重組惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白及其製法和用途的製作方法

2023-05-27 15:56:31 3

專利名稱：：重組惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白及其製法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及DNA重組技術和基因工程疫苗領域。更具體地，本發明涉及一種源自惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的重組蛋白；編碼所述重組蛋白的DNA序列；含所述DNA序列的載體；含所述載體的宿主細胞；含所述重組蛋白的疫苗；用基因工程製備該重組蛋白的方法；以及該重組蛋白在製備抗瘧疾疫苗方面的應用。
背景技術：
：瘧疾是人類最古老的傳染病之一，目前仍嚴重影響人類的健康。據世界衛生組織(WHO)的最新調查，約世界人口的40%仍處在瘧疾威脅之中，分布於100多個國家。目前世界上每年有3至5億人罹患瘧疾，其中約300萬人死亡。更為嚴重的是，由於瘧原蟲及蚊媒抗藥性的產生和迅速擴散，瘧疾不僅沒有得到有效控制，反而有巻土重來之勢。因此，開展全球遏制瘧疾計劃已成為WHO在新世紀兩個重點研究領域之一。人們在瘧疾防治中依靠或期望獲得突破的主要有三個途徑抗瘧藥、矩:-疾疫苗和蚊媒防制。但抗瘧藥及蚊媒防制面臨著巨大的困難和挑戰，這是因為瘧原蟲及蚊蟲抗藥性的產生和擴散。儘管目前尚未有應用價值的瘧疾疫苗問世，但普遍認為發展瘧疾疫苗是人類控制乃至消滅瘧疾的重要途徑。大量研究表明，瘧疾是可以通過研製有效的疫苗而實現預防的。如用滅活子孢子免疫的志願者能完全保護後來的攻擊感染。再如用鼠瘧原蟲的重組抗原免疫小鼠，亦能完全保護後來同種瘧原蟲的攻擊感染。此外，瘧疾流行病學研究也顯示，死於瘧疾的主要是無瘧疾免疫力的人群，如在瘧區的兒童和非瘧區人群進入瘧區，而在瘧區的成人很少因瘧疾而死亡。如給這些無免疫力的人群接種有效的疫苗，使其達到與瘧區成人同樣的免疫力，這樣就能實現預防瘧疾和降低瘧疾死亡率的目標。因此，瘧疾疫苗研製已成為當今世界性熱點課題。瘧疾疫苗的研究己進行了20多年，但至今仍無可應用的有效症疾疫苗問世。目前正在研究開發的瘧疾疫苗有3種，g卩抗子孢子疫苗，紅內期疫苗和阻斷傳播的疫苗。然而，這些疫苗均因為效力低下、持續時間短、或不穩定等原因，應用受到限制。此外，研製由瘧原蟲紅外期和紅內期等抗原組成的多價多期疫苗是瘧疾疫苗研發的趨勢。本申請人已經研製了含有主要裂殖子表面抗原(MSP1)和裂殖子頂端膜抗原(AMA-1)的融合蛋白的疫苗(也稱為PfCP-2.9)，其是--種紅內期存-;疾疫苗。為提高疫苗的免疫保護效力，需要尋找合適的紅外期抗原與其聯合應用，以達到全面且良好的防治瘧疾的效果。
發明內容本發明的目的就是提供源自惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的重組蛋白。在本發明的第一方面，提供一種重組蛋白，所述重組蛋白具有以下結構元件B-連接肽-元件A;或元件A-連接肽-元件B;其中，元件A為惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的C端免疫區；元件B為無，或惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白中除C端免疫區以外的免疫反應表位區域；連接肽為無，或長度為l-30胺基酸的肽，所述的連接肽對於元件A和元件B的構象基本上無影響。並且，所述的重組蛋白不具有惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的胺基酸序列，更優選的，所述的重組蛋白不具有SEQIDNO:8所示的胺基酸序列。在本發明的另一優選例中，所述惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的C端免疫區是惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白中位於中心重複區與錨定區之間、且不包括中心重複區與錨定區的胺基酸序列。在本發明的另一優選例中，所述惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的C端免疫區包括惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白第二區域(RII區域)和C-末端內的T、B細胞表位。在本發明的另一優選例中，在所述元件A的胺基酸序列中，消除了糖基化位點的胺基酸序列。更優選的，將所述的惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的第382位的Asn轉變為Ala，從而消除糖基化位點。更佳地，所述的元件A具有SEQIDNO:2中第5-l16位的胺基酸序列。在本發明的另一優選例中，除了連接、克隆、表達或純化相關位點以外，所述重組蛋白上的其它區域均來源於惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白。在本發明的另一優選例中，所述元件B是惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白中心重複區的部分或全部的胺基酸序列。在本發明的另一優選例中，所述的中心重複區的胺基酸序列為(MNP),,,其中，n=3-34。在本發明的另一優選例中，所述的中心重複區的胺基酸序列為(NANPk。在本發明的另一優選例中，所述元件B還包括惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白RI區的部分或全部的胺基酸序列。在本發明的另一優選例中，所述的重組蛋白含有SEQIDNO:2中第5-116位所示的胺基酸序列；或SEQIDNO:4中第5-205位所示的胺基酸序列。在本發明的另一優選例中，所述的重組蛋白中不含有連接肽。在本發明的另一優選例中，所述的重組蛋白的N端還包含釀酒酵母a-因子信號肽切割序列。在本發明的第二方面，提供一種分離的DNA分子，該DNA分子選自(i)編碼所述的重組蛋白的DNA分子；或(ii)與(i)中的DNA分子互補的DNA分-f-。在本發明的另一優選例中，所述的DNA分子編碼具有SEQIDNO:2中第5-116位所示的胺基酸序列或SEQIDNO:4中第5-205位所示的胺基酸序列的蛋白。在本發明的另一優選例中，所述的DNA分子具有SEQIDNO:1中第13-360位所示的核苷酸序列；或SEQIDNO:3中第13-627位所示的核苷酸序列。在本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的DNA分子。在本發明的第四方面，提供一種宿主細胞，它含有所述的載體；或它的基因組中整合有所述的多核苷酸。在本發明的另一優選例中，所述的宿主細胞為畢赤酵母細胞。在本發明的第五方面，提供一種抗瘧疾組合物，它含有所述的重組蛋白或所述的DNA分子；以及藥學上可接受的載體。在本發明的另一優選例中，所述的抗瘧疾組合物還含有(a)主要裂殖子表面抗原(MSP1)和裂殖子頂端膜抗原(AMA-1)的融合蛋。，或(b)編碼(a)所述融合蛋白的DNA分子。在本發明的另一優選例中，所述的組合物含有所述的重組蛋白以及MSPl與AMA-l的融合蛋白。在本發明的另一優選例中，所述的組合物為疫苗。在本發明的另一優選例中，所述的組合物中還含有ISA720佐劑。在本發明的第六方面，提供一種產生所述的重組蛋白的方法，包括步驟在適合表達所述重組蛋白的條件下，培養所述的宿主細胞從而表達出所述的重組蛋白；分離所述的重組蛋白。另一方面，本發明還提供一種預防瘧疾的方法，給需要的對象施用免疫有效量的所述的蛋白。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖l顯示了全長惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白(PfCSP)以及重組蛋白PfCSP-C和PfCSP-RC的示意圖。其中，SP:信號肽；RI:RegionI區；重複區NANP重複區；RII:RegionII區。此外，273Asn為PfCSP的C端免疫區的起始點胺基酸、384Ser為PfCSP的C-末端錨定區起始點的前一個胺基酸、86Leu為RI區域的起始點胺基酸、112Pro為RI區域末端的胺基酸，211Asn為本發明的重組蛋白PfCSP-RC的中心重複區的起始點胺基酸(對應於SEQIDNO:4中第32位)。圖2顯示了重組蛋白基因PfCSP-RC和PfCSP-C的合成示意圖。其中，圖2A為PfCSP-RC基因的合成627bpPfCSP-RC基因分成8個寡核苷酸片段，用不對稱PCR法分步進行基因拼接。基因5，和3'分別加上XhoI和EcoRI位點用於基因片段的克隆。各合成片段克隆在pBluscript載體進行序列分析。圖2B為PfCSP-C基因的合成設計一對引物分別位於PfCSP-RC的C末端起始處(Pa)和3'末端(Pb)，用PCR方法擴增獲得。圖3顯示了pPIC9k/PfCSP-C重組表達質粒的圖譜。圖4顯示了pPIC9k/PfCSP-RC重組表達質粒的圖譜。圖5顯示了SDS-PAGE檢測PfCSP-C(圖7A)和PfCSP-RC(圖7B)的表達。其中，圖5A:在誘導前0hr(泳道l)及誘導後21(泳道2)、31(泳道3)、46(泳道4)、54(泳道5)、60(泳道6)和70(泳道7)小時分別取培養上清15ti1進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色。在16.5KD處出現一條PfCSP-C目的蛋白。圖5B:在誘導前Ohr(泳道1)及誘導後18(泳道2)、28(泳道3)和41(泳道4)小時分別取培養上清15u1進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色。在31KD處出現一條目的蛋白。圖6顯示了免疫印跡法檢測PfCSP-C和PfCSP-RC表達的電泳圖。其中，泳道l代表PfCSP-C的電泳結果，泳道2代表PfCSP-RC的電泳結果。用PfCSP免疫兔血清進行檢測。圖7顯示了純化的PfCSP-C和PfCSP-RC重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖。表達—i二清分離後，用離子交換柱和分子篩兩步純化，經SDS-PAGE測定獲得目的蛋白純度大於95%。泳道l:PfCSP-RC，5(Ig;泳道2:PfCSP-C，5flg。圖8顯示了用ELISA法測定聯合疫苗免疫兔血清抗NANP重複多肽IgG的水平。各組分別為ISA720佐劑；ISA720佐劑+PfCP-2.9;ISA720佐劑+PfCSP-C;ISA720佐劑+PfCSP-RC;ISA720佐劑+PfCSP-RC+PfCP-2.9。具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，出乎意料地發現，含有惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的C端免疫區(元件A)的重組蛋白在表達後形成的構象非常接近PfCSP的C末端的天然構象，將其作為抗原可非常有效地引起免疫應答，在動物體內可產生高水平的特異性抗體。並且，將所述的C端免疫區蛋白與由MSP1和AMA-1融合而成的融合蛋白(參見中國專利申請CN01105292.9，也稱為PfCP-2.9)共同作為抗原進行免疫，可產生良好的聯合免疫效果，因此所述的C端免疫區蛋白可以作為抗瘧疾多價聯合疫苗的組成成分。基於此完成了本發明。如本發明所用，所述的"惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的C端免疫區"(或簡稱為"C端免疫區"或"C端免疫區蛋白")是指惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白中位於中心重複區與錨定區之間、且不包括中心重複區與錨定區的胺基酸序列。優選地，所述的"C端免疫區"包括惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的RIl區和C-末端內T、B細胞表位。如本發明所用，所述的"連接、克隆、表達或純化相關位點"是指為了便於構建、表達、純化所述重組蛋白或促進所述重組蛋白的免疫原性，而設計於所述重組蛋白上的結構，這些結構本身不構成免疫反應的表位。惡性培原蟲環子孢子表面蛋白如本發明所用，"惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白(PfCSP)"是指與天然的或變異的瘧原蟲PfCSP具有基本上相同的胺基酸序列，並且具有與天然瘧原蟲PfCSP基本上相同的抗原活性的蛋白。所述的"惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白"的胺基酸序列比如可參見GenBank登錄號X15363。PfCSP覆蓋在整個子孢子的表面，為子孢子正常發育和入侵肝細胞所必需，經基因敲除技術缺失PfCSP基因的伯氏瘧原蟲子孢子不能在蚊蟲卵囊內正常發育。在蛋白結構上，PfCSP分子由N端、中心重複區以及C末端組成，其中心重複區由4個胺基酸組成，gpNANP，不同株間的變異表現為NANP重複次數的差異。在該重複區的兩側分別含有兩個種間高度保守的區域，稱為RI區和RII區。PfCSP的C末端除RII區域外，還含有其它的T、B細胞表位。儘管已知PfCSP可以作為一種開發瘧疾疫苗的候選抗原，然而，全長的PfCSP由於序列較長，結構特殊比如含有34個中心四肽重複區，因此在真核表達系統進行分泌表達、產生結構穩定並兩個末端完整的重組蛋白等均比較困難。全長的序列表達產量不高，這給疫苗生產製備帶來困難且疫苗成本高。此外，全長的PfCSP作為抗原，其主要的免疫保護區如中心重複區等引起的免疫應答水平有限，而且有可能影響聯合疫苗中其它抗原的免疫應答。幵發瘧疾疫苗需要克服的一個問題是人體腿C分子多態性。由於人體腿C分子的多態性，使得一些抗原不能與某些機體MHC分子結合，導致抗原遞呈受阻，出現免疫個體無反應現象。因此，需在現有瘧原蟲抗原中鑑定出能識別多數人MHC分子的多反應表位，製成疫苗，從而確保疫苗可在絕大多數個體中得到有效遞呈。重組蛋白及其編碼基因本發明提供了一種重組蛋白，所述重組蛋白具有以下結構元件B-連接肽-元件A;或元件A-連接肽-元件B;其中，元件A為惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的C端免疫區；元件B為無，或惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白中除C端免疫區以外的免疫反應表位區域；連接肽為無，或長度為l-30胺基酸的肽，所述的連接肽對於元件A和元件B的構象基本上無影響。作為一種更優選的方式，所述的元件B是惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白中心重複區的部分或全部的胺基酸序列。優選的，所述中心重複區含有3-34個重複的NANP。更優選的，所述的中心重複區的胺基酸序列為(NANPk。通常，所述的中心重複區的C端與所述的C端免疫區的N端相連接。作為一種更優選的方式，所述的元件B是惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白RI區的部分或全部的胺基酸序列。通常，所述的RI區的C端與中心重複區的N端相連接。較優選的，本發明人在所述的重組蛋白中，消除了糖基化位點的胺基酸序列。更優選的，本發明人將所述的惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的第382位的Asn轉變為Ala，從而消除糖基化位點。此外，在本發明的重組蛋白的N端或C末端還可添加其它不影響該重組蛋白免疫原性的胺基酸序列。較佳地，這些添加的胺基酸序列為有利於本發明的重組蛋白的表達(如信號肽)或純化(如6XHis序列、釀酒酵母a-因子信號肽切割位點(Glu-Lys-Arg))，或可促進本發明的重組蛋白的免疫原性(例如IL-2、GM-CSF等細胞因子的序列)。作為本發明的優選實例，提供了重組蛋白PfCSP-C，它具有SEQIDNO:2所示的胺基酸序列；以及重組蛋白PfCSP-RC，它具有SEQIDNO:4所示的胺基酸序列。本發明還包括編碼本發明的重組蛋白的DNA分子。所述的DNA分子可以全部人工合成，也可用PC財廣增或合成的方法獲得。為了提高宿主細胞的表達量，可以對本發明的重組蛋白的編碼序列進行改造，例如採用宿主細胞偏好的密碼子，消除不利於基因轉錄及翻譯的序列。在本發明的一個實施例中，採用了酵母偏好的密碼子，並採用計算機DNA軟體對本發明的重組蛋白基因進行檢測，排除在基因中不利於基因轉錄及翻譯的序列，包括內含子剪切位點，轉錄終止序列等。在獲得了編碼本發明新重組蛋白的DNA序列之後，將其連入合適的表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最後，培養轉化後的宿主細胞，通過分離純化得到本發明的新的重組蛋白。如本文所用，術語"載體"包括質粒、粘粒、表達載體、克隆載體、病毒載體等。在本發明中，可選用本領域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然後將編碼本發明新重組蛋白的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。如本文所用，"可操作地連於"指這樣-一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，"可操作地連於"意味著相鄰近，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發明中，術語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，更佳地是酵母細胞。在獲得轉化的宿主細胞後，可在適合表達本發明重組蛋白的條件下培養該細胞，從而表達出重組蛋白。然後再分離出表達的重組蛋白。連接肽如本文所用，術語"連接肽"(linker)指位於元件A和元件B之間的、起連接作用的短肽。連接肽的長度沒有特別限制。連接肽的長度也可為0，此時元件A和元件B直接相連。通常，連接肽不影響或不顯著影響元件A和元件B胺基酸序列形成正確的摺疊和空間構象。一些連接肽的例子包括(但並不限於)(a)疏水性胺基酸Gly和Pro構成的3-15個胺基酸序列，例如Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro(SEQIDNO:7);(b)多克隆位點所編碼的胺基酸序列。該序列通常為2-20個，較佳地2-10個胺基酸；(c)由(a)或(b)組合形成的胺基酸序列。重組蛋白的用途本發明提供了所述重組蛋白的用途，其可被用於製備防治瘧疾的組合物，例如疫苗。在本發明的實例中，本發明人合成了包含PfCSP的C端免疫區的胺基酸序列的PfCSP-C、以及同時包含PfCSP的C端免疫區胺基酸序列和中心重複區胺基酸序列的PfCSP-RC，並在畢氏酵母中分泌表達出蛋白。採用這兩個重組蛋白作為抗原免疫小鼠後，小鼠血清能夠識別惡性瘧原蟲子孢子。而且，PfCSP-RC的免疫血清中含有高水平針對NANP重複區的抗體(閣8)，而這種抗體具有抑制子孢子入侵肝細胞的作用。這些實例證明，本發明的重組蛋白對於瘧疾的防治是非常有用的^疫苗本發明還提供了含有所述的重組蛋白作為免疫原的組合物。優選的，本發明的組合物是疫苗。所述的疫苗可以是預防性的(即預防感染)。這些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脫氧核糖核酸)，通常與"藥學上可接受的載體"組合，這些載體包括本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、胺基酸聚合物、胺基酸共聚物、脂質凝集物(如油滴或脂質體)以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑("佐劑")作用。增強組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限於(1)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；P)ISA"0佐劑；(3)福氏佐劑等。疫苗組合物(包括抗原，藥學上可接受的載體和/或佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質，如潤溼劑或乳化劑、pH緩衝物質等可存在於這類運載體中。此外，包括免疫原性組合物在內的疫苗組合物可含有在藥學上可接受載體中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。更具體地，包括免疫原性組合物在內的疫苗，包含免疫有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的組分。"免疫有效量"指以單劑或連續劑---部分給予個體的量對治療或預防是有效的。該用量根據所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別(如非人靈長類等)、個體免疫系統合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配製、治療醫師對醫療狀況的評估、及其它的相關因素而定。預計該用量將在相對較寬的範圍內，可通過常規實驗來確定。通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物製成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可製成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該製劑還可乳化或包封在脂質體中，在上述藥學上可接受的載體下增強佐劑效果。常規方法是從腸胃外(皮下或肌內)途徑通過注射給予免疫原性組合物。適合其它給藥方式的其它配方包括口服、栓劑和透皮應用等。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結合其它免疫調節劑一起給予。-種疫苗方式是DNA疫苗，即含有編碼本發明重組蛋白的編碼序列的DNA疫苗。聯合免疫瘧原蟲生活史複雜，在人體內先後寄生於肝細胞和紅細胞內，進行裂體增殖。其子孢子在進入人體後，隨血侵入肝細胞，攝取肝細胞內應用進行發育並裂體增殖，形成紅外期裂殖體。紅外期裂殖子從肝細胞釋放出來後，進入血流後很快侵入紅細胞，進行紅內期裂體增殖。瘧原蟲的抗原具有明顯的期特異性，由期特異抗原產生的免疫力只對本期瘧原蟲有作用，也就是說紅外期抗原產生的免疫只對子孢子禾n肝內原蟲有效，而對紅內期瘧原蟲無效。這樣，若紅外期疫苗不能100%有效，當個別子孢子逃避紅外期疫苗保護，這些子孢子即可產生大量裂殖子進入紅內期繁殖，由於紅外期疫苗對紅內期原蟲無效，因此紅內期原蟲繁殖即可致病乃至致命。因此，一個有效的疫苗最好由針對瘧原蟲多個生長環節的抗原組成，這樣可增強疫苗的有效性和克服瘧原蟲變異性等問題。特別是將紅內期抗原與紅外期抗原聯合，這種聯合疫苗對紅內期和紅外期原蟲均能產生殺滅作用。本發明人發現，本發明的重組蛋白可有效地引起針對紅外期惡性瘧原蟲的免疫應答，其與紅內期候選疫苗PfCP-2.9的聯合免疫試驗中未發現抗原競爭性免疫抑制現象，並且聯合免疫血清能夠更有效抑制瘧原蟲的生長。因此，本發明的重組蛋白與紅內期候選疫苗PfCP-2.9可以作為抗瘧疾多價聯合疫苗的組成成分。抗體本發明還包括對本發明的重組蛋白或其編碼DNA具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，"特異性"是指抗體能結合於本發明的重組蛋白或其片段。較佳地，指那些能與本發明的重組蛋白或其片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的本發明的重組蛋白結合的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備例如，純化的本發明的重組蛋白，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達本發明的重組蛋白的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature256;495，1975;Kohler等人，Eur丄Immunol.6:511,1976;Kohler等人，Eur丄Immunol.6:292,1976;Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.，1981)。多克隆抗體的生產可用本發明的重組蛋白或多肽免疫動物，如家兔、小鼠、大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於福氏佐劑、ISA720佐劑坐寸o本發明的主要優點在於(1)本發明的重組蛋白作為抗原可非常有效地引起免疫應答，在動物體內可產生高水平的特異性抗體。(2)本發明的重組蛋白與紅內期瘧疾候選疫苗PfCP-2.9作為聯合疫苗免疫動物時，不發生抗原競爭性現象。免疫血清能識別紅內期原蟲和子孢子，含有高水平的能抵抗子孢子入侵的NANP四肽重複區抗體，並能抑制瘧原蟲體外生長。(3)本發明的重組蛋白採用畢氏酵母分泌表達系統表達，由此產生的蛋廣d的構象非常接近天然PfCSP的C-末端結構。(4)本發明的重組蛋白的表達產物能分泌到胞外，並進入無蛋白培養上清，便於分離純化。此外，根據該蛋白高等電點的特性，建立簡便高效以離子交換純化為基礎的製備工藝純度可達95%以上。(5)本發明的重組蛋白的表達水平高，在15L發酵罐中表達產量在lg/L以下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人的分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例lPfCSP-C和PfCSP-RC基因的合成1.重組蛋白的設計本發明PfCSP-C和PfCSP-RC重組蛋白的序列來自惡性瘧原蟲3D7株環子孢子表面蛋白的胺基酸序列，其胺基酸序列見GenBank登錄號X15363(SEQIDNO:8)。PfCSP-C重組蛋白由PfCSP的C末端區域(不含錨定區)組成，PfCSP-RC重組蛋白由PfCSP的RI區、中心重複區以及C末端(不含錨定區)組成，各個功能區直接相連。圖l顯示了本實施例構建的天然PfCSP、PfCSP-C和PfCSP-RC的蛋白結構的示意圖。此外，在融合抗原的N端增設XhoI克隆位點(Leu-Glu)和釀酒酵母a-因子信號肽切割序列(Lys-Arg)。鑑定出該抗原序列中一個潛在糖基化位點(SEQIDNO:2中的第114位胺基酸，和SEQIDNO:4中的第203位胺基酸)，並通過將胺基酸Asn轉為Ala(SEQIDNO:2中的114Asn，和SEQIDNO:4中的203Asn)而排除這-個糖基化位點。這樣，PfCSP-C重組抗原由116個胺基酸組成，如SEQIDNO:2所示，而PfCSP-RC融合抗原由205個胺基酸組成，見SEQIDNO:4所示。2.重組抗原基因的設計選用酵母密碼子使用頻率，將PfCSP-C和PfCSP-RC胺基酸序列逆轉錄成DNA序列，產生PfCSP-C和PfCSP-RC合成基因。並且，採用計算機DNA軟體(DNAstar)對該基因進行檢測，並排除在該基因中不利於基因轉錄及翻譯的序列，包括內含子剪切位點，轉錄終止序列等。最終獲得的PfCSP-C合成基因的全長為360bp，如SEQIDNO:l所示，而PfCSP--RC為627bp，如SEQIDNO:3所示(3'端的12個鹼基是轉錄終止序列TaaTag和克隆位點EcoRI)。3.融合抗原基因的合成PfCSP-RC基因的構建627bpPfCSP-RC基因由8條寡核苷酸鏈拼接而成(OverlapPCR法)。相鄰兩條鏈設有1820bp的重疊區。用PCR方法將8條鏈拼接成雙鏈DNA分子，合成示意圖見圖2A。PCR擴增條件為:95°CIO秒(變性)、55°C30秒(退火)和72T:〗分30秒(延伸)，每次25個循環。PCR產物用P/。瓊脂糖膠分離，並用QiagenDNA回收試劑盒分離目的基因。用XhoI和EcoRI雙酶切目的基因片段，酶切條件為在20ul反應體系中含有2pg目的基因片段，1X酶切緩衝液，XhoI及EcoRI酶各5單位，37。C反應l小時。酶切片段與經同樣酶切的pBluscript載體(購於lnvitrogen公司)連接，並轉化感受態DH5a大腸桿菌。抽提氨卞青黴素抗性菌落的質粒DNA，經雙酶切鑑定為正確插入後進行DNA序列分析。在所測2個克隆中，有一個克隆的序列無任何錯誤鹼基。於是形成627bp全長PfCSP-RC合成基因(SEQIDNO:3)。為使PfCSP-RC基因能在畢氏酵母中分泌表達，本發明人在設計基因時，已經在該基因5'端進行修飾，即加上編碼Lys和Arg兩個胺基酸的DNA序列，這兩個胺基酸是《-因子信號肽切割位點的序列。在PfSCP-RC基因的5，及3'端分別含有XhoI及EcoRI位點用於該基因克隆入表達載體。PfCSP-C基因的構建合成以下一對引物5，引物序列Pa(SEQIDNO:5):ccgetcgagaaaagaaacaagaataaccaaggt;3'引物序列Pb(SEQIDNO:6):cgggaattcctattatgaggatgcaactetcat。以前述製備的PfCSP-RC基因為模板，用以上引物進行PCR反應，獲得360bpPfCSP-C基因，合成示意圖見圖2B。將上述獲得的基因克隆入pBluscript載體進行序列分析。證實無錯誤序列的PfCSP-C基因用於表達研究。實施例2PfCSP-C和PfCSP-RC基因在畢氏酵母中分泌表達2.1表達載體的構建PfCSP-C和PfCSP-RC基因通過XhoI和EcoRI位點插入到pPIC9酵母表達質粒(購於lnvitrogen公司)。這樣，重組蛋白的N端與該載體上釀酒酵母a-因子信號肽C末端融合。由於重組蛋白分子N端含有該信號肽切點3個特異胺基酸Glu-lys-Arg序列。故分泌表達釋放的目的蛋白不含信號肽序列。pPIC9K載體的基本元件與pPIC9相同，但它帶有卡那黴素抗性基因，可用G418進行高拷貝插入子的篩選。這樣，用BamHI和EcoRI將含PfCSP-C和PfCSP-RC片段從pBluscript載體切出，並插入pPIC9K表達質粒的相應位點中，構建成pPIC9K/PfCSP-C(圖3)和pPIC9K/PfCSP-RC(圖4)。2.2轉化畢氏酵母GS115用SalI將pPIC9K/PfCSP-C和pPIC9K/PfCSP-RC質粒分別線性化，10Mg線性化表達質粒電轉化GS115畢氏酵母(購於lnvitrogen公司)。轉化菌先用組氨酸缺陷平板篩選His+轉化子，然後用不同濃度G418平板篩選多拷貝插入的轉化子。抽提不同轉化子的基因組DNA，用一對目的基因內部引物PCR加以鑑定，表明表達質粒插入酵母染色體。經鑑定有插入的轉化子用於以下表達研究。2.3PfCSP-C和PfCSP-RC表達轉化子先接種在以甘油為碳源的培養基中，生長24小時後，轉接到的以甲醇為碳源的培養基中。進行誘導表達。每24小時取樣、檢測表達產物上清和細胞沉澱。SDS-PAGE和考馬斯亮藍檢測結果顯示在16.5kD處有明顯的PfCSP-C表達條帶，該表達帶只在甲醇誘導後出現，並隨表達時間延長，其表達產物明顯增加，見圖5A。在31kD處有明顯的PfCSP-RC表達條帶，該表達帶只在甲醇誘導後出現，並隨表達時間延長，其表達產物明顯增加，見圖5B。用兔抗PfCSP抗血清進行免疫印跡法檢測表達產物，結果可見目的蛋白印跡，見圖6，其中，l表示PfCSP-C的印跡，2表示PfCSP-RC的印跡。實施例3PfCSP-C和PfCSP-RC發酵與純化經對表達條件的優化研究，搖瓶表達水平可達100mg/L。用15L灌進行發酵表達。在整個發酵周期中，前期的細胞呈指數生長上升，細胞密度達ODwflOO。到甘油添加生長期，細胞生長呈直線上升，細胞密度達到0D,p560。但到了甲醇誘導表達階段，細胞總密度基本保持不變，而目的蛋白表達是在甲醇加入後3-7hr開始，並隨時間延長，表達產率迅速提高，並不斷分泌到發酵液中，這兩個重組蛋白的表達量可達lg/L以上。PfCSP-C和PfCSP-RC表達產物的純化分兩步進行由於這兩個重組蛋白的等電點分別為7.23和8.66，因此第一步可以用陽離子交換柱純化。第:步是用凝膠過濾層析純化。經兩步純化的蛋白純度可達95%。純化的PfCSP-C(l)和PfCSP-RC(2)重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖見圖7。實施例4PfCSP-C和PfCSP-RC免疫小鼠和家兔在該實施例中，用純化的PfCSP-C和PfCSP-RC為抗原，用ISA720為免疫佐劑免疫家兔，實驗分為6組第一組ISA720+PfCP-2.9;第二組ISA720+PfCSP-C;第三組ISA720+PfCSP-RC;第四組ISA720+PfCP-2.9+PfCSP-C:第五組ISA720+PfCP-2.9+PfCSP-RC;第六組ISA720佐劑對照。免疫分4次進行，每次免疫分別在第O、20、40、和61天進行。每次免疫前及免疫結束後兩周左右取血測定特異抗體水平。具體方法如下重組蛋白與ISA720佐劑按3:7的比例混合，用注射器抽吸乳化至均勻。免疫劑量為每隻家兔200yg，為lml體積。採用皮下多點注射。四次免疫注射時間分別在DO、D20、D40和D61。在首次免疫後D33和D54、D75取血測定抗體ELISA及IFA滴度。ELISA按以下程序進行採用重組蛋白為抗原，每孔包被量為O.lug,加入不同稀釋度的抗血清IOOUl，每份稀釋血清樣本重複三孔，經37。C反應lhr和洗滌後，加入酶標二抗，用TMD底物顯色，並讀取450mMOD值。用免疫前血清確定陽性閾值，大於該值的稀釋度為抗血清陽性最終滴度。IFA按以下程序進行按國際上通用的Trager氏蠟燭缸法體外培養惡性瘧原蟲FCC1/HN株，待生長至裂殖體階段時取培養液進行塗片。自然乾燥，預冷甲醇固定15分鐘。用10mMPH7.4PBS洗片，然後用含3。/。脫脂奶粉的PBS封閉30分鐘。待檢血清用封閉液從l:20開始對倍稀釋，共6個稀釋度；一張玻片分成8格，每格加一個稀釋度的樣品，剩餘兩格加陽性血清和免疫前血7清(皆為1:20稀釋)。37。C孵育l小時，然後用PBS液洗片3次，5min/次。FITC標記的抗人IgG用封閉液l:100稀釋，然後加到玻片上各個樣品所對應的反應位點上。37。C孵育l小時，然後用PBS液洗片3次，置於暗處，晾乾片子。螢光顯微鏡下讀片，先觀察陽性對照，判斷反應體系是否正常。然後，觀察陰性對照，應該出現比較暗淡的背景，而不能出現較為明顯的螢光裂殖子。這兩個對照正常的前提下，從最低稀釋度開始從低到高觀察樣品反應情況，以出現螢光裂殖子的數目明顯多於陰性對照時的最大稀釋度為該樣品的IFA滴度。對於針對子孢子的IFA試驗，則用惡性瘧原蟲子孢子代替紅內期瘧原蟲。表l顯示了以PfCP-2.9、PfCSP-C、PfCSP-RC或其組合作為抗原，與佐劑ISA720混合後，單獨免疫或聯合免疫小鼠和兔後，血清中PfCP-2.9、PfCSP-C和PfCSP-RC特異IgG的水平。各組分別為ISA720佐劑；ISA720佐劑+PfCP-2.9;ISA720佐劑+PfCSP-C;ISA720佐劑+PfCSP-C+PfCP-2.9;ISA720佐劑+PfCSP-RC;ISA720佐劑+PfCSP-RC+PfCP-2.9。ELISA結果顯示，佐劑對照組沒有產生特異性抗體，其餘組均產生很高的特異性抗體水平，而且PfCSP-C和PfCSP-RC重組蛋白單獨免疫與聯合免疫組之間沒有明顯差異。表l組(免疫原)包被的抗原PfCP-2.9PfCSP-CPfCSP-RC(a)KM小鼠"PfCP-2.9+佐劑62.0±50.1NDPfCP-2.9+PfCSP-C+佐劑86.7±56.133.5士50.1NDPfCP-2.9+PfCSP-RC+佐劑32.3±19.238.5±35.757.8±42.4PfCSP-C+佐劑ND64.3±43.7NDPfCSP-RC+佐劑ND18.8±31.217.9±27.6(b)BALB/c小鼠8PfCP-2.9+佐劑162.7±78.4NDNDPfCP-2.9+PfCSP-C+佐劑120.4±66.916.7±4.9NDPfCP-2.9+PfCSP-RC+佐劑173.2±86.197.4±35.168.9±38.7PfCSP-C+佐劑ND37.4±23.7NDPfCSP-RC+佐劑ND119.6±67.984.0±87.3(c)兔"PfCP-2.9+佐劑390.0±275.5NDNDPfCP-2.9+PfCSP-C+佐劑794.0±115.0499.3±261.6NDPfCP-2.9+PfCSP-RC+佐劑704.1±27.063.l士ll.1121..2±11.2PfCSP-C+佐劑ND165.5±140.5NDPfCSP-RC+佐劑ND66.9±19.6162:.2±121.0a每組5隻小鼠(昆明(KM)鼠或BALB/c小鼠)，分別測定每隻小鼠免疫血清的特異性抗體滴度，然後計算每組的幾何均數值；b每組3隻紐西蘭大白兔，分別測定每隻兔子免疫血清的特異性抗體滴度，然後計算每組的幾何均數值。此外，PfCSP-RC重組蛋白單獨或聯合免疫都能產生針對NANP重複區的特異性抗體，而且聯合免疫的抗重複區抗體水平更高，見圖8。表2顯示了用IFA法測定單獨免疫或聯合免疫後，小鼠血清與紅內期瘧原蟲以及子孢子的反應性。各組分別為ISA720佐劑；ISA720佐劑+PfCSP-C;ISA720佐劑+PfCSP-C+PfCP-2.9;ISA720佐劑+PfCSP-RC;ISA720佐劑+PfCSP-RC+PfCP-2.9。IFA結果顯示，單獨或聯合免疫的重組蛋白都能產生識別天然子孢子的抗體。表2組免疫原對於紅內期瘧原蟲(X103)對於子孢子I佐劑一b一PfCSP-C+佐劑—IIIPfCSP-RC+佐劑一+IVPfCP-2.9+PfCSP-C+佐劑10.24±5.02VPfCP-2.9+PfCSP-RC+佐劑11.76±4.10+實施例5PfCSP-C或PfCSP-RC與PfCP-2.9聯合免疫血清對疙原蟲的體外抑制試驗用於本實施例的惡性瘧原蟲FCC1/HN株取自海南省。培養按國際上通用的Trager氏蠟燭缸法進行，並按以下公式計算抑制原蟲生長率(抑制率)抑制率，，組^^原氣讓具體方法如下惡性瘧原蟲FCCl/HN株按Trager方法進行體外培養，每天更換培養液，每4天添加紅細胞。用於抑制試驗的原蟲需經過同步處理，即在實驗前24小時，含有各期的瘧原蟲與5%山梨醇混合，置室溫30miru經此處理的原蟲主要只含環狀體時期的原蟲。再繼續培養24小時，絕大部分已發育到裂殖體。將此時的原蟲配製成2%細胞壓積和0.5%的原蟲感染率。按實驗需要加入不同量抗血清，配製成不同抗血清濃度的起始培養物。以每孔200ul將該培養物置96孔平板中，培養24hr或72小時後，製作薄血膜、吉氏染色，用顯微鏡計數原蟲率。抗血清製備用滅菌注射器從免疫家兔心臟取血，置滅菌離心管中，待血液凝固，血凝塊逐漸縮小溢出血清後，離心回收血清，分離的血清經56。C30min滅活及過濾除菌後用於上述抑制試驗。表3顯示了聯合疫苗免疫兔血清抑制瘧原蟲體外生長效率，其中各組分別是ISA720佐劑；ISA720佐劑+PfCP-2.9;ISA720佐劑+PfCSP-C+PfCP-2.9;ISA720佐劑+PfCSP-RC+PfCP-2.9。體外抑制試驗結果顯示ISA720佐劑+PfCP-2.9、ISA720佐劑+PfCP-2.9+PfCSP-C及ISA720佐劑+PfCP-2.9+PfCSP-RC聯合抗原的免疫血清經6.7倍稀釋後能有效抑制瘧原蟲的生長，而佐劑對照組血清沒有任何效果。表3tableseeoriginaldocumentpage22以上抑制試驗結果表明(1)PfCSP-C/PfCSP-RC重組蛋白與PfCP-2.9之間不存在抗原競爭性，聯合免疫時不影響PfCP-2.9的生物學活性產生的免疫血清經6.7倍(15%血清含量)稀釋後能非常有效地抑制瘧原蟲體外生長，抑制率達到約100%;(2)ISA720佐劑是由法國賽比克公司研製的新型佐齊U，本結果顯示，ISA720和PfCSP-C/PfCSP-RC聯合免疫產生很高的特異性抗體水平，這為PfCSP-C/PfCSP-RC作為疫苗進行臨床試驗尋找到了合適的佐劑。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。序列表〈110〉中國人民解放軍第二軍醫大學繭組惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋n及其製法和用途<130〉067357<160〉6<170〉Patentlnversion3.31<211〉360<212〉DNA人工序列raise—feature<223〉重組基丙<400〉1ctcgagaa朋gaa^c^gaat幼ccaaggtaatggac肌ggtcataacatgcctaatgat60cctaatagaaacgttgatgaaaatgccaacgcaaattctgccgttaagaa120gaagagccttccgacaagcatacttgaacaa幼ttcagaiitagtctttct,180actgagtggtccccttgttctgtcacctgcggaaacggtatccaagtgag肌tta^gcct240ggttccgcaaataagcctaaaggrtgaattggactatgccaacgatatcgagaagaagatt300tgtaagatggagaaatgtagttctgtgtttaatgtagttg(:atcctcataataggaattc3602116〈212〉PRT<213〉人—E序列<220〉<221〉MISC一FEATURE重組蛋A3627〈212>DNA人T.序列<221〉m丄sc—feature:歪組基丙<■〉3ctcgagaaaagattgagaaaaagaaattgaagcaacctgctgatggaaac60ccagatcctaatgccaacccaaacgttgatcct犯ccc犯atgcc朋ccctaacgc犯ac120cccaacgctaatcctaatgcgaatcctaatgcc犯ccc肪atgccaatcccaatgctaat180atccgaatgctaacccs犯cgcgaatcctaacgctaatccaaa^cgctaat240ccaaacgctaatccaaacgctaatcccaacgccaaccctaacaagaataaccaaggtaat300ggacaaggtcataacatgcctaatgatcctaatagaaacgttgatgaaaatgccaacgca360aattctgccgtaacaatg犯gagccttccgacaagcacat420ttga;icaa犯ttcagaatagtctttctactgagtggtccccttgttctgtcacctgcgga480aacggtatccaagtgagaattaagcctggttccgcaaatatgaattggac540tatgccaacgatatcgagaagaagatttgta卿tgg卿aatgtagttctgtgtttaat600gtagttgcatcctcataataggaattc627<210〉4<211〉205<212〉PRT人T序列<220〉MISCFEATURE繭組蛋l"l〈213〉5DNA人工序列misc—feature引物〈400>5ccgctcg3gaaaag膽acaagaat幼ccaaggt<210〉〈212〉632DNA人丁序列misc_feature引物336cgggaattcctattatgaggatgcaactacat32<211〉76PRT人工序列〈223>MISC—FEATURE連接序列7GlyProGlyProGlyPro15〈211><213〉8397PRT疾原蟲8Met1GluArgAsnLeu65GluProAsnAsnAsn145AsnAsnAsnAsnMetAlaVal(;lu50LysAspAlaAlaAlai30AlaAlaAlaAlaAla210ArgI.,euLeu35LeuLysAsnAspAsn115AsnAsnAsnAsnAsn195AsnLysPhe20AsnGluAsnGluGly100ProProProProPro180ProProLeu5GinGluMetSerLys85AsnAsnAsnAsnAsn165AsnAsnAsnAlaGluLeuAsnArg70LeuProValAlaAla150AlaAlaValAlalieTyrAsnTyr55SerArgAspAspAsn135AsnAsnAsnAspAsn215LeuGinTyr40TyrLeuLysProPro120ProProProProPro200ProSerCys25AspGlyGlyProAsn105AsnAsnAsnAsnAsn185AsnAsnVal10TyrAsnLysGluSerGlyAlaGinAsn75HisLy90AlaAsnAleiAsnAlaAsnAlaAsn155AlaAsn170AlaAsnAlaAsnAlaAsnSerSerGLyGlu60AspI-ysProProPro■MOProProProProPro220PheSerThr45AsnAspl,ysAsnAsn125AsnAsnAsnAsnAsn205AsnSer30AsnTrpGlyLeuVal110ValAlaAlaAlaAla190AlaAlaPhe15AsnLeuTyrAsnLys95AspAspAsnAsnAsn175AsnAsnAsnValThrTyrSerAsn80GinProProProPro160ProProProProAsn225AsnAsnAsnProAsn305AsnThrLysCyslie385A〗aAlaAlal,ysAsn290AsnLysCysLys370GlyAsnAsnAsnAsn275ArgAsnlieGly匕ys355MetLeuProProProAsnAsnAsnGinAsn340AspGlulieAsnAsn245AsnGinValGluAsn325GlyGluLysMetAla230AlaAlaGlyAspGlu310SerlieLeuCysVal390AsnAsnAsnAsnGlu295ProLeuGinAspSer375LeuProProProGiy280AsnSerSerValTyr360SerSerAsnAsnAsn265GinAlaAspThrArg345AlaValPheAlaAsn235AlaAsn250AlaAsnGlyHisAsnAIeiLysHis315GluTrp330lieLysAsnAspPheAsnLeuPhe395ProAsnProAsnProAsnA.snMet,285AsnSer300Il.g匕ysSerProPro(;lylieGlu365ValVal380LeuAsnAlaA]aAla270l〕roAlaGluCysSer350lysAsnAsnAsn255AsnAsnVaTyrSer335AlaLysSerPro240ProProAsplysLeu320ValAsnlieSer權利要求1.一種重組蛋白，其特徵在於，所述重組蛋白具有以下結構元件B-連接肽-元件A；或元件A-連接肽-元件B；其中，元件A為惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的C端免疫區；元件B為無，或惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白中除C端免疫區以外的免疫反應表位區域；連接肽為無，或長度為1-30胺基酸的肽，所述的連接肽對於元件A和元件B的構象基本上無影響。2.如權利要求l所述的重組蛋白，其特徵在於，所述元件B是惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白中心重複區的部分或全部的胺基酸序列。3.如權利要求2所述的重組蛋白，其特徵在於，所述元件B還包括惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白RI區的部分或全部的胺基酸序列。4.如權利要求l所述的重組蛋白，其特徵在於，它含有SEQIDNO:2中第5-116位所示的胺基酸序列；或SEQIDNO:4中第5-205位所示的胺基酸序列。5.—種分離的DNA分子，其特徵在於，該DNA分子選自(i)編碼權利要求1所述的重組蛋白的DNA分子；或(ii)與(i)中的DNA分子互補的DNA分子。6.—種載體，其特徵在於，它含有權利要求5所述的DNA分子。7.—種宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求6所述的載體；或它的基因組中整合有權利要求5所述的多核苷酸。8.—種抗瘧疾組合物，其特徵在於，它含有權利要求1所述的重組蛋白或權利要求5所述的DNA分子；以及藥學上可接受的載體。9.如權利要求8所述的組合物，其特徵在於，它還含有(a)主要裂殖子表面抗原和裂殖子頂端膜抗原的融合蛋白，或(b)編碼(a)所述融合蛋白的DNA分子。10.—種產生權利要求l所述的重組蛋白的方法，包括步驟-在適合表達所述重組蛋白的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞從而表達出所述的重組蛋白；分離所述的重組蛋白。全文摘要本發明提供了一種重組蛋白，所述重組蛋白含有惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白的C端免疫區結構；更優選的，所述重組蛋白含有惡性瘧原蟲環子孢子表面蛋白RI區域、中心四肽重複區和C端免疫區結構。本發明的重組蛋白作為抗原可非常有效地引起免疫應答，在動物體內可產生高水平的特異性抗體。本發明的重組蛋白在畢氏酵母中分泌表達產生N-和C-末端完整且構象接近PfCSP的C-末端天然構象的蛋白，將其作為抗原可非常有效地引起免疫應答，在動物體內可產生高水平的特異性抗體。並且，將所述的重組蛋白與由MSP1和AMA-1融合而成的融合蛋白共同作為抗原進行免疫，可產生良好的聯合免疫效果。文檔編號C07K19/00GK101190946SQ20061011894公開日2008年6月4日申請日期2006年12月1日優先權日2006年12月1日發明者張青鋒,潘衛慶申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學