使用補體C5a受體調節劑治療神經系統病症的製作方法

2023-05-27 14:30:06 1

專利名稱:使用補體C5a受體調節劑治療神經系統病症的製作方法
發明領域本發明涉及使用具有調節C5a受體活性的能力的新的環狀多肽以及肽模擬化合物治療神經系統病症。所述化合物優選作為C5a受體的拮抗劑，以及對多形核白細胞、單核細胞、淋巴細胞和/或巨噬細胞上的C5a受體是活性的。在本發明的優選的實施方式中，神經系統病症是神經退行性疾病(neurodegenerative disease)、神經免疫失調、由血腦屏障功能異常引起的疾病以及中風。
發明背景所有引用文獻包括任何專利或專利申請，在此引入說明書作為參考。不經允許，任何引用的文獻不構成現有技術。所述參考文獻的論述表明了作者要求以及申請人保留對所述引用文件的準確性以及相關性提出異議的權利。很容易理解，雖然在此引用了一些現有技術出版物，但這種參考並非承認任何這些文獻構成了在澳大利亞或任何其它國家的所述技術領域：
中公共常識的一部分。
G蛋白偶聯受體在人體內普遍存在，包括已知細胞受體類型的大約60％，並介導非常廣泛範圍的內源性配體的跨細胞膜信號轉導。它們參與多種類型的生理和病理生理過程，包括但不限於與心血管、中樞和周圍神經系統、生殖、新陳代謝、消化、免疫、炎症和生長失調相關的過程，以及與其它的細胞調節和增殖失調相關的過程。選擇性調節G蛋白偶聯受體功能的物質具有重要的治療性應用。由於這些受體在信號轉導中的極其重要的作用，因此逐漸地認識到它們可以作為重要的藥物靶位(G protein-coupledReceptors，IBC Biomedical Library Series，1996)。
研究最深入的G蛋白偶聯受體之一是C5a受體。C5a是已知最有效的趨化劑之一。它具有多種活性，包括(a)募集嗜中性粒細胞和巨噬細胞到損傷位點；(b)改變嗜中性粒細胞和巨噬細胞的形態；(c)誘導嗜中性粒細胞脫粒；(d)增加鈣轉移、血管通透性(浮腫)和嗜中性粒細胞粘附；(e)誘導平滑肌收縮；(f)刺激炎性介質的釋放，包括組胺、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、前列腺素和白細胞三烯；(g)刺激溶菌酶釋放；(h)促進氧自由基的形成；和(i)增強抗體產生(Gerard and Gerard 1994)。
限制C5a的促炎症作用的物質具有抑制急性和慢性炎症以及其伴隨的疼痛和組織損傷的潛在作用。因為這種化合物作用於上述多種炎症介質的上遊，而且抑制許多這些介質的形成，比那些直接抑制這些介質或其受體活性的物質在減輕或預防炎症症狀可能具有更有效的效果。
我們在先前的申請No.PCT/AU98/00490中描述了一些人C5a的C-末端類似物的三維結構，而且利用這些信息來設計結合人C5a受體(C5aR)的新化合物，其作為C5a的激動劑或拮抗劑。以前認為對於受體結合和拮抗劑活性，假定的拮抗劑可能既需要C末端精氨酸和C末端羧化物。實際上，我們示出對於高親和力結合C5aR或者對於拮抗劑的活性而言，末端羧化物基團通常不是必需的。而我們發現了一個迄今沒有認識到的結構特徵，一個轉角構象，是高親和力結合嗜中性粒細胞上的人C5a受體的關鍵識別特徵。如在我們的國際申請PCT/AU01/01427中所述，我們利用這些發現來設計能夠使疏水基團裝配成與C5a受體相互作用的疏水陣列的約束性結構模板(constrained structural template)。這些說明書的全部公開內容在此併入參考。
運動失調構成了一個嚴重的健康問題，尤其是在老年人中。這些運動失調經常是大腦損傷或神經退行性病症的結果。涉及基底神經節、導致運動失調的失調包括帕金森氏病(parkinson’s disease)、阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、亨廷頓氏舞蹈病(Huntington’s chorea)和威爾遜疾病Wilson’s disease)。而且，運動障礙經常是由大腦局部缺血和其它神經紊亂的後遺症。
神經退行性病症是慢性進行性病症，通常伴有運動和/或認知能力的明顯下降。一些疾病，如阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏舞蹈病、額顳性痴呆(皮克病(Pick’s disease))、Lewy體形成痴呆(dementia with Lewy bodyformation)、帕金森氏病、朊病毒相關病症如克-雅二氏病和新變異的克-雅二氏病、和肌萎縮性脊髓側索硬化(ALS；亦稱Lou Gehrig’s病)與蛋白在大腦內的聚集沉積有關。其它的，如多發性硬化，涉及自身免疫機制。由創傷、感染、先天性代謝缺陷、腦出血或腦血栓引起的腦損傷是嚴重殘疾的非常常見原因，所述殘疾包括麻痺和/或認知缺損。運動神經元疾病包括一組嚴重的神經系統失調，每種失調的特徵在於運動神經元的進行性退化。運動神經元疾病可能影響上運動神經元，其介導著從大腦到髓質或到脊髓的傳導，和/或下運動神經元，其介導著從脊髓到機體肌肉的傳導。痙攣和過度反射表明了對上運動神經元的損害。那些喪失其神經分布的進行性萎縮和肌無力表明了對下運動神經元的損害。這組中的病症包括肌萎縮性脊髓側索硬化；進行性延髓性麻痺；包括幼兒型和青少年型的脊髓性肌萎縮；庫-韋二氏綜合症；杜興氏麻痺；韋-霍二氏病；和良性病灶肌萎縮(benign focal amyotrophy)。所有這些病症都非常痛苦，不僅治療的選擇受到限制並且非常昂貴，而且現行沒有有效的治療方法。因此急需改善這些病症的治療方法，尤其是發展更多有成本效益的治療方法。
一類少見的遺傳失調，多聚穀氨醯胺重複疾病家族(polyglutaminerepeat disease family)，表現出稱為早現遺傳(anticipation)的現象，其中父母可能沒有表現出症狀，但是他們孩子的50％發展出所述疾病。這個家族包括亨廷頓舞蹈病及其它神經退行性疾病，包括脊髓和延髓肌萎縮、脊髓小腦性共濟失調的若干形式、和齒狀紅核蒼白球路易斯核萎縮(dentatorubral pallidoluysian atrophy)。這些病症特徵在於特定基因中的三核苷酸重複，其在相應蛋白中編碼多聚穀氨醯胺序列，該蛋白導致不可溶聚集物形成；但是，上述起因蛋白在其它方面是無關的，而且沒有已知功能。所述蛋白聚集物誘導病理學的機制仍不清楚。
亨廷頓舞蹈病的症狀包括舞蹈病(由運動協調喪失而引起的胳膊和腿的急跳運動)、語言、舌咽、專注及記憶困難以及精神病學症狀如抑鬱。在每下一代，發病年齡下降，疾病嚴重程度增加。
亨廷頓舞蹈病的特徵蛋白，亨廷頓蛋白(hungtingtin)沒有已知功能。編碼亨廷頓蛋白的基因的第一個外顯子含有一系列能夠在代與代之間自然擴增的三核苷酸CAG(穀氨醯胺)重複序列。如果所述擴增超過35個重複這一臨界值，就會破壞亨廷頓蛋白的正常功能。導致的神經毒性作用殺死大腦皮層和紋狀體神經元，對記憶、高級認知功能、和運動協調產生災難性的作用。可以觀察到特徵性紋狀體損傷。
所有人都攜帶該基因，但是如果所述三核苷酸重複數在5和35之間，那就沒有影響；但是，超過這個數值，該基因就變得不穩定，就會自然擴增。該重複數與發病年齡非常相關；在200個重複時，1或2歲的兒童就可能會有症狀出現，而這些孩子會在孩童時期早期死去。與此相比，具有35到39個重複的個體並不總是發展成失調，而且其中趨向出現所述疾病的人群也在生命晚期出現。如果該缺損基因是父性遺傳，則就會較早地發展成失調而且很快會變得嚴重。
甘迺迪病(Kennedy disease)(脊髓和延髓肌萎縮)大約影響著每50,000個人中的1個，是這種疾病家族的另一個成員，而且起因於導致雄激素受體蛋白中多聚穀氨醯胺重複或擴增的突變(La Spada，1991)。所述疾病，在人類中是X-連鎖的，通常在男性40幾歲時發生，而且導致運動神經元喪失、肌萎縮和睪丸病變。已經表明結合雄激素受體的睪酮可能在控制所述疾病進程中起重要作用。女性具有顯著較少的循環睪酮，這可能影響了神經變性比率。
帕金森氏病的四種典型症狀是顫動、僵直、行動不能和體位改變。帕金森氏病還通常伴隨著抑鬱、痴呆和總體認知下降。帕金森氏病發病率為總人口數的1/1,000，而年齡超過60歲時發病率增加到1/100。黑質中多巴胺能神經元的退化和隨後的紋狀體中多巴胺間質濃度的降低對帕金森氏病的發展很關鍵；在臨床症狀顯示之前，大約80％的來自黑質的細胞要被破壞。
目前治療帕金森氏病的策略是基於遞質替代治療(L-二羥苯乙酸(L-多巴))、抑制單胺氧化酶(如Deprenyl)、多巴胺受體激動劑(如溴麥角環肽和阿撲嗎啡)及抗膽鹼能藥(如benztrophine和鄰甲基苯海拉明)。但是，這些療法，特別是遞質替代治療，並不能達到穩定的臨床效果。長期的遞質替代治療之後會出現「開關」症狀，而且這種療法還會帶來手足徐動症和舞蹈病的不隨意運動、噁心和嘔吐。此外，目前的療法還不能治療潛在的神經退行性失調，所以儘管患者接受治療但仍表現出持續的認知下降。
儘管在該技術領域：
近來有所進展，但仍需要對運動失調、尤其是亨廷頓舞蹈病和帕金森氏病以及神經退行性病症如ALS的改良治療方法。特別地，需要減少給藥次數而降低和/或減少嚴重副作用、和/或控制或逆轉潛在的神經退行性失調的有效療法。
雖然，普遍認為炎症機制可能涉及許多神經退行性病症的發病機理，所述病症包括亨廷頓舞蹈病、額顳性痴呆(皮克病)、多發性硬化、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病和年齡相關神經變性(痴呆)以及由中風或創傷引起的急性腦損傷，而較少注意到這些病症中補體的可能作用。亨廷頓舞蹈病、額顳性痴呆(皮克病)和阿爾茨海默氏病中補體激活作用已有研究，而且已知所述補體成分在正常和病變大腦裡都廣泛表達。已經在亨廷頓舞蹈病患者的大腦中檢測到所述補體途徑的一些成分上調，所述成分包括補體激活劑C1r、C4和C3、補體調節劑C1抑制劑、叢生蛋白(clusterin)、MCP、DAF和CD59和所述過敏毒素C3a和C5a的受體。已表明在所述亨廷頓舞蹈病尾核的神經元中聚集的亨廷頓蛋白突變體可能與C1q結合，於是引發了經典的補體途徑的激活(Singhrao et al et al，1999)。
但是，迄今沒有證據表明C5a受體的抑制劑，特別是這種受體的低分子量拮抗劑可以用於治療涉及炎症的神經性或神經退行性病症。
發明概述我們現在驚奇的發現C5a受體的低分子量拮抗劑，一種小的環肽，能夠預防或減輕由新陳代謝-局部缺血誘導的神經元細胞死亡動物模型中的神經損傷。這種動物模型作為模型系統用於多種神經系統病症，尤其是與紋狀體損害有關的病症。我們還在ALS動物模型中證明了存活率提高和延遲運動機能喪失。
第一方面，本發明提供了一種治療涉及炎症的神經性或神經退行性病症的方法，包括給需要這種治療的患者施用有效量的C5a受體抑制劑的步驟。優選的所述病症是與補體途徑活性增加有關的病症。
優選的抑制劑是一種化合物，其(a)是C5a受體的拮抗劑，(b)基本上沒有激動劑活性，和(c)是一種式I所示的環肽或肽模擬物化合物
其中A是H、烷基、芳基、NH2、NH-烷基、N(烷基)2、NH-芳基、NH-醯基、NH-苯甲醯基、NHSO3、NHSO2-烷基、NHSO2-芳基、OH、O-烷基、或O-芳基。
B是烷基、芳基、苯基、苯甲基、萘基或吲哚基團、或如L-苯丙氨酸或L-苯基甘氨酸的D-或L-胺基酸的側鏈，但不是下列物質的側鏈甘氨酸、D-苯丙氨酸、L-同型苯丙氨酸、L-色氨酸、L-同型色氨酸、L-酪氨酸、或L-同型酪氨酸。
C是一種小取代基，如D-、L-或同型胺基酸如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、或硫代脯氨酸的側鏈，但優選不是如異亮氨酸、苯丙氨酸或環己基丙氨酸的大取代基。
D是中性D-胺基酸的側鏈，所述中性D-胺基酸如D-亮氨酸、D-同型亮氨酸、D-環己基丙氨酸、D-同型環己基丙氨酸、D-纈氨酸、D-正亮氨酸、D-同型-正亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-四氫異喹啉、D-穀氨醯胺、D-穀氨酸、或D-酪氨酸，但優選D不是如甘氨酸或D-丙氨酸側鏈的小取代基、如D-色氨酸的大平面側鏈或如D-精氨酸或D-賴氨酸的大的帶電側鏈。
E是大取代基，如選白L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-同型色氨酸的胺基酸的側鏈，或是L-1-萘基或L-3-苯並噻吩基丙氨酸(L-3-benzothienylalanine)，但不是下列物質的側鏈D-色氨酸、L-N-甲基色氨酸、L-同型苯丙氨酸、L-2-萘基L-四氫異喹啉、L-環己基丙氨酸、D-亮氨酸、L-芴基丙氨酸(L-fluorenylalanine)、或L-組氨酸；F是L-精氨酸的側鏈、L-同型精氨酸的側鏈、L-瓜氨酸的側鏈、或L-刀豆氨酸的側鏈、或其生物異構體(bioisostere)的側鏈，即其中保留末端胍或脲基團的側鏈，但所述的碳主鏈被具有不同結構的基團取代，但其側鏈整體上如母基團(parent group)那樣與靶蛋白反應；以及X是-(CH2)nNH-、或(CH2)n-S-，其中n是從1到4的整數，優選2或3；-(CH2)2O-；-(CH2)3O-；-(CH2)3-；-(CH2)4-；-CH2COCHRNH-；或-CH2-CHCOCHRNH-，其中R是任何常見或不常見胺基酸的側鏈。
在C中，所述羥脯氨酸和硫代脯氨酸的順式和反式形式都可以使用。
優選A是乙醯胺基團、氨甲基、或者取代的或未被取代的磺胺基團。
優選其中A是取代的磺胺，所述取代基是1到6、優選1到4個碳原子的烷基鏈，或是苯基或甲苯甲醯基團。
在一個特別優選的優選方案中，所述化合物具有針對C5aR的拮抗劑活性，並且基本上沒有C5a激動劑活性。
所述化合物優選是位於人和哺乳動物細胞上的C5a受體的拮抗劑，包括但不限於人多形核白細胞、單核細胞、淋巴細胞和巨噬細胞。所述化合物優選有效地和選擇性地結合C5a受體，更優選在亞微摩爾濃度時具有有效的拮抗劑活性。更優選所述化合物具有IC50＜25μM的受體親合力，和IC50＜1μM的拮抗劑效能(potency)。
最優選所述化合物是國際專利申請號為PCT/AU02/01427中描述的化合物1(PMX53；AcF[OP-DCha-WR])、化合物33(PMX273；AcF[OP-DPhe-WR])、化合物60(PMX95；AcF[OP-DCha-FR])或化合物45(PMX201；AcF[OP-DCha-WCit])，或HC-[OPdChaWR；(PMX205)或HC-[OPdPheWR](PMX218)。圖1中描述了這些環肽的結構。
在一個優選的實施方案中，所述化合物能夠穿過血腦屏障。在一個特別優選的實施方案中，所述化合物是PMX205或PMX53。
在本發明一個優選形式中，所述病症是與紋狀體損傷和/或多聚穀氨醯胺重複有關的神經退行性病症。
在本發明這種形式中，所述病症更優選自亨廷頓舞蹈病、脊髓和延髓肌萎縮、脊髓小腦性共濟失調、齒狀紅核蒼白球路易斯核萎縮、紋狀體損傷、和與I型戊二醛酸尿有關的急性紋狀體壞死。
在本發明另一優選形式中，所述病症是運動神經元疾病，如肌萎縮性脊髓側索硬化；進行性延髓麻痺；脊髓性肌萎縮，包括幼兒型和青少年型；庫-韋二氏綜合症；杜興氏麻痺；韋-霍二氏病；和良性病灶肌萎縮。
在本發明第三個優選形式中，所述病症是涉及神經變性和/或缺血性損傷的失調，包括但不限於帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、威爾遜疾病、和由大腦局部缺血和其他神經紊亂引起的後遺症，包括與血腦屏障功能紊亂有關的疾病。已知紋狀體區域是大腦最常受中風影響的區域，3-NP模型是中風的有用模型，因為3-NP誘發大腦缺氧。特別感興趣的帕金森型病症是帕金森氏病、藥物誘發的帕金森氏症候群(Parkinsonism)、腦炎後帕金森氏症候群、中毒(例如MPTP、錳或一氧化碳)誘導的帕金森氏症候群和外傷後帕金森氏病(拳擊醉酒樣綜合症(punch-drunk syndrome))。其它治療可能有效的運動失調包括進行性的核上性麻痺、亨廷頓舞蹈病、多系統萎縮、皮質基底退化、威爾遜疾病、哈-斯二氏病(Hallervorden-Spatzdisease)(伴有大腦鐵累積的神經變性)、進行性蒼白球萎縮、多巴-應答性張力障礙-帕金森氏綜合症(Dopa-responsive dystonia-Parkinsonism)、僵直、阿爾茨海默氏病及其他導致異常運動或體位的基底神經節失調。
所述抑制劑可以和其它治療這些病症一或多種藥物聯合使用。例如，包括海藻糖、copaxone、短的單鏈寡核苷酸、肌酸、二甲胺四環素和組蛋白去乙醯化酶抑制劑的多種藥物已經表明可以用於治療亨廷頓舞蹈病。Riluzone，一種穀氨酸途徑拮抗劑，被批准用於治療ALS，並且肌酸、重組人IGF-1和睫狀神經營養因子都處在治療這種病症的臨床試驗階段。最近表明可以通過抑制異常的SOD1基因來治療ALS的家族性形式，該療法使用RNA幹涉組合基因療法導入正常的SOD1基因(Raoul et al.，2005；Ralphet al.，2005)。但是，這種方法很可能多年後才能到臨床應用。抗雄激素藥物亮丙瑞林(leuprorelin)正處於治療脊髓和延髓肌萎縮的試驗階段(Katsunoet al，2003)。遞質替代物L-二羥苯乙酸(L-多巴)、單胺氧化酶抑制劑如Deprenyl、多巴胺受體激動劑如溴麥角環肽和阿撲嗎啡及抗膽鹼能藥如benztrophine和鄰甲基苯海拉明目前已用於治療帕金森氏病。
本發明的組合物可以配製為口服、腸胃外、吸入、鼻內、直腸或經皮使用，但優選口服或腸胃外製劑。預期本發明的化合物如果不是全部至少大多數在存在新陳代謝酶如腸道、血液、肺部或細胞內酶的情況下是穩定的。本領域技術人員可以通過已知常規方法容易地檢測這種穩定性。
任選地，所述製劑可包括促進所述化合物轉移穿過血腦屏障的物質或載體。一些這種物質在本領域中是已知的，例如甘露醇這樣的滲透活化物質。
適合通過任何所需途徑給藥的製劑可以通過標準方法來製備，例如通過參考熟知的教科書如RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy、Vol.II，2000(20thedition)，A.R.Gennaro(ed)，Williams Wilkins，Pennsylvania。
同時本發明並不以任何方式局限於任何特定動物或物種的治療，特別期待本發明的方法可以用於人類醫學治療，而且用於獸醫治療，尤其群居動物如貓和狗，牲畜如牛、馬和羊，和動物園動物，包括非-人靈長類動物、大型牛科動物、貓科動物、有蹄類動物和犬科動物。
所述化合物可以任何適合的劑量和通過任何適合的途徑來施用。優選口服、經皮或鼻內給藥，因為這些途徑更方便並且更容易接受。有效劑量取決於所要治療病症的性質，和治療個體的年齡、體重和潛在的健康狀況。這些可以按照主治醫師或獸醫師的意見自行判斷。適合的劑量水平可以通過本領域內熟知的方法通過試錯法實驗容易地確定。
圖1顯示了本發明優選化合物的結構。
圖2顯示了PMX53在3-NP大鼠模型上的效果的試點研究結果。
A體重變化；B食物消耗；C神經學/行為學得分；D假操作(A)、未治療(B)和PMX53-治療(C)的大鼠紋狀體的典型甲苯紫(cresyl violet)染色切片，顯示在該區域內的壞死程度。
圖3顯示了經口服填餵法施用PMX53或對照藥物的實驗結果。
A第7天體重變化；B第7天食物消耗；C神經學/行為學得分；D假操作(A)、未治療(B)、PMX53治療(C)和PMX205治療(D)第7天的大鼠紋狀體的典型甲苯紫染色切片，顯示在該區域內的壞死程度。
圖4顯示了實施例2的深入研究所獲得的結果。
A第7天體重變化；B第7天食物消耗；C神經學/行為學得分；D通過分析大鼠大腦的尼氏染色切片而測定的病變大小。
圖5顯示了來自實施例2中的大鼠大腦切片的組織學和組織化學檢驗結果。
(a)蘇木精和伊紅染色(b)萘基酯酶染色
(c)TUNEL染色用於檢測凋亡。
圖6顯示了來自實施例2中的大鼠大腦切片的免疫組織化學檢驗結果圖7顯示本發明的化合物在ALS轉基因大鼠模型中的治療效果。
(a)運動機能喪失發作時間(b)百分比存活率(c)顯示了每組中相對於時間運動症狀出現的大鼠百分比(d)在首次體重減輕和運動症狀出現之間的延遲。
圖8顯示了i.v.注射後本發明化合物在大腦中的水平。
發明詳述本發明通過參考下列常規方法和實驗性實例來描述。
關於本說明書應當清楚地理解「包含」意思是指「包括但不限於」。
本文中使用的單數形式的「一」和「該」包括複數形式，除非本說明書的上下文清楚地規定了其它意思。因此，例如，提及″一種酶″包括這種酶的複數，和提及″一種胺基酸″是指一或多種胺基酸。
當表示一個數值範圍時，應清楚地理解這個範圍涵蓋了所述範圍的上下限，和介與這些界限內的所有數值。
除非另外限定，本文中使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬技術領域：
的技術人員所理解的相同意思。雖然任何與本文中描述相似或等同的材料和方法可以用於實施或試驗本發明，而這裡描述的是優選的材料和方法。
本文中使用的簡寫如下C5aR C5a受體Cit 瓜氨酸dCha D-環己胺Dphe D-苯丙氨酸
IL-6 細胞介素-6ip 腹膜內i.v. 靜脈內LPS 脂多糖MPO 髓過氧化物酶3-NP 3-硝基丙酸PBS 磷酸鹽緩衝液PMN 多形核粒細胞PMSF 苯甲基磺醯氟po 經口sc 皮下TdT 末端脫氧核苷酸轉移酶TNF-α 腫瘤壞死因子-α本說明書全部使用通用的單字母和三字母代碼來表示胺基酸。
用於本說明書目的，術語″烷基″是指直鏈的、支鏈的、或環狀的、取代的或未被取代的1到6個、優選1到4個碳的烷基鏈。最優選的烷基是甲基。術語″醯基″是指取代的或未被取代的的1到6個、優選1到4個碳原子的醯基。最優選的醯基是乙醯基。術語″芳基″是指取代的或未被取代的同型環狀或雜環芳基，其中優選所述環具有5元或6元。
″常見″胺基酸是選自由甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、天冬醯胺、穀氨酸、穀氨醯胺、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、賴氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和組氨酸的L-胺基酸。
″非常見「胺基酸包括但不限於D-胺基酸、同型-胺基酸、N-烷基胺基酸、去氫胺基酸、不是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的芳香族胺基酸、鄰-、間-或對-氨基苯甲酸、鳥氨酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、正亮氨酸、γ-穀氨酸、氨基丁酸、L-芴基丙氨酸、L-3-苯並噻吩基丙氨酸和α，α-雙取代的胺基酸。
通常，本文中使用的術語″治療″等是指作用於個體、組織或細胞以獲得所需的藥理學和/或生理學效果。所述效果可以是預防性的即完全或部分預防疾病或其病徵或症狀，和/或可以是治療性的即部分或完全治癒疾病。
本文中使用的″治療″涵蓋脊椎動物、哺乳動物、尤其是人中疾病的任何治療或預防，並且包括預防所述疾病在易感所述疾病的個體上發生，但還沒有被診斷出具有所述疾病；抑制所述疾病，即停滯其進展；或減輕或改善所述疾病的影響，即引起所述疾病影響的消退。
本發明包括用於改善所述疾病的多種藥物組合物的應用。本發明一個實施方案的所述藥物組合物由具有式I的化合物、其類似物、衍生物或鹽和一或多種藥學上有活性的物質製備、或式I的化合物和一或多種藥學上有活性的物質組合來製備成適合於施用給個體的形式，使用載體、賦形劑和添加劑或輔劑(auxiliary)進行。
經常使用的載體或輔劑包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇及其他糖類、滑石粉、牛乳蛋白質、明膠、澱粉、維生素、纖維素及其衍生物、動植物油、聚乙二醇和溶劑，如無菌水、醇、甘油和多元醇。靜脈內載體包括流體和營養補充物。防腐劑包括抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。其他藥學上可接受的載體包括水溶液、無毒的賦形劑，包括鹽、防腐劑、緩衝液等等，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，20th ed.WilliamsWilkins(2000)和The British National Formulary 43rd ed.(British MedicalAssociation and Royal Pharmaceutical Society ofGreat Britain，2002；http://bnf.rhn.net)中所述，其內容在此併入參考。根據本領域的常規技術可以調節所述藥物組合物的多種成分的pH值和準確濃度。參見Goodman andGilman′s The Pharmacological Basis for Therapeutics(7th ed.，1985)。
優選以劑量單位的方式製備和施用所述藥物組合物。固體劑量單位包括片劑、膠囊、和栓劑。治療個體時，根據所述化合物的活性、給藥方式、所述失調的特點和嚴重程度、個體的年齡和體重，可以使用不同的每日劑量。在一些情況下，還可以適當使用較高或較低的每日劑量。每日劑量的施用既可以單一劑量單位的形式或以幾個較小劑量單位的形式一次施用也可以一定間隔多次施用分劑量(subdivided dose)。
可以局部或全身施用治療有效劑量的本發明的藥物組合物。用於這種使用的有效量當然取決於所述疾病的嚴重程度和個體的體重和綜合情況。典型地，體外使用的劑量可以對用於原位施用所述藥物組合物的量提供指導，並且動物模型可以用來確定所述治療細胞毒性副作用的有效劑量。多種情況描述在如Langer，Science，2491527，(1990)中。用於口服的製劑可以是硬明膠膠囊的形式，其中所述活性成分與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合。同時也可以是軟明膠膠囊的形式，其中所述活性成分與水或油介質如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
水性懸浮液通常含有活性材料，其與適於製備所述水性懸浮液的賦形劑混合。這種賦形劑可以是懸浮劑如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；分散劑或增溼劑，其可以是(a)天然存在的磷脂如卵磷脂；(b)氧化烯與脂肪酸的縮合產物，例如聚氧乙烯硬脂酸；(c)氧化乙烯與長鏈脂肪醇的縮合產物，例如十七乙烯氧基鯨蠟醇(heptadecaethylenoxycetanol)；(d)氧化乙烯與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產物，如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或(e)氧化乙烯與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產物，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯。
所述藥物組合物可以是無菌的可注射含水或含油懸浮液的形式。這種懸浮液可以使用如上述的適合分散劑或增溼劑和懸浮劑根據已知方法配製。所述無菌可注射製品也可以是於非毒性腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如溶劑1，3-丁二醇溶液。所述可以使用的可接受載體和溶劑可以是水、Ringer′s溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌的、不揮髮油類通常可以作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可以使用任何刺激性少的不揮發性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸可以用於注射劑的製備。
式I的化合物也可以以脂質體輸送系統的形式施用，如小單層脂質體，大單層脂質體和多層脂質體。脂質體可以由多種磷脂，如膽固醇、十八胺或磷脂醯膽鹼形成。
本發明式I化合物的劑量水平通常具有大約0.5mg到大約20mg每公斤體重的程度，優選的劑量範圍在大約0.5mg到大約10mg每公斤體重每日(從大約0.5g到大約3g每患者每日)。同載體材料組合用於製備單個劑量的活性成分的量可以變化，依賴於治療的宿主和特定的施用方式。例如，意欲給人口服施用的製劑可含有大約5mg到1g活性化合物和適當並方便量的載體材料，其可以在組合物總數的大約百分之5到95變化。劑量單位形式通常含有介於大約5mg到500mg的活性成分。
然而，應能夠理解對於任何特定患者的特定劑量水平將依賴於多種因素，包括使用的特定化合物的活性、年齡、體重、健康情況、性別、飲食、施用時間、施用途徑、排洩速率、藥物組合和正在接受治療的特定疾病的嚴重程度。
另外，本發明的一些化合物可以與水或常規有機溶劑形成溶劑化物。這種溶劑化物包含在本發明的範疇內。
本發明的化合物可以另外與其它治療性的化合物組合以提供一種有效組合。傾向於包括任何化學上相容的藥學活性物質的組合，只要所述組合併不消除本發明化合物的活性。
一般方法肽合成根據在我們較早的申請No.PCTAU98/00490和No.PCT/AU02/01427中詳細描述的方法製備式I的環肽化合物，所述申請以其全部公開內容併入本文參考。儘管本發明參考相應的線性肽是Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-Trp-Arg的化合物AcF-[OPdChaWR](PMX53)進行特異闡述，但應清楚理解本發明不限於這種化合物。
公開在國際專利申請No.PCT/AU98/00490中的化合物1-6、17、20、28、30、31、36和44和第一次公開在國際專利申請PCT/AU02/01427中的化合物10-12、14、15、25、33、35、40、45、48、52、58、60、66和68-70對位於人嗜中性粒細胞上的C5a受體具有明顯的拮抗劑效力(IC50＜1μM)，最優選PMX205、PMX53和PMX273、PMX201和PMX218。
我們發現迄今為止被檢測的式I的所有化合物都具有廣泛相似的藥理學活性，儘管由於其特定取代基不同導致了每個化合物的物理化學性質、效力和生物利用率多少有所變化。
下面所述的一般測試用於初始篩選候選的G蛋白-偶聯受體的抑制劑，尤其是C5a受體的抑制劑。
藥物製備和製劑如上述合成人C5a受體拮抗體AcF-[OPdChaWR](AcPhe[Orn-Pro-D-環己基丙氨酸-Trp-Arg])，用反相HPLC純化，並通過質譜分析法和質子NMR光譜學完全定性。於蒸餾水中製備用於口服劑型的C5a拮抗劑。
受體結合分析用如前述(Sanderson et al，1995)分離的新鮮人PMN進行分析，使用的緩衝液為50mM HEPES、1mM CaCl2、5mM MgCl2、0.5％牛血清白蛋白、0.1％桿菌肽(bacitracin)和100μM的苯甲基磺醯氟(PMSF)。在4℃進行分析，緩衝液、未標記的人重組C5a(Sigma)或測試肽、由Hunter/Bolton方法製備的標記125I-C5a(～20pM)(New England Nuclear，MA)和PMN(0.2×106)依次加入到具有終容積為200μL/孔的Millipore Multiscreen分析平板(HV0.45)上。在4℃溫育60分鐘後，過濾所述樣品並用緩衝液洗滌平板一次。對濾膜進行乾燥，穿孔並用LKBγ計數器計數。通過含有1mM肽或100nM C5a來評估非特異性結合，其典型導致10-15％的總結合。
用Dunnett post-test使用非線性回歸和統計學分析數據。
針對拮抗劑活性的髓過氧化物酶釋放分析如前述(Sanderson et al，1995)分離細胞並與細胞鬆弛素B溫育(5μg/mL，15分鐘，37℃)。將含有0.15％明膠和測試肽的Hank′s Balanced Salt溶液加入到96孔平板(總體積100μL/孔)中，隨後加入25μL細胞(4×106/mL)。為了評估每種肽拮抗C5a的能力，在37℃下細胞與每種肽溫育5分鐘，隨後加入C5a(100nM)並繼續溫育5分鐘。然後將50μL的磷酸鈉(0.1M，pH6.8)加入每孔中，將平板冷卻到室溫，並在每孔中加入25μL的新鮮的等體積的二甲氧基聯苯胺(5.7mg/mL)和H2O2(0.5 1％)。在10分鐘時加入2％的疊氮化鈉終止反應。在Bioscan 450平板讀數器在450nm處測量吸光度，用對照值(沒有肽存在的情況下)校正，並通過非線性回歸分析。
動物和細胞模型已確定3-硝基丙酸(3-NP)，一種琥珀酸脫氫酶抑制劑，在齧齒動物和靈長類動物中誘導運動、損傷和/或認知作用，這些是亨廷頓舞蹈病的特徵(Brouillet et al，1999；Palfi et al，1996；Blum et al，2001)。3-NP通過產生新陳代謝誘導的缺氧選擇性地在紋狀體區域誘導神經元死亡。此模型用於評價治療亨廷頓舞蹈病及其他病症的候選藥物。因為3-NP誘導選擇性紋狀體損害，提示此系統可以用作急性紋狀體壞死的模型，該症狀常見於患有I型戊二酸尿症的嬰兒中，I型戊二酸尿症是有機酸代謝的先天性障礙(Strauss andMorton，2003)。因為3-NP對於血腦屏障的作用，穀氨酸能興奮毒性(glutamatergic excitotoxicity)、穀氨酸轉運和多巴胺能毒性，表明這是可以用於中風、血腦屏障功能紊亂、神經退行性或神經免疫學紊亂和神經元/膠質細胞死亡研究的有用模型(Nishino et al，2000)。在此模型中紋狀體損害中已經檢測到C3/C4受體的表達(Shimano et al，1995)。
表達SOD1 G93A，一種超氧化物歧化酶1(SOD1)突變體的轉基因大鼠是一種用於ALS的公認模型，其廣泛用於測試候選治療化合物。表達SOD1 G93A的轉基因大鼠在大約115天時出現後肢無力。在這些動物上看到的病理學與在突變體SOD1小鼠模型中觀察到的相似，在疾病後期具有非常明顯的星形膠質細胞穀氨酸轉運蛋白EAAT2的喪失，證明其在ALS病原學中EAAT2功能紊亂的作用。這種轉運蛋白是維持低的胞外穀氨酸水平的主要方式，而其喪失導致胞外穀氨酸增加，引起運動神經元的興奮毒性退化。最早的EAAT2表達變化在運動神經元喪失前檢測到(Howland et al，2002)。
已有兩種亨廷頓舞蹈病的轉基因小鼠模型，一種具有敲入的人亨廷頓蛋白基因115-三核苷酸重複序列(Mangiarini et al，1996)，另一種在其自身亨廷頓蛋白基因內具有敲入的人基因的關鍵的首個外顯子的拷貝。
還描述了一種細胞模型，其中Neuro2a細胞表達截短的N末端亨廷頓蛋白，含有60或150與增強的綠色螢光蛋白融合的穀氨醯胺(Wang et al，1999)。
最近報導了一種用於甘迺迪病(脊髓和延髓肌萎縮)的小鼠模型表現了大部分這種人類疾病的症狀，包括肌無力和不育症(McManamny et al(2002)。
還描述了一種用於脊髓小腦共濟性失調-1小鼠模型(Klement，I.A.et al.Cell95，41-53(1998)。
一般實驗方法除非另有說明，本研究中用於誘導所用3-NP神經毒性的方法與Blum etal(2001；2002)的相似，除了我們使用了42mg/kg/天用7天而不是56mg/kg用5天。簡要地，製備於PBS(0.1 M，pH7.4)中的90mg/mL的3-NP溶液並用5M NaOH調節到pH7.4。將充滿這種溶液的Alzet滲透微泵(model2ML1，輸送10μL/hr，7天)植入12周齡的雄性Lewis大鼠，以便每隻大鼠接受正好42mg/kg/天。
把大鼠放在單獨的籠子裡。用克他命(ketamine)、甲苯噻嗪和唑拉西泮(zolazapam)麻醉這些大鼠。通過肩胛間的切口把泵s.c.插入每隻大鼠的背部，切口用縫合夾(wound clip)閉合。隨後從麻醉中恢復，在隨後7天每天檢測食物攝取、體重和神經系統。還通過對所述組的性質不知情的觀測者，根據一般標準在幾個點進行神經學和行為學評價。
大鼠被分成下面幾組測試組 在3-NP(Day-2)施用之前2天直至實驗結束，在飲用水中施用測試劑及s.c.注射或通過口服填餵法治療假操作組 假操作對照；沒有3-NP未治療組 給予3-NP但沒有其它治療比較組 在飲用水中給予infliximab(在0天以5mg/kg單次i.v.注射)或布洛芬(ibuprofen)(30mg/kg)得分如下肌張力障礙無肌張力障礙 -01條後肢的間歇性肌張力障礙 -1
2條後肢的間歇性肌張力障礙 -2持久性的後肢肌張力障礙 -3步態正常步態 -0不協調的步態和擺動 -1躺臥輕度躺臥 -1(動物側躺著的但當受刺激時顯示出不協調的運動)接近死亡的躺臥 -2籠抓用前爪能抓住籠 -0不能用前爪能抓住籠 -1升高平臺檢測能在平臺停留10秒 -0不能在平臺停留10秒 -1總得分 8完成這些研究後，用甲苯噻嗪和克他命深度麻醉大鼠。然後用大約100mL的亞硝酸鈉溶液灌注大鼠除去血液，隨後用大約400mL的甲醛溶液原位固定大腦。在進行組織學研究之前，小心地摘取大腦並保存在甲醛溶液中至少3天。用甲苯紫給切片染色並用光學顯微鏡檢查。
實施例1PMX53作用的試點研究初步實驗已經表明42mg/kg/天的劑量施用7天可重現的誘導該模型。為了測試PMX53對該模型系統中的作用，進行試點研究。在這個研究中，用PMX53治療的大鼠與假操作和未經治療的對照比較。總共使用了12隻大鼠，如下假操作 2未經治療 5PMX53 5在給予3-NP兩天之前開始以2mg/kg的劑量用飲用水每日施用PMX53。在第0、3、6和8天時s.c.給與這些PMX53-治療動物1mg/kg的劑量，因為它們沒有進食，因此認為它們可能沒有飲水。在隨後的實驗中，通過填餵法給予動物每日劑量，在第2天開始，以避免這種潛在的影響因素。在這個最初實驗中，7天後除去泵並在輕度氟烷麻醉下縫合皮膚，並在隨後7天裡每日檢查所述大鼠。
所述結果顯示在圖2A-2D。這表明未經治療和PMX53治療的大鼠都顯示了體重和食物消耗的下降，隨後恢復，而所述假操作大鼠在所述實驗期間顯示出持續生長(圖2A和2B)。PMX53治療大鼠在5-7天時明顯出現較少的體重減輕(P＜0.05，n＝5；圖2A)，但在5-7天時食物攝取明顯增加(P＜0.05，n＝5；圖2B)。未經治療的大鼠在第4天開始輸注3-NP期間神經學/行為學得分急劇增加，並在第7天時達到峰值，隨後在第12天時減少到稍微提高的水平(即停止輸注後5天)。相比，PMX53治療的大鼠在得分上只略微增加，在第7天又達到峰值，隨後在12天時減少到只稍微提高的水平。PMX53治療大鼠在4-9天時的神經學/行為學得分明顯降低(P＜0.05，n＝5；圖2C)。假治療的大鼠在實驗期間得分上沒有明顯變化。
組織學上，未經治療大鼠的大腦紋狀體切片在這些初步研究顯示出細胞壞死和病變，與前述發表的研究結果一致(圖2D)。然而，PMX53治療的大鼠與對照相比較在所述紋狀體區域顯示出較少的壞死細胞。
因為發現7天後所有的大鼠開始康復，所以在組間出現最大差異期間停止隨後的實驗，即第一個7天後沒有必要除去所述泵。
實施例2使用其它物質比較比較PMX53與式I的另一種化合物，PMX205(氫化肉桂酸-[OpdChaWR](HC-[OPdChaWR])和已知的消炎劑布洛芬和infliximab的作用。大鼠的分組和每組數量如下假操作 4未經治療 6PMX53 4PMX205 4布洛芬 5Infliximab 4通過填餵法每日施用PMX53(10mg/kg/天)和 PMX205(10mg/kg/天)並且用飲用水施用布洛芬(30mg/kg/天)，在給予3-NP兩天之前開始。在0天時以單劑量5mg/kg靜脈內輸注infliximab。
所述結果顯示在圖3A-3D中。圖2A和2B顯示了7天後體重增加和食物消耗的程度與在實施例1中觀察到的相似。對於神經學/行為學得分，PMX53和PMX205都具有針對3-NP的不利作用的顯著保護作用，而infliximab即便有也是很小，並且布洛芬直到5天時才顯示出作用(圖3C)。
如圖3D中所示，未經治療大鼠大腦的紋狀體區域切片的組織學檢查顯示出明顯的細胞壞死和肉眼可見的病變，與在實施例1中觀察到的程度相比更大。用PMX53治療過的大鼠在所述紋狀體區域顯示出較少的壞死細胞，這與實施例1中PMX53-治療大鼠的切片相似。
這個實驗可擴展包括更多動物和本發明的其它化合物，PMX201。另外，通過檢測用Nissl染料染色的大腦切片圖並且使用計算機軟體分析計算病變大小來計算在大腦病變大小。動物的分組如下未經治療 26PMX53 21PMX205 19PMX201 3infliximab 10布洛芬 12所述結果概括在圖4中，並且顯示了所有三種測試的PMX化合物改善了3-NP的不利作用。PMX53和PMX205的作用在所有四個測試參數上都是在統計學顯著的；然而，用PMX201治療的動物數目受所述化合物有效性的限制，因此數目太少不能評估顯著性。因為可以獲得更多的化合物PMX201，所以將重複這部分實驗。
實施例3PMX53類似物的作用如實施例2所述以相同方法測試式I的如下化合物PMX205HC-[OPdChaWR]PMX273AcF-[OPdPheWR]PMX201AcF-[OPdChaW瓜氨酸]PMX218HC-[OPdPheWR]在第2天開始，所有的藥物通過填餵法以10mg/kg/天的劑量施用。如果發現這個劑量是有效的，為了確定劑量-應答關係再檢測3mg/kg/天和1mg/kg/天或更少劑量。還測定了PMX53的劑量-應答關係。
還比較這些物質的作用同infliximab(以5mg/kg的單劑量在0天時靜脈內注射)和通過飲用水給予的布洛芬(30mg/kg)的作用。
實施例4對實施例2的樣品進行組織學和組織化學檢測對實施例2中所用的大鼠腦組織石蠟切片進行蘇木精和伊紅染色並在顯微鏡下檢測。明顯病變周圍和內部的炎性細胞的廣泛侵潤，如圖5a所示，並且這被用萘基酯酶染色的嗜中性粒細胞特異染色所證實，如圖5b所示。
TUNEL(TdT-介導的dUTP缺口末端標記)分析(Gavrieli，Y.，et al.(1992)J.Cell.Biol.119，493)測量核DNA片段化，其是凋亡的一項重要生化標誌。該方法已經用於證明韋-霍二氏病，一種脊髓肌萎縮形式中運動神經元的凋亡(Simic et al，2000)。因此使用標準試劑盒對大腦切片染色以進行TUNEL分析(ApopTag Plus/TUNEL method；Chemicon)。含有感興趣區域大腦紋狀體切片被固定到載玻片上並脫蠟。然後用蛋白酶K(20μg/mL)預處理該切片，並用含有3％過氧化氫的內源過氧化物酶淬滅。然後加入平衡緩衝液，隨後用TdT酶反應1小時。然後洗滌樣品，並加入抗洋地黃毒苷綴合物反應30分鐘。然後加入過氧化物酶底物(二氨基聯苯胺)，並顯色超過6分鐘。然後用0.5％甲基綠復染樣品並用Permount封片。在每個步驟間用PBS(0.1M，ph7.4)洗滌切片。圖5c顯示所述病變明顯含有凋亡細胞。
在所有情況下，用C5a受體拮抗劑PMX53和PMX205的治療完全預防了嗜中性粒細胞滲潤並降低凋亡程度。
實施例5免疫組織化學分析對實施例2的大鼠大腦切片也用針對多種補體成分的特異性抗體染色。一種標準試劑盒(IHC Select；Chemicon)用於染色C3、C9和C5a受體切片。
對於C5a受體(C5aR)染色，初級單克隆抗體，小鼠抗-大鼠C5aR購自HyCult Biotechnology。該抗體已示出特異於大鼠C5a受體(Rothermel et al.，2000)。將含有感興趣區域的大腦紋狀體切片固定到載玻片並脫蠟。用檸檬酸鹽緩衝液(pH6.0)在80℃處理切片40分鐘以暴露抗原。然後用血清阻斷載玻片，隨後用所述初級抗體1∶100稀釋液溫育2小時。然後用3％過氧化氫淬滅內源過氧化物酶，並加入二級抗體(兔抗-小鼠IgG)反應2小時。然後用鏈黴抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶溫育切片，再用二氨基聯苯胺溫育6分鐘，或直到顯色。然後用Permount封片。在每個步驟間用PBS洗滌所有切片。
對於C3染色，兔抗-大鼠C3抗體購自Bethyl Laboratories。該多克隆抗體已經在一定程度上被定性(Julian etal.，1992)。對於C9染色，兔抗-大鼠C9抗血清得自BP.Morgan教授(University of Wales College of Medicine，Cardiff)。該抗體已被完全定性(Linington et al.，1989)。如上述使用這些抗體，除了所述抗體以1∶10濃度溫育並使用山羊抗-兔IgG二級抗體。典型的結果舉例說明在圖6中，顯示C5a受體的染色。暗-染色的細胞可能是激活的小膠質細胞，其表達C5a受體，並發現於所述病變的邊緣。假治療動物則不具備可檢測的染色。
在所述病變的邊緣周圍還觀察到補體成分C3和C9和C5a受體的強烈上調。這表明補體激活和伴隨的C5a受體表達的提高是這一模型病理學的關鍵過程，因此解釋了本發明的C5a受體拮抗劑的明顯治療作用。在不明顯創傷後的這些大鼠大腦中補體的明顯上調，即線粒體局部缺血，其導致細胞死亡，說明大腦中補體激活和上調可能是多種腦創傷，如中風、創傷和神經退行性病症中存在的一種共同途徑。
實施例63-NP模型中的進一步研究假定補體C5a結合上調的腦細胞(神經元和神經膠質)上的C5a受體，並促進炎性細胞浸潤，最後形成病變(腦細胞壞死/凋亡)。在當前進行的實驗中，在整個7天當中在不同時間點檢測這個模型中所用的大鼠，以便觀察大腦中補體激活是否發生在可檢測到明顯的病變之前。
其它研究正在進行以確定C5a拮抗劑是否能夠逆轉病理學。我們目前自3-NP施用開始後2天起將PMX205(10mg/kg/天po)給予大鼠。
紋狀體細胞培養物或來自該紋狀體的大腦切片在體外在3-NP存在的情況下溫育以誘導出細胞損傷。然後加入C5a拮抗劑到該培養物中以評估其預防這種損傷的能力。預期這可以用作初步篩選分析以選擇用於進一步體內測試的候選物質。
實施例7C5a受體拮抗劑在ALS模型中的作用攜帶一個拷貝的突變體SOD-1基因(G63A)的轉基因Sprague-Dawley大鼠購自the Howard Florey Institute for Physiology and Medicine，Melbourne，Australia。這些大鼠自發出現一種急性形式的運動神經元疾病(MND；肌萎縮性側索硬化(ALS))，在大約110-140天齡的時候出現，其與在人類病症中所見非常相似。實際上，G63A突變與10-20％的ALS家族形式的人類患者中所見的是相同的突變。
這提供了一種合適的模型來研究C5a受體拮抗劑的效用。在開始研究中，使用PMX53(n＝6)、PMX205(n＝2)治療雄性大鼠，或者用水單獨處理未經治療的疾病對照組(n＝10)。當這些大鼠70天齡時開始治療。以大約1mg/kg/天的劑量用飲用水施用藥物。包括一組3隻野生型(WT)Sprague-Dawley大鼠(G63)作為假操作組動物。然後每日監測大鼠運動失調跡象，使用下列指標後肢(左肢和右肢的得分)沒有異常明顯肌無力(當抓住尾部時傾斜或顫抖)極端肌無力(不能背屈)肢麻痺步態無異常步態異常，蹣跚等等正位反射(當背部放置時翻正自身的時間)0秒(不能成功地背部放置)＜1秒(或大鼠不能立即翻正自身)＜5秒5-10秒＞10秒 --＞此時安樂死同時每日記錄體重。當正位反應得分達到4時，或比峰值體重減少＞20％時安樂死處死大鼠。
安樂死後，每隻大鼠用鹽水(100mL)灌注，然後用甲醛固定組織。然後切除大腦、脊髓和雙下肢後側腓腸肌肌肉，樣品用於組織學、組織化學和電子顯微鏡檢測。
結果示於圖7。如圖7A所示，自101天齡時未經治療的未治療大鼠開始顯示運動機能喪失的跡象，平均發病年齡在116±4天。用PMX53治療的大鼠平均發病年齡是124±10天，而PMX205治療的大鼠平均發病年齡在138±7天。因此PMX205治療組的發病年齡明顯延遲，並比PMX53治療組發病年齡稍所延長。在大量動物上重複了該實驗證實PMX205的效果。
圖7B顯示不同組大鼠對時間的百分比存活率。而且，兩隻PMX205治療大鼠的死亡率明顯延遲。與未經治療動物相比，PMX53治療組也許有一些小的改善。
圖7C顯示不同組大鼠出現運動症狀對時間的百分比。作為顯示在圖7C中的存活率結果，兩隻PMX205治療大鼠的運動發病明顯延遲。與未經治療動物相比，PMX53治療大鼠也許有一些小的改善。
圖7D顯示了在C5a拮抗劑治療的大鼠中，第一次體重減輕與第一次可見的運動機能喪失之間的間隔時間增加。這個結果尤其在PMX205治療大鼠中更為明顯。這提示藥物治療大鼠存活率的增加可能與疾病進程的延遲有關。
這些結果表明C5a受體拮抗劑在這種轉基因大鼠MND模型中具有治療效果。特別是該數據表明PMX205比PMX53具有更大的效力和/或潛力。在其它疾病模型中同樣觀察到這兩種化合物具有相應趨勢。因此製備大批量的PMX205以在該模型中作進一步研究。
實施例8對用C5a受體拮抗劑治療的轉基因大鼠的組織的研究對實施例7的脊髓和大腦樣品進行組織學分析來測定在脊髓和皮層運動區裡運動神經元的數目，以便確定C5a受體拮抗劑是否減少運動神經元的死亡由此而延長存活率。使用電子顯微鏡技術檢測後肢腓腸肌肌肉終板退化跡象，以便確定C5a拮抗劑是否具有防止肌肉本身退化。如實施例5所述，用針對不同補體成分的抗體包括C5a受體的抗體對切除的脊髓和皮層運動區進行免疫化學染色，以說明補體上調是否與這種疾病的發病機理有關。
實施例9用PMX205治療的時間效果在實施例7裡我們顯示了在預期的疾病症狀出現之前施用C5a受體拮抗劑大約1-2月獲得了有益的效果。雄性SOD-1大鼠(n＝12)組從28天齡時施用PMX205(在飲用水中，1mg/kg/天)，以檢測早期治療是否能夠提高治療應答。
症狀出現後在不同階段檢測施用藥物大鼠的作用，以便看看是否藥物治療可以逆轉活性疾病。
還檢測了雌性大鼠。
實施例10PMX化合物能穿過血腦屏障嗎 為了確定PMX化合物是否能夠穿過血腦屏障，麻醉雌性Wistar大鼠(250-300g)，然後通過股靜脈靜脈內注射3mg/kg的PMX53(AcF-[OPdChaWR])、PMX205(HC-[OPdChaWR])、PMX201(AcF-[OpdChaWCit])或PMX200(HC-[OPdChaWCit])。然後放置大鼠15分鐘，此時自尾部取血進行血漿收集，然後通過心臟穿刺用150mL鹽水灌注大鼠以從大腦中除去血液。然後剖出大腦。製備血漿和大腦樣品用於藥物動力學分析，並測定每個樣品中PMX化合物的水平。結果示於圖8，在大腦中測定的水平表示為血液中水平的百分比。
靜脈施用後15分鐘，所有用PMX化合物治療的大鼠顯示了大腦吸收的程度。施用了PMX53、PMX205或PMX201的大鼠顯示出相似的吸收水平(～7％)，而PMX200顯示出較低程度的吸收。
這些結果表明全身施用後，C5a受體拮抗劑能夠穿過血腦屏障，而且通過瓜氨酸取代去掉該化合物末端精氨酸的正電荷，並不影響吸收。此外，通過用氫化肉桂酸或者瓜氨酸取代來提高PMX化合物的親脂性也不改變吸收。這綜合一致的、相對高水平的PMX化合物的攝取(除了PMX200的例外)可能表明了用於穿過血腦屏障的特異轉運蛋白機制。
通過多種途徑施用(i.v.，i.p.，s.c.，p.o等)後，通過製備詳細的化合物到大腦的藥物動力學吸收圖譜，進一步研究了PMX化合物穿過血腦屏障的吸收。這包括在施用後的不同時間點取樣。在施用該化合物後還在不同時間取腦脊液樣品。大腦取樣之前還檢測了長期地給大鼠施用PMX化合物後所述化合物在大腦中的累積。
實施例11在其它細胞和動物模型中的測試如上所述，為了進一步研究本發明的化合物對亨廷頓舞蹈病的作用，可以使用一種Neuro2a細胞模型用於體外研究和轉基因小鼠模型用於體內研究。小鼠模型已知用於甘迺迪病(脊髓和延髓肌萎縮)和脊髓小腦性共濟失調-1。
使用Neuro2a細胞模型可在體外初步篩選式I的化合物。測試化合物的合適劑量可以使用常規試錯實驗容易地確定。
使用一或多個轉基因小鼠模型還在體內測試了發現在這個模型或3-NP模型中有效的化合物。
食物攝取和體重減輕的發現表明本發明的化合物示出最小的毒性，並且PMX53正在進行類風溼性關節炎和牛皮癬的臨床試驗。本領域技術人員能夠容易地設計適當的臨床試驗方案來測試式I的化合物在治療本文所列的神經性和神經退行性病症中的效力和安全性。
雖然為了清楚和理解的目的，本發明進行了詳細描述，但是對於本領域技術人員而言，很明顯在不脫離本說明書揭示的發明構思的範圍內可以對本文所述的實施方案和方法進行多種修飾和改變。
本文中引用的參考文獻列在如下，並併入本文參考。
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權利要求
1.一種治療涉及炎症的神經性或神經退行性病症的方法，包括給需要上述治療的個體施用有效量的C5a受體抑制劑的步驟。
2.根據權利要求
1所述的方法，其中所述病症與補體途徑活性提高相關。
3.權利要求
1或2所述的方法，其中所述抑制劑是一種化合物，其(a)是一種C5a受體的拮抗劑，(b)基本上無激動劑活性，和(c)是式I的環肽或肽模擬化合物， 其中A是H、烷基、芳基、NH2、NH-烷基、N(烷基)2、NH-芳基、NH-醯基、NH-苯甲醯基、NHSO3、NHSO2-烷基、NHSO2-芳基、OH、O-烷基、或O-芳基；B是烷基、芳基、苯基、苯甲基、萘基或吲哚基團，或D-或L-胺基酸的側鏈，但不是下列物質的側鏈甘氨酸、D-苯丙氨酸、L-同型苯丙氨酸、L-色氨酸、L-同型色氨酸、L-酪氨酸或L-同型酪氨酸；C是D-、L-或同型-胺基酸的側鏈，但不是異亮氨酸的側鏈、苯丙氨酸的側鏈或環己基丙氨酸的側鏈；D是中性D-胺基酸的側鏈，但不是甘氨酸或D-丙氨酸的側鏈、大的平面側鏈或大的帶電側鏈；E是大的取代基，但不是下列物質的側鏈D-色氨酸、L-N-甲基色氨酸、L-同型苯丙氨酸、L-2-萘基-L-四氫異喹啉、L-環己基丙氨酸、D-亮氨酸、L-芴基丙氨酸、或L-組氨酸；F是L-精氨酸的側鏈、L-同型精氨酸的側鏈、L-瓜氨酸的側鏈、L-刀豆氨酸的側鏈、或其生物異構體的側鏈；和X是-(CH2)nNH-或(CH2)n-S-，其中n是從1到4的整數；-(CH2)2O-；-(CH2)3O-；-(CH2)3-；-(CH2)4-；-CH2COCHRNH-；或-CH2-CHCOCHRNH-，其中R是任何常見或不常見胺基酸的側鏈。
4.根據權利要求
3所述的方法，其中n是2或3。
5.根據權利要求
3或4所述的方法，其中A是乙醯胺基團、氨甲基基團、或取代的或未被取代的磺胺基團。
6.根據權利要求
5所述的方法，其中A是取代的磺胺，並且該取代基是1到6個碳原子的烷基鏈、或苯基或甲苯甲醯基團。
7.根據權利要求
6所述的方法，其中該取代基是1到4個碳原子的烷基鏈。
8.根據權利要求
3到7任一項所述的方法，其中B是L-苯丙氨酸或L-苯基甘氨酸的側鏈。
9.根據權利要求
3到8任一項所述的方法，其中C是下列物質的側鏈甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、或硫代脯氨酸。
10.根據權利要求
3到9任一項所述的方法，其中D是下列物質的側鏈D-亮氨酸、D-同型亮氨酸、D-環己基丙氨酸、D-同型環己基丙氨酸、D-纈氨酸、D-正亮氨酸、D-同型-正亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-四氫異喹啉、D-穀氨醯胺、D-穀氨酸、或D-酪氨酸。
11.根據權利要求
3到10任一項所述的方法，其中E是選自由L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-同型色氨酸組成的組中的胺基酸的側鏈，或是L-1-萘基丙氨酸或L-3-苯並噻吩基丙氨酸。
12.根據權利要求
1到11任一項所述的方法，其中所述抑制劑是具有針對C5aR的拮抗劑活性並無C5a激動劑活性的化合物。
13.根據權利要求
1到12任一項所述的方法，其中所述抑制劑在亞微摩爾濃度具有有效的拮抗劑活性。
14.根據權利要求
1到13任一項所述的方法，其中所述化合物具有IC50＜25μM的受體親和性和IC50＜1μM的拮抗劑效力。
15.根據權利要求
1到14任一項所述的方法，其中所述化合物選自由在PCT/AU02/01427中描述的化合物1到6、10到15、17、19、20、22、25、26、28、30、31、33到37、39到45、47到50、52到58和60到70所組成的組中。
16.根據權利要求
14所述的方法，其中所述化合物是PMX53(AcF[OP-DCha-WR])、PMX205(HC-[OPdChaWR])、PMX273(AcF[OP-DPhe-WR])、PMX201(AcF[OP-Dcha-WCit])或PMX218(HC-[OPdPheWR])。
17.根據權利要求
16所述的方法，其中所述化合物是PMX205或PMX53。
18.根據權利要求
1到14任一項所述的方法，其中所述化合物能夠穿過血腦屏障。
19.根據權利要求
1到18任一項所述的方法，其中所述病症是與紋狀體損傷和/或多聚穀氨醯胺重複有關的神經退行性病症。
20.根據權利要求
19所述的方法，其中所述病症選自亨廷頓舞蹈病、脊髓和延髓肌萎縮、脊髓小腦性共濟失調、齒狀紅核蒼白球路易斯核萎縮、紋狀體損傷和與I型戊二酸尿相關的急性紋狀體壞死。
21.根據權利要求
1到18任一項所述的方法，其中所述病症是運動神經元疾病。
22.根據權利要求
20所述的方法，其中所述病症選自肌萎縮性側索硬化；進行性延髓麻痺；脊髓肌萎縮，包括嬰兒和青少年型；庫-韋二氏綜合症；杜興麻痺；韋-霍二氏病；和良性病灶肌萎縮。
23.根據權利要求
1到18任一項所述的方法，其中所述病症是一種與神經變性和/或缺血性損傷有關的疾病。
24.根據權利要求
23所述的方法，其中所述病症選自帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、威爾遜疾病和作為腦缺血及其他神經系統疾病的後遺症而發生的病變，包括與血腦屏障功能紊亂相關的疾病。
25.根據權利要求
1到18任一項所述的方法，其中所述病症是運動失調。
26.根據權利要求
23所述的方法，其中所述病症選自進行性核上性麻痺、亨廷頓舞蹈病、多系統萎縮症、皮質基底退化、威爾遜疾病、哈-斯二氏病(伴有大腦鐵累積的神經變性)、進行性蒼白球萎縮、多巴-應答性張力障礙-帕金森氏綜合症、痙攣、阿爾茨海默氏病及其他引起異常運動或姿勢的基底神經節疾病。
27.根據權利要求
1到26任一項所述的方法，其中所述抑制劑可以與一或多種用於治療所述神經性或神經退行性病症的其它藥物聯合使用。
28.根據權利要求
27所述的方法，其中其它藥物是infliximab或是C3a的抑制劑。
29.C5a受體抑制劑在製備用於治療涉及炎症的神經性或神經退行性病症的藥物中的用途。
30.根據權利要求
29所述的用途，其中所述病症與補體途徑活性的提高有關。
31.根據權利要求
29或30所述的用途，其中所述化合物是如權利要求
3到18中任一項所定義的化合物。
專利摘要
本發明涉及使用具有調節C5a受體活性的能力的新的環狀多肽以及肽模擬化合物治療神經系統病症。所述化合物優選作為C5a受體的拮抗劑，並對於多形核白細胞、單核細胞、淋巴細胞和/或巨噬細胞上的C5a受體具有活性。本發明的優選神經系統病症是神經退行性疾病、神經免疫失調、由血腦屏障功能異常引起的疾病以及中風。
文檔編號A61P25/28GK1997384SQ20058001650
公開日2007年7月11日 申請日期2005年3月21日
發明者特倫特·馬丁·伍德拉夫, 史蒂芬·馬克斯韋爾·泰勒 申請人:普羅米克斯有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan