一種重組j亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-20 17:52:06 2

專利名稱：一種重組j亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及禽白血病病毒感染性克隆領域，具體涉及一種重組J亞群禽白血病病 毒感染性克隆質粒及其製備方法和應用。
背景技術：
禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)屬於正逆轉錄病毒亞科、D逆轉錄病 毒屬(Fauquet et al，2005)。禽白血病(Avian leukosis, AL)是由ALV引起的禽類多種 腫瘤性疾病的總稱，該病在臨床上表現形式多樣，其中包括淋巴細胞性白血病、成紅細胞性 白血病、成髓細胞性白血病、髓細胞性白血病等(Ewert, 1988 ；Coffin, 1992 ；Payne et al， 1997 ；Payne,1998 ；Fadly et al，2003)。20世紀80年代以前，ALV亞群的變異都很小，主要是六十年代鑑定出的5個亞 群(Levy，1992)。之後，美國、以色列、法國等國家的肉雞陸續發生J亞群禽白血病流行 (Payne，1991)，並迅速擴散至世界各國，造成了巨大的經濟損失，成為全世界家禽業所面臨 的一個主要問題。自從杜巖等(1999)在我國商品肉雞中首次發現J亞群禽白血病病毒 (subgroup J avian leukosis virus, ALV-J)以來，各主要養雞地區均有J亞群禽白血病 病例出現，並且，ALV-J在中國的流行範圍及對宿主的危害有擴大的趨勢(楊玉瑩，2003 ；Xu et al，2004 ；成子強等，2005 ；邱玉等，2007)。A、B、C、D等亞群禽白血病病毒主要引起雞的淋巴細胞性白血病(lymphocytic leukosis, LL)，而J亞群禽白血病病毒則主要引起25 55周齡肉雞的髓細胞性白血病 (myeloid leukosis，ML)，致死率可達 6% (Payne et al, 1998) ALV-J 原型株 HPRS-103 接種11日齡雞胚可使肉雞出殼後142 143天出現髓細胞瘤或腎瘤並造成死亡(Payne et al, 1992)。然而，後來從臨床和實驗性的ALV-J病例中分離到的一些急性轉化型毒株可迅 速轉化骨髓細胞，其誘發肉用型雞ML死亡周齡提早到9周齡，且表現出很高的傳染性和發 病率(Arshad et al，1997)，可見，在ALV-J發現後的近20年內，其致病性發生了重大的演 化。Chesters (2002)通過研究替換了 A和J亞群的囊膜蛋白的嵌合病毒的致瘤性 發現，病毒的囊膜蛋白是致瘤譜系的一個主要決定因素。一般認為，骨髓細胞性白血病是 ALV-J作用於骨髓細胞系前體細胞的結果，因此，ALV-J也常被描述為骨髓細胞瘤型禽白血 病病毒，實際上，ALV-J同時也可引起其他類型的腫瘤，例如淋巴細胞瘤、神經膠質瘤和成紅 細胞性白血病等，這可能和病毒與不同品系或個體宿主細胞的相互作用以及發生轉化的細 胞外整體因素有關，其中癌基因在特定時間、特定位點的表達是造成不同腫瘤發生的原因。 儘管如此，一直以來，臨床及國內實驗感染引起的J亞群禽白血病病理變化都主要表現為 骨髓細胞瘤。辛朝安等(2006)首次在中國發現疑似ALV-J引起的蛋雞血管瘤病變型白血 病，此後各地不斷有ALV-J相關的蛋雞及肉種雞血管瘤病例出現，證明這一新病變型ALV-J 正在中國雞群中不斷蔓延感染。
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ALV-J的強致病性、高變異性及滅活病毒誘導中和抗體的能力低下嚴重阻礙了 ALV-J疫苗的研製。E亞群禽白血病病毒(ALV-E)是在雞體內極普遍存在的低致病性或無致 病性的內源性白血病病毒，研究表明不同亞群ALV的致病力不同的主要原因在於其非編碼 區LTR =ALV-J LTR起到一種強啟動子和增強子的作用，其通過整合在宿主的原癌基因位點 附近促發原癌基因的表達，最終導致腫瘤的發生；此外，ALV的病毒蛋白如囊膜糖蛋白等對 ALV的致病性也有一定的影響。而ALV-E的LTR啟動子和增強子的作用很弱，這是ALV-E 低或無致病力的主要原因，但雞基因組中ALV-E基因大都存在缺陷，不能自發產生有感染 性的病毒粒子，給ALV-E感染性克隆帶來很大困難。Yang等(2007)發現LTR可以激活細胞 的端粒末端轉移酶活性以開啟或增強腫瘤的發展。此外，腫瘤的產生也可能和ALV-J與其 受體NHEl的相互作用有關，NHEl受各種的胞內或胞外信號調控，可提升細胞分裂和增殖並 且減少細胞粘著、增加細胞移行，這些也是腫瘤發生和侵襲所必需的，因此，ALV-J感染可能 激活NHEl，影響其下遊信號途徑，導致被感染細胞的轉化。

發明內容
本發明的目的在於根據現有技術中存在的不足，提供一種重組J亞群禽白血病病 毒克隆質粒。本發明另一目的在於提供上述重組J亞群禽白血病病毒克隆質粒的製備方法。本發明還有一個目的在於提供上述重組J亞群禽白血病病毒克隆質粒的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現一種重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒，該感染性病毒克隆質粒所包含J 亞群禽白血病病毒前病毒全長基因兩端的長末端重複序列(LTR)被替換為E亞群禽白血病 病毒的LTR，該感染性病毒克隆的基因序列如SEQ ID N0:1所示。本發明重組J亞群禽白血病病毒感染性病毒克隆的製備方法，是將J亞群禽白血 病前病毒基因兩端的長末端重複序列替換為E亞群禽白血病前病毒兩端的長末端重複序 列，得到重組J亞群禽白血病病毒基因序列，並以此構建了重組J亞群禽白血病病毒感染性 克隆質粒，通過轉染入細胞後得到重組J亞群禽白血病病毒；所述J亞群禽白血病病毒前病 毒基因序列如SEQ ID NO :15所示，所述E亞群禽白血病病毒前病毒兩端的長末端重複序列 如 SEQ ID NO 16 17 所示。本發明是參考GenBank公開的序列，以及前期獲取的國內J亞群禽白血病病毒株 及E亞群禽白血病病毒株的基因組序列，運用DNAStar軟體包中MapDraw功能分析保守酶 切位點分布信息，結合載體PGEM-T Easy和pGEM-7zf(+)的酶切位點情況進行比較分析後， 將J亞群禽白血病病毒前病毒基因組分為3個長2. (Γ3. 5kb的片段，利用Primer Premier 5. 0專業引物設計軟體設計引物，確保引物擴增出的3個片段間有約200bp的重疊區域，同 時還設計了針對E亞群禽白血病病毒的基因組兩端長末端重複序列的引物，將所設計引物 按照PAGE級別合成。本發明利用擴增得到的J亞群禽白血病病毒前病毒基因組目的片段 中的酶切位點BstEII、MluI、KpnI、EcoRI及E亞群禽白血病病毒前病毒基因組目的片段中 的 MluI、pGEM-T Easy 中的 Sail、pGEM-7zf(+)中的 HindIII、KpnI、EcoRI、Xba I，對上述 各質粒進行一系列的酶切連接，最終獲得含有上述重組J亞群禽白血病病毒前病毒全長基 因組的感染性克隆質粒。
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本發明重組J亞群禽白血病病毒克隆質粒的具體製備方法如下(1)設計引物，引物序列按照先上遊引物後下遊引物的形式，如SEQ IDN0:2 7所 示，以感染J亞群禽白血病病毒的雞胚成纖維細胞DNA為模板，擴增J亞群禽白血病病毒前 病毒DNA片段按照從左至右的方向如SEQ ID NO :8 10所示，分別單獨克隆入載體pGEM_T Easy中，得到相應的重組質粒A、B和C ；(2)設計引物，引物序列按照先上遊引物後下遊引物的形式，如SEQ ID NO : Γ 4 所示，以攜帶E亞群禽白血病病毒的雞組織DNA為模板擴增E亞群禽白血病病毒前病毒DNA 兩端的長末端重複序列所在片段並分別單獨克隆入載體PGEM-T Easy中，得到相應的重組 質粒D和E ；(3)將經酶切的A與D、C與E分別連接，得到重組片段F和G ；(4)酶切後的載體pGEM_7zf(+)與G連接，得到的片段再經酶切後與F連接，得到 重組質粒M ；(5)重組質粒M經酶切，與B連接，得到重組J亞群禽白血病病毒克隆質粒。上述製備方法中，載體pGEM-T Easy可以被具有Sail、MluI單酶切位點，但不含 BstEII、Xba I、EcoRI、HindIII、KpnI 的克隆載體替代。載體pGEM_7zf(+)可以被如下單酶切位點排序分布(正反方向不限)的克隆載 體HindIII、KpnI、EcoRI、Xba I。上述製備方法中，所述A中插入片段上的BstEII與SalI單酶切位點之間間隔 353bp ；C中插入片段上的KpnI與載體上的MluI單酶切位點之間間隔574bp ；D中插入片段 上的BstEII與SalI單酶切位點之間間隔304bp ；E中插入片段上的MluI與載體上的MluI 酶切位點之間間隔51bp。上述製備方法中，步驟(3)中所述C與E的酶切連接方法是C和E分別經MluI酶 切後，回收片段，將兩個片段連接起來，再經KpnI、HindIII酶切，得到重組片段G;步驟(4) 中，載體的酶切位點是KpnI和Hindlll，與G連接後的片段的酶切位點是Xba I和EcoRI ； 步驟(5)中所述重組質粒M的酶切位點是KpnI和EcoRI。上述製備方法中，所述連接是用T4DNA連接酶連接。上述製備方法中，質粒的大量擴增是通過轉化大腸桿菌感受態細胞實現的，該大 腸桿菌可以是任意一種本領域技術人員所常用的大腸桿菌，如DH5ci、Τ0Ρ10或JM109細胞。本發明重組J亞群禽白血病病毒克隆質粒可以用於製備J亞群禽白血病病毒疫 苗，還可以為禽白血病病毒的研究提供理論和實踐依據。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果(1)本發明利用反向遺傳操作技術將J亞群禽白血病病毒的LTR替換為E亞群禽 白血病病毒的LTR，並成功得到重組病毒克隆質粒，為J亞群禽白血病病毒疫苗的研製、J亞 群禽白血病病毒的致病機理、基因結構以及功能的關係、病毒的複製、遺傳變異規律提供了 借鑑；(2)本發明利用J亞群禽白血病病毒及E亞群禽白血病病毒前病毒基因組中保 守的酶切位點以及特定克隆載體上的特定酶切位點，加強了本發明方法的通用性和可重複 性。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。實施例1感染性克隆質粒的構建1. ALV-J與ALV-E前病毒目的基因片段的獲得1. IALV-J與ALV-E前病毒目的基因片段的擴增引物參考ALV-J及ALV-E的全基因序列分別設計5對引物對ALV-J與ALV-E前病毒目 的基因片段進行擴增，同時在部分引物5』端引入必要的酶切位點，5對引物序列如SEQ ID NO :2 7、11 14所示。1. 2ALV-J目的基因片段的PCR擴增以已感染ALV-J的CEF細胞DNA為模板，用PrimeSTARTM HS DNA聚合酶(TaKaRa) 及以下3對引物進行ALV-J前病毒DNA目的片段的擴增第一對引物對的PCR 反應條件為98°C 3min ；98°C 15s，55°C 10s，72°C 3min，進行 30個循環；72°C延伸8min後置4°C保存。第二對引物對的Touch down PCR 反應條件為98°C 3min ；98°C 15s，64°C (每個 循環降 1°C )10s，72°C 3min 進行 9 個循環；98°C 15s，55°C 10s，72°C 3min，進行 30 個循環； 72°C延伸8min後置4°C保存。第三對引物對的PCR反應條件為98 V 3min ；98 V 15s，69 V (每個循環降 rc )10s,72°C 3min 進行 18 個循環；98°C 15s，51°C 10s，72°C 3min，進行 30 個循環；72°C延 伸Smin後置4°C保存。1. 3ALV-E目的基因片段的PCR擴增 以感染ALV-E的SPF雞組織DNA為模板，利用PrimeSTARTM HS DNA聚合酶 (TaKaRa)及以下2對引物擴增ALV-E前病毒DNA目的片段兩對引物的PCR反應條件為98°C 3min ；98°C 15s，68°C (每個循環降1°C ) 10s， 72°C 3min 進行 15 個循環；98°C 15s，53°C 10s，72°C lmin，進行 30 個循環；72°C延伸 8min 後置4°C保存。1. 4各目的基因片段重組質粒的構建各PCR產物分別利用TIANGEN 超薄DNA產物純化試劑盒進行純化後，利 用ExTaqTM DNA聚合酶(TaKaRa)進行加A尾以便進行T-A克隆，加A尾反應條件為 72°C45min。之後通過瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。參照普洛麥格公司(Promega) pGEM -T EASY載體的使用說明書進行目的片段與載體的連接。IOyL連接體系中 包括以下各組分2XRapid Ligation Buffer 5 μ L, pGEM -T Easy Vector (50ng/ UL)0. 5yL,目的DNA 3. 5 μ L，T4DNA連接酶1 μ L。各組分混勻後，16°C連接2h，轉化DH5 α 感受態宿主菌，通過菌液PCR將初步鑑定為陽性的克隆用自動序列測序儀測序。將測序結 果通過基因分析軟體包DNASTAR中的EditSeq與SeqMan程序進行序列比對和拼接。鑑定 為按正確方向插入上述產物片段的陽性質粒分別命名為Α、B、C、D和Ε，其中A與D分別以 插入片段上的BstEII與SalI單酶切位點之間間隔353bp和304bp為正確插入陽性質粒；C 以插入片段上的KpnI與載體上的MluI單酶切位點之間間隔574bp為正確插入陽性質粒；E 以分別位於插入片段與載體上的兩個MluI酶切位點之間間隔51bp為正確插入陽性質粒。
2感染性克隆質粒的構建2. 1重組F片段的構建A經BstEII與SalI雙酶切，回收約5. 3kb的載體片段，命名為rCHNA ；D經BstEII 與SalI雙酶切，回收約300bp的載體片段，命名為rE5LTR。rCHNA與rELTR利用T4DNA連 接酶連接，連接產物轉化DH5 α感受態細胞，將陽性克隆菌液用自動序列測序儀測序鑑定， 得到的陽性重組質粒，先後經Xba I與EcoRI酶切，回收約2. 5kb的片段，命名為F。2. 2重組G片段的構建C經MluI酶切回收約2. 6kb的載體片段，命名為rCHNC ；E經MluI酶切回收約 3. 3kb的載體片段，命名為rE3LTR。rCHNC與rE3LTR利用T4DNA連接酶連接，連接產物轉 化DH5 α感受態細胞，最終得到的重組質粒進行測序鑑定，插入目的片段上的的KpnI與 HindIII單酶切位點間隔2353bp為正確插入陽性質粒，陽性質粒先後經KpnI與HindIII 雙酶切，回收約2. 4kb的片段，命名為G。2. 3L克隆的構建pGEM-7zf (+)先後經KpnI與HindIII雙酶切，回收約3. Okb的載體片段與G利用 T4DNA連接酶連接，連接產物轉化DH5 α感受態細胞，經測序鑑定最終得到的陽性重組質粒 先後經Xba I與EcoRI酶切，回收約5. 3kb的片段與F利用T4DNA連接酶連接，連接產物轉 化DH5a感受態細胞，經測序鑑定最終得到的陽性重組質粒命名為Μ。M經KpnI與EcoRI 雙酶切，回收約7. Skb的片段；B經KpnI與EcoRI雙酶切，回收約2. 7kb的片段，兩個片段 利用T4DNA連接酶連接，連接產物轉化DH5 α感受態細胞，經測序鑑定最終得到的陽性重組 質粒命名為L。本實施例所涉及的雙酶切、連接和轉化等步驟，均採用本領域的常規操作。實施例2細胞轉染與病毒收穫1.轉染用質粒及細胞的準備參照OMEGA去內毒素質粒提取試劑盒說明書，具體如下用1.5mL離心管收集 3-5mL 菌液，8000r/min 離心 3min。棄去上清液,加入 250 μ L SolutionI 液(含 RNase Α)， 渦旋振蕩使菌體重懸混勻；然後加入250yL Solution II液，輕柔顛倒混勻6次；若此時溶 液已比較澄清，則立即加入350 μ L Solution III液，若仍比較混濁，可作用2 5min後加入 350 μ L Solution III液，顛倒混勻6次。12000r/min離心15min。將上清液轉移到離心柱 中，10000r/min離心30s，棄去收集管中的濾液。加入500 μ L HB Buffer於柱中，IOOOOr/ min離心30s，棄收集管中的濾液。加入700 μ L DNA Washing Buffer洗滌，10000r/min離 心30s，棄收集管中的濾液，重複此步驟一次後，將離心柱空離心lmin。取下離心柱置於滅 菌的1. 5mL EP離心管中，加入適量的TE Buffer，室溫靜止5min，10000r/min離心lmin，洗 脫可疑重組質粒DNA，直接測序或-20°C備用。在轉染前1天按常規方法製作DF-I細胞或雞胚成纖維細胞CEF，控制每孔的細胞 數量，使得細胞培養板中各孔中的細胞在第2天轉染時可長滿約90%。2.轉染參考invitrogen 公司Lipfectamine 2000說明書的方法，按照6孔細胞培養板 的規格，每個細胞培養孔對應4 μ g的感染性克隆質粒L和10 μ L的Lipfectamine 2000， 將其分別與250 μ L的Opti-MEM IMedium輕輕混合；室溫孵育5min後，繼續將兩混合液輕輕混合在一起，室溫孵育20min後加入6孔細胞培養板中使混合液完全覆蓋細胞，將轉染的 細胞置於37°C的CO2培養箱中孵育。3.病毒的收穫轉染24h後，棄上清，加入等體積的含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續生長，待細 胞活力恢復後用含1 %胎牛血清的DMEM作為維持液，轉染後第6天將細胞凍融一次即得到 含有致弱的J亞群禽白血病病毒的細胞培養物，分裝置於-70°C冰箱中保存備用。本實施例所涉及的細胞培養和轉染等步驟，均採用本領域的常規操作。一種重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒及其製備方法和應用序列表SEQUENCE LISTING華南農業大學 一種重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒及其製備方法和應用17PatentIn version 3. 2110506DNA人工序列1gggcgaattgggcccgacgtcgcatgctcctctagatgtagtcaaatagagccagaggca60
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21CN [06011033[0602DNA[0603人工序列[060416[0605tctagatgtagtcaaatagagccagaggcaacttgaaaagtctaaagaccaaataaggaa60[0606aaagcaagacattccatatgctcattggtggcgactagataaggaaggaatgacgcaagg120[0607acatatgggcgtagacgaagctatgtacgattatataagctgttgccgccatcaaataaa180[0608cgccattttaccatccaccacattggtgtgcacctgggtagatggacagaccgttgagtc240[0609cctaacgattgcgaacacctgaatgaagcagaaggcttcatttggtgaccccgacgtgat300[0610cgttagggaatagtggtcggccaccggcggcgtggcgatcctgccctcatccgtcccgct360[0611taacggggagcgggcgatgaccctagtagagggggctgcggcttaggagggcagaagctg420[0612agtggcgtcggggggagctctactgcagggagcccacataccctaccgagcactcagagg480[0613gtcgttggaagacgaggaggaagcccgacgactgagtggtccgcaccaggCgCggttCCg540[0614gttgctctgcgtgattctggtcgccctgtggatcaagcatggaagccgtcataaaggtga600[0615tttcgtccgcgtgtaaaacctattgcgggaaaacctctccttctaagaaggaaatagggg660[0616ccatgttgtccctcttacaagatgaagggttgcttatgtccccctcagacttatattccc720[0617cggggtcctgggatcccattaccgcggcgctctcccagcgggctatggtgcttgggaaat780[0618cgggagagttaaaaacctggggattgattttgggggcattgaaggcggctcgagaggaac840[0619aggctacatctgagcaagcaaagttttggttcgggctagggggagggggggtctctcccc900[0620caggtccggagtgtatcgaaaaaccagcaacggagcggcggatcggcaaaggggaggaag960[0621cgagagagacaactgcgcagcgagatgcgaagatggcgccggaggaagcggccacaccta1020[0622aaaccgttggcac1033[062317[0624305[0625DNA[0626人工序列[062717[0628acgcgtttgcatagggagggggaaatgtagtcaaatagagccagaggcaacttgaatagt60[0629ctaaagaccaaataaggaaaaagcaagacattccgtatgctcattggtggcaactagata120[0630aggaaggaatgacgcaaggacatatgggcgtagacgaagctatgtacgattatataagct180[0631gttgccacca CclclcltclclclCgccattttaccatccaccacattggtgtgcacctgggtag240[0632atggacagaccgttgagtccctaacgattgcgaacaactgaatgaagcagaaggcttcaa300[0633agctt305
2權利要求
一種重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒，其特徵在於所述病毒感染性克隆質粒的基因序列如SEQ ID NO1所示。
2.權利要求1所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒的製備方法，其特徵在於 所述製備方法如下(1)設計引物，引物序列如SEQID NO :2 7所示，以感染J亞群禽白血病病毒的雞胚成 纖維細胞DNA為模板，擴增J亞群禽白血病病毒前病毒DNA片段如SEQ ID NO :8 10所示， 分別單獨克隆入載體中，得到相應的重組質粒A、B和C ；(2)設計引物，引物序列如SEQID NO :1廣14所示，以攜帶E亞群禽白血病病毒的雞組 織DNA為模板擴增E亞群禽白血病病毒前病毒DNA兩端的長末端重複序列所在片段並分別 單獨克隆入載體中，得到相應的重組質粒D和E ；(3)將經酶切的A與D、C與E分別連接，得到重組片段F和G；(4)酶切後的載體與G連接，得到的片段再經酶切後與F連接，得到重組質粒M；(5)重組質粒M經酶切，與B連接，得到重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒。
3.根據權利要求2所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒的製備方法，其特徵 在於所述A中插入片段上的BstEII與SalI單酶切位點之間間隔353bp ；C中插入片段上的 KpnI與載體上的MluI單酶切位點之間間隔574bp ；D中插入片段上的BstEII與SalI單酶 切位點之間間隔304bp ；E中插入片段上的MluI與載體上的MluI酶切位點之間間隔51bp。
4.根據權利要求2所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒的製備方法，其特徵 在於步驟(3)中所述A與D的酶切連接方法是A和D分別經BstEII與SalI雙酶切，回收 片段，將兩個片段連接起來，再經Xba I>EcoRI酶切，得到重組片段F。
5.根據權利要求2所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒的製備方法，其特徵 在於步驟(3)中所述C與E的酶切連接方法是C和E分別經MluI酶切後，回收片段，將兩 個片段連接起來，再經KpnI、HindIII酶切，得到重組片段G ；步驟(4)中，載體的酶切位點 是KpnI和Hindlll，與G連接後的片段的酶切位點是Xba I和EcoRI ；步驟(5)中所述重組 質粒M的酶切位點是KpnI和EcoRI。
6.根據權利要求2所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒的製備方法，其特 徵在於步驟(1)和(2)中所述載體為具有Sail、MluI單酶切位點，但不含BstEII、Xba I、 EcoRI、HindIII、KpnI 的克隆載體。
7.根據權利要求2所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒的製備方法，其特 徵在於步驟(4)中所述載體為具有如下單酶切位點排序分布的克隆載體HindIII、KpnI、 EcoRI、Xba I。
8.根據權利要求3 7中任意一條權利要求所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質 粒的製備方法，其特徵在於所述連接是用T4DNA連接酶連接。
9.權利要求1所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒的應用，其特徵在於所述 重組J亞群禽白血病病毒作為一種帶人工標記的J亞群禽白血病病毒弱毒，用於研究禽白 血病病毒的複製、致弱、免疫保護機制以及J亞群禽白血病病毒弱毒活疫苗。
全文摘要
本發明公開了一種重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒及其製備方法和應用。本發明是將J亞群禽白血病病毒前病毒基因兩端的長末端重複序列替換為E亞群禽白血病病毒前病毒基因兩端的長末端重複序列，將其插入載體中，以此構建了重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質粒，得到序列如SEQ ID NO1所示。本發明重組J亞群禽白血病病毒克隆質粒經轉染得到的重組病毒株的複製能力和致病性明顯弱於自然的J亞群禽白血病病毒，但可表達J亞群禽白血病病毒的結構蛋白，具備J亞群禽白血病病毒的抗原性，可被J亞群禽白血病病毒特異性單克隆抗體JE9所識別。本發明病毒克隆質粒為製備J亞群禽白血病病毒弱毒性活疫苗提供了材料和方法借鑑。
文檔編號A61P31/14GK101899465SQ200910213800
公開日2010年12月1日 申請日期2009年12月15日 優先權日2009年12月15日
發明者廖明, 張賀楠, 曹偉勝, 賴漢漳, 辛朝安 申請人:華南農業大學