用於對特異性細胞進行篩選的微流控晶片及細胞篩選方法

2023-05-27 15:57:46 5

用於對特異性細胞進行篩選的微流控晶片及細胞篩選方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於對特異性細胞進行篩選的微流控晶片及細胞篩選方法。其中，晶片包括基底和腔道以及聲波激勵源；腔道包括中間通道、入口和出口；聲波激勵源位於基底上且位於中間通道的兩側，聲波激勵源包括沿中心通道並向出口方向延伸的兩部分，靠近出口的第二部分對應的聲波共振頻率是遠離出口的第一部分對應的聲波共振頻率的整數倍。通過靶向微泡及非對稱聲場形成的聲流效應，使微泡粘附於特異性特異性細胞表面，由於微流體的層流特性，富集的細胞在流過第一部分後仍然會在一條直線中移動不會擴散，而由於第二部分的聲波共振頻率不同於第一部分，使得粘附靶向微泡的特異性特異性細胞發生偏移，從而實現在血液中篩選特異性細胞特異性的目的。
【專利說明】用於對特異性細胞進行篩選的微流控晶片及細胞篩選方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞分析【技術領域】，具體涉及一種用於對特異性細胞進行篩選的微流 控晶片及細胞篩選方法。

【背景技術】
[0002] 分子生物學和臨床研究表明，部分診斷為早期的癌症實際上已有遠處轉移，即腫 瘤微轉移，而常規影像學、組織學或細胞學方法難以發現。腫瘤微轉移可通過血行及淋巴 途徑在全身組織和器官中形成微小轉移病灶，而淋巴結轉移發展最終也要進入血液循環中 形成循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells, CTCs)，導致原發腫瘤轉移的全身化傾向。 CTCs的檢測有助於早期發現腫瘤微轉移、監測術後復發、評估療效及預後或選擇合適的個 體化治療。
[0003] 在對肺癌發生機制不斷深入認識以及分子生物學方法發展的基礎上，CTCs的 檢測方法也有了較大的進展。免疫磁珠法、反轉錄多聚酶鏈式反應（RT-PCR，Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)及流式細胞分析技術（Flow Cytometry， FCM)是目前常用的檢測惡性腫瘤患者血液和骨髓液中隱匿腫瘤細胞的方法。免疫磁珠法利 用免疫磁珠（一種人工合成的微米級含鐵小微粒）的功能層的特點（功能層既可以結合生 物分子，同時又能被磁力所吸引），使免疫磁珠在磁力作用下發生力學移動，使複合物與其 它物質分離，從而達到分離特異性抗原的目的；然而，免疫磁珠法的缺點是，磁珠密度過大， 容易導致磁珠的聚集和沉降，而使富集效率降低，磁珠與細胞偶聯後不易從細胞表面脫附， 還常常夾雜非相關的細胞，從而影響分離的效果。RT-PCR檢測法是通過設計腫瘤細胞標誌 性基因或靶RNA的特異性引物，通過對外周血樣本進行RT-PCR來檢測外周血是否含有腫瘤 細胞；但是這種方法同時因受實驗汙染、非常規轉錄等限制，導致存在假陽性率過高的缺點 而限制了其在外周血檢測癌細胞中的應用。FCM法能將處在快速直線流動狀態中的細胞或 生物顆粒進行多參數的、快速的定量分析和分選，且研究發現FCM法檢測外周血腫瘤細胞 的敏感性為每1000個外周血淋巴細胞中可檢測出一個腫瘤細胞，但由於流式細胞儀設備 昂貴，且缺乏特異性抗原，因此也限制了該技術的推廣。
[0004] 另一方面，隨著微納加工技術的不斷發展，基於微流控晶片的細胞篩選技術得到 了廣泛的關注和認可。微流控晶片的腔道結構可以任意設計，提高了細胞篩選的靈活性和 可靠性，而腔道的尺寸與細胞大小相匹配，可更有效的分選細胞。目前，基於微流控篩選細 胞的方法主要包括：
[0005] (1)介電電泳方法（DEP, Dielectrophoresis)法。其中，介電電泳指在空間非均 一電場下的細胞，由於其相對於周邊介質的誘導偶極距不同而產生的電遷移，從而受到介 電力的作用。這種方法需要較強的電場，而電場引起的熱效應有可能會對細胞造成損傷。
[0006] (2)水流動力學方法。這種方法通過特殊設計的通道結構可以改變流體的流場，可 以用來進行層流混合、富集和篩選，利用流體引起的拽力，實現CTCs的分離。然而，水流動 力學方法只適用於一定尺寸的細胞，並且容易堵塞腔道。
[0007] (3)光學方法。當光被細胞表面反射吸收以及發生折射時，它的傳播方向會發生改 變，動量也隨之改變，根據動量守恆定律，細胞會獲得光子損失的動量，進而表現為受到光 的作用力，因此，利用光鑷可有效分離CTCs。然而這種方法通常是適用於單個細胞，很難對 大量細胞進行同時篩選，降低了細胞篩選的通量。
[0008] (4)聲學方法。聲波，作為一種機械波，攜帶動能和能量同樣可對細胞進行分選。 然而聲學的方法缺少特異性，而CTCs的粒徑大小與血液中細胞粒徑存在混疊（如圖1所 示），很難對CTCs細胞進行篩選。
[0009] 綜上所述，目前雖有多種方法可實現CTCs的篩選，但每種方法均存在一定的缺點 與不足，直接影響了細胞篩選的效率和細胞的活性，難以達到對癌症轉移的早期診斷。因 此，還需要開發一種高效、準確、並行、無損傷的分選方法。


【發明內容】

[0010] 本發明提供一種新的用於對特異性細胞進行篩選的微流控晶片及相關的篩選方 法。
[0011] 根據本發明的第一方面，本發明提供一種用於對特異性細胞進行篩選的微流控芯 片，包括基底和附著於所述基底上的腔道，還包括聲波激勵源；所述腔道包括中間通道、位 於所述中間通道一端的用於供靶向微泡和含有特異性細胞的血液注入的入口和位於所述 中間通道另一端的用於供分離出的特異性細胞和血細胞輸出的出口；所述聲波激勵源位於 基底上且位於所述中間通道的兩側，所述聲波激勵源包括沿所述中心通道並向出口方向延 伸的兩部分，其中靠近出口的第二部分對應的聲波共振頻率是遠離出口的第一部分對應的 聲波共振頻率的整數倍。
[0012] 優選地，所述聲波激勵源包括一對叉指換能器，所述叉指換能器位於基底上且位 於所述中間通道的兩側，所述叉指換能器包括第一電極部分、第二電極部分和用於連接所 述第一電極部分和所述第二電極部分的過濾帶（222)，所述第一電極部分對應所述遠離出 口的第一部分，所述第二電極部分對應所述靠近出口的第二部分。進一步地，所述第一電極 部分的指條寬度為所述第二電極部分的指條寬度的整數倍。
[0013] 優選地，所述基底為128度YX雙面拋光的鈮酸鋰晶體；所述腔道由聚二甲基矽氧 烷材質製作；所述入口包括用於供靶向微泡注入的第一入口和用於供血液注入的第二入 口，所述出口包括用於供分離出的特異性細胞輸出的第三出口、第五出口和用於供血細胞 輸出的第四出口，且所述第四出口位於所述第三出口和所述第五出口之間。
[0014] 優選地，所述聲波激勵源包括基於體聲波的激勵源。
[0015] 優選地，所述特異性細胞包括循環腫瘤細胞；所述特異性細胞與所述靶向微泡的 特異性不同，且所述靶向微泡在聲波激勵源的作用下粘附於所述特異性細胞。
[0016] 優選地，所述腔道採用軟光刻工藝製作。
[0017] 根據本發明的第二方面，本發明提供一種用於對特異性細胞進行篩選的方法，包 括：細胞富集步驟，即將含有特異性細胞的血液和已製備的靶向微泡注入如上所述的微流 控晶片，當所述血液和所述靶向微泡移動到與所述第一部分相對應的位置時，對所述微流 控晶片施加信號以在所述腔道內形成駐波聲場，且使得血液中的血細胞以及與靶向微泡充 分接觸的特異性細胞沿所述中心通道並朝向出口方向移動；和細胞分選步驟，即當所述血 液和所述靶向微泡移動到與所述第二部分相對應的位置時，調整所述信號的頻率或相位， 從而使得靶向微泡及與其充分接觸的特異性細胞的移動速度大於血細胞的移動速度。
[0018] 優選地，所述特異性細胞為循環腫瘤細胞；所述靶向微泡的製備包括：步驟A，即 在容器中按一定比例將一定量的二硬脂醯磷脂醯膽鹼、聚乙二醇2000修飾二硬脂醯磷脂 醯乙醇胺溶解在三氯甲烷中且在渦旋混合器上混勻，通入氮氣除去三氯甲烷並使磷脂在 容器壁上形成一層均勻的薄膜，真空乾燥若干小時；步驟B，即在含有乾燥磷脂薄膜的容器 中加入經脫氣處理的三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液，所述緩衝溶液含有10%體積的甘油和 10%體積的丙二醇，加熱所述緩衝溶液到相轉變溫度以上，水浴超聲震蕩使磷脂溶液分散 徹底直至透明；步驟C，即將透明的磷脂溶液分裝置西林瓶中，並將西林瓶中的空氣置換為 生物惰性氣體；步驟D，即震蕩西林瓶從而製備出微泡。
[0019] 優選地，所述微流控晶片的聲波激勵源為位於基底上且位於所述中間通道的兩側 的一對叉指換能器，所述叉指換能器包括第一電極部分、第二電極部分和用於連接所述第 一電極部分和所述第二電極部分的過濾帶，所述第一電極部分對應的聲波共振頻率為所述 第二電極部分對應的聲波共振頻率的整數倍。
[0020] 本發明的有益效果是：通過注入的靶向微泡以及採用的非對稱聲場形成的聲流效 應，使微泡與血液中的特異性細胞結合，使微泡粘附於特異性細胞表面，由於微流體的層流 特性，富集的細胞在流過第一部分的駐波聲場後，這些細胞仍然會在一條直線中移動，而由 於第二部分的聲波共振頻率不同於第一部分，使得粘附靶向微泡的特異性細胞發生偏移， 特異性細胞將移動到第二部分的聲波共振頻率的聲場中的節點位置，而血液中其它血細胞 仍然在層流拽力的作用下依舊在第一部分的聲波共振頻率的聲場中的節點位置移動，從而 實現在血液中篩選特異性的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，其中相同參考標號表示相同部分。
[0022] 圖1示意性地示出了血液中白細胞、紅細胞與CTCs粒徑大小，其中白細胞與CTCs 粒徑存在混置；
[0023] 圖2示意性地示出了本發明一種實施方式的微流控晶片的結構示意圖；
[0024] 圖3和圖4示意性地示出了靶向微泡與小鼠淋巴細胞的黏附，其中A為非靶向微 泡，B為Lyp-Ι靶向微泡，圖示中非靶向微泡基本不能與細胞粘附，而大量靶向微泡可與細 胞緊密粘附。

【具體實施方式】
[0025] 隨著微機電系統（MEMS)工藝的不斷進步，微流控晶片（microfluidic device)得 到了迅速發展，本發明是在此技術基礎上，提出了一種用於特異性細胞篩選的微流控晶片 及其相關方法。以下通過【具體實施方式】結合附圖對本發明作進一步詳細說明。其中，以特 異性細胞為CTCs為例進行說明，當然，本發明同樣適用於其它類型細胞，只要細胞之間的 聲阻抗有差異，例如將血小板在血細胞中分離。
[0026] [實施例1]
[0027] 如圖2所示，本實施例提供一種用於對特異性細胞進行篩選的微流控晶片，包括 基底21、附著於基底21上的腔道23、以及聲波激勵源。
[0028] -種具體實現中，為獲得較大的機電耦合係數，基底為128° YX雙面拋光的鈮酸 裡晶體。
[0029] 又一種具體實現中，腔道由聚二甲基矽氧烷（PDMS)材質製作。腔道23包括中間 通道、位於中間通道一端的入口 231、232以及位於中間通道另一端的出口 233、234、235。其 中，入口 231用於供靶向微泡33注入，入口 232用於供含有特異性細胞31及血細胞32 (包 括紅細胞、白細胞和血小板）的血液注入，出口 233、235用於供分離出的特異性細胞及粘附 於其表面的微泡輸出，出口 234用於供血細胞輸出，並且出口 234位於出口 233和出口 235 之間。
[0030] 聲波激勵源位於基底21上且位於中間通道的兩側，聲波激勵源包括沿所述中心 通道並向出口方向延伸的兩部分，其中靠近出口的第二部分對應的聲波共振頻率是遠離出 口的第一部分對應的聲波共振頻率的整數倍。一種具體實現中，聲波激勵源基於聲表面波， 其具體為一對叉指換能器22。叉指換能器是指在壓電基底上濺射周期性的叉指電極，對叉 指電極施加射頻輸入信號，利用逆壓電效應使得基底產生振動並產生聲表面波。叉指換能 器22位於基底21上且位於中間通道的兩側，叉指換能器22包括第一電極部分221、第二電 極部分223和用於連接第一電極部分221和第二電極部分223的過濾帶222,第一電極部分 221對應前述的遠離出口的第一部分，第二電極部分223對應前述的靠近出口的第二部分， 如圖2所示。一種具體實現中，第一電極部分221的指條寬度為第二電極部分223的指條 寬度的整數倍。另一種具體實現中，聲波激勵源基於體聲波，即利用壓電陶瓷為激勵源實現 細胞篩選。
[0031] 本實施例的微流控晶片由於聲波激勵源的兩部分的聲波共振頻率不相同，即可得 到非對稱聲場，藉此通過形成的聲流效應可以實現對特異性細胞例如CTCS的分離。
[0032] 採用本實施例的微流控晶片分選細胞具有以下特點：
[0033] (1)微流控晶片不需要鞘流，不會稀釋細胞，以及鞘流引起的剪切應力損傷細胞帶 來的負面效應，本發明僅依靠聲波富集，富集效率高，速度快。
[0034] (2)分選效率高：由於CTCs表面充分粘附著靶向微泡，CTCs具有較高的聲學敏感 性，只需要較小的聲壓，便可將CTCs從血液中分選，得到較高的分選效率。
[0035] (3)細胞生物活性：分選後CTCs表面粘附這微泡，而微泡可在常壓的破碎，不需要 其他生化手段將微泡與細胞分離，從而保證了細胞的生物活性。
[0036] (4)微流控晶片性能具有良好的一致性。由於MEMS工藝具有標準化流程，利用 MEMS工藝製備的聲表面波微流控晶片能夠保證器件的可靠性和一致性。
[0037] (5)具有普遍適用性。細胞的富集與分選僅僅依靠調節輸入到叉指換能器的射頻 信號，不需要改變聲表面波微流控晶片的結構，只要靶向微泡的配體與CTCs細胞的抗體能 夠牢固結合，CTCs便可實現分選，具有較好的普遍適用性。
[0038] (6)晶片成本低。晶片製備工藝為標準的MEMS技術，工藝成熟器件的性能一致性 良好，並且成本低廉,可大量生產。
[0039] 這些特點可通過如下實施例2及其示例予以體現。
[0040] [實施例2]
[0041] 本實施例提供一種對特異性細胞進行篩選的方法，其採用實施例1提供的微流控 晶片為實驗平臺，在聲波的作用下將CTCs富集，藉助靶向微泡與CTCs的粘附，增強CTCs的 聲阻抗差異，通過調控聲波的幅值與頻率，實現細胞的篩選，並且細胞的生物活性不會受到 影響，為CTCs的篩選提出了一種新的途徑。
[0042] 本實施例的細胞篩選方法的過程包括如下步驟S1?S4 :
[0043] 步驟S1，製備靶向微泡。微泡通常稱為超聲造影劑，是一種含有惰性氣體的包膜微 氣泡，最初主要作用是增強超聲圖像的對比度，提高圖像質量。最近研究表明，可對微泡的 表面進行化學修飾，將帶有特異性配體的微泡與靶細胞結合，使微泡沾附在細胞表面，進一 步實現分子影像以及靶向給藥的目的。本發明將研究配體與微泡的不同修飾方式，確保微 泡能夠穩定的、特異性的結合CTCs，而不會與血液中正常細胞結合。
[0044] -種具體實現中，靶向微泡的製備過程包括：
[0045] A.按一定比例將一定量的二硬脂醯磷脂醯膽鹼（distearoyl phosphatidylcholine, DSPC)、聚乙二醇 2000 修飾二硬脂醯磷脂醯乙醇胺（DSPE-PEK-2k) 溶解在三氯甲烷中在渦旋混合器上混勻。在乾燥的N2氣流作用下除去三氯甲烷使磷脂在 試管壁上形成一層均勻的薄膜，用石蠟膜封上試管口，並用針戳幾個孔作為氣體出口，將試 管置於真空烘箱中乾燥若干小時（例如2小時）以上，除去殘餘的溶劑三氯甲烷。
[0046] B.在含有乾燥磷脂薄膜的試管中加入一定體積脫氣的三羥甲基氨基甲烷（Tris) 緩衝溶液（例如其pH值為7. 4)，緩衝溶液中含有10%體積比的甘油和10%體積比的丙二 醇。加熱緩衝溶液到所含磷脂的相轉變溫度（例如55-60°C)以上，將試管置於水浴式超聲 振蕩器中震蕩並不停的轉動，使牛奶狀的磷脂徹底分散在緩衝溶液中直至得到透明的磷脂 溶液。
[0047] C.將透明的磷脂溶液轉移到西林瓶中（例如按每瓶1ml轉移到2ml的西林瓶中）， 蓋上橡膠塞，將瓶中的空氣置換成生物惰性氣體（例如六氟化硫或者全氟丙烷），然後用鋁 塑蓋和手握式壓蓋機密封，貼上標籤（例如4°C下）存儲備用。
[0048] D.將西林瓶從冰箱取出待其溫度恢復到室溫，用機械振蕩器製備微泡，靜置若干 時間（例如10分鐘）待其穩定後即可使用。
[0049] 步驟S2,製備實施例1述及的微流控晶片。其中，製備一對叉指換能器，每個叉指 換能器有兩個共振頻率，其中一個共振頻率為另一個共振頻率的整數倍，例如分別為15MHz 和30MHz。將叉指換能器與PDMS腔道通過等離子處理的方法綁定，使其成為聲表面波微流 控晶片，此外還可以研究晶片的加工工藝，探索最佳塗膠厚度、曝光時間、以及鍍膜厚度；還 可以研究金屬膜材料、指條對數、聲孔徑尺寸對器件插入損耗及器件帶寬的影響。
[0050] 在製備這一對叉指換能器時，每個叉指換能器分為三部分：第一部分的叉指電極 對應的聲表面波共振頻率為例如15MHz，對應的指條寬度為65微米，在系統中主要起到富 集CTCs、血細胞的作用；第二部分為過渡帶，由於第一部分與第二部分的指條寬度不同，需 要過渡帶進行連接，但由於過渡帶的指條斜率較大，插入損耗較大，在系統中不起到篩選的 作用，只起到連接第一部分與第二部分指條的作用；第三部分的叉指電極對應的聲表面波 共振頻率為例如30MHz，對應的指條寬度為32. 5微米，在系統中主要起到分選CTCs的作用。 聲表面波微流控晶片的製備流程，主要包括塗膠、光刻、鍍膜、剝離、等離子處理等工藝，可 參考已有的相關技術實現。以下過程說明中以第一電極部分的聲波共振頻率為15MHz、第二 電極部分的聲波共振頻率為30MHz為例進行說明，但應理解，這些數值僅僅是為了描述上 方便而給出的距離，其它數值也是可以的，只要保證第二電極部分的聲波共振頻率為第一 電極部分的整數倍即可。
[0051] 晶片中的腔道為PDMS腔道，其包括兩個入口，分別進入外周血液與靶向細胞，出 口為三個，分別為CTCs、血細胞和CTCs，腔道的寬度為例如65微米，深度為例如50微米，一 種具體實現中可利用軟光刻的工藝製備PDMS腔道。
[0052] 步驟S3為CTCs富集階段（如圖2示意性示出的縱向的兩條虛線曲線截出的部 分），即將外周血液與靶向微泡分別通過兩個入口注入晶片內，在對叉指換能器施加15MHz 連續正弦信號，便可在PDMS腔道內形成一個駐波聲場，靶向微泡，血液中CTCs、紅細胞、白 細胞、血小板將聚集在駐波節點的位置，提高CTCs的濃度。另外，使CTCs與靶向微泡能夠 得到充分的接觸，靶向微泡能夠牢固的粘附在細胞表面，增強CTCs的聲學敏感性。
[0053] 在CTCs富集階段，當外周血液與靶向微泡通過注射泵注入到PDMS腔道內，微泡與 血細胞，CTCs均勻的散落在PDMS腔道內。對一對叉指換能器同時施加15MHz的連續正弦 信號，在PDMS腔道內構建以平面駐波聲場，細胞與微泡在駐波聲場內，受到的聲輻射力可 分別表達為： 5 - 2A
[0054] = %\4 sin(2kd)(kRr ? 5(Ι + ΛΡ) ⑴ πΡ〇\At kRdl-1 w2)sin(2M)
[0055] th =---^ , ^rf-
[0056] 通過公式（1)與公式（2)可知：細胞受到的聲輻射力方向與細胞的可壓縮比與密 度有關，而微泡受到的聲輻射力方向與微泡的共振頻率和聲波的共振頻率有關。本發明中， 由於細胞的密度大於液體介質密度，在駐波聲場中，細胞將向節點移動，並被捕獲在駐波聲 場節點位置。另一方面，磷脂微泡的共振頻率一般為2-8ΜΗζ，遠小於聲波頻率（15MHz)，微 泡最終也將被節點俘獲。這表明在本發明中微泡與細胞所受到的聲輻射力方向相同，並且 微泡與細胞均將被捕獲在駐波節點的位置，由於腔道內包含四分之一個波長，這樣細胞將 排列在駐波聲場中節點的位置，即腔道中心的部位。在這一階段，由於靶向微泡與CTCs均 停留在聲場節點的位置，靶向微泡與CTCs均具有較高的濃度，能夠使得靶向微泡與CTCs細 胞充分接觸，使得CTCs與靶向微泡通過表面配體與抗體的結合，微泡牢固的粘附在CTCs表 面，形成一個整體。
[0057] 步驟S4為CTCs篩選步驟。通過富集階段，CTCs、靶向微泡、紅細胞、白細胞、血小 板均將匯聚為一條直線，由於微流體的層流特性，富集的細胞在流過15MHz的駐波聲場後， 這些細胞仍然會在一條直線中移動。與此同時，對叉指換能器施加30MHz的連續正弦信號， 通過調節施加信號的電壓，使得粘附靶向微泡的CTCs發生偏移，CTCs細胞將移動到30MHz 聲場中的節點位置；而血液中的紅細胞、白細胞、血小板仍然在層流拽力的作用下依舊在 15MHz聲場中的節點位置移動，從而實現在血液中篩選CTCs的目的。
[0058] 在CTCs篩選階段（如圖2示意性示出的橫向的兩條虛線直線截出的部分），由於 微流體中流體的雷諾數很低，流體為層流，層流效應將使聚集的CTCs與血液細胞經過第一 階段與過度帶後依舊沿著腔道的中心移動，這時通過對叉指換能器施加30MHz連續交流信 號，在PDMS腔道內形成一個30MHz的駐波聲場，這樣腔道內將會形成兩個駐波聲場的節點， 分別位於腔道的壁面位置，如圖2所示。通過公式（1)與公式（2)可知，在相同的情況下， 微泡的聲阻抗差異較大，微泡受到的輻射力遠大於細胞所受到的聲輻射力，所以，微泡的移 動速度遠大於細胞的移動速度。由於CTCs表面粘附了大量的靶向微泡，使得CTCs的聲阻 抗產生了明顯的差異，在相同的情況下，CTCs細胞比血液細胞受到的聲輻射力更大，對聲波 更敏感，更加容易移動到30MHz聲波的節點位置。這與免疫磁珠的方法有些類似，粘附磁珠 的細胞對磁場敏感，可移動到磁極位置。通過調節施加在叉指換能器的電壓，根據CTCs與 血液細胞的聲阻抗差異，可控制CTCs與血液細胞的移動，使得CTCs細胞移動到30MHz的節 點位置，即腔道的兩個壁面，而血液細胞受到的聲輻射力不足以抵抗層流引起的拽力，而依 舊沿著腔道的中心移動，從而實現篩選CTCs的目的。
[0059] -種示例中採用本實施例的細胞篩選方法進行實驗，該示例的實驗表明：
[0060] (1)靶向微泡製備與特異性腫瘤細胞的粘附。採用深圳先進技術研究院製備的 Lyp-Ι靶向微泡可與MDA-MB-453特異性粘附，而是非靶向微泡則不能夠與腫瘤細胞粘附， 如圖3和圖4所示，其中圖3表明靶向微泡可以與腫瘤細胞的粘附，而圖4表明非靶向微泡 不能與腫瘤細胞粘附。
[0061] (2)細胞的富集。為了研究聲表面波微流控晶片操控大量微納米顆粒的性能，將發 出紅色螢光的細胞以5 μ Ι/min的速度注入到PDMS腔道中。從實驗可以看出，開始時注射 泵壓力驅動細胞懸浮液，細胞在腔道內快速移動，當對兩個叉指換能器同時施加兩個相同 的射頻信號，細胞開始快速聚集，經過約l〇s後，細胞被排列為一條直線，並且細胞螢光強 度隨著聚集細胞數量的增多而不斷增強。
[0062] (3)聲分選實驗研究。基於微機電系統（MEMS)工藝，製備聲表面波微流控晶片， 利用非對稱聲場形成的聲流效應聚集微泡。不例中，在一維駐波聲場中，細胞被排列為一條 直線，通過改變施加在叉指換能器的頻率，改變駐波聲場中節點位置，可實現細胞的橫向移 動，從而實現細胞的篩選。這種方法通過調節駐波場中行波的頻率，改變駐波場中節點位 置，從而引起微粒（細胞、微泡）任意定點移動，不僅能夠連續、精確、可控的移動微粒；還 可對微粒的運動軌跡進行編程和多維度的空間操控；更重要的是體外的細胞實驗證實，該 方法不會影響細胞的活性，可以實現篩選CTCs。利用頻率調製方法，微泡的移動解析度為 2. 2 μ m,微泡移動的最大速度可達465 μ m/s。
[0063] (4)微泡與細胞在駐波聲場中受力。在15MHz駐波聲場中，將微泡和細胞同時注入 到微腔道內，施加駐波聲場，實驗發現微泡與細胞均朝向駐波聲場的節點位置移動，即微泡 與細胞所受到的聲輻射力方向一致，並且微泡的移動速度遠大於細胞，這表明微泡對聲波 更加敏感，更容易受到聲波的作用，也就是說可通過在CTCs表面粘附微泡增強CTCs的聲波 敏感性。
[0064] (5)實驗表明利用本實施例的細胞篩選方法進行篩選不會影響細胞的生物活性。 具體地，實驗通過實時量化觀測細胞活性，可以採用鈣黃綠素（Calcein-AM)和碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI)溶液，其可分別對活細胞和死細胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基 酯親脂性很高，可透過細胞膜，通過活細胞內的酯酶作用，脫去AM基，產生的Calcein (鈣 黃綠素）發出強綠色螢光，因此Calcein-AM僅對活細胞染色。另一方面，作為核染色染料 的PI不能穿過活細胞的細胞膜。它穿過死細胞膜的無序區域而到達細胞核，並嵌入細胞的 DNA雙螺旋從而產生紅色螢光，因此PI僅對死細胞染色。利用Calcein AM/PI螢光雙染色 的特點，活細胞包質內酯酶可將Calcein-AM轉化為calcein，進而發出黃綠色突光。然而， PI可以通過壞死細胞紊亂的細胞膜與DNA結合，產生紅色的螢光。將細胞溶液分成三組：第 一組的細胞為陽性對照組，將細胞繼續放置在37°C的培養箱內培養；將第二組的細胞為聲 表面波篩選後的細胞；第三組的細胞為陰性對照組，將細胞放置在65°C的烘箱內烘烤1小 時。示例實驗結果顯示，在第一組中，幾乎所有的細胞都發出綠色的螢光，只有幾個細胞發 出紅色螢光，在第二組的被聲表面波篩選的細胞中，細胞發出綠色螢光的亮度與第一組的 細胞沒有明顯的差別，大概有85%的細胞在聲表面波的篩選後依舊保持其活性，這表明聲 表面波篩選不會明顯的影響細胞活性，而在第三組中，98%的細胞已經凋亡，幾乎所有的細 胞都發出紅色螢光。這些結果表明，聲表面波篩選後的細胞活性與陽性對照組差別不大，表 明這種篩選方法不會對細胞的生物活性產生影響。
[0065] 綜上，本實施例的關鍵點如下：
[0066] 首先，是靶向微泡的引入。靶向微泡目前主要作為超聲造影劑被適用於超聲成像 中，靶向微泡也可在表面嵌入藥物實現超聲給藥的目的。然而，本實施例將靶向微泡作為一 種載體，粘附在細胞表面，增強細胞的聲阻抗差異，提高細胞受到的聲輻射力，加快CTCs的 橫向移動速度，提高CTCs分選效率。
[0067] 其次，本實施例提出利用聲表面波晶片作為CTCs分選晶片，聲表面波晶片通常作 為諧振器、濾波器廣泛的應用於電子產品中，主要利用聲表面波的電學信號，然而本實施例 主要利用聲表面作為驅動源，更注重的是聲表面波的驅動能力，是CTCs篩選的基礎。
[0068] 再次，是利用聲波富集CTCs。目前傳統的CTCs富集方法主要依靠流動聚焦原理， 晶片中需要鞘流的注入，引入鞘流不僅會對外周血、CTCs細胞進行稀釋，而且鞘流引起的剪 切應力有可能損傷CTCs的生物活性。本實施例利用駐波效應，將血液中CTCs、血細胞均富 集於駐波節點位置，不需要鞘流，更大程度上保護了細胞的生物效應。此外，本實施例不需 要先將CTCs與微泡混合，而是利用駐波聲場的勢阱效應，將靶向微泡與CTCs同時俘獲在駐 波節點位置，通過充分接觸，使CTCs表面充分、穩定的粘附靶向細胞，提高系統的穩定性和 篩選的特異性。
[0069] 最後，對於篩選CTCs，本實施例通過調控聲波的頻率、幅值來分選CTCs細胞。通過 粘附靶向微泡，CTCs細胞對聲波更加敏感，更容易受到聲波的作用，CTCs更容易移動到駐 波聲場中節點位置（腔道兩側），而其他血細胞在較小的聲輻射力作用下不足以抵抗層流 引起的拽力作用，依舊沿原先的路徑移動（腔道中心），從而實現了分選目的。本實施例不 需要改變器件的結構、腔道的尺寸，只需要改變射頻信號的輸入便可實現細胞的分選。
[0070] 可以理解，對於上述實施例的基於的篩選方法，除了可以改變聲波的頻率、幅度， 還可以改變聲波的相位、幅度。而且，聲波分選晶片除了基於聲表面波，還可基於體聲波，即 利用壓電陶瓷為激勵源實現細胞篩選。此外，利用靶向微泡篩選CTCs的方法不僅僅適用於 CTCs，只要細胞之間的聲阻抗有差異，也適用與分選血液細胞，例如將血小板在血細胞中分 離。
[0071] 綜上各實施例可知，本發明通過構建聲波微流控晶片，並製備靶向微泡，首先將血 液中的CTCs富集，使CTCs與靶向微泡充分接觸，使靶向微泡粘附在CTCs表面，其後，通過 調控聲波的幅值、相位，篩選出血液中CTCs。這種基於祀向微泡的CTCs聲學篩選方法，可提 高篩選效率，而不影響細胞的生物活性，為腫瘤轉移早期提供新的診斷方法。
[0072] 以上內容是結合具體的實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發 明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫 離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。
【權利要求】
1. 一種用於對特異性細胞進行篩選的微流控晶片，包括基底（21)和附著於所述基底 上的腔道（23)，其特徵在於，還包括聲波激勵源；所述腔道包括中間通道、位於所述中間通 道一端的用於供靶向微泡和含有特異性細胞的血液注入的入口（231，232)和位於所述中 間通道另一端的用於供分離出的特異性細胞和血細胞輸出的出口（233, 234, 235);所述聲 波激勵源位於基底上且位於所述中間通道的兩側，所述聲波激勵源包括沿所述中心通道並 向出口方向延伸的兩部分，其中靠近出口的第二部分對應的聲波共振頻率是遠尚出口的第 一部分對應的聲波共振頻率的整數倍。
2. 如權利要求1所述的微流控晶片，其特徵在於，所述聲波激勵源包括一對叉指換能 器（22)，所述叉指換能器位於基底上且位於所述中間通道的兩側，所述叉指換能器包括第 一電極部分（221)、第二電極部分（223)和用於連接所述第一電極部分和所述第二電極部 分的過濾帶（222)，所述第一電極部分對應所述遠離出口的第一部分，所述第二電極部分對 應所述靠近出口的第二部分。
3. 如權利要求2所述的微流控晶片，其特徵在於，所述第一電極部分的指條寬度為所 述第二電極部分的指條寬度的整數倍。
4. 如權利要求1所述的微流控晶片，其特徵在於，所述基底為128度YX雙面拋光的鈮 酸鋰晶體；所述腔道由聚二甲基矽氧烷材質製作；所述入口包括用於供靶向微泡注入的第 一入口（231)和用於供血液注入的第二入口（232)，所述出口包括用於供分離出的特異性 細胞輸出的第三出口（233)、第五出口（235)和用於供血細胞輸出的第四出口（234)，且所 述第四出口位於所述第三出口和所述第五出口之間。
5. 如權利要求1所述的微流控晶片，其特徵在於，所述聲波激勵源包括基於體聲波的 激勵源。
6. 如權利要求1所述的微流控晶片，其特徵在於，所述特異性細胞包括循環腫瘤細胞； 所述特異性細胞與所述靶向微泡的特異性不同，且所述靶向微泡在聲波激勵源的作用下粘 附於所述特異性細胞。
7. 如權利要求1所述的微流控晶片，其特徵在於，所述腔道採用軟光刻工藝製作。
8. -種用於對特異性細胞進行篩選的方法，其特徵在於，包括： 細胞富集步驟：將含有特異性細胞的血液和已製備的靶向微泡注入如權利要求1所述 的微流控晶片，當所述血液和所述靶向微泡移動到與所述第一部分相對應的位置時，對所 述微流控晶片施加信號以在所述腔道內形成駐波聲場，且使得血液中的血細胞以及與靶向 微泡充分接觸的特異性細胞沿所述中心通道並朝向出口方向移動； 細胞分選步驟：當所述血液和所述靶向微泡移動到與所述第二部分相對應的位置時， 調整所述信號的頻率或相位，從而使得靶向微泡及與其充分接觸的特異性細胞的移動速度 大於血細胞的移動速度。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述特異性細胞為循環腫瘤細胞；所述靶向 微泡的製備包括： 步驟A :在容器中按一定比例將一定量的二硬脂醯磷脂醯膽鹼、聚乙二醇2000修飾二 硬脂醯磷脂醯乙醇胺溶解在三氯甲烷中且在渦旋混合器上混勻，通入氮氣除去三氯甲烷並 使磷脂在容器壁上形成一層均勻的薄膜，真空乾燥若干小時； 步驟B:在含有乾燥磷脂薄膜的容器中加入經脫氣處理的三羥甲基氨基甲烷緩衝溶 液，所述緩衝溶液含有10%體積的甘油和10%體積的丙二醇，加熱所述緩衝溶液到相轉變 溫度以上，水浴超聲震蕩使磷脂溶液分散徹底直至透明； 步驟C:將透明的磷脂溶液分裝置西林瓶中，並將西林瓶中的空氣置換為生物惰性氣 體； 步驟D :震蕩西林瓶從而製備出微泡。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特徵在於，所述微流控晶片的聲波激勵源為位 於基底上且位於所述中間通道的兩側的一對叉指換能器，所述叉指換能器包括第一電極部 分、第二電極部分和用於連接所述第一電極部分和所述第二電極部分的過濾帶，所述第一 電極部分對應的聲波共振頻率為所述第二電極部分對應的聲波共振頻率的整數倍。
【文檔編號】C12M1/00GK104195028SQ201410382668
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月5日 優先權日:2014年8月5日
【發明者】鄭海榮, 孟龍, 蔡飛燕, 牛麗麗, 李飛, 肖楊 申請人:深圳先進技術研究院