擔子菌的天冬醯胺酶的製作方法

2023-05-27 10:23:26 2

專利名稱：擔子菌的天冬醯胺酶的製作方法
擔子菌的天冬醯胺酶發明領域
本發明的領域涉及可自真菌擔子菌獲得的天冬醯胺酶，所述擔子菌特別是擔子菌絨狀火燕(Flammulina velutipes)。還公開了用於水解L-天冬醯胺和L-穀氨醯胺的方法。還公開了用於降低包含L-天冬醯胺的物質中的丙烯醯胺形成的方法。發明背景
天冬醯胺酶在食品技術中的應用源於發現在存在還原糖類的條件下，對食品的熱處理將天冬醯胺部分轉化為丙烯醯胺。由於糖類在食品中與胺基酸一樣普遍，因此在食品熱處理的過程中，存在持續的風險產生致癌和遺傳毒性的丙烯醯胺。熱處理是例如對食物的烘焙、烤、炙烤或熱油炸。在食品熱處理過程中，在120°C以上的溫度下觀察到出現丙烯醯胺形成。考慮到丙烯醯胺的遺傳毒性和致癌性，糧農組織/世界衛生組織食品添加劑專家委員會(JECFA)提出膳食暴露於丙烯醯胺可暗示人的健康問題(參見www.1nchem.org/ documents/jecfa/jeceval/jec_41. htm,見於 2010 年 7 月 I 日)。
食品工業對多種本身需要熱處理的品種予以特殊關注，例如麵包、曲奇、小食、餅乾、穀物、烘乾的種子(例如可可、咖啡)、擠壓和切割的土豆產品。
食品的熱處理對於食品質量而言是不可或缺的。例如食品的褐化(邁拉德反應) 反應形成了食品的典型風味、顏色和抗氧化劑。此外，由於熱處理食品，可以實現食品的微生物安全性和延長的保存期。
能夠在熱處理食品前選擇性的去除L-天冬醯胺是理想的。
已報導，使用反義天冬醯胺合酶基因和塊莖特異性啟動子對土豆進行遺傳改造， 降低但不能從土豆塊莖中消除天冬醯胺(Rommens 2007);完全消除天冬醯胺對於植物可能是致死的。
酶是理想的選擇性工具，用於在不影響其他食物組分的條件下修飾食物組分。酶對食品的催化作用隨高的底物和反應特異性以及酶反應的溫和物理條件而不同。酶對食品的作用是更加環境友好的，因為不涉及有機溶劑或重金屬(「綠色化學」;「白色生物技術」)。 用於修飾食物組分的酶能夠改變單個食物組分，同時避免任何可能最終導致在食品中形成毒性化合物的副反應。
然而，目前尚無任何酶技術可設想用於從食物蛋白質中選擇性水解蛋白質結合的胺基酸，例如天冬醯胺，而對於同時保持相應食物材料的典型結構和味覺特性來說則所述技術則更少。
理想的是水解例如食物中的游離的和可移動的天冬醯胺為天冬氨酸。則天冬醯胺之後不能作為食品熱處理時形成丙烯醯胺的前體分子。
技術現狀
天冬醯胺酶(EC 3. 5.1.1 ;L_天冬醯胺醯胺水解酶)是催化L-天冬醯胺水解為天冬氨酸，並釋放氨的酶。根據定義，天冬醯胺酶作用於線性醯胺中的氮-碳鍵，而不作用於 L-天冬醯胺的肽鍵。
L-天冬醯胺是第一個被檢測到的胺基酸(1806年，在石刁柏(Asparagusofficinalis)的汁中)，L-天冬醯胺普遍存在於所有的活細胞中。因此,從原核微生物至脊椎動物，自然界存在豐富的天冬醯胺酶；參見Halpern, Y. S.和Grossowicz,N. ,Hydrolysis of amides by extracts frommycobacteria, Biochem. J. 65 :716-720 (1957) ；Ho, P.P.K., Frank, B. H. ^PBurck, P. J. , Crystalline L-asparaginase from Escherichia coli B., Sciencel65 :510-512(1969) ；Suld, Η. M.和 Herbut, P. A. , Guinea pig serum andliver L-asparaginases—Comparison of serum and papain-digested IiverL-asparaginase. J. Biol. Chem. 245 :2797-2801 (1970)。具有326個胺基酸的大腸桿菌的四聚體天冬醯胺酶 (Jackson,R. Ch.和Handschumacher,R. Ε· ,Escherichia coli L-asparaginase. Catalytic activity and subunit nature, Biochemistry, 1970,9 (18),第 3585-3590 頁)是首個被詳細檢測的。
直到近期為止，L-天冬醯胺酶才在癌症治療中被用作cytostaticum,抵抗白血病細胞和肥大細胞腫瘤(Herbert F. Oettgen, L-asparaginase Einneues Prinzip in der Chemotherapie maligner Neoplasien, Annals ofHematology,1969,19(6), 351-356)。
最近，報導了源自細菌(幽門螺桿菌(Helicobacter pylori), Scotti等人， 2010 ；Pyrococcus furiosus, Greiner-Stoeffele and Struhalla, 2008)和黴菌(黑麴黴 (Aspergillus niger), Van der Laan 等人，2008 ;米麴黴(Aspergillus oryzae), Matsui 等人，2008)的天冬醯胺酶。據稱加入二價和三價陽離子和多種胺基酸和游離巰基(Elder 等人，2007)，或加入α澱粉酶(de Boer，2006)，或加入氯化鈣與磷酸或檸檬酸(Elder等人，2005) —定程度的支持了天冬醯胺酶的活性。
穀氨醯胺酶與天冬醯胺酶相關。穀氨醯胺酶典型的源自乳酸菌，例如存在於雞腸道微生物叢中的(Thongsanit等人,2008 ;鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus), Weingand-Ziade 等人,2003),或源自酵母(魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii), Iyer和Singhal 2010),或源自海洋真菌(球抱白僵菌(Beauveria bassiana), Sabu等人, 2002)，或仍源自麴黴屬黴菌(Prasanth等人， 2009)。
天冬醯胺酶在食品技術中的相關用途很新。在2007年，PreventAse (DSM)酶被引入歐洲市場。PreventAse (DSM)酶是通過重組黴菌-黑麴黴生產的。使用浸泡式補料_分批發酵攜帶編碼米麴黴天冬醯胺酶的基因的遺傳修飾的菌株，從相關的黴菌物種——米麴黴(Aspergillus oryzea)獲得了被稱為Acrylaway (Novozymes)的競爭性天冬醯胺酶。兩種麴黴(黑麴黴和米麴黴)都具有較長的安全工業應用的歷史，在自然界中廣泛分布，且常用於生產食品級酶。
在烘焙應用中，通常在熱處理食品(例如，烘焙)前，將天冬醯胺酶與生麵團混合， 以消除丙烯醯胺形成。對於油炸馬鈴薯，可以使用將土豆片浸入天冬醯胺酶的溶液或用天冬醯胺酶的溶液對其進行噴霧。此類處理可以非常有效。在薯片生產中，Corrigan(2008) 報導了相比未處理過的薯片，終產品中的丙烯醯胺水平從1688μ g/kg減少至60μ g/kg。將丙烯醯胺形成降低> 99. 9%被認為是可行的(Elder等人，2004)。
向食品應用的天冬醯胺酶不造成產品安全性問題，因為在包裝前步驟中的食品熱處理可以熱失活天冬醯胺酶。因此，天冬醯胺酶不可能以其活性形式與消費者接觸。
擔子菌的酶
約1000種可食用真菌中的大部分都屬於擔子菌綱(Basidiomycota)。擔子菌通常被稱為高等真菌。擔子菌的繁殖是通過形成攜帶4個減數孢子的柱狀細胞(pillar-like cell) ο擔子菌的解剖學賦予其命名(拉丁文的Basidium = pillar)。由於其豐富的風味、 高蛋白質、高纖維含量和低熱量，擔子菌被世界範圍的認可。亞洲文化還認為許多擔子菌類真菌具有顯著的健康保護和治療活性。
腐生擔子菌通常棲居在森林碎屑、森林土壤、落葉層和倒下的樹木上。營養細胞在地下球狀體中延展形成長纖維狀細胞(菌絲)。為了在土壤中最難對付的有機材料—— 三維的木質素網絡——生存，腐生擔子菌具有極強力的氧化還原酶類。所述氧化還原酶包括木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶、多功能過氧化物酶、產生H2O2的氧化酶如葡萄糖氧化酶，以及漆酶類型的酚氧化酶。還可見糖苷酶，例如纖維素酶，幫助降解木材的纖維素部分。
由於落葉樹和針葉樹不含大量的蛋白質和胺基酸，預期生長在這類特定天然棲息地中的真菌不存在天冬醯胺酶活性。
擔子菌中的絨狀火菇栽培種也被稱為金菇(Enokitake)、金針菇或冬菇(velvet foot)。絨狀火菇形成瘦長的白色子實體，在亞洲烹飪中被用作多用途的蘑菇。該蘑菇在傳統上被新鮮的或罐裝的用於湯、沙拉和其他菜餚。該蘑菇可以冷藏約I周。
發明的目標
本發明的一個目標是提供具有高活性和高操作穩定性的天冬醯胺酶。
本發明的另一個目標是通過使用天冬醯胺酶，降低食品中的丙烯醯胺形成。
發明概述
在本發明的一個方面，本發明涉及可自擔子菌獲得的天冬醯胺酶。所述擔子菌特別是擔子菌絨狀火菇。
在另一個方面，本發明涉及水解至少一種L-天冬醯胺或L-穀氨醯胺的方法。方法包括用可自擔子菌獲得的天冬醯胺酶處理包含至少一種L-天冬醯胺或L-穀氨醯胺的物質。
在另一個方面，本發明涉及用於降低包含L-天冬醯胺的物質中的丙烯醯胺形成的方法。方法包括向包含L-天冬醯胺的物質應用可自擔子菌獲得的天冬醯胺酶。方法之後包括加熱包含L-天冬醯胺的物質。
包含至少一種L-天冬醯胺或L-穀氨醯胺的物質可以是食品。
本發明還涉及通過本發明的方法獲得的產物。
附圖
下文中，參考如下圖所示的一些實施方案來描述本發明，其中


圖1顯示了在浸沒培養中生長的絨狀火菇胞內形成天冬醯胺酶的時間過程。
圖2顯示了在浸沒培養中生長的絨狀火菇胞外形成天冬醯胺酶的時間過程。
圖3顯示了絨狀火菇的天冬醯胺酶的(A)基因組核苷酸序列、(B)編碼核苷酸序列和(C)胺基酸序列。前19個胺基酸標註為信號序列。
圖4顯示了絨狀火菇的天冬醯胺酶的鹽耐受，所述酶是在作為異源宿主的大腸桿菌中表達的，並作為粗酶被使用。
圖5顯示了絨狀火菇的天冬醯胺酶的pH穩定性，所述酶是在作為異源宿主的大腸桿菌中表達的，並作為粗酶被使用。
圖6顯示了絨狀火菇的天冬醯胺酶的最佳pH。
圖7顯示了絨狀火菇的天冬醯胺酶的溫度穩定性，所述酶是在作為異源宿主的大腸桿菌中表達的，並作為粗酶被使用。
圖8顯示了絨狀火菇的天冬醯胺酶的a)活性染色的天然聚丙烯醯胺凝膠電泳 (PAGE)和b)變性PAGE分離。
圖9顯示了絨狀火菇的天冬醯胺酶的最佳溫度。
發明詳述
為了完全理解本發明及其優點，參考本發明的詳細描述和附圖。
應該理解，本發明的各個方面僅是製備和使用本發明的具體方式的示例，其在考慮權利要求和下列詳細說明時，不作為對本發明範圍的限制。
在本發明中，術語天冬醯胺酶用於指能夠同時水解L-天冬醯胺和L-穀氨醯胺的酶。
本發明的目的是通過用天冬醯胺酶預定地酶水解丙烯醯胺前體——L-天冬醯胺， 顯著降低熱處理的食品中的致癌性丙烯醯胺的形成。
在本發明的一個實施方案中，公開了用於生產天冬醯胺酶的方法。天冬醯胺酶具有操作穩定性，獲得自擔子菌絨狀火菇的菌絲體。
絨狀火菇的菌株是可通過培養物收藏中心商購的，例如DSMZ (Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)或 CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands)。
使用擔子菌絨狀火菇的菌絲體為生產和培養的便利提供了極大優勢，因為不需要從野外收集子實體。該擔子菌絨狀火菇物種作為食材廣泛使用，因此沒有明顯的健康風險或安全性問題。
擔子菌絨狀火菇真菌可以在浸沒培養中方便的生長，對培養基添加物僅有最低要求。必需存在有機碳源、氮源 和磷源；這些來源通常由天然混合物提供，例如酵母提取物或葡萄糖加無機氨和磷酸鹽。推薦在微生物的所有營養培養基中加入微量和痕量兀素的混合物。優選在浸沒培養中進行3至20天擔子菌絨狀火菇的培養，優選6至15天。在擔子菌絨狀火菇真菌培養過程中的溫度通常是從10至35°C，優選從20至30°C的範圍。約4_8的 PH是典型的，約5-7的pH是優選的。此外，低光照條件對於方法而言是典型的。
生物量和天冬醯胺酶的生產方法在溫和條件下操作，與現有技術的方法相比是環境友好的。
如圖1所示，天冬醯胺酶活性首先積累在胞內，然後分泌到營養培養基中，如圖2 所示。
營養培養基有利於方法的操作，和使用本領域已知的技術分離和富集天冬醯胺酶。技術可以是超濾、沉澱或吸附。因此可以獲得天冬醯胺酶的無細胞的、濃縮的培養上清液，並將其進一步用於技術性水解。雖然可以通過本領域已知的技術分離天冬醯胺酶，但並非必須分離，本方法中也可以進一步使用所獲得的天冬醯胺酶的粗製混合物。
在絨狀火菇的浸沒培養過程中，約I周后發現胞內天冬醯胺酶活性的峰。在12天後開始向胞外空間分泌，約14天後到達最高峰。
如圖8所示，天然聚丙烯醯胺凝膠上的活性染色驗證了催化特異性，並在13和 74kDa表現出純化酶的活性條帶，表示存在單體外的寡聚體形式。
如果需要最大的天冬醯胺酶純度,可以使用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 的重組產物。為了開發重組菌株，需要知道天冬醯胺酶的全長胺基酸序列。圖3顯示了天冬醯胺酶的全長胺基酸序列，顯示具有共計123個胺基酸部分的全長序列，從結構基因的全長372個鹼基對序列推斷而來。在編碼區前有18個鹼基對的信號序列。
向底物添加天冬醯胺酶。通過向底物添加天冬醯胺酶，希望天冬醯胺酶與底物接觸。這可以包括例如用天冬醯胺酶噴霧、浸泡或包被底物。底物優選的是包含任意一種 L-天冬醯胺或L-穀氨醯胺的食物材料。天冬醯胺酶通常向底物應用的濃度是I至200毫摩爾的總水平，優選10至20毫摩爾，取決於比活。天冬醯胺酶可以作為純蛋白質添加。可選的，可以根據預期的用途定製天冬醯胺酶，這通過向天冬醯胺酶添加成分，例如乳糖、甘油或白蛋白，以利於配料(dosage)。生產的天冬醯胺酶或定製的天冬醯胺酶可以是酶片劑、 顆粒、穩定的液體或糊狀製品的形式。
實施底物水解，獲得相比處理前的底物，具有顯著較低的天冬醯胺或穀氨醯胺水平的底物。可用於水解的條件是標準的，可以由本領域技術人員方便的確定。
由於天冬醯胺酶活性不受它所存在的化學環境的影響，待處理的底物可以是例如
飲料
可可豆
乳酪
咖啡豆
糖果(confectionery)
甜點·
生麵團
調料(dressings)
油炸馬鈴薯(Frenchfries)
果汁飲料
肉製品
藥膳(Medicaldiets)
營養添加物
寵物食品
薯片
調味料
小食
湯。
特別的是，底物是可被人或動物消耗的任何物品。
可以通過測量天冬醯胺減少、天冬氨酸或氨增加，或者在加工食品後，通過測量任何殘留的丙烯醯胺的水平，來評估底物中的天冬醯胺的水解程度。
本發明提供的優點是所獲得的新型天冬醯胺酶具有對L-天冬醯胺水解而言顯著的親和力和改善的效力。
更令人驚訝的是，天冬醯胺酶對於操作穩定性的優秀技術特性使其能夠用於具有升高的溫度和離子強度以及不同的PH條件的工藝中(圖4-7)。除水外，其他添加劑或其他協同底物(co-substrate)都不是必需的。
新型天冬醯胺酶具有良好的pH穩定性和處於pH 5. 5至9之間的廣泛最佳pH，參見圖5和6。大部分食品的pH都位於該範圍內。
即使在高達55°C的溫度下，天冬醯胺酶的操作穩定性也不會減少，參見圖7。
如等電聚焦凝膠電泳所確定的，天冬醯胺酶單體和寡聚體的等電點接近5. 2。根據全長序列推出，天冬醯胺酶單體和寡聚體的分子量是12. 8，根據天然聚丙烯醯胺凝膠電泳 (PAGE)推出，聚集形式的分子量為約74，參見圖8。
通過ES1-MS分析確定圖3所示的天冬醯胺酶的唯一序列。最初發現的肽的最佳同源性被發現是對羧化酶/金屬肽酶(E值> 30)、脂肪酶/酯酶/脫乙醯酶(E值> 100)， 和對胃蛋白酶樣天冬氨酸/糖苷水解酶出值> 14)。一般非均相的結果和差的E值表示該天冬醯胺酶沒有先例，確實是新的。這可用唯一的來源——擔子菌物種解釋。
通過下列非限制性實施例中的示例，本文進一步描述了本發明。
實施例
在下列實施例中，列出了使用的材料和方法。
材料和方法
培養絨狀火菇
在使用前高壓滅菌所有的培養基和設備，在整個過程中使用標準的無菌技術。 絨狀火菇保持在標準瓊脂平板(30. Og L—1葡萄糖單水合物；4. SgL-1天冬醯胺單水合物；1.5g L^1KH2PO4 ；0. 5g L^1MgSO4 ；3. Og L—1 酵母提取物；15. Og L—1 瓊脂；1. OmL L—1 痕量金屬溶液，其含有 O. 005g L-1CuSO4 · 5H20,0, 08g L-1FeCl3 · 6Η20、0· 09g L^1ZnSO4 · 7Η20,0. 03g L-1MnSO4 · H2O,以及O. 4g T1EDTA (乙二胺四乙酸))上。在滅菌前，用IM NaOH調節培養基的pH至ρΗ6 ο
在IOOmL無菌的標準營養溶液中，使用 Ultra Turrax (Miccra D_9, Art,Miillheim, Germany)均化IOxlOmm瓊脂塞子(agar plug)和絨狀火燕的菌絲體,製備預培養物。將浸沒的培養物保持在24°C和150rpm。培養5天後，將50ml預培養物轉移到分別由基本培養基(1. 5g L-1KH2PO4 ；0. 5g L-1MgSO4 ；1. Oml L-1 痕量金屬溶液)和 40g L-1 谷蛋白或 IOmM 穀氨醯胺組成的250ml主培養基中。
絨狀火菇的天冬醯胺酶製品
培養18天後，過濾培養物，將含有胞外天冬醯胺酶的上清液(200mL)逆向發泡 (reverse-foamed) [I]。使用 10, OOOkDa 的 MWCO (Mi I lipore, Bedford, MA)超濾濃縮存留物，用200mM Tris/HCl pH 7. 5在Superose 6上通過尺寸排阻層析對其進行分離。
活性測試
在37°C分別預熱在O.1M磷酸鉀pH 7. O中的IOmM L-穀氨醯胺或IOmM L-天冬醯胺。在150 μ L總反應體積中加入50 μ L天然的或10 μ L重組的酶開始所獲得的測定，並在10-20min後，通過加入20μ L3% TCA或在95°C加熱IOmin終止。進行沒有胺基酸的對照實驗。用HPLC跟蹤產物形成。一單位的酶活性計算為在37°C下，每分鐘分別產生I μΜ 穀氨酸或天冬氨酸所需的酶量。
實施HPLC,其中使用 C18Nucleodur Pyramid, 5 μ m, 4mm ID 柱，甲醇作為洗脫劑 A,O.1M醋酸鈉加O. 044%三乙胺(用HCl調節pH至6. 5)作為洗脫劑B，鄰苯二醛作為衍生化試劑，以及螢光檢測儀。
游離蛋白質
根據Lowry方法，使用牛血清白蛋白作為標準，估算水解上清液中的蛋白質濃度。
最佳溫度和pH
用培養過程中收穫的酶溶液，或在可獲得可溶形式的重組蛋白質之後，實施對天冬醯胺酶的最佳溫度和PH的確定。37°C下，在pH 4至9的範圍內檢驗最佳pH (O.1M醋酸鈉pH 4、5 ；0.1M磷酸鉀pH 6、7、8 ；0.1M碳酸鈉pH 9)。在最佳pH下，從20至70°C的範圍內確定最佳溫度。
溫度和pH穩定性
為了確定pH穩定性，在40 μ L的上述各緩衝液中，在37°C孵育10 μ L重組酶16h。 加入在O.1M磷酸鉀(pH 7)中的IOOyL IOmM穀氨醯胺，在37°C孵育反應20min。進行沒有底物的對照實驗。在95°C下IOmin終止反應。在如上所述的HPLC分析後，計算所產生的穀氨酸。
為了分析溫度穩定性，在40 μ L的O.1M磷酸鉀緩衝液(pH 7)中，在各個。C下孵育 10 μ L重組酶Ih。之後，加入在O.1M磷酸鉀(pH 7)中的IOOyL IOmM穀氨醯胺，在37°C孵育測定混合物20min。進行沒有底物的對照實驗。在95°C下IOmin終止反應。在如上所述的HPLC分析後，計算所產生的穀氨酸。
ES1-串聯MS分析胰蛋白酶消化肽段
從SDS聚丙烯醯胺凝膠上切出肽酶條帶，乾燥，和用胰蛋白酶消化。根據標準規程提取和純化所獲得的肽。使用 裝備了納米噴霧離子源和金包被毛細管的QtofII質譜 (Micromass,U. K)進行肽的電噴射離子化(ESI)MS。對於碰撞誘導解離實驗，將多電荷的母離子從四極質譜儀選擇性的轉移到碰撞室中(25-30eV)。通過正交飛行時間質譜儀分離獲得的子離子。從ES1-串聯MS分析獲得的肽質量指紋分析用於在公共蛋白質基本序列資料庫中進行跨物種的蛋白質鑑別。
天然PAGE 和變性 SDS-PAGE
在12%聚丙烯醯胺分離凝膠上實施SDS-PAGE分析。通過混合20 μ L天冬醯胺酶溶液和 20 μ L 上樣緩衝液(O.1M Tris/HCl (pH 6· 8)，O. 2MDTT，4% SDS，20%甘油，O. 2%溴酚藍)，並煮沸15min來製備樣品。按每塊膠20mA電泳後，用銀或考馬斯亮藍染色凝膠。對於分子確定，使用250至IOkDa(BioRad, Germany)的標誌物蛋白。
在非變性條件下實施天然PAGE。通過與上樣緩衝液(0.05MTris/HCL(pH 6.8)、 2%505、10(%甘油、0.1(%溴酚藍)1 I (v/v)混合製備樣品。在8°C下每塊膠IOmA電泳後， 在2. 5% Triton X-100中洗滌凝膠2次。染色程序基於穀氨醯胺酶對L-穀氨醯胺脫醯胺作用產生L-穀氨酸。穀氨酸脫氫酶對L-穀氨酸的氧化與四唑.榻■染料對其顯色的不可溶性甲 的還原相偶聯。穀氨醯胺酶染色溶液含有15mM L-穀氨醯胺、O. SgmL—1牛肝穀氨酸脫氫酶、O.1M磷酸鉀pH 7、2mg mL_1NAD>0. 04mg ml/1吩嗪硫酸甲酯和2mg ml/1氮藍四唑.銷·。在37 °C下孵育後，酶活性顯示為紫色條帶。
等電聚焦
在Multiphor II 系統(Pharmacia LKB, Sweden)上，使用具有 3 至 10 的固定 pH 梯度的 Servalyt Precotes 預製凝膠(Serva, Germany),在 3500V h (2000V, 6mA, 12W)實施IEF聚丙烯醯胺凝膠電泳。使用pi 3. 5至10. 7 (Serva,Germany)的蛋白質測試混合物， 估算天冬醯胺酶的等電點是5。如上所述，對凝膠考馬斯藍、銀染或活性染色。
RNA-製備
使用NltcleoSpin RNA 植物試劑盒(Macherey-Nagel, Diiren, Germany),從 500mg 儲藏在RNALiater (Invitrogen)中的菌絲體製備 RNA。
cDNA-合成
5μ g 總 RNA 與 25pmol 3』PCR(ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 30 * T VN)混合， 用DEPC-處理的H2O填補至11 μ I。混合物在70°C孵育5min，然後在冰上冷卻2min。加入 4μ I 5χ 反應緩衝液、2 μ I dNTP 混合物(IOmM ea. ),0. 5 μ I RiboLock 和 20pmol SMART II A (AAGCAGTGGTATCMCGCAGAGTACGCGGG)，混合併在 37°C孵育 5min。在加入 200U RevertAidTM H Minus M-MuLV逆轉錄酶後，在42°C孵育混合物60min。在70°C加熱5min進行終止。
通過混合2. 5 μ I IOx Long PCR 緩衝液、2 μ I dNTP 混合物(2. 5mMea.)、25pmol 5，PCR(AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT)、25pmol 3，PCR、lyl DMSOUU Long PCR酶混合物、3 μ I ss cDNA和ddH20至25 μ I，進行第二鏈合成。
在94°C孵育反應混合物5min，然後進行30個循環的94°C下20s，68°C下6min，在 68°C實施最終的延伸2 0min。
從Fermentas, St. Leon-Rot, Germany 購買酶和試劑。由 EurofinsMWG Operon, Ebersberg, Germany合成寡核苷酸。
序列Fishing
從肽序列推斷變性的(Degenerated)引物。通過混合2· 5μ I lOxTrueStart Taq-緩衝液、2 μ I dNTP 混合物(2. 5mM ea.)、2μ I 25mMMgCl2、25pmol 正向引物、25pmol 反向引物、0，8μ1 DMS0.0, 625UTrueStart Taq DNA聚合酶、1μ I ds cDNA和 ddH20至 25 μ 1， 實施PCR。
通過在95°C孵育反應混合物5min，然後進行12個循環的95°C下30s，(72°C _1°C / 循環)下60s和72°C下90s，來實施Touchdown PCR[2]。在60°C退火溫度下再進行25個循環。在72°C實施最終的延伸20min。
通過瓊脂糖凝膠電泳(1%瓊脂糖(Serva, Heidelberg, Germany),在TAE-緩衝液 (40mM Tris、20mM醋酸、ImM EDTA pH 8))中顯影，分析PCR。為了檢測DNA，在冷卻至約50°C 後，向溶液中加入 O. 05%。SYBRSafe (Invitrogen)。
用NucleoSpin Extract II 試劑盒(Macherey-Nagel)從瓊脂糖凝膠進行 DNA 提取。
通過混合I μ I載體、I μ I IOx T4DNA連接酶緩衝液、5U T4DNA連接酶、O. 5 μ I 5mM ATP和6. 5 μ I插入DNA，將DNA片段連接到pCR2.1 TA-載體(Invitrogen)中。反應化合物在25°C孵育2小時。
為了轉化，將5μ I連接反應物加入到50μ I化學感受態的大腸桿菌 TOPlO(Invitrogen)中，冰上孵育20min，42°C熱激45s，重新移至冰上。立即加入500 μ I的 SOC培養基(Invitrogen)。在200rpm和37°C振蕩細胞60min,然後放在含有50 μ g/ml氨苄青黴素和20 μ g/ml X-Gal (Roth)的LB瓊脂上。在37 °C孵育接種平板過夜。
通過集落PCR實施陽性克隆的選擇。反應混合物組成如上所述，但使用引物 M13uni(-21) (TGTAAAACGAC GGC CAGT)和 M13rev(_29) (CAGGAAACAGCTAT GACC)。通過在反應混合物中重懸白色集落材料來加入模板。
反應混合物在95°C孵育5min，再進行40個循環的95°C下30s，55°C下Imin和72°C 下lmin/kb。在72 °C實施最終延伸20min。
用NucleoSpin Plasmid DNA試劑盒(Macherey-Nagel)分離質粒DNA。由 Eurof ins MWG Operon (Ebersberg, Germany)實施測序。
為了使序列完整，具體引物源自已鑑別的天冬醯胺酶DNA片段，且分別與引物 5』 PCR或3』 PCR配對。使用55°C的退火溫度和72°C下Imin的延伸步驟，如上所述進行 PCR。
用弓 I 物 FvNase_5』 (ATGAAATCTTTTGCCCTCTTCG)和 FvNase_3』 (TCAAGCAAAGTGATGAAGG)實現擴增全長天冬醯胺酶序列，使用55 °C的退火溫度和72°C下Imin的延伸步驟。
為了驗證序列，使用基因組DNA純化試劑盒(Fermentas),從菌絲體製備基因組 DNA。擴增並測序全長天冬醯胺酶序列。
分析DNA和胺基酸序列通過用Signal P 3. O [3]分析進行N端信號序列的鑑別。使用BLAST，通過GenBank 資料庫探討序列同源性[4]。
在大腸桿菌中的異源表達
為了克隆天冬醯胺酶，使用
FvNase_EcoRI(ATAGAATTCATGAAATCTTTTGCCCTCTTC)和 FvNase_BamHI(ATAGGATCC TCAAGCAAAGTCGATGAA)，用側翼的限制性位點EcoRI和BamHI，通過PCR從質粒DNA擴增基因。消化基因盒，連接到X-Zyme的pCTP2表達載體中，產生表達構建體pCTP2-Aspa。37°C 下，在LB-培養基中生長用pCTP2-Aspa轉化的大腸桿菌菌株DH5 α和JM105，至OD6tltol為 O. 7，用O. 5mM IPTG誘導，並進一步培養過夜。將細胞重懸在Tris-緩衝液pH 7. 5中，超聲裂解，通過離心去除細胞碎片。用硫酸銨促進天冬醯胺酶的純化。
枯草芽孢桿菌的重組天冬醯胺酶
細菌分泌蛋白質是ATP依賴性的過程，涉及前蛋白質的易位和前蛋白質在膜外表面上的後續蛋白水解切割，成為成熟的酶。信號序列含有靶向蛋白質至膜用於易位所必需的全部信息。
雖然對枯草芽孢桿菌中的分泌不如對大腸桿菌中的分泌了解清楚，但一般假設其具有相同的機制(Saier, M. H.，Jr.，Werner, P. K.和 Muller, Μ. 1989, Microbiol. Rev 53 333-366 ；Overhoff, B.，Klein, M.，Spies, M.和 Freudl, R.，1991, Mol. Gen. Genet. 228 417-423)。兩類分泌蛋白之間的一個差異是其信號肽的長度，在革蘭氏陽性菌中傾向於比相應的革蘭氏陰性菌的對應物的長多達20個胺基酸。因此，在革蘭氏陽性生物(例如枯草芽孢桿菌)中表達異源蛋白質的一般對策涉及匹配靶蛋白與宿主的分泌裝置(Mountain， A. , 1989, Bacillus, C. Harwood 編著，Plenum Press, New York, 73-114)。使用上述技術的標準規程是本領域已知的，用於通過枯草芽孢桿菌過表達重組天冬醯胺酶。
實施例1-培養絨狀火燕
在使用前高壓滅菌所有的培養基和設備，在整個過程中使用標準的無菌技術。絨狀火菇種植在標準瓊脂平板(30. Og L—1葡萄糖單水合物；4. SgL—1天冬醯胺單水合物；1. 5g L-1 KH2PO4 ；0. 5g L-1 MgSO4 ；3. Og L—1 酵母提取物；15. Og L—1 瓊脂；1. OmL L—1 痕量金屬溶液，其含有 O. 005g L-1CuSO4 · 5H20、0, 08g L-1 FeCl3 · 6Η20、0· 09g L-1 ZnSO4 · 7Η20、0· 03g L-1MnSO4 · H2O,以及0. 4g Γ1 EDTA)上。在滅菌前，用IM NaOH調節培養基的pH至pH6。
在IOOmL無菌的標準營養溶液中，使用 Ultra Turrax (Miccra D-9, Art, MillIheim, Germany)均化IOxlOmm瓊脂塞子(agar plug)和絨狀火燕的菌絲體,製備預培養物。將浸沒的培養物保持在24°C和150rpm。培養5天後，將50ml預培養物轉移到分別由基本培養基(1. 5g L-1KH2PO4 ；0. 5g L-1 MgSO4 ；1. Oml L-1 痕量金屬溶液)和 40g L-1 谷蛋白或 IOmM 穀氨醯胺組成的250ml主培養基中。
實施例2-從絨狀火菇製備酶
培養18天後，過濾培養物，將含有胞外酶的上清液(200mL)逆向發泡 (reverse-foamed),天冬醯胺酶和另一種蛋白質是留在上清液中的僅有蛋白質。使用超濾 (MWC0 10,000)濃縮剩餘的液體,通過Superose6的尺寸排阻層析分離兩種蛋白質。
回收了大部分最初存在的水解活性，表明該方法僅通過2步就產生了有效的酶濃縮液。
實施例3-使用天然酶水解L-天冬醯胺
在37°C 預熱 100 μ L 在 O.1M Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 緩衝液(pH 7. O)中的 IOmM 天冬醯胺 5min。加入50 μ L酶溶液開始反應。在熱振蕩器(thermoshaker)中37°C和400rpm孵育 20min的時間後，通過加入20 μ LTCA終止測定。進行沒有底物的對照實驗。在OPA-衍生後，用HPLC定量測量天冬氨酸的含量，然後使用樣品和對照之間的差異計算酶活性。·
分析學證據指示了底物L-天冬醯胺的快速酶促水解。
實施例4-使用天然酶水解L-穀氨醯胺
在37°C 預熱 100 μ L 在 O.1M Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 緩衝液(pH 7. O)中的 IOmM 穀氨醯胺 5min。加入50 μ L酶溶液開始反應。在熱振蕩器中37°C和400rpm孵育20min的時間後，通過加入20 μ L TCA(三氯乙酸)終止測定。進行沒有底物的對照實驗。在OPA-衍生後，用 HPLC定量測量穀氨酸的含量，使用樣品和對照之間的差異計算酶活性。
這一分析學證據表示天冬醯胺酶對底物L-穀氨醯胺的有用的副活性。
實施例5-使用重組酶水解L-天冬醯胺
在37°C 預熱 140 μ L 在 O.1M Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 緩衝液(pH 7. O)中的 IOmM 天冬醯胺 5min。加入10 μ L用水稀釋200倍的重組酶溶液開始反應。在熱振蕩器中37°C和400rpm 孵育IOmin的時間後，通過在95°C加熱IOmin終止測定。進行沒有底物的對照實驗。在 OPA-衍生後，用HPLC定量測量天冬氨酸的含量，使用樣品和對照之間的差異計算酶活性。 重組天冬醯胺酶對天冬醯胺的活性計算為43. 3kU L'
實施例6-用重組酶水解L-穀氨醯胺
在37°C 預熱 140 μ L 在 O.1M Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 緩衝液(pH 7. O)中的 IOmM 穀氨醯胺 5min。加入用水稀釋200倍的10 μ L重組酶溶液開始反應。在熱振蕩器中37°C和400rpm 孵育IOmin的時間後，通過在95°C加熱IOmin終止測定。製備沒有底物的空白。在OPA-衍生後，用HPLC定量測量穀氨酸的含量，使用樣品和對照之間的差異計算酶活性。重組天冬醯胺酶對穀氨醯胺的活性計算為4. 3kU L—1。
本發明詳述如上，應理解詳細的說明並非意在限制其發明的範圍。下列權利要求中提出了希望專利許可保護的 內容。
權利要求
1.可自擔子菌獲得的天冬醯胺酶。
2.權利要求1的天冬醯胺酶，其中擔子菌是擔子菌絨狀火燕(Flammulinavelutipes)。
3.具有下述胺基酸序列的天冬醯胺酶MKSFALFVPL IVAAVVNSAV VTFSTGLGCN SVSQTYRGNG NFCADPPGDffSSVGFSEIGG DNRVTVHNQN SCTPASQVGQ GFGPACffNQG ATKLRSAffVACPGQRLAENG TIVDDDGAFI DFA。
4.任一項上述權利要求的天冬醯胺酶，其處於固體、液體或介於固體和液體之間的中間體的形式。
5.任一項上述權利要求的天冬醯胺酶和賦形劑的組合，所述賦形劑選自乳糖、甘油或白蛋白之任一。
6.用於水解至少一種L-天冬醯胺或L-穀氨醯胺的方法，包括 -用權利要求1至5的任一項的天冬醯胺酶處理包含至少一種L-天冬醯胺或L-穀氨醯胺的物質。
7.權利要求6的方法，其中包含至少一種L-天冬醯胺或L-穀氨醯胺的物質是至少一種可被人消耗的產物或可被動物消耗的產物。
8.權利要求6至7的任一項的方法，其中物質選自飲料、可可豆、乳酪、咖啡豆、糖果、甜點、生麵團、調料、油炸馬鈴薯、酒、肉製品、藥物添加物、營養添加物、寵物食品、薯片、調味料、小食或湯的至少一種。
9.用於降低包含L-天冬醯胺的食品物質中的丙烯醯胺形成的方法，包括 -向包含L-天冬醯胺的食品物質應用權利要求1至5的任一項的天冬醯胺酶；和 -加熱包含L-天冬醯胺的物質。
10.權利要求9的方法，其中加熱至至少120°C。
11.權利要求9至10的任一項的方法，其中L-天冬醯胺的來源是至少一種可被人消耗的產物或可被動物消耗的產物。
12.通過權利要求6至11的任一項的方法可獲得的產物。
全文摘要
源自真菌擔子菌的天冬醯胺酶，特別地擔子菌是絨狀火菇(Flammulinavelutipes)。用於水解至少一種L-天冬醯胺或L-穀氨醯胺的方法。還描述了用於降低包含L-天冬醯胺的物質中的丙烯醯胺形成的方法。
文檔編號C07K14/00GK103003297SQ201180034717
公開日2013年3月27日 申請日期2011年4月6日 優先權日2010年7月14日
發明者P·貝倫茨, S·拉貝, R·G·伯格, D·林克, N·艾澤勒 申請人:雀巢產品技術援助有限公司