用於治療囊性纖維化的cftr修飾基因和表達的多肽以及檢測和/或鑑定它們的方法和產品的製作方法

2023-05-27 12:21:36 1

專利名稱：用於治療囊性纖維化的cftr修飾基因和表達的多肽以及檢測和/或鑑定它們的方法和產品的製作方法
技術領域：
本申請涉及用於治療囊性纖維化(CF)，或至少引起CF的症狀的CFTR修飾基因，及其表達的多肽。本申請還涉及使用調節該CFTR修飾基因的遺傳調節物，以及使用多肽調節物影響各表達多肽的功能和/或活性。本申請還涉及檢測和/或鑑定該CFTR修飾基因，各表達多肽的方法和產品，調節該修飾基因的表達的遺傳調節物，和影響各表達多肽的功能和/或活性的多肽調節物。
背景技術：
囊性纖維化(CF)是人類最常見的致命性遺傳疾病。參見Boat等，TheMetabolic Basis of Inherited Diseases(Scriver，C.R.等編，McGraw-Hill，NewYork(1989))。目前，在美國有成千上萬個CF病人。儘管現在有標準療法，但是存活的平均年齡只有26歲。肺呼吸道疾病是發病的主要原因且導致95％的死亡率。儘管在CF中許多器官受到影響，但是該疾病的發病率和死亡率主要與肺內的粘液積聚，復發性感染和過多炎症相關。
CF相關性基因的蛋白產物稱為囊性纖維化跨膜傳導調節物(CFTR)。參見Riordan等，Science(1989)2451066-1073。CFTR是由兩個重複元件組成的大約1480個胺基酸的蛋白質，其中每個元件包含6個跨膜片段和一個核苷酸結合結構域。兩個重複元件被一個大型極性含有多個潛在的磷酸化位點的所謂R-結構域分開。根據其預期的結構域結構，CFTR是包括多藥抗性(MDR)或P-糖蛋白，牛腺苷環化酶，酵母STE6蛋白，以及幾個細菌胺基酸轉運蛋白的一類相關蛋白質中的一個成員。參見Riordan等，Science(1989)2451066-1073；Hyde等，Nature(1990)346362-365。這組蛋白質的特徵在於與分子泵入或者泵出細胞相關。
已推定CFTR與通過環AMP(cAMP)-依賴型蛋白激酶或蛋白激酶C的磷酸化響應調節陰離子流出上皮細胞。參見Riordan等，Science(1989)2451066-1073；Frizzell等，Science(1986)233558-560；Welsh等，Nature(1986)322467；Li等，Nature(1988)331358-360；Hwang等，Science(1989)2441351-1353。儘管CF的發病機理不完全了解，但是據認為與CFTR缺陷相關的上皮細胞的環AMP依賴型氯化物分泌異常和過多的鈉再吸收改變了呼吸道表面液體(ASL)的液體體內平衡，導致其脫水，黏膜纖毛清除率受損和感染。參見Tarran等，Molecular Cell，(2001)8149-58。由於闡明了CFTR的一級結構，已經將許多功能和許多與其它細胞蛋白的相互作用歸因於CFTR。因此，除了CFTR在調節cAMP-依賴型氯運輸中的作用外，該蛋白質通過與細胞骨架，膜轉運蛋白，以及受體，蛋白途徑選擇和降解機制相互作用在許多細胞過程中發揮多效作用。參見Welsh等，「Cystic Fibrosis，」Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease(8thEd.2001)，第5121-88頁。
許多研究也支持在CF肺中發生過多炎症反應的觀念，但是這些異常包含的機理尚不清楚。IL-8和介導炎症信號的其它蛋白質，包括NFκB和iNOS水平的改變與CF相關，不論是否存在感染，導致很可能在CFTR中的異常可組成型改變介導炎症的途徑。參見Khan等，Am J.Respir.Crit.Care Med.，(1995)1511075-82；DiMango等，J.Clin.Invest.，(1998)1012598-2605；Elmer等，Am.J.Physiol.，(1999)276L466-73。
對CF染色體的CFTR基因進行序列分析揭示了各種引起疾病的突變。參見Cutting等，Nature(1990)346366-369；Dean等，Cell(1990)61863870；和Kerem等，Science(1989)2451073-1080；Kerem等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)878447-8451。事實上，在CFTR基因中超過800個不同的突變與CF的臨床疾病特徵相關。參見Welsh等，「Cystic Fibrosis，」Metabolic andMolecular Bases of Inherited Disease(8thEd.2001)，第5121-88頁。群體研究表明最常見的CF突變，即編碼CFTR胺基酸序列第508位苯丙氨酸的3個核苷酸缺失(ΔF508)，與大約70％的囊性纖維化病例相關。該突變導致與cAMP反應的上皮細胞氯離子通道失效。參見Frizzell等，Science(1986)233558-560；Welsh Science(1986)2321648-1650；Li等，Nature(1988)331358-360；Quinton，Clin.Chem.(1989)35726-730。在呼吸道細胞中，這導致離子和液體運輸不平衡。普遍認為這引起粘液分泌異常，並最終導致肺感染和上皮細胞損傷。
在肺部，CFTR主要分布在呼吸道頂端區域和黏膜下層腺體上皮細胞中。參見Engelhardt等，J.Clin.Invest.，(1994)93737-49。CFTR表達的豐度和細胞位點受發育，空間，和體液因素的強烈影響，支持了CFTR的表達和功能在轉錄和轉錄後水平上都受到調節的觀點。儘管進行了廣泛的研究，但是對CFTR在CF疾病發病機理中的精確作用所知甚少。在臨床水平上，CF疾病的嚴重性即使在帶有相同突變的個體中也是高度變化的，這支持了環境和遺傳因素可影響該疾病嚴重性的觀點。參見Welsh等，「Cystic Fibrosis，」Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease(8thEd.2001)，第5121-88頁。這些臨床觀察結果，和證實在小鼠中CFTR基因靶向或突變後存在CF表型嚴重性的品系差異的觀察結果(參見Rozmahel等，Nat.Genet.，(1996)，12280-87)，支持了CFTR的表達及其在細胞過程中的功能受到各種器官中加重或減輕CF疾病的許多基因或途徑的影響的觀點。
根據對CF基因的已有知識，目前採用三種全身性矯正方案(相對於致力於改善該症狀的療法)來逆轉CF呼吸道中異常減少的氯(Cl-)分泌和增加的鈉(Na+)吸收。據認為呼吸道上皮的電解質轉運缺陷可改變呼吸分泌物和粘液的組成。參見Boat等，The Metabolic Basis of Inherited Diseases(Scriver，C.R.等編，McGraw-Hill，New York(1989))；Quinton，FASEB J.(1990)42709-2717。因此，採用藥物學治療致力於矯正電解質轉運的異常。用霧化形式的藥物氨氯吡嗪脒，即一種抑制鈉(Na+)通道，從而抑制鈉吸收的利尿劑，進行的試驗已有進展。初步結果表明該藥物是安全的且表明通過肺功能檢測測量的疾病進展速率略有改變。參見Knowles等，N.Eng.J.Med(1990)3221189-1194；App，Am.Rev.Respir.Dis.(1990)141-605。諸如ATP或UTP的核苷酸刺激呼吸道上皮中的嘌呤能(purinergic)受體。因此，它們打開不同於CFTR氯(Cl-)通道的一類氯(Cl-)通道。體外試驗表明ATP和UTP可刺激氯(Cl-)分泌。參見Knowles等，N.Eng.J.Med(1991)325-533。測試核苷酸刺激體內分泌，從而矯正電解質轉運異常的能力的初步試驗正開始進行。
對於所有藥物學試劑，諸如藥物毒性和給藥的問題在開發治療CF的合適藥物學試劑中是重要的。對於CF治療的藥物學方案更基本的考慮是與CFTR相關的氯(Cl-)通道活性是否是導致該疾病狀態的決定性特性。已有推測存在另一尚未鑑定的CFTR系統成份，它是一種關鍵性調節物，且如果是這樣，可能基於氯(Cl-)轉運的藥物學方案可成功調節離子平衡，但仍然不能減輕基本生理學問題。參見美國專利號5,639,661(Welsh等)，1997年6月17日出版。如果事實如此，那麼可能基於氯(Cl-)轉運的藥物學方案可成功調節離子平衡，但仍然不能減輕基本生理學問題。
治療囊性纖維化的第二個方案，即「蛋白質取代」尋求給CF突變細胞遞送有功能的重組CFTR直接增加缺少的CFTR活性。CF的蛋白質取代療法概念簡單即將在一些融合脂質體或重組病毒載體中配製的高純度重組CFTR製品通過滴注法或氣溶膠給藥到呼吸道。然而，配製CF蛋白取代治療劑的嘗試遇到了許多困難。例如，CFTR不是用於以前的蛋白質取代療法或其它治療用途的可溶性蛋白質類型。對於可在重組細胞中表達的具有生化活性的膜蛋白量也有限制。例如，文獻中有報導105-106個分子/細胞代表其上限(參見Wang等，J.Biol.Chem(1989)26414424)，相比之下，諸如EPO，胰島素，生長激素，和tPA的分泌蛋白報導為2000個分子/秒/細胞。
除了表達能力有限外，CFTR，即一種膜結合蛋白的純化比可溶性蛋白質的純化更困難。膜蛋白需要在去汙劑中溶解。然而，在去汙劑存在下純化CFTR表示是一個比可溶性蛋白所需的純化過程更低效的過程。蛋白質取代方案的其它潛在的障礙包括(1)由粘液堵塞和CF呼吸道中的環境有害特性引起的呼吸道上皮難以接近；(2)潛在的免疫原性；和(3)CFTR與接受細胞的融合可能無效。
囊性纖維化治療的第三個方案是基因治療方案，其中將編碼CFTR的DNA轉移到CF缺陷型細胞(例如，呼吸道的細胞)。然而，將DNA導入細胞的方法一般是無效的。由於病毒以非常有效的方式將其核酸導入細胞，因此許多基因治療方案利用改造的缺陷型病毒。然而，病毒載體接納外源基因的空間有限。例如，儘管腺伴隨病毒(AAV)在許多方面是一個有吸引力的基因治療載體，但是它僅有4.5Kb可用於接納外源性DNA。編碼全長CFTR基因的DNA代表了其上限。另外，CF的基因治療方案與蛋白質治療一樣會面臨許多相同的臨床挑戰。
儘管基於目前對編碼CFTR的基因，表達的蛋白產物和作用機制的知識在開發治療CF的療法中有了重要進展，但是治療CF的每一種方案都仍有障礙。CF病人的發病率和死亡率與粘液積聚，炎症和感染引起的肺病強烈相關。然而，在小鼠中缺失CFTR並不引起明顯的肺病，表明有替代通道或其它補充基因表達來維持小鼠的肺部內環境穩定。事實上，已發現CF小鼠模型中的肺病是高度可變的。一般來說，在CFTR突變型小鼠中肺病可以是輕微或不存在的。這表明在肺內表達的其它基因強烈影響CFTR的功能。
儘管開發了許多體外和體內模型用於研究CFTR，但是分析CFTR存在與否的基因組反應由於細胞模型的異質性和可獨立於CFTR影響細胞功能和基因表達的培養條件而複雜化。對患有CF的人肺組織的直接RNA分析由於幾乎普遍存在的嚴重肺感染而複雜化，該感染可再次修改細胞反應和基因表達，使得鑑定體內CFTR的反應複雜化。
因此，仍然需要揭示和鑑定可修飾或增強離子轉運，氯(Cl-)轉運或其它協同轉運離子，以及CFTR影響的其它活性的基因或試劑。這樣可提供鑑定CF的治療靶，以及潛在的新基因，試劑和治療CF的療法的能力。具體地說，需要揭示或鑑定在治療CF中更有效的影響離子轉運，特別是氯(Cl-)轉運的替代途徑。
發明簡述本發明涉及發現CFTR修飾基因，且特別是Kir4.2基因，及其表達的多肽，可用於通過給缺乏表達CFTR的能力，或表達提供無效或低效CFTR功能和/或活性的突變CFTR的CF-影響的細胞(CF-affected cell)提供補償功能和/或活性來治療囊性纖維化(CF)疾病。本發明還涉及發現了可調節該CFTR修飾基因表達的遺傳調節物，以及影響各表達多肽的功能和/或活性的多肽調節物。
因此，本發明提供了檢測和/或鑑定CFTR修飾基因，各自表達的CFTR修飾多肽，調節該CFTR修飾基因表達的遺傳調節物，和影響各自表達的CFTR修飾多肽的功能和/或活性的調節物的方法和產品。本發明的檢測/鑑定方法和產品的一些實施方案包括(1)Kir4.2基因和其它CFTR修飾基因及其表達的多肽作為篩選或測定可調節基因表達(即，基因調節物)，或可影響表達多肽的功能特性(即多肽調節物)的潛在試劑(例如，藥物)的用途；(2)CFTR-缺陷型轉基因非人哺乳動物(例如，小鼠)用於鑑定潛在的CFTR修飾基因，及其各自表達的CFTR修飾多肽的用途；和(3)將含有CFTR修飾基因和/或基因啟動子的合適載體導入哺乳動物(人和非人)，酵母，或昆蟲細胞或細胞系以便可在測定系統中使用基因表達或多肽功能和/或活性的改變來檢測和/或鑑定潛在的遺傳和/或多肽調節物。
本發明還提供了使用這些CFTR修飾基因，其各自表達的多肽，以及其它試劑用於治療CF的組合物和方法，包括在含有或沒有其它治療或試劑的條件下，(1)使用遺傳調節物調節CF影響的細胞中的CFTR修飾基因表達；(2)使用多肽調節物影響(例如，增強)CF影響的細胞中CFTR修飾多肽的功能和/或活性；(3)將CFTR修飾多肽遞送到CF影響的細胞中；和/或(4)將CFTR修飾基因遞送到CF影響的細胞中。
令人驚奇的是發現Kir4.2，以及其它CFTR修飾基因意外地能夠補償CFTR缺乏，或存在低效或無效的突變CFTRs(例如CFTR ΔF508)以致於治療CF，或至少引起CF的症狀。具體地說，發現Kir4.2基因通過提供鉀(K+)通道作為替代途徑而意外地影響和加強氯(Cl-)離子轉運。另外，驚奇地發現提供這些鉀(K+)通道的Kir4.2基因表達的多肽可與諸如通過CFTR-依賴型通道刺激氯(Cl-)離子轉運的環AMP(cAMP)刺激劑(例如，毛喉素和IBMX)的各種試劑反應受到激活和/或調節。因此，由於Kir4.2激活也加強氯(Cl-)離子轉運，因此調節Kir4.2表達(在轉錄時或轉錄後)，或影響表達的Kir4.2多肽的功能和/或活性的藥物學試劑也可有益地影響鉀(K+)離子轉運，從而影響氯(Cl-)離子轉運。事實上，本發明的優勢在於治療CF的能力，它通過調節內源性CFTR修飾基因的表達和/或影響內源性CFTR修飾多肽的功能/活性通過替代途徑(例如，對於Kir4.2，通過鉀(K+)通道)有益地影響離子轉運。


圖1是從FABP-hCFTR/mCFTR(-/-)CFTR-缺陷型腸-矯正小鼠肺收穫的mRNAs相對於野生型CFTR(+/+)小鼠的差別表達篩選(p-值＜0.05)模式圖(相對強度在y-軸，小鼠對的年齡增加在x-軸繪圖)，顯示27個基因，包括Kir4.2基因，它們是潛在的CFTR修飾基因。
圖2是柱形圖，顯示CFTR缺陷型腸-矯正小鼠相對於野生型對照小鼠肺中的Kir4.2mRNA增加。
圖3是相對於對照的克隆化鉀(K+)通道活性圖，所述活性是Kir4.2基因對cAMP刺激劑(毛喉素與IBMX的組合)反應所表達的(pA/pF在y-軸，以mV表示的Vm在x-軸)。
圖4顯示CFTR(-/-)和CFTR(+/+)小鼠各RNAs分布圖，左側一組是log比率和基因頻率的直方圖，右側一組是異常值方框圖，其中以x和y標記表示的虛線末端是從其各自的四分值(quartile)鑑定的異常值。
圖5是針對存在或不存在CFTR而明顯改變的315個基因/表達序列標籤(ESTs)的二維級系聚類(dimensional hierarchial clustering)圖。
圖6針對不存在CFTR而穩定改變的54個選定RNAs的表達譜圖。
圖7是圖6的54個選定RNAs的各自級系聚類圖。
圖8，9，10和11分別代表顯示對Grind2d(圖8)，Kir4.2(圖9)，CEBPδ(圖10)和TNFAIP3(圖11)的mRNAs進行實時PCR分析的柱形圖。
圖12，13，14和15分別是從三月齡的iFABP-hCFTR，CFTR(-/-)小鼠(圖13，15)和iFABP-hCFTR，CFTR(+/+)同窩小鼠(圖12，14)固定後獲得的肺組織的照片。
序列表的簡要描述SEQ ID NO1顯示小鼠Kir4.2基因cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO2顯示小鼠Kir4.2基因表達的Kir4.2多肽。
SEQ ID NO3顯示人Kir4.2基因cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO4顯示人Kir4.2基因cDNA的核苷酸序列變異體。
SEQ ID NO5顯示人Kir4.2基因cDNA的核苷酸序列的另一變異體。
SEQ ID NO6顯示SEQ ID NOs.3-5的人Kir4.2基因表達的Kir4.2多肽。
SEQ ID NO7顯示人Kir4.2基因cDNA的核苷酸序列的另一變異體。
SEQ ID NO8顯示SEQ ID NO.7的人Kir4.2基因表達的Kir4.2多肽。
發明詳述1.定義本文使用的術語「基因」是指攜帶編碼多肽(例如，蛋白質)的信息的遺傳物質的序列(例如，DNA和RNA)。
本文使用的術語「RNA」可互換地指RNA，mRNA或tRNA。
除非本文另有說明，術語「多肽」是指蛋白質，多肽或肽。
本文使用的術語「載體」是指含有能夠將核酸序列導入細胞，導致在該細胞中表達該核酸序列的DNA或RNA，基本上由其組成，或由其組成的介質。
本文使用的術語「表達載體」是指攜帶可導入合適宿主細胞並在其中指導所編碼的多肽表達或合成的基因或cDNA的修飾質粒或病毒。
本文使用的術語「質粒」和「克隆載體」可互換使用，是指能夠在細胞中自主複製的，環形的，一般較小的染色體外DNA分子。
本文使用的術語「囊性纖維化跨膜傳導調節多肽(Cystic FibrosisTransmembrane Conductance Regulator polypeptide)」或「CFTR多肽」是指含有兩個跨膜結構域(MSDs)，兩個核苷酸結合域(NBDs)和單個R結構域的大約1480個胺基酸的蛋白質，其充當受磷酸化和核苷三磷酸調節的氯(Cl-)通道。術語「CFTR多肽」也可指保留CFTR基因功能域的那些CFTR基因的部分。
本文使用的術語「CFTR Δ508」和「CFTR ΔF508」可互換使用，是指不能編碼CFTR胺基酸序列第508位的苯丙氨酸產生的CFTR突變多肽。
本文使用的術語「囊性纖維化跨膜傳導調節物(CFTR)功能或活性」是指一般由野生型CFTR完成的功能。該功能可包括介導，調節或控制離子，(例如，氯(Cl-)離子)轉運穿過細胞膜。
本文使用的術語「囊性纖維化(CF)-缺陷型或影響的細胞」是指由於缺少CFTR，或者由於CFTR突變多肽不能提供CFTR功能和/或活性，或者提供的CFTR功能和/或活性低效而缺乏囊性纖維化跨膜傳導調節功能的細胞。該細胞的例子包括至今鑑定的1300個不同變異體的CFTR突變體(例如，CFTR ΔF508)。參見，例如，Kunzelmann等，「Pharmacotherapy of the IonTransport Defect in Cystic Fibrosis，」Clin.Exper.Pharm.Phys.(2001)28857-67；Welsh等，「Molecular Mechanisms of CFTR Chloride ChannelDysfunction in Cystic Fibrosis，」Cell(1993)731251-54。
本文使用的術語「CFTR修飾基因」和「CFTR補償(compensateory)基因」可互換使用，是指能夠補償CF-影響的細胞中的CFTR活性或功能，包括表達能夠補償CF-影響的細胞中CFTR的功能和/或活性的多肽的基因。CFTR修飾基因的例子包括下列正調節基因EST Affymetrix ID#92319(可介導蛋白質運輸的遍在蛋白家族成員)；鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基(G蛋白偶聯的受體途徑蛋白)；Repetin(GenBank登錄號X99251)；膜糖蛋白(GenBank登錄號Z22552)；ras-相關性地塞米松誘導型蛋白(DEXRAS1)mRNA；SWAP-70mRNA；vq96e09.41 cDNA；鋅指蛋白(Peg3)mRNA；uo89c05.x1 cDNA；和ATP-敏感性輸入矯正鉀通道14(ATP-sensitiveinward rectifier potassium channel 14，GenBank登錄號AI314692)。CFTR修飾基因的例子還包括下列負調節基因Preproapelin(GenBank登錄號AB023494)；Caspase-12(GenBank登錄號Y13090)；胰島細胞自身抗原1(GenBank登錄號U37186)；鈉尿肽前體A型(Natriuretic peptide precursortype A，GenBank登錄號K02781)；mSox7(GenBank登錄號AB023419)；分泌捲曲相關蛋白(secreted frizzled related protein)sFRP-2(Sfrp2)mRNA(GenBank登錄號U88567)；U[-M-BH1-ang-b-04-0-U].s1 cDNA(GenBank登錄號AW050325)；C88243 cDNA(GenBank登錄號C88243)；U[-M-BH0-ajq-h-03-0-U].s1(GenBank登錄號AI853682)；IB3(GenBank登錄號X79131)；丁醯膽鹼酯酶(Butyrylcholinesterase)mRNA(GenBank登錄號M99492)；同源框A5(homeo box A5，GenBank登錄號Y00208)；連接蛋白37間隙連接膜通道蛋白α4(Connexin 37 Gap junction membrane Channel proteinα4，GenBank登錄號X57971)；Wnt10a mRNA(GenBank登錄號U61969)；鈣聯接蛋白(Calnexin，GenBank登錄號L18888)；囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白同源物(GenBank登錄號M60493)；和相似於人的造血特異性蛋白1的mRNA(GenBank登錄號X84797)。補償存在失效和/或低效CFTR突變體的CF疾病狀態的基因本文也稱為CFTR修飾基因。
下表是相對於mCFTR(+/+)小鼠在mCFTR(-/-)小鼠中發現受到正調節的其它基因表1 受正調節的基因


下表是相對於mCFTR(+/+)小鼠在mCFTR(-/-)小鼠中發現受到負調的其它基因表2 受負調節的基因


本文使用的術語「治療囊性纖維化(CF)」，「囊性纖維化(CF)治療」和類似術語包括給CF影響的細胞提供任何可檢測的減小，減輕，改善，受益或其它正面效果(直接或間接)的治療，以及對於引起CF或與CF相關的任何症狀，包括離子轉運進出CF影響的細胞方面的缺陷，提供任何可檢測的減小，減輕，改善，受益或其它正面改進的任何治療。
本文使用的短語「CF修飾基因治療」是指將編碼補償CFTR功能和/或活性的遺傳物質(例如，DNA或RNA)轉移進CF-影響的細胞以減小，減輕，或改善囊性纖維化(CF)的症狀，或者肯定地治療囊性纖維化。
本文使用的術語「CFTR(+/+)」是指野生型CFTR小鼠。
本文使用的術語「CFTR(-/-)」是指CFTR缺陷型小鼠。
本文使用的術語「FABP-hCFTR」是指在轉基因小鼠腸道表達的人CFTR。
本文使用的術語「FABP-hCFTR/mCFTR(-/-)」是指CFTR缺陷型腸矯正的轉基因小鼠。
本文使用的術語「CHO」是指中國倉鼠卵巢。
本文所用的術語「cAMP」是指環腺苷單磷酸。
本文所用的術語「SP-C」是指表面活性劑蛋白-C，位於哺乳動物和其它呼吸動物呼吸道的肺表面活性液體的主要成份。
本文所用的術語「SPC-hΔ508」是指在SP-C啟動子序列調節下在肺上皮細胞中表達人CFTRΔ508的轉基因小鼠。
本文所用的術語「Kir4.2基因」是指輸入矯正鉀(K+)通道基因(inwardrectirying potassium(K+)channel)，它表達充當鉀(K+)通道的多肽且以前發現在發育期間的腎和肺中和在包括腎和腦的一些成人組織中表達。Kir4.2基因也稱為KIR4.2或KCNJ15，且位於人第21號染色體上。參見Gosset等，「ANew Inward Rectifier Potassium Channel Gene(KCNJ15)Localized onChromosome 21 in the Down Syndrome Chromosome Region 1(DCR 1)，」Genomics(1997)44237-41，引用該文獻以供參考。與許多基因一樣，等位基因變異體可產生基本上相似的多肽，且本文提供了來自人類的例子。小鼠Kir4.2基因的cDNA具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列(GenBank登錄號AF 085696)，而人Kir4.2基因的cDNA具有SEQ ID NO3(GenBank登錄號NM_170737)，SEQ ID NO4(GenBank登錄號NM_170736)，SEQ ID NO5(GenBank登錄號NM_002243)或SEQ ID NO7(GenBank登錄號Y10745)所示的核苷酸序列。在不存在正常CFTR，和在存在CFTRΔ508且無正常CFTR的條件下Kir4.2基因的表達水平升高。已發現Kir4.2可在肺呼吸道上皮的有關區域表達，從而增加各Kir4.2多肽(小鼠如SEQ ID NO2所示，人如SEQ ID NOs6和8所示)的表達或增強該多肽的活性以繞過氯(Cl-)轉運和細胞功能的CFTR-依賴型缺陷。分析Kir4.2和CFTR基因的調控區顯示出有許多相似性，將其潛在的功能聯繫起來且證實了Kir4.2是一種CFTR修飾基因的意外發現。對於與Kir4.2基因相關的其它基因家族成員參見Durell等，「A Family of Putative Kir Potassium Channels in Prokaryotes，」BMCEvolutionary Biology(2001)，第1-9頁；Fakler等，「Heterooligomeric Assemblyof Inward-Rectifier K+Channels from Subunits of Different SubfamiliesKir2.1(IRK1)and Kir 4.1(BIR10)，」Pflugers Arch-Eur.J.Physiol.(1996)43377-83(本文引用以供參考)。
本文使用的術語「基因啟動子」是指調節，控制或調整(例如，刺激或抑制)特定基因表達的該基因的部分核苷酸序列。例如，基因啟動子可增強該基因的轉錄和/或翻譯，從而增加從該基因轉錄的mRNA水平。
本文所用的術語「基因表達」和「基因轉錄」可互換使用，是指在DNA分子水平導致產生基因多肽產物的起始步驟。因此，基因轉錄在本文中應理解為結果是基因表達，或者產生由所轉錄或表達的基因編碼的多肽。
本文所用的術語「報導基因」是指導入細胞中的遺傳物質，通常是DNA，該報導基因在有利條件下在該細胞中表達，以便指示達到了滿足這些有利條件的標準。這些有利條件可包括，但不限於，pH，離子流，存在合適的轉錄因子庫，或者其它細胞內分子或因子。
本文使用的術語「轉錄因子」是指在基因轉錄加工之前，期間，或者之後結合DNA或者導致其它多肽結合DNA的廣泛細胞內多肽。
本文所用的術語「遺傳調節物」是指調節基因表達的物質。在本發明中，遺傳調節物通常是指特別是在CF影響的細胞中增加或減少CFTR修飾基因表達的至少一種細胞多肽(例如，蛋白質)的細胞內水平的物質。遺傳調節物可包括內源性細胞多肽，藥物試劑或其它生物學活性分子。
本文使用的術語「多肽調節物」是指在CF影響的細胞中能夠影響(例如，提高或降低)至少一種CFTR修飾多肽的細胞功能和/或活性的物質。多肽調節物可刺激，增強，或增加該多肽的功能和/或活性，以及抑制或減小該功能或活性。本文所用的在CF影響的細胞中CFTR修飾多肽的功能和/或活性受多肽調節物影響以便直接或間接有益地調節，控制或調整離子轉運(例如，氯(Cl-)，鉀(K+)，等)或者其它CFTR功能和/或活性，以便減輕或者肯定地治療CF。
本文使用的術語「可藥用的鹽」是指化合物的無毒性鹽(一般通過將游離酸與合適的有機或無機鹼反應製備)且包括，但不限於，乙酸鹽，苯磺酸鹽，苯甲酸鹽，碳酸氫鹽，重硫酸鹽，重酒石酸鹽，硼酸鹽，溴化物，鈣，camsylate，碳酸鹽，氯化物，棒酸鹽，檸檬酸鹽，二氫氯化物，乙二胺四乙酸鹽，edisylate，estolate，esylate，延胡索酸鹽，gluceptate，葡萄糖酸鹽，穀氨酸鹽，glycollylarsanilate，hexylresorcinate，hydrabamine，氫溴化物，鹽酸鹽，羥萘甲酸鹽，碘化物，isothionate，乳酸鹽，乳糖酸鹽，月桂酸鹽，蘋果酸鹽，馬來酸鹽，mandlate，mesylate，甲基溴化物，甲基硝酸鹽，甲基磺酸鹽，粘酸鹽，napsylate，硝酸鹽，油酸鹽，草酸鹽，pamaote，棕櫚酸鹽，panthothenate，磷酸鹽，diphospate，聚半乳糖醛酸鹽，水楊酸鹽，硬脂酸鹽，次醋酸鹽，琥珀酸鹽，單寧酸鹽，酒石酸鹽，teoclate，甲苯磺酸鹽，triethiodide，和戊酸鹽，以及這些鹽的混合物。
本文使用的術語「試劑」，「藥物」，和「藥品」可互換使用，是指藥學組合物，配製品或化合物，包括用作遺傳和/或多肽調節物的物質。
本文使用的術語「哺乳動物」是指人和非人哺乳動物，包括靈長目(例如，人，猴，狒狒，獼猴)，狗，貓，兔，大鼠，沙土鼠，倉鼠，小鼠，馬，奶牛，山羊，和統稱為哺乳動物的其它種類。
本文使用的術語「受試者」是指包括對CF易感的哺乳動物。該術語「受試者」還試圖包括轉基因非人哺乳動物。「受試者」也稱為本文可互換的「患者」。
本文使用的術語「包含」是指在本發明中可結合使用的各種試劑，組合物，化合物，基因，多肽，成份，步驟等。因此，術語「包含」包括更限制性的術語「基本上由其組成」和「由其組成」。
本文使用的所有量，部分，比率和百分數均按重量計，除非另有說明。
2.CFTR修飾基因，遺傳調節物和多肽調節物的檢測和鑑定本發明涉及發現了儘管缺乏CFTR基因表達，或者表達不能提供或低效提供CFTR功能或活性的突變CFTR，例如在患有CF疾病的受試者中發現的情況，但是在非人哺乳動物(例如，小鼠)中可改變許多基因(即，諸如Kir4.2基因的CFTR修飾基因)的表達以提供表面正常的肺功能。已發現這些CFTR修飾基因的表達改變是一種代償適應。由於喪失CFTR功能和/或活性在人類和其它非人哺乳動物(例如，小鼠)中一般產生疾病，因此該CFTR修飾基因可能補償CFTR的作用，特別是補償CFTR表達的喪失。結果，這些補償性CFTR修飾基因，及其表達的多肽可恢復肺的內環境穩定且可用於治療CF。
因此，本發明涉及用於檢測和/或鑑定CFTR修飾基因，包括諸如表1所列的正調節基因，以及諸如表2所列的負調節基因，其表達的CFTR修飾多肽，調節該修飾基因表達的遺傳調節物，和影響其各自表達的多肽的功能和/或活性的調節物的方法和產品。可使用各種生物學材料和方法檢測和/或鑑定潛在的CFTR修飾基因及其各自表達的多肽，CFTR修飾基因的潛在遺傳調節物，以及影響各自表達的多肽的功能和/或活性的潛在多肽調節物，包括藥物篩選；試驗；生物學分子(例如，核苷酸或多肽)的陣列和/或探針；以及小鼠和其它非人哺乳動物模型。這些檢測和鑑定方法和產品一般包括將含有潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物和/或CFTR修飾多肽的調節物的樣品與一種指示劑接觸，當樣品中存在潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物和/或CFTR修飾多肽的調節物時該指示劑可以識別出來。
用於檢測和/或鑑定CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物和CFTR修飾多肽的調節物的合適的產品，試劑盒，和試驗可以是陣列的形式；探針；雜交試驗；夾心試驗；使用DNA測序和通過雜交鑑定(包括使用不連續的多個探針的分析)；使用核苷酸和多肽的測序，指紋法和作圖；和多肽(例如，蛋白質)捕獲試劑陣列。參見，例如，1995年8月29日發布的美國專利號5,445,934(Fodor等)；2000年2月22日發布的美國專利號6,027,800(Cronin等)；2000年4月4日發布的美國專利號6,045,996(Cronin等)；美國專利號6,077,673(Chenchik等)；2001年7月31日發布的美國專利號6,268,210(Baier等)；2001年8月7日發布的美國專利號6,270,961(Drmanac)；2002年3月12日發布的美國專利號6,355,432(Fodor等)；且引用所有這些文獻以供參考。例如，對於陣列，將表面包含多數(或更典型的是多樣)生物學活性物質的基質附著到不同區域的表面，該生物學物質能夠鑑定潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物和/或CFTR修飾多肽的調節物。於是該陣列可用於篩選潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物和/或CFTR修飾多肽的調節物。例如，該陣列可與含有潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物和/或CFTR修飾多肽的調節物的樣品接觸，該陣列還具有與其相聯的指示劑，用於鑑定樣品中是否存在潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物和/或CFTR修飾多肽的調節物。
a.CFTR修飾基因和多肽檢測和/或鑑定CFTR修飾基因的方法一般是尋找補償CFTR表達或活性改變的基因。例如，在具有轉基因操作CFTR表達的非人哺乳動物(例如，小鼠)中基因表達的改變可揭示出補償CFTR表達或活性喪失(或減少)的那些基因。用於檢測和/或鑑定CFTR修飾基因的方法和產品包括使用轉基因非人哺乳動物作為測定CF疾病中基因表達改變的RNA來源。這些方法和產品一般包含將含有潛在CFTR修飾基因混合物的樣品，優選mRNA或總細胞RNA的分離物與當樣品中存在潛在的CFTR修飾物mRNA時可進行識別的指示劑接觸。這些方法和產品包括，但不限於RT-PCR，Northern印跡，微陣列，實時PCR，或諸如Affymetrix的基因晶片技術。例如，可從具有全身性或肺特異性CFTR基因突變的轉基因小鼠分離含有未知mRNAs混合物的mRNA樣品，然後測定可改善CF疾病影響的基因表達的改變。該轉基因小鼠可包括具有轉基因腸特異性表達CFTR使得CFTR-無效突變型小鼠活過成年期的CFTR-無效突變小鼠。還包括使用具有肺特異性轉基因表達人Δ508-突變型CFTR基因的CFTR無效突變型小鼠。在包含使用CFTR-缺陷型轉基因小鼠鑑定可補償CFTR表達或活性改變，例如在CF疾病中出現的那些改變或突變的CFTR修飾基因的方法中，從患有CF疾病的任何器官或組織，包括但不限於，CFTR-缺陷型小鼠的上呼吸道上皮，肺，胰腺，和腸收穫RNA。
該檢測和/或鑑定方法的一個實施方案包括如下步驟(1)提供CFTR突變型小鼠或不存在CFTR的小鼠(例如，通過轉基因表達CFTR突變基因或者通過CFTR基因的基因定向突變)；(2)從CFTR突變型小鼠分離編碼CFTR突變型多肽的遺傳物質(通常是RNA)或從小鼠分離不編碼CFTR的遺傳物質；和(3)使用該分離的遺傳物質鑑定可補償CFTR突變或CFTR缺乏時的基因表達的改變。
優選的是該突變CFTR基因在缺少內源性CFTR或者具有CFTR-缺陷型的非人哺乳動物(例如，小鼠)中表達，以便該突變基因是感興趣的組織，例如肺中的唯一CFTR來源。使用Affymetrix或其它基因晶片可分析來自具有突變CFTR的轉基因小鼠的樣品中的mRNA表達水平並與野生型小鼠該樣品中的mRNA表達水平(即，對照)進行比較以測定那些基因具有潛在可補償受損的CFTR功能和/或活性的表達水平改變。然後進一步分析這些潛在的CFTR修飾基因以證實它們通過補償CFTR功能和/或活性的喪失(或受損)改變肺的內環境穩定。該驗證通常包括在該基因的表達低下或不可檢測的細胞類型中表達該基因，並測定它編碼的多肽的功能和/或活性。驗證也可包括產生具有缺失，錯誤表達，或過量表達所述基因的轉基因小鼠以證實其作為CFTR修飾基因的推定作用。
也可使用本領域的技術人員已知的任何蛋白微陣列(proteomic)測定系統測定基因表達的定性和定量改變。參見，例如，2002年4月2日發布的美國專利6,365,418(Wagner等)(本文引用以供參考)中可用於該測定系統的多肽(例如，蛋白質)捕獲試劑陣列。可從本文所述的人或非人哺乳動物收穫組織或器官，分級分離以分離蛋白質混合物，並用於測定多肽功能和/或活性的定性和/或定量改變。轉基因非人哺乳動物，例如，CFTR-缺陷型腸-矯正小鼠或表達突變CFTR的CFTR-缺陷型小鼠，以及具有對CFTR基因的其它突變，包括基因定向突變的小鼠，可用於使用蛋白微陣列方法檢測和/或鑑定CFTR修飾基因。用於該分析的蛋白微陣列技術的一個例子是Cyphergen系統。可勻漿從諸如FABP-hCFTR/mCFTR(-/-)小鼠的小鼠收穫的組織或器官並分級分離以分離多肽混合物；然後將具有多肽結合表面的晶片與多肽混合物接觸，然後使用生物信息分析測定與晶片表面結合的多肽特性。
b.CFTR修飾基因和多肽的調節物本領域稱為基因啟動子的基因區域可用於測定系統中以檢測和/或鑑定哪些試劑可潛在調節特定CFTR修飾基因的表達。一般來說，基因啟動子包含被細胞內產生的反式作用因子識別且隨後結合的一組順式元件。這些反式作用因子的DNA結合活性調節任何細胞內所有基因的表達。一般來說，反式作用因子是稱為轉錄因子的多肽。一些轉錄因子是刺激型且提高基因表達的水平，而另一些是抑制型且降低表達水平。各細胞類型與其它細胞類型相比表達細胞特異性的一組特有或重疊的因子。各基因啟動子需要特異性的一組轉錄因子。因此，細胞的表型很大一部分依賴於該細胞內表達的一組轉錄因子。
可用報導基因構建體開始分析基因啟動子中的啟動子元件，其中基因啟動子與表達載體內的報導基因相連。可將報導基因構建體導入培養細胞的同源群體中，例如永生化哺乳動物細胞系或其它合適的細胞系或類型的群體中。如果該細胞表達足夠量的報導基因構建體中啟動子所需的轉錄因子，那麼該啟動子將引起報導基因表達。然後可測量報導基因表達的多肽量以測定由(1)轉錄因子的量或活性；和(2)啟動子序列中存在所需的順式元件，產生的啟動子活性水平。
由於轉錄因子是多肽，其活性可通過多肽調節劑調節或影響。因此，可將基因啟動子放在報導基因構建體中，轉染進合適的細胞類型，並用於鑑定通過首先影響結合待測基因啟動子順式元件的轉錄因子活性而間接調節報導基因表達的試劑。這樣提供了開發用於檢測和/或鑑定可調節CFTR修飾基因表達的潛在遺傳調節物的方法和產品的能力。
為了構建報導基因，可使用質粒克隆載體構建包含與報導基因編碼序列可操作地連接的待測基因啟動子的DNA分子。該載體中還包括哺乳動物內含子和SV-40 Poly A序列。報導基因可包括氯黴素轉移酶，LacZ，綠色螢光蛋白(GFP)，螢光素酶，或任何其它合適的報導基因。使用包括磷酸鈣或氯化鈣共沉澱，DEAE葡聚糖介導的轉染，脂轉染，或電穿孔的任一本領域的技術人員熟知的各種技術可將該構建體導入細胞中。細胞可用單一試劑處理，或擴增並接種在96-或384-孔平板上用於大規模篩選。這樣允許篩選藥物文庫或組合文庫以檢測和/或鑑定潛在的用作遺傳調節物的試劑，該試劑用於活化內源性轉錄因子或調節基因轉錄的其它細胞過程。也可測序基因啟動子序列並使用生物信息學分析以確定啟動子序列中編碼的潛在順式元件。
在一個實施方案中，將啟動子區域，例如Kir4.2基因的啟動子區域與CFTR和肺表面活性蛋白-D的啟動子區域進行了比較。與小鼠中的Kir4.2和CFTR共有元件的例子包括cAMP反應元件結合蛋白(CREBP)，C-Ets-1，cut-iMe同源域蛋白，肝核因子1，慢病毒Poly A信號結合蛋白，活化T-細胞的核因子(NFAT)，ocatmer-結合因子1，Pax-3，PU.1，逆轉錄病毒Poly A下遊元件結合蛋白，STAT，和RFX1。因此，這些轉錄因子是可調節Kir4.2表達的試劑的靶子。
在另一實施方案中，也可將包含諸如Kir4.2的CFTR修飾基因啟動子區域的報導基因構建體轉染進培養的細胞中以提供鑑定CFTR修飾基因遺傳調節物的測定法。可從本文所述的小鼠收穫肺上皮細胞或來自其它器官的細胞的原代培養物並用於一種測定法，該測定法用於鑑定可充當CFTR修飾基因的遺傳調節物和/或充當CFTR修飾多肽的調節物的試劑。可使用包括磷酸鈣或氯化鈣共沉澱，DEAE葡聚糖介導的轉染，脂轉染，或電穿孔的任一本領域的技術人員熟知的各種技術將該構建體導入細胞中。轉染的細胞可包括但不限於原代的，轉化的，或永生化的細胞。轉染的細胞的來源可包括，但不限於哺乳動物(人和非人)，酵母，或昆蟲細胞。細胞可用單一試劑處理，或擴增並接種在96-或384-孔平板上用於大規模篩選。這樣允許篩選藥物文庫或組合文庫以檢測和/或鑑定潛在的用於激活內源性轉錄因子或促進CFTR修飾基因轉錄的其它細胞過程的試劑。
在測定系統中可使用CFTR修飾基因的多肽編碼區，或多肽本身以檢測和/或鑑定潛在充當多肽調節物的試劑。使用CFTR修飾基因(例如，Kir4.2基因)及其表達的多肽檢測和/或鑑定多肽調節物的方法和產品包括(1)用於篩選潛在試劑的細胞培養物測定檢測系統；和(2)用潛在的試劑進行實驗處理後表達的CFTR修飾多肽的蛋白微陣列測定法。
在細胞培養物測定檢測系統中，可將CFTR修飾基因導入任何廣泛的細胞類型中並在其中表達。然後可使用表達CFTR修飾基因的細胞篩選組合文庫或獨立的化合物或藥物中可影響該表達多肽的功能和/或活性的物質(即，是多肽調節物)。轉染的細胞可包括但不限於原代的，轉化的，或永生化的細胞。轉染的細胞的來源可包括但不限於哺乳動物(人和非人哺乳動物)，酵母，或昆蟲細胞。轉染方法可以是包括磷酸鈣或氯化鈣共沉澱，DEAE葡聚糖介導的轉染，脂轉染，或電穿孔的任一本領域的技術人員熟知的各種技術。轉染的細胞可用單一試劑處理，或擴增並接種在96-或384-孔平板上用於大規模篩選。可通過使用指示劑染料，螢光，化學發光，或反映離子濃度改變的其它指示劑方法測量或測定CFTR修飾多肽的活性。指示劑染料，螢光，化學發光，用於該目的的其它指示劑方法的使用是本領域的技術人員熟知的。
在該檢測和/或鑑定方法的一個實施方案中，將諸如小鼠Kir4.2 cDNA核苷酸序列的CFTR修飾基因cDNA核苷酸序列放在含有人巨細胞病毒啟動子，哺乳動物內含子，和Sv-40poly-A序列的表達載體中。將含有Kir4.2的表達載體穩定轉染進CHO細胞中。Kir4.2 mRNA可通過RT-PCR檢測，且Kir4.2多肽可通過Western印跡檢測，從而證實表達了Kir4.2 cDNA。用諸如毛喉素和/或IBMX的cAMP-刺激劑處理該細胞。實驗處理後，通過與未轉染的細胞進行比較可測定鉀(K+)離子流的增加。
使用本領域的技術人員已知的任一蛋白微陣列測定系統也可測定CFTR修飾多肽表達水平的定性和定量改變。在上述細胞培養物測定檢測系統中鑑定的試劑可用於進一步的體外或體內處理。細胞可來自本文所述的任何細胞培養物測定系統，或者來自任何本文所述的動物。可收穫細胞或組織，分級分離以分離蛋白質混合物，並測定反映實驗處理的CFTR修飾多肽功能和/或活性的改變。檢測和/或鑑定潛在多肽調節物的方法包括使用轉基因非人哺乳動物，例如，腸-矯正的CFTR-缺陷型小鼠，FABP-hCFTR/mCFTR(-/-)或表達突變CFTR的CFTR-缺陷型小鼠，用於蛋白微陣列試驗的SPC-hΔ508/FABP-hCFTR/mCFTR(-/-)，以及具有對CFTR基因的其它突變，包括基因定向突變的小鼠作為按本發明方法進行實驗處理的模型系統。另外，野生型小鼠和其它非人哺乳動物物種也可用作試驗動物以測定影響CFTR修飾多肽功能和/或活性的試劑的效力。該試劑經實驗給藥後，可收穫這些動物的器官和組織並測定CFTR修飾多肽表達的改變。
3.CFTR修飾基因，多肽和調節物的用途本發明還涉及使用CFTR修飾劑基因，包括表1所列的正調節基因，以及表2所列負調節基因，其各自表達的多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物，和/或CFTR修飾多肽的多肽調節物治療CF，或至少CF引起的症狀，包括調節，控制或調整CF-影響的細胞的離子轉運。CFTR修飾基因，各自表達的多肽，遺傳調節物和多肽調節物可單獨用於治療CF，或者可結合用於治療CF。例如，可使用遺傳和多肽調節物聯合治療CF。
a.CFTR修飾基因表達的遺傳調節物用於本發明的CFTR修飾基因，且特別是Kir4.2基因，的合適遺傳調節物包括轉錄因子(例如，AP1，PU.1)；增強轉錄的原癌基因；幹擾素γ和其類似物；巴比妥鹽及其類似物；NF-κB及其類似物；活化細胞的核因子和鈣通道激活劑；PU.1，例如ets因子試劑和GM-CSF；IL-6，IL-1α，IL-1β，INF-γ和其類似物；cAMP類似物，腺苷酸環化酶激活劑和cAMP磷酸二酯酶抑制劑；視網膜樣和孤兒受體(orphan recaptor)激活劑，視黃酸受體激動劑，視黃醇，視黃酸和其類似物；類固醇生成因子(steriodogenic factor)，糖皮質激素和糖皮質激素類似物，鹽皮質激素，雌激素，孕酮，和其類似物；倍他米松(betamethasone)，Decadron；和其混合物。
已經發現CFTR修飾基因，且特別是Kir4.2基因，可直接或間接影響細胞，特別是CF影響的細胞，的離子轉運進出，具體地說，可影響CF影響的細胞的氯(Cl-)離子運出。具體地說，已經發現影響基底外側鉀(K+)離子運輸的Kir4.2基因也可加強(直接或間接)頂端氯(Cl-)離子運輸。這意味著Kir4.2基因的刺激或表達增加可增強正常的且特別是CFTR-受損的細胞中的氯(Cl-)離子運輸，且因此可繞過據信引起CF的氯(Cl-)轉運和細胞功能的CFTR-依賴型缺陷。
CFTR修飾基因調節物可配製成治療組合物或包裝藥品用於治療患有CF的受試者。治療組合物包括治療有效量的至少一種上述遺傳調節物和任選一種可藥用的載體。包裝藥品包括至少一種上述遺傳調節物，任選一種可藥用的載體，和施用該遺傳調節物治療患有CF的受試者的說明書。說明書可書寫或列印在紙片上，可與包裝藥品包裝在一起，可以是能夠加載，安裝(直接或者通過遠程下載，例如通過LAN，WAN或網際網路)，或者能通過計算機，個人數字助手(PDA)或其它電子裝置讀取的電子介質或軟體的形式(例如，軟盤或CD ROM磁碟)，或者是提供如何施用該遺傳調節物治療患有CF的受試者的說明的任何其它方法。
儘管上述遺傳調節物可單獨給藥，但是它們優選作為藥用配製品的一部分給藥。該配製品可包含本領域的技術人員已知的可藥用的載體，以及其它治療劑。也可預期本發明的遺傳調節物可以各種可藥用的形式，例如，作為其可藥用的鹽給藥。
根據本發明給藥的遺傳調節物和配製品的合適劑量依賴於CFTR突變或缺陷的類型，和所治療的症狀的嚴重性，且也可根據不同的受試者而變化。測定可接受的或最佳的劑量一般包含平衡治療效益的水平與本發明的劑量和治療的任何危險或有害副作用。對於「治療有效」的劑量，必須具有所需效果，即，調節本文限定的CFTR修飾多肽的表達，從而導致受試者的有益改善，例如用該劑量治療的CF-影響的細胞離子轉運(例如，Cl-分泌)改善。最佳劑量可以是當給患有CF的受試者給藥時，導致例如，離子轉運(例如，氯(Cl-)分泌)改善到或接近野生型CFTR水平的劑量。
除了該遺傳調節物，本發明的藥用配製品也可包含也幫助緩解CF症狀的其它化合物和/或組合物，包括下文所述的CFTR修飾多肽調節物。本發明提供了治療CF的藥用配製品，它包含安全且治療有效量的上述合適遺傳調節物，可藥用的載體，和安全且治療有效量的下述CFTR修飾多肽調節物。該遺傳調節物可與一個以上的多肽調節物組合。遺傳調節物與多肽調節物的比例依賴於各單個化合物所需的劑量。優選的是，該多肽調節物可作為可藥用的水溶液給藥，其中該藥用配製品包含(1)從大約0.001％到大約10％的遺傳調節物；(2)從大約10％到大約99％的可藥用的載體；和(3)從大約0.001％到大約10％的下文所述的多肽調節物。
含有或不含可藥用的載體和/或其它多肽調節物的遺傳調節物的給藥可以是通過任何合適的途徑，包括口，鼻，局部(包括頰和舌下)，腸胃外(包括皮下，肌內，靜脈內和真皮內)，陰道或直腸，優選口和鼻給藥。因此該配製品包括適合於通過該途徑給藥的那些配製品。可預料到優選途徑可隨例如，受試者的狀況和年齡而變化。該配製品適合於以單位劑量形式提供，例如，片劑和持續釋放的膠囊，且可通過藥學領域的技術人員熟知的任何方法製備和給藥，包括脂質體傳遞系統。
適合於口服給藥的本發明的配製品可以為分離的單位，例如膠囊，扁囊劑或片劑，為粉末或顆粒，或者為溶液，懸液或乳劑。片劑形式可包括一種或多種乳糖，甘露醇，玉米澱粉，馬鈴薯澱粉，微晶纖維素，阿拉伯膠，明膠，二氧化矽膠體，croscarmellose sodium，滑石粉，硬脂酸鎂，硬脂酸，和其它賦形劑，著色劑，稀釋劑，緩衝劑，加溼劑，防腐劑，調味劑和藥用上相容的載體。適合於口腔局部給藥的配製品還包括在合適的基質或液體載體中給藥的錠劑，糖錠，漱口劑和吸入霧劑。錠劑形式可包含在諸如蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠中的活性成份，以及含有在諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠乳劑，凝膠的惰性基質中的活性成份的糖錠和含有除了活性成份外的諸如本領域已知的載體的類似物。適合於局部施用於皮膚的配製品可作為含有待給化合物和可藥用的載體的軟膏，乳膏，凝膠和糊劑，或者以經皮膚的膏藥提供。
適合於鼻給藥的配製品如果載體是固體則包括顆粒大小為，例如大約20至500微米，可通過鼻通道迅速吸入給藥的粉末。如果載體是液體則合適的的配製品可作為，例如，鼻噴霧劑或滴劑給藥。適合於通過吸入給藥的配製品包括放入加壓的諸如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，丙烷，氮等的可接受的推進劑中的氣溶膠配製品。該活性劑可用合適的賦形劑煙霧化。為了吸入給藥，該配製品優選以這樣的濃度溶於或分散於諸如水或鹽水的液體形式中，即在該濃度下該組合物充分溶解且在可吸入的體積內可給藥合適的劑量。合適的劑量應為每天將每升大約0.001至大約5.0mmol的組合物放在呼吸道表面大約4次。給藥可一天重複幾次，依賴於選擇的特定劑量和選擇的組合物從呼吸道清除的速率，目的是維持呼吸道上皮細胞的氯通透性。可通過噴霧器或標明劑量的吸入器給藥。用於遺傳調節物的氣溶膠給藥的合適方法也在1996年8月6日發布的美國專利5,543,399(Riordan等)；1997年6月24日發布的美國專利5,641,662(Debs等)；1998年10月27日發布的美國專利5,827,703(Debs等)；1998年5月26日發布的美國專利5,756,353(Debs)；1999年1月12日發布的美國專利5,858,784(Debs等)；1999年9月7日發布的美國專利5,948,681(Scanlin等)；和1999年12月14日發布的美國專利6,001,644(Debs等)中公開，引用所有這些文獻以供參考。
適合於腸胃外給藥的配製品包括可含有抗氧化劑，緩衝劑，制菌劑和導致該配製品與目的接受者血液等滲的溶質的含水和無水的無菌注射溶液；和可包含懸浮劑和增稠劑的含水和無水無菌懸液。適合於靜脈內和腹膜內給藥的配製品可包括，例如，可含有抗氧化劑，緩衝劑，制菌劑和導致該配製品與目的接受者血液等滲的溶質的含水和無水的，等滲無菌注射溶液和可包含懸浮劑，增溶劑，增稠劑，穩定劑，和防腐劑的含水和無水無菌懸液。該配製品可以在單位容器或多劑量容器中，例如，密封的安培和小瓶中，且可以是凍幹的，僅需要在使用前臨時加入諸如注射水的無菌液體載體。可從前面所述類型的無菌粉末，顆粒和片劑製備臨時注射溶液和懸液。
適合於陰道給藥的配製品可作為子宮託，栓塞，乳膏，凝膠，糊劑，泡沫劑或噴霧劑給藥。直腸給藥的配製品可作為含有合適基質的栓劑提供。
b.CFTR修飾多肽的功能或活性的調節物
CFTR修飾多肽，且特別是Kir4.2多肽，的功能和/或活性的合適調節物包括本領域的技術人員已知的對於緩解CF症狀有用的劑量的激活靶細胞中腺苷酸環化酶的試劑，例如，腎上腺素能試劑，catacholamines，cAMP激動劑和cAMP添加劑，例如毛喉素，異丙腎上腺素和沙丁胺醇(albuterol)，cAMP及其類似物；各種多肽激素，例如，刺激cAMP的血管升壓素；抑制cAMP降解的cAMP磷酸二酯酶抑制劑，例如烷基黃嘌呤，茶葉鹼和氨茶鹼；cAMP-特異性抑制劑，例如Rolipram(Shearing AG)，糖皮質激素，TGF-β(SMAD3)；鉀KATP通道開啟劑，例如cromakalim，吡那地爾(pinacidil)，尼可地爾(nicorandil)，硫酸米諾地爾(nimoxidil sulphate)，aprikalim，二氮嗪(diazoxide)；鉀BKCa通道開啟劑，例如NS004，苯並咪唑酮，例如1-乙基-2-苯並咪唑酮(1-EBIO)，fenamates，dehydroxoyasaponin-I(DHS-I)，maxikdiol，cromakalim，nirendipine，和根皮素；UTP，8-氧化補骨脂素(Methoxsalen，8-MOP)，和染料木黃酮；鈣離子激動劑，例如離子黴素，A23187，碳醯膽鹼，緩激肽，耐久黴素和毒胡蘿蔔素；人DNase 1；鈉通道抑制劑，例如阿米洛利(amiloride)和三氨蝶呤(triamterene)；胰酶添加劑；及其混合物。
用於本發明的合適的烷基黃嘌呤包括甲基黃嘌呤，例如3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和1，3-二甲基黃嘌呤(茶葉鹼)和其它黃嘌呤，例如罌粟鹼，己酮可可豆鹼和咖啡鹼。也可參見1994年11月22日發布的美國專利5,366,977(Pollard等)(本文引用以供參考)，其中公開了本文適用的拮抗A1-腺苷細胞受體而不拮抗A2-腺苷細胞受體的化合物且包括8-環戊基-1，3-二丙基黃嘌呤(CPX)，黃嘌呤氨基同系物(8-[4-[2-氨乙基氨基羰基甲氧基]-苯基]-1，3-二丙基黃嘌呤，XAC)，或其治療上有效的衍生物。
用於本發明的合適的苯並咪唑或苯並咪唑衍生物在2000年12月12日發布的美國專利6,159,968(Cuppoletti)(本文引用以供參考)中公開的那些物質，特別是2-[(吡啶基)-甲基亞磺醯基或甲硫基]苯並咪唑衍生物和其鹽，例如奧美拉唑(omeprazole)，蘭索拉唑(lansoprazole)，thimoprazole和pantoprazole，以及下列例證性的化合物4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-2-吡啶甲基)巰基]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3-甲基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-5-甲基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3-甲基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-5-甲基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-2-吡啶甲基)-亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3-甲基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-5-甲基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3-甲基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-5-甲基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑和5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；2-[2-(4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-乙醯基-6-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(4，6-二甲基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-乙醯基-6-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲酯基-6-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(4-乙氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲酯基-6-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(3-甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲酯基-6-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲酯基-6-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(4-甲氧基-5-甲基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲酯基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-5-甲酯基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-乙醯基)-苯並咪唑；2-[2-(4-甲氧基-5-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲氧基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲氧基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-氯)-苯並咪唑；2-[2-[3-甲基-4-(2，2，2-三氟乙氧基)吡啶基]甲基亞磺醯基]苯並咪唑(蘭索拉唑)；2-[2-[3-甲基-4-(2，2，3，3-四氟丙氧基)吡啶基]甲基硫]苯並咪唑；2-[(2-吡啶基)甲基亞磺醯基]苯並咪唑(thimoprazole)；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基吡啶基)甲基亞磺醯基]-5-甲氧基-1H-苯並咪唑(奧美拉唑)；2-[2-[4-(3-甲氧基丙氧基)-3-甲基吡啶基]甲基亞磺醯基]-1H-苯並咪唑；2-[2-(3，4-二甲氧基吡啶基)甲基亞磺醯基]-5-二氟甲氧基-1H-苯並咪唑(pantoprazole)；4-甲基-3-(2，2，2-三氟乙氧基)-5H-吡啶並[1′，2′4，5][1，2，4]thiaziano[2，3-a]苯並咪唑-13-鎓四氟硼酸鹽或其可藥用的鹽。
與CFTR遺傳調節物一樣，CFTR修飾多肽調節物可配製成治療組合物或包裝藥品用於治療患有CF的受試者。該治療組合物包括治療有效量的至少一種上述多肽調節物和一種可藥用的載體。該包裝藥品包括至少一種上述多肽調節物和施用該多肽調節物治療患有CF的受試者的說明書。說明書可書寫或列印在紙片上，可與包裝藥品包裝在一起，可以是能夠加載，安裝(直接或者通過遠程下載，例如通過LAN，WAN或網際網路)，或者能通過計算機，個人數字助手(PDA)或其它電子裝置讀取的電子介質或軟體的形式(例如，軟盤或CD ROM磁碟)，或者是提供如何施用該遺傳調節物治療患有CF的受試者的說明的任何其它合適的方法。
根據本發明給藥的CFTR修飾多肽調節物和配製品的合適劑量依賴於CFTR突變或缺陷的類型，和所治療的症狀的嚴重性，且也可根據受試者的不同而變化。測定可接受的或最佳的劑量一般包含平衡治療效益的水平與本發明的劑量和治療的任何危險或有害副作用。對於「治療有效」的劑量，必須具有所需效果，即，影響本文限定的CFTR修飾多肽的功能和/或活性，從而導致受試者的有益改善，例如，用該劑量治療的CF-影響的細胞離子轉運(例如，氯(Cl-)分泌)改善。最佳劑量可以是當給患有CF的受試者給藥時，導致例如，離子轉運(例如，氯(Cl-)分泌)改善到或接近野生型CFTR水平的劑量。
用於這些CFTR修飾多肽調節物的合適的給藥方法，藥用配製品，可藥用的載體，等可與前面所述的遺傳調節物所用的相同或相似。用於CFTR修飾多肽調節物的氣溶膠給藥的合適方法也在1996年8月6日發布的美國專利5,543,399(Riordan等)；1997年6月24日發布的美國專利5,641,662(Debs等)；1998年10月27日發布的美國專利5,827,703(Debs等)；1998年5月26日發布的美國專利5,756,353(Debs)；1999年1月12日發布的美國專利5,858,784(Debs等)；1999年9月7日發布的美國專利5,948,681(Scanlin等)；和1999年12月14日發布的美國專利6,001,644(Debs等)中公開，引用所有這些文獻以供參考。
c.CFTR修飾多肽治療通過將CFTR修飾多肽有效導入CF-影響的細胞膜給這些細胞提供CFTR修飾物功能和/或活性的任何方法可實現多肽治療。CFTR修飾多肽的有效量(即，足以減小，減輕，改善，或改良與CF相關的症狀的量)可單獨或與幫助穿過(例如，經過融合或胞吞)細胞膜的試劑聯合給藥到CF受試者(即，具有CF缺陷型細胞的受試者)。本領域的技術人員根據諸如所治療的症狀的類型和嚴重性，受試者的體重和/或年齡，受試者以前的病歷，該試劑選擇的給藥途徑的因素可確定什麼是「有效量」。
重組或天然CFTR修飾多肽可使用諸如離子交換色譜，凝膠過濾色譜，電泳和親和色譜的已知方法從宿主細胞中純化。參見Tilly等，J.Biol.Chem.，(1992)267(14)9470-73；Anderson等，Science(1991)251679-682)。純化方法的一個實施方案包含在非變性去汙劑存在下首先溶解該蛋白質。
為了用於蛋白質治療，一般將CFTR修飾多肽與諸如去汙劑或其它兩親性分子團的脂類，膜泡囊，脂質體，病毒體，或微粒體相聯。特別優選天然融合或者可改造成融合(例如，通過將融合蛋白摻入脂類中)的脂類組合物。融合蛋白可從病毒，例如副流感病毒1-3，呼吸道合胞病毒(RSV)，流感A，仙臺病毒，和披膜病毒的融合蛋白獲得。非病毒融合蛋白包括介導細胞-細胞融合的正常細胞蛋白。其它非病毒融合蛋白包括精子蛋白PH-30，它是位於精細胞表面的膜內在蛋白，據信它介導精子和卵之間的融合。參見Blobel等，Nature(1992)356248-251。還有其它的非病毒融合蛋白包括諸如PH-30與流感病毒血凝素結合成份和PH-30與分解蛋白(disintegrin)(例如，bitistatin，barbourin，蝮蛇毒素，和鋸鱗血抑肽)的嵌合PH-30蛋白。此外，可使用諸如聚乙二醇(PEG)的傳統化學融合劑融合脂膜。
與CFTR遺傳調節物一樣，CFTR修飾多肽可配製成治療組合物或包裝藥品用於治療患有CF的受試者。該治療組合物包括治療有效量的至少一種上述CFTR修飾多肽和一種可藥用的載體。該包裝藥品包括至少一種上述CFTR修飾多肽和施用該多肽調節物治療患有CF的受試者的說明書。說明書可書寫或列印在紙片上，可與包裝藥品包裝在一起，可以是能夠加載，安裝(直接或者通過遠程下載，例如通過LAN，WAN或網際網路)，或者能通過計算機，個人數字助手(PDA)或其它電子裝置讀取的電子介質或軟體的形式(例如，軟盤或CD ROM磁碟)，或者是提供如何施用該遺傳調節物治療患有CF的受試者的說明的任何其它合適的方法。
根據本發明給藥的CFTR修飾多肽和配製品的合適劑量依賴於CFTR突變或缺陷的類型，和所治療的症狀的嚴重性，且也可根據受試者的不同而變化。測定可接受的或最佳的劑量一般包含平衡治療效益的水平與本發明的劑量和治療的任何危險或有害副作用。對於「治療有效」的劑量，必須具有所需效果，即，給受試者提供有益改善，例如，用該劑量治療的CF-影響的細胞離子轉運(例如，氯(Cl-)分泌)改善。最佳劑量可以是當給患有CF的受試者給藥時，導致例如，離子轉運(例如，氯(Cl-)分泌)改善到或接近野生型CFTR水平的劑量。
用於這些CFTR修飾多肽的合適的給藥方法，藥用配製品，可藥用的載體，等可與前面所述的遺傳和多肽調節物所用的相同或相似。用於CFTR修飾多肽的氣溶膠給藥的合適方法也在1996年8月6日發布的美國專利5,543,399(Riordan等)；1997年6月24日發布的美國專利5,641,662(Debs等)；1998年10月27日發布的美國專利5,827,703(Debs等)；1998年5月26日發布的美國專利5,756,353(Debs)；1999年1月12日發布的美國專利5,858,784(Debs等)；1999年9月7日發布的美國專利5,948,681(Scanlin等)；和1999年12月14日發布的美國專利6,001,644(Debs等)中公開，引用所有這些文獻以供參考。
d.CFTR修飾基因治療本發明還涉及含有或不含其它試劑或治療的CFTR修飾基因的給藥，作為治療CF的療法。參見，例如，1993年8月31日發布的美國專利5,240,846(Collins等)，和1999年9月28日發布的美國專利5,958,893(Welsh等)(本文引用以供參考)，其中描述了給藥根據本發明的CFTR修飾基因的合適方法。重組逆轉錄病毒載體以及其它CFTR基因轉移方案可用於本發明的實踐中。可使用CF上皮細胞和攜帶轉導或轉移進其中的CFTR修飾基因的細胞系。
在治療CF的療法中使用的CFTR修飾基因可通過諸如DNA克隆，人工構建或其它方式的常規方法獲得。用於該療法的基因轉移可通過本領域熟知的各種方法實現，包括使用磷酸鈣共沉澱的轉染，靶細胞與攜帶該CFTR修飾基因的脂質體，紅細胞血影或原生質球的融合，質粒和病毒載體介導的轉移和DNA蛋白複合物介導的基因轉移。
作為選擇，可將編碼CFTR修飾多肽的基因製品摻入合適的載體中用於將該基因傳遞進CF受試者的CF影響的細胞中。可使用標準技術(例如，經過磷酸鈣或氯化鈣共沉澱，DEAE葡聚糖介導的轉染，脂轉染，或電穿孔)將編碼合適多肽的CFTR修飾基因(例如，在下文所述的合適表達序列盒中)導入培養的細胞中。然後以允許表達CFTR修飾多肽的方式體外培養重組細胞。優選的產生CFTR修飾多肽的宿主細胞包括例如，哺乳動物(人和非人哺乳動物)細胞，酵母細胞和昆蟲細胞。
用於該療法的重組病毒載體包含能夠感染靶細胞的逆轉錄病毒基因組的至少一部分和與其可操作地相連的CFTR修飾基因的DNA。「感染」一般是指病毒將遺傳物質轉移給其宿主或靶細胞的過程。優選的是在本發明的載體構建中使用的逆轉錄病毒還引起複製缺陷以去掉病毒複製對靶細胞的影響。在這種情況下，可按照常規技術用輔助病毒包裝該複製缺陷型病毒基因組。一般來說在本發明的實踐中可採用滿足上述傳染性和CFTR基因轉移能力的條件的任何逆轉錄病毒。可預料到當病毒載體方案用於CFTR修飾基因轉移時，使用減毒的或烈性的病毒也是可預期的。如果在本發明的實踐中適用，也可使用CFTR修飾基因的擴增來增強正常表達水平。
根據本發明轉導或基因轉移靶向的細胞包括需要傳遞CFTR修飾基因的任何細胞。一般來說，該細胞是具有CFTR基因缺陷或不足的那些細胞，例如CF影響的細胞。靶向的CF影響的細胞優選是上皮細胞，包括胰腺，汗腺，肝，腸，腎細胞，且甚至更優選呼吸道上皮細胞，例如肺細胞。
根據本發明可在體內或體外治療細胞或細胞群。例如，在體內治療中，可給受試者施用本發明的CFTR修飾物載體，優選在生物學相容的溶液或可藥用的給藥載體中通過吞食，注射，吸入或許多其它方法給藥。給藥劑量隨受試者的不同而變化且可通過平衡CFTR功能增強的水平與任何危險或有害副作用來測定。監測轉導水平，CFTR修飾物表達和/或CFTR修飾多肽的出現或水平可幫助選擇和調整給藥劑量。本發明也包含體外轉導。可從受試者取出或者提供具有缺陷型CFTR基因的細胞群體，根據本發明的原理用CFTR修飾基因轉導，然後(再)導入受試者。
儘管可用本發明的基因轉移方法和載體靶向諸如胰腺和汗腺細胞的任何CF-影響的上皮細胞，但是由於CF最嚴重的併發症通常與肺有關，因此呼吸道上皮細胞是本發明的基因治療最可取的靶細胞。另外，鑑於已經發現呼吸道上皮細胞容易被重組逆轉錄病毒感染，因此對這些細胞進行根據本發明的基因轉移是完全可行的。
用於CFTR修飾基因的氣溶膠給藥的合適方法，以及轉染細胞的方法也在1996年8月6日發布的美國專利5,543,399(Riordan等)；1997年6月24日發布的美國專利5,641,662(Debs等)；1998年10月27日發布的美國專利5,827,703(Debs等)；1998年5月26日發布的美國專利5,756,353(Debs)；1999年1月12日發布的美國專利5,858,784(Debs等)；1999年9月7日發布的美國專利5,948,681(Scanlin等)；和1999年12月14日發布的美國專利6,001,644(Debs等)中公開，引用所有這些文獻以供參考。
可構建包含與轉錄和翻譯調控元件(例如，啟動子，核糖體結合位點，操縱子，或增強子)可操作地相連或在其調控下的編碼合適多肽的CFTR修飾基因的「表達序列盒」並用於體外或體內表達CFTR修飾多肽。所用的調控元件的選擇可根據，例如轉染的宿主細胞和所需的表達水平而變化。用於哺乳動物細胞的一些基因啟動子是本領域已知的且包括，例如，肺特異性表達的表面活性蛋白-C(SP-C)啟動子，磷酸甘油酸(PGK)啟動子，猿猴病毒40(SV 40)早期啟動子，勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子，腺病毒主要晚期啟動子(MLP)和人巨細胞病毒(CMV)立即早期1啟動子。然而，在本發明中可使用產生合適表達水平的任何基因啟動子。誘導型基因啟動子，(例如，從熱激基因，金屬硫蛋白基因，β幹擾素基因，或類固醇激素應答性基因獲得的啟動子)可用於根據外部刺激調節轉錄。
4.鑑定包括Kir4.2基因的CFTR修飾基因本發明還涉及檢測和鑑定CFTR修飾基因，包括鑑定受到體內存在或不存在CFTR的影響的RNAs，以鑑定包括類似於表1所列的那些正調節基因和類似於表2所列的那些負調節基因的基因，並鑑定與CFTR相互作用或補償CFTR以維持或正常化肺功能的途徑。在無感染或疾病的肺組織中觀察到對缺乏CFTR的定型化基因組反應。
在一個實施方案中，使用Affymetrix小鼠基因陣列檢測從年齡匹配的野生型和CFTR-缺陷型小鼠，特別是CFTR(+/+)與FABP-hCFTR/mCFTR(-/-)或CFTR(-/-)小鼠分離的肺mRNAs的差異表達(相對強度標示在y-軸，而小鼠對年齡的增加在x-軸)。以相同的方式還分析了表達突變CFTR的CFTR缺陷型小鼠，即SPC-hΔ508/FABP-hCFTR/mCFTR(-/-)，以及具有對CFTR基因的其它突變，包括強力黴素(doxycyline)-誘導的突變的小鼠。生物信息篩選分析(即，使用p-值＜0.02)揭示了在統計學上與CFTR-缺陷型表型相關的341個基因。CFTR本身的表達在CFTR(-/-)小鼠中顯著下降，證實了該小鼠模型。用進一步的篩選，該341個基因中有27個符合統計學檢驗(p-值＜0.05)，證實在CFTR-缺陷型小鼠中與野生型相比它們存在差異，表明這些基因可潛在地修飾CFTR-依賴型途徑，且因此修飾CF疾病過程(見圖l)。該27個基因之一，即Kir4.2的補償活性的根據是，在試驗的所有CFTR-缺陷型小鼠中都增加。通過LightCycler PCR評定與野生型小鼠肺相比在CFTR-缺陷型小鼠中Kir4.2 mRNA也增加，證實了該基因陣列數據結果(見圖2)。參見Gosset等，「A New Inward Rectifier Potassium Channel Gene(KCNJ15) Localized on Chromosome 21 in the Down Syndrome ChromosomeRegion 1(DCR 1)，」Genomics(1997)44237-41。在CHO細胞中表達小鼠Kir4.2 cDNA，然後用cAMP-刺激劑，例如毛喉素和IBMX的組合，進行處理，這樣可增加鉀(K+)離子流(見圖3)。由於基底外側鉀(K+)轉運加強頂端氯(Cl-)轉運，這表明Kir4.2的刺激或表達增加可能增強正常的或CFTR-受損的細胞或肺中的氯(Cl-)離子轉運。由於Kir4.2在肺呼吸道上皮相關區域表達，因此Kir4.2的表達增加可用於繞過氯(Cl-)轉運和細胞功能的CFTR-依賴型缺陷。
涉及檢測和鑑定CFTR修飾基因的另一實施方案如下在腸脂肪酸結合蛋白基因啟動子(iFABP)控制下在腸上皮中表達人CFTR cDNA，可完全矯正小腸病變並支持CFTR(-/-)轉基因小鼠的正常產後存活。iFABP-hCFTR，CFTR(-/-)小鼠可在混合的FVB/N，C57BL/6背景中維持而沒有GI或肺病的跡象。組織學和生化研究鑑定了與表達CFTR的窩型匹配的對照相比在這些小鼠的肺組織中無明顯病變。參見Zhou等，Science，(1994)，2661705-8；Chroneos，J.Immunol.，(2000)1653941-50。小鼠居住在小型分隔籠中。成年iFABP-hCFTR，CFTR(-/-)和對照小鼠的肺通過在血液瓊脂板上定量培養肺勻漿組織評定無細菌病原體或建群。
將FABP-hCFTR(+/+)/mCFTR(-/-)小鼠與野生型FVB/N-mCFTR(+/+)小鼠交配，用於產生F1 FABP-hCFTR(+/-)/mCFTR(-/+)小鼠。雜交這些小鼠以產生F2後代窩型匹配小鼠，然後確定其基因型。確定基因型使用下列引物進行用於mCFTR PCR的引物是正向引物(內含子9)5′-AGG GGC TCGCTC TTC TTT GTG AAC，-3′，反向引物(內含子10)5′-TGG CTG TCT GCTTCC TGA CTA TGG，-3′，用於新黴素抗性基因PCR的正向引物是5′-CACAAC AGA CAA TCG GCT GCT，-3′，反向引物是5′-ACA GTT CGG CTGGCG CGA G，-3′，用於hCFTR PCR的正向引物(外顯子9)是5′-AAA CTTCTA ATG GTG ATG ACA G-3′。反向引物(外顯子11)是5′-AGA AAT TCTTGC TCG TTG AC-3′。鑑定FABP-hCFTR(+/+)/mCFTR(-/-)和hCFTR(+/+)/mCFTR(+/+)小鼠。所有CFTR(+/+)小鼠的靶mCFTR基因都是雜合型。
在下面實施例中，成對進行cDNA合成和微陣列分析以最小化與RNA分離和雜交條件相關的技術變異性。從性別匹配的窩型匹配小鼠小心分離肺並去掉輸導氣管和縱隔結構。在TRIzol試劑(Life Technologies)中使用廠商建議的方法勻漿肺。為了最小化在小鼠群體中品種差異的潛在影響，可從3，6，和11周齡的性別匹配的窩型匹配小鼠中分離肺RNA。還從3周齡的存活CFTR-/-)/hCFTR-/-)和CFTR(+/+)窩型匹配小鼠肺中分離了RNA用於與攜帶iFABP-hCFTR轉基因的小鼠進行比較。
實施例1使用帶有T7啟動子序列的寡聚dT對總RNA進行逆轉錄，接著進行第二鏈cDNA合成。然後使用T7 RNA聚合酶擴增並生物素標記抗血清cRNA，之後使用Affymetrix建議的方法與Affymetrix基因晶片小鼠U74aV2雜交。Affymetrix MicroArray Suite 5.0版用於使用默認掃描設置掃描和定量基因晶片。從各晶片收集強度數據，定標到1500的靶強度並使用MicroArray Suite和GeneSpring 5.0(Silicon Genetics，Inc.，Redwood City，CA)分析結果。cDNAs與U74aV2晶片(Affymetrix Inc.)雜交。雜交數據在2-步加工中正態化以去掉或最小化晶片和基因水平的系統差異來源。具體地說，正態化各晶片中所有基因在晶片上的分布以控制樣品間的差異。mCFTR(-/-)小鼠的各RNA樣品相對於其特定的對照(即，性別和年齡匹配的mCFTR(+/+)窩型匹配小鼠)正態化。將數據進一步轉化成對數比率用於分布的分析和對稱。通過結合分布分析(JMP4，SAS Institute，Inc.)和Welch ANOVA來鑑定RNA水平的改變。使用異常值框和四分值框繪圖來鑑定符合超高異常值＞＝上級四分值+1.5(中間四分值範圍)，和超低異常值＜＝下級四分值-1.5(中間四分值範圍)定義的異常值。通過Welch t-檢驗以p值＜＝0.05計算顯著改變。通過Westfall和Young置換(permutation)計算調整的P-值以校正假陽性(GeneSpring 4.2.1，Silicon Genetics)。使用單向ANOVA進行各基因型和年齡組之間的比較。為了鑑定不分年齡因CFTR基因型而差異表達的基因，使用分級和k-方式聚類來鑑定在所有三個時間點與CFTR缺乏反應的基因表達的一致改變。根據再現性和絕對強度進一步篩選候選RNAs。計算各平行測定的平均值，標準誤差和係數差異。從分析中刪除CV＞＝50％的平行測定。表達在檢測水平之下的基因作為實驗噪聲被排除。
結果為了鑑定與CFTR反應的基因，比較了3，6或11周齡的iFABP-hCFTR，mCFTR(-/-)，iFABP-hCFTR，mCFTR(+/+)；mCFTR(-/-)和mCFTR(+/+)窩型匹配小鼠的肺RNAs。在3和6周齡分離的RNA以一式兩份進行微陣列分析。正態化10個Affymetrix鼠基因組U74Av2晶片的數據並鑑定在CFTR缺陷型(CFTR-)和對照(CFTR+)小鼠之間的統計學差異。通過異常值分析和/或不配對的t-檢驗鑑定與年齡相關的差異。正態化後，觀察到從所有年齡獲得的肺組織的強度數據為正態分布。來自3周齡CFTR(+/+)和CFTR(-/-)小鼠(無iFABP-hCFTR轉基因)的肺RNA數據與攜帶FABP-hCFTR基因的數據分布相似且因此在分析中包括。
為了鑑定不分年齡與CFTR反應而差異表達的RNAs，將CFTR(-/-)和CFTR(+/+)數據分成兩組。圖4表示對數比率分布和組合數據組的異常值繪圖。從分析的12442個基因/ESTs鑑定了共1977個異常值。848個RNAs的豐度增加；1129個減少。Welch t-檢驗與Westfall和Young的逐步降低置換(step-down permutation)一起將差異表達的RNAs數目進一步縮小到315。使用分級聚類來觀察和分類該數據組。參見圖5。以2D矩陣表示數據以鑑定具有相似表達模式的基因群且顯示315個選定基因的明顯分級的基因表達模式。晶片水平上(樹狀圖頂部)受CFTR影響的RNAs形成兩個不同的組。在每組內，從年齡匹配的小鼠對收集的樣品比來自不同年齡的樣品更接近，表明年齡也影響基因表達。在RNA水平上(左側的樹狀圖)，基因明顯分成兩個主要的組在mCFTR(-/-)小鼠中mRNAs增加或減少的組。以在所有時間點表達水平差異一致(CV＜＝50％)和其絕對強度超過243(通過Affymetrix軟體90％的基因該數據組＜＝243，稱為陰性)進一步篩選基因。進一步的篩選將RNAs數目減少到54個，其中29個與其mCFTR(+/+)窩型匹配的小鼠相比在mCFTR(-/-)中一致增加且25個減少。見表1(正調節基因)和表2(負調節基因)。這54個基因的表達模式在圖6和7中表示，證實了CFTR反應性RNAs的表達模式不分年齡具有一致性。
差異表達的基因根據其已知的或推測的功能進一步分類。評定和指定每個基因的功能類型。為了簡化計算，假定每一類型中的基因滿足二項分布。使用全部U74Av2作為參考數據組計算每一類型的二項概率。「炎症性反應」是mCFTR(-/-)小鼠中RNAs增加的基因最具代表性的類型。在因缺乏CFTR而增加其豐度的RNAs中，最具代表性的是其影響炎症，轉錄，和運輸且由與mCFTR(-/-)小鼠中其表達減少的那些基因完全不同的功能類型的組組成。見表1(正調節基因)和表2(負調節基因)。在三個年齡組使用Welch t-檢驗還評估了FABP-hCFTR轉基因對RNA表達的潛在影響。在GI-矯正小鼠的分析中鑑定的差異調節的RNAs在mCFTR(-/-)小鼠中受到同樣的影響，表明iFABP-hCFTR對該基因亞組無影響。其表達不依賴iFABP-hCFTR轉基因而改變的基因包括7個減少的和11個增加的RNAs。它們的表達水平的差異不顯著(不超過1.5-倍)，如下表所示表3 fabp-hCFTR(+/+)對肺基因表達的影響

比較iFABP-hCFTR，CFTR(-/-)(即，腸矯正，GC)的肺RNA樣品與CFTR(+/+)(無iFARP-hCFTR轉基因，即腸未矯正的，NGC)的樣品比率定義為R＝GC/NGC if(GC＞NGC)；如果(GC＜NGC)則R＝-NGC/GC。
實施例2為了驗證微陣列分析鑑定的反應性RNAs，使用Light cycler_或定時熱循環儀進行實時RT-PCR，接著進行凝膠電泳。按上述分離肺RNAs。通過逆轉錄產生cDNAs並使用下列引物進行PCR分析Kir 4.2正向引物為5′-CTTTGA GTT TGT GCC TGT GGT TTC，-3′，反向引物為5′-GCT GTG TGA TTTGGT AGT GCG G，-3′；人CFTR同上；小鼠CFTR正向引物為5′-TGC TTC CCTACA GAG TCA TCA ACG G，-3′，反向引物為5′-CAC AGG ATT TCC CACAAC GCA GAG-3′；β-肌動蛋白標準化正向引物為5′-TGG AAT CCT GCGGCA TCC ATG AAC；反向引物為5′-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAGTCC G，-3′；GAPDH正向引物為5′-CTT CAC CAC CAT GGA GAA GGC，-3′，反向引物為5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG，-3′；CEBPδ正向引物為5′-CGC AAC AAC ATC GCT GTG，-3′，反向引物為5′-GGG CTG GGC AGTTTT TTG；-3′，TNF-AIP-3正向引物為5′-GCA CGA ATA CAA GAA ATG GCAGG，-3′，反向引物為5′-GGC ATA AAG GCT GAG TGT TCA，-3′CG；Grin 2d正向引物為5′-CCT TCT TTG CCG TCA，TCT TTC TTG C，-3′，反向引物為5′-AAA CTT CAG GGG TGG GTA TTG CTC C，-3′。
結果通過RT-PCR證實了在微陣列分析中鑑定的選定RNA水平的改變。使用β-肌動蛋白或GAPDH正態化mRNA水平。對於Kir 4.2(Kcnj15)，CEBPδ，TNF-AIP-3和Grin2d，CFTR(-/-)小鼠與對照窩型匹配小鼠相比mRNA明顯增加。見圖8，9，10和11。正如預期，以RT-PCR在mCFTR(-/-)小鼠中沒有檢測到鼠CFTR，在攜帶iFABP-hCFTR的小鼠肺中也沒有檢測到hCFTRmRNA。
實施例3對選定的基因進行深入檢索以鑑定生物學功能和相關的調節途徑。構建所有陣列元件及其相關Genbank登錄號的帶系統標識符的U74Av2注釋(annotation)資料庫。標明基因描述，功能類型，生物學過程，分子功能，細胞成份，蛋白結構域和文獻信息。信息資源包括NetAffy(http//www.affymetrix.com)，來源檢索(http//genomewww5.stanford.edu/cgi-bin/SMD/source/)，BLAST NCBI，LocusLink，小鼠-人同源檢索(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)，和基因本體資料庫(http//www.godatabase.org/chi-bin/go.cgi)。差異表達的基因根據基因本體論定義分類進功能類型中。為了確定哪一種功能類型總體上代表選定基因表，使用全部U74Av2(含有12488個小鼠基因)作為參考數據組計算各類型的二項概率。二項概率由如下等式定義P(k,n,p)=k=0nnkpk(1-p)n-k]]>如果在給定群體(U74Av2)中概率為p則它產生在n次試驗中取得k次成功的概率。使用公開的文獻信息確定潛在的蛋白質/蛋白質或蛋白質/DNA相互作用。
從成對的mCFTR(-/-)小鼠和mCFTR(+/+)窩型匹配小鼠(缺少iFABP-hCFTR轉基因的小鼠)準備陣列分析，證實了微陣列的發現，表明在mCFTR(-/-)肺中缺乏mCFTR mRNA和該RNA的改變都不依賴於iFABP-hCFTR轉基因。
實施例4產後動物的肺通過氣管插管用4％的低聚甲醛以25cm H2O壓力充氣固定。肺組織根據標準方法加工並包埋於石蠟中。用於免疫染色的程序在Whitsett等，J.Biol.Chem.，(2002)27722743-49中描述。抗110kDa Mac-3抗原的兔單克隆抗體以1∶40,000用於鑑定肺泡巨噬細胞(Pharmingen，SanDiego，CA)。
結果成年iFABP-hCFTR，CFTR(-/-)；iFABP-hCFTR，CFTR(+/+)，和CFTR(+/+)對照小鼠的肺組織學無差異。見圖11，12，13和14。不存在肺炎症，感染或改型的跡象。使用Mac-3染色鑑定肺泡巨噬細胞。肺泡巨噬細胞的數目和組織學不因mCFTR而改變。組織學分析證實了在這些小鼠的肺中無結構異常，感染或炎症，支持了基因表達的改變與CFTR相關而與年齡或肺病不相關的觀念。
mCFTR(-/-)小鼠中肺內環境穩定的維持與基因表達的複雜適應性應答相關。CFTR影響編碼轉錄因子，離子通道，膜受體，細胞因子，和細胞內運輸蛋白的RNAs。最終，CFTR通過可能代表對CFTR(-/-)蛋白複合物介導的功能進行轉錄應答的蛋白質-蛋白質相互作用來改變與CFTR相互作用的許多蛋白質的表達。其表達因CFTR而改變的基因的多樣性支持了這樣的觀點，即除了調節Cl-轉運，CFTR在多種細胞功能中起不同的作用。在CFTR(-/-)小鼠中肺內環境穩定通過對缺乏CFTR的複雜基因組應答來維持而不是通過單一替代性Cl-通道的作用來維持。最後，在本發明中鑑定的基因和途徑提供了CFTR與可影響CF肺病發病的細胞過程之間的新聯繫。
儘管描述了本發明的具體實施方案，但是對本領域的技術人員而言顯而易見的是可對其作出各種修改而不偏離所附權利要求書限定的本發明的實質和範圍。
序 列 表110兒童醫院醫療中心(Children’s Hospital Medical Center)120用於治療囊腫性纖維化的CFTR修飾基因和經表達的多肽以及檢測和/或鑑定它們的方法和產品130CHM-001PAT15060/384,8561512002-05-3115060/384,8551512003-05-311608170PatentIn version 3.221012111443212DNA213小鼠4001gccctctaca tgcatgctcg agcggccgcc agtgtgatgg atatctgcag aattcggctt 60ggtaagccag gtgggagaag gggagcgagg acgcgccact taccctgcag aagattcctg 120acctacagag tgagtgacca ggtggtccaa agatggatgc cattcacctt ggcatgtcca 180gtgccccact ggtgaagcat accaacgggg ttggactcaa ggcccacaga ccccgagtca 240tgtcaaaggg tgggcacagt aatgtgagaa tcgataaggt agacggaatc tatttactct 300acctccagga cttgtggaca accgtcatcg acatgaagtg gcgatacaag ctcaccctat 360ttgctgccac ctttgtgatg acctggtttc tgtttggagt ggtctactat gccatagcct 420ttattcatgg tgacttacaa cttggggaat ctaattccaa ccacacaccc tgcattatga 480aagtggactc tctcacggga gcattcctct tttccttgga atctcagaca accattggct 540acggggtccg ttccatcaca gaggagtgtc cccatgctat cttcctctta gtcgcccaac 600tggtcatcac cacattgatt gagatcttca ttacggggac ctttctggct aaaattgcaa 660gacccaaaaa gcgagccgag accattaagt tcagccactg tgctgtcatc agcaagcaga 720atggaaagct atgcctggtc atcagggtgg ccgacatgag gaagagtctc ctgattcagt 780gccagctctc tggaaaactc ctgcagacac acgtcaccaa agagggagaa cgcattctcg 840tcaaccaggc cactgtcaaa ttccacgtgg actcctcttc cgagagtccc ttcctcatcc 900tgcccatgac cttctaccac gtgttggatg agacaagccc cctgcgggac ctcacacccc 960aaaacgtaaa ggagaaggag tttgagctgg tggtacttct caacgccacg gtggagtcta1020ccagcgccgt ctgccagagc cgaacgtctt acatcccgga ggagatctac tggggctttg1080agtttgtgcc tgtggtttct ctctccaaaa atggaaagta tgtggctgat ttcagtcaat1140
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225 230 235 240Ser Ser Ser Glu Ser Pro Phe Leu Ile Leu Pro Met Thr Phe Tyr His245 250 255Val Leu Asp Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Leu Thr Pro Gln Asn Val260 265 270Lys Glu Lys Glu Phe Glu Leu Val Val Leu Leu Asn Ala Thr Val Glu275 280 285Ser Thr Ser Ala Val Cys Gln Ser Arg Thr Ser Tyr Ile Pro Glu Glu290 295 300Ile Tyr Trp Gly Phe Glu Phe Val Pro Val Val Ser Leu Ser Lys Asn305 310 315 320Gly Lys Tyr Val Ala Asp Phe Ser Gln Phe Glu Gln Ile Arg Lys Ser325 330 335Pro Gly Cys Thr Phe Tyr Cys Ala Asp Ser Glu Lys Gln Lys Leu Glu340 345 350Glu Gln Tyr Arg Gln Glu Asp Gln Arg Glu Arg Glu Leu Arg Ser Leu355 360 365Leu Leu Gln Gln Ser Asn Val370 37521032112732212DNA213人4003cagatctctg ggatcttcag ctgagattgg gccccagcac ctggactcaa ggcagtagca 60gaatcccatg gtagccaggt gggtgaaggg gagcgaggac gttctacctg ccttgaagaa 120gacacctgac ctgcggagtg agtgaccagt gtttccagag cctggcaatg gatgccattc 180acatcggcat gtccagcacc cccctggtga agcacactgc tggggctggg ctcaaggcca 240acagaccccg cgtcatgtcc aagagtgggc acagcaacgt gagaattgac aaagtggatg 300gcatatacct actctacctg caagacctgt ggaccacagt tatcgacatg aagtggagat 360acaaactcac cctgttcgct gccacttttg tgatgacctg gttccttttt ggagtcatct 420actatgccat cgcgtttatt catggggact tagaacccgg tgagcccatt tcaaatcata 480ccccctgcat catgaaagtg gactctctca ctggggcgtt tctcttttcc ctggaatccc 540agacaaccat tggctatgga gtccgttcca tcacagagga atgtcctcat gccatcttcc 600tgttggttgc tcagttggtc atcacgacct tgattgagat cttcatcacc ggaaccttcc 660tggccaaaat cgccagaccc aaaaagcggg ctgagaccat caagttcagc cactgtgcag 720tcatcaccaa gcagaatggg aagctgtgct tggtgattca ggtagccaat atgaggaaga 780gcctcttgat tcagtgccag ctctctggca agctcctgca gacccacgtc accaaggagg 840
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Thr Ile Lys Phe Ser His Cys Ala Val Ile Thr Lys Gln Asn Gly Lys180 185 190Leu Cys Leu Val Ile Gln Val Ala Asn Met Arg Lys Ser Leu Leu Ile195 200 205Gln Cys Gln Leu Ser Gly Lys Leu Leu Gln Thr His Val Thr Lys Glu210 215 220Gly Glu Arg Ile Leu Leu Asn Gln Ala Thr Val Lys Phe His Val Asp225 230 235 240Ser Ser Ser Glu Ser Pro Phe Leu Ile Leu Pro Met Thr Phe Tyr His245 250 255Val Leu Asp Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Leu Thr Pro Gln Asn Leu260 265 270Lys Glu Lys Glu Phe Glu Leu Val Val Leu Leu Asn Ala Thr Val Glu275 280 285Ser Thr Ser Ala Val Cys Gln Ser Arg Thr Ser Tyr Ile Pro Glu Glu290 295 300Ile Tyr Trp Gly Phe Glu Phe Val Pro Val Val Ser Leu Ser Lys Asn305 310 315 320Gly Lys Tyr Val Ala Asp Phe Ser Gln Phe Glu Gln Ile Arg Lys Ser325 330 335Pro Asp Cys Thr Phe Tyr Cys Ala Asp Ser Glu Lys Gln Gln Leu Glu340 345 350Glu Lys Tyr Arg Gln Glu Asp Gln Arg Glu Arg Glu Leu Arg Thr Leu355 360 365Leu Leu Gln Gln Ser Asn Val370 37521072111708212DNA213人4007gcagtagcag aatcccatgg tagccaggtg ggtgaagggg agcgaggacg ttctacctgc 60cttgaagaag acacctgacc tgcggagtga gtgaccagtg tttccagagc ctggcaatgg 120atgccattca catcggcatg tccagcaccc ccctggtgaa gcacactgct ggggctgggc 180tcaaggccaa cagaccccgc gtcatgtcca agagtgggca cagcaacgtg agaattgaca 240aagtggatgg catataccta ctctacctgc aagacctgtg gaccacagtt atcgacatga 300agtggagata caaactcacc ctgttcgctg ccacttttgt gatgacctgg ttcctttttg 360gagtcatcta ctatgccatc gcgtttattc atggggactt agaacccggt gagcccattt 420caaatcatac cccctgcatc atgaaagtgg actctctcac tggggcgttt ctcttttccc 480
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Phe Gly Val Ile Tyr Tyr Ala Ile Ala Phe Ile His Gly Asp Leu Glu85 90 95Pro Gly Glu Pro Ile Ser Asn His Thr Pro Cys Ile Met Lys Val Asp100 105 110Ser Leu Thr Gly Ala Phe Leu Phe Ser Leu Glu Ser Gln Thr Thr Ile115 120 125Gly Tyr Gly Val Arg Ser Ile Thr Glu Glu Cys Pro His Ala Ile Phe130 135 140Leu Leu Val Ala Gln Leu Val Ile Thr Thr Leu Ile Glu Ile Phe Ile145 150 155 160Thr Gly Thr Phe Leu Ala Lys Ile Ala Arg Pro Lys Lys Arg Ala Glu165 170 175Thr Ile Lys Phe Ser His Cys Ala Val Ile Thr Lys Gln Asn Gly Lys180 185 190Leu Cys Leu Val Ile Gln Val Ala Asn Met Arg Lys Ser Leu Leu Ile195 200 205Gln Cys Gln Leu Ser Gly Lys Leu Leu Gln Thr His Val Thr Lys Glu210 215 220Gly Glu Arg Ile Leu Leu Asn Gln Ala Thr Ala Lys Phe His Val Asp225 230 235 240Ser Ser Ser Glu Ser Pro Phe Leu Ile Leu Pro Met Thr Phe Tyr His245 250 255Val Leu Asp Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Leu Thr Pro Gln Asn Leu260 265 270Lys Glu Lys Glu Phe Glu Leu Val Val Leu Leu Asn Ala Thr Val Glu275 280 285Ser Thr Ser Ala Val Cys Gln Ser Arg Thr Ser Tyr Ile Pro Glu Glu290 295 300Ile Tyr Trp Gly Phe Glu Phe Val Pro Val Val Ser Leu Ser Lys Asn305 310 315 320Gly Lys Tyr Val Ala Asp Phe Ser Gln Phe Glu Gln Ile Arg Lys Ser325 330 335Pro Asp Cys Thr Phe Tyr Cys Ala Asp Ser Glu Lys Gln Gln Leu Glu340 345 350Glu Lys Tyr Arg Gln Glu Asp Gln Arg Glu Arg Glu Leu Arg Thr Leu355 360 365Leu Leu Gln Gln Ser Asn Val370 37權利要求
1.治療具有CF-影響的細胞的受試者中的囊性纖維化的方法，包括步驟給具有CF-影響的細胞的受試者施用治療有效量的選自由CFTR修飾多肽；CFTR修飾基因的遺傳調節物；CFTR修飾多肽的調節物；或其組合組成的組中的一個成員。
2.權利要求1的方法，包括給受試者施用由鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基，膜糖蛋白，ras-相關性地塞米松誘導型蛋白(DEXRAS1)，ATP-敏感性輸入矯正鉀通道14，鋅指蛋白(Peg3)，分泌捲曲相關蛋白sFRP-2，連接蛋白37間隙連接膜通道蛋白α4，和人的造血特異性蛋白1(GenBank登錄號X84797)組成的組中的CFTR修飾多肽；選自由Kir4.2，EST AffymetrixID#92319，Repetin，SWAP-70，vq96e09.41，uo89c05.x1，Preproapelin，Caspase-12，胰島細胞自身抗原1，鈉尿肽前體A型，U[-M-BH1-ang-b-04-0-U].s1，C88243，U[-M-BH0-ajq-h-03-0-U].s1，丁醯膽鹼酯酶，同源框A5，Wnt10a，囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白同源物，以及表1和2所列CFTR修飾基因組成的組中的CFTR修飾基因表達的CFTR修飾多肽；選自由表達鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基，膜糖蛋白，ras-相關性地塞米松誘導型蛋白(DEXRAS1)，ATP-敏感性輸入矯正鉀通道14，鋅指蛋白(Peg3)，分泌捲曲相關蛋白sFRP-2，連接蛋白37間隙連接膜通道蛋白α4，和人的造血特異性蛋白1(GenBank登錄號X84797)，和那些被選自由Kir4.2，EST Affymetrix ID#92319，Repetin，SWAP-70，vq96e09.41，uo89c05.x1，Preproapelin，Caspase-12，胰島細胞自身抗原1，鈉尿肽前體A型，U[-M-BH1-ang-b-04-0-U].s1，C88243，U[-M-BH0-ajq-h-03-0-U].s1，丁醯膽鹼酯酶，同源框A5，Wnt10a，囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白同源物，以及表1和2所列CFTR修飾基因組成的組中的CFTR修飾基因所表達的CFTR修飾多肽的那些基因組成的組中的CFTR修飾基因的遺傳調節物；選自鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基，膜糖蛋白，ras-相關性地塞米松誘導型蛋白(DEXRAS1)，ATP-敏感性輸入矯正鉀通道14，鋅指蛋白(Peg3)，分泌捲曲相關蛋白sFRP-2，連接蛋白37間隙連接膜通道蛋白α4，和人的造血特異性蛋白1(GenBank登錄號X84797)，選自由Kir4.2，ESTAffymetrix ID#92319，Repetin，SWAP-70，vq96e09.41，uo89c05.x1，Preproapelin，Caspase-12，胰島細胞自身抗原1，鈉尿肽前體A型，mSox7，U[-M-BH1-ang-b-04-0-U].s1，C88243，U[-M-BH0-ajq-h-03-0-U].s1，丁醯膽鹼酯酶，同源框A5，Wnt10a，囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白同源物，以及表1和2所列CFTR修飾基因組成的組中的CFTR修飾基因所表達的CFTR修飾多肽中的CFTR修飾多肽的調節物，或其組合。
3.權利要求2的方法，包含給受試者施用CFTR修飾基因表達的CFTR修飾多肽，所述CFTR修飾基因選自由Kir4.2；鉀輸入矯正通道，成員15；亞家族J，成員15；溶質載體家族38，成員4，蛋白酶體(前體，macropain)26S亞基，ATPase 3；和穀氨酸受體，離子化，NMDA2D(ε4)組成的組。
4.權利要求2的方法，包含給受試者施用CFTR修飾基因的遺傳調節物，所述CFTR修飾基因選自由Kir4.2；鉀輸入矯正通道，成員15；亞家族J，成員15；溶質載體家族38，成員4，蛋白酶體(前體，macropain)26S亞基，ATPase 3；和穀氨酸受體，離子化，NMDA2D(ε4)，囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白同源物和小鼠間隙連接蛋白基因連接蛋白37組成的組。
5.權利要求2的方法，包含給受試者施用CFTR修飾基因表達的CFTR修飾多肽的調節物，所述CFTR修飾基因選自由Kir4.2；鉀輸入矯正通道，成員15；亞家族J，成員15；溶質載體家族38，成員4，蛋白酶體(前體，macropain)26S亞基，ATPase 3；和穀氨酸受體，離子化，NMDA2D(ε4)，囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白同源物和小鼠間隙連接蛋白基因連接蛋白37組成的組。
6.權利要求2的方法，包含給受試者施用Kir4.2基因表達的CFTR修飾多肽；Kir4.2基因的遺傳調節物；或Kir4.2基因表達的CFTR修飾多肽的調節物。
7.用於檢測和/或鑑定選自由CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物，CFTR修飾多肽的調節物及其組合組成的組中的一個成員的方法，它包含步驟將含有潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物，CFTR修飾多肽的調節物或其組合的樣品與當樣品中存在潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物，CFTR修飾多肽的調節物，或其組合時可識別的指示劑接觸。
8.權利要求7的方法，包含將含有潛在的CFTR修飾基因或CFTR修飾多肽的樣品與所述指示劑接觸。
9.用於檢測和鑑定CFTR修飾基因的方法，包括步驟a.提供CFTR突變型小鼠或不存在CFTR的小鼠；b.從CFTR突變型小鼠分離編碼CFTR突變多肽的遺傳物質或從不存在CFTR的小鼠分離不編碼CFTR的遺傳物質；和c.使用該分離的遺傳物質鑑定可補償CFTR突變或CFTR缺乏時的基因表達的改變。
10.檢測和鑑定懷疑具有CFTR突變或可能不存在CFTR的人體中潛在的CFTR修飾基因的方法，包括步驟a.從懷疑的人體分離可能編碼CFTR突變型多肽的遺傳物質或從可能不存在CFTR的人體分離不編碼CFTR的遺傳物質；和b.使用分離的遺傳物質鑑定基因表達中與囊性纖維化或CFTR缺乏相關的任何潛在改變。
11.用於篩選潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物，CFTR修飾多肽的調節物，和其組合的陣列，該陣列包含具有附著到不同區域表面的多數生物學物質的基質，所述生物學物質能夠鑑定潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物，CFTR修飾多肽的調節物或其組合。
12.權利要求11的陣列，其中所述生物學物質是選自由表達鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基，膜糖蛋白，ras-相關性地塞米松誘導型蛋白(DEXRAS1)，ATP-敏感性輸入矯正鉀通道14，鋅指蛋白(Peg3)，分泌捲曲相關蛋白sFRP-2，連接蛋白37間隙連接膜通道蛋白α4，和人的造血特異性蛋白1(GenBank登錄號X84797)的CFTR修飾基因組成的組中的CFTR修飾基因；選自由Kir4.2，EST Affymetrix ID#92319，Repetin，SWAP-70，vq96e09.41，uo89c05.x1，Preproapelin，Caspase-12，胰島細胞自身抗原1，鈉尿肽前體A型，mSox7，U[-M-BH1-ang-b-04-0-U].s1，C88243，U[-M-BH0-ajq-h-03-0-U].s1，丁醯膽鹼酯酶，同源框A5，Wnt10a，囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白同源物，表1和2所列的CFTR修飾基因組成的組中的CFTR修飾基因；或由任何這些CFTR修飾基因表達的CFTR修飾多肽；和其組合。
13.權利要求12的陣列，其中該生物學材料是CFTR修飾基因。
14.權利要求13的陣列，其中該生物學材料是選自由表達鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基，膜糖蛋白，ras-相關性地塞米松誘導型蛋白(DEXRAS1)，ATP-敏感性輸入矯正鉀通道14的那些基因組成的組中的CFTR修飾基因；Kir4.2，EST Affymetrix ID#92319，Repetin，SWAP-70，vq96e09.41，和uo89c05.x1，表1所列的CFTR修飾基因，和其組合。
15.權利要求13的陣列，其中該生物學材料是選自由表達分泌捲曲相關蛋白sFRP-2，連接蛋白37間隙連接膜通道蛋白α4，和人的造血特異性蛋白1(GenBank登錄號X84797)的那些基因組成的組中的CFTR修飾基因；Preproapelin，Caspase-12，胰島細胞自身抗原1，鈉尿肽前體A型，mSox7，U[-M-BH1-ang-b-04-0-U].s1，C88243，U[-M-BH0-ajq-h-03-0-U].s1，丁醯膽鹼酯酶，同源框A5，Wnt10a，囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白同源物，表2所列的CFTR修飾基因，和其組合。
16.用於篩選潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物，CFTR修飾多肽的調節物，或其組合的方法，該方法包含步驟將權利要求10的陣列與含有潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物，CFTR修飾多肽的調節物或其組合的樣品接觸，該陣列具有與其相聯的指示劑，該指示劑用於鑑定樣品中是否存在潛在的CFTR修飾基因，CFTR修飾多肽，CFTR修飾基因的遺傳調節物，CFTR修飾多肽的調節物，或其組合。
17.用於篩選潛在的CFTR修飾基因的遺傳調節物的方法，它包含步驟將含有潛在的CFTR修飾基因的遺傳調節物的樣品與能夠鑑定CFTR修飾基因的遺傳調節物的報導基因轉染的細胞培養物接觸。
18.權利要求17的方法，它包含接觸樣品的步驟，其中該報導基因能夠鑑定選自由表達鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基，膜糖蛋白，ras-相關性地塞米松誘導型蛋白(DEXRAS1)，ATP-敏感性輸入矯正鉀通道14，鋅指蛋白(Peg3)，分泌捲曲相關蛋白sFRP-2，連接蛋白37間隙連接膜通道蛋白α4，和人的造血特異性蛋白1(GenBank登錄號X84797)的CFTR修飾基因組成的組中的CFTR修飾基因的遺傳調節物；選自由Kir4.2，EST AffymetrixID#92319，Repetin，SWAP-70，vq96e09.41，uo89c05.x1，Preproapelin，Caspase-12，胰島細胞自身抗原1，鈉尿肽前體A型，mSox7，U[-M-BH1-ang-b-04-0-U].s1，C88243，U[-M-BH0-ajq-h-03-0-U].s1，丁醯膽鹼酯酶，同源框A5，Wnt10a，囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白同源物，以及表1和2所列的CFTR修飾基因組成的組中的CFTR修飾基因；或由任何這些CFTR修飾基因表達的CFTR修飾多肽；和其組合。
19.權利要求18的方法，它包含接觸樣品的步驟，其中該報導基因能夠鑑定選自由表達鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基，膜糖蛋白，ras-相關性地塞米松誘導型蛋白(DEXRAS1)，ATP-敏感性輸入矯正鉀通道14的CFTR修飾基因組成的組中的CFTR修飾基因的遺傳調節物；Kir4.2，ESTAffymetrix ID#92319，Repetin，SWAP-70，vq96e09.41，和uo89c05.x1，表1所列的CFTR修飾基因，和其組合。
20.權利要求18的方法，它包含接觸樣品的步驟，其中該報導基因能夠鑑定選自由表達分泌捲曲相關蛋白sFRP-2，連接蛋白37間隙連接膜通道蛋白α4，和人的造血特異性蛋白1(GenBank登錄號X84797)的那些基因組成的組中的CFTR修飾基因的遺傳調節物；Preproapelin，Caspase-12，胰島細胞自身抗原1，鈉尿肽前體A型，mSox7，U[-M-BH1-ang-b-04-0-U].s1，C88243，U[-M-BH0-ajq-h-03-0-U].s1，丁醯膽鹼酯酶，同源框A5，Wnt10a，囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白同源物，表2所列的CFTR修飾基因，和其組合。
21.篩選潛在的CFTR修飾多肽調節物的方法，包括步驟將含有潛在的CFTR修飾多肽的樣品與能夠鑑定CFTR修飾多肽的含有CFTR修飾基因的表達載體轉染的細胞培養物接觸。
22.權利要求21的方法，包含接觸樣品的步驟，其中該表達載體含有選自由表達鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基，膜糖蛋白，ras-相關性地塞米松誘導型蛋白(DEXRAS1)，ATP-敏感性輸入矯正鉀通道14，鋅指蛋白(Peg3)，分泌捲曲相關蛋白sFRP-2，連接蛋白37間隙連接膜通道蛋白α4，和人的造血特異性蛋白1(GenBank登錄號X84797)的那些基因組成的組中的CFTR修飾基因；選自由Kir4.2，EST Affymetrix ID#92319，Repetin，SWAP-70，vq96e09.41，uo89c05.x1，Preproapelin，Caspase-12，胰島細胞自身抗原1，鈉尿肽前體A型，mSox7，U[-M-BH1-ang-b-04-0-U].s1，C88243，U[-M-BH0-ajq-h-03-0-U].s1，丁醯膽鹼酯酶，同源框A5，Wnt10a，囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白同源物，表1和2所列的CFTR修飾基因組成的組中的CFTR修飾基因；或由任何這些CFTR修飾基因表達的CFTR修飾多肽；和其組合。
23.權利要求22的方法，它包含接觸樣品的步驟，其中該表達載體含有選自由表達鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基，膜糖蛋白，ras-相關性地塞米松誘導型蛋白(DEXRAS1)，ATP-敏感性輸入矯正鉀通道14的那些基因組成的組中的CFTR修飾基因；Kir4.2，EST Affymetrix ID#92319，Repetin，SWAP-70，vq96e09.41，和uo89c05.x1，表1所列的CFTR修飾基因，和其組合。
24.權利要求22的方法，它包含接觸樣品的步驟，其中該表達載體含有選自由表達分泌捲曲相關蛋白sFRP-2，連接蛋白37間隙連接膜通道蛋白o4，和人的造血特異性蛋白1(GenBank登錄號X84797)的那些基因組成的組中的CFTR修飾基因；Preproapelin，Caspase-12，胰島細胞自身抗原1，鈉尿肽前體A型，mSox7，U[-M-BH1-ang-b-04-0-U].s1，C88243，U[-M-BH0-ajq-h-03-0-U].s1，丁醯膽鹼酯酶，同源框A5，Wnt10a，囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白同源物，表2所列的CFTR修飾基因，和其組合。
25.治療具有CF-影響的細胞的受試者中的囊性纖維化的方法，包括步驟給具有CF-影響的細胞的受試者施用治療有效量的CFTR修飾基因的遺傳調節物。
26.權利要求25的方法，包括施用選自由轉錄因子，增強轉錄的原癌基因，幹擾素γ和其類似物，NF-κB及其類似物，活化細胞的核因子，鈣通道激活劑，ets因子試劑，GM-CSF；IL-6，IL-1α，IL-1β，INF-γ和其類似物，cAMP類似物，腺苷酸環化酶激活劑，cAMP磷酸二酯酶抑制劑，視網膜樣，孤兒受體激活劑；視黃酸受體激動劑，視黃醇，視黃酸和其類似物；類固醇生成因子，糖皮質激素，糖皮質激素類似物，鹽皮質激素，雌激素，孕酮，和其類似物；倍他米松，Decadron，和其混合物組成的組中的遺傳調節物。
27.權利要求26的方法，其中給哺乳動物施用該遺傳調節物。
28.權利要求27的方法，其中給人施用該遺傳調節物。
29.治療具有CF-影響的細胞的受試者中的囊性纖維化的方法，包括步驟給具有CF-影響的細胞的受試者施用治療有效量的CFTR修飾多肽的多肽調節物。
30.權利要求29的方法，包括施用選自由激活靶細胞中腺苷酸環化酶的試劑，cAMP激動劑，cAMP添加劑，刺激cAMP的多肽激素，抑制cAMP降解的cAMP磷酸二酯酶抑制劑，cAMP-特異性抑制劑，糖皮質激素，TGF-β(SMAD3)；鉀KATP通道開啟劑，鉀BKCa通道開啟劑，苯並咪唑酮，UTP，8-氧化補骨脂素，和染料木黃酮，鈣離子激動劑，人DNase 1鈉通道抑制劑，胰酶添加劑；及其混合物組成的組中的多肽調節物。
31.權利要求30的方法，包括施用選自由毛喉素，異丙腎上腺素和沙丁胺醇，cAMP及其類似物，血管升壓素，烷基黃嘌呤，氨茶鹼；Rolipram，糖皮質激素，TGF-β(SMAD3)，cromakalim，吡那地爾，尼可地爾，米諾地爾硫酸鹽，aprikalim，二氮嗪，NS004，1-乙基-2-苯並咪唑酮，fenamates，dehydroxoyasaponin-I，maxikdiol，cromakalim，nirendipine，和根皮素，UTP，8-氧化補骨脂素，染料木黃酮；離子黴素，A23187，碳醯膽鹼，緩激肽，耐久黴素，毒胡蘿蔔素，人DNase 1，阿米洛利，三氨蝶呤，胰酶添加劑，及其混合物組成的組中的多肽調節物。
32.權利要求30的方法，包含施用選自由烷基黃嘌呤，苯並咪唑或苯並咪唑衍生物組成的組中的多肽調節物，該烷基黃嘌呤選自由3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，1，3-二甲基黃嘌呤，罌粟鹼，己酮可可豆鹼，咖啡鹼，和其混合物組成的組中，且該苯並咪唑或苯並咪唑衍生物選自由奧美拉唑，蘭索拉唑，thimoprazole，pantoprazole，4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-2-吡啶甲基)巰基]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3-甲基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-5-甲基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3-甲基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-5-甲基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶甲基)硫]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-2-吡啶甲基)-亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3-甲基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-5-甲基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；4-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3-甲基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-5-甲基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑和5-三氟甲基-2-[(4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶甲基)亞磺醯基]-(1H)-苯並咪唑；2-[2-(4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-乙醯基-6-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(4，6-二甲基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-乙醯基-6-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲酯基-6-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(4-乙氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲酯基-6-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(3-甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲酯基-6-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲酯基-6-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(4-甲氧基-5-甲基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲酯基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-5-甲酯基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-乙醯基)-苯並咪唑；2-[2-(4-甲氧基-5-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲氧基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲氧基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-甲基)-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-苯並咪唑；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基)-吡啶甲基亞磺醯基]-(5-氯)-苯並咪唑；2-[2-[3-甲基-4-(2，2，2-三氟乙氧基)吡啶基]甲基亞磺醯基]苯並咪唑(蘭索拉唑)；2-[2-[3-甲基-4-(2，2，3，3-四氟丙氧基)吡啶基]甲硫基]苯並咪唑；2-[(2-吡啶基)甲基亞磺醯基]苯並咪唑(thimoprazole)；2-[2-(3，5-二甲基-4-甲氧基吡啶基)甲基亞磺醯基]-5-甲氧基-1H-苯並咪唑(奧美拉唑)；2-[2-[4-(3-甲氧基丙氧基)-3-甲基吡啶基]甲基亞磺醯基]-1H-苯並咪唑；2-[2-(3，4-二甲氧基吡啶基)甲基亞磺醯基]-5-二氟甲氧基-1H-苯並咪唑(pantoprazole)；4-甲基-3-(2，2，2-三氟乙氧基)-5H-吡啶並[1′，2′4，5][1，2，4]thiaziano[2，3-a]苯並咪唑-13-鎓四氟硼酸鹽，其可藥用的鹽，和其混合物組成的組中。
33.權利要求32的方法，其中給哺乳動物施用該多肽調節物。
34.權利要求33的方法，其中給人施用該多肽調節物。
35.權利要求32的方法，包含施用選自由毛喉素和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤組成的組中的多肽調節物。
全文摘要
本發明發現CFTR修飾基因，特別是Kir4.2基因，表達的多肽，及其遺傳和多肽調節物，可用於治療囊性纖維化(CF)，或至少引起CF的症狀。還公開了檢測和/或鑑定CFTR修飾基因，其各自表達的多肽，該CFTR修飾基因的遺傳調節物，和其各自表達的多肽的調節物的方法和產品。還公開了使用這些CFTR修飾基因，其各自表達的多肽，這些CFTR修飾基因的遺傳調節物，和/或CFTR修飾多肽調節物達到治療CF，或至少引起CF的症狀的目的組合物和方法。
文檔編號C12M1/00GK1671734SQ03818347
公開日2005年9月21日 申請日期2003年5月30日 優先權日2002年5月31日
發明者傑弗裡·A·惠蔡特, 布魯斯·J·阿羅諾, 瓊·C·京拉克 申請人:兒童醫院醫療中心