗體藥物已經投入市場，或已經制出即將投入市場(Dickman，S.，Science 2801196-1197，1998)。單克隆抗體藥物的特徵在與，它們僅選擇性結合唯一的特定抗原，從而表達它們抑制或消除該抗原的活性。因此，對於它們將來的醫藥開發有較高預期。但是，單克隆抗體藥物也存在以下問題1)它們通常用哺乳動物雜交瘤製備，而製備雜交瘤的費用一般較高，且2)由於它們通常是進行全身給藥，因此引起副作用，如發熱，雖然是輕微的。已經有人嘗試用諸如大腸桿菌(Escherichia coli)等細菌，酵母或昆蟲細胞來製備抗體，但仍擔心糖鏈修飾等差異可能影響抗體的生物活性和抗體蛋白的抗原性。

發明內容
本發明的一個目標是提供副粘病毒載體及其應用，所述載體編碼包含抗體可變區的多肽。
本發明人認為，如果基因導入載體可以用於表達目前廣泛應用的單克隆抗體藥物，並且預期在將來有更廣泛的應用，那就有可能在病灶附近局部表達該抗體藥物，這很有可能減輕副作用，並解決開發單克隆抗體藥物總是伴有的費用問題。
近年開發了多種用於基因治療的基因導入載體，並預計可以依據載體的類型進行基因導入型細胞的局部表達。具體地，本發明人迄今為止已經用仙臺病毒(SeV)開發了一種新的可以用於基因導入和基因治療的基因導入載體。SeV是非分節段負鏈RNA病毒，屬於副粘病毒科(Paramyxovirus)，是鼠副流感病毒的一種。本發明人新近構建了表達單克隆抗體的SeV，並用它們進行實驗來確立在活體內表達單克隆抗體的新的基因療法。本發明人採用了傳播型和傳播能力缺陷型這兩種SeV，來構建攜帶神經軸索伸長抑制物(axonal outgrowth inhibitor，NOGO)中和抗體(IN-1)的Fab基因(H和L鏈)的載體。結果成功重建了這兩種載體，並成功回收了29HAU(約5×108CIU/ml)的傳播型載體和2.7×107CIU/ml的傳播能力缺陷型(F基因缺陷型)載體。將這些載體導入細胞，細胞培養上清在氧化條件下檢測到約47kDa的帶，在還原條件下檢測到約30kDa的帶，表明氧化條件下形成了Fab抗體，且其中的H和L鏈是相結合的。由於表達抗神經軸索伸長抑制物抗體的載體預計可以應用於脊髓損傷，本發明的載體可以用於脊髓損傷的基因治療。
此外，本發明人發現，表達抗體的副粘病毒載體還可以作為具有減弱的免疫原性的載體來使用。將病毒載體給藥至活體內可以誘導對該病毒的免疫反應，從而消除該病毒載體並抑制導入基因的長期表達。在這類情況下，載體多次給藥也是很困難的。如果載體包含對免疫反應的誘導進行抑制的活性，則可以抑制抗該載體的免疫反應，並有可能使導入基因長期表達和多次(反覆)給藥。因此，表達抗免疫信號分子的抗體的載體都是有效的。例如，協同刺激信號可以與來自免疫細胞如T細胞的T細胞受體(TCR)、抗原、和主要組織相容性複合物(MHC)抗原的信號一起發揮作用，它屬於第二信號，通過用載體表達抗傳遞協同刺激信號的分子的抗體，可以消除該第二信號，並使T細胞失活。這樣的副粘病毒載體能抑制抗所述載體的細胞免疫，並長期表達導入的基因。
因此，本發明提供的載體適合於體內(in vivo)給藥，尤其是在基因治療中，並且預計可以應用於多種疾病和損傷。此外，由所述副粘病毒載體能使導入的基因在哺乳動物細胞中以極高水平表達，因此可以在這些哺乳動物細胞(包括人的細胞)中產生大量所需抗體。因此，所述表達抗體的副粘病毒載體不僅在臨床上具有極高應用價值，而且在產業上具有極高應用價值。
本發明涉及編碼多肽的副粘病毒載體及其應用，所述多肽包含抗體可變區。本發明更具體地涉及(1)一種副粘病毒載體，其編碼包含抗體可變區的多肽。
(2)(1)的副粘病毒載體，其中所述副粘病毒是仙臺病毒。
(3)(1)的副粘病毒載體，其中所述多肽是分泌型多肽。
(4)(1)的副粘病毒載體，其中所述載體編碼包含抗體H鏈可變區的多肽和包含抗體L鏈可變區的多肽。
(5)(4)的副粘病毒載體，其中所述包含抗體H鏈可變區的多肽和包含抗體L鏈可變區的多肽彼此相連形成Fab。
(6)(5)的副粘病毒載體，其中至少一種抗體可變區源自抗配體或受體的抗體。
(7)(6)的副粘病毒載體，其中所述抗體與抑制神經細胞生存或分化或軸索伸長的蛋白質結合。
(8)(7)的副粘病毒載體，其中所述抗體是抗NOGO抗體。
(9)(6)的副粘病毒載體，其中所述抗體是抗與免疫信號傳遞相關的受體或其配體的抗體。
(10)(9)的副粘病毒載體，其中所述抗體是抗表達在T細胞或抗原呈遞細胞表面的受體或其配體的抗體。
(11)(10)的副粘病毒載體，其中所述受體或其配體是T細胞或抗原呈遞細胞的協同刺激信號的信號傳遞分子。
(12)(11)的副粘病毒載體，其中所述信號傳遞分子是選自CD28，CD80，CD86，LFA-1，ICAM-1(CD54)，PD-1，或ICOS的分子。
(13)(9)的副粘病毒載體，其中所述載體還編碼另一種外來基因。
(14)製備包含抗體可變區的重組多肽的方法，包括以下步驟(a)將(1)的病毒載體導入哺乳動物細胞；和(b)從導入了所述載體的哺乳動物細胞或其培養上清回收所產生的多肽。
(15)一種多肽，由(14)的方法製得。
(16)促進神經形成的方法，包括將(7)的載體送達需要形成神經的部位。
(17)治療脊髓損傷的方法，包括將(7)的載體送達損傷部位。
(18)抑制免疫反應的方法，包括給藥(9)所述載體。
(19)(18)的方法，還包括給藥抗體或給藥CTLA-4或其片段的步驟，所述抗體抗與免疫信號傳遞相關的受體或其配體。
(20)增強載體的基因表達的方法，所述增強基因表達通過使該載體持續進行基因表達和/或通過重複給藥該載體來實現，所述方法包括給藥(9)所述載體。
(21)(20)的方法，還包括給藥抗體或給藥CTLA-4或其片段的步驟，所述抗體抗與免疫信號傳遞相關的受體或其配體。
(22)一種載體組合物，所述載體的表達持續性延長，所述組合物包含(9的載體和可藥用承運體。
(23)一種基因導入試劑盒，包含(a)(9)的載體和(b)抗與免疫信號傳遞相關的受體或其配體的抗體，或CTLA-4或其片段。
本發明中的「抗體」是包含免疫球蛋白可變區的多肽的統稱，更具體地包括免疫球蛋白鏈(H或L鏈)、包含其可變區的片段、以及包含這些片段的多肽。抗體可以是天然抗體或人工製備的抗體。例如，它們可以是兩種或更多抗體的嵌合體(例如，人的抗體與另一種哺乳動物的抗體的嵌合體)。本發明中的「抗體」還包括通過Fc區取代或通過CDR移植構建的重組抗體(例如，人源化抗體)。「免疫球蛋白可變區」是指免疫球蛋白H或L鏈的可變區(即，VH或VL)或其一部分。L鏈可以是κ鏈或γ鏈。本發明中，可變區可以包含含有任一種互補決定區(CDR)的胺基酸序列，具體地，可以包含H或L鏈的CDR1，CDR2或CDR3。優選地，在本發明中，免疫球蛋白可變區包含H或L鏈的CDR1，CDR2，以及CDR3。在本發明中，免疫球蛋白包括任一類免疫球蛋白，例如，IgM，IgG，IgA，IgE，和IgD。
重組病毒是指利用重組多核苷酸製備的病毒。重組多核苷酸是指一種多核苷酸，其中的核苷酸並非按照自然狀態結合。具體地，重組多核苷酸是其結合經過了人工修飾(切割或連接)的多核苷酸。重組多核苷酸可以通過將多核苷酸合成，核酸酶處理，連接酶處理等等組合，用本領域已知的基因重組方法來生成。重組蛋白可以通過表達編碼所述蛋白的重組多核苷酸來產生。重組病毒可以通過表達編碼所述病毒基因組的多核苷酸，然後重建所述病毒來生成，其中所述多核苷酸通過基因操作而構建。「重組蛋白」是指由重組多核苷酸生成的蛋白或人工合成的蛋白。
本發明中，「基因」是指遺傳物質，編碼轉錄單位的核酸。基因可以是RNA或DNA。本發明中，編碼蛋白的核酸被稱為該蛋白的基因。基因也可以不編碼蛋白。例如，編碼功能性RNA如核酶或反義RNA的基因被稱為核酶的基因或反義RNA的基因。基因可以是天然產生的或是人工設計的序列。此外，本發明中，「DNA」包括單鏈DNA和雙鏈DNA。「編碼蛋白」是指多核苷酸包含編碼該蛋白的胺基酸序列的ORF有義鏈或反義鏈，致使該蛋白可以在合適的條件下表達。
本發明中，副粘病毒是指屬於副粘病毒科的病毒，或其衍生物。副粘病毒是一組以非分節段的負鏈RNA為其基因組的病毒，包括副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)(包括呼吸道病毒屬(Respirovirus)(也稱為副粘病毒屬(Paramyxovirus))，腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)，和麻疹病毒屬(Morbillivirus))，以及肺病毒亞科(Pneumovirinae)(包括肺病毒屬(Pneumovirus)和間質肺病毒屬(Metapneumovirus))。本發明可以應用的副粘病毒的具體實例有，仙臺病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒(RS病毒)，牛瘟病毒，瘟熱病毒，猴副流感病毒(SV5)，和人副流感病毒1，2，和3型，等等。更具體地例如，仙臺病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟熱病毒(phocinedistemper virus，PDV)，犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)，海豚麻疹病毒(dolphin molbillivirus)(DMV)，小反芻獸疫病毒(peste-des-petits-ruminants virus，PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，立百病毒(Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2)，猴副流感病毒5(SV5)，人副流感病毒-4a(HPIV-4a)，人副流感病毒-4b(HPIV-4b)，腮腺炎病毒(Mumps)，和新城疫病毒(NDV)。更優選的實例包括選自下組的病毒仙臺病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟熱病毒(PDV)，犬瘟熱病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反芻獸疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，和立百病毒(Nipah Virus)。本發明的病毒優選屬於副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬，腮腺炎病毒屬和麻疹病毒屬)，更優選屬於呼吸道病毒屬(也稱副粘病毒屬)的病毒或其衍生物。本發明可利用的呼吸道病毒屬的病毒包括，人副流感病毒1型(HPIV-1)，人副流感病毒3型(HPIV-3)，牛副流感病毒3型(BPIV-3)，仙臺病毒(也稱鼠副流感病毒1型)，猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本發明的副粘病毒最優選仙臺病毒。這些病毒可源自天然株，野生型株，突變株，實驗室傳代株，人工構建株等。
本發明中，「載體」是用於將核酸導入細胞的承運體(carrier)。副粘病毒載體是源自副粘病毒的用於將核酸導入細胞的承運體。SeV等副粘病毒是優秀的基因導入載體。由於副粘病毒僅在宿主細胞的細胞質中進行轉錄和複製，並且由於它們沒有DNA時期，它們不發生染色體整合。故它們不會造成由染色體異常帶來的癌症或永生化等安全問題。副粘病毒的這種特徵對採用副粘病毒作為載體時的安全性有很大貢獻。當用於表達外來基因時，SeV幾乎不表現任何核苷酸突變，即使在連續多次傳代後也是如此，這表明其基因組具有高度穩定性，能長期穩定表達所插入的外來基因(Yu，D.etal.，Genes Cells 2，457-466(1997))。SeV還具有其它性質，例如，由於它不具有衣殼結構蛋白，故插入並包裝的基因的大小具有一定柔軟性(flexibility)。傳播型SeV載體可以導入至少4kb的外來基因，並且可以通過添加轉錄單位而同時表達兩種以上的基因。因此，可以從同一載體表達抗體H鏈和L鏈(實施例1)。
已知SeV對齧齒動物具有致病性，可以引起肺炎。但對人類不具有致病性。鼻內給藥野生型仙臺病毒不會對非人靈長類造成嚴重的有害作用，有報告支持這一點(Hurwitz，J.L.et al.，Vaccine 15533-540，1997)。更引人注目的優點是其「高感染性」和「高表達水平」。SeV載體通過與細胞膜蛋白糖鏈上的唾液酸結合而感染細胞，由於唾液酸在幾乎所有細胞中均有表達，因此有廣譜感染性，即高感染性。當基於SeV複製子的傳播型載體釋放病毒粒子時，這些病毒粒子可以再感染周圍細胞，在受感染細胞的細胞質中持續表達複製性多核糖核蛋白(replicating multipleribonucleoprotein，RNP)拷貝，並隨著細胞分裂將它們擴散到子代細胞，從而可以期待持續表達。SeV載體有非常寬的組織適用範圍，這表明這些載體可以用於各種類型的抗體治療(和分析)。由於只在細胞質內轉錄和複製的特徵性表達機制，使其攜帶的基因的表達量非常高(Moriya，C.etal.，FEBS Lett.425(1)105-111(1998)；WO00/70070)。此外，通過缺失包膜基因而製得的非傳播型SeV載體已經回收成功(WO00/70070；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))，因此可以改進SeV載體，以便在維持其「高感染性」和「高表達量」的同時，提高其「安全性」。
SeV的這些特徵使副粘病毒載體包括SeV可以有效進行基因治療和基因導入，並且在以體外(in vivo)或回體(ex vivo)抗體表達為目的的基因治療中SeV有望成為一種選擇。特別是，能共表達高水平H鏈和L鏈且對人無毒性的載體具有很高臨床可能性。通過將用於治療(和分析)的抗體基因插入副粘病毒載體，並使載體發揮功能，可以期待該抗體基因在病灶附近高水平表達，產生確定的治療效果，並減小副作用。而且，所述載體還很有可能解決單克隆抗體醫藥開發所一直伴隨的成本問題。我們認為，這些效果在可以誘導導入的基因暫時性強表達的副粘病毒載體，包括SeV，中更為明顯。
副粘病毒載體包含副粘病毒基因組RNA。基因組RNA是指具備這樣的能力的RNA，它與副粘病毒蛋白一起形成RNP，使這些蛋白表達基因組中的基因，使核酸複製形成子代RNP。副粘病毒是在其基因組中具有單鏈負鏈RNA的病毒，這種RNA可編碼基因的反義序列。通常副粘病毒基因組在3』前導區和5』尾隨區之間含有反義形式的病毒基因。各基因開放閱讀框之間存在一組序列轉錄終止序列(E序列)，間插序列(I序列)和轉錄起始序列(S序列)，這樣一來，編碼各基因ORF的RNA可以被轉錄為單獨的順反子。本發明載體的基因組RNA包含編碼N(核衣殼)，P(磷)和L(大蛋白)的反義RNA序列，這些蛋白對於所述RNA編碼基因的表達以及RNA本身的自主複製十分必要。所述RNA還可以編碼形成病毒粒子所必需的M(基質)蛋白。所述RNA還可以編碼病毒粒子感染所必需的包膜蛋白。副粘病毒包膜蛋白包括，引起細胞膜融合的F(融合)蛋白，以及細胞粘附所必需的HN(血凝素-神經氨酸酶)蛋白。但是，HN蛋白並非感染一些細胞類型所必需的蛋白(Markwell，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(4)978-982(1985))，僅有F蛋白就可以實現感染。所述RNA可以編碼除了F蛋白和/或HN蛋白以外的包膜蛋白。
本發明的副粘病毒載體可以是，例如，副粘病毒基因組RNA與病毒蛋白形成的複合體，即核糖核蛋白體(RNP)。RNP可以，例如，與所需轉染試劑一起導入細胞。這種RNP更具體而言，可以是含有副粘病毒基因組RNA，N蛋白，P蛋白，和L蛋白的複合體。將RNP導入細胞後，病毒蛋白使基因組RNA中編碼病毒蛋白的順反子轉錄，同時，基因組自身複製，形成子代RNP。基因組RNA的複製可以用RT-PCR，Northern雜交等檢測RNA拷貝數的增加來確認。
本發明的副粘病毒載體優選副粘病毒的病毒粒子。術語「病毒粒子」指通過病毒蛋白的作用從細胞中釋放的含有核酸的微小粒子。副粘病毒的病毒粒子在來源於細胞膜的脂質膜(也稱包膜)中包含上述RNP，該RNP包含基因組RNA和病毒蛋白。病毒粒子可以具有感染力。感染力是指副粘病毒載體由於保留了它們的細胞粘附能力和膜融合能力，而將該載體中的核酸導入該病毒粒子所粘附的細胞中的能力。本發明的副粘病毒載體可以是傳播型載體或傳播能力缺陷型載體。「傳播型」是指，當病毒載體導入宿主細胞時，該病毒可以在細胞中自主複製，產生感染性病毒粒子。
例如，副粘病毒亞科的每一種病毒中的基因概述如下。其中N基因通常也稱為「NP」。
呼吸道病毒(Respirovirus)屬 NP P/C/V M F HN - L腮腺炎病毒(Rubullavirus)屬 NP P/V M F HN (SH) L麻疹(Morbillivirus)屬 NP P/C/V M F H - L例如，每種仙臺病毒基因的鹼基序列的資料庫登錄號是N基因為M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046和X17218；P基因為M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007和X17008；M基因為D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584和X53056；F基因為D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152和X02131；HN基因為D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X0280和X56131；L基因為D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587和X58886。其它病毒編碼的病毒基因有N基因，如CDV，AF014953；DMV，X75961；HPIV-1，D01070；HPIV-2，M55320；HPIV-3，D10025；Mapuera，X85128；Mumps，D86172；MV，K01711；NDV，AF064091；PDPR，X74443；PDV，X75717；RPV，X68311；SeV，X00087；SV5，M81442；Tupaia，AF079780；P基因，如CDV，X51869；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，X04721；HPIV-4a，M55975；HPIV-4b，M55976；Mumps，D86173；MV，M89920；NDV，M20302；PDV，X75960；RPV，X6831；SeV，M30202；SV5，AF052755；Tupaia，AF079780；C基因，如CDV，AF014953；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，D00047；MV，ABO16162；RPV，X68311；SeV，AB005796；and Tupaia，AF079780；M基因，如CDV，M12669；DMV，Z30087；HPIV-1，S38067；HPIV-2，M62734；HPIV-3，D00130；HPIV-4a，D10241；HPIV-4b，D10242；Mumps，D86171；MV，AB012948；NDV，AF089819；PDPR，Z47977；PDV，X75717；RPV，M34018；SeV，U31956；SV5，M32248；F基因，如CDV，M21849；DMV，AJ224704；HPN-1，M22347；HPIV-2，M60182；HPIV-3，X05303；HPIV-4a，D49821；HPIV-4b，D49822；Mumps，D86169；MV，AB003178；NDV，AF048763；PDPR，Z37017；PDV，AJ224706；RPV，M21514；SeV，D17334；SV5，AB021962；HN(H或N)基因，如CDV，AF112189；DMV，AJ224705；HPIV-1，U709498；HPIV-2，D000865；HPIV-3，AB012132；HPIV-4A，M34033；HPIV-4B，AB006954；Mumps，X99040；MV，K01711；NDV，AF204872；PDPR，Z81358；PDV，Z36979；RPV，AF132934；SeV，U06433；SV-5，S76876。但是，已知每種病毒有多種毒株，並且由於毒株之間的差異，還存在包含除上述以外的序列的基因。
這些病毒蛋白的ORF可以在基因組RNA中藉助上述E-I-S序列而排列為反義序列。離基因組RNA3』端最近的ORF僅需要位於3』前導區和該ORF之間的S序列，不需要E序列或I序列。離基因組5』端最近的ORF需要位於5』尾隨區和該ORF之間的E序列，不需要I序列或S序列。使用例如內部核糖體進入位點(IRES)序列可以將兩個ORF轉錄成單個順反子。在這種情況中，這兩個ORF之間不需要E-I-S序列。在野生型副粘病毒中，典型的RNA基因組具有3』前導區和以反義方向順序編碼N，P，M，F，HN，和L蛋白的六種ORF，在另一端是5』尾隨區。在本發明的基因組RNA中，與野生型病毒一樣，優選在3』前導區之後依次是編碼N，P，M，F，HN，和L蛋白的ORF，然後是5』尾隨區，但基因排列不限於此。一些副粘病毒並未包含所有這6種病毒基因，但即使在這種情況下，優選將各個病毒基因按照上述在野生型中一樣進行排列。一般情況下，持有N，P，和L基因的載體可以在細胞中從RNA基因組自主表達基因，複製基因組RNA。通過F基因和HN基因等編碼包膜蛋白的基因，以及M基因的作用，可以形成感染性病毒粒子，並將它們釋放到細胞外。從而使這種載體變成傳播型病毒載體。可以將編碼含抗體可變區的多肽的基因如下述插入該基因組的蛋白非編碼區。
此外，本發明的副粘病毒載體可以缺陷任一種野生型副粘病毒基因。例如，不含M、F或HN基因或其任意組合的副粘病毒載體可以優選作為本發明的副粘病毒載體。這種病毒載體可以通過，例如外來提供缺陷基因的產物而重建。如此製得的病毒載體象野生型病毒一樣，粘附宿主細胞，引起細胞融合，但由於導入細胞中的載體基因組有病毒基因的缺陷，它們不形成與起始載體具有同樣感染力的子代病毒粒子。因此，這種載體可以用作僅能進行一次基因導入的安全的病毒載體。基因組中可以缺陷的基因有F基因和/或HN基因。例如，用表達F基因缺陷型重組副粘病毒載體基因組的質粒，以及F蛋白表達載體和NP、P、L蛋白表達載體一起轉染宿主細胞，可以重建病毒載體(WO00/70055和WO00/70070；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。也可以通過，例如，利用已經在其染色體中插入了F基因的那些宿主細胞來製得病毒。在外來供應這些蛋白的情況中，這些蛋白的胺基酸序列不必與病毒序列相同，可以使用另一種病毒的突變基因或同源基因作為代用品，只要它們的核酸導入活性與天然型的相同或更高即可。
此外，本發明的病毒載體可以製成包含下述包膜蛋白的載體，所述包膜蛋白與衍生該載體基因組的病毒的包膜蛋白不同。例如，在重構病毒時，可以通過表達除了基本病毒基因組編碼的包膜蛋白以外的其它包膜蛋白來製備包含所需包膜蛋白的病毒載體。這類蛋白無特殊限制，包括其它病毒的包膜蛋白，例如，水泡性口炎病毒(VSV-G)的G蛋白。本發明的病毒載體包括含有VSV-G等包膜蛋白的假型病毒載體，所述包膜蛋白來自與衍生該基因組的病毒不同的病毒。通過設計病毒載體，使這些包膜蛋白不在RNA基因組中編碼，可以在病毒粒子感染細胞後不表達這些病毒。
本發明的病毒載體可以是，例如，在其包膜表面具有可以粘附具體細胞的蛋白的載體，所述蛋白例如粘附因子，配體，受體，抗體或其片段；或者是，含有嵌合蛋白的載體，其中所述蛋白位於細胞外區域，而源自病毒包膜的多肽位於細胞內區域。因此還可以製備靶向具體組織的載體。所述蛋白可以由病毒基因組編碼，或者通過在重建病毒之時表達除了病毒基因組以外的基因(例如，宿主染色體上的其它表達載體或基因)來供給。
本發明的載體所含的任何病毒基因可以通過修飾野生型基因而獲得，從而例如降低病毒蛋白的免疫原性，或者提高RNA轉錄效率或複製效率。具體而言，例如，在副粘病毒載體中，可通過修飾至少一種複製因子NP基因，P基因和L基因來增強轉錄或複製功能。包膜蛋白HN具有血凝素和神經氨酸酶兩種活性；但是，當前一種活性降低時，可以提高病毒在血液中的穩定性，當後一種活性改變時，可以調控其感染力。修飾F蛋白可以調控膜融合能力。例如，可以分析作為細胞表面抗原分子的F蛋白或HN蛋白的表位，以此製備一種病毒載體，其針對這些蛋白的抗原遞呈能力減弱。
本發明的載體可以缺陷任何輔助基因。例如，敲除V基因(一種SeV輔助基因)，可以在不破壞培養細胞中基因的表達和複製的情況下，使SeV對宿主如小鼠的致病性顯著降低(Kato，A.et al.，1997，J.Virol.717266-7272；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587；Curran，J.et al.，WO01/04272，EP1067179)。這種減毒載體特別優選作為體內或回體(exvivo)基因導入所用的無毒性病毒載體。
本發明的病毒載體可以在上述副粘病毒載體基因組中包含編碼多肽的核酸，所述多肽含有抗體可變區。含抗體可變區的那些多肽可以是全長(完整)天然抗體，或其包含抗體可變區的片段，只要它們識別抗原。抗體片段包括Fab，F(ab』)2，和scFv。可將編碼抗體片段的核酸插入基因組的蛋白非編碼區中的任何所需位置。例如，可以將上述核酸插入3』-前導區與最靠近3』-端的病毒蛋白ORF之間；每種病毒蛋白ORF之間；和/或最靠近5』-端的病毒蛋白ORF與5』-尾隨區之間。而且，在缺陷F或HN等基因的基因組中，可以將編碼抗體片段的核酸插入那些缺陷區。在將外來基因插入副粘病毒時，優選所插入的基因的鏈長為6的倍數(Journal of Virology，Vol.67，No.8，1993，p.4822-4830)。需在所插入的外來基因與病毒ORF之間安排E-I-S序列。可以藉助E-I-S序列串聯插入兩個或多個基因。或者，可以藉助IRES(內部核糖體進入位點)插入所需基因。
本發明的載體可以編碼，例如包含抗體H鏈可變區的多肽，以及包含抗體L鏈可變區的多肽。這兩種多肽包含一或多個彼此相連的胺基酸。例如，野生型抗體在H鏈恆定區CH1和CH2之間包含半胱氨酸殘基，它將H鏈和L鏈通過二硫鍵相連。通過從載體表達包含該半胱氨酸的抗體片段，可以使來自H鏈和L鏈的肽彼此相連(實施例1)。或者，通過將彼此相連的標籤肽添加到抗體片段上，可以利用這些標籤肽將來自H鏈和L鏈的肽相連。在天然抗體中，每條H鏈中還有兩個半胱氨酸，形成兩組二硫鍵，它們將H鏈彼此相連。含至少一個半胱氨酸殘基的H鏈彼此相連，形成二價抗體。缺乏使H鏈結合的半胱氨酸的抗體片段形成單價抗體，如Fab。
在本發明中，Fab是指一條包含抗體H鏈可變區的多肽鏈與一條包含L鏈可變區的多肽鏈的複合體。這些多肽彼此結合，形成一個(單價)抗原結合位點。Fab通常可以通過用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白來獲得，但具有與其同等的結構的抗體片段在本發明中也稱為Fab。具體地，Fab可以是一種二聚體蛋白，其中免疫球蛋白L鏈與包含H鏈可變區(Vh)和CH1的多肽鏈相連。H鏈片段的C末端位點可以不被木瓜蛋白酶切割，該片段可以是用另一種蛋白酶或試劑切割的片段，或者它可以是人工設計的片段。在本發明中，Fab包括Fab』(通過用胃蛋白酶消化免疫球蛋白，並裂解H鏈之間的二硫鍵而獲得)和Fab(t)(通過用胰蛋白酶消化免疫球蛋白而獲得)，因為它們具有與Fab同等的結構。免疫球蛋白的類別無限制，包括所有類別，如IgG和IgM。Fab通常在H鏈片段和L鏈片段的C末端附近包含半胱氨酸，致使這兩種片段可以通過二硫鍵彼此相連。但是在本發明中，Fab不必被二硫鍵連接，而且例如，通過添加可以彼此相連從而與L鏈片段和L鏈片段相連的肽片段，可以使這兩條鏈藉助這些肽形成Fab。
在本發明中，F(ab』)2是指缺失了抗體恆定區的抗體，或具有與其同等的結構的蛋白複合體。具體地，F(ab』)2是指包含兩個複合單位的蛋白複合體，其中的每一個複合單位包括一條含有抗體H鏈可變區的多肽鏈和一條含有抗體L鏈可變區的多肽鏈。F(ab』)2是含有兩個抗原結合位點以及H鏈鉸鏈區的抗體，一般通過用pH接近4的胃蛋白酶消化抗體而獲得。但在本發明中，F(ab』)2可以通過用另一種蛋白酶或試劑切割而獲得，或者可以人工設計。肽鏈可以通過二硫鍵或其它連接方式連接。免疫球蛋白類別不限，包括所有類別，如IgG和IgM。
scFv是指一種多肽，其中抗體H鏈可變區和L鏈可變區都包含在單個多肽鏈中。所述H鏈可變區和L鏈可變區藉助適當長度的間隔臂相連，該間隔臂的長度適於所述H鏈和L鏈彼此相連，從而形成抗原結合位點。
載體中所攜帶的外來基因的表達水平可以用添加到該基因上遊(負鏈3』-側)的轉錄起始序列的類型來調節(WO01/18223)。也可以通過控制外來基因在基因組中的插入位置來控制表達水平插入位置越靠近負鏈3』-末端，表達水平越高；插入位置越靠近負鏈5』-末端，表達水平越低。因此，為獲得所需表達水平，可以適當控制外來基因的插入位置，使之與前和後的病毒蛋白編碼基因的組合最佳。一般來說，由於認為抗體片段高水平表達較有利，故優選將編碼抗體的外來基因與高效轉錄起始序列相連，並將其插入負鏈基因組3』-端附近。具體地，可以將外來基因插入3』-前導區與靠近3』-端的病毒蛋白ORF之間。或者，可以將外來基因插入最靠近3』-端的病毒基因ORF與次靠近3』-端的病毒基因之間。在野生型副粘病毒中，最靠近基因組3』-端的病毒蛋白基因是N基因，次靠近的基因是P基因。反之，當不希望所插入的基因高水平表達時，可以，例如，通過將外來基因插入載體中儘可能靠近負鏈基因組5』-側的位置，或者通過選擇低效率轉錄起始序列，來抑制病毒載體的基因表達水平，從而獲得相應效果。
當一條含H鏈可變區的多肽以及一條含L鏈可變區的多肽，這兩者都要從載體表達時，可以將所述多肽各自的核酸插入載體基因組中。優選這兩種核酸藉助E-I-S序列串聯排列。優選使用轉錄起始效率高的S序列，例如，5』-CTTTCACCCT-3』(負鏈，SEQ ID NO1)。
本發明的載體可以在編碼抗體片段的基因的插入位置以外持有其它外來基因。對這類外來基因沒有限制。例如，它們可以是用於控制載體感染的標記基因，或者是細胞因子、激素及免疫系統其它調節因子的基因。本發明的載體可以將基因直接(體內(in vivo))給藥到活體中的目標位置，或者間接(回體(ex vivo))給藥，即將本發明的載體導入來自患者的細胞或其它細胞中，然後將這些細胞注入目標位置。
本發明的載體所攜帶的抗體可以是抗宿主可溶性蛋白、膜蛋白、結構蛋白、酶等等的抗體。它們優選包括抗與信號傳遞相關的分泌蛋白或其受體的抗體，抗細胞內信號傳遞分子的抗體。例如，所述抗體包括抗細胞外受體區的抗體，或抗受體配體的抗體(例如，抗配體的受體結合位點的抗體)。通過給藥表達這類抗體的載體，可以抑制配體與受體結合，從而阻斷經由該受體傳遞的信號。尤其，本發明載體所攜帶的抗體優選是對疾病或損傷具有治療效果的抗體。關於攜帶抗體基因的基因導入載體已有多篇報導。幾乎所有這些報導都旨在靶向這些載體。已報導的、以靶向為目的、攜帶抗體基因的基因導入載體使用的病毒例如逆轉錄病毒(Somia，N.V.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(16)7570-7574(1995)；Marin，M.et al.，J.Virol.70(5)2957-2962(1996)；Chu，T.H. Dornburg，R.，J.Virol.71(1)720-725(1997)；Ager，S.et al.，Hum.Gene Ther.7(17)2157-2167(1997)；Jiang，A.et al.，J.Virol.72(12)10148-10156(1998)；Jiang，A. Durnburg，R.Gene Ther.6(12)1982-1987(1999)；Kuroki，M.et al.，Anticancer Res.20(6A)4067-4071(2000)；Pizzato，M.et al.，Gene Ther.8(14)1088-1096(2001)；Khare，P.D.et al.，CancerRes.61(1)370-375(2001))，腺病毒(Douglas，J.T.et al.，Nat.Biotechnol.14(11)1574-1578(1996)；Curiel，D.T.Ann.NY Acad.Sci.886 158-171(1999)；Haisma，H.J.et al.，Cancer Gene Ther.7(6)901-904(2000)；Yoon，S.K.et al.，BiochemBiophys.Res.Commun.272(2)497-504(2000)；Kashentseva，E.A.et al.，Cancer Res.62(2)609-616(2002))，腺伴隨病毒(AAV)(Bartlett，J.S.et al.，Nat.Biotechnol.17(4)393(1999)，MVA(Paul，S.et al.，Hum.Gene Ther.11(10)1417-1428(2000))，及麻疹病毒(Hammond，A.L.J.Virol.75(5)2087-2096(2001))。幾乎所有例子都是使用單鏈抗體(scFv)，其中大多數是靶向癌細胞。通過用本發明的載體製備包膜表面包含所述抗體的副粘病毒，還可以構建感染特定細胞的靶向載體。例如，通過攜帶編碼抗促炎細胞因子(如白細胞介素-6(IL-6)或成纖維細胞生長因子(FGF))的抗體，本發明的載體可以用作靶向類風溼性關節炎(RA)等自身免疫病和癌症的載體。我們非常希望用表達自殺基因或癌症疫苗蛋白的這些靶向載體來治療癌症。
但是，本發明載體的優勢還在於，它們除了可以進行上述靶向以外，還具有其它用途。例如，本發明提供編碼抗體的副粘病毒載體，其中所述抗體對疾病或損傷具有治療效果。例如，為了治療癌症，攜帶抗-erbB-2抗體的scFv基因的腺病毒載體可以用作內抗體(intrabody，一種在細胞內發揮作用的抗體)(Kim，M.et al.，Hum.Gene Ther.8(2)157-170(1997)；Deshane，J.et al.，Gynecol.Oncol.64(3)378-385(1997))，到目前為止已進行到臨床研究階段(Alvarez，R.D. Curiel，D.T.Hum.Gene Ther.8(2)229-242(1997)；Alvarez，R.D.et al.，Clin.Cancer Res.6(8)3081-3087(2000))。在將scFv基因攜帶在腺病毒載體中用於同樣的癌症治療方面，已有關於同樣的抗-erbB-2抗體作為分泌型抗體、而不是作為內抗體的報導(Arafat，W.O.et al.，GeneTher.9(4)256-262(2002))；關於抗-4-1BB(T細胞活化分子)抗體的報導(Hellstrom，Y.Z.et al.，Nat.Med.8(4)343-348(2002))；以及關於抗-CEA(癌胚抗原)抗體的報導(Whittington，H.A.et al.，Gene Ther 5(6)770-777(1998))，等等。這些載體主要利用scFv。用本發明載體構建的編碼這些抗體的副粘病毒可以用作能體內給藥以便進行醫學治療的病毒載體。由於本發明的載體不摻入宿主染色體並因此具有安全性，還由於它們可以在數日到數周的時間內表達所攜帶的基因，它們可以用於治療各種疾病和損傷。本發明載體的優秀在於，它們不僅可以如上述攜帶scFv，還可以同時攜帶H鏈基因和L鏈基因，從而表達多聚體如Fab，F(ab』)2，或完整(全長)抗體，而且它們因此可以產生包含多條鏈的抗體複合體。編碼組成Fab，完整抗體(全長抗體)，其片段等等的H鏈和L鏈的載體預計比表達scFv的載體具有更好的治療效果。
本發明的載體除了涉及上述癌症治療以外還涉及多種應用。例如，關於除癌症以外的疾病，已有抗REV，抗gp120或抗整合酶的HIV治療的報導，它們利用的是逆轉錄病毒載體(Ho，W.Z.et al.，AIDS Res.Hum.Retroviruss 14(17)1573-1580(1998))；AAV載體(Inouye，R.T. et al.，J.Virol.71(5)4071-4078(1997))，SV40(BouHamdan，M.et al.，Gene Ther.6(4)660-666(1999))；或質粒(Chen，S.Y.et al.，Hum.Gene Ther.5(5)595-601(1994))。上述所有實例都是利用scFv。關於其它感染性疾病，已有將完整抗-狂犬病毒抗體攜帶在狂犬病毒疫苗株中的報導(Morimoto，K.et al.，J.Immunol.Methods 252(1-2)199-206(2001))，以及將抗-新培斯病毒抗體的H鏈和L鏈分別攜帶在不同的新培斯病毒載體中的報導(Liang，X.H.Mol.Immunol.34(12-13)907-917(1997))。上述後兩種情況都在病毒載體中成功攜帶了完整抗體，並分泌出大量活性病毒。但是，上兩篇報導涉及單克隆抗體製備系統，根本不涉及給藥這些載體來治療感染性疾病。而且，從安全性等角度考慮，實際治療中體內給藥(臨床應用)上述載體不能指望所述抗體局部高表達。相反，本發明的載體具有適用於抗體生成和基因治療兩方面的優點。特別是，本發明的載體對人不具有致病性，因此尤其可以作為載體攜帶對人類非常安全的用於基因治療的抗體基因。預計局部給藥本發明的載體進行治療，可以在體內(臨床應用)中獲得局部高表達。
特別適於從本發明載體進行表達的抗體是那些抗細胞內信號傳遞相關分子以及抗細胞外信號傳遞相關分子的抗體。當然，本發明優選採用抗抑制神經生存和分化或軸索伸長的配體和受體的抗體。這類信號分子包括NOGO等神經軸索伸長抑制物。表達抗神經軸索伸長抑制物的抗體的載體使得有可能對神經損傷進行新的基因治療。
很多組織在損傷後仍具有自我再生能力，神經系統也是如此，末梢神經的軸索(axon)在切斷或磨損等損傷後能延伸並再生。但是，腦和脊髓等中樞神經系統的神經細胞未顯示損傷後軸索伸長，也不具有再生能力(RamonyCajal S，New YorkHafner(1928)；Schwab，M.E.and Bartholdi，D.Physiol.Rev.76，319-370(1996))。但是，已經證實，即使是中樞神經系統在移植到末梢組織後也顯示軸索伸長(David，S.and Aguayo，A.J.Science 214，931-933(1981))，因此假設，中樞神經系統的神經細胞天生具有再生軸索的能力，但中樞神經系統的環境抑制了軸索伸長，即中樞神經系統中存在抑制神經細胞再生(軸索伸長)的因子。
實際上，NOGO已被鑑定為神經軸索伸長抑制物(Prinjha，R.et al.，Nature 403，383-384(2000)；Chen，M.S.et al.，Nature 403，434-439(2000)；GrandPre，T.et al.，Nature 403，439-444(2000))。現有三種已知的Nogo同工型Nogo-A(Ac.No.AJ242961，(CAB71027))，Nogo-B(Ac.No.AJ242962，(CAB71028))，和Nogo-C(Ac.No.AJ242963，(CAB71029))，預計它們是剪接變體。神經軸索伸長抑制活性以最大的NOGO，Nogo-A(分子量約250kDa)為最強，活性位點預計是所有三種同工型共有的胞外區66個胺基酸(GrandPre，T.et al.，Nature 403，439-444(2000))。因此，編碼與Nogo-A，Nogo-B或Nogo-C結合的抗體的副粘病毒載體可以優選用於促進神經形成。已知IN-1是抗-NOGO單克隆抗體。根據報導，IN-1可以在體外中和少突膠質細胞(oligodendrocyte)和髓磷脂(myelin)對軸索伸長的抑制作用(Caroni，P.and Schwab，M.E.Neuron 1，85-96(1988))。在一種誘導了脊髓機械損傷的大鼠體內模型中，將IN-1給藥到受損部位導致該受損部位5％的軸索伸長，使功能顯著恢復(Bregman，B.S.et al.，Nature 378，498-501(1995))。因此，抗具有中樞神經軸索伸長抑制活性的體內因子的中和抗體很有可能在中樞神經系統神經細胞再生中有效。除NOGO以外，具有類似活性(神經軸索伸長抑制活性)的已知因子包括semaphorin，ephrin，slit等(semaphorinGenbank Ac.Nos.NM_006080(蛋白NP_006071)，L26081(AAA65938)；ephrinAc.Nos.NM 001405(NP_001396)，NM_005227(NP_005218)，NM_001962(NP_001953)，NM_004093(NP_004084)，NM_001406(NP_001397)；slitAc.Nos.AB017167(BAA35184)，AB017168(BAA35185)，AB017169(BAA35186))(Chisholm，A.and Tessier-Lavigne，M.Curr.Opin.Neurobiol.9，603-615(1999))。即使具有不同作用，抗這些因子的抗體也可以使中樞神經系統中一般認為不具有再生能力的軸索伸長。因此，這些抗體不僅可以象IN-1顯示的那樣應用於脊髓損傷，而且可以應用於多種神經變性疾病。
此外，抗以下物質的抗體也是有用的具有與NOGO同樣的神經軸索伸長抑制活性的髓磷脂-相關糖蛋白(MAG)(ACCESSION NM_002361(NP_002352)，NM_080600(NP_542167)，Aboul-Enein，F.et al.，J.Neuropathol.Exp.Neurol.62(1)，25-33(2003)；Schnaar，R.L.et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.845，92-105(1998)；Spagnol，G.et al.，J.Neurosci.Res.24(2)，137-142(1989)；Sato，S.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.163(3)，1473-1480(1989)；Attia，J.et al.，Clin.Chem.35(5)，717-720(1989)；Quarles，R.H.，Crit Rev Neurobiol 5(1)，1-28(1989)；Barton，D.E.et al.，Genomics 1(2)，107-112(1987)；McKerracher，L.et al.(1994)Identification of myelin-associated glycoprotein asa major myelin-derived inhibitor of axonal growth.Neuron 13805-811；Mukhopadhay，G.et al.(1994)A novel role for myelin associated glycoprotein asan inhibitor of axonal regeneration.Neuron 13757-767；Tang，S.et al.(1997)Soluble myelin-associated glycoprotein(MAG) found in vivo inhibits axonalregeneration.Mol Cell Neurosci 9333-346；Nogo受體，它是NOGO和MAG的共同受體(Nogo-66受體)(ACCESSION NM_023004(NP_075380，Q9BZR6)，Josephson，A.，et al.，J.Comp.Neurol.453(3)，292-304(2002)；Wang，K.C.，et al.，Nature 420(6911)，74-78(2002)；Wang，K.C.，et al.，Nature 417(6892)，941-944(2002)；Fournier，A.E.，et al.，Nature 409(6818)，341-346(2001)；Dunham，I.，et al.，Nature 402(6761)，489-495(1999)；Strausberg，R.L.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)，16899-16903(2002)；GrandPre，T.etal.，Nature 417(6888)，547-551(2002)；Liu，B.P.et al.，Science 297(5584)，1190-1193(2002)；Woolf，C.J.and Bloechlinger，S.，Science 297(5584)，1132-1134(2002)；Ng，C.E.and Tang，B.L.，J.Neurosci.Res.67(5)，559-565(2002))，對軸索伸長具有抑制作用的硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)等位於膠質周邊的細胞外基質(Rudge，JS，Silver，J.(1990)Inhibition of neuriteoutgrowth on astroglial scars in vitro.J Neurosci 103594-3603；McKeon，RJ，etal.(1999)The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan areexpressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar.J Neurosci 1910778-10788；Smith-Thomas，LC et al.(1995)Increased axon regeneration inastrocytes grown in the presence of proteoglycan synthesis inhibitors.J Cell Sci1081307-1315；Davies，SJA，et al.(1997)Regeneration of adult axons in whitematter tracts of the central nervous system.Nature 390680-683；Fidler，PS et al.(1999)Comparing astrocytic cell lines that are inhibitory or permissive for axongrowththe major axon-inhibitory proteoglycan is NG2.J Neurosci198778-8788)，尤其NG2(Levine，JM et al.(1993)Development anddifferentiation of glial precursor cells in the rat cerebellum.Glia 7307-321)，neurocan(Asher，RA et al.(2000)Neurocan is upregulated in injured brain andin cytokine-treated astrocytes.J Neurosci 202427-2438；Haas，CA，et al.(1999)Entorhinal cortex lesion in adult rats induces the expression of the neuronalchondroitin sulfate proteoglycan neurocan in reactive astrocytes.J Neurosci 199953-9963)，phosphacan(McKeon，RJ et al.(1999)The chondroitin sulfateproteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes inthe chronic CNS glial scar.J Neurosci 1910778-10788)，以及versican(Morven，C.，et al.，Cell Tissue Res(2001)305267-273)(Genbank Ac.Nos.NM_021948(protein NP_068767)，NM_004386(protein NP_004377))(McKerracher，L.and Ellezam，B.(2002)Putting the brakes on regeneration.Science 296，1819-20；McKerracher，L.and Winton，MJ(2002)Nogo on the go.Neuron 36，345-8)。
在了解了每一種因子的作用以後，可以選出更適用於每一種神經變性疾病的配體，並且可以將抗所述因子的抗體應用於具體的神經變性疾病。
例如，在考慮用攜帶這些抗體基因的副粘病毒載體治療脊髓損傷時，可以採用將所述載體直接給藥到受損部位的方法。由於載體表達水平非常高，還可以預計將它們給藥到靠近受損部位的脊髓腔中的可能性。此外，軸索受損變性後，需要數日的時間才能進入再生期，因此有充裕的時間來考慮是否給藥。此外，由於變性伴有的炎症反應在損傷後很快變得活躍，故極有可能在損傷數日後，具體是損傷3-10日後，實際給藥病毒載體。還有可能考慮聯合使用不僅攜帶抗神經軸索伸長抑制因子中和抗體的基因、而且攜帶軸索伸長積極促進因子的基因的載體，蛋白或具有類似活性的化合物。膠質細胞衍生的神經營養因子(GDNF)等神經營養因子可以用作軸索伸長促進因子。
本發明還涉及編碼下述多肽的副粘病毒載體，所述多肽包含編碼抑制免疫反應的抗體可變區。本發明人發現，載體自身固有的免疫原性可以通過在該載體中攜帶抑制免疫反應的抗體的基因而減弱。例如，可以利用表達抗免疫細胞協同刺激因子或其受體的抗體的載體，來抑制該協同刺激因子引起的信號傳遞，從而抑制免疫系統活化和實現該載體中所攜帶的基因的長期表達。這種經修飾的載體尤其可在將基因導入活體時用作載體。被這類抗體抑制的靶分子包括任何傳遞免疫活化信號的所需信號分子，可以是生長因子或細胞因子等體液因子，或它們的受體。
已知針對病毒的活體防禦機制是複雜而多重的。這種重要系統是活體防禦所必需的，但在利用病毒載體進行基因治療時卻是最好能避免的。這類機制之一是，被RNA病毒感染產生的雙鏈RNA所活化的幹擾素調節因子3(IRF-3Lin，R.et al.，Mol.Cell.Biol.18(5)2986-2996(1998)；Heylbroeck，C.et al.，J.Virol.74(8)3781-3792(2000)，Genbank Ac.No.NM_001571(protein NP_001562))，雙鏈RNA活化的蛋白激酶(PKRDer，S.D. Lau，A.S.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92，8841-8845(1995)；Dejucq，N.et al.，J.Cell.Biol.139(4)865-873(1997)，Genbank登錄號AH008429(protein AAF13156))等等，活化下遊轉錄因子，加速幹擾素(IFN)等的表達。例如，通過攜帶內抗體(intrabody)等能抑制IRF-3或PKR活性、且為細胞內有功能形式的抗體的基因的載體，有可能對天然免疫反應進行部分地抑制，以便能通過持續感染而持續表達所攜帶的基因。實際上，在表達高水平的反義PKR而抑制PKR活性的細胞中，腦心肌炎病毒至少在體外水平顯示持續感染(Yeung，M.C.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(21)11860-11865(1999))。Toll-樣受體(TLR)家族中的TLR-3已顯示能識別雙鏈RNA，通過病毒感染誘導天然免疫(Alexopoulou，L.et al.，Nature 413，732-738(2001))。TLR-4也顯示通過呼吸道合胞病毒感染而參與相同的免疫誘導(Haynes，L.M.et al.，J.Virol.75(22)10730-10737(2001))。有可能抗TLR-3或TLR-4(TLR-3GenbankAc.No.NM_003265(protein NP_003256)；TLP-4Genbank Ac.No.AH009665(proteinAAF89753))的中和抗體也對病毒載體的持續基因表達有貢獻。
同樣，也有可能應用以減弱病毒載體的免疫原性為目的、在器官移植中嘗試的方法。即為了外周免疫耐受的目的而在載體中攜帶抗體基因。有人提出以下的T細胞活化模型(Schwartz，R.H.et al.，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.2，605-610(1989))靜止期T細胞的活化需要來自T細胞受體(TCR)，抗原，以及組織相容性複合體(MHC)的信號，還需要第二協同刺激信號。當在缺乏第二信號的情況下發生抗原刺激時，T細胞的不活化可以誘導免疫耐受。如果能以這種方式在病毒載體感染的細胞中誘導免疫耐受，就可以在不抑制其它免疫反應的同時避免對病毒載體產生免疫反應。這是理想的方法。CD28已被鑑定為T細胞協同刺激因子(登錄號J02988(proteinAAA60581)，AF222341(AAF33792)，AF222342(AAF33793)，和AF222343(AAF33794))，它與抗原呈遞細胞表面的CD80(登錄號NM 005191(NP_005182))和CD86(登錄號U04343(AAB03814)，NM_006889(NP_008820))相互作用可放大來自TCR的刺激，通過產生IL-2等進一步活化T細胞。另一方面，CTLA-4(細胞毒T淋巴細胞抗原4CD152)(登錄號L15006，(AAB59385))以高親和力結合與CD28共有的配體(CD80，CD86)，發揮抑制T細胞的作用(Walunas，T.L.et al.，Immunity1(5)405-413(1994))。PD-1L及其受體PD-1已知是同樣的活化配體(PD-1Genbank Ac.No.U64863(protein AAC51773)，PD-1LAF233516(protein AAG18508；在本說明書中它們統稱為PD-1))(Finger，L.R.et al.，Gene 197，177-187(1997)；Freeman，G.J.et al.，J.Exp.Med.192，1027-1034(2000))。據說，T細胞表面的淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)(登錄號Y00057(CAA68266))與抗原呈遞細胞表面的細胞間粘附分子-1(ICAM-1CD54)(登錄號J03132(AAA52709)，X06990(CAA30051))結合，同樣參與協同刺激。根據以上描述，攜帶抑制CD28的抗體、模擬CTLA-4活性的抗體、和/或抑制LFA-1與ICAM-1結合的抗體的基因的病毒載體預計可以使受染細胞獲得外周免疫耐受，並實現長期基因表達或多重給藥。實際上，對器官移植病例的研究顯示，短期給藥相應抗體可以誘導出免疫耐受。例如，關於利用能抑制協同刺激因子CD28結合的抗-CD28抗體的效果(Yu，X.Z.et al.，J.Immunol.164(9)4564-4568(2000)；Laskowski，I.A.et al.，J.Am.Soc.Nephrol.13(2)519-527(2002))，關於利用具有抑制T細胞活化功能的CTLA-4自身與IgG1·Fc結合形成的蛋白(CTLA4-Ig)的效果(Pearson，T.C.et al.，Transplantation 57(12)1701-1706(1994)；Blazzer，B.R.et al.，Blood 85(9)2607-2618(1995)；Hakim，F.T.et al.，J.Immunol.155(4)1757-1766(1995)；Gainer，A.L.et al.，Transplantation 63(7)1017-1021(1997)；Kirk，A.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(16)8789-8794(1997)；Comoli，P.et al.，Bone Marrow Transplant27(12)1263-1273(2001))，以及關於利用能抑制LFA-1與ICAM-1結合的抗體的效果(Heagy，W.et al.，Transplantation 37(5)520-523(1984)；Fischer，A.etal.，Blood 77(2)249-256(1991)；Guerette，B.et al.，J.Immunol.159(5)2522-2531(1997)；Nicolls，M.R.et al.，J Immunol.164(7)3627-3634(2000)；Poston，R.S.et al.，Transplantation 69(10)2005-2013(2000)；Morikawa，M.etal.，Transplantation 71(11)1616-1621(2001)；Da Silva，M.et al.，J.Urol. 166(5)1915-1919(2001))都有報導。而且，利用與CD28和CTLA-4結構和功能類似的、最近鑑定的誘導型協同刺激因子(ICOSWallin，J.J.et al.，J.Immunol.167(1)132-139(2001)；Sperling，A.I. Bluestone，J.A.Nat.Immunol.2(7)573-574(2001)；Ozkaynak，E.et al.，Nat.Immunol.2(7)591-596(2001)；Ac.No.AJ277832(CAC06612))進行同樣的研究，確認了抗-ICOS抗體的效果(Ogawa，S.et al.，J.Immunol.167(10)5741-5748(2001)；Guo，L.et al.，Transplantation73(7)1027-1032(2002))。利用病毒載體的方法已有報導，攜帶CTLA4-Ig基因的腺病毒載體在器官移植中的應用已有研究(Pearson，T.C.et al.，Transplantation 57(12)1701-1706(1994)；Li，T.S.et al.，Transplantation 72(12)1983-1985(2001))。
上述以器官移植中外周免疫耐受為目的的方法，也可以在利用病毒載體進行基因導入時作為誘導免疫耐受的有效方法，通過在病毒載體中攜帶相應抗體基因(或CTLA4-Ig)可以實現長期基因表達或反覆給藥。在這一方面，關於腺病毒載體的報導表明，將攜帶CTLA4-Ig基因的腺病毒載體與攜帶另一種標記基因(lacZ)的載體一起給藥，可以抑制免疫反應並延長標記基因的表達(Ali，R.R.et al.，Gene Ther.5(11)1561-1565(1998)；Ideguchi，M.etal.，Neuroscience 95(1)217-226(2000)；Uchida，T.et al.，Brain Res.898(2)272-280(2001))。在這種簡單系統中，免疫耐受僅用CTLA4-Ig基因和另一載體中攜帶的標記基因來檢查。關於在同一載體中攜帶這兩種基因，用抗體基因抑制另一種協同刺激因子，或者具體是副粘病毒載體的效果等沒有報導，也根本沒有詳細的檢查。在本發明中，可以使用抗上述各種信號分子的抗體的基因，而且可以從單個載體表達多個基因，如誘導免疫耐受的抗體基因，以及治療基因(或標記基因)。特別是，通過用抗體基因抑制T細胞活化的協同刺激因子的作用，可以，例如，構建局限於給藥部位、能長期表達作用於免疫系統的基因的載體，也可以反覆(多次)給藥。
攜帶抗這些因子或受體的抗體基因的副粘病毒載體可以用作另外攜帶治療基因的治療載體。或者將這類副粘病毒載體與另一種攜帶治療基因的載體一起給藥可以長期表達治療基因和/或反覆給藥。任何疾病都可以作為基因治療的目標。與用每一種治療基因進行基因治療一致的治療方法可以用作給藥本發明載體的方法。
本發明編碼誘導免疫耐受的抗體的載體與不編碼該抗體的對照載體相比，活體給藥後基因表達持續性出現升高。基因表達持續性可以通過，例如將本發明的載體和對照載體以相同滴度給藥相同部位(例如，左右對稱的部位)，以剛剛給藥後的水平為100，測量相對表達水平的經時變化來評價。例如，可以測量，給藥後相對表達水平降低到50，30，或10所需的時間；或在預定時間之後的相對表達水平。本發明的載體與對照相比，表達水平的持續性出現統計學顯著的升高(例如，5％以上的顯著性水平)。統計學分析可以用，例如t檢驗來進行。
與此同時，通過給藥抗協同刺激信號分子的抗體，或CTLA-4或其片段，可以使載體的基因表達持續性進一步延長。可以用抗上述CD28，CD80，CD86，LFA-1，ICAM-1(CD54)，ICOS等的抗體作為抗協同刺激信號分子的抗體。這類抗體片段可以按照，例如「Japanese Biochemical Society，ed.，NewBiochemical Experiment Manual 12，Molecular Immunology III，pp 185-195(Tokyo Kagaku Dojin)」和/或「Current Protocols in Immunology，Volume 1，(John Wiley Sons，Inc.)」所述來製備。抗體片段可以通過，例如，用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等蛋白酶消化抗體而獲得。或者，可以通過分析可變區的胺基酸序列，將這些序列表達為重組蛋白來製備這些片段。抗體還可以包括人源化抗體和人抗體。抗體可以用蛋白A層析柱，蛋白G層析柱等通過親和層析純化。任何所需多肽都可以用作CTLA-4或其片段，只要它們包含CTLA-4的CD80/CD86結合位點，並與CD80和/或CD86結合而抑制與CD28的相互作用；但優選使用，例如IgG(例如，IgG1)Fc片段與CTLA-4胞外區融合形成的可溶性多肽。這些多肽和抗體可以通過凍幹而配製成藥物製劑，或者與所需可藥用承運體，具體是生理鹽水或磷酸鹽緩衝液(PBS)等配製成水性組合物。本發明涉及包含這些多肽或抗體以及本發明載體的基因轉導試劑盒。這些試劑盒可以用於延長載體給藥後的表達期，尤其是用於延長反覆給藥的載體的基因表達期。
為了製備本發明的載體，可以在哺乳動物細胞中，在有包含副粘病毒基因組RNA的RNP重建所必需的病毒蛋白(即N，P，和L蛋白)存在的條件下，轉錄本發明編碼副粘病毒基因組RNA的cDNA。病毒RNP可以通過產生負鏈基因組(即與病毒基因組相同的反義鏈)或正鏈(編碼病毒蛋白的有義鏈)來重建。優選通過產生正鏈來提高載體重建的效率。RNA末端優選儘可能正確反映天然病毒基因組3』-前導序列和5』-尾隨序列的末端。例如，為了正確調節轉錄產物的5』-端，可以利用T7 RNA聚合酶的識別位點作為轉錄起始點，在細胞中表達RNA聚合酶。例如，為了調節轉錄產物的3』-端，可以在轉錄產物的3』-端編碼自我切割型核酶，以便用該核酶正確切割3』-端(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587；and Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2457-466)。
可以按照例如Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587；Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2457-466中記載方法，如下構建帶有外來基因的重組仙臺病毒載體。
首先，製備包含所需外來基因的cDNA序列的DNA樣品。優選此DNA樣品在25ng/μl或更高的濃度可以通過電泳確認為單個質粒。下面是一個利用NotI位點將外來基因插入編碼病毒基因組RNA的DNA中的實例。當目的cDNA鹼基序列中包含NotI識別位點時，優選事先用定點誘變法等改變鹼基序列以除去該位點，但不改變所編碼的胺基酸序列。目標基因片段通過PCR從所述DNA樣品擴增並回收。通過在一對引物的5』區添加NotI位點，使擴增片段的兩個末端都為NotI位點。引物中包括E-I-S序列或其片段，導致將外來基因插入病毒基因組之後，在外來基因的ORF兩側，以及病毒基因ORF之間各有一個E-I-S序列。
例如，正向側合成DNA序列在5』-末端包含任意兩個或多個核苷酸(優選4個核苷酸，不包括GCG和GCC等來自NotI識別位點的序列，更優選ACTT)，以確保用NotI消化。在該序列的3』-末端添加NotI識別序列gcggccgc。另外，在3』-側還添加任意9個核苷酸或9加6的倍數個核苷酸作為間隔臂序列。進一步地，還在3』-末端添加所需cDNA ORF的約25個核苷酸的序列，它從起始密碼子ATG開始並包括ATG。優選地，從所需cDNA選取約25個核苷酸作為正向側合成DNA的3』-末端，使最後一個核苷酸為G或C。
反向側合成DNA序列在5』末端包含任意兩個或多個核苷酸(優選4個核苷酸，不包括GCG和GCC等來自NotI識別位點的序列，更優選ACTT)。在該序列的3』-末端添加NotI識別序列『gcggccgc』。另外，在3』-末端還添加oligo DNA插入片段以調整長度。該Oligo DNA的長度如下設計最終PCR擴增產物的NotI片段，包括添加的E-I-S序列，總鏈長為6的倍數個核苷酸(所謂「6的法則」；Kolakofski，D.，et al.，J.Virol.72891-899，1998；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993)。當在該引物中添加E-I-S序列時，在oligo DNA插入片段的3』-末端添加仙臺病毒S序列的互補序列(優選5』-CTTTCACCCT-3』；SEQID NO1)、I序列的互補序列(優選5』-AAG-3』)、E序列的互補序列(優選5』-TTTTTCTTACTACGG-3』；SEQ ID NO2)；進一步在該3』-末端添加自所需cDNA終止密碼子起反向計數的約25個核苷酸的互補序列，使其最後一個核苷酸為G或C，製得反向側合成DNA的3』末端。
PCR可以利用Taq聚合酶或其它DNA聚合酶按常規方法進行。目的擴增片段用NotI消化，然後插入pBluescript等質粒載體的NotI位點。所得PCR產物的鹼基序列用測序儀確認，選出具有正確序列的質粒。質粒中的插入片段用NotI切出，克隆至包含基因組cDNA的質粒的NotI位點。也可以不利用質粒載體，直接將所述片段插入NotI位點，獲得重組仙臺病毒cDNA。
例如，重組仙臺病毒基因組cDNA可以根據文獻記載的方法構建(Yu，D.et al.，Genes Cells 2457-466，1997；Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997)。例如，首先將帶有NotI識別位點的18bp間隔臂序列(5′-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3′；SEQ ID NO3)插到克隆化仙臺病毒基因組cDNA(pSeV(+))中前導序列與N蛋白ORF之間，得到帶有源自δ肝炎病毒反基因組鏈的自我切割型核酶位點的質粒pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 782813-2820)。將外來基因片段插入pSeV18+b(+)的NotI位點，能獲得插入了所需外來基因的重組仙臺病毒cDNA。
按上述製備的重組副粘病毒基因組RNA的編碼DNA，在上述病毒蛋白(L、P和N)存在的情況下，在細胞中轉錄，可以重建本發明的載體。本發明提供，用於製備本發明載體的、編碼本發明載體中病毒基因組RNA的DNA。本發明還涉及編碼載體基因組RNA的DNA用於製備本發明載體的用途。重組病毒可以按照公知的方法重建(WO97/16539；WO97/16538；Durbin，A.P.et al.，1997，Virology 235323-332；Whelan，S.P.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392；Schnell.M.J.et al.，1994，EMBO J.134195-4203；Radecke，F.et al.，1995，EMBO J.145773-5784；Lawson，N.D.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481；Garcin，D.et al.，1995，EMBO J.146087-6094；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1569-579；Baron，M.D.andBarrett，T.，1997，J.Virol.711265-1271；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9315400-15404)。用這些方法能從DNA重建(-)鏈RNA病毒，包括副流感病毒、水皰性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒和仙臺病毒。本發明載體可以用這些方法重建。當病毒載體DNA中缺失F、HN和/或M基因時，無法形成感染性病毒粒子，但有可能將這些缺失基因和/或編碼其它病毒包膜蛋白的基因導入宿主細胞並表達，從而能產生感染性病毒粒子。
具體地，所述病毒可以如下製備(a)在表達N、P和L蛋白的細胞中轉錄編碼副粘病毒基因組RNA或其互補鏈(正鏈)的cDNA，(b)從這些細胞或其培養上清中回收包含基因組RNA的複合體。為了進行轉錄，將編碼基因組RNA的DNA連接到適當啟動子的下遊。如此轉錄的基因組RNA在有N，L和P蛋白存在的情況下複製形成RNP複合體。然後，在有M、HN，和F蛋白存在的情況下，形成包裹在包膜中的病毒粒子。例如，可以將編碼基因組RNA的DNA連接到T7啟動子的下遊，然後通過T7 RNA聚合酶轉錄成RNA。除了包含T7聚合酶識別序列的啟動子以外，可以利用其它任何所需的啟動子。或者，也可以用體外轉錄的RNA轉染細胞。
從DNA起始基因組RNA轉錄所必需的T7 RNA聚合酶等酶類，可以通過例如，轉導能表達它們質粒載體或病毒載體，或者將其基因摻入細胞染色體以便能誘導它們的轉錄，然後在病毒重建時誘導表達，來提供。基因組RNA以及病毒重建所必需的病毒蛋白，可以例如通過轉導能表達它們的質粒來提供。在供給這些病毒蛋白時，可以使用輔助病毒，例如野生型病毒或一些類型的突變副粘病毒，但這有可能導致混入這些病毒，因此並不優選這種方法。
將表達基因組RNA的DNA導入細胞的方法包括，例如(i)製備能被目的細胞攝入的DNA沉澱的方法，(ii)製備包含帶正電的DNA的複合體的方法，所述複合體適於被目的細胞攝入並且具有較低細胞毒性，和(iii)利用電脈衝在目的細胞膜上瞬時開孔的方法，孔的大小僅足以讓DNA分子通過。
方法(ii)中可以使用各種轉染試劑，例如DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN #301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche #1811169)等。方法(i)中，可以用磷酸鈣進行轉染，用這種方法導入細胞的DNA被吞噬體攝入，但已知足量的DNA也能被攝入細胞核中(Graham，F.L.and Van Der Eb，J.，1973，Virology 52456；Wigler，M.and Silverstein，S.，1977，Cell 11223)。Chen和Okayama研究了導入技術的最佳條件，他們報導說(1)細胞和共沉澱物的溫育條件為2～4％CO2，35℃，15～24hr，(2)環狀DNA比線性DNA活性更高，和(3)當沉澱混合液中DNA濃度為20～30μg/ml時，可形成最佳沉澱(Chen，C.and Okayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.72745)。方法(ii)適於瞬時轉染。已知更早的方法是配製具有所需DNA濃度比的DEAE-葡聚糖(Sigma #D-9885 M.W.5×105)混合液進行轉染。由於大多數複合體在內體中降解，可以加入氯喹來提高轉染效力(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。方法(iii)被稱為電穿孔方法，由於沒有細胞選擇性，它比方法(i)和(ii)應用更廣。可通過最優化脈衝電流的持續時間、脈衝形式、電場強度(電極間空隙，電壓)、緩衝液的導電性、DNA濃度和細胞密度使轉染效力最大化。
在上述三種方法中，方法(ii)操作簡單，並且能用大量的細胞檢測大量樣品，因此轉染試劑適用於在重建載體時將DNA導入細胞中，轉染試劑優選但不限於Superfect Transfection Reagent(QIAGEN，目錄號301305)或DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Roche，目錄號1811169)。
具體地，可以按下述方法從cDNA重建病毒在24孔或6孔塑料板或100mm Petri培養皿中，用極限必需培養基(MEM)將猴腎細胞LLC-MK2培養至100％鋪滿，所述培養基含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100U/ml青黴素G和100μg/ml鏈黴素)。將表達T7聚合酶的重組痘苗病毒vTF7-3在1μg/ml補骨脂素存在的情況下於UV中暴露20分鐘滅活，然後以2PFU/細胞的量感染細胞(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838122-8126，1986；Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579，1996)。可以適當調整補骨脂素的加入量和暴露於UV的時間長短。感染1小時後，將2-60μg(更優選3-20μg)編碼重組仙臺病毒基因組RNA的DNA和表達病毒RNP生成所必需的反式作用病毒蛋白的質粒(0.5-24μgpGEM-N、0.25-12μg pGEM-P和0.5-24μg pGEM-L)(Kato，A.et al.，GenesCells 1569-579，1996)採用Superfect(QIAGEN)的脂轉染方法等進行轉染。編碼N、P和L蛋白的載體的量優選比例為2∶1∶2；質粒的量優選調整為，例如，1-4μg pGEM-N，0.5-2μg pGEM-P，1-4μg pGEM-L。
轉染的細胞在不含血清的MEM中培養，所述MEM根據需要，可以含有100μg/ml利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)，優選濃度為40μg/ml的阿糖胞苷(AraC)(Sigma)，以便將藥物濃度調整至最佳，從而使痘苗病毒的細胞毒性最小而病毒的回收率最高(Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1569-579)。轉染後將細胞培養48-72hr，然後回收細胞，凍融三次使細胞破碎。用含RNP的細胞裂解物再度感染LLC-MK2細胞並培養。或者回收培養上清，將其添加到LLC-MK2細胞的培養液中，使其感染細胞並進行培養。轉染可以如下進行例如，與脂轉染胺，聚陽離子脂質體等形成複合體，然後導入細胞具體地，可以使用各種轉染試劑。例如，DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE和DOSPER(Roche #1811169)。為了防止在內體中降解，還可加入氯喹(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。在導入了RNP的細胞中，進行從RNP表達病毒基因和RNP複製的過程，使載體擴增。將所得病毒液稀釋(例如，106-倍)，再進行擴增，可以完全除去痘苗病毒vTF7-3。將擴增重複例如3次以上。所得載體可以在-80℃貯存。為了重建缺陷了包膜蛋白編碼基因、不具有傳播能力的病毒載體，可以用表達該包膜蛋白的LLC-MK2細胞進行感染，或者可以與表達該包膜蛋白的質粒一起感染。另一種方法是，將轉染的細胞覆蓋在表達該包膜蛋白的LLK-MK2細胞上層並進行培養，使缺陷型病毒載體繁殖(見WO00/70055和WO00/70070)。
回收的病毒的滴度可通過測定CIU(細胞感染單位)或血凝素活性(HA)來確定(WO00/70070；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1569-579；Yonemitsu，Y. Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated genedelivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of VascularDiseases.Method in Molecular MedicineHumana Presspp.295-306，1999)。攜帶GFP(綠色螢光蛋白)等標記基因的載體，可以利用所述標記作為指標，直接計數受感染的細胞來定量(例如，GFP-CIU)。如此測定的滴度可以用與CIU同等的方式進行處理(WO00/70070)。
對重建所用的宿主細胞無特殊限制，只要能重建病毒載體。例如，在仙臺病毒載體等的重建中，可以使用來自猴腎的LLC-MK2細胞和CV-1細胞、來自倉鼠腎的BHK細胞、來自人的細胞等。通過在這些細胞中表達適當的包膜蛋白，可以獲得包膜中包含這些蛋白的感染性病毒粒子。此外，為了獲得大量仙臺病毒載體，可以用從上述宿主獲得的病毒載體感染受孕雞卵，從而擴增該載體。已經開發了用雞卵製備病毒載體的方法(Nakanishi，et al.，ed.(1993)，「State-of-the-Art Technology Protocol in NeuroscienceResearch III，Molecular Neuron Physiology」，Koseisha，Osaka，pp.153-172)。具體地，例如，將受精卵在孵化器中37-38℃培養9-12天以形成胚。將病毒載體接種到尿囊腔，進一步將該受精卵培養數日(例如3日)使病毒載體繁殖。可根據所用的重組仙臺病毒的不同而改變培養時間等條件。然後，回收含有載體的尿囊液。可以用常規方法從尿囊液中分離和純化仙臺病毒載體(Tashiro，M.，「Virus Experiment Protocol，」Nagai，Ishihama，ed.，Medical ViewCo.，Ltd.，pp.68-73，(1995))。
例如，可以如下構建和製備F基因缺陷型仙臺病毒載體(見WO00/70055和WO00/70070)。
1構建F基因缺失型仙臺病毒基因組cDNA和F表達質粒仙臺病毒(SeV)的全長基因組cDNA，pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 782813-2820)(「pSeV18+b(+)」也稱「pSeV18+」)用SphI/KpnI消化，回收消化片段(14673bp)，將該片段克隆到pUC18，得到質粒pUC18/KS。在pUC18/KS上構建F基因缺失位點。F基因缺失通過聯合應用PCR-連接反應來創建，結果除去F基因ORF(ATG-TGA＝1698bp)，與例如atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO4)連接，由此構建F基因缺失型SeV基因組cDNA(pSeV18+/ΔF)。用F基因上遊引物對[正向5』-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO5，反向5』-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQID NO6]和F基因下遊引物對[正向5』-atgcatgccggcagatga/SEQ ID NO7，反向5』-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO8]進行PCR，所得PCR產物在EcoT22I位點連接。按上述方法獲得的質粒用SacI和SalI消化，回收含有F基因缺失位點的片段(4931bp)，將其克隆到pUC18，得到pUC18/dFSS。用DraIII消化該pUC18/dFSS，回收片段，用pSeV18+中包含F基因區域的DraIII片段置換，連接後得到質粒pSeV18+/ΔF。
將外來基因插入例如pUC18/dFSS中F基因缺失部位的NsiI和NgoMIV限制酶位點。為此，例如，可以用尾部為NsiI的引物和尾部為NgoMIV的引物擴增外來基因片段。
2製備誘導SeV-F蛋白表達的輔助細胞為了構建表達仙臺病毒F基因(SeV-F)的Cre/loxP誘導型表達質粒，通過PCR擴增SeV-F基因，將擴增產物插入為了能通過Cre DNA重組酶誘導基因產物表達而設計的質粒pCALNdLw(Arai，T.et al.，J.Virology 72，1998，p1115-1121)的唯一SwaI位點，由此構建質粒pCALNdLw/F。
為了從F基因缺失型基因組回收感染性病毒顆粒，建立表達SeV-F蛋白的輔助細胞株。可以使用例如SeV增殖中常用的猴腎細胞株LLC-MK2。在37℃和5％CO2中用含有下列成分的MEM培養LLC-MK2細胞10％熱滅活胎牛血清(FBS)、青黴素G鈉(50U/ml)和鏈黴素(50μg/ml)。由於SeV-F基因產物具有細胞毒性，用磷酸鈣法(利用哺乳動物轉染試劑盒(Stratagene))將為了能通過Cre DNA重組酶誘導F基因產物表達而設計的上述質粒pCALNdLw/F按公知的方案導入LLC-MK2細胞。
將質粒pCALNdLw/F(10μg)導入已在10cm培養皿中培養至40％鋪滿的LLC-MK2細胞中，然後用含10％FBS的MEM培養基(10ml)在37℃、5％CO2培養箱中培養24小時。24小時後將細胞剝下，懸浮於培養基(10ml)後，接種五個10ml培養皿，其中一皿為5ml、兩皿為2ml、兩皿為0.2ml，用含G418(Gibco-BRL)(1,200μg/ml)和10％FBS的MEM培養基(10ml)培養14天，每兩天更換一次培養基，選出穩定的基因導入株。用克隆環回收上述培養基中生長的G418抗性細胞。回收的各克隆均在10cm培養皿中擴增到鋪滿。
在6cm培養皿中將細胞擴增到鋪滿，按照齊藤等的方法(Saito et al.，Nucl.Acids Res.233816-3821(1995)；Arai，T.et al.，J.Virol 72，1115-1121(1998))以例如moi＝3的腺病毒AxCANCre感染細胞，由此誘導F蛋白表達。
3F基因缺失型SeV病毒的重建和擴增將上述導入了外來基因的質粒pSeV18+/ΔF用以下方法轉染LLC-MK2細胞。將LLC-MK2細胞以5×106個細胞/皿接種100mm的Petri皿。在用T7RNA聚合酶進行基因組RNA轉錄的情況下，將細胞培養24小時後，用經補骨脂素和長波長紫外線(365nm)處理20分鐘的表達T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒(PLWUV-VacT7Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))，以moi約為2的水平，室溫轉染1小時。用例如裝有5隻15瓦燈泡的UV Stratalinker 2400(商品目錄號400676(100V)，Stratagene，La Jolla，CA，USA)進行痘苗病毒的紫外線照射。將細胞用無血清MEM洗滌後，表達基因組RNA的質粒和分別表達副粘病毒N，P，L，F和HN蛋白的質粒用適當的脂轉染試劑轉染細胞。這些質粒用量的比優選按照上述順序為6∶2∶1∶2∶2∶2，但不限於此。例如，表達基因組RNA的質粒以及表達N，P，L和F+HN的質粒(pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L和pGEM/F-HN；WO00/70070，Kato，A.et al.，Genes Cells 1，569-579(1996))分別以12μg，12μg，4μg，2μg，4μg和4μg/皿的量進行轉染。培養數小時後，將細胞用無血清MEM洗兩次，在含40μg/ml胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraCSigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培養。回收這些細胞，將細胞團懸浮於Opti-MEM(107個細胞/ml)。將懸浮液反覆凍融三次，與脂轉染試劑DOSPER(Boehlinger Mannheim)(106個細胞/25μl DOSPER)混合，室溫放置15分鐘後，轉染上述克隆化的表達F的輔助細胞(106個細胞/孔，12孔板)，用不含血清的MEM(含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)培養，回收上清。缺失了除F以外的基因(例如HN基因或M基因)的病毒可以用同樣的方法製備。
在製備病毒基因缺陷型載體的情況中，例如，將在其載體基因組中缺失了不同包膜基因的兩種或更多種不同載體導入同一細胞時，每種缺失的病毒蛋白通過另一載體的表達來提供。因此，這些載體可以互補蛋白缺失，導致產生感染性病毒顆粒，結果通過複製循環可以擴增這些病毒載體。換而言之，將兩種或多種可以互補病毒蛋白缺陷的本發明載體同時混合接種，能以較低成本大量產生各種病毒基因缺陷型病毒載體的混合物。由於這些缺失病毒基因的病毒與未缺失病毒基因的病毒相比具有較小的基因組，它們可以攜帶較長的外來基因。此外，這些由於缺失病毒基因而缺乏增殖能力的病毒毒性大大減弱，並且在細胞外稀釋後很難維持共感染狀態，因此它們不會產生後代，在環境釋放的管理方面較有利。例如，可以想到分別構建能彼此互補的編碼抗體H鏈的載體和編碼L鏈的載體，用它們進行共感染。本發明提供一種組合物，它包含，編碼含有抗體H鏈可變區的多肽的副粘病毒載體，以及編碼含有抗體L鏈可變區的多肽的副粘病毒載體。本發明還提供一種試劑盒，它包含，編碼含有抗體H鏈可變區的多肽的副粘病毒載體，以及編碼含有抗體L鏈可變區的多肽的副粘病毒載體。這些組合物和試劑盒可以用於通過同時感染而形成包含H鏈和L鏈的抗體。
當將傳播型副粘病毒載體給藥個體或細胞後，因治療結束等原因必須限制該病毒載體的增殖時，也可以通過給藥RNA-依賴性RNA聚合酶抑制劑，而僅僅特異性限制該病毒載體的增殖，但對宿主不造成損害。
根據本發明的方法，本發明的病毒載體可以以，例如，1×105CIU/ml或以上，優選1×106CIU/ml或以上，更優選5×106CIU/ml或以上，更優選1×107CIU/ml或以上，更優選5×107CIU/ml或以上，更優選1×108CIU/m或以上，更優選5×108CIU/ml或以上的滴度釋放到病毒生成性細胞的培養基中。病毒滴度可以用本說明書描述的方法測量，也可以用其它方法(Kiyotani，K.et al.，Virology 177(1)，65-74(1990)；WO00/70070)。
可以將回收的副粘病毒純化使其達到基本純。純化方法包括過濾、離心分離和柱純化等公知的純化分離方法或上述方法的組合。「基本純」是指病毒載體是其所在樣品的主要成分，一般來說，當樣品所含的全部蛋白(作為承運體和穩定劑加入的蛋白除外)中，來自病毒載體的蛋白比例為10％或以上，優選20％或以上，更優選50％或以上，優選70％或以上，更優選80％或以上，進一步優選90％或以上時，可以確定為基本純的病毒載體。副粘病毒的具體純化方法包括，採用纖維素硫酸酯或交聯多糖硫酸酯的方法(特公昭JP62-30752、特公昭JP62-33879和特公昭JP62-30753)，以及吸附於含有硫酸巖藻糖的多糖和/或其分解產物上的方法(WO97/32010)。
在製備包含載體的組合物時，該載體可以根據需要與可藥用承運體或賦形劑混合。「可藥用承運體或賦形劑」是指可以與本發明載體一起給藥，不明顯抑制該載體的基因導入活性的材料。例如，該載體可以用生理鹽水或磷酸鹽緩衝液(PBS)等適當稀釋，製成組合物。當載體在雞卵中增殖時，「可藥用承運體或賦形劑」可以包含尿囊液。另外，包含載體的組合物還可以含有去離子水和5％葡萄糖水溶液等承運體或賦形劑。進一步地，還可以含有植物油、懸浮劑、表面活性劑、穩定劑和殺菌劑等。另外，可以添加防腐劑或其它添加劑。包含本發明載體的組合物可以用作試劑或藥物。
載體的給藥量因疾病、患者的體重、年齡、性別、症狀、給藥目的、給藥組合物的形式、給藥方法和導入的基因等而異，本領域技術人員可以適當決定。給藥途徑可以適當選擇，例如，經皮，鼻腔內，經支氣管，肌肉內，腹腔內，靜脈內，關節內，脊髓腔內，或皮下，但不限於此。也可以局部給藥或全身給藥。載體的給藥量優選為，在可藥用承運體中優選約105CIU/ml-約1011CIU/ml，更優選約107CIU/ml-約109CIU/ml，最優選約1×108CIU/ml-約5×108CIU/ml。在人類中，單一劑量優選為2×105CIU-2×1010CIU，可以給藥一次或更多次，只要副作用在臨床可接受的範圍內。每天的給藥次數也可照此辦理。在用本發明載體製備蛋白製劑的情況中，該蛋白給藥量可以是，例如10ng/kg-100μg/kg，優選100ng/kg-50μg/kg，更優選1μg/kg-5μg/kg。在除人類以外的其它動物的情況中，例如，可以根據目的動物與人的體重比或給藥部位體積比(例如，平均值)換算上述給藥量，然後按照該換算的給藥量給藥該動物。含有本發明載體的組合物的給藥對象包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、羊、牛和狗等所有哺乳動物。


圖1是核苷酸序列，它編碼抗NOGO中和抗體的Fab(H鏈和L鏈)的NotI片段。蛋白編碼序列用大寫字母表示。此外，SeVE信號、間插序列和S信號的核苷酸序列用下劃線-點狀下劃線-下劃線表示。波狀下劃線表示產生與NotI相同的粘性末端的位點，該序列可以，例如，用於將H鏈和L鏈的編碼序列克隆到不同載體的NotI位點中。
圖2是構建圖1所示Fab編碼片段時用到的寡核苷酸。SEQ ID NO12-42依次表示SYN80 F1-SYN80 R16。
圖3示圖2中寡核苷酸的設置。
圖4顯示傳播型病毒(SeV18+IN-1)(A圖)和傳播能力缺陷型病毒(SeV18+IN-1/ΔF)(B圖)的結構，它們都攜帶NOGO中和抗體的Fab基因。圖中還顯示了確認該病毒基因組的RT-PCR照片。
圖5為照片，顯示傳播型病毒或F基因缺陷型病毒的Fab表達，這兩種病毒都攜帶NOGO中和抗體的Fab基因。用攜帶GFP基因的傳播型SeV載體作為陰性對照(NC)。圖中顯示了感染後2天(d2)或4天(d4)的抗體表達。
圖6為照片，顯示攜帶IN-1基因的SeV對抗q-pool活性的作用，該活性影響NIH-3T3細胞的形態。圖中顯示了每一種情況下開始培養的3天後(SeV感染的2天後)，NIH-3T3細胞的顯微照片。(A)使用未經q-pool處理的平板；(B)使用經q-pool處理的平板；(C)使用經q-pool處理的平板，且細胞用MOI＝1的SeV18+GFP感染；(D)與(C)同一視野的GFP螢光照片，在(C)上重疊(指示SeV-感染細胞的比例)；和(E)使用經q-pool處理的平板，且細胞用MOI＝1的SeV18+IN1感染。
圖7顯示攜帶IN-1基因的SeV對NIH-3T3細胞增殖的作用。用Alamarblue根據線粒體活性來測量每一種情況下開始培養的3天後(SeV感染的2天後)NIH-3T3細胞的細胞數量比。(A)使用未經q-pool處理的平板；(B)使用經q-pool(1μg/cm2)處理的平板；(C)使用經q-pool(10μg/cm2)處理的平板；和(D)使用經q-pool(30μg/cm2)處理的平板，且細胞用MOI＝1的SeV18+IN1感染。
圖8是一組照片，顯示攜IN-1基因的SeV抗q-pool活性的作用，所述活性影響大鼠後根神經節的神經細胞的軸突(neurite)伸展。圖中顯示了每種情況下在SeV感染36小時後(開始培養的60小時後)大鼠後根神經節的神經細胞的顯微照片。(A)使用未經q-pool處理的平板，且細胞用SeV18+GFP以1×105CIU/500μl/孔進行感染；(C)使用經q-pool處理的平板，且細胞用SeV18+GFP以1×105CIU/500μl/孔進行感染；(B)和(D)分別是(A)和(C)的同視野的GFP螢光照片；(E)和(F)使用經q-pool處理的平板，且細胞用SeV18+IN1以1×105CIU/500μl/孔進行感染。
圖9是一組照片，顯示攜GFP基因的SeV載體對小鼠耳廓內(intra-auricular)給藥後，源自GFP的螢光的經時變化。將攜GFP基因的傳播型SeV載體(SeV18+GFP5×106GFP-CIU/5μl)，或缺陷F基因的SeV載體(SeV18+GFP/ΔF5×106GFP-CIU/5μl)，經耳廓內途徑給藥小鼠，從外部經時觀察GFP蛋白的螢光。
圖10顯示耳廓內給藥方法的定量評價(1)。用攜帶螢光素酶基因的SeV載體評價(A)給藥滴度依賴性。將攜帶螢光素酶基因的傳播型SeV載體(SeV18+Luci)以不同的給藥滴度對小鼠耳廓內給藥(5×104，5×105，5×106CIU/5μl)，2天後切除耳廓(auricle)，經組織勻漿後檢測螢光素酶活性(n＝3)。結果觀察到依賴於給藥滴度的螢光素酶活性改變。(B)經時變化。將SeV18+Luci(5×106CIU/5μl)對小鼠耳廓內給藥，在不同時間切除各只耳廓，組織勻漿後檢測螢光素酶活性(n＝3)。
圖11的照片和圖表顯示耳廓內給藥方法的定量評價(2)。用攜帶GFP基因的SeV載體進行評價將SeV18+GFP(5×106GFP-CIU/5μl)對小鼠耳廓內給藥，從外部經時觀察GFP蛋白的螢光(n＝4)。(A)GFP螢光照片。(B)對GFP螢光強度的定量。用圖像處理軟體Adobe Photoshop提取綠色螢光，然後用圖像分析軟體NIH image定量螢光強度。
圖12的照片和圖表顯示根據反覆給藥評價法評價的耳廓內給藥的有效性。將SeV18+GFP/ΔF(5×106GFP-CIU/5μl)對小鼠右耳廓給藥(首次給藥)，然後分別在1，2，4，6，8，28，和62天後將SeV18+GFP/ΔF(5×106GFP-CIU/5μl)對小鼠左耳廓給藥(二次給藥)。在上述每一次給藥後，經時檢查GFP螢光強度的變化。(A)GFP螢光照片。(B)對GFP螢光強度的定量。
圖13的照片顯示耳廓內給藥方法(1)感染的細胞的鑑定。將SeV18+GFP/ΔF(5×106GFP-CIU/5μl)對小鼠耳廓內給藥，感染2天後切除耳廓，製備冰凍切片，在螢光顯微鏡下觀察GFP螢光(A)。同樣的連續切片用抗-GFP抗體染色(C)。(B)顯示將這些圖像重疊的結果。
圖14的照片顯示耳廓內給藥方法(2)感染的細胞的鑑定。將SeV18+GFP/ΔF(5×106GFP-CIU/5μl)對小鼠耳廓內給藥，感染2天後切除耳廓，製備冰凍切片，在螢光顯微鏡下觀察GFP螢光(與圖13的小鼠不同的小鼠)。
圖15顯示合成抗-CD28抗體基因片段(SYN205-13)所用的oligo DNA的設置。
圖16顯示攜帶抗-CD28抗體基因的SeV載體cDNA的構建。
圖17的照片顯示攜帶抗-CD28抗體基因的SeV載體(SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP)的病毒基因組經RT-PCR確認。
圖18的照片顯示攜帶αCD28基因的SeV載體(SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP)的抗體表達。
圖19是一組照片，顯示將攜帶抗-CD28抗體(αCD28cst)和GFP基因的SeV載體(SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP)對小鼠耳廓內給藥後，源自GFP的螢光的經時變化。將5×106GFP-CIU/5μl對小鼠耳廓內給藥，從外部經時觀察GFP蛋白的螢光，將其與SeV18+GFP/ΔF給藥組的螢光進行比較。
圖20是一組照片，顯示將SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP對小鼠耳廓內給藥並在感染初期聯合給予CTLA4-Ig蛋白後，源自GFP的螢光的經時變化。將5×106GFP-CIU/5μl對小鼠耳廓內給藥，在給藥的1小時和10小時後，腹腔內給藥CTLA4-Ig蛋白(0.5mg/機體)。從外部經時觀察GFP蛋白的螢光，將其與SeV18+GFP/ΔF給藥組的螢光進行比較。
圖21顯示GFP-螢光強度的定量。在圖19和20的螢光照片的基礎上，用圖像處理軟體Adobe Photoshop提取綠色螢光，然後用圖像分析軟體NIHimage定量螢光強度。
圖22是一組照片，顯示由於GFP基因攜帶位置的差異導致由GFP產生的螢光強度的差異(體外確認)。用MOI＝3的SeV18+GFP/ΔF或SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP轉染LLC-MK2細胞，經時觀察GFP螢光。
實施本發明的最佳模式下面參照實施例更詳細說明本發明，但不應理解位本發明僅限於這些實施例。本文中引用的所有參考文獻都是本說明書的一部分。
構建攜帶Fab基因的SeV載體通過SeV載體在脊髓損傷部位的應用舉例說明以抑制軸索伸長抑制物(如NOGO)為目的的治療載體。由於已知IN-1(小鼠IgMκ型)是抗NOGO的中和抗體(Brosamle，C.et al.，J.Neurosci.20(21)，8061-8068(2000)等)，因此構建攜帶IN-1基因的傳播型SeV載體。還構建了F-基因缺陷的SeV載體(傳播能力缺陷型)。
1)基因的全合成為了構建攜帶IN-1的Fab(H和L鏈)基因的SeV載體，進行IN-1的Fab基因的全合成。根據IN-1的單鏈Fab片段的鹼基序列(登錄號Y08011；Bandtlow，C.et al.，Eur.J.Biochem.241(2)468-475(1996))設計序列，使得His-標籤被除去，兩個末端都包含NotI識別位點，並且H鏈(SEQ ID NO10)和L鏈(SEQ ID NO11)串聯，它們之間夾著SeV EIS序列(圖1；SEQ ID NO9)。合成所用的oligo DNA的序列和名稱見圖2，它們的設置見圖3。將NotI片段的全長設為6n(6的倍數)。
2)構建攜帶IN-1(Fab)的SeV cDNA基因將上述合成的NotI片段插入pBluescript II KS(Stratagene，LaJolla，CA)。確認基因序列後，用NotI從該質粒中切出包含EIS的NotI片段，將其插入編碼傳播型仙臺病毒基因組的質粒(pSeV18+)(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587；and Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2457-466)和編碼F基因-缺陷型仙臺病毒基因組的質粒(pSeV18+/ΔF)(Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))的+18位點(NotI位點)，分別得到pSeV18+IN-1和SeV18+IN-1/ΔF。
3)重建SeV(傳播型SeV18+IN-1)按照Kato et al.(Kato，A.et al.，Genes Cells 1，569-579(1996))的報導進行病毒重建。將LLC-MK2細胞接種在直徑100mm的平皿中，5×106細胞/皿，培養24小時後，細胞用已被補骨脂素和長波長紫外光(365nm)處理了20分鐘的表達T7聚合酶的重組痘苗病毒(PLWUV-VacT7Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))以MOI＝2在37℃感染1小時。細胞用不含血清的MEM清洗後，將pSeV18+IN-1，pGEM/NP，pGEM/P，和pGEM/L(Kato，A.et al.，Genes Cells 1，569-579(1996))分別以12μg，4μg，2μg，和4μg/皿的量懸浮在Opti-MEM(200μl)(Gibco-BRL，Rockville，MD)中。將其與相當於1μg DNA/5μl的SuperFect轉染試劑(Qiagen，Bothell，WA)混合，室溫靜置15分鐘，最後加入含3％FBS的Opti-MEM(3ml)，添加細胞進行培養。培養5小時後，細胞用不含血清的MEM清洗兩次，並在含有40μg/ml胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraCSigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培養3天(P0)。
回收細胞，並將沉澱懸浮在PBS(1ml/皿)中。凍融3次後，將上述裂解物以100μl/卵的水平接種10日齡受精卵，在35.5℃將這些卵持續翻轉3天(P1)。這些卵在4℃靜置4-6小時後，回收尿囊液，測定紅細胞凝集活性(HA活性)，從而確定是否回收到病毒。
HA活性按照Kato et al.(Kato，A.et al.，Genes Cell 1，569-579(1996))的方法進行測量。即，病毒溶液用PBS在圓底96孔板上進行逐步稀釋，製作50μl/孔的2倍稀釋系列。用PBS將50μl保存血(Cosmo Bio，Tokyo，Japan)稀釋到1％，將其與上述50μl病毒溶液混合，4℃靜置30分鐘，觀察紅細胞凝集，將凝集樣品中最高的病毒稀釋度判定為HA活性。將1HAU換算為1×106病毒，以此計算病毒數。
將回收的P1尿囊液用PBS稀釋10-5-倍和10-6-倍(當觀察到HAU時)，或降低該稀釋率(當沒有觀察到HAU時)。然後用它們以100μl/卵的水平接種10日齡受精卵，35.5℃孵育3天並翻轉這些卵(P2)。回收尿囊液後，測定HA活性，以便確定是否回收到病毒。將回收的P2尿囊液稀釋10-5-倍和10-6-倍，然後進行同樣的操作(P3)。回收P3的尿囊液，測定HA活性。結果觀察到HA活性升高，因此判斷病毒重建是成功的。回收的尿囊液的HA活性值(HAU)見下表。P4樣品滴度經計算為29HAU(約5×108CIU/ml)。
表1

4)重建SeV(F基因-缺陷型SeV18+IN-1/ΔF)按照Li et al.(Li，H.-O.et al.，J.Virology 74.6564-6569(2000)，WO00/70070)的報導進行病毒重建。利用F蛋白輔助細胞重建F基因-缺陷型病毒。所述輔助細胞利用Cre/loxP表達誘導體系來製備。該體系使用pCALNdLw質粒，它被設計用於利用Cre DNA重組酶誘導基因產物表達(Arai，T.et al.，J.Virol.721115-1121(1988))。為了使插入的基因表達，經上述質粒轉化的細胞使用Saito et al.的方法(Saito，I.et al.，Nucl.Acid.Res.23，3816-3821(1995)，Arai，T.et al.，J.Virol.72，111135-1121(1998))，用表達Cre DNA重組酶的重組腺病毒(AxCANCre)感染。在SeV-F蛋白的情況下，將含有F基因的轉化細胞稱為LLC-MK2/F7，而經AxCANCre誘導後能夠持續表達F蛋白的細胞稱為LLC-MK2/F7/A。
F基因-缺陷型SeV(SeV18+IN-1/ΔF)如下重建將LLC-MK2細胞接種在直徑100mm的平皿中，5×106細胞/皿，培養24小時後，細胞用PLWUV-VacT7室溫感染1小時(MOI＝2)。細胞用不含血清的MEM清洗後，將pSeV18+IN-1/ΔF，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L，和pGEM/F-HN分別以12μg，4μg，2μg，4μg，和4μg/皿的重量比懸浮在Opti-MEM中。將其與相當於1μg DNA/5μl的SuperFect轉染試劑混合，室溫靜置15分鐘，最後加入含3％FBS的Opti-MEM(3ml)，添加細胞進行培養。培養5小時後，細胞用不含血清的MEM洗兩次，並在含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中培養。培養24小時後，在所述細胞上覆蓋8.5×106細胞/皿的LLC-MK2/F7/A細胞，在含有40μg/ml Arac和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中37℃再培養2天。回收細胞，將沉澱懸浮於Opti-MEM中(2ml/皿)，凍融三次，製得P0裂解物。另一方面，將LLC-MK2/F7/A細胞接種在24孔板中，當幾乎融匯時，將這些細胞轉移到32℃培養箱中培養1天。用SeV18+IN-1/ΔF的P0裂解物轉染這些細胞(200μl/孔)，用不含血清但含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM在32℃培養。在P2階段之後，用P1培養上清重複同樣的培養直到P3階段，並將LLC-MK2/F7/A細胞接種在6孔板中。
用HA活性確認病毒增殖後，在P1階段之後的樣品中觀察到HA活性的升高。P3階段第4天的樣品滴度(P3d4)為2.7×107CIU/ml。
5)通過RT-PCR確認病毒基因組利用QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，Bothell，WA)從傳播型病毒(SeV18+IN-1)液(P2樣品)回收病毒RNA。利用配有Platinum TaqKit的Super Script One-Step RT-PCR(Gibco-BRL，Rockville，MD)進行一步RT-PCR。使用組合引物SYN80F12/SYN80R1進行RT-PCR。確認目的大小的基因被擴增，這表示該病毒基因攜帶IN-1基因(圖4A)。
用F-基因缺陷型(SeV18+IN-1/ΔF)實施同樣的方法。採用P3d4樣品和引物組合SYN80F12/SYN80R1。在這種情況下，也確認目的大小的基因的擴增，其表明該病毒基因攜帶IN-1基因(圖4B)。
6)確認SeV所攜帶的基因的蛋白表達由於IN-1是小鼠IgMκ型，其蛋白表達用Western印跡第二抗體HRP-偶聯的抗-小鼠IgG+IgM(山羊F(ab』)2抗-小鼠IgG+IgM(AM14074)BioSource International)(無第一抗體)通過Western印跡來確認。
在6孔板上培養直至融匯的LLC-MK2細胞用MOI＝5的SeV18+IN-1或SeV18-IN-1/ΔF感染。感染2天或4天後回收培養上清，濃縮樣品，用PAGE prep Protein Clean-Up and Enrichment Kit(Pierce)除去雜質。用攜帶GFP基因的傳播型SeV載體在同樣條件下感染，如上述回收培養上清，作為陰性對照(NC)。300μl培養上清經處理，回收40μl SDS-樣品，加載樣品10μl/泳道。結果見圖5。在氧化條件下檢測到約47kDa的帶，在還原條件下檢測到約30kDa的帶。根據胺基酸序列來推測，H鏈的分子量是24.0kDa，L鏈的是23.4kDa。據此判斷上述結果，在氧化條件下，H鏈與L鏈呈結合狀態，在還原條件下，H鏈或L鏈呈解離狀態，由此確認形成Fab。
攜帶IN-1基因的SeV的體外功能評價已知IN-1是抗軸索伸長抑制物NOGO的中和抗體(Chen，M.S.et al.，Nature 403，434-439(2000))。因此，為了對攜帶IN-1的Fab基因的SeV進行功能評價，必需觀察在抑制軸索伸長的條件下，即，在有軸索伸長抑制物的條件下，對軸索伸長的促進活性。含有抑制物的脊髓抽出液被稱為q-pool，其按照Spillmann et al.的方法(Spillmann，A.A.et al.，J.Biol.Chem.273，19283-19293(1998))製備。從三隻成年大鼠抽取脊髓，獲得1.5mgq-pool。IN-1活性按照Chen的方法以及Spillmann et al.的方法(Chen，M.S.etal.，Nature 403，434-439(2000)；Spillmann，A.A.et al.，J.Biol.Chem.273，19283-19293(1998))進行評價。採用2種方法，評價小鼠成纖維細胞系(NIH-3T3)的擴散以及大鼠胚胎後根神經節(Dorsal root ganglion，DRG)原代培養物中的軸突伸長。
利用NIH-3T3進行評價時，首先將q-pool用PBS稀釋並分配到96孔培養板中，約30μg/cm2，37℃保溫2小時。板用PBS洗兩次，然後用於細胞培養。在已用q-pool處理(或未處理)的96-孔板中接種NIH-3T3細胞，1×103細胞/孔，用含10％FBS的D-MEM開始培養。1天後，用各種滴度的SeV感染這些細胞。感染2天後，觀察形態並進行細胞計數。用Alamar Blue(BIOSOURCE InternationalInc.California，USA)進行細胞計數。未經q-pool處理的平板中培養的細胞具有所謂成纖維細胞樣的形態，而在經過q-pool處理的平板中培養的細胞可見到很多球形細胞(圖6(B))。當用攜帶GFP基因的對照SeV載體(SeV18+GFP)感染經過q-pool處理的細胞時，同樣觀察到很多球形細胞(圖6(C))。當用攜帶IN-1基因的SeV載體(SeV18+IN1)感染經q-pool處理的細胞時，培養體系中很少見到球形細胞，很多細胞是成纖維細胞樣形態(圖6(E))。這意味著，正如此前的報導所述，IN-1抑制NIH-3T3細胞形態改變的功能是由q-pool引起的，這表明SeV載體中所攜帶的IN-1基因具有此功能。另外，從細胞數(細胞增殖)的角度評價同樣的體系。在未經q-pool處理或經過低濃度q-pool處理的平板中，僅僅在用高MOI(MOI＝3，10，和30)的SeV18+IN1感染的NIH-3T3細胞中觀察到對細胞增殖的抑制效應(圖7(A)-(C))。由於未在細胞中觀察到明顯的形態損傷，因此判定所觀察到的是增殖抑制而非細胞損傷。雖然迄今為止沒有這方面的報導，但有理由相信，當IN-1濃度極高時有可能出現這種活性。此外，這種增殖抑制效應未在高濃度q-pool處理的情況下觀察到(圖7(D))。也就是說，在這些情況下，q-pool抑制IN-1的活性，這進一步表明IN-1可以彌補對q-pool活性的抑制。
在評價IN-1活性的另一方法中，通過測定對大鼠DRG原代培養體系中軸突伸展的影響來進行評價。在這種情況下，也是首先將q-pool用PBS並分配在經過I型膠原蛋白包被的24-孔培養板(Asahi Technoglass，Chiba)中，約25μg/cm2，37℃保溫2小時。板用PBS洗兩次，然後用於細胞培養。從14日齡SD大鼠胚胎(Charles River Japan，Kanagawa)取出後根神經節，植入包含終濃度為100ng/ml的神經生長因子(NGF，Serotec Ltd，U.K.)和10％FBS的D-MEM中。開始培養24小時後，用SeV18+GFP或SeV18+IN1感染細胞，1×105CIU/500μl/孔。感染36小時後，在顯微鏡下觀察細胞形態。在未經q-pool處理的平板中，軸突伸展可見於被對照SeV即SeV18+GFP感染的細胞(圖8(A))；在經過q-pool-處理的平板中，僅觀察到非常有限的軸突伸展(圖8(C))。圖8(B)和圖8(D)顯示分別與圖8(A)和圖8(C)相同的視野的GFP螢光照片，可以觀察到SeV18+GFP感染的程度。另一方面，在經過q-pool-處理的平板中，被SeV18+IN1感染的細胞可以觀察到非常顯著的軸突伸展(圖8(E)和(F))。也就是說，從軸突伸展的角度確認了，IN-1可以抑制q-pool的軸突伸展抑制活性，並判斷SeV載體中所攜帶的IN-1基因具有此功能。
評價載體表達持續性以及反覆給藥後的表達的體內評價體系為了評價載體表達的持續性和反覆給藥的可能性，確立更有效且更可靠的體內評價體系很重要。本實施例公開了利用新開發的小鼠耳廓內給藥的評價體系。結果表明，將攜帶GFP基因的傳播型SeV載體(SeV18+GFP5×106GFP-CIU/5μl)或F基因-缺陷型SeV載體(SeV18+GFP/ΔF5×106GFP-CIU/5μl)對小鼠耳廓內給藥，有可能非侵襲性地從外部觀察受感染細胞中表達的GFP蛋白的螢光(圖9)。這種評價體系為非侵襲性的，其能利用同一個體經時觀察SeV載體-來源的蛋白(GFP)的表達，因此該體系非常適合評價基因表達的持續性。不僅如此，由於可以在同一個體中追蹤經時變化，致使實驗所用的動物個體數大大減少。作為實際上的經時變化，可以在給藥的4天內觀察GFP蛋白螢光，其在給藥第2天達到峰值，在給藥第5-6天基本消失(圖9)。
為了判定GFP螢光的這些改變是否定量反映SeV的基因表達動力學，用攜帶螢光素酶基因的傳播型SeV載體(SeV18+LuciYonemitsu，Y.et al.，Nat.Biotech.18，970-973(2000))進行同樣的耳廓內給藥。首先觀察到，螢光素酶蛋白活性的改變取決於給藥滴度(圖10(A))。其次，定量了耳廓內螢光素酶蛋白表達的經時變化，從而確認，其表達水平在給藥第2日為峰值，第4日略有下降，在給藥第7和第11日幾乎達到基線表達水平(圖10(B))。在此情況下，同時進行給藥攜帶GFP基因的相同類型SeV(SeV18+GFP)的實驗，以便檢測GFP螢光的經時變化。用圖像處理軟體Adobe Photoshop(Adobe Systems Incorporated，CA，USA)從GFP螢光照片中提取綠色螢光(圖11(A))，然後用圖像分析軟體NIH image(National Institute of Health，USA)定量螢光強度(圖11(B))。結果發現，螢光素酶活性的經時變化(圖10(B))與螢光強度的經時變化(圖11(B))高度相關。可見，GFP螢光的變化與螢光素酶活性的變化非常一致。因此判斷，追蹤GFP螢光強度的變化使得能夠進行相對定量。
還進行了評價反覆給藥後表達的實驗。對右耳耳廓給藥SeV18+GFP/ΔF(5×106GFP-CIU/5μl)並確認其表達後，將同樣的SeV18+GFP/ΔF(5×106GFP-CIU/5μl)在不同給藥時間對左耳耳廓給藥，檢測是否表達(圖12(A))。還是在該實驗中，定量GFP螢光強度並顯示之(圖12(B))。右耳耳廓感染1日後和2日後，確認左耳耳廓感染和表達。但是，右耳耳廓感染4日後，左耳耳廓的感染程度大大減少，右耳耳廓感染6日後，左耳耳廓的感染幾乎消失。右耳耳廓感染8日後，幾乎不再有左耳耳廓感染，但感染62日後確認有輕度感染。這種現象被認為表明，該評價方法是檢測SeV載體對免疫系統影響的良好手段，同時也是評價反覆給藥後的表達的優良實驗體系。
接下來，檢查通過對小鼠耳廓內給藥感染的細胞。將SeV18+GFP/ΔF(5×106CIU/5μl)對小鼠耳廓內給藥。感染2日後切除耳廓，製備冰凍切片，在螢光顯微鏡下觀察GFP螢光，同時用抗-GFP抗體(Molecular Probes Inc.，Eugene OR，USA)染色。GFP螢光以及被抗-GFP抗體識別的陽性細胞都在真皮細胞中出現(圖13)。檢查其它個體的耳廓組織，觀察到軟骨膜周邊(圖14(A))，軟骨膜附近的真皮(圖14(B))，表皮附近的真皮(圖14(C))等部位的感染；但沒有真皮和彈性軟骨感染。因此判斷本給藥方法所感染的細胞是耳廓真皮和軟骨膜(含有成纖維細胞)。
構建攜帶抗-CD28抗體(αCD28)基因的SeV載體T細胞活化通過抗原呈遞細胞表面II類(或I類)MHC分子/抗原肽複合物與T細胞受體的反應(第一信號)以及通過CD80(CD86)與CD28(一種第二信號或協同刺激信號)等協同刺激信號的反應來誘導。如此活化的T細胞隨後通過CD80(CD86)與CTLA-4等抑制性協同刺激分子的反應而變得鎮靜(mitigated)。對這些協同刺激信號的阻斷已知可誘導外周免疫耐受。因此，為了在活體內長期表達治療性SeV載體上攜帶的基因的產物，例示了攜帶有抑制協同刺激信號相關基因並誘導外周免疫耐受的抗體基因的載體。為了通過用抗CD28抗體抑制T細胞活化來誘導免疫耐受，構建了一種F基因-缺陷型SeV載體(傳播能力缺陷型)，該載體攜帶抗CD28(αCD28)的單鏈抗體基因。
1)基因的全合成為了構建攜帶αCD28基因的SeV載體，進行該基因的全合成。根據Grosse-Hovest L.等報導的αCD28基因序列(DDBJ database資料庫SYN507107)，進行αCD28(LV鏈和HV鏈的單鏈抗體)基因的全合成，使兩個末端都包含XbaI位點。將該合成的XbaI片段(SEQ ID NO43)(即SYN205-13；兩端各有6個核苷酸包含XbaI位點；αCD28胺基酸序列見SEQID NO44)引入pBluescript II SK+載體(pBluescript/αCD28)。該合成所用的oligo DNA的序列和名稱如下，它們的設置見圖15。此外，載體構建示意圖見圖16。另外還製備了一種DNA片段，其在小鼠抗體κL鏈信號肽(SEQ IDNO46)與SeV的EIS序列之間包含XbaI位點，並且兩端都有NheI/NotI位點。將該DNA片段的NheI位點與pGEM-4Z載體(Promega)的XbaI位點相連，構建出盒式質粒pGEM-4Zcst(SEQ ID NO45，僅顯示含EIS序列的NotI片段)。將包含pBluescript/αCD28的αCD28基因的XbaI片段引入pGEM-4Zcst載體的XbaI位點，構建出包含上述信號肽以及SeV的EIS序列的αCD28基因(αCD28cst基因)。如此獲得的包含αCD28cst基因的NotI片段，其全長為6的倍數(6n)。
表2合成所用的oligo DNA的序列和名稱SYN205F01(SEQ ID NO47)TCTAGAGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGAGCCACCATCTSYN205F02(SEQ ID NO48)AGGGCAGAGAGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGTGAGAGTGTTGAATATTATGTCACAAGTTTAATGCAGSYN205F03(SEQ ID NO49)ATGTCACAAGTTTAATGCAGTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTTTGCTGCSYN205F04(SEQ ID NO50)CCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGGAGGCGGCGGTTCTGGCGGTGGCGGATSYN205F05(SEQ ID NO51)CGGTTCTGGCGGTGGCGGATCAGGTGGCGGAGGCTCGCAGGTGAAACTGCAGCAGTCTGGACCTGGCCTGSYN205F06(SEQ ID NO52)AGCAGTCTGGACCTGGCCTGGTGACGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGTACTGTCTCTGGGTTTTCSYN205F07(SEQ ID NO53)GACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAGCTGATGACACAGCCGTGTATTACTSYN205F08(SEQ ID NO54)
TGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGATAAGGGATACTCCTATTACTATTCTATGGACTACTGGGGCSYN205R01(SEQ ID NO55)TCTAGACGAGGAGACAGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGAATSYN205R02(SEQ ID NO56)ACTTGGCTCTTGGAGTTGTCTTTGCTGATGCTCTTTCTGGACATGAGAGCCGAATTATAATTCGTGCCTCSYN205R03(SEQ ID NO57)CGAATTATAATTCGTGCCTCCACCAGCCCATATTACTCCCAGCCACTCCAGTCCCTGTCCTGGAGACTGGSYN205R04(SEQ ID NO58)GTCCCTGTCCTGGAGACTGGCGAACCCAGTGAACACCATAGTCGCTTAATGAAAACCCAGAGACAGTACASYN205R05(SEQ ID NO59)CCCCCTCCGAACGTGTAAGGAACCTTCCTACTTTGCTGACAGAAATACATTGCAACATCATCCTCGTCCASYN205R06(SEQ ID NO60)TGCAACATCATCCTCGTCCACAGGATGGATGTTGAGGCTGAAGTTTGTCCCAGACCCACTGCCACTAAACSYN205R07(SEQ ID NO61)CAGACCCACTGCCACTAAACCTGGCAGGGACCCCAGATTCTACGTTGGATGCAGCAAAGATGAGGAGTTT2)構建攜帶αCD28基因的F基因-缺陷型SeV cDNA(pSeV18+αCD28cst/ΔF-GFP)確認上述構建的NotI片段基因序列後，從該質粒中切出該NotI片段，將其插入攜帶綠色螢光蛋白(GFP)基因的F基因-缺陷型SeV cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP)(Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))的+18位點(NotI位點)，得到pSeV18+αCD28cst/ΔF-GFP。
3)重建攜有αCD28基因的F基因-缺陷型SeV(SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP)按照Li et al.(Li，H.-O.et al.，J.Virology 74.6564-6569(2000)，WO00/70070)的報導進行病毒重建。利用F蛋白輔助細胞重建F基因-缺陷型病毒。所述輔助細胞利用Cre/loxP表達誘導體系來製備。該體系使用pCALNdLw質粒，它被設計用於利用Cre DNA重組酶誘導基因產物表達(Arai，T.et al.，J.Virol.721115-1121(1988))。為了使插入的基因表達，經上述質粒轉化的細胞使用Saito et al.的方法(Saito，I.et al.，Nucl.Acid.Res.23，3816-3821(1995)，Arai，T.et al.，J.Virol.72，111135-1121(1998))，用表達Cre DNA重組酶的重組腺病毒(AxCANCre)感染。在SeV-F蛋白的情況下，將含有F基因的轉化細胞稱為LLC-MK2/F7，而經AxCANCre誘導後能夠持續表達F蛋白的細胞稱為LLC-MK2/F7/A。
SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP如下重建將LLC-MK2細胞接種在直徑100mm的平皿中，5×106細胞/皿，培養24小時後，細胞用PLWUV-VacT7室溫感染1小時(MOI＝2)。細胞用不含血清的MEM清洗後，將pSeV18+αCD28cst/ΔF-GFP，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L，和pGEM/F-HN分別以12μg，4μg，2μg，4μg，和4μg/皿的重量比懸浮在Opti-MEM中，然後與相當於1μgDNA/5μl的SuperFect轉染試劑混合，室溫靜置15分鐘，加入含3％FBS的Opti-MEM(3ml)，添加細胞進行培養。培養5小時後，細胞用不含血清的MEM洗兩次，然後在含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中培養。培養24小時後，在所述細胞上覆蓋8.5×106細胞/皿的LLC-MK2/F7/A細胞，在含有40μg/ml Arac和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中37℃再培養2天。回收細胞，將沉澱懸浮於Opti-MEM中(2ml/皿)，凍融三次，製得P0裂解物。另一方面，將LLC-MK2/F7/A細胞接種在24孔板中，當幾乎融匯時，將這些細胞轉移到32℃培養箱中培養1天。用SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP的P0裂解物轉染這些細胞(200μl/孔)，用不含血清但含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM在32℃培養。在P2階段之後，用P1培養上清重複同樣的培養直到P3階段，並將LLC-MK2/F7/A細胞接種在6孔板中。
第5天的P3病毒滴度(P3d5)為7×106CIU/ml。
4)通過RT-PCR確認病毒基因組利用QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，Bothell，WA)從F基因-缺陷型SeV，SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP的病毒液(P3樣品)回收病毒RNA。利用配有Platinum Taq Kit的Super Script One-Step RT-PCR(Gibco-BRL，Rockville，MD)進行一步法RT-PCR。使用組合引物F6(5』-acaagagaaaaaacatgtatgg-3』)/R199(5』-GATAACAGCACCTCCTCCCGACT-3』)(分別為SEQ ID NOS62和63)作為引物對進行RT-PCR。確認目的大小的基因被擴增，這表示該病毒基因攜帶αCD28cst基因(圖17)。
5)確認SeV所攜帶的基因的蛋白表達在6孔板上培養直至融匯的LLC-MK2細胞用MOI＝1的SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP感染，用1ml無血清MEM在37℃有5％CO2的情況下進行培養。感染1天後更換MEM，4天後回收培養上清作為樣品。用攜帶GFP基因的F基因-缺陷型SeV載體(SeV18+GFP/ΔF)在同樣條件下感染並回收培養上清，作為陰性對照(NC)。用PAGE prep Protein Clean-Upand Enrichment Kit(Pierce)將300μl培養上清濃縮為40μl，作為SDS-PAGE電泳樣品，加載5μl/泳道，進行Western印跡。另一方面，為了進行考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue，CBB)染色，用同樣的方法將600μl培養上清濃縮為40μl，加載10μl/泳道進行試驗。用抗-小鼠Ig，辣根過氧化物酶-偶聯的全抗體(來自綿羊)(Amersham Bioscience)作為Western印跡檢測所用的抗體。圖18顯示了結果。測出約29kDa的泳帶，與從胺基酸序列預測的分子量一致。
評價攜帶抗-CD28抗體基因的SeV的體內表達持續性作為對攜帶抗-CD28抗體(αCD28cst)基因的F基因-缺陷型SeV(SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP)進行功能評價的一個環節，評價其體內表達持續性。此時，持續性的差異用攜帶GFP基因但不攜帶抗-CD28抗體基因的F基因-缺陷型SeV(SeV18+GFP/ΔF)作為對照進行檢測。並且，由於感染初期αCD28cst蛋白不表達(或非常少地表達)，為了彌補該階段這種蛋白的表達，在SeV給藥的同一天還給予CTLA4-Ig蛋白，並評價該體系，其中所述CTLA4-Ig蛋白預計具有與αCD28cst蛋白同樣的功能。CTLA4-Ig蛋白可以商購(Ancell Corporation)，但這次所用的蛋白是用此前報導的方法製備的(Iwasaki，N.et al.，Transplantation 73(3)334-340(2002)；Harada，H.et al.，Urol.Res.28(1)69-74(2000)；Iwasaki，N.et al.，Transplantation 73(3)334-340(2002)；Glysing-Jensen，T.et al.，Transplantation 64(12)1641-1645(1997))。
表達持續性用實施例3所述的小鼠耳廓內給藥的方法來評價。將包含GFP基因的SeV載體對小鼠耳廓內給藥，可以非侵襲性地從外部觀察到受感染的細胞中所表達的GFP蛋白的螢光。該體系允許用同一個體經時觀察SeV載體-來源的蛋白(GFP)的表達，因此它非常適合評價基因表達的持續性。將攜帶GFP基因的F基因-缺陷型SeV載體(SeV18+GFP/ΔF5×106CIU/5μl)或攜帶抗-CD28抗體基因以及GFP基因的F基因-缺陷型SeV載體(SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP5×106CIU/5μl)對小鼠耳廓內給藥，經時觀察GFP蛋白表達。而且，兩個給藥組中的一些小鼠在用SeV感染的1小時和10小時後腹腔注射CTLA4-Ig蛋白，0.5mg/機體(每組n＝2)。首先確認，攜帶用於抑制協同刺激因子的抗體基因(本例中為αCD28cst)的SeV載體即使在體內也具有感染性(圖19)。與SeV18+GFP/ΔF相比，可以觀察到GFP表達水平有差異，其解釋如下。就持續性而言，SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP給藥組與對照組相比，可以觀察到GFP蛋白的持續性，但非常微弱。也就是說，在SeV18+GFP/ΔF給藥組，直到給藥5天後都能觀察到明顯的GFP表達，但給藥6天後觀察到表達突然消失，幾乎沒有GFP表達。而在SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP給藥組，減少趨勢是微弱的並且是緩慢的，並且即使在給藥6天後也觀察到GFP的螢光(圖19)。SeV感染當天給藥CTLA4-Ig蛋白的效果被清楚地顯示出來。在給予CTLA4-Ig蛋白後，SeV18+GFP/ΔF給藥組和SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP給藥組都觀察到GFP表達增加。而且在SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP給藥組，甚至在感染6天後都觀察到比較清楚的GFP螢光(圖20)。用圖像處理軟體Adobe Photoshop(Adobe SystemsIncorporated，CA，USA)從GFP螢光照片中提取綠色螢光，並用圖像分析軟體NIH image(National Institute of Health，USA)定量螢光強度。圖21顯示了結果。在給予CTLA4-Ig蛋白的情況下，隨著GFP表達的增加，SeV攜帶αCD28cst基因對來自該SeV所攜基因的蛋白(此時為GFP)的效果儘管輕微，但仍得到確認。這些結果證實了抑制協同刺激活性對SeV感染及其持續性的效果，表明確實存在這一方面。此外，即使用單獨的SeV載體感染對表達持續性僅有非常弱的影響，這些結果也表明，通過同時給予預計在SeV感染初期具有相同機制的蛋白，有可能延長表達持續性。
SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP給藥組比SeV18+GFP/ΔF給藥組的GFP蛋白螢光弱，這通過下述體外體系進行確認。用SeV18+GFP/ΔF或SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP以MOI＝5感染LLC-MK2細胞，在螢光顯微鏡下經時觀察GFP表達(圖22)。感染16小時後，在被SeV18+GFP/ΔF感染的細胞中觀察到GFP，但在被SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP感染的細胞中未觀察到。經過確認，在被SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP感染的細胞中在感染24小時後觀察到GFP螢光的表達，但螢光一直很微弱，且表達水平也低於被SeV18+GFP/ΔF感染的細胞。已知SeV基因組中所攜帶的基因的表達量差異存在極性效應(Glazier，K.et al.，J.Virol.21(3)，863-871(1977)；Homann，H.E.et al.，Virology 177(1)，131-140(1990))。即，由於RNA聚合酶的重起(restart)效率並不高，故基因越接近所述基因組的3』-端，其表達水平越高，基因越接近5』-端，其表達水平越低。實際上，有人通過在不同位置攜帶同樣的標誌基因，證明了這種極性效果，同時還提出了關於控制表達水平的設計(Tokusumi，T.et al.，Virus Res 86，33-38(2002))。本例檢測中所用的GFP基因攜帶在SeV18+GFP/ΔF中的3』-端，SeV18+αCD28csst/ΔF-GFP中缺陷F基因的位置，因此SeV18+GFP/ΔF的GFP蛋白量較高而SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP的蛋白量相對較低。但是，由於預計這兩種載體也同樣表達其它SeV蛋白(約為相同的量)，因而想到引起免疫原性的蛋白的表達水平大致相同，並且僅有測試蛋白(GFP)在被SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP感染的細胞中減少。根據上述結果，用耳廓內給藥體系在SeV18+αCD28cst/ΔF-GFP給藥組中確認的基因表達的略微延長表明，實際的延長效果比從GFP觀察結果預測的更強。
產業實用性本發明提供了表達含有抗體可變區的多肽的副粘病毒載體。本發明的載體適於作為基因治療載體對活體進行體內給藥或回體給藥。具體地，表達抗神經伸長抑制物的抗體片段的載體可用於神經損傷的基因治療。此外，本發明表達抑制免疫活化信號傳遞的抗體的載體允許基因從該載體長期表達並進行反覆給藥。
序列表序列表110株式會社載體研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)120編碼抗體的副粘病毒載體及其應用130D3-A0203P150JP 2002-1619641512002-06-0316063170PatentIn version 3.1210121110212DNA213仙臺病毒4001ctttcaccct 10210221115212DNA213仙臺病毒4002tttttcttac tacgg 15210321118212DNA213人工220
223間隔臂序列4003cggccgcaga tcttcacg182104
21118212DNA213人工220
223間隔臂序列4004atgcatgccg gcagatga 18210521118212DNA213人工220
223用於擴增仙臺病毒基因組片段的引物4005gttgagtact gcaagagc 18210621142212DNA213人工220
223用於擴增仙臺病毒基因組片段的引物4006tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42210721118212DNA213人工220
223用於擴增仙臺病毒基因組片段的引物4007atgcatgccg gcagatga 18
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223用於擴增仙臺病毒基因組片段的引物4008tgggtgaatg agagaatcag c 2121092111550212DNA213人工220
223編碼抗體IN-1的V區的基因片段220
221CDS222(18)..(749)223
220
221CDS222(801)..(1505)223
4009gcggccgccg tacggcc atg aaa aag aca gct atc gcg att gca gtg gca 50Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala1 5 10ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc gaa gtt aaa ctg cat gag 98Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Lys Leu His Glu15 20 25tca ggg cct ggg ctg gta agg cct ggg act tca gtg aag ata tcc tgc 146Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys30 35 40aag gct tct ggc tac acc ttc act aac tac tgg cta ggt tgg gta aag 194Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys
45 50 55cag agg cct gga cat gga ctt gag tgg att gga gat att tac cct gga 242Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly60 65 70 75ggt ggt tat act aac tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg 290Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu80 85 90act gca gac aca tcc tcc agc act gcc tac atg cag ctc agt agc ctg 338Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu95 100 105aca tct gag gac tct gct gtc tat ttc tgt gca aga ttt tac tac ggt 386Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Phe Tyr Tyr Gly110 115 120agt agc tac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggc acc acg gtc acc 434Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr125 130 135gtc tcc tca gca aag acc act cct ccg tct gtt tac cct ctg gct cct 482Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro140 145 150 155ggt tct gcg gct cag act aac tct atg gtg act ctg gga tgc ctg gtc 530Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val160 165 170aag ggc tat ttc cct gag cca gtg aca gtg acc tgg aac tct gga tcc 578Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser175 180 185ctg tcc agc ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg caa tct gac ctc 626Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu190 195 200tac act ctg agc agc tca gtg act gtc ccc tcc agc acc tgg ccc agc 674Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser205 210 215gag acc gtc acc tgc aac gtt gcc cac ccg gct tct agc acc aaa gtt 722Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val220 225 230 235
gac aag aaa atc gta ccg cgc gac tgc taaccgtagt aagaaaaact769Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys240tagggtgaaa gttcatcgcg gccgtacggc c atg aaa caa agc act att gca 821Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala245 250ctg gca ctc tta ccg tta ctg ttt acc cct gtg aca aaa gcc gac atc 869Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Asp Ile255 260 265gag ctc acc cag tct cca gca atc atg gct gca tct gtg gga gaa act 917Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ala Ala Ser Val Gly Glu Thr270 275 280gtc acc atc aca tgt gga gca agt gag aat att tac ggt gct tta aat 965Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu Asn285 290 295tgg tat cag cgg aaa cag gga aaa tct cct cag ctc ctg atc tat ggt 1013Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly300 305 310 315gca acc aac ttg gca gat ggc atg tca tcg agg ttc agt ggc agt gga 1061Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly320 325 330tct ggt aga cag tat tct ctc aag atc agt agc ctg cat cct gac gat 1109Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro Asp Asp335 340 345gtt gca acg tat tac tgt caa aat gtg tta agt act cct cgg acg ttc 1157Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Arg Thr Phe350 355 360gga gct ggg acc aag ctc gag ctg aag cgc gct gat gct gca ccg act 1205Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr365 370 375gta tcc atc ttc cca cca tcc agt gag cag tta aca tct gga ggt gcc 1253Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala380 385 390 395tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc 1301Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
400 405 410aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga caa aat ggc gtc ctg aac agt 1349Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser415 420 425tgg act gat cag gac agc aaa gac agc acc tac agc atg agc agc acc 1397Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr430 435 440ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa cga cat aac agc tat acc tgt 1445Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys445 450 455gag gcc act cac aag aca tca act tca ccc att gtc aag agc ttc aac 1493Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn460 465 470 475agg aat gag tgt tagtccgtag taagaaaaac ttagggtgaa agttcatgcg gccgc 1550Arg Asn Glu Cys21010211244212PRT213人工220
223免疫球蛋白IN-1重鏈40010Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1 5 10 15Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Lys Leu His Glu Ser Gly Pro Gly Leu20 25 30Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr35 40 45Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His50 55 60Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn65 70 75 80
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser85 90 95Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser100 105 110Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr115 120 125Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys130 135 140Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln145 150 155 160Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro165 170 175Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser195 200 205Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys210 215 220Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val225 230 235 240Pro Arg Asp Cys21011211235212PRT213人工220
223免疫球蛋白IN-1輕鏈40011Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr1 5 10 15
Pro Val Thr Lys Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met20 25 30Ala Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu35 40 45Asn Ile Tyr Gly Ala Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser50 55 60Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser65 70 75 80Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile85 90 95Ser Ser Leu His Pro Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val100 105 110Leu Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys115 120 125Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu130 135 140Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe145 150 155 160Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg165 170 175Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser180 185 190Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu195 200 205Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser210 215 220Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys225 230 2352101221168
212DNA213人工220
223用於構建Fab基因片段的合成寡核苷酸40012cggaattcgc ggccgccgta cggccatgaa aaagacagct atcgcgattg cagtggcact 60ggctggtt 682101321170212DNA213人工220
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223用於構建Fab基因片段的合成寡核苷酸40018cgggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcaatct gacctctaca 602101921170212DNA213人工
220
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223用於構建Fab基因片段的合成寡核苷酸40020gcacctggcc cagcgagacc gtcacctgca acgttgccca cccggcttct agcaccaaag 60ttgacaagaa702102121170212DNA213人工220
223用於構建Fab基因片段的合成寡核苷酸40021gccgacatcg agctcaccca gtctccagca atcatggctg catctgtggg agaaactgtc 60accatcacat702102221170212DNA213人工220
223用於構建Fab基因片段的合成寡核苷酸
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223用於構建Fab基因片段的合成寡核苷酸40035
agaaaaactt agggtgaaag ttcatcgcgg ccgtacggcc atgaaacaaa gcactattgc 60actggcactc702103621170212DNA213人工220
223用於構建Fab基因片段的合成寡核苷酸40036agcaccaaag ttgacaagaa aatcgtaccg cgcgactgct aaccgtagta agaaaaactt 60agggtgaaag702103721170212DNA213人工220
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223用於構建Fab基因片段的合成寡核苷酸40038gtctgtttac cctctggctc ctggttctgc ggctcagact aactctatgg tgactctggg 60atgcctggtc70
2103921170212DNA213人工220
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213人工220
223用於構建Fab基因片段的合成寡核苷酸40042tcctgcaagg cttctggcta caccttcact aactactggc taggttgggt aaagcagagg 60cctggacatg7021043211753212DNA213人工220
223抗-CD28ScFv抗體基因(SYN205-13)40043tctagagaca tcgagctcac tcagtctcca gcttctttgg ctgtgtctct agggcagaga 60gccaccatct cctgcagagc cagtgagagt gttgaatatt atgtcacaag tttaatgcag120tggtaccagc agaagccagg acagccaccc aaactcctca tctttgctgc atccaacgta180gaatctgggg tccctgccag gtttagtggc agtgggtctg ggacaaactt cagcctcaac240atccatcctg tggacgagga tgatgttgca atgtatttct gtcagcaaag taggaaggtt300ccttacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac ggggaggcgg cggttctggc360ggtggcggat caggtggcgg aggctcgcag gtgaaactgc agcagtctgg acctggcctg420gtgacgccct cacagagcct gtccatcact tgtactgtct ctgggttttc attaagcgac480tatggtgttc actgggttcg ccagtctcca ggacagggac tggagtggct gggagtaata540tgggctggtg gaggcacgaa ttataattcg gctctcatgt ccagaaagag catcagcaaa600gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa atgaacagtc tgcaagctga tgacacagcc660gtgtattact gtgccagaga taagggatac tcctattact attctatgga ctactggggc720caagggacca cggtcactgt ctcctcgtct aga 753
21044211247212PRT213人工220
223由SYN205-13編碼的抗-CD28 ScFv片段40044Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr20 25 30Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Ser Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Asp Glu Asp Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg85 90 95Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg100 105 110Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln115 120 125Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln Ser130 135 140Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Gly145 150 155 160Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu Gly165 170 175Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser180 185 190
Arg Lys Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys195 200 205Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg210 215 220Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly225 230 235 240Thr Thr Val Thr Val Ser Ser24521045211131212DNA213人工220
223pGEM-4Zcst中包含EIS序列的NotI片段40045gcggccgcca aagttcaatg gattttcagg tgcagatttt cagcttcctg ctaatcagtg60cctcagtcat aatgtccaga ggatctagac cgtagtaaga aaaacttagg gtgaaagttc120atcgcggccg c 1312104621122212PRT213鼠(Mus musculus)40046Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Met Ser Arg Gly202104721170212DNA
213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40047tctagagaca tcgagctcac tcagtctcca gcttctttgg ctgtgtctct agggcagaga60gccaccatct 702104821170212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40048agggcagaga gccaccatct cctgcagagc cagtgagagt gttgaatatt atgtcacaag60tttaatgcag 702104921170212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40049atgtcacaag tttaatgcag tggtaccagc agaagccagg acagccaccc aaactcctca60tctttgctgc 702105021170212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40050ccttacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac ggggaggcgg cggttctggc60ggtggcggat 702105121170212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40051cggttctggc ggtggcggat caggtggcgg aggctcgcag gtgaaactgc agcagtctgg60acctggcctg 702105221170212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40052agcagtctgg acctggcctg gtgacgccct cacagagcct gtccatcact tgtactgtct60ctgggttttc 702105321170212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40053gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa atgaacagtc tgcaagctga tgacacagcc60
gtgtattact 702105421170212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40054tgacacagcc gtgtattact gtgccagaga taagggatac tcctattact attctatgga60ctactggggc 702105521153212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40055tctagacgag gagacagtga ccgtggtccc ttggccccag tagtccatag aat 532105621170212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40056acttggctct tggagttgtc tttgctgatg ctctttctgg acatgagagc cgaattataa60ttcgtgcctc 702105721170
212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40057cgaattataa ttcgtgcctc caccagccca tattactccc agccactcca gtccctgtcc60tggagactgg 702105821170212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40058gtccctgtcc tggagactgg cgaacccagt gaacaccata gtcgcttaat gaaaacccag60agacagtaca 702105921170212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40059ccccctccga acgtgtaagg aaccttccta ctttgctgac agaaatacat tgcaacatca60tcctcgtcca 702106021170212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40060tgcaacatca tcctcgtcca caggatggat gttgaggctg aagtttgtcc cagacccact60gccactaaac 702106121170212DNA213人工220
223用於構建抗-CD28cst基因片段的合成寡核苷酸40061cagacccact gccactaaac ctggcaggga ccccagattc tacgttggat gcagcaaaga60tgaggagttt 702106221122212DNA213人工220
223合成引物F640062acaagagaaa aaacatgtatgg 222106321123212DNA213人工220
223合成引物R19940063gataacagca cctcctcccg act2權利要求
1.一種副粘病毒載體，其編碼包含抗體可變區的多肽。
2.權利要求1的副粘病毒載體，其中所述副粘病毒是仙臺病毒。
3.權利要求1的副粘病毒載體，其中所述多肽是分泌型多肽。
4.權利要求1的副粘病毒載體，其中所述載體編碼包含抗體H鏈可變區的多肽和包含抗體L鏈可變區的多肽。
5.權利要求4的副粘病毒載體，其中所述包含抗體H鏈可變區的多肽和包含抗體L鏈可變區的多肽彼此相連形成Fab。
6.權利要求5的副粘病毒載體，其中至少一種抗體可變區源自抗配體或受體的抗體。
7.權利要求6的副粘病毒載體，其中所述抗體與抑制神經細胞生存或分化或軸索伸長的蛋白質結合。
8.權利要求7的副粘病毒載體，其中所述抗體是抗NOGO抗體。
9.權利要求6的副粘病毒載體，其中所述抗體是抗與免疫信號傳遞相關的受體或其配體的抗體。
10.權利要求9的副粘病毒載體，其中所述抗體是抗表達在T細胞或抗原呈遞細胞表面的受體或其配體的抗體。
11.權利要求10的副粘病毒載體，其中所述受體或其配體是T細胞或抗原呈遞細胞的協同刺激信號的信號傳遞分子。
12.權利要求11的副粘病毒載體，其中所述信號傳遞分子是選自CD28，CD80，CD86，LFA-1，ICAM-1(CD54)，PD-1，或ICOS的分子。
13.權利要求9的副粘病毒載體，其中所述載體還編碼另一種外來基因。
14.製備包含抗體可變區的重組多肽的方法，包括以下步驟(a)將權利要求1的病毒載體導入哺乳動物細胞；和(b)從導入了所述載體的哺乳動物細胞或其培養上清回收所產生的多肽。
15.一種多肽，由權利要求14的方法製得。
16.促進神經形成的方法，包括將權利要求7的載體送達需要形成神經的部位。
17.治療脊髓損傷的方法，包括將權利要求7的載體送達損傷部位。
18.抑制免疫反應的方法，包括給藥權利要求9所述載體。
19.權利要求18的方法，還包括給藥抗體或給藥CTLA-4或其片段的步驟，所述抗體抗與免疫信號傳遞相關的受體或其配體。
20.增強載體的基因表達的方法，所述增強基因表達通過使該載體持續進行基因表達和/或通過重複給藥該載體來實現，所述方法包括給藥權利要求9所述載體。
21.權利要求20的方法，還包括給藥抗體或給藥CTLA-4或其片段的步驟，所述抗體抗與免疫信號傳遞相關的受體或其配體。
22.一種載體組合物，所述載體的表達持續性延長，所述組合物包含權利要求9的載體和可藥用承運體。
23.一種基因導入試劑盒，包含(a)權利要求9的載體和(b)抗與免疫信號傳遞相關的受體或其配體的抗體，或CTLA-4或其片段。
全文摘要
本發明提供了表達包含抗體可變區的多肽的副粘病毒載體。本發明所述編碼抗體可變區H鏈和L鏈的載體成功地同時表達這些抗體鏈來形成Fab，並成功地高水平表達單鏈抗體。本發明的載體適合作為基因治療載體，用於對活體進行體內給藥或回體給藥。具體地，表達抗神經伸長抑制物的抗體片段的載體可以用於神經損傷的基因治療。此外，本發明的表達抑制免疫活化信號傳遞的抗體的載體使得能夠由所述載體對基因進行長期表達。
文檔編號C12N15/86GK1675357SQ0381865
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月3日 優先權日2002年6月3日
發明者井上誠, 長谷川護, 弘中孝史 申請人:株式會社載體研究所