C型肝炎治療藥的製作方法

2023-05-27 02:34:36 4

專利名稱：C型肝炎治療藥的製作方法
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本發明涉及與C型肝炎病毒(以下也稱之為「HCV」)包膜糖蛋白結合的各種物質，詳細地講是具有通過與HCV包膜糖蛋白結合來阻止HCV感染作用等抗病毒效果的抗體等蛋白質、硫酸化多糖類、低分子化合物。
如果感染上HCV，得急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化的機率高，最終轉變為肝癌，使患者死亡。以往治療中使用代表性抗病毒藥是幹擾素，存在著治療效果在患者中差異較大，以及發熱等副作用的問題(J.Med.Virol.，Vol.42，299-305，1994)(日消會誌，Vol.91，995-1002，1994)。
另外雖然也進行了使用利巴韋林等其它抗病毒藥物的治療研究，但都沒有獲得十分滿意的效果(Lancet，Vol.337，1058-1061，1991)、現狀就是期待著新的抗HCV藥物的開發。
另外人們認為HCV基因非常容易變異，由於HCV的高變異性，它可逃避患者體內的免疫。特別是在HCV的E2/NS1的N末端存在著由25個到30個胺基酸構成的稱之為hyper variable region(超可變區)的富於變異的區域，按照加藤的預測人免疫系統的抗原表位可能不在超可變區(j.Virol.，Vol.67，No.7，3923-3930，1993)(J.Virol.，Vol.68，No.8，4776-4784，1994)內。就是說，由於人的免疫系統，例如中和抗體識別的區域處於超可變區內，中和抗體即使在感染患者體內生成，但由於超可變區迅速變異病毒有可能逃避抗體。然而石井等人的報告發現抑制E2/NS1與人T細胞Molt-4結合的抗體以高活性只出現在自然治癒HCV感染的患者的血中，表明儘管HCV的變異性高，但體液免疫與HCV的治癒有關(Hepatology，Vol.28，No.4，1117-1120，1998)。
而1999年美國Chiron公司分離出了E2/NS1結合的細胞表面蛋白-CD81(SCIENCE，Vol.282，938-941，1999)。在大腸桿菌表達的CD81與E2/NS1的結合就像石井等人報告的那樣，而HCV自然治癒患者的血清抑制這種結合。這一結果表明CD81是HCV的受體。
通過以上結果可以考慮如果利用與HCV感染細胞有密切關係的包膜蛋白結合的，而且阻止與有HCV感染性人細胞結合的物質，例如抗體那樣的物質作為藥物，就有可能阻止血中的HCV再感染肝臟等感染對象，就有可能使患者治癒。然而現狀是就針對起因於HCV疾病的阻止感染物質還沒有進行充分地研究。
在本發明中，為了開發改善C型肝炎患者症狀的藥物，又進行了抑制E2/NS1與有HCV感染性的細胞、CD81表達細胞或CD81結合的物質的探索，結果獲得了期待的阻止HCV與有HCV感染性細胞結合和感染的物質。
即本發明提供抑制C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白與有感染性的C型肝炎病毒細胞、表達CD81的細胞或CD81結合的物質。
按照本發明的理想模式，可以提供以通過與含有C型肝炎病毒E2/NS1蛋白的帶正電荷的區域結合，能夠抑制C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白與有感染性的C型肝炎病毒細胞、表達CD81的細胞或CD81結合為特徵的物質；以C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是在C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上帶有可識別該E2/NS1蛋白的物質的蛋白質為特徵的物質；以C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是在C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上帶有通過螢光法或發色法可檢測該E2/NS1蛋白的物質的蛋白質為特徵的物質；以C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是在C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上帶有標記的蛋白質為特徵的物質；以C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是在C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白的C末端帶有標記的蛋白質為特徵的物質；以表達CD81的細胞是表達人CD81的細胞為特徵的物質；以CD81是可溶表達的人CD81為特徵的物質；以與C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白的結合常數在108以上，而解離常數在10-8以下為特徵的物質；以結合常數在109以上，或解離常數在10-9以下為特徵的物質；以物質是蛋白質、硫酸化多糖類或低分子化合物為特徵的物質；以蛋白質是抗體為特徵的物質；以抗體來自C型肝炎治癒患者B細胞為特徵的物質；以抗體來自C型肝炎治癒患者的B細胞的基因為特徵的物質；以及以C型肝炎治癒患者是自然治癒患者，B細胞是周圍血單核細胞為特徵的物質。
本發明另一方面還可以提供H鏈可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列號1、2和3記載的胺基酸序列，或是含有在序列號1、2和3記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒E2/NS1蛋白有親和性的抗體；以含有序列表中序列號16或34記載的胺基酸序列，或含有在序列號16或34記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列為特徵的上述抗體；L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表中序列號4、5和6記載的胺基酸序列，或含有在序列號4、5和6記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體；以含有序列表中序列號17記載的胺基酸序列，或在序列號17記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列為特徵的上述抗體；L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列號7、8和9記載的胺基酸序列，或含有在序列號7、8和9記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體；以含有序列表中序列號18記載的胺基酸序列，或在序列號18記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列為特徵的上述抗體；L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列號10、11和12記載的胺基酸序列，或含有在序列號10、11和12記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體；以含有序列表中序列號19記載的胺基酸序列，或在序列號19記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列為特徵的抗體；L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列號13、14和15記載的胺基酸序列，或含有在13、14和15記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體；以含有序列表中序列號20記載的胺基酸序列，或含有在序列號20記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列為特徵的上述抗體。
本發明另一方面還可以提供L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表的序列號42、43和44記載的胺基酸序列，或含有在序列號42、43和44記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體；以含有序列表中序列號54記載的胺基酸序列，或含有在序列號54記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列為特徵的上述抗體；本發明另一方面還可以提供L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表的序列號45、46和47記載的胺基酸序列，或含有在序列號45、46和47記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體；以含有序列表中序列號55記載的胺基酸序列，或含有在序列號55記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列為特徵的上述抗體；L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表中序列號48、49和50記載的胺基酸序列，或含有在序列號48、49和50記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體；以含有序列表中序列號56記載的胺基酸序列，或含有在序列號56記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列為特徵的上述抗體；L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列號51、52和53記載的胺基酸序列，或含有在序列號51、52和53記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體；以含有序列表中序列號57記載的胺基酸序列，或含有在序列號57記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列為特徵的上述抗體。
本發明另一方面還提供作為重鏈的胺基酸序列含有序列表中序列號40記載的胺基酸序列，或含有在序列號40記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體；作為輕鏈的胺基酸序列含有序列表中序列號41記載的胺基酸序列，或含有在序列號41記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體。
本發明另一方面還提供含有序列表中序列號26、27、28或29記載的胺基酸序列，或含有在序列號26、27、28或29記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的單鏈抗體。
本發明另一方面還提供含有序列表中序列號36、37、38或39記載的胺基酸序列，或含有在序列號36、37、38或39記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的單鏈抗體。
本發明另一方面還提供含有序列表中序列號62、63、64或65記載的胺基酸序列，或含有在序列號62、63、64或65記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的單鏈抗體。
本發明另一方面還提供編碼上述本發明抗體的核酸。提供的比較理想的上述核酸是含有序列表中序列號21、22、23、24、25、35、58、59、60、61中任一個記載的鹼基序列的上述核酸；含有序列號40或41記載的鹼基序列的上述核酸；含有序列表中序列號26、27、28、29中任一個序列記載的鹼基序列的上述核酸；含有序列表中序列號36、37、38、39中任一個序列記載的鹼基序列的上述核酸；含有序列表中序列號62、63、64、65中任一個序列記載的鹼基序列的上述核酸。
本發明另一方面還提供應用上述任一個核酸生產抗體的方法。
本發明另一方面還提供應用上述方法可以獲得的對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的重組抗體。提供的理想的重組抗體是抗體的Fc區是人源化重組抗體，抗體是單鏈抗體。
本發明另一方面還提供含有上述本發明物質作為有效成分的藥物，含有上述本發明的抗體作為有效成分的藥物，含有上述本發明的重組抗體作為有效成分的藥物。提供的理想藥物是治療和/或預防C型肝炎的藥物，以及用於診斷C型肝炎的藥物。另外本發明提供含有上述本發明的物質作為有效成分的抗HCV劑、含有上述本發明的抗體作為有效成分的抗HCV劑、含有上述本發明的重組抗體作為有效成分的抗HCV劑。
本發明另一方面還提供獲得抗體可變區序列的方法，其特徵是刺激C型肝炎治癒患者的B細胞，使抗C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白的抗體的mRNA表達，從該B細胞獲得抗體mRNA和抗體cDNA，獲得與該E2/NS1結合的抗體的可變區序列。理想的是以C型肝炎治癒患者是自然治癒患者、B細胞是周圍血單核細胞為特徵的獲得抗體可變區序列的方法。
本發明另一方面還提供含有利用上述方法獲得的具有可變區序列的抗體。
本發明另一方面還提供包括在被檢驗物質存在或不存在情況下使C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白與有C型肝炎病毒感染性的細胞、表達CD81的細胞或CD81接觸的工序；以及在被檢驗物質存在或不存在情況下對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白與有C型肝炎病毒感染性的細胞、表達CD81的細胞或CD81結合進行比較的工序的，對抑制C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白與有C型肝炎病毒感染性的細胞、表達CD81的細胞或CD81結合的物質進行篩選的方法。比較理想的是提供以C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上帶有可識別該E2/NS1蛋白的物質的蛋白為特徵的篩選方法，以C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是在C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上帶有通過螢光法或發色法可檢測出該E2/NS1蛋白的物質的蛋白質為特徵的篩選方法；以C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是在C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上帶有標記的蛋白質為特徵的篩選方法；以C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是在C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白的C末端帶有標記的蛋白質為特徵的篩選方法；以表達CD81的細胞是表達人CD81的細胞為特徵的篩選方法；以CD81是可溶表達的人CD81為特徵的篩選方法；以被檢驗物質為蛋白質、硫酸化多糖類或低分子化合物為特徵的篩選方法。
本發明另一方面還提供由上述任一篩選方法得到的，抑制C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白與有C型肝炎病毒感染性的細胞、表達CD81的細胞或CD81結合的物質。
本發明另一方面還提供抑制C型肝炎病毒生活環境的物質，該C型肝炎病毒是通過包括在被檢驗物質存在或不存在情況下測定有HCV感染性的細胞和表達HCV蛋白的細胞的結合，與沒有被檢驗物質存在情況下的結合進行比較的工序的篩選方法得到的；以及提供抑制C型肝炎病毒生活環境的物質，該C型肝炎病毒是通過包括在被檢驗物質存在或不存在情況下在有HCV感染性的細胞和表達HCV蛋白的細胞結合後，對被檢驗物質與有HCV感染性細胞或表達HCV蛋白的細胞的融合進行測定，與沒有被檢驗物質存在情況下的融合進行比較的工序的篩選方法得到的。理想的被檢驗物質是蛋白質、硫酸化多糖類或低分子化合物。
本發明另一方面還提供含有上述物質作為有效成分的抗HCV劑；以及提供使用上述物質包括使抗HCV劑製劑化的抗HCV劑的製造方法，該製造方法最好包括利用上述篩選方法確認抑制C型肝炎病毒增殖的工序。
圖2是表示肝素的中和活性圖。
圖3表示舒拉明中和活性圖。
圖4是表示修飾scFv的NOB活性圖。
圖5是表示whole抗體的NOB活性圖。
圖6是表示whole抗體的抑制細胞融合(cell fusion)活性圖。
圖7是表示表達質粒pEX gammal loxP-Hyg HCVI的構建圖。
圖8是表示表達質粒pEX kappa Km HCVI的構建圖。
圖9是表示表達質粒pEX loxP-Hyg HCVI W的構建圖。
實施發明的最好方式以下就本發明進行詳細地說明。
本發明的物質是抑制C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白與有C型肝炎病毒感染性細胞(以下有時也稱之為「HCV感染性細胞」)、表達CD81的細胞(以下有時也稱之為「CD81表達細胞」)或CD81結合的物質。
以下就對上述那樣的物質進行篩選，各種物質是否有抑制E2/NS1與HCV感染性細胞、表達CD81的細胞或CD81結合的可能性進行說明。
象上述那樣，HCV的包膜蛋白中含有E1和E2/NS1。人們預測其中稱之為E2/NS1超可變區的富於變異區域可能不是人免疫系統的抗原表位。就是說，由於人們預料E2/NS1與作為病毒感染的第一階段-與細胞結合有密切關係，所以在本發明中進行到將阻止E2/NS1與HCV感染性細胞、CD81表達細胞或CD81結合的物質作為阻止HCV與細胞結合或感染的物質開發的地步。
E2/NS1是由HCV基因組表達的蛋白質的第384位胺基酸到746位胺基酸的蛋白質。在本發明中E2/NS1與HCV感染細胞的結合可以通過例如使在HCV基因的E2/NS1的C末端帶有標記的蛋白以可溶性形式表達，然後與HCV感染性細胞或CD81表達細胞結合，使用針對其標記的抗體，通過發光法或發色法進行確認E2/NS1與上述細胞的結合。抑制結合的物質是通過在確認結合的系統中可溶性E2/NS1與上述細胞結合之前使E2/NS1與希望確認抑制結合的物質混合，然後與該細胞混合之後通過測定發光或發色的變化進行確認的。抑制結合的物質雖然後面進行了詳細的敘述，例如有H鏈中存在序列號1到3記載的胺基酸序列，L鏈中存在序列號4到6記載的胺基酸序列的抗體、肝素、蘇拉明等，但只要是對E2/NS1與HCV感染性細胞或CD81表達細胞結合有抑制的物質即可，並不受此限定。另外由於可溶性CD81和E2結合也有報導(SCIENCE，Vol.282，938-941)，所以容易類推使用上述物質也有可能抑制可溶性CD81和E2的結合。
人們已經知道肝素等硫酸化多糖類帶負電荷多，與抗凝血酶III和成纖維細胞生長因子等蛋白中帶正電荷多的區域結合(FEBSLett，Vol.69，51-54，1976)(Cell，Vol.64，841-848，1991)。另外就像後面的實施例所表明的那樣，在本發明中發現了E2/NS1與肝素結合。就是說，可以很容易類推在實施例給出的物質中，肝素通過與E2/NS1的正電荷多的部位結合，抑制E2/NS1與HCV感染性細胞或CD81表達細胞或CD81的結合。即只要是與E2/NS1含有正電荷多的部位結合的物質，有可能抑制E2/NS1與HCV感染性細胞、CD81表達細胞或CD81的結合。
另外由於肝素等硫酸化多糖類與糖蛋白結合時影響該蛋白表面的電荷，也引起結構上的變化，所以在本發明中雖然對硫酸化多糖類與E2/NS1的結合進行了確認，但也可以想像到上述那樣的結構變化也與E2/NS1與HCV感染性細胞或CD81表達細胞或CD81的結合有關。
這裡所說的帶負電荷或正電荷是指存在於蛋白或與蛋白結合的糖鏈上的帶有電荷的地方。在本發明中E2/NS1作為與肝素瓊脂糖CL-6B(Phamacia公司)結合，在沒有用含有0.15M的NaCl的10mM磷酸緩衝液洗脫時與柱子結合的結構域。
在本發明中所謂可識別C型肝炎病毒E2/NS1蛋白的物質是指利用象以下那樣帶有標記的蛋白、半抗原等的抗體可檢測該E2/NS1蛋白的物質。
本發明所謂的在C型肝炎病毒E2/NS1蛋白上帶有標記的蛋白例如只要是在由HCV基因組上的384位到711位胺基酸構成的蛋白質的C末端上附加上由眾所周知的Etag(Phamacia公司)、Histag、myctag、FLAGtag、HAtag、GST、IgG Fc區域等5個以上胺基酸構成的可被特異抗體識別的序列即可，並沒有特別限定。進一步講，就像先前討論的那樣，人們認為在HCV的E2/NS1的N末端存在稱之為超可變區的免疫系統的抗原表位。因此使E2/NS1結合上標記使其表達時，有希望使用C末端結合標記的E2/NS1。而這樣得到的蛋白質是可溶性的。該可溶性E2/NS1隻要是使384位到746位胺基酸間的E2/NS1的膜外結構域表達即可，可以無特別限制地使用。帶有標記的可溶性蛋白E2/NS1可以使其在動物細胞、昆蟲細胞、酵母等蛋白上可能附加糖鏈的細胞中表達。
而所謂在C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上加上通過半抗原等的抗體等可檢出的物質的蛋白指的是例如E2/NS1在使384位到746位胺基酸間的E2/NS1的膜外結構域表達的產物上結合生物素、螢光素、DIG等可被抗體等識別的低分子物質。其中識別低分子的物質例如象例舉的生物素由於除了抗體以外也可以被抗生物素蛋白、鏈抗生物素蛋白等蛋白所識別，所以只要是識別該物質的物質即可，不一定非得是抗體和蛋白質。
另外在所謂的在C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上帶有通過螢光法、發色法可檢出的物質的蛋白指的是例如E2/NS1在使384位到746位胺基酸間的E2/NS1的膜外結構域表達的產物結合上FITC、鹼性磷酸酶、HRP等發螢光的物質，或該物質與某物質、例如酶的底物混合時發色的物質，並沒有特別限定。
本發明所謂的有HCV感染性細胞指的是作為HCV可以增殖或感染的細胞如Huh7、HepG2、WRL68等人肝細胞以及Molt-4、MT-2、Daudi等淋巴系細胞，只要是確認HCV感染性的細胞即可，即使不是這裡提到的細胞也可以。
所謂表達CD81的細胞舉一個例子，如利用脂質轉染法(GIBCOBRL)將在invitrogen公司的pCDNA3.1(+)的多克隆位點插入了人的CD81基因(Gen Bank登錄號M33680)的載體導入NIH3T3細胞後的細胞，但只要CD81在通過基因重組常規方法構建的細胞中的表達能夠利用蛋白質印跡法、抗CD81抗體的螢光檢測法、RNA印跡法等可檢測蛋白或mRNA的方法確認，在本發明中CD81表達用的載體、表達細胞、基因導入法沒有特別限定。
在本發明中在選擇抑制E2/NS1與CD81結合的物質時，這裡說的CD81也可以利用可溶性人CD81。可溶性人CD81隻要是可使CD81的膜外結構域表達即可，使用上沒有特別限制。可溶性CD81使用動物細胞、昆蟲細胞、酵母和大腸桿菌等利用基因重組常規方法使其表達是可能的。另外也沒有必要只使可溶性CD81的膜外結構域表達，例如為了純化或檢測目的即使是加上標記的產物或進行修飾的產物也沒有問題。
而在使用針對標記的抗體檢出E2/NS1與HCV感染性細胞或CD81表達細胞或CD81結合的方法如發光法、發色法，理想的是流式細胞儀、cell ELISA法、ELISA法等。但只要是可以檢測出E2/NS1與CD81表達細胞或CD81結合的方法即可，沒有特別限定。
所謂本發明的抗體除了包括通常生物體內存在的抗體外，也包括至少含有一個由抗體的H鏈或L鏈的可變區或它們的組合形成的抗原結合部位的肽、由1組H鏈片段和L鏈片段構成的Fab、由2組H鏈片段和L鏈片段構成的F(ab)2、H鏈片段和L鏈片段串連結合在同一個肽的單鏈抗體(以下有時也稱之為「scFv」)。在本發明中whole抗體最理想。
在本發明中單克隆抗體是通過從C型肝炎治癒患者的B細胞獲得的抗體的基因製作的。作為從來自人的多個B細胞只分離目的抗體基因的方法有用EBV轉化患者B細胞之後，使B細胞增殖後，只克隆生產目的抗體的細胞等以往的手法，但本發明人通過深入研究，結果利用噬菌體展示法獲得了scFv。
舉一個利用噬菌體展示法獲得抗體的例子，從C型肝炎治癒患者進行肝素採血，使用Ficoll法獲得周圍血單核細胞，利用抗CD19抗體單抗只純化B細胞。然後使用人IL-2、人IL-10、E2/NS1抗原1ng/ml、抗人CD40抗體1μg/ml，刺激B細胞中抗體基因向mRNA的轉錄。該B細胞的純化只要是能夠特異地分離B細胞的方法即可，並沒有特別限制。而有關B細胞的刺激也可以利用上述以外的方法，即使使用適當簡略的方法也沒有問題。然後從B細胞提取抗體mRNA，進一步獲得抗體cDNA。接下來在scFv表達質粒製作整合H鏈和L鏈可變區的基因的單鏈抗體基因的框架，再於框架的下遊結合上M13噬菌體的gene3基因。在整合抗體的H鏈和L鏈的可變區地方整合從上述得到的cDNA利用PCR法隨機獲得的H鏈和L鏈。利用該質粒以與gene3蛋白的融合蛋白形式使整合的單鏈抗體在M13噬菌體的前端表達，然後通過只選擇與E2/NS1結合的抗體，獲得表達H鏈的可變區的CDR1、CDR2以及CDR3分別是序列表中序列號1、2和3記載的胺基酸序列，L鏈的可變區的CDR1、CDR2以及CDR3的序列分別是序列表中序列號4、5和6記載的胺基酸序列的單鏈scFv1-1以及表達該scFv1-1的噬菌體。而且發現scFv1-1和表達該scFv1-1的噬菌體對E2/NS1的親和性特別強，強烈地抑制E2/NS1與HCV感染性細胞或CD81表達細胞或CD81的結合。
另外上述例舉了使用M13噬菌體系統篩選單鏈抗體的手法，在本發明中「抗體」和噬菌體表面提示蛋白只要是以融合蛋白形式表達的手法即可，沒有特別限制。
本發明提到的C型肝炎治癒患者指的是檢測血液中HCV的mRNA，測定肝功能的值，例如ALT等值發現異常，即處於所謂C型肝炎狀態的患者的血液中的HCV的mRNA處於檢測界限以下，ALT等肝功能測定值連續6個月以上處於正常狀態的患者。
上述作為本發明抗體代表性例子例舉的scFv1-1使用BIACORE(BIACORE公司)測定與E2/NS1的結合常數Ka為4.5×108(M)，解離常數Kd為2.2×10-9(1/M)。本發明人獲得了多個帶有與scFv1-1相同的可變區的H鏈而L鏈可變區不同的單鏈抗體，對各個單鏈抗體的結合能力與抑制E2/NS1與HCV感染性細胞以及人CD81表達細胞結合的能力進行比較時，發現各個單鏈抗體的結合能力與阻止E2/NS1與細胞結合的能力存在相關性。其中結合常數在108(M)以上，解離常數在10-8(1/M)以下的單鏈抗體scFv1-1從其抑制活性可以判斷作為藥物的能力是充分的。就是說，通過用BIACORE測定，與E2/NS1的結合常數在108(M)以上，解離常數在10-8(1/M)以下的抗體作為阻止感染HCV感染性細胞的藥物更理想。為了進一步提高抗體的能力，結合常數為109(M)以上，解離常數為10-9(1/M)以下的抗體作為藥物最理想。
通常的抗體是由兩種大小的多肽鏈構成的，大的亞基稱為「H鏈」，小的亞基稱為「L鏈」。而各個肽鏈是由存在於N末端形成抗原結合部位的「可變區」和與抗體類別有關的一定的「恆定區」構成的。可變區又可進一步分為與抗原結合部位的形成有特別密切關係的互補決定區「CDR」和存在於該區域之間的「框架」。已知CDR在H鏈和L鏈中從N末端開始分別存在著稱之為「CDR1」、「CDR2」和「CDR3」的3個區域。
以下舉例說明本發明的抗體ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4。抗體ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的胺基酸序列記載於序列表中序列號1至20，DNA序列記載於序列號21至25。
構成抗體可變區的胺基酸往往因抗體不同而不同。ScFv1-1的H鏈的部分胺基酸序列如序列號16所示。而序列號16是表示為使scFv在大腸桿菌表達的序列、即scFv1-1的H鏈的N末端附加了2個胺基酸的序列。因此考慮到作為抗體的框架，給出了由序列號16胺基酸的第3位到32位構成的框架1、從第33位到37位的「CDR1」、第38位到51位構成的框架2、從第52位到68位的「CDR2」、第69位到100位的框架3、從第101位到117位的「CDR3」、第118位到128位構成的框架4。ScFv1-1的L鏈的部分胺基酸序列如序列號17所示。序列號17胺基酸的第1位到23位構成的框架1、從第24位到34位的「CDR1」、第35位到49位構成的框架2、從第50位到56位的「CDR2」、第57位到88位的框架3、從第89位到97位的「CDR3」、第98位到111位構成的框架4。ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的H鏈胺基酸序列都如序列號16所示。而關於L鏈分別如下面所示那樣。ScFv1-2的L鏈的部分胺基酸序列如序列號18所示。序列號18胺基酸的第1位到23位構成的框架1、從第24位到34位的「CDR1」、第35位到49位構成的框架2、從第50位到56位的「CDR2」、第57位到88位的框架3、從第89位到97位的「CDR3」、第98位到111位構成的框架4。ScFv1-3的L鏈的部分胺基酸序列如序列號19所示。序列號19胺基酸的第1位到23位構成的框架1、從第2 4位到34位的「CDR1」、第35位到49位構成的框架2、從第50位到56位的「CDR2」、第57位到88位的框架3、從第89位到97位的「CDR3」、第98位到111位構成的框架4。ScFv1-4的L鏈的部分胺基酸序列如序列號20所示。序列號20胺基酸的第1位到22位構成的框架1、從第23位到36位的「CDR1」、第37位到51位構成的框架2、從第52位到58位的「CDR2」、第59位到90位的框架3、從第91位到102位的「CDR3」、第103位到116位構成的框架4。這些框架和CDR的分界是參考Kabat等人的「免疫學上有用蛋白的序列」(National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1987)和(1991)決定的。
在ScFv的製備中可以利用重組噬菌體抗體系統(RecombinantPhage Antibody System(Phamacia公司))等，但該單鏈抗體對於作為生產宿主的大腸桿菌有毒性，會引起大腸桿菌死亡、該單鏈抗體分解那樣的情形，所以不能有效利用試劑盒就需要更多的辦法。單鏈抗體可以通過研究pSE380質粒(invitrogen公司)和pET24d(+)質粒(Novagen公司)等的誘導性載體和作為宿主的菌體製備。另外在生產中除了上述方法外，也可以有效利用動物細胞表達系統、昆蟲細胞表達系統、酵母細胞表達系統。連接H鏈和L鏈的鉸鏈在實施例中使用了3個重複的(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)共15個殘基的胺基酸，在本發明中不限定於本序列，也可以利用其它序列。
序列表中序列號21給出了相當於序列表中序列號16的第1位到128位的胺基酸序列的核酸鹼基序列。序列表中序列號22給出了相當於序列表中序列號17的第1位到111位的胺基酸序列的核酸鹼基序列。序列表中序列號23給出了相當於序列表中序列號18的第1位到111位的胺基酸序列的核酸鹼基序列。序列表中序列號24給出了相當於序列表中序列號19的第1位到111位胺基酸序列的核酸鹼基序列。序列表中序列號25給出了相當於序列表中序列號20的第1位到116位的胺基酸序列的核酸鹼基序列。而在這些鹼基序列中只要表現出本發明敘述的那樣的效果，缺失、置換或附加1個或數個鹼基的鹼基序列也都包括在本發明的範圍內。
抗體的抗原特異性和與抗原結合的強度主要由CDR的胺基酸序列決定，這是通過小鼠抗體的人源化表示的(MethodsinEnzymology，203，99-121，1991)。
另外由scFv製作通常存在於生物體內的抗體是有可能的。舉一個例子，利用PCR法從與E2/NS1結合的scFv的質粒只擴增H鏈和L鏈的可變區部分。擴增的各個片段重組到例如含有人抗體的H鏈基因和/或L鏈基因的質粒，作成帶有處於上述ScFv可變區的存在於通常生物體內形式的抗體是有可能的。具體來說，例如在通過從質粒擴增H鏈和L鏈的可變區時得到的基因片段的兩端引入適當的限制酶切位點，然後與含有人抗體的H鏈和/或L鏈的質粒上的適當的限制酶切位點組合，為了不引起框架漂移可改換可變區的基因。利用這樣的方法製作保持原有處於質粒上的可變區序列的出現在通常生物體內的抗體是有可能的。由該抗體製作至少含有一個由抗體的H鏈或L鏈的可變區或它們的組合形成的抗原結合部位的肽、由1組H鏈片段和L鏈片段構成的Fab、2組H鏈片段和L鏈片段構成的(Fab』2)也是有可能的。
另外通過置換下列本發明給出的抗體的序列有可能提高與E2/NS1的結合能力以及中和活性，這些抗體是H鏈可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別是序列號1、2和3記載的胺基酸序列，L鏈可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別是序列號4、5和6記載的胺基酸序列的抗體；或者H鏈可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別是序列號1、2和3記載的胺基酸序列，L鏈可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別是序列號7、8和9記載的胺基酸序列的抗體；或者H鏈可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別是序列號1、2和3記載的胺基酸序列，L鏈可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別是序列號10、11和12記載的胺基酸序列的抗體；或者H鏈可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別是序列號1、2和3記載的胺基酸序列，L鏈可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別是序列號13、14和15記載的胺基酸序列的抗體。例如通過隨機置換CDR3序列改換抗體也是有可能的，通過置換H鏈和L鏈的CDR-1、CDR-2以及CDR-3的胺基酸序列和基因序列獲得高活性的抗體也是有可能的。此時變換了胺基酸序列的抗體只要沒有丟失中和活性就沒有問題。就是說，在本發明中只要具有抑制E2/NS1與HCV感染性細胞、表達CD81的細胞或CD81的結合，即使在上述胺基酸序列中進行了置換、缺失、插入等修飾的序列也都包括在本發明範圍內。
本發明的抗體ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3和ScFv2-4是在上述抗體ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的H鏈中進行了胺基酸置換的抗體。抗體ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3和ScFv2-4的H鏈胺基酸序列和DNA序列記載於序列表中序列號34和35中。
抗體ScFv3-1、ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4的胺基酸序列和DNA序列記載於序列表中序列號42至65中。
有關抗體ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3、ScFv2-4、ScFv3-1、ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4的說明與ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的說明同樣。
在本發明，使用全長抗體最理想。
在本發明抗體的表達中雖然可以使用大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等，但考慮到作為用於人的藥品，要進行糖鏈修飾使用更接近人型的動物細胞更好。舉一例子，在使抗體在COS或CHO細胞中表達時可以使用pCDNA3.1(+)或pMAMneo(CLONETECH公司)等。例如將通過上述手法獲得的抗體的H鏈的基因插入到pCDNA3.1(+)的多克隆位點，將L鏈的基因插入到pMAMneo。並且在插入了H鏈的載體的適當位點插入在啟動子和polyA之間含有L鏈基因的表達單元。將該載體通過基因工程的常規方法導入COS細胞或CHO-K1、CHO.DG44中，可以進行目的抗體的生產。另外在上述製作的載體中例如從pSV2/DHFR(Nature，1981，Vol.294，Lee F.et al.，)切出DHFR基因的表達單元，整合到表達H鏈和L鏈的載體中。將該載體通過基因工程的常規方法導入CHO DG44。由此選擇的細胞通過使用採用MTX的DHFR基因擴增系統有可能大幅度提高抗體的生產率。雖然在COS細胞中只瞬時表達抗體，但在CHO細胞中抗體的基因有可能以染色體的整合形式進行表達。而通過使用先前提到的DHFR基因擴增系統也可以使抗體高效表達，由於在無血清的培養基中可以進行抗體生產，所以工業生產使用CHO細胞更好。
COS細胞通常使用加有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s改良Eagle’s Medium(DMEM)，於5％CO2、37℃下進行培養。向COS細胞導入基因後的細胞育種生產法在「生物手冊系列叢書4基因導入和表達、解析法；橫田崇、新井賢一」(羊土公司、1994)等實驗書中有記載。向COS細胞導入基因的方法除了電穿孔法之外也可以使用DEAE葡聚糖法、脂質轉染法等使用轉染試劑的方法。
CHO K-1細胞、CHO DG44細胞除了使用在DMEM加有10％FBS的培養基外，也可以使用例如CHO S SFM2(GIBCO公司)等銷售的無血清培養基於5％CO2、37℃下進行培養。向CHO細胞導入基因也與COS細胞一樣除了電穿孔法之外也可以使用DEAE葡聚糖法、脂質轉染法等使用轉染試劑的方法。特別是對於CHO DG44細胞，可以在沒有次黃嘌呤、胸苷的培養基中培養，可以通過向培養基中添加DHFR的抑制劑MTX，通過基因擴增使抗體的生產率提高。
本發明在生產抗體時，為了避免混入來自血清的牛抗體，希望在無血清培養基中進行培養。而對於不適合無血清培養基的COS和CHO在血清培養基培養的細胞希望通過不加入血清的DEME進行培養。從這樣培養上清中得到的本發明的抗體可以通過諸如使用蛋白A柱子或蛋白G柱子的一般純化IgG抗體的方法很容易地進行純化。
本發明中生產的抗體可以用於HCV的治療，作為抗體的形狀雖然也可以直接利用生產的抗體分子，經各種蛋白酶處理得到的含有抗原結合部位的片段Fab、F(ab』)2、Fv或Fd也適用，但whole抗體最理想。關於這些片段在「抗體工學入門」(地人書館)中有詳細的說明。肽片段可以通過用酶處理抗體分子得到，也可以通過基因工程手法使細菌、酵母等生產肽片段。通過利用這些方法得到的單克隆抗體、來自單克隆抗體的抗體片段、肽等的組合，產生更強的結合性。
利用本發明生產的抗體，可以減少HCV感染患者血液中的HCV粒子。例如，通過將本發明生產的抗體投予使用HCV的mRNA或者市售的HCV診斷藥物在血液中觀察到存在抗HCV抗體的患者，由於使血液中的HCV粒子減少，所以可以防止HCV的再感染、使患者治癒。另外如果將本抗體投予HCV患者，也可以與HCV患者的體內HCV感染的細胞，特別是細胞表面有E2/NS1提示的細胞結合。預期通過該結合和生物體內補體等免疫系統的活化對HCV感染細胞也有阻礙能力。另外通過整合來自其它抗體的可變區基因生產雙特異性抗體、多特異性抗體也是有可能的。所謂多特異性抗體指的是至少含有2種以上識別不同抗原或同一抗原的不同抗原表位的抗原結合部位的抗體。而其中的雙特異性抗體指的是至少含有2種以上識別不同抗原或抗原表位的抗原結合部位的抗體。例如通常的抗體一方的抗原結合部位與另一方抗原結合部位不同的雙特異性抗體比通常的抗體與抗原的結合更強，且可與範圍廣泛序列的HCV結合。另外作為IgM識別更多價抗原的抗體的製作也是可能的。在進行這樣生產時除了進行雙特異性化以外，也可以對單克隆抗體進行生產、純化，然後使抗體之間結合進行雙特異性化，多特異性化。該雙特異性化不僅對同一抗原，而且針對其它抗原的組合也是可能的。例如，利用針對出現在HCV粒子表面的E1的抗體，製作雙特異性抗體、以及多特異性抗體也是有可能的。
單鏈抗體ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的胺基酸序列如序列表中序列號26、序列號27、序列號28和序列號29所示。而編碼這些序列的核酸序列也隨胺基酸序列一起給出了。序列號26胺基酸序列的第1位到22位是含有來自大腸桿菌的分泌用信號肽的序列，第23位到第148的序列是H鏈的可變區，第149位到第165位序列是接頭，第166位到第276位是L鏈的可變區，第277位到299位的序列是含有tag的序列。序列號27胺基酸序列的第1位到22位是含有來自大腸桿菌的分泌用信號肽的序列，第23位到第148的序列是H鏈的可變區，第149位到第165位序列是接頭，第166位到第276位是L鏈的可變區，第277位到299位的序列是含有tag的序列。序列號28胺基酸序列的第1位到22位是含有來自大腸桿菌的分泌用信號肽的序列，第23位到第148的序列是H鏈的可變區，第149位到第165位序列是接頭，第166位到第276位是L鏈的可變區，第277位到299位的序列是含有tag的序列。序列號29的胺基酸序列的第1位到22位是含有來自大腸桿菌的分泌用信號肽的序列，第23位到第148的序列是H鏈的可變區，第149位到第165位序列是接頭，第166位到第281位是L鏈的可變區，第282位到304位的序列是含有tag的序列。
缺失序列號26、序列號27、序列號28和序列號29記載的胺基酸序列中第1位到22位的序列也有可能在大腸桿菌中表達單鏈抗體。而序列號26、序列號27和序列號28記載的胺基酸序列的第277到第299位序列是為了檢測單鏈抗體、以及純化用的序列，也可以缺失或置換成任意序列。另外，序列號29中記載的胺基酸的第282位到304位同樣為了檢測單鏈抗體，以及純化的序列，也可以缺失成置換成任意序列。含有來自大腸桿菌的分泌信號肽以及純化用序列的載體的製作如實施例所示那樣進行。序列號26、序列號27、序列號28和序列號29記載的胺基酸序列的第149位到165位的接頭序列只要實質上使H鏈和L鏈的可變區的立體結構與ScFv1-1保持一樣也可以置換為任何序列。單鏈抗體除了在動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞生產以外，也可以在大腸桿菌中生產。
另外單鏈抗體ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3、以及ScFv2-4的胺基酸序列如序列表中序列號36、序列號37、序列號38和序列號39所示。而編碼這些序列的核酸序列也隨胺基酸序列一起給出了。
另外單鏈抗體ScFv3-1、ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4的胺基酸序列如序列表中序列號62、序列號63、序列號64和序列號65所示。而編碼這些序列的核酸序列也隨胺基酸序列一起給出了。
有關單鏈抗體ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3、ScFv2-4、ScFv3-1、ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4的說明就像上述ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4說明的那樣。
即使單鏈抗體也有可能雙特異性化和多特異性化。例如可以通過將多個抗原識別部位組合的H鏈和L鏈反覆排列在一條肽鏈內使其生產。而在生產、純化後進行連接也是可能的。不通過H鏈和L鏈的組合，只利用H鏈或L鏈也可以。這樣構成的抗體種類的選擇可以根據使用用途進行，可以通過結合強度、抗原結合部位進行選擇。
另外本發明還提供含有上述抗體或具有與這些抗體同樣功能的所謂本發明規定的抑制E2/NS1與有HCV感染性細胞、表達CD81的細胞或CD81的結合的物質作為有效成分的藥物，例如上述物質與藥學上容許成分組成的載體構成的藥物組合物。特別是本發明中的抗E2/NS1抗體基因使抗E2/NS1抗體效率生產成為可能，可提供各種形式的治療用製劑。這樣生產的重組抗體可以與例如為了在將藥學上容許的成分組成的載體或穩定劑等用於人體時使該抗體保持活性而使用的物質一起包含在藥物組合物中。作為這樣的載體和穩定劑如人血清清蛋白、明膠等。所謂藥學上容許意味著不會發生噁心、目眩、嘔吐等副作用，以及不會發生對多次使用的製劑的免疫應答等。另外使諸如毒素等物質與本發明抗體結合的抗體也可以作為藥物使用。而與醫藥上容許的適當的溶劑和稀釋劑、穩定劑一起溶解的液體藥物組合物也可以使用。另外除了上述藥物組合物之外以在生物體內調節濃度為目的微粒體、脂質體進行非口服(注射)用藥時，抗體和單鏈抗體為1μg～50mg/體重kg比較合適，但不限於該範圍。
上面以抗體作為代表例子進行敘述，而在本發明中作為抑制E2/NS1與HCV感染性細胞、表達CD81的細胞或CD81結合的物質除了抗體之外，抗體以外的蛋白質、硫酸化多糖類或低分子化合物只要不損失本發明的活性也可以使用。
作為抗體以外的蛋白質如乳鐵蛋白等，作為藥物組合物的製備和投藥方法可以按照上述抗體的情況進行。
另外本發明中提到的硫酸化多糖類指的是如分子量從平均分子量5000Da到1000000Da範圍的肝素、硫酸乙醯肝素、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C、硫酸皮膚素、硫酸角質素1和硫酸角質素2等葡萄糖胺聚糖類和硫酸葡聚糖等，理想的是5000Da到30000Da左右大小的肝素。投藥方法有諸如將10000到30000單位用5％葡萄糖液、生理鹽水、複方生理鹽水稀釋後進行靜脈點滴；每隔4至8小時一次靜脈注射5000到10000單位，但採用注射開始3小時後每隔2到4小時進行間歇靜脈注射法；以及濃製劑初次15O00到20000單位，然後繼續維持每天2次，每次10000到15000單位經皮下/肌肉注射注射法，但並不限定於這些方法。
本發明提到的低分子化合物是如下面的實施例例舉的蘇拉明等，但只要是抑制HCV的E2/NS1和HCV感染的物質即可，並不限定於蘇拉明。
該低分子化合物的結合部位要考慮到各種各樣的場所，如果是結合在上述肝素結合的地方的物質，最好是附加了硫酸基的化合物。
將這裡舉出的抗體等蛋白質、硫酸化多糖類、低分子化合物作為藥物使用時，不必單獨使用，就各個物質來說按照本說明書給出範圍內的量也可以多個物質同時投藥。
另外如果是上述單鏈抗體的情況，用於C型肝炎病毒診斷比較合適。
還有，本發明涉及到在被檢驗物質存在或不存在情況下對HCV有感染性的細胞和表達HCV蛋白的細胞的結合進行測定，通過包括與在沒有被檢驗物質存在情況下結合進行比較的工序在內篩選方法得到的抑制C型肝炎病毒生活環境的物質，以及通過包括在被檢驗物質存在或不存在情況下在對HCV有感染性的細胞和表達HCV蛋白的細胞結合後，對被檢驗物質和對HCV有感染性的細胞和表達HCV蛋白的細胞的融合進行測定，通過包括與沒有被檢驗物質存在情況下的融合進行比較的工序在內的篩選方法得到的抑制C型肝炎病毒生活環境的物質。這裡提到的C型肝炎病毒生活環境的物質的例子有C型肝炎病毒感染和增殖等。
在Takikawa等人文獻(Takikawa et al，J.Virol.，74，5066-5074，2000)中記載了有關可對HCV感染性細胞(HepG2)和表達HCV蛋白的CHO細胞的結合和融合進行測定的分析系統和使用該系統分析的HCV感染機制。
通過本發明得到的抗體是最初得到的可以競爭性地中和該分析系統的物質。
細胞融合分析系統是在通過HTLV-1等測定病毒的細胞融合活性中使用的系統。本發明的分析系統由於是模擬表示HCV的細胞融合系統，所以希望抑制本分析系統的物質具有阻止HCV感染、特別是抑制與細胞的結合和脫核的效果。
1.E2的表達(E2tag表達載體的構建)使用由HCV J1克隆基因(Genbank登錄號D89815)內E2/NS1的HCV基因組中的第384位胺基酸到711位構成的部分100ng，作為PCR擴增用引物在5』側使用含有促進在動物細胞中分泌的信號肽序列的PCR引物基因(5』CCC AAG CTT ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTGCTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG GCT ACC CAT ACC CGC GTG ACG GGG GGGGTG CAA GG 3』；序列號30)，基因3』側使用含有Etag序列的PCR引物(5』CCC CCT CGA GTC TAG ATT AAC GCG GTT CCA GCG GAT CCG GAT ACGGCA CCG GCG CAC CGG AGA CGA CCG CCG ACC CTA TAC C 3』；序列號31)，通過PCR反應對DNA(tPA信號肽+E2(384-711)+tag)片段進行擴增。使用Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler，聚合酶使用KOD(從東洋紡公司購入，反應條件按照說明書進行)進行PCR反應。然後，目的DNA片段使用5％丙烯醯胺凝膠電泳法按照Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor記載的方法進行純化。對純化的1μl DNA片段使用1單位的HIndIII和Xba I在50μl的系M(10mMTris-HCl，50mM NaCl，2mM MgCl2)中於37℃反應2小時，進行酶切，然後通過70℃的10分鐘的熱處理，使酶失活。同時對動物細胞用表達載體pCDNA 3.1(+)(從Invitrogen公司購入)1μg使用1單位的HindIII和XbaI在50μl的系M(10mMTris-HCl，50mMNaCl，2mM MgCl2)中於37℃反應2小時，進行酶切，然後通過70℃的10分鐘的熱處理，使酶失活，添加與酶液等量的苯酚、氯仿和異丙醇(以25∶24∶1比例混合)的混合液，進行離心，只回收水相(今後該操作稱為苯酚氯仿萃取)。然後使1/10體積的3M醋酸鈉和2.5倍體積的乙醇與回收的水相混合，於-20℃下過夜，或者是於-80℃下靜置15分鐘，然後離心回收DNA片段。再加入70％的乙醇之後，進行潷析、真空乾燥(今後將這些加乙醇，回收DNA片段等一系列操作稱之為乙醇沉澱)後，將回收的DNA片段溶解在5μl的滅菌水中。使用連接酶試劑盒使(從寶酒造購入，反應按說明書進行)該純化的DNA片段之間連接，轉化大腸桿菌JM109(從寶酒造購入，反應按照說明書進行)，得到目的E2tag表達質粒pE2tag。(E2tag在動物細胞中的表達)帶有質粒pE2tag的大腸桿菌於擋板燒瓶培養過夜。通過於8,000rpm下離心10分鐘回收菌體，使用QIAGEN Plasmid Midi kit(從QIAGEN公司購入)根據說明書純化質粒。
使用脂質轉染試劑(從LIFETECH公司購入)，根據說明書用純化的質粒轉染於添加了5％FBS的EX-CELL302(從JRH購入)培養的CHODG44株。CHO DG44於5％CO2、37℃下進行培養。轉化2天後，細胞用0.25％的胰蛋白酶溶解之後，將細胞接種到添加了400μg/ml G418的EX-CELL302中。2周左右使用G418添加培養基進行培養基交換，確認有菌落出現。
得到的細胞表達E2tag的確認是通過Western blotting操作確認的。蛋白質印跡法是根據從Pharmacia公司購入的Anti-E TagAntibody的說明書進行的。在檢測抗體時使用了HRP結合山羊抗鼠IgG抗體。發光反應使用ECL蛋白質印跡檢測試劑(從Pharmaciabiotech購入)，根據說明書通過使X線光片感光進行的。將得到的多個克隆中表達更高的細胞用於以後的實驗。(E2tag的純化)
為了獲得需要量的上清將用上述方法得到的E2tag於EX-CELL302中進行培養。細胞對數增殖期結束時通過離心除去細胞，回收上清。上清再用0.45μm膜除去混入物。這樣獲得的上清使用RPASPurification Module(從Pharmacia公司購入)進行親和層析純化。純化根據RPAS Purification Module附帶的說明書進行。由於E2tag是在RPAS Purification Module附帶的洗脫緩衝液中得到的，所以置換為PBS。具體來說，向Centricon 30(從Amicon公司購入)的膜上部添加含有上述E2tag的各個洗脫級分，於5000rpm下進行離心直至其中含有的緩衝液量達到100μl以下為止。然後再添加2mL左右PBS進行同樣的離心操作。該操作重複進行4次以上，回收溶解在PBS中的E2tag。2.NOB分析系統的構建(CD81表達載體的構建)為了獲得人CD81基因(Genbank登錄號M33680)的全長DNA，使用RT-PCR kit ver2.1(TAKARA公司)，根據附帶的資料使用隨機引物從Hela細胞純化的1μg mRNA合成cDNA。然後根據該試劑盒附帶的資料，作為PCR擴增用引物5』端設計為GCGCCGCCATGGGAGTGGAGGGCTGC(序列號32)，3』端設計為CTCAGTACACGGAGCTGTTCCGGA(序列33)，進行PCR反應。PCR產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAEXII Gel Extraction Kit(從QIAGEN公司購入)，根據附帶的說明書純化目的帶。然後再使用TOPO TACloning KIT with TOP10F』cells(從Invitrogen公司購入)，根據附帶的說明書使pCR2.1-TOPO與上述目的CD81片段結合併轉染大腸桿菌，得到目的pCRhCD81。使用1單位的EcoRI在50μl的系H(10mMTris-HCl，100mM NaCl，2mM MgCl2)於37℃下反應2小時，對pCRhCD81 11μg進行酶切，通過於70℃下進行10分鐘熱處理，使酶失活後，使用QIAEXII Gel Extraction Kit(從QIAGEN公司購入)，根據附帶說明書純化含有CD81基因的片段。pCDNA3.1(+)也利用另外同樣的系統進行EcoRI處理，使酶失活後，加入1μl的細菌鹼性磷酸酶(從TOYOBO公司購入)，於65℃下溫育1小時。然後經酚氯仿萃取和乙醇沉澱純化後，將分別回收的DNA片段溶解在5μl滅菌水中。再將兩個片段用連接酶試劑盒(從寶酒造購入，反應根據說明書進行)進行連接，轉染大腸桿菌JM109(從寶酒造購入，反應根據說明書進行)，得到所期望的CD81表達質粒pCDNA 3.1(+)/CD81。(CD81表達細胞構建)帶有質粒pCDNA3.1(+)/CD81的大腸桿菌於50mL擋板燒瓶培養過夜。通過於8,000rpm下離心回收菌體，使用QIAGEN Plamid Midikit(從QIAGEN公司購入)，根據說明書純化質粒。
用純化的質粒使用轉染試劑(從LIFETECH公司購入)根據說明書轉染10％FBS的Dulbeccos Modified Eagle’s Medium(DMEM)培養的NI H3T3株。NIH3T3以下都於5％CO2、37℃下進行培養。轉染2天後，細胞用0.25％的胰蛋白酶溶解之後，將細胞接種到添加了10％FBS和800μg/mL G418的DMEM中。2周左右使用G418添加培養基進行培養基交換，確認有菌落出現。
CD81在得到的細胞株中表達的確認通過以下操作進行。將得到的細胞株用選擇培養基在6孔板中培養至鋪滿。細胞用PBS/0.05％EDTA洗一次後，用PBS/0.05％EDTA溶解後，懸浮於含有0.1％BSA和0.1％疊氮化物的20μl PBS(以下稱為FACS緩衝液)，加入抗CD81抗體(從Pharmacia購入)(終濃度為0.025mg/mL)，混合後，於冰上溫育1小時。加200μl FACS緩衝液後，於3000rpm離心，回收細胞，上述操作反覆進行2次。將回收的細胞懸浮於30μl的FACS緩衝液，加入FITC標記羊抗鼠Igs抗體(從カペル公司購入)使終濃度為0.05mg/mL，混合後，避光之後於冰上溫育1小時。加入200μl FACS緩衝液後，於3000rpm下離心，回收細胞，上述操作反覆進行2次後，將細胞懸浮於200μl FACS緩衝液之後，通過FACScan(BectonDickinson公司)測定細胞的螢光量，選擇螢光量高的細胞，命名為NIH3T3/CD81。(E2tag與Molt-4或NIH3T3/CD81結合的確認)將Molt-4(理研RCB No.0206)或NIH3T3/CD81的終濃度定為5×106cell/mL，E2tag最終濃度為50μg/mL以下，搖動混合，於含有1％FBS的RPMI 1640中用20μl的繫於冰上溫育1小時。加入含有5％FBS的PBS 200μl，用3000rpm進行離心，回收細胞，上述操作反覆進行2次。用含有1％FBS的RPMI 1640將抗Etag抗體稀釋到10μg/mL，向各個樣品中加入10μl稀釋液，混合後於冰上溫育1小時。加入含5％FBS的PBS 200μl、在3000rpm下離心回收細胞，操作重複2次。用含有5％FBS的PBS稀釋FITC標記山羊抗鼠Igs(從カペル公司購入)，使其終濃度變為25μg/mL，將該稀釋液10μl加入到各個樣品中。混合後於冰上溫育1小時。加200μL含有5％FBS的PBS，於3000rpm離心，回收細胞，上述操作反覆進行2次。將樣品懸浮於200μL含有5％FBS的PBS後通過FACScan(Becton Dickinson公司)測定細胞的螢光量變化，對E2tag與Molt-4或NIH3T3/CD81的結合進行確認。(抑制E2tag與Molt-4或NIH3T3/CD81結合的物質的確認)將E2tag用含有1％FBS的RPMI 1640稀釋，稀釋後最終濃度為50μg/mL，該稀釋液和用含有1％FBS的RPMI 1640稀釋的濃度範圍為0.125μg/mL～12.5μg/mL的ScFv(通過本說明書中以下記載的篩選方法得到的抗體)、4μg/mL～400μg/mL的肝素(sigma公司生產、H3393)、50μg/mL～5000g/mL的蘇拉明(sigma公司生產、S2671)溶液各10μl混合，於37℃下溫育30分鐘。將Molt-4或NIH3T3/CD81懸浮於含有1％FBS的RPMI 1640中的溶液10μl混合(終濃度為1×107cell/mL)，於冰上溫育1小時。加200μl含5％FBS的PBS，於3000rpm離心，回收細胞，上述操作反覆進行2次。用含有1％FBS的RPMI 1640將抗Etag抗體稀釋到10μg/mL，向各個樣品中加入10μl稀釋液，混合後於冰上溫育1小時。加200μl含有5％FBS的PBS，於3000rpm離心，回收細胞，上述操作反覆進行2次。用含有5％FBS的PBS稀釋FITC標記抗鼠Igs(從カペル公司購入)，使其終濃度變為25μg/mL，將該稀釋液10μl加入到各個樣品中。混合後於冰上溫育1小時。加200μL含有5％FBS的PBS，於3000rpm離心，回收細胞，上述操作反覆進行2次。將樣品懸浮於200μl含有5％FBS的PBS後通過FACScan(Belton Dickinson公司)測定細胞的螢光量變化，確認E2tag與Molt-4或NIH3T3/CD81的結合可以被添加的患者血清或抗體抑制。
結果如

圖1至3所示。圖1表示上述胺基酸序列代表的抗體的中和活性。圖1中ScFv1-1和ScFv1-4對應於上述的胺基酸序列表示的抗體，對照表示識別VLA4的單鏈抗體。圖2是表示使用肝素時的中和活性，圖3表示使用蘇拉明時的中和活性圖。3.抗體文庫的製作(來自HCV治癒患者的mRNA的純化)從HCV治癒患者進行肝素採血，獲得血液40mL，該HCV治癒患者血清中含有具有阻止E2tag與Molt-4或表達NIH3T3/CD81細胞的結合能力的抗體。為了分離末梢血淋巴細胞，利用比重離心法(Ficoll-PaquePharmacia)獲得4×107淋巴細胞。使用MACS(第一化學藥品，Miltenyi Biotec GmbH公司生產)利用抗CD19抗體進行B細胞純化，獲得2.8×106細胞。為了確認純化細胞中的B細胞的純度，對用抗CD19抗體純化的細胞進行染色，通過流式細胞儀確認純度在95％以上。使用該純化的B細胞，在人IL-2(Genzym)200uni t/mL、人IL-10(Genzym)10ng/mL、E2/NS1抗原1ng/mL、抗人CD40抗體(Genzym)1μg/mL的刺激下，於5×105B細胞/mL 10％FCSRPMI的條件下培養72小時。通過顯微鏡確認B細胞的活化，用PBS洗2次，使用RNAlater(Ambion公司)根據說明書進行操作，從B細胞中獲得mRNA並進行了純化。(抗體文庫的製作)抗體文庫的製作根據By-Passing Immunization HumanAntibodies from V-gene Libraties Displayed on Phage(Journalof Molecular Biology 1991 222582-597)記載的方法進行。使用RT-PCR kit ver2.1(TAKARA公司)，根據附帶的資料利用隨機引物從1μg純化的mRNA合成cDNA。然後根據試劑盒附帶的資料，以該cDNA為模板，通過PCR分別擴增抗體的H鏈、L鏈(λ鏈、κ鏈)。抗體基因克隆用引物和接頭使用根據上述論文製作的產物。PCR產物利用1％瓊脂糖凝膠進行電泳，切出抗體H鏈、L鏈的帶。使用QIAEX II Gelextraction kit(QIAGEN公司)，從切出的瓊脂糖凝膠萃取DNA。然後使相同摩爾數的H鏈、L鏈、接頭混合，使用連接用引物進行PCR。PCR是在50μl的體系中，使用1單位Tag polymerase(PerkinElmer公司)、於94℃下加熱5分鐘後，進行每循環為94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的30個循環，然後於72℃加熱5分鐘結束。PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，切出H鏈、L鏈、接頭連接成一條鏈的帶。使用QIAEX II Gel extraction kit(QIAGEN公司)，從切出的瓊脂糖凝膠萃取DNA。然後通過限制酶Sfi I和50μl的體系M(10mMTris-HCl，50mM NaCl，2mM MgCl2)於55℃下反應2小時進行酶切，經70℃下的10分鐘熱處理，使酶失活。進一步添加限制酶NotI50μl的體系從(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，2mM MgCl2)於37℃反應2小時進行酶切，經70℃的10分鐘處理使酶失活。對DNA依次通過酚氯仿萃取和乙醇沉澱進行純化，溶解在50μl的滅菌水中。使用TAKARA公司的連接酶試劑盒，根據說明書使純化的DNA片段100ng和50ng的pCantab5MycHis(pCantab5E(AmershamPharmacia)的Etag序列替換為Myc-Histag的載體)結合。對連接樣品依次通過酚氯仿萃取和乙醇沉澱進行純化，溶解在10μl的滅菌水。然後取出5μl樣品根據Molecular Cloning(1982)p249、Cold Spring Harbor Labs.進行轉化。獲得1×106菌落。將這些菌落作為單鏈抗體文庫備以後用。4.文庫噬菌體的篩選(噬菌體的製備)用2ml的2×TY液體培養基回收生長在平板上的大腸桿菌，取其中20μl加到2ml的2×TY液體培養基(含有100μg/mL氨苄西林和2％葡萄糖)。於37℃、200rpm下進行振蕩培養，培養至吸光度600nm值達到1.0為止。向該培養液中加入1×1011pfu/mL的輔助噬菌體M13K07，於37℃下靜置30分鐘。然後繼續於37℃、200rpm下進行振蕩培養。30分鐘後，將該溶液用3000rpm離心10分鐘，回收大腸桿菌。棄掉上清，沉澱懸浮於20ml的2×TY液體培養基(含有100μg/mL氨苄西林和50μg/mL卡那黴素)，於37℃、200rpm下振蕩培養過夜。第二天用15000rpm將培養液離心，使大腸桿菌沉澱，回收上清。該上清作為噬菌體溶液使用。(篩選操作)
將溶解在50mM NaHCO3(pH9.6)溶液中的10μg/mL的E2抗原1ml加到塑料管(Nunc MaxisorpTube)中，於4℃下放置過夜。第二天，棄掉抗原溶液，用PBS溶液5ml洗該試管，反覆洗3次。然後加入5ml的5％BSA，置於37℃下。2小時後，棄掉BSA溶液，用5ml的PBS溶液洗試管。然後將事先準備的噬菌體溶液250μl與5％BSA溶液750μl混合，加到試管中，置於37℃下。1小時後，棄掉加入的溶液，用PBST(0.1％)溶液5ml洗試管。上述操作重複20次。然後用5ml的PBS溶液洗試管，反覆操作20次。向該試管中加入1mL的100mM三乙基胺，於室溫下放置10分鐘。然後回收三乙基胺溶液，向該溶液中加入500μL的1M Tris-HCl(pH7.5)，充分混合。將該溶液750μl加到培養到吸光度600nm值達到0.6的10mL的大腸桿菌TG-1中，於37℃下放置30分鐘。然後於37℃、200rpm下進行振蕩培養。30分鐘後，用3000rpm對該溶液離心10分鐘，回收大腸桿菌。將該大腸桿菌鋪在2×TY平板培養基(含有100μg/L氨苄西林和2％葡萄糖)，於37℃下放置過夜。第二天，按照(噬菌體製備)記載的操作從平板上生長的大腸桿菌回收噬菌體，重複(篩選操作)記載的操作。反覆進行3次篩選操作。
其結果得到了含有序列表中序列號1～29記載的胺基酸序列的抗體ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4。
序列表中序列號1～3表示抗體ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的H鏈的CDR-1、CDR-2、和CDR-3的胺基酸序列。
序列表中序列號4～6表示抗體ScFv1-1的L鏈的CDR-1、CDR-2、和CDR-3的胺基酸序列。
序列表中序列號7～9表示抗體ScFv1-2的L鏈的CDR-1、CDR-2、和CDR-3的胺基酸序列。
序列表中序列號10～12表示抗體ScFv1-3的L鏈的CDR-1、CDR-2、和CDR-3的胺基酸序列。
序列表中序列號13～15表示抗體ScFv1-4的L鏈的CDR-1、CDR-2、和CDR-3的胺基酸序列。
序列表中序列號16表示抗體ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的H鏈的胺基酸序列。
序列表中序列號17～20分別表示抗體ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的L鏈的胺基酸序列。
序列表中序列號21表示抗體ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的H鏈的鹼基序列。
序列表中序列號22～25分別表示抗體ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的L鏈的鹼基序列。
序列表中序列號26～29分別表示抗體ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的L鏈的鹼基序列和胺基酸序列。
另外也可得到H鏈胺基酸序列為序列表中序列號34記載的胺基酸序列的抗體ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3和ScFv2-4。
序列表中序列號34表示抗體ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3和ScFv2-4的H鏈的胺基酸序列。
序列表中序列號35表示抗體ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3和ScFv2-4的H鏈的鹼基序列。
序列表中序列號36～39分別表示抗體ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3和ScFv2-4的鹼基序列和胺基酸序列。5.關於ScFv的改造(抗體文庫的製作)抗體文庫的製作利用與上述抗體文庫製作一項同樣的手法進行。
首先製作將PCantab5scFv3-1MycHis(將實施例給出的ScFv1-1基因插入到PCantab5MycHis的Sfi I site和Not I site之間，L鏈的5′末端配置Alw44 I、3′末端配置Not I位點)的L鏈部分替換成對HCV抗原沒有反應性的L鏈的載體。該載體稱之為PCantab5scFv3-1/L-/MycHis。
使用RT-PCR kit ver2.1(TAKARA公司)，根據附帶的資料利用隨機引物從1μg純化的mRNA合成cDNA。然後根據試劑盒附帶的資料，以該cDNA為模板，通過PCR分別擴增抗體的L鏈(λ鏈、κ鏈)。抗體基因克隆用引物使用根據上述論文製作的產物。PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，切出抗體H鏈、L鏈的帶。使用QIAEX II Gelextraction kit(QIAGEN公司)，從切出的瓊脂糖凝膠萃取DNA。
然後通過限制酶Alw44 I和50μl的體系M(10mMTris-HCl，50mMNaCl，2mM MgCl2)於37℃下反應2小時進行酶切，經70℃下的10分鐘熱處理，使酶失活。然後再加入Not I於100μl的體系H(10mMTris-HCl，50mM NaCl，2mM MgCl2)，於37℃下反應2小時進行酶切，經70℃下的10分鐘熱處理，使酶失活。對DNA依次通過酚氯仿萃取和乙醇沉澱進行純化，溶解在50μl的滅菌水。使用TAKARA公司的連接酶試劑盒，根據說明書使純化的DNA片段100ng與同樣經Alw44I和Not I處理的50ng的pCantab5scFv3-1/L-/MycHis結合。對連接樣品依次通過酚氯仿萃取和乙醇沉澱進行純化，溶解在10μl的滅菌水。然後取出5μl樣品根據Molecular Cloning(1982)p249、ColdSpring Harbor Labs.進行轉化。獲得1×106菌落。將這些菌落作為單鏈抗體文庫備以後用。(文庫噬菌體的篩選)噬菌體的製備、篩選操作都與上述操作一樣。
其結果得到了含有序列表中序列號42～65記載的胺基酸序列的抗體ScFv3-1、ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4。
序列表中序列號42～44表示抗體ScFv3-1的L鏈的CDR-1、CDR-2、和CDR-3的胺基酸序列。
序列表中序列號45～47表示抗體ScFv3-2的L鏈的CDR-1、CDR-2、和CDR-3的胺基酸序列。
序列表中序列號48～50表示抗體ScFv3-3的L鏈的CDR-1、CDR-2、和CDR-3的胺基酸序列。
序列表中序列號51～53表示抗體ScFv3-4的L鏈的CDR-1、CDR-2、和CDR-3的胺基酸序列。
序列表中序列號54～57分別表示抗體ScFv3-1、ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4的L鏈的胺基酸序列。
序列表中序列號58～61分別表示抗體ScFv3-1、ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4的L鏈的鹼基序列。
序列表中序列號62～65分別表示抗體ScFv3-1、ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4的鹼基序列和胺基酸序列。6.從篩選的噬菌體製備scFv將候補菌落接種於100ml的2×TY液體培養基(含有100μg/L氨苄西林和2％葡萄糖)，於30℃、200rpm下振蕩培養過夜。翌日，將上述培養液加到900ml的2×TY液體培養基(含有100μg/mL氨苄西林和2％葡萄糖)中，於30℃、200rpm下振蕩培養1小時。加入1mL的1M IPTG(異丙基-β-硫-吡喃半乳糖)，再於同樣條件下培養5小時。培養液於8000rpm下離心10分鐘，使菌沉澱。棄掉上清，用50ml的50mM Tris-HCl(pH8)、20％蔗糖、1mM EDTA溶液將沉澱懸浮後，於冰中放置15分鐘。接著用10000rpm將懸浮液離心15分鐘，回收上清，上清中加入MgCl2，其終濃度為1mM。7.ScFv的純化上述從大腸桿菌得到的ScFv使用Ni-NTA瓊脂糖(從QIAGEN公司購入)根據說明書進行純化。加入30ml的A溶液(50mMNa-phosphate、300mM NaCl、pH7.4)洗1mL的Ni-NTA，攪拌後於1000rpm下離心2分鐘，棄掉上清。向該Ni-NTA瓊脂糖中加入上述上清。於4℃下攪拌45分鐘，使ScFv的His tag部位與Ni-NTA agarose結合。然後後於1000rpm下離心2分鐘，棄掉上清。加入30ml的A溶液洗Ni-NTA瓊脂糖，於1000rpm下離心2分鐘，棄掉上清。然後再用30mlB溶液(A溶液+10mM咪唑)按照同樣操作洗。然後懸浮於10ml B溶液，添加到poly-prep柱子(Bio-Rad公司)上。再添加10ml B溶液，洗Ni-NTA瓊脂糖。加入的洗液完全從柱子上流出後，用2ml的C溶液(A溶液+250mM咪唑)洗脫結合在Ni-NTA瓊脂糖上的ScFv。然後將洗脫出的溶液加入到用25ml的PBS(10mM phosphate、pH7.4、150mM NaCl)洗的PD10柱(AmershamPharmacia公司)上，用PBS溶液洗脫，改換緩衝液。測定各個洗脫級分的280nm的吸光度，將ScFv洗脫級分作為一個級分用於以後的實驗。8.ScFv的E2結合能力的確認將溶解於50mM NaHCO3(pH9.6)溶液的1μg/ml的E2tag 1mL加到FALCON的96孔板中，每孔50μl，於37℃下溫育1小時。同時向作為對照的孔中只加入同樣量的不含E2tag的緩衝液。通過傾倒棄掉各個孔的溶液後，向各個孔加入200μl的加有0.1％的Tween20的PBS，然後傾倒棄掉，反覆進行5次。除去各個孔的水分後，向每一個孔中加入200μl的含有5％BSA的PBS溶液，於37℃下溫育1小時。通過傾倒棄掉各個孔的溶液後，向各個孔加入200μl的加有0.1％的Tween20的PBS，然後傾倒棄掉，反覆進行5次。用含有0.1％BSA的PBS溶液稀釋分別從加有E2tag的孔和沒加E2tag的孔得到的scFv，稀釋到終濃度至10μg/ml以下，然後向每個孔中加入稀釋後溶液50μl，於37℃下溫育1小時。通過傾倒棄掉各個孔的溶液後，向各個孔加入200μl的加有0.1％的Tween20的PBS，然後傾倒棄掉，反覆進行5次。除去各個孔的水分後，抗myc-tag抗體(Santa CruzBiotechnology公司購入)用含有0.1％BSA的PBS溶液稀釋(終濃度為10μg/ml)，然後向每個孔中加入稀釋後溶液50μl，於37℃下溫育1小時。通過傾倒棄掉各個孔的溶液後，向各個孔加入200μl的加有0.1％Tween20的PBS，然後傾倒棄掉，反覆進行5次。HRP標記抗鼠Igs用含有0.1％BSA的PBS溶液稀釋(終濃度為1μg/mL)，然後向每個孔中加入稀釋後溶液50μl，於室溫下溫育1小時。通過傾倒棄掉各個孔的溶液後，向各個孔加入200μl的加有0.1％的Tween20的PBS，然後傾倒棄掉，反覆進行5次。向各個孔中各加入100μl的於25ml OPD緩衝液中加有鄰苯二胺10mg、30％過氧化氫12.5μl的溶液，於室溫溫育直至充分發色，然後加4N硫酸100μl終止反應，通過測定490nm的吸光度，確認scFv與E2tag的結合。9.抗體表達載體的構建通過PCR對含有pRC/CMV(從In Vitrogen公司購入)的CMV啟動子的區域、多克隆位點、polyA信號肽序列區(同一公司基因圖譜209-1250鹼基區)進行擴增。使用的引物序列5′端為5′CCC TGA TCA GAA TTC GCA GGA TCC CTC GAG ACT AGT GATGAT CGG GCC AGA TAT ACG CG 3′(序列號66)、3′端為5′CCC TGA TCA AGA TCT GCT AGC GTC GAC TCC CCA GCA TGC CTGCTG CTA TTG 3′(序列號67)，利用Applied Biosystems Model 394合成後，根據常規方法製備。使用Perkin Elmer Cetus DNA thermalCycler，聚合酶使用KOD(從東洋紡公司購入，反應條件根據說明書)，進行PCR反應。然後所希望的約1.0Kbp DNA片段通過5％聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，根據Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold SpringHarvor記載的方法進行純化。用1單位的Bcl I在50μl的體系H中對1μg純化的DNA片段於37℃下進行2小時酶切。另外用1單位的BamH I在50μl的體系H中對ppUC119(從寶酒造公司購入)DNA 1μg於37℃下進行2小時酶切。使用連接酶試劑盒(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)對酶切得到的DNA片段和質粒進行連接，轉染大腸桿菌JM109(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)，得到所希望的表達質粒pKS1。
用1單位SpeI 1在50μl的體系M中對上面得到的pKS1於37℃下進行2小時酶切。
pcDNA3.1/Hygro(+)(從In Vitrogen公司購入)，通過PCR對loxP-Hygromicin融合基因進行擴增。使用的引物序列5′端為Hyg-stopccccagatctctattcctttgccctcggacgag(序列號68)，3′端為Hy-atgccccaagcttatgaaaaagcctgaactcaccgcg 3』(序列號69)，委託SciMedia公司合成的。使用Perkin Elmer Cetus DNA thermalCycler，聚合酶使用KOD(從東洋紡公司購入，反應條件根據說明書)，進行PCR反應。然後所希望的片段通過5％聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，根據Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor記載的方法進行純化。用1單位的NheI和NaeI在50μl的體系M中對約1μg純化的DNA片段於37℃下進行2小時酶切。
使用pNeo.gal(從Stratagene公司購入)，通過PCR擴增含有TK(A)n的DNA。使用的引物序列5′端cccgccggctgggtgtggcggaccgc3』(序列號70)，3′端5』cccctctagaaagtataggaacttcaagc 3』(序列號71)，利用Applied Biosystems Model 394合成後，根據常規方法製備。使用Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler，聚合酶使用KOD(從東洋紡公司購入，反應條件根據說明書)，進行PCR反應。然後所希望DNA片段通過5％聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，根據Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor記載的方法進行純化。用1單位的Xba I和Nae I在50μl的體系M中對約1μg純化的DNA片段於37℃下進行2小時酶切。
使用連接酶試劑盒(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)對酶切得到的質粒與loxP-HygromicinDNA片段和Tk(A)nDNA片段進行連接，轉染大腸桿菌JM109(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)，得到所希望的表達質粒pEX loxP-Hyg。
使用pEX1-3-1W(特願2000-172684)，通過PCR擴增含有重鏈恆定區的DNA片段。使用的引物序列5′端5』ccccaagcttctcgagactagtaccaagggcccatcggtcttccc3』(序列號72)，3′端5』ccccgggccctctagtagctttcatttacccggagacaggg3』(序列號73)，委託サイメデイア公司合成的。使用Perkin Elmer Cetus DNA thermal Cycler，聚合酶使用KOD(從東洋紡公司購入，反應條件根據說明書)，進行PCR反應。然後所希望DNA片段通過5％聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，根據Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor記載的方法進行純化。用1單位的Hind III和ApaI在50μl的體系M中對1μg純化的DNA片段於37℃下進行2小時酶切。
用1單位的Hind III和Apa I在50μl的體系M中對1μg pEXloxP-Hyg DNA於37℃下進行2小時酶切。
使用連接酶試劑盒(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)對酶切得到的質粒與含有重鏈恆定區的DNA片段進行連接，轉染大腸桿菌JM109(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)，得到所希望的表達質粒pEX gammal loxP-Hyg。
使用ScFv1-1，通過PCR擴增含有重鏈可變區的DNA片段。使用的引物序列為HB1-N5』cccaagcttcaccATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCtggtgcagtctg3』(序列號74)，HB1-C5』cecgctagcACTCGAGACGGTGACCAGGGTGCC3』(序列號75)，委託サイメデイア公司合成的。使用Perkin Elmer Cetus DNA thermal Cycler，聚合酶使用KOD(從東洋紡公司購入，反應條件根據說明書)，進行PCR反應。然後所希望DNA片段通過5％聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，根據Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor記載的方法進行純化。用1單位的Hind III和Nhe I在50μl的體系M中對約1μg純化的DNA片段於37℃下進行2小時酶切。
用1單位的Hind III和SpeI 1在50μl的體系M中對1μg pEXgammal loxP-Hyg DNA於37℃下進行2小時酶切。
使用連接酶試劑盒(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)對酶切得到的質粒與含有重鏈可變區的DNA片段進行連接，轉化大腸桿菌JM109(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)，得到所希望的表達質粒pEX gammal loxP-Hyg HCVI(圖7)。
使用pEGFPN2(從Clonetech公司購入)，通過PCR擴增含有卡那黴素抗性基因的DNA片段。使用的引物序列為H鏈5′端為5′ccccagagctagtcctgcaggcggggaaatgtgcgcggaacccct3′(序列號76)，3′端為5′ccccgctagcctgcaagtcatttcgaaccccagcgtccc3′(序列號77)，委託サイメデイア公司合成。使用Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler，聚合酶使用KOD(從東洋紡公司購入，反應條件根據說明書)，進行PCR反應。然後所希望DNA片段通過5％聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，根據Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor記載的方法進行純化。用1單位的SpeI和NheI在50μl的體系M中對約1μg純化的DNA片段於37℃下進行2小時酶切。
用1單位的Nhe I在50μl的體系M中對1μg pSK1 DNA於37℃下進行2小時酶切。
使用連接酶試劑盒(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)對酶切得到的質粒與含有卡那黴素抗性基因的DNA片段進行連接，轉化大腸桿菌JM109(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)，得到所希望的表達質粒pEX-1Km、Amp。
用1單位的Dra I，Sca I在50μl的體系H中對1μg pEX-1Km、Amp1 DNA於37℃下進行2小時酶切。
使用連接酶試劑盒(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)連接酶切得到的質粒，轉化大腸桿菌JM109(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)，得到所希望的表達質粒pEX-1Km。
使用pCZOK(T，Shibui等人Appl MicrobiolBiotechnol(1993)38，770-775記載)，通過PCR擴增含有輕鏈恆定區的DNA片段。使用的引物序列為H鏈5′端為5』ccccaagcttctagagtcgacggtaccgtggaaatcaaacgaactgtgg3』(序列號78)，3′端為5』ccccgggccctctagcggccgcctaacactctcccctgttgaagc3』(序列號79)，委託サイメデイア公司合成。使用Perkin Elmer Cetus DNA ThermalCycler，聚合酶使用KOD(從東洋紡公司購入，反應條件根據說明書)，進行PCR反應。然後所希望的DNA片段通過5％聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，根據Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor記載的方法進行純化。用1單位的Hind III和Apa I在50μl的體系M中對1μg純化的DNA片段於37℃下進行2小時酶切。
用1單位的Hind III和Apa I在50μl的體系M中對1μg pEX-1Km DNA於37℃下進行2小時酶切。
使用連接酶試劑盒(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)對酶切得到的質粒與含有輕鏈恆定區的DNA片段進行連接，轉化大腸桿菌JM109(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)，得到所希望的表達質粒pEXkappa Km。
使用scFv1-1，通過PCR擴增含有輕鏈可變區的DNA片段。使用的引物序列為LK1-N5』cccaagcttcaccATGGCGTTGGAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGgacatccagatgacccagtctcc3』(序列號80)，LK1-C5』CcccgtacgTTTGATTTCCACCTTGGTCCCCCCG3』(序列號81)，委託サイメデイア公司合成。使用Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler，聚合酶使用KOD(從東洋紡公司購入，反應條件根據說明書)，進行PCR反應。然後所希望DNA片段通過5％聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，根據Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor記載的方法進行純化。用1單位的Hind III和BsiWI在50μl的體系M中對1μg純化的DNA片段於37℃下進行2小時反應後，在50℃反應2小時後酶切。
用1單位的Hind III和Asp187 I在50μl的體系M中對1μg pEXkappa Km DNA於37℃下進行2小時酶切。
使用連接酶試劑盒(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)對酶切得到的質粒與含有重鏈可變區的DNA片段進行連接，轉化大腸桿菌JM109(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)，得到所希望的表達質粒pEX kappa Km HCVI。(圖8)用1單位的Spe I，Nhe I在50μl的體系M中對1μg pEX kappa KmHCV1 DNA於37℃下進行2小時酶切。
用1單位的NheI在50μl的體系M中對1μg pEX gammalloxP-Hyg HCVI DNA片段於37℃下進行2小時酶切。
使用連接酶試劑盒(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)對酶切得到的質粒進行連接，轉化大腸桿菌JM109(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)，得到所希望的表達質粒pEX loxp-Hyg HCVIW Km。
用1單位的Sse8387在50μl的體系M中對1μg pEX loxp-HygHCVI W Km1 DNA片段於37℃下進行2小時酶切。
使用連接酶試劑盒(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)對酶切得到的質粒進行連接，轉化大腸桿菌JM109(從寶酒造公司購入，反應按照說明書進行)，得到所希望的表達質粒pEX loxp-Hyg HCV1W(圖9)。
10.抗體基因向高表達部位檢索株的位點特異導入使用Mkamp 1株(特願2000-172684記載的菌株)根據說明書對pBS185(位點特異的重組酶表達質粒，從Lifetech公司購入)、pEXloxP-Hyg HCV1 W進行轉染(每200萬個細胞使用1.0μg的DNA)。用含有5％FBS(胎牛血清從Lifet ech公司購入)的CHO-S-SFM-II培養基(從Lifetech公司購入)，於37℃、5％CO2條件下培養48小時後，再用加有200mg/L的潮黴素(從SIGMA公司購入)的同一培養基於37℃、5％CO2條件下培養25日，選擇新黴素抗性菌落(MkampHCV1株)。
11.利用ELISA assay測定抗體產率將抗人免疫球蛋白山羊抗體(從Zymed公司購入)溶液(用溶液1稀釋到10μg/ml)加到96孔板中，每孔50μl，於37℃下處理2小時。然後將孔中的溶液倒掉，向各個孔中加入250μl的溶液2，於4℃下保溫16小時以上。除去溶液後，用溶液3洗各個孔，洗5次，向各孔中加入用溶液4稀釋的抗體(標準)或樣品溶液(用溶液4對培養上清任意稀釋後的溶液)，每孔50μl，於37℃下保溫2小時。除去溶液後，用溶液3洗5次，然後加入溶液5，每孔50μl，於20℃下保溫40分鐘。除去溶液後，用PBS洗5次，然後加入溶液9，每孔100μl，於室溫下避光反應約5分鐘。然後加入等量的10％硫酸終止反應後，利用Immuno Reader(Inter Med公司製造，Immuno Reader NJ-2000)測定各個孔在11＝490nm以及12＝650nm的吸光度A1和A2，求(A1-A2)。利用稀釋標準液製作測量曲線，測定樣品中的1-3-1抗體(作標準使用的)的濃度。各溶液組成如下。
溶液1含有0.1％疊氮化鈉的PBS溶液2含有1％BSA、0.1％疊氮化鈉的PBS溶液3含有0.05％Tween20的PBS溶液4含有1％BSA的PBS溶液5HRP標記抗人免疫球蛋白山羊抗體(從Zymed公司購入)原液2μl溶解在10ml溶液4中後的溶液(用時製備)溶液6取磷酸一氫鈉14.2g，加水配成500ml溶液7取帶1個水合物的檸檬酸10.5 g，加水配成500ml溶液8向257ml溶液5中加入243ml溶液6，加水配成1000ml溶液9取鄰苯二胺(從和光純藥購入)4.0mg，10ml溶液7和30％(v/v)過氧化氫5μl，進行溶解的溶液(製備後10分鐘以內使用)12.向Mkamp株位點特異導入了抗體表達基因後的菌株的抗體生產率通過上述ELISA法確認以下的生產量。
親本株名 抗體基因導入株螢光潮黴素抗性 抗體生產率Mkamp 1 無 有抗性 10mg/l13.重組whole抗體的特性利用與測定單鏈抗體對抗原的親和性、中和活性時同樣的方法測定得到的純化重組whole抗體的值。
Kd＝2×10-9中和活性 IC50＝25mg/l得到的重組whole抗體稱之為whole抗體1-1，其重鏈和輕鏈的胺基酸序列以及鹼基序列分別表示在序列表中序列號40和41中。
14.細胞融合分析細胞融合分析根據Takikawa等人的方法(Takikawa etal.，J.Virol.，74，5066-5074.2000)。將在細胞表面表達重組E1和E2蛋白的CHO細胞(Matsuura et al.，unpublished)接種到包被了膠原的96孔板的各個孔中，每孔2萬個，於5％CO2、37℃條件下進行培養。準備細胞時，不使用胰蛋白酶，在添加了10mM EDTA的磷酸緩衝食鹽水(PBS)中浸5分鐘之後，振蕩燒瓶使細胞儘可能地分散，用吸管輕輕地吸、排，進行剝落。培養24小時後，細胞用200μL的OptiMEM(Gibco BRL)洗2次，使用Trans IT-LT1(Mirus)將在T7啟動子的下遊整合了螢火蟲螢光素酶基因的報告質粒pT7EMCLuc(Aokiet al.，Virology，250，140-150，1998)和為使基因導入效率標準化在CMV啟動子的下遊整合了海椎茸的螢光素酶基因的pRL-CMV(Promega)導入細胞。每一個板都按以下組成準備，靜置15分鐘，每孔加入30μl。2小時後各添加150μl的添加了10％血清的D-MEM(Gibco)，繼續培養。
Opti-MEM 3mlTrans IT-LT1 50μlpT7EMCLuc9μgpRL-CMV 0.6μg作為細胞融合反應的容納細胞使用來自人肝細胞癌的HepG2細胞。將HepG2細胞接種到6孔板中的各個孔，每孔80×105個細胞，於5％CO2、37℃條件下進行培養。培養24小時後，將表達T7 RNA聚合酶的質粒pCAGT7pol(Ishii et al.，unpublished)以下列組成導入細胞，2小時後，添加1.5ml的加有10％血清的D-MEM。培養24～36小時後，用胰蛋白酶使細胞剝落，懸浮於25～30ml的加有10％血清的D-MEM後，轉移至50ml的離心管中，於5％CO2、37℃條件下，放置在振蕩機上浮遊培養過夜。
Opti-MEM 100μlTrans IT-LT11 5μlpCAGT7pol 1μg在向96孔板中導入了準備的報告質粒的表達HCV包膜蛋白的CHO細胞(轉染48小時後)的上面導入表達T7RNA聚合酶的質粒之後，向各個孔各加入浮遊培養一夜的2×104/100μl的HepG2細胞，培養5小時後，倒掉介質，在100μl的pH5.0約PBS中浸漬2分鐘後，直接捨棄掉該液體，向各孔加入加有10％血清的D-MEM200μl，繼續培養。培養5小時後，使用dual-luciferaze reporter assaysytem(Promega)，按照附帶的程序測定細胞的螢光素酶的活性，對細胞融合活性進行評價。
15.細胞融合抑制分析研究抗體抑制細胞融合的抑制活性基本上與上述細胞融合抑制分析相同，在向CHO細胞加入HepG2細胞之前，先用Opti-MEM將HepG2細胞洗2次後，在與用Opti-MEM階段稀釋的被檢測抗體(whole抗體)反應60分鐘之後，進行共培養。然後同樣測定螢光素酶活性，對細胞融合抑制活性進行評價。結果可以確認在以表現NOB活性的單鏈抗體為基礎製作的完全抗體中，HCV的包膜蛋白具有特異抑制細胞融合的活性。
16.利用BIACOR X測定結合常數利用BIACOR X測定得到的ScFv的結合常數根據附帶的說明書進行。
用セントリコン30將E2tag置換為10mM醋酸緩衝液(pH＝5.0)。通過將該E2tag(100μg/mL、20μl)以5μl/min速度輸送到傳感晶片CM5(BIACOR公司)的各個不同line(陣列)上，利用氨基偶合(aminocappling)法進行固定，得到固定了E2tag的傳感晶片。用セントリコン30將ScFv1-1置換為HBS緩衝液(10mMHEPES(pH＝7.4)，0.15MNaCl，3.4mM EDTA，0.005％Tween 20)。利用BIACORE X(BIACOR公司)，將該scFv1-1溶液以5μl/min速度輸送到先前製作的E2tag傳感晶片上，得到結合時的sensorgram。然後只將HBS緩衝液以5μl/min速度輸送到傳感晶片上，得到解離時的sensorgram。通過這些sensorgram的解析，得到E2tag與scFv1-1的結合常數4.5×108(M)、解離常數2.2×10-9(M)。
17.E2tag與肝素結合的確認作為確認在E2tag上存在與硫酸化多糖類結合的部位的方法是對E2tag與肝素共價結合的柱子Heparin-Sepharose CL-6B(從Pharmacia公司購入)結合進行確認的方法。Heparin-SepharoseCL-6B用10mM磷酸緩衝液(pH＝7.0)平衡。
在50μl的體系中使溶解在PBS的E2tag2μg和高分子量肝素(從Sigma公司購入)300μg或Heparin(從Sigma公司購入)300μg混合，於37℃攪拌下溫育1小時。與此同時也準備了作為對照只溫育E2tag的樣品。用10,000rpm離心5分鐘，只將上清轉移到其它容器中。加入100μl的0.15M NaCl、10mM磷酸緩衝液(pH＝7.0)後，離心之後，將上清轉移到其它容器，這樣操作反覆進行5次。加50μl的0.15M NaCl、10mM磷酸緩衝液(pH＝7.0)，於室溫溫育5分鐘後，離心後將上清轉移到其它容器。
移至其它容器的洗脫樣品進行10％聚丙烯醯胺凝膠電泳，利用與E2tag表達株構建一節同樣的方法進行Western blotting，確認各個洗脫級分中是否存在E2tag，結果只有將E2tag與Heparin-SepharoseCL-6B混合時，E2tag全部結合在柱子上，而在與Heparin-SepharoseCL-6B混合前，與高分子量肝素或與肝素溫育時，抑制E2tag與柱子的結合。該結果表明E2tag和E2中存在與肝素緊密結合的部位。產業上利用的可能性利用本發明可以提供具有抑制HCV感染作用等抗病毒效果的新藥。
序列表序列表110三菱東京製藥株式會社120C型肝炎治療藥130A11037MA1608121012115212PRT213人類4001Asp Gln Pro Ile Gly15210221117212PRT213人類4002Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1 5 10 15Gly210321117212PRT213人類4003Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg Gly Ser Cys Tyr Asp Trp Leu Asp1 5 10 15Pro210421111212PRT213人類4004Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn1 5 1021052117212PRT213人類4005Ala Thr Ser Arg Leu Tyr Ser1 521062119212PRT213人類4006Gln Gln Thr Lys Ser Phe Pro Leu Thr1 5210721111212PRT213人類4007Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Trp Leu Ala1 5 1021082117212PRT213人類4008Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 521092119212PRT213人類4009Leu Gln His Asp Ser Tyr Pro Phe Ser1 5210102118212PRT213人類40010Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn1 5210112117212PRT213人類40011Ala Ala Ser Arg Leu Gln Arg1 5210122119212PRT213人類40012Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Asn Pro Thr1 52101321114212PRT213人類40013Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His1 5 10210142117212PRT213人類40014Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser1 52101521111212PRT213人類40015Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Phe Glu1 5 1021016211128212PRT213人類40016Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro1 5 10 15Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ile20 25 30Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu35 40 45Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro His Tyr Ala Gln50 55 60Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr65 70 75 80Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr85 90 95Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg Gly Ser Cys Tyr100 105 110Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120 12521017211111212PRT213人類40017Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu35 40 45Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Ath Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys Ser Phe Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala100 105 11021018211111212PRT213人類40018Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro SerArg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asp Ser Tyr Pro Phe85 90 95Ser Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala100 105 11021019211111212PRT213人類40019Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Thr Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe20 25 30Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Met Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Arg Gly Asp Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ser Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Asn Pro85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
100 105 11021020211116212PRT213人類40020Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Pro Pro Gly Gln1 5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly20 25 30Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu35 40 45Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser85 90 95Leu Ser Gly Phe Glu Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110Arg Ala Ala Ala11521021211384212DNA213人類40021atg gcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct 48Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro1 5 10 15ggg tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc tac atc 96Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ile20 25 30gac caa cct atc ggc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag 144Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu35 40 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1.抑制C型肝炎病毒E2/NS1蛋白與C型肝炎病毒感染性細胞、表達CD81的細胞或CD81結合的物質。
2.權利要求1記載的物質，其特徵是通過與C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白帶有正電荷的區域結合，抑制C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白與C型肝炎病毒感染性細胞、表達CD81的細胞或CD81結合。
3.權利要求1或2記載的物質，其特徵是C型肝炎病毒E2/NS1蛋白是C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上帶有可識別該E2/NS1蛋白的物質的蛋白。
4.權利要求1至3中任一項記載的物質，其特徵是C型肝炎病毒E2/NS1蛋白是在C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上帶有通過螢光法或發色法可檢測出該E2/NS1蛋白的物質的蛋白。
5.權利要求1至4中任一項記載的物質，其特徵是C型肝炎病毒E2/NS1蛋白是C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上帶有標記的蛋白。
6.權利要求5記載的物質，其特徵是C型肝炎病毒E2/NS1蛋白是C型肝炎病毒E2/NS1蛋白的C末端上帶有標記的蛋白。
7.權利要求1至6中任一項記載的物質，其特徵是表達CD81的細胞是表達人CD81的細胞。
8.權利要求1至7中任一項記載的物質，其特徵是CD81是可溶性表達的人CD81。
9.權利要求1至8中任一項記載的物質，其特徵是與C型肝炎病毒E2/NS1蛋白的結合常數在108以上，或解離常數在10-8以下。
10.權利要求9記載的物質，其特徵是結合常數在109以上，或解離常數在10-9以下。
11.權利要求1至10中任一項記載的物質，其特徵是物質是蛋白質、硫酸化多糖類或低分子化合物。
12.權利要求11記載的物質，其特徵是蛋白質是抗體。
13.權利要求12記載的物質，其特徵是抗體來自C型肝炎治癒患者的B細胞。
14.權利要求13記載的物質，其特徵是抗體來自C型肝炎治癒患者的B細胞的基因。
15.權利要求13或14記載的物質，其特徵是C型肝炎治癒患者是自然治癒患者，B細胞是周圍血單核細胞。
16.一種抗體，其是H鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表中序列號1、2和3記載的胺基酸序列，或含有在序列號1、2和3記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒E2/NS1蛋白有親和性的抗體。
17.權利要求16記載的抗體，其特徵是含有序列表中序列號16或34記載的胺基酸序列，或在序列號16或34記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列。
18.一種抗體，其是L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表中序列號4、5和6記載的胺基酸序列，或在序列號4、5和6記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒E2/NS1蛋白有親和性的抗體。
19.權利要求18記載的抗體，其特徵是含有序列表中序列號17記載的胺基酸序列，或在序列號17記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列。
20.一種抗體，其是L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表中序列號7、8和9記載的胺基酸序列，或在序列號7、8和9記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒E2/NS1蛋白有親和性的抗體。
21.權利要求20記載的抗體，其特徵是含有序列表中序列號18記載的胺基酸序列，或在序列號18記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列。
22.一種抗體，其是L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表中序列號10、11和12記載的胺基酸序列，或在序列號10、11和12記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒E2/NS1蛋白有親和性的抗體。
23.權利要求22記載的抗體，其特徵是含有序列表中序列號19記載的胺基酸序列，或在序列號19記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列。
24.一種抗體，其是L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表中序列號13、14和15記載的胺基酸序列，或在序列號13、14和15記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體。
25.權利要求24記載的抗體，其特徵是含有序列表中序列號20記載的胺基酸序列，或在序列號20記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列。
26.一種抗體，其是L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表的序列號42、43和44記載的胺基酸序列，或在序列號42、43和44記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體。
27.權利要求26記載的抗體，其特徵是含有序列表中序列號54記載的胺基酸序列，或在序列號54記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列。
28.一種抗體，其是L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表的序列號45、46和47記載的胺基酸序列，或在序列號45、46和47記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體。
29.權利要求28記載的抗體，其特徵是含有序列表中序列號55記載的胺基酸序列，或在序列號55記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列。
30.一種抗體，其是L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表中序列號48、49和50記載的胺基酸序列，或在序列號48、49和50記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的抗體。
31.權利要求30記載的抗體，其特徵是含有序列表中序列號56記載的胺基酸序列，或在序列號56記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列。
32.一種抗體，其是L鏈的可變區的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分別含有序列表中序列號51、52和53記載的胺基酸序列，或在序列號51、52和53記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒E2/NS1蛋白有親和性的抗體。
33.權利要求32記載的抗體，其特徵是含有序列表中序列號57記載的胺基酸序列，或在序列號57記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列。
34.一種抗體，其是作為重鏈的胺基酸序列含有序列表中序列號40記載的胺基酸序列，或在序列號40記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒E2/NS1蛋白有親和性的抗體。
35.一種抗體，其是作為輕鏈的胺基酸序列含有序列表中序列號41記載的胺基酸序列，或在序列號41記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列，並對C型肝炎病毒E2/NS1蛋白有親和性的抗體。
36.對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的單鏈抗體，其特徵是含有序列表中序列號26、27、28或29記載的胺基酸序列，或在序列號26、27、28或29記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列。
37.對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的單鏈抗體，其特徵是含有序列表中序列號36、37、38或39記載的胺基酸序列，或在序列號36、37、38或39記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列。
38.對C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有親和性的單鏈抗體，其特徵是含有序列表中序列號62、63、64或65記載的胺基酸序列，或在序列號62、63、64或65記載的胺基酸序列中缺失、置換或附加1個或數個胺基酸的胺基酸序列。
39.編碼權利要求16至38中任一項記載的抗體的核酸。
40.權利要求39記載的核酸，含有序列表中序列號21、22、23、24、25、35、58、59、60、61中任一個序列記載的鹼基序列。
41.權利要求39記載的核酸，含有序列表中序列號40或41記載的鹼基序列。
42.權利要求39記載的核酸，含有序列表中序列號26、27、28、29中任一個序列記載的鹼基序列。
43.權利要求39記載的核酸，含有序列表中序列號36、37、38、39中任一個序列記載的鹼基序列。
44.權利要求39記載的核酸，含有序列表中序列號62、63、64、65中任一個序列記載的鹼基序列。
45.利用權利要求39至44中任一項記載的核酸生產抗體的方法。
46.可以利用權利要求45中的方法獲得的，對C型肝炎病毒E2/NS1蛋白有親和性的重組抗體。
47.權利要求46記載的重組抗體，其中抗體Fc區是人源型的。
48.權利要求46或47記載的重組抗體，其中抗體是單鏈抗體。
49.含有權利要求1至15中任一項記載的物質作為有效成分的藥物。
50.含有權利要求16至38中任一項記載的抗體作為有效成分的藥物。
51.含有權利要求46至48中任一項記載的重組抗體作為有效成分的藥物。
52.權利要求49至51中任一項記載的藥物，其是治療和/或預防C型肝炎的藥物。
53.權利要求49至51中任一項記載的藥物，是用於診斷C型肝炎的藥物。
54.含有權利要求1至15中任一項記載的物質作為有效成分的抗HCV劑。
55.含有權利要求16至38中任一項記載的抗體作為有效成分的抗HCV劑。
56.含有權利要求46至48中任一項記載的重組抗體作為有效成分的抗HCV劑。
57.通過刺激C型肝炎治癒患者的B細胞，使抗C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白的抗體的mRNA表達，從該B細胞獲得抗體mRNA和抗體cDNA，獲得與該E2/NS1蛋白結合的抗體的可變區序列的方法。
58.權利要求57記載的獲得抗體可變區序列的方法，其特徵是C型肝炎治癒患者是自然治癒患者，B細胞是周圍血單核細胞。
59.含有利用權利要求57或58記載的方法獲得的可變區序列的抗體。
60.篩選抑制C型肝炎病毒E2/NS1蛋白與有C型肝炎病毒感染性的細胞、表達CD81的細胞或CD81結合的物質的方法，該方法包括在被檢驗物質存在或不存在情況下使C型肝炎病毒E2/NS1蛋白與有C型肝炎病毒感染性細胞、表達CD81的細胞或CD81接觸的工序；以及在被檢驗物質存在或不存在情況下對C型肝炎病毒E2/NS1蛋白與有C型肝炎病毒感染性細胞、表達CD81的細胞或CD81結合進行比較的工序。
61.權利要求60記載的篩選方法，其特徵是C型肝炎病毒E2/NS1蛋白是C型肝炎病毒E2/NS1蛋白上帶有可識別該E2/NS1蛋白的物質的蛋白。
62.權利要求60或61記載的篩選方法，其特徵是C型肝炎病毒E2/NS1蛋白是C型肝炎病毒E2/NS1蛋白上帶有通過螢光法或發色法可檢測出該E2/NS1蛋白的物質的蛋白質。
63.權利要求60至62中任一項記載的篩選方法，其特徵是C型肝炎病毒E2/NS1蛋白是C型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上帶有標記的蛋白質。
64.權利要求63記載的篩選方法，其特徵是C型肝炎病毒E2/NS1蛋白是C型肝炎病毒E2/NS1蛋白的C末端帶有標記的蛋白質。
65.權利要求60至63中任一項記載的篩選方法，其特徵是表達CD81的細胞是表達人CD81的細胞。
66.權利要求60至63中任一項記載的篩選方法，其特徵是CD81是可溶性表達的人CD81。
67.權利要求60至66中任一項記載的篩選方法，其特徵是被檢驗物質是蛋白質、硫酸化多糖類或低分子化合物。
68.通過權利要求60至67中任一項記載的方法得到的抑制C型肝炎病毒E2/NS1蛋白與有C型肝炎病毒感染性細胞、表達CD81的細胞或CD81結合的物質。
69.通過包括在被檢驗物質存在或不存在情況下，測定有HCV感染性細胞和表達HCV蛋白的細胞的結合，與沒有被檢驗物質存在情況下的結合進行比較的工序在內的篩選方法得到的抑制C型肝炎病毒生活環境的物質。
70.通過包括在被檢驗物質存在或不存在情況下，有HCV感染性細胞和表達HCV蛋白的細胞結合後，對被檢驗物質和有HCV感染性細胞和表達HCV蛋白的細胞的融合進行測定，與沒有被檢驗物質存在情況下的融合進行比較的工序在內的篩選方法得到的抑制C型肝炎病毒生活環境的物質。
71.權利要求69至70中任一項記載的抑制C型肝炎病毒生活環境的物質，其中被檢驗物質是蛋白質、硫酸化多糖類或低分子化合物。
72.以權利要求68至71中任一項記載的物質為有效成分的抗HCV劑。
73.包括使用權利要求68至71中任一項記載的物質，使抗HCV劑製劑化在內的抗HCV劑的製造方法。
74.權利要求73記載的抗HCV劑的製造方法，包括利用權利要求68至71中任一項記載的篩選方法確認抑制C型肝炎病毒增殖的工序。
全文摘要
本發明提供抑制C型肝炎病毒E2/NS1蛋白與有C型肝炎病毒感染性細胞、表達CD81的細胞或CD81結合的物質。根據本發明有可能提供具有阻止HCV感染作用等抗病毒效果的新藥。
文檔編號C12N5/02GK1423561SQ01808059
公開日2003年6月11日 申請日期2001年2月13日 優先權日2000年2月14日
發明者伊丹清馬, 澀井達郎, 關誠, 四本能尚, 松浦善治, 宮村達男 申請人:三菱製藥株式會社, 日本國立感染症研究所