編程性細胞死亡誘導分子Ⅱ的製作方法

2023-06-20 20:42:41 2

專利名稱：編程性細胞死亡誘導分子Ⅱ的製作方法
技術領域：
本發明涉及TNF-配基超家族的一個新成員。具體地說，本發明提供了編碼人編程性細胞死亡誘導分子II(Apoptosis Inducing MolecularII，AIM II)的分離的核酸分子。本發明還提供了AIM II多肽，以及生產該多肽的載體、宿主細胞和重組方法。本發明還涉及鑑定AIM II活性的激動劑和拮抗劑的篩選方法。本發明也提供了治療淋巴結病、自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病以及抑制腫瘤如腫瘤細胞生長的治療方法。
背景技術：
人腫瘤壞死因子α(TNF-α)和β(TNF-β，或淋巴細胞毒素)是一個多肽介導分子大類中的相關成員，該類多肽介導分子包括幹擾素、白細胞介素和生長因子，總稱為細胞因子(Beutler B.和Cerami A.，Annu.Ret.Immunol.，7625-655(1989))。
腫瘤壞死因子(TNF-α和TNF-β)最初是由於其抗腫瘤活性效果而被發現的，然而目前它被看作是一種多效細胞因子，具有多種生物學活性，包括參與一些轉化細胞系的編程性細胞死亡、介導細胞的活化和增殖，並在免疫調控和炎症中也有重要作用。
迄今為止，TNF-配基超家族的已知成員有TNF-α、TNF-β(淋巴細胞毒素-α)、LT-β、OX40L、Fax配基、CD30L、CD27L、CD40L以及4-IBBL。TNF配基超家族的配基是酸性的、類似TNF的分子，在胞外結構域有大約20％(範圍，12％-36％)的序列同源性，並主要以膜結合形式存在，其具生物活性的類型是三聚體/多聚體複合物。目前僅從TNF、LTα和Fas配基鑑定出TNF配基超家族的可溶性形式(一般綜述見Gruss H.和Dower S.K.，血液，85(12)3378-3404(1995))。此處全文引入此文獻作為參考。
這些蛋白質參與細胞增殖、活化和分化過程的調控，包括通過編程性細胞死亡或細胞毒性控制細胞的存活或死亡(Armitage R.J.，Curr.Opin.Immunol.，6407(1994)及Smith C.A.，細胞，75959(1994))。
哺乳動物的發育依賴於細胞的增殖和分化，以及在編程性細胞死亡過程中發生的細胞程序性死亡(Walker等，Methods Achiev.Exp.Pathol.，1318(1988)。編程性細胞死亡在識別自身抗原的免疫胸腺細胞的破壞過程中起著非常重要的作用。正常排除過程的失效可能在自身免疫疾病中具有一定作用(Gammon等，今日免疫學，12193(1991))。
Itoh等(細胞，66233(1991))描述了一種細胞表面抗原-Fas/CD95。它介導編程性細胞死亡，參與T-細胞的克隆缺失。Fas在已活化的T-細胞、B-細胞和嗜中性白細胞以及胸腺、肝、心臟、肺中都有表達。Fas除了在已活化的T-細胞、B-細胞和嗜中性白細胞中表達外，它還在成年小鼠卵巢中表達(Watanate-Fukunaga等，免疫學雜誌，1481274(1992))。在將Fas的單克隆抗體與Fas交聯的實驗中，會引發編程性細胞死亡(Yonehara等，實驗醫學雜誌，1691747(1989)；Trauth等，科學，245301(1989))。另外，有例子表明，單克隆抗體與Fas的結合有可能在一定條件下刺激T-細胞(Alderson等，實驗醫學雜誌，1782231(1993))。
Fas抗原是一種細胞表面蛋白，共相對分子量為45kd。人和鼠的Fas基因已由Watanabe-Fukunaga等(免疫學雜誌，1481274(1992)和Itoh等(細胞，66233(1991)克隆。兩種基因所編碼的蛋白質均為跨膜蛋白，與神經生長因子/腫瘤壞死因子受體超家族具有結構上的同源性，所述超家族包括兩種TNF受體、低親和性神經生長因子受體及LTβ受體CD40、CD27、CD30和OX40。
近來Fas配基已有描述(Suda等，細胞75II69(1993))。其胺基酸序列表明Fas配基是屬於TNF家族的II型跨膜蛋白。Fas配基在脾細胞和胸腺細胞中表達，經純化的Fas配基分子量為40kd。
近來，已經證明Fas/Fas配基間的相互作用是T細胞激活後的編程性細胞死亡過程所必需的(Ju等，自然，373444(1995)；Brunner等，自然，373441(1995))。T細胞的活化可誘導細胞表面上的這兩種蛋白質，隨後配基與受體間的相互作用導致了細胞的編程性細胞死亡。由此證明，在正常免疫反應中，Fas/Fas配基相互作用所誘導的編程性細胞死亡過程可能具有一定的調控作用。
根據結構和生物學上的相似性，本發明的多肽已被鑑定為TNF配基超家族的一個新成員。
顯然，應該存在一些因子，它們可調控正常和異常細胞的活化和分化。因此，有必要鑑定和表徵在正常和疾病狀態下調控正常和異常細胞的活化和分化的這類因子。具體地說，有必要分離和鑑定控制編程性細胞死亡以治療自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病及淋巴結病的其它的Fas配基。
發明概述本發明提供了含有編碼AIM II多肽的多核苷酸的分離的核酸分子，所述AIM II多肽具有

圖1A-C(SEQ ID NO2)所示胺基酸序列或由保藏於細菌宿主的cDNA克隆所編碼的胺基酸序列，該細菌宿主於1996年8月22日以ATCC保藏號97689進行了保藏。
本發明也涉及含有本發明的分離核酸分子的重組載體、含有所述重組載體的宿主細胞，以及通過重組技術製備所述載體和宿主細胞並利用它們生產AIM II多肽或肽的方法。
本發明還提供了具有由本文所述多核苷酸編碼的胺基酸序列的分離的AIM II多肽。
本文所用術語「AIM II」多肽包括保留了AIM II多肽活性的膜結合蛋白質(含有一個細胞質結構域、一個跨膜結構域，以及一個胞外結構域)及其截短的蛋白質。在一個實施方案中，可溶性AIM II多肽含有AIM II蛋白全部或部分胞外結構域，但缺乏能將所述多肽保留於細胞膜上的跨膜區。只要可溶性AIM II蛋白能分泌出來，它也可含有部分跨膜區或部分胞質結構域或其它序列。可將一段異源信號肽融合於可溶性AIM II多肽的N-末端，以使該可溶性AIM II多肽在表達時能分泌出來。
本發明也提供了可用於治療淋巴結病、自身免疫疾病及移植物抗宿主疾病的AIM II多肽，特別是人AIM多肽，所述AIM II多肽可用於刺激周邊耐受性、破壞一些轉化細胞系、介導細胞活化和增殖，在功能上也可作為免疫調節和炎症反應的初級介導分子。
本發明還提供了含有AIM II多核苷酸或AIM II多肽的組合物，所述組合物可施用於體外細胞、離體(ex vivo)細胞和體內細胞，或可施用於多細胞生物體。在本發明此方面某些特別優選的實施方案中，該組合物中含有AIM II多核苷酸，以便在宿主生物中表達用於治療疾病的AIM II多肽。就此而言，特別優選在病人體內進行表達，以便治療與AIMII內源活性異常相關的疾病。
本發明也提供了鑑定可增強或抑制由AIM II所誘導的細胞反應的化合物的篩選方法，該篩選方法包括將表達AIM II的細胞與候選化合物接觸、測試細胞反應以及將該細胞反應與標準細胞反應相比較，所述標準是在無該候選化合物的接觸下測定的；由此，細胞反應比標準增強則表明該化合物是激動劑，細胞反應比標準降低則表明該化合物是拮抗劑。
另一方面，本發明提供了AIM II激動劑和拮抗劑的篩選試驗。拮抗劑可用於預防敗血症性休克、炎症、腦型瘧、HIV病毒的活化、移植物-宿主排斥反應、骨吸收、類風溼性關節炎及惡病質(消瘦或營養不良)。
本發明另一方面涉及需要更高水平的體內AIM II活性的個體的治療方法，所述方法包括對這類個體施用含有治療有效劑量的本發明的分離AIM II多肽或其激動劑的組合物。
本發明另一方面還涉及需要更低水平的體內AIM II活性的個體的治療方法，所述方法包括對這類個體施用含有治療有效劑量的AIM II拮抗劑的組合物。
附圖簡述圖1A-C示AIM II的核苷酸序列(SEQ ID NO1)及推斷的胺基酸序列(SEQ ID NO2)。該蛋白質推斷的分子量大約為26.4kDa。AIM II蛋白推測的跨膜結構域用下劃線表示。
圖2A-F示AIM II蛋白和人TNF-α(SEQ ID NO3)、人TNF-β(SEQ ID NO4)、人淋巴細胞毒素(SEQ ID NO5)及人Fas配基(SEQ ID NO6)的胺基酸序列之間的相似區。
圖3A-F示AIM II胺基酸序列分析。圖中示意了α、β、轉角和捲曲區；親水性和疏水性；兩親區、柔性區；抗原性指數和表面可能性。在「抗原性指數-Jameson-Wolf」圖表中，圖1A-C中大約第13-20、23-36、69-79、85-94、167-178、184-196、221-233位胺基酸對應於AIM II蛋白中顯示出高抗原性的區域。
發明詳述本發明提供了含有編碼AIM II多肽的多核苷酸的分離核酸分子，該核酸分子通過對克隆的cDNA進行測序而測定，所述AIM II多肽具有圖1A-C所示胺基酸序列(SEQ ID NO2)。本發明的AIM II蛋白與人TNF-α(SEQ ID NO3)、人TNF-β(SEQ ID NO4)、人淋巴細胞毒素(SEQ ID NO5)和人Fas配基(SEQ ID NO6)有序列同源性(圖2A-F)。圖1A-C中所示核苷酸序列得自於cDNA克隆的測序結果，所述cDNA克隆於1996年8月22日保藏於美國典型培養物保藏中心，12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852，保藏號為97689。該保藏克隆包含於pBluescript SK(-)質粒(Stratagene，La Jolla，CA)中。
除非特別指出，本文由DNA分子測序確定的所有核苷酸序列都是利用自動化DNA測序儀(如Applied Biosystems，Inc.的373型)測定的，由本文所測定的DNA分子所編碼的多肽的所有胺基酸序列都是對上述所測定的DNA序列進行翻譯而推測的。因此，如同本領域對由此自動化途徑測定的任何DNA序列所知的那樣，本文所測定的任何核苷酸序列都可能存在一些差錯。通過自動化所測定的核苷酸序列與測序DNA分子的真實核苷酸序列之間通常至少有約90％同一性、更通常是至少有約95％至至少約99.9％同一性。通過其它途徑可更準確地測定真實序列，這些途徑包括本領域所熟知的手工DNA測序。本領域亦知，與真實序列相比，在測定的核苷酸序列內單一插入或缺失可造成核苷酸序列翻譯時的移框，因此導致由測定的核苷酸序列所編碼的推測胺基酸序列與由測序DNA分子真實編碼的胺基酸序列從這類插入或缺失點處開始完全不同。
利用本文所提供的信息，如圖1A-C中的核苷酸序列，通過標準的克降和篩選方法，如使用mRNA作為起始材料克隆cDNA時所使用的方法，有可能獲得編碼AIM II多肽的本發明的核酸分子。如本發明所述，圖1A-C中所述核酸分子(SEQ ID NO1)發現於來自人巨噬細胞ox LDL(HMCCB64)的cDNA文庫中。在來自活化T細胞(HT4CC72)的cDNA文庫中也鑑定到此基因。圖1A-C中AIM II cDNA測出的核苷酸序列(SEQ ID NO1)含有編碼240個胺基酸殘基的蛋白質的開放閱讀框，其具有的起始密碼子位於圖1A-C(SEQ ID NO1)中核苷酸序列第49-51位，胞外結構域含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中約第60至約第240位的胺基酸殘基，跨膜結構域含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中約第37至約第59位的胺基酸殘基，胞內結構域含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中由約第1至約第36位的胺基酸殘基，推斷其分子量大約26.4kDa。圖1A-C(SEQ ID NO2)所示AIM II蛋白與人Fas配基(圖2A-F)的胺基酸序列具有大約27％同一性和大約51％相似性，與人TNF-α(圖2A-F)的胺基酸序列具有大約26％同一性和大約47％相似性。
作為一名普通技術人員，應能理解由於存在上面所討論的測序錯誤的可能性，由保藏的cDNA所編碼的推測AIM II多肽含有大約240個胺基酸，但胺基酸數可能是230-250個。進一步應理解，根據所使用的標準，AIM II多肽的胞外、胞內和跨膜結構域的確切位點可能有微小差異。比如，圖1A-C(SEQ ID NO2)中AIM II胞外結構域的確切位點可能會由於用來限定該區域的標準而會有微小不同(如具體位點可能在約第1至5位殘基間「漂移」)。
如上所述，本發明的核酸分子可以是RNA形式，如mRNA，或DNA形式，包括如通過克隆或合成產生的cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈(也稱被為有義鏈)，也可以是非編碼鏈(也被稱為反義鏈)。
「分離」的核酸分子意指從其天然環境中分離出的核酸分子-DNA或RNA。例如，為了本發明目的，將包含於載體中的重組DNA分子也看作是「分離的」。分離的DNA分子的其它例子包括存在於異源宿主細胞內的重組DNA分子或以溶液狀態存在的已純化(部分或基本上)DNA分子。分離的RNA分子包括本發明的DNA分子的體內或體外RNA轉錄本。根據本發明，分離的核酸分子還包括合成生產的此類分子。
本發明的分離核酸分子包括含有圖1A-C(SEQ ID NO1)所示開放閱讀框(ORF)的DNA分子；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)所示AIM II蛋白編碼序列的DNA分子；以及含有與上述序列基本上不同、但由於遺傳密碼簡併性而仍編碼AIM II蛋白的序列的DNA分子。當然，遺傳密碼在本領域是眾所周知的。因此，對本領域技術人員而言，產生這類簡併性變體的方法是很常規的。
另一方面，本發明提供了編碼AIM II多肽的分離核酸分子，所述AIM II多肽具有cNDA克隆所編碼的胺基酸序列，該cDNA克隆位於1996年8月22日以ATCC保藏號97689保藏的質粒中。優選地，該核酸分子編碼由上述保藏cDNA克隆所編碼的多肽。本發明還提供了具有圖1A-C(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列或具有上述保藏克隆所含AIM II CDNA的核苷酸序列的分離核酸分子，或具有與上述序列之一互補的序列的核酸分子。這類分離的分子，尤其是DNA分子，可有效用作探針，通過染色體原位雜交進行基因作圖，以及通過如Northern印跡分析檢測人組織中AIM II基因的表達。
本發明也涉及本文所述的分離核酸分子的片段。具有保藏cDNA的核苷酸序列或具有圖1A-C(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列的分離核酸的片段意指如本文所述可有效用作診斷探針和引物的長度至少大約15nt、更優選至少約20nt、更更優選至少約30nt、甚至更優選至少約40nt的片段。當然，按照本發明，50-1500nt長度的更大片段也是有用的，與保藏cDNA或圖1A-C(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列絕大部分(如果不是全部的話)一致的片段同樣是有用的。例如，長度至少約20nt的片段意指含有保藏cDNA的核苷酸序列或圖1A-C(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列來源的20或更多個連續鹼基的片段。
優選本發明的核酸片段包括編碼AIM II蛋白中含表位的區域的核酸分子。具體地說，本發明的這類核酸片段包括編碼下述多肽的核酸分子含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中約第13位至約第20位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中約第23位至約第36位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中約第69位至約第79位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中約第85位至約第94位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQID NO2)中約第167位至約第178位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中約第184位至約第196位胺基酸殘基的多肽；以及含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中的第221位至約第233位胺基酸殘基的多肽。本發明人已測出上述多肽片段都是AIM II蛋白的抗原性區域。下面詳述測定AIM II蛋白其它的含表位的區域的方法。
根據本發明，AIM II多核苷酸可用於多種應用中，尤其是利用了AIM II的化學和生物學特性的應用中。這些應用涉及自身免疫疾病和異常細胞增殖。其它一些應用涉及細胞、組織和生物體異常的診斷和治療。
本發明也涉及將AIM II多核苷酸用於檢測互補性多核苷酸鏈的用途，例如用作診斷試劑。對與機能障礙相關的AIM II突變形式的檢測將提供一種診斷工具，這種診斷工具可增強或限定起因於AIM II過低表達、過高表達或異常表達的疾病或疾病敏感性(如自身免疫疾病)的診斷中。由於AIM II基因存在於多種腫瘤細胞系中，包括胰腺腫瘤、睪丸腫瘤、子宮內膜腫瘤和T細胞淋巴結瘤，因此，編碼AIM II的多核苷酸也可用作診斷標記以檢測本發明多肽的表達。
另一方面，本發明提供了含有某種多核苷酸的分離核酸分子，該多核苷酸在嚴格雜交條件下與本發明的上述核酸分子(如ATCC保藏號97689所含cDNA克隆)中的多核苷酸區段能雜交。「嚴格雜交條件」意指在含有下述成分的溶液中於42℃保溫過夜50％甲醯胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖及20g/ml變性的經剪切的鮭精DNA，隨後在0.1×SSC中於大約65℃下洗滌濾膜。
能與一個多核苷酸的「區段」雜交的多核苷酸意指一個與標準多核苷酸中至少大約15個核苷酸(nt)、更優選至少約20nt、更更優選至少約30nt、甚至更優選大約30-70nt的區段能雜交的多核苷酸(DNA或RNA)。如上文和下文詳細論述，它們可有效用作診斷探針和引物。
例如，「長度至少為20nt」的多核苷酸的區段意指來源於標準多核苷酸(如保藏的cDNA或圖1A-C(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列)的核苷酸序列中20個或更多個連續核苷酸。
當然，僅與poly A序列〔如圖1A-C(SEQ ID NO1)所示AIM IIcDNA的3′末端poly(A)區〕或T(或U)殘基的互補延伸鏈能雜交的多核苷酸並不包括在用於與本發明核酸區段的雜交中的本發明多核苷酸內，這是由於這種多核苷酸分子與含有poly(A)延伸鏈或其互補區段的任何核酸分子(如實際中的任何雙鏈cDNA克隆)都能雜交上。
如本文所述，編碼AIM II多肽的本發明的核酸分子可包括但並不限於下述核酸分子編碼所述多肽的胺基酸序列的那些核酸分子；多肽編碼序列和其它序列，如編碼前導序列或分泌序列(如前蛋白或蛋白原或前蛋白原序列)的序列；含有或不含有前述的其它編碼序列的多肽編碼序列，所述多肽編碼序列還含有其它的非編碼序列，包括但不局限於如內含子、5′和3′非編碼序列(如在轉錄和mRNA剪切中具有如結合核糖體、穩定mRNA等功能的轉錄、但不翻譯的序列，包括剪切和聚腺苷酸化信號)；編碼其它胺基酸如提供其它功能的胺基酸的其它編碼序列。因此，編碼該多肽的序列可與標記序列融合，所述標記序列例如是編碼能簡化融合多肽的純化的多肽的序列。在本發明此方面的某些優選實施方案中，標記胺基酸序列是六-組氨酸肽，如pQE載體(Qiagen，Inc.)上提供的標記，這類肽中多數可商購。例如，如同Gentz等，美國國家科學院院報，86821-824(1989)所述，六-組氨酸的存在便於對融合蛋白進行純化。「HA」標記是另一個可有效用於純化的肽，此「HA」標記對應於流感血凝素蛋白來源的表位，該表位已被記載於Wilson等，細胞，37767(1984)。如下文所述，其它這類融合蛋白包括在N末端或C末端與Fc融合的AIM II。
本發明的核酸分子還包括編碼缺乏N-末端甲硫氨酸的全長AIM-II多肽的核酸分子。
本發明還涉及本發明的核酸分子的變體，這些變體編碼AIM II蛋白的區段、類似物或衍生物。變體可以是天然存在的，如天然的等位基因變體。一個「等位基因變體」意指位於某種生物體中某條染色體上特定位點的某基因的若干種變體形式之一(基因II，Lewin B.編，JohnWiley Sons，New York(1985))。非天然存在的變體可利用本領域已知的致突技術產生。
這類變體包括可涉及一個或多個核苷酸的核苷酸取代、缺失或添加而產生的核酸分子。這些變體可以在編碼區、非編碼區或兩種區域中都發生了改變。編碼區內的改變可產生保守的或非保守的胺基酸取代、缺失或添加。這些改變中特別優選沉默取代、添加和缺失，它們並不改變AIM II蛋白或其區段的性質和活性。就此而言，也特別優選保守取代。
本發明的另一實施方案中包括含有某種多核苷酸和分離核酸分子，該多核苷酸與下述核苷酸序列之一的同一性至少為90％、更優選至少為95％、96％、97％、98％或99％(a)編碼具有圖1A-C(SEQ IDNO2)中全部胺基酸序列的AIM II多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有cDNA克隆所編碼的全部胺基酸序列的AIM II多肽的核苷酸序列，該cDNA克隆包含於ATCC保藏號97689中；(c)編碼AIM II多肽胞外結構域的核苷酸序列；(d)編碼AIM II多肽跨膜結構域的核苷酸序列；(e)編碼AIM II多肽胞內結構域的核苷酸序列；(f)編碼可溶性AIM II多肽的核苷酸序列，該可溶性AIM II多肽具有胞外和胞內結構域，但缺乏跨膜結構域；以及(g)與上述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中任一種核苷酸序列互補的核苷酸序列。
例如，含有與編碼AIM II多肽的標準核苷酸序列具有至少95％「同一性」的核苷酸序列的多核苷酸意指所述多核苷酸的核苷酸序列與標準序列大致上是相同的，只是該多核苷酸序列在編碼AIM II多肽的標準核苷酸序列中每100個核苷酸內可含有不超過5個點突變。換句話說，為了獲得含有與標準核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，標準序列內不超過5％的核苷酸可缺失或由其它核苷酸所取代；或者是，在標準序列內可插入佔標準序列總核酸數不超過5％的數目的核苷酸。標準序列的這些突變可發生在標準核苷酸序列的5′或3′末端位置，也可發生在這些末端位置之間的任何地方，它們或者是在標準序列內核苷酸序列之間分散存在，或者是在標準序列內以一個或數個連續組的形式存在。
作為一項實際工作，任一特定核酸分子與如圖1A-C所示的核苷酸序列或保藏cDNA克隆的核苷酸序列是否具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性可常規地利用如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，575 Science Drive，Madison，WI 53711)等已知電腦程式進行測定。Bestfit程序使用了Smith和Waterman，應用數學進展，2482-489(1981)的局部同源性算法以尋找兩序列間具同源性的最佳區段。利用Bestfit或其它任何一種序列比較程序確定某一特定序列與本發明的標準序列是否具有至少如95％同一性時，參數的設置當然是為了確保同一性百分比是相對標準核苷酸序列的全長計算的，並且也允許存在佔標準序列的核苷酸總數不超過5％的同源性缺口。
本專利申請涉及與圖1A-C(SEQ ID NO1)所示核酸序列或與保藏cDNA的核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸分子，並且毋需要求這些核酸分子是否編碼具有AIM II活性的多肽。這是因為即使某一特定核酸分子不編碼具有AIM II活性的多肽，本領域技術人員也應知道如何利用這些核酸分子，如用作雜交探針或聚合酶鏈反應(PCR)引物。本發明中不編碼具有AIM II活性的多肽的核酸分子包括如下應用(1)從cDNA文庫中分離AIM II基因或其等位基因變體；(2)如Verma等，《人類染色體基礎技術手冊》，Pergamon出版社，紐約(1988)所述，與中期染色體進行原位雜交(如「FISH」)以進行AIM II基因的準確染色體定位；以及Northern印跡分析以檢測特異組織中AIM mRNA表達情況。
然而，優選的核酸分子是具有與圖1A-C(SEQ ID NO1)所示的核酸序列或保藏cDNA的核酸序列之間存在至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列並且確實編碼具有AIM II蛋白活性的多肽的核酸分子。「具有AIM II活性的多肽」意指通過特定生物學測試，具有與本發明AIM II蛋白活性相似的、但毋需完全相同的活性的多肽。例如，如同Zarres等，細胞，7031-46(1992)所述，AIM II蛋白細胞毒活性可通過propidium iodide染色分析編程性細胞死亡情況而進行測定。或者，也可通過Gavierli等，細胞生物學雜誌，119493-501(1992)所述的TUNEL染色測定AIM II誘導的編程性細胞死亡。
簡要地說，propidium iodide染色的操作如下將組織或培養物來源的細胞在甲醛中固定，製成冰凍切片，再用propidium iodide進行染色。利用共集點螢光顯微鏡通過propidium iodide可觀察到細胞核。通過固縮核(染色體凝集、皺縮和/或核的片段化)可示出細胞死亡情況。
當然，由於遺傳密碼的簡併性，本領域普通技術人員很快會明白，含有與保藏cDNA的核酸序列或圖1A-C(SEQ ID NO1)所示的核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的大量核酸分子也編碼「具有AIM II蛋白活性」的多肽。事實上，由於這些核苷酸序列的簡併性變體都編碼同樣的蛋白質，即使不進行上述對比測試，本領域技術人員也清楚這一點。本領域技術人員還明白，對於那些不是簡併性變體的核酸分子，相當一部分也能編碼具有AIM II蛋白活性的多肽。這是由於本領域技術人員完全了解那些極少可能或不大可能顯著影響蛋白質活性的胺基酸取代(例如，一種脂肪族胺基酸被另一種脂肪族胺基酸所取代)。
例如，Bowie J.U.等，「解譯蛋白質序列內的信息胺基酸取代的耐受性」，科學，2471306-1310(1990)中記載了有關如何進行無表型變化的胺基酸取代的規則，其中作者指出蛋白質出人意料地能耐受胺基酸取代。載體和宿主細胞本發明也涉及含有本發明的分離DNA分子的載體、利用該重組載體進行了遺傳學操作的宿主細胞，以及通過重組技術進行的AIM II多肽或其片段的生產。
該多核苷酸可與含有選擇性標記以在宿主中進行增殖的載體連接起來。通常質粒載體可通過沉澱物如磷酸鈣沉澱物或具有帶電脂類的複合物導入宿主。如果載體是一種病毒，利用適當的包裝細胞系可在體外將其包裝起來，再轉導至宿主細胞中。
DNA插入片段應與適當的啟動子有效連接，如噬菌體λPL啟動子、大腸桿菌lac、trp和tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子、逆轉錄病毒LTR啟動子等。本領域技術人員也熟知適當的其它啟動子。表達構建體還含有轉錄起始點、終止點，以及轉錄區內用於翻譯的核糖體結合位點。由此構建體表達的成熟轉錄本的編碼區段優選地在起始處含有翻譯起始序列，在待翻譯的多肽末端適當位置處含有終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
如上所述，表達載體優選地含有至少一個選擇性標記。這類標記包括用於真核細胞培養的新黴素抗性基因、二氫葉酸還原酶基因，用於大腸桿菌和其它細菌培養的四環素或氨苄青黴素抗性基因。適當宿主的代表性例子有細菌細胞如大腸桿菌、鏈黴菌和鼠傷寒沙門氏菌細胞；真菌細胞，如酵母細胞；昆蟲細胞，如果蠅S2和Spodoptera Sf9細胞；動物細胞，如CHO、COS和Bowes黑素瘤細胞；以及植物細胞，但並不局限於上述細胞。本領域熟知上述宿主細胞的適當培養介質和培養條件。
用於細菌的優選載體包括可以Qiagen獲得的pQE70、pQE60和pEQ-9；可從Stratagene獲得的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A和pNH46A；以及可從Pharmacia獲得的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5；等等。優選的真核生物載體有可從Stratagene獲得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可從Pharmacia獲得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；等。對本領域技術人員而言，適宜的其它載體也是顯而易見的。
可通過下列方法將構建體導入宿主細胞磷酸鈣沉澱轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子類脂介導的轉染、電擊法、轉導、感染或其它方法。這些方法已記載於多種標準實驗手冊中，如Davis等，《分子生物學基本方法》(1986)。
多肽可以修飾形式如融合蛋白形式表達，並且不僅可含有分泌信號，還可含有其它的異源性功能區。例如，可在多肽的N-末端添加含其它胺基酸特別是帶電胺基酸的區域，以便在宿主細胞內、在純化過程中或在隨後的使用和貯存過程中提供穩定性和持續性。另外，也可將小肽添加到多肽中以便於純化，並可在多肽的終製備前去除這類區域。將小肽添加到多肽中以分泌去除這類區域。將小肽添加到多肽中以分泌和排出多肽、提高多肽穩定性、方便純化多肽的技術是本領域的熟練和常規技術。優選的融合蛋白含有有助於蛋白質溶解的來源於免疫球蛋白的異源區域。例如，EP-A-O 464 533(加拿大對應號2045869)公開了含有免疫球蛋白分子恆定區的各種區段以及其它人類蛋白質或其部分的融合蛋白。在多種情形下，融合蛋白中的Fc部分在治療和診斷中是非常有應用價值的，並能提高如藥物動力學特性(EP-A 0 232 262)。另一方面，在有些應用中，最好是在通過已述的較好方法表達、檢測並純化該融合蛋白後去除其中的Fc部分。當Fc區段被證實對於融合蛋白在治療和診斷中的應用具有不良作用如融合蛋白用作免疫抗原時，就是如此。例如，在藥物的發掘中，人類蛋白質如hIL-5就與Fc區段融合以達到鑑定hIL-5拮抗物的篩選試驗的高容量目的。參見D.Bennett等，分子識別雜誌，第8卷52-58(1995)和K.Johanson等，生物化學雜誌，第270卷，16期9459-9471(1995)。
通過眾所周知的方法，包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析及外源凝集素層析等方法，可從重組細胞培養物中回收和純化AIM II多肽。在純化過程中，最優選使用高效液相層析方法(「HPLC」)。本發明的多肽包括天然純化產物、化學合成途徑產生的產物以及從原核生物或真核生物宿主包括如細菌、酵母、更高等的植物、昆蟲和哺乳動物細胞等通過重組技術產生的產物。根據在重組生產方法中應用的宿主類型，本發明的多肽可能被糖基化，也可能未被糖基化。另外，本發明的多肽也可能含有已修飾的起始甲硫氨酸殘基，在有些情形下這是由於宿主介導的過程產生的。AIM II多肽和片段本發明還提供了具有保藏cDNA所編碼的胺基酸序列或圖1A-C(SEQ ID NO2)中的胺基酸序列的分離AIM II多肽，或含有上述多肽的一個區段的肽或多肽。
本領域深知可改變AIM II多肽的一些胺基酸序列而不顯著影響此蛋白的結構或功能。如能仔細分析這類序列差異，應能清楚蛋白質中存在決定其活性的重要區域。
因此，本發明還包括具有顯著的AIM II多肽活性或含有AIM II蛋白區域(如下述的蛋白質區段)的AIM II多肽的變體。這類突變體包括缺失、插入、轉換、重複和類型取代。如上所述，有關何種胺基酸變化有可能無表型差異的規則可見於Bowie J.U.等，「解譯蛋白質序列中的信息對胺基酸替換的耐受性」，科學，2471306-1310(1990)。
因此，圖1A-C(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏cDNA所編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)其中一個或多個胺基酸殘基被保守的或非保守的胺基酸殘基(優選保守的胺基酸殘基)所取代，這種取代的胺基酸殘基可以是、也可以不是由該遺傳密碼所編碼的胺基酸；或(ii)其中一個或多個胺基酸殘基含有取代基；或(iii)其中成熟多肽與另一種化合物如能提高此多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)相融合；或(iv)其中成熟多肽中融合了其它的胺基酸，如IgG Fc融合區肽、前導序列、分泌性序列或可用於成熟多肽純化的序列，或蛋白原序列。這類片段、衍生物和類似物也在本文所教導的本領域技術人員的範圍之內。
尤其引人注目的是帶電胺基酸被另一種帶電胺基酸、中性或帶負電的胺基酸所取代，後者能產生帶更少正電荷的蛋白質，因而能改進AIM II蛋白的特性。極有必要能避免凝集現象。蛋白質的凝集不僅會破壞活性，而且在製備藥物製劑時也會由於具有免疫原性而帶來大問題(Pinckard等，臨床實驗免疫學，2331-340(1967)；Robbins等，糖尿病，36838-845(1987))；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic Drug CarrierSystems，10307-377(1993))。
胺基酸的置換也可改變多肽與細胞表面受體的選擇性結合。Ostade等，自然，361266-268(1993)中描述了某些突變能導致TNF-α僅與TNF受體的兩種已知類型中的一種選擇性結合。因此，本發明的AIM II受體可含有一個或多個胺基酸取代、缺失或添加，這類改變可以是天然突變或人工操作的結果。
如所述，優選影響較小的改變，如不顯著影響蛋白質摺疊或活性的保守胺基酸取代(見表1)。
表1保守胺基酸取代

通過本領域已知方法，如位點特異性誘變方法或丙氨酸掃描誘變方法(Cunningham和Wells，科學，2441081-1085(1989))，可鑑定出本發明的AIM II蛋白內對其功能是必不可少的胺基酸。後一方法是在分子內任何一個殘基處引入單一丙氨酸突變，然後測定由此獲得的突變體分子的生物學活性，如受體結合力，或體內或體外增殖活性。也可通過結構分析，如結晶過程、核磁共振或光親和標記(Smith等，分子生物學雜誌，224899-904(1992)和deVos等，科學，255306-312(1992))測定出對配基-受體的結合至關重要的位點。
優選以分離形式提供本發明的多肽。「分離的多肽」意指從其天然環境中提取的多肽。因此，為了本發明目的，重組宿主細胞內生產和包含的多肽也被認為是「分離的」。「分離的多肽」還指已從重組宿主內部分或基本上純化的多肽。例如，可通過Smith和Hohnson，基因，6731-40(1988)所述的一步法基本純化重組生產型AIM II多肽。
本發明的多肽包括由保藏cDNA編碼的多肽、圖1A-C(SEQ ID NO2)的多肽、缺乏N-末端甲硫氨酸的圖1A-C(SEQ ID NO2)的多肽、胞外結構域、跨膜結構域、胞內結構域、含有全部或部分胞外和胞內結構域但缺乏跨膜結構域的可溶性多肽，以及與保藏cDNA編碼的多肽或圖1A-C(SEQ IDNO2)的多肽間的同一性至少為80％、更優選至少為90％或95％、更更優選至少為96％、97％、98％或99％的多肽，還包括含有至少30個胺基酸、更優選至少50個胺基酸的此類多肽的區段。
含有與AIM II多肽的標準胺基酸序列具有至少如95％「同一性」的胺基酸序列的多肽意指此多肽的胺基酸序列與標準序列基本相同，只是此多肽序列在AIM II多肽的標準胺基酸中每100個胺基酸可含有不多於5個胺基酸的改變。換句話說，為了獲得含有與標準胺基酸序列具有至少95％同一性的胺基酸序列的多肽，可對標準序列中不超過5％的胺基酸殘基進行缺失或由其它的胺基酸所取代；或者是，可將佔標準序列內總胺基酸殘基不超過5％數量的胺基酸插入至標準序列中。標準序列的這些改變可位於標準胺基酸序列的氨基或羧基末端位置，可這些末端位置之間的任何部位，它們或者單獨分散於標準序列的殘基中，或以一個或多個連續群組的形式存在於標準序列內。
作為一項實際工作，可利用如Bestfit程度(WisconsinSequence analysis Package，575 Science Drive，Madison，WI53711)等已知電腦程式常規地測定任一特定多肽與如圖1A-C(SEQ ID NO2)所示的胺基酸序列或保藏cDNA克隆所編碼的胺基酸序列是否具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。利用Bestfit或其它任何一種序列比較程序分析某一特定序列與本發明的標準序列間是否具有至少如95％同一性時，參數的設置當然是為了確保同一性百分比是相對於標準胺基酸序列的全長計算的，並且也允許存在佔標準序列的胺基酸總數達5％的同源性缺口。
本文所用術語「AIM II」多肽包括膜結合性蛋白(含有胞質結構域、跨膜結構域及胞外結構域)，以及保留有AIM II多肽活性的截短蛋白質。在一個實施方案中，可溶性AIM II多肽含有AIMII蛋白胞外結構域的全部或部分，但缺乏能將多肽滯留於細胞膜上的跨膜區段。只要可溶性AIM II能被分泌出來，它也可含有部分跨膜結構域或部分細胞質結構域或其它序列。可在可溶性AIM II多肽的N-末端融合一段異源信號肽，以便在表達可溶性AIM II多肽後將其分泌出來。
利用本領域技術人員熟知的方法，可將本發明的多肽用作SDS-PAGE凝膠或分子篩凝膠過濾柱上的分子量標記。
另一方面，本發明提供了含有本發明多肽的含表位的區段的肽或多肽。此多肽區段的表位是本文所述多肽的免疫原性或抗原性表位。「免疫原性表位」是指整個蛋白質作為免疫時能引發抗體反應的蛋白質部分，而能與抗體結合的蛋白質分子中的區域則被稱為「抗原性表位」。蛋白質內免疫原性表位的數目一般比抗原性表位少。參見如Geysen等，美國國家科學院院報，813998-4002(1983)。
至於含有抗原性表位的肽或多肽(即含有蛋白質分子中能與抗體結合的區域的肽或多肽)的選擇，本領域熟知與部分蛋白南序列極為相似的相對較短的合成肽一般能刺激產生可與該部分相似的蛋白質發生反應的抗血清。參見如Sutcliffe H.G.，Shinnick T.M.，Green N.和Learner R.A.(1983)，「可與蛋白質中預定位點發生反應的抗體」，科學，219660-666。能引發產生蛋白質反應性血清的肽多以蛋白質的一級序列表示，它們可通過一套簡單的化學規則確定，並且不局限於完整蛋白質的免疫顯性區域(即免疫原性表位)或者其氨基或羧基末端。
因此，本發明中含有抗原性表位的肽和多肽可有效用於製備能與本發明多肽特異性結合的抗體，包括單克隆抗體。參見如Wilson等，細胞，37767-778(1984)，於777頁。
本發明攜有抗原性表位的肽和多肽所含的一段序列是本發明的多肽的胺基酸序列內所含的優選至少7個、更優選至少9個、最優選至少15個左右至30個左右的胺基酸。
能用於製備AIM II特異性抗體的抗原性多肽或肽的例子包括但並不局限於如下含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第13位至大約第20位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQID NO2)中大約第23位至大約第36位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第69位至大約第79位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第85位至大約第94位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ IDNO2)中大約第167位至大約第178位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SE Q ID NO2)中大約第184位至大約第196位胺基酸殘基的多肽；以及含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第221位至大約第233位胺基酸殘基的多肽。如上所述，本發明人已確定上述多肽片段是AIM II蛋白的抗原性區域。
可通過任何傳統途徑生產本發明攜有表位的肽和多肽。Houghten R.A.(1985)，「快速固相合成大量多肽的一般方法抗原-抗體反應在單個胺基酸水平上的特異性」，美國國家科學院院報，825131-5135。這種「多個多肽同時合成(SMPS)」途徑被進一步描述於Houghten等的美國專利號4,631,211中。
可將本發明的AIM II多肽用於治療誘發淋巴結病的淋巴組織增生性疾病。由於AIM II可通過刺激T-細胞的克隆缺失進而介導編程性細胞死亡，因而，可將AIM II應用於治療自身免疫疾病、刺激周邊耐受性和T-細胞介導的具細胞毒性的編程性細胞死亡過程。也可將AIM II用作研究工具，以闡明自身免疫紊亂和過敏反應的生物學機制，並治療移植物抗宿主疾病，所述自身免疫紊亂包括系統性紅斑狼瘡(SLE)、免疫增生性疾病、淋巴結病(IPL)、血管免疫增生性淋巴結病(AIL)、淋巴母細胞性淋巴結病(IBL)、類風溼性關節炎、糖尿病和多發性硬化症。
也可將本發明的AIM II多肽用來抑制腫瘤，如腫瘤細胞生長。AIM II多肽可能通過編程性細胞死亡和對某些細胞的細胞毒作用而對腫瘤的破壞起著一定的作用。由於AIM II能刺激內皮來源細胞的增殖，因而也可將AIM II用於治療一些需生長促進活性的疾病，如再狹窄性疾病。並且，AIM II也可用於調節內皮細胞發育過程中的造血功能。
本發明還提供了鑑定能與AIM II結合的分子如受體分子的方法。通過本領域技術人員已知的眾多方法，如配基選擇和FACS分類，可鑑定出編碼能與AIM II結合的蛋白質如受體蛋白的基因。在許多實驗室手冊如Coligan等，免疫學現代方法，1(2)第5章(1991)中，都記載有這類方法。
例如，為了此目的，可使用表達克隆法。為達此目的，首先從對AIM II具有反應的細胞中製備聚腺苷酸化的RNA，從此RNA構建cDNA文庫，將文庫分成幾組，再分別轉化對AIM II無反應的細胞。然後將轉化細胞與標記AIM II混合處理。(AIM II的標記可通過多種熟知技術，包括放射性碘處理或包含位點特異性蛋白激酶識別位點等標準方法。)處理後，固定細胞，並測定AIM II的結合率。此方法可在載玻片上簡便進行。
鑑定出含有能產生AIM II結合性細胞的cDNA的各組。將這些陽性組分成亞組，再按上述方法轉化宿主細胞並進行篩選。通過這種重複性亞分組-重新篩選(sub-pooling and re-screening)過程，可分離出編碼推定的結合分子如受體分子的一個或多個單克隆。
或者是將經標記的配基與細胞提取物如膜或膜提取物進行光親合性連接，這種細胞提取物是從能表達可與該配基結合的分子如受體分子的細胞中製備的。通過聚丙烯醯胺凝膠電泳(「PAGE」)分離交聯物質，再對X-光膠片進行曝光。切下含有配基-受體的標記複合物，將其裂解為肽片段，再進行蛋白質微量測序。利用從微量測序結果中獲得的胺基酸序列，可設計出特異性或簡併性寡核苷酸探針，以對cDNA文庫進行篩選，鑑定出編碼推定的受體分子的基因。
也可將本發明的受肽用於驗證細胞或無細胞製備物中的AIMII結合性分子如受體分子結合AIM II的能力。
本領域技術人員深知，可將本發明的AIM II多肽或上述的其含表位的片段與免疫球蛋白(IgG)恆定結構域的一部分相組合產生嵌合多肽。這類融合蛋白可便於純化，並在體內具有更長的半衰期。如含有人CD4多肽前兩個結構域和哺乳動物免疫球蛋白重鏈或輕鏈的恆定區內各個結構域的嵌合蛋白就體現了上述特點(EPA394,827；Traunecker等，自然，33184-86(1988))。由於IgG部分而具有二硫鍵連接的雙體結構的融合蛋白與單體AIMII蛋白或單獨的蛋白片段相比，前者也能更有效結合和中和其它分子(Fountoulakis等，生物化學雜誌，2703958-3964(1995))。
本發明人已經發現AIM II在脾臟、胸腺和骨髓組織中都有表達。對一系列紊亂如敗血症性休克、炎症、腦型瘧、HIV病毒的活化、移植物-宿主排斥性、骨吸收、類風溼性關節炎和惡病質而言，在具有這類紊亂的個體的某些組織(如脾臟、胸腺和骨髓組織)或體液(如血清、細胞液、尿液、滑液或脊柱液)中，能檢測到明顯高於或低於「標準」AIM II基因表達水平的AIM II基因的表達，其中「標準」AIM II基因表達水平即為不具有這類紊亂的個體的組織或體液中AIM II的表達水平。因此，本發明提供了一種在紊亂診斷過程中非常有用的診斷方法，這種方法包括(a)測定個體的細胞或體液中AIM II基因表達水平；(b)將測得的AIM II基因表達水平與標準AIM II基因表達水平進行比較，其中測得的AIM II基因表達水平高於或低於標準表達水平都表明存在某種紊亂。AIM II激動劑和拮抗劑本發明也提供了篩選化合物以鑑定出能增強或阻抑AIM II對細胞的作用如與AIM II結合性分子(如受體分子)的相互作用的化合物的方法。激動劑是能增強AIM II天然生物學功能或以類似於AIM II的方式發揮作用的化合物；而拮抗劑則能降低或消除這類功能。
例如，從表達可結合AIM II的分子如由AIM II通過信號或調節途徑調控的分子的細胞中可製備細胞組分，如膜製備物。在缺乏或存在待測分子(該待測分子可能是AIM II的激動劑或拮抗劑)的情況下將製備物與已標記的AIM II一起保溫。標記配基結合力的降低水平反映了待測分子與結合性分子或AIM II本身相結合的能力。能「無償」結合即與AIM II結合性分子結合時不會誘導AIM II反應的分子最有可能是好的拮抗劑。能很好結合併且作用效果與AIM II相同或密切相關的分子是好的激動劑。
例如，通過潛在激動劑或拮抗劑與細胞或適當的細胞製備物間的相互作用而測定第二信使系統的活性，並與AIM II或具有與AIM II相同功能的分子的活性相比較，可測出待測分子的AIM II相似性活性。在這方面，有效的第二信使系統包括但不限於AMP鳥苷酸環化酶、離子通道或磷酸肌醇水解第二信使系統。
AIM II拮抗劑測試法的另一個例子是競爭性測試法，這種測試方法是在適於競爭抑制測試的適當條件下，將AIM II和潛在拮抗劑與膜結合的AIM II受體分子或重組AIM II受體分子相組合。可通過如放射性活性等對AIM II進行標記，以便能準確測定與受體分子結合的AIM II分子的數量，從而估計該潛在拮抗劑的效果。
潛在的拮抗劑包括能與本發明的多肽結合從而能抑制或消除其活性的一些小的有機分子、肽、多肽和抗體。潛在的拮抗劑也可以是能與結合性分子如受體分子的相同位點結合而不誘導出AIMII誘導性活性、因而通過阻止AIM II的結合而抑制AIM II的作用的一些小的有機分子、肽或多肽，如密切相關的蛋白質或抗體。
其它潛在的拮抗劑包括反義分子。可通過反義DNA或反義RNA或通過三聯體螺旋形成而利用反義技術控制基因表達。反義技術已被記載於如Okano，神經化學雜誌，56560(1991)；《用作基因表達反義抑制劑的寡脫氧核苷酸》，CRC Press，BocaRaton，RL(1988)。三聯體螺旋形成記載於如Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學，241456(1988)；以及Dervan等，科學，2511360(1991)。這些方法都是基於多核苷酸與互補性DNA或RNA的結合。例如，可利用編碼本發明成熟多肽的多核苷酸的5′編碼區，設計長度約10～40個鹼基對的反義RN寡核苷酸。DNA寡核苷酸設計為與參與轉錄的基因區互補，因而可抑制AIM II的轉錄和生成。反義RNA寡核苷酸與體內mRNA雜交，從而阻斷mRNA分子翻譯為AIM II多肽的過程。也可將上述寡核苷酸導入至細胞內以便在體內表達該反義RNA或DNA，從而抑制AIM II的生成。
可將拮抗劑與藥用載體(如後述)一起製成組合物進行應用。
例如，可將拮抗劑用於治療惡病質，這種病是由於脂蛋白脂肪酶的系統性缺乏導致的類脂清除缺陷，據稱這種脂蛋白脂肪酶可被AIM II抑制。也可將AIM II拮抗劑用於治療腦型瘧，AIM II可能在此病中具有病理學作用。也可應用此拮抗劑治療是類風溼性關節炎，這是通過抑制AIM II誘導的炎症因子如滑膜細胞內的IL1的產生而進行的。在治療關節炎時，優選將AIM II拮抗劑注入關節內。
也可利用AIM II拮抗劑，通過阻止免疫系統的刺激而預防移植物存在時發生的移植物-宿主排斥反應。
也可利用AIM II拮抗劑抑制骨吸收，因而治療和/或預防骨質疏鬆症。
也可將拮抗劑用作抗炎症試劑，並治療內毒素性休克。這種危險狀態起因於對細菌或其它類型感染作出的超常反應。癌症預測與相應的「正常」哺乳動物相比，患有癌症的哺乳動物的某些組織表達AIM II蛋白和編碼AIM II蛋白的mRNA的水平顯著降低。正常哺乳動物即是指與患癌哺乳動物屬同一種類的不患癌症的個體。另外，與屬同一種類但不患癌症的哺乳動物的血清相比，在患有癌症的哺乳動物的某些體液(如血清、胞質、尿液和脊柱液)中測到的AIM II水平明顯降低。因此，本發明提供了可在腫瘤診斷中有效應用的診斷方法，這種方法包括測定哺乳動物細胞或體液中編碼AIM II蛋白的基因的表達水平，並將測得的基因表達水平與標準AIM II基因表達水平相比較，如果測得的基因表達水平低於標準即表明患有某種腫瘤。
按照常規方法已能進行腫瘤診斷時，本發明可有效用作預測指示劑，其中具有強化AIM II基因表達的病人比基因表達水平更低的病人的臨床效果可能要更好一些。
「測定編碼AIM II蛋白的基因的表達水平」意指直接地(如通過測定或估計蛋白質水平或mRNA水平的絕對量)或相對地(如通過與第二種生物樣品的AIM II蛋白水平或mRNA水平相比較)定性或定量地測定或估計第一種樣品中AIM II蛋白水平或編碼AIM II蛋白的mRNA的水平。
優選地，測定或估計第一種生物樣品內AIM II蛋白水平或mRNA水平並與標準AIM II蛋白水平或mRNA水平相比較，此標準值是從得自未長癌的個體的第二種生物樣品中測得的。本領域深知，一旦已測得標準AIM II蛋白水平或mRNA水平，即可將該值重複用作比較標準。
「生物樣品」意指得自含有AIM II蛋白或mRNA的個體、細胞系、組織培養物或其它來源的任何生物樣品。生物樣品包括含有分泌的成熟AIM II蛋白的哺乳動物體液(如血清、胞質、尿液、滑液和脊柱液)，以及卵巢、前列腺、心臟、胎盤、胰臟、肝、脾、肺、胸和臍組織。
本發明可有效用於哺乳動物的癌症診斷中。本發明尤其可有效用於哺乳動物內下列各類器官的癌症的診斷中胸、卵巢、前列腺、骨、肝、肺、胰和脾。優選的哺乳動物包括猴、猿、貓、狗、牛、豬、馬、兔和人類。尤其優選人類。
利用Chomczynski和Sacchi，生物化學年鑑(Anal.Biochem.)，162156-159(1987)記載的硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法可從生物樣品中分離總細胞RNA。然後利用適當的方法測定編碼AIM II蛋白的mRNA的水平。這些方法包括Northern印跡分析(Harada等，細胞，63303-312(1990))、S1核酸酶作圖(Fujita等，細胞，49357-367(1987))、聚合酶鏈反應(PCR)、逆轉錄與聚合酶鏈反應的組合(RT-PCR)(Makino等，技術，2295-301(1990))，以及逆轉錄與連接酶鏈反應的組合(RT-LCR)。
利用基於抗體的技術可測定生物樣品中AIM II蛋白的水平。例如，通過傳統的免疫組織學方法(Jalkanen M.等，細胞生物學雜誌，101976-985(1985)；Jalkanen M.等，細胞生物學雜誌，1053087-3096(1987))，可研究組織中AIM II蛋白的表達情況。
其它可有效用於AIM II蛋白基因表達測定的基於抗體的方法包括免疫測定，如酶連免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。
本領域熟知各種適用標記，它們包括酶標記如葡萄糖氧化酶，放射性同位素如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35C)、氚(3H)、銦(112In)和鎝(99mTc)，以及螢光標記如螢光素、若丹明和生物素。療法可將AIM II多肽尤其是人AIM II多肽用於治療瘤形成、淋巴結病、自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病。另外，本發明的AIMII多肽也可用於抑制瘤生成，如腫瘤細胞的生長。AIM II多肽可能通過編程性細胞死亡和對某些細胞的細胞毒作用而參與破壞腫瘤。由於AIM II對內皮來源的細胞具有增殖效果，故也可將AIMII用於需生長促進活性的疾病治療中，如再狹窄。因此，也可將AIM II用於調節內皮細胞發育過程中的造血功能。給藥方式應該明白，上述病症可通過服用AIM II蛋白而得到治療。因此，本發明還提供了治療需提高AIM II活性水平的個體的方法，這種方法包括給這類個體服用含有有效量的本發明的分離AIM II多肽、特別是AIM II的成熟形式的藥用組合物，以有效提高這種個體體內的AIM II活性水平。
儘管如上所述可根據治療需要靈活掌握用量，但作為一般建議，經胃腸外服用的AIM II多肽的總治療有效量每劑為大約1μg/kg病人體重/天～10mg/kg病人體重/天。此劑量更加優選為至少0.01mg/kg/天，對人類最優選此激素服用劑量為大約0.01～1mg/kg/天。如果持續給藥，通常可通過每天1～4次注射或連續性皮下輸液(如利用微型泵)完成，其中AIM II多肽服用的劑量速率為大約1μg/kg/hour～50μg/kg/hour。也可使用靜脈內包溶液。
含有本發明的AIM II的藥用組合物可通過口服給藥、直腸內給藥、胃腸外給藥、腦池內給藥、陰道內給藥、腹膜內給藥、局部給藥(通過粉末、軟膏、滴劑或表皮貼片)、頰部(bucally)給藥或通過口腔或鼻腔噴霧劑給藥。「藥用載體」意指無毒的固體、半固體或液體配方、稀釋劑、膠囊類物質或任何類型的製劑輔劑。本文所用術語「胃腸外的」意指包括靜脈內、肌肉內、腹膜內、胸骨內、皮下和關節內注射和輸液等的給藥方式。
除可使用可溶性AIM II多肽外，也可使用通過加入去汙劑如曲拉通X-100和緩衝液而適當溶解了的含有跨膜區的AIM II多肽。染色體檢測本發明的核酸分子在染色體鑑定工作中也是很有價值的。此序列可特異性導向至人個體染色體的特定位點並與其雜交。按照本發明，將DNA定位於染色體上是在聯繫序列與疾病相關基因時非常重要的首要步驟。
在這方面的某些優選實施方案中，可利用本文所公開的cDNA克隆AIM II蛋白的基因組DNA。利用本領域熟知的多種技術和文庫即可完成此項工作。這些文庫一般可商購。然後，通過本領域熟知的可進行原位染色體作圖的技術，利用此基因組DNA進行原位染色體作圖。
另外，在某些情況下，通過從cDNA製備PCR引物(優選15-25bp)可將序列定位在染色體上。通過計算機分析該基因的3′非翻譯區，可快速挑選出並不跨越基因組DNA中一個以上外顯子的引物，因而可使擴增過程複雜化。然後，利用這些引物，對含有人個體染色體的體細胞雜合體進行PCR篩選。
利用cDNA克隆對中期染色體進行螢光原位雜交(「FISH」)可一步提供精確的染色體定位。該項技術中可使用來自cDNA的短至50或60bp的探針。有關該技術的綜述參見Verma等，人類染色體基礎技術手冊，Pergamon Press，紐約(1988)。
一旦一個序列已定位於染色體上某一精確位點時，即可將此序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數據聯繫起來。這類數據可見於如V.McKusick，《人類孟德爾遺傳》，通過與Johns HopkinsUniversity，Welch Medical Library聯機獲得。再通過連鎖分析(物理上鄰接基因的共遺傳)對已定位於同一染色體區的基因和疾病之間的關係進行鑑定。
接著，有必要對感染個體與未感染個體的cDNA或基因組序列之間的差異進行分析測定。若在一些或全部感染個體內觀察到突變的存在，而在任何正常個體中均未發現突變，那麼，這種突變很可能是該病的病因。
上面已對本發明進行了一般性描述，下述實施例將有助於更好地理解本發明，這些實施例是以舉例方式提供的，但並不用來限制本發明。實施例實施例1在大腸桿菌內表達和純化AIM IIA.帶有N-末端HA標記的AIM II的表達利用特異於AIM II蛋白氨基末端序列及此基因的3′側的載體序列的PCR寡核苷酸引物，擴增出保藏cDNA克隆內編碼AIM II蛋白的DNA序列。分別在5′和3′序列中添加了含有便於克隆的限制性位點的額外的核苷酸。
利用下述引物可表達一個22kDa的AIM II蛋白片段(缺乏N-末端和跨膜區)5′寡核苷酸引物的序列為5′GCGGGATCCGGAGAGATGGTCACC3′(SEQ ID NO3)，它對應於圖1A-C(SEQ ID NO1)中AIM II蛋白編碼序列內第244-258位核苷酸，並在其中含有一個由下劃線標出的BamHI限制性位點；3′引物的序列為5′CGCAAGCTTCCTTCACACCATGAAAGC3′(SEQ ID NO8)，它含有一個由下劃線標出的Hind III限制性位點及緊隨其後的圖1A-C中所示第756-783位核苷酸。
通過下述引物可表達完整AIM II蛋白5′寡核苷酸引物的序列為5′GACCGGATCCATG GAG GAGAGT GTC GTA CGG C3′(SEQ ID NO9)，它對應於圖1A-C(SEQ ID NO1)中AIM II蛋白編碼序列內22個核苷酸，並在其中含有一個由下列劃線標出的BamHI限制性位點；3′引物的序列為5′CGCAAGCTTCCT TCA CAC CAT GAAAGC3′(SEQ ID NO10)，它含有一個由下劃線標出的Hind III限制性位點及緊隨其後的圖1A-C中所示第756-783位核苷酸。
這些限制性位點與細菌表達載體pQE9內的限制性酶切位點是相匹配的，可在這些實施例中用於細菌的表達。(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE9編碼氨苄青黴素抗生素抗性(「Ampr」)，並含有一個細菌複製起點(「ori」)，一個IPTG誘導型啟動子、一個核糖體結合位點(「RBS」)、一個6-His標記以及一些限制性酶切位點。
利用BamHI和Hind III消化經擴增的AIM II DNA和載體pQE9，然後將這些已消化的DNA連接在一起。在已經限制性切割的pQE9載體內插入AIM II蛋白DNA後，AIM II蛋白編碼區被置於載體內IPTG誘導型啟動子的下遊，並與其有效相連，而且，AIM II蛋白編碼區的插入位置使其與適當放置以便於AIM II蛋白翻譯的起始AUG密碼子讀框一致。B.具有C-末端HA標記的AIM II的表達本實施例中使用細菌表達載體pQE60進行細菌表達。(QIAGEN，Inc..9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE60編碼氨苄青黴素抗生素抗性(「Ampr」)，並含有一個細菌複製起點(「ori」)、一個IPTG誘導型啟動子、一個核糖體結合位點(「RBS」)、編碼組氨酸殘基的六個密碼子，以及適當的單一限制性酶切位點，其中所述的組氨酸殘基可允許通過利用QIAGEN公司(公司地址同前)所售鎳-次氮基三乙酸(「Ni-NTA」)親和樹脂進行親和純化。這些元件排列的方式能保證編碼多肽的DNA片段插入後所表達的多肽在其羧基末端可共價連接6個組氨酸殘基(即「6x His標記」)。
利用分別可與所需的AIM II蛋白區段的氨基末端序列及保藏構建體中cDNA編碼序列的3′側的序列可退火的PCR寡核苷酸引物，從保藏cDNA克隆中擴增編碼所需的AIM II蛋白區段的DNA序列。在5′和3′序列中分別添加了含有可便於克隆至pQE60載體的限制性位點的額外核苷酸。
為了克隆蛋白質，所用5′引物的序列為5′GACGCCCATGGAG GAG GAG AGT GTC GTA CGC C3′(SEQ ID NO17)，此序列中含有由下劃線標出的NcoI限制性位點，其後為可與圖1A-C中AIM II序列的氨基末端編碼序列互補的核苷酸。當然，本領域普通技術人員深知，可改變蛋白質編碼序列內5′引物起始位點，以擴增編碼完整蛋白質中任何所需區段的DNA片段(更短或更長)。3′引物的序列為5′GACCGGATCCCAC CAT GAA AGCCCC GAA GTA AG3′(SEQ ID NO18)，此序列中含有由下劃線標出的BamHI限制性位點，其後為可與圖1A-C中AIM IIDNA序列內終止密碼子前的編碼序列3′-末端互補的核苷酸，編碼序列與限制性位點排列的方式能確保其讀框與pQE60載體內6個His密碼子的讀框一致。
利用BamHI和NcoI消化擴增的AIM II DNA片段及載體pQE60，然後將已消化的DNA連接在一起。將AIM II DNA插入於已限制性消化的pQE60載體中使AIM II蛋白編碼區置於IPTG誘導型啟動子的下遊，並與起始密碼子AUG和其中的6個組氨酸密碼子讀框一致。
利用標準方法，將上述A或B中製成的含有HA標記的表達構建體的連接混合物轉化至感受態大腸桿菌細胞中。Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(1989)中記載了這類方法。將含有多拷貝質粒pREP4的大腸桿菌M15/rep4菌株用於進行本文所述的實施例，其中，所述質粒pREP4可表達lac阻遏子，並賦予卡那黴素抗性(「Kanr」)。該菌株僅是可適用於表達AIM II蛋白的多種菌株中的一種，它可購自Qiagen公司。
通過在含有氨苄青黴素和卡那黴素的LB平板上的生長能力鑑定出轉化體。從抗性菌落中提取質粒DNA，再通過限制性酶切分析確證克隆DNA的同一性。
在添加有氨苄青黴素(100μg/ml)和卡那黴素(25μg/ml)的液體LB培養基中過夜(「O/N」)培養含有所需構建體的克隆。
按約1∶100至1∶250的衡釋度，將O/N培養物接種至大量培養物中。培養細胞至600nm處的光密度值(「OD600」)為0.4～0.6，然後加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(「IPTG」)至終濃度為1mM，以通過滅活lacI阻遏子而誘導從lac阻遏子敏感性啟動子轉錄。隨後進一步培養細胞3至4小時。然後，通過離心收集細胞，並通過標準方法裂解細胞。利用常規收集技術從裂解細胞內純化包涵體，再將包涵體內的蛋白質溶解於8M尿素中。在2×磷酸緩衝鹽溶液(「PBS」)中將含有已溶解的蛋白質的8M尿素溶液過一個PD-10柱，由此去除尿素，更換緩衝液，並使蛋白質重新摺疊。再通過另一個步驟-層析，對蛋白質進一步純化以除去內毒素。然後，進行無菌過濾。將無菌過濾的蛋白質製備液以95μ/ml的濃度保存於2×PBS中。C.不含有HA標記的AIM II蛋白的表達和純化本實施例中使用細菌表達載體pQE60進行細菌表達。(QIAGEN，Inc..9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE60編碼氨苄青黴素抗生素抗性(「Ampr」)，並含有一個細菌複製起點(「ori」)、一個IPTG誘導型啟動子、一個核糖體結合位點(「RBS」)、編碼組氨酸殘基的六個密碼子，以及適當的單一限制性酶切位點，其中所述的組氨酸殘基可允許通過利用QIAGEN公司(公司地址同前)所售鎳-次氮基三乙酸(「Ni-NTA」)親和樹脂進行親和純化。這些元件排列的方式能保證編碼多肽的DNA片段插入後所表達的多肽在其羧基末端可共價連接6個組氨酸殘基(即「6x His標記」)。然而，此實施例中，該多肽編碼序列的插入方式使這六個組氨酸密碼子不能被翻譯，因而產生的多肽並不含有6×His標記。
利用分別可與所需的AIM II蛋白區段的氨基末端序列及保藏構建體中cDNA編碼序列的3′側的序列退火的PCR寡核苷酸引物，從保藏cDNA克隆中擴增編碼所需的缺乏疏水性前導序列的AIM II蛋白區段的DNA序列。在5′和3′序列中分別添加了含有可便於克隆至pQE60載體的限制性位點的額外核苷酸。
為了克隆蛋白質，所用5′引物的序列為5′GACGCCCATGGAG GAG GAG AGT GTC GTA CGC C3′(SEQ ID NO17)，此序列中含有由下劃線標出的NcoI限制性位點，其後為可與圖1A-C中AIM II序列的氨基末端編碼序列互補的核苷酸。當然，本領域普通技術人員深知，可改變蛋白質編碼序列內5′引物起始位點，以擴增編碼完整蛋白質中任何所需區段的DNA片段(更短或更長)。3′引物的序列為5′CGCAAGCTTCCTT CAC ACC ATGAAA GC3′(SEQ ID NO19)，此序列中含有由下劃線標出的Hind III限制性位點，其後為可與圖1A-C中AIM II DNA序列內3′末端非編碼序列互補的核苷酸。
利用Hind III和NcoI消化擴增獲得的AIM II DNA片段及載體pQE60，然後將已消化的DNA連接在一起。將AIM II DNA插入於已限制性消化的pQE60載體中使AIM II蛋白編碼區及其終止密碼子一起置於IPTG誘導型啟動子的下遊並與起始密碼子AUG讀框一致。該終止密碼子能阻止插入位點下遊的6個組氨酸密碼子的翻譯。
利用標準方法，如Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(1989)中所記載的那些方法，將連接混合物轉化至感受態大腸桿菌細胞中。將含有多拷貝質粒pREP4的大腸桿菌M15/rep4菌株用於進行本文所述的實施例，其中，所述質粒pREP4可表達lac阻遏子，並賦予卡那黴素抗性(「Kanr」)。此菌株僅是可適用於表達AIM II蛋白的多種菌株中的一種，它可購自Qiagen公司(地址同前)。通過在含有氨苄青黴素和卡那黴素的LB平板上的生長能力鑑定出轉化體。從抗性菌落中提取質粒DNA，再通過限制性酶切分析、PCR和DNA測序確證克隆DNA的同一性。
在補加有氨苄青黴素(100μg/ml)和卡那黴素(25μg/ml)的液體LB培養基中過夜(「O/N」)培養含有所需構建體的克隆。再按大約1∶25至1∶250的稀釋度，將O/N培養物接種至大量培養物中。培養細胞至600nm處的光密度值(「OD600」)為0.4～0.6，然後加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(「IPTG」)至終濃度為1mM，以通過滅活lacI阻遏子而誘導從lac阻遏子敏感性啟動子轉錄。隨後進一步培養細胞3至4小時，再通過離心收集細胞。
然後，在6M鹽酸胍、pH8中，於4℃將細胞勻漿3-4小時。通過離心去除細胞碎片，在添加有200mM NaCl的50mM乙酸鈉緩衝液pH6中透析含有AIM II的上清液。或者，通過在含有蛋白酶抑制劑的500mM NaCl、20％甘油、25mM Tris·HCl pH7.4中透析上清液，可成功地對蛋白質進行重新摺疊。復性後，蛋白質可通過離子交換、疏水性相互作用和尺寸排阻層析進行純化。或者，可通過親和層析步驟，如利用抗體柱以獲得純的AIM II蛋白。將已純化的蛋白質貯於4℃，或凍於-80℃。實施例2在杆狀病毒表達系統內克隆和表達AIM II蛋白利用對應於AIM II基因5′和3′序列的PCR寡核苷酸引物擴增保藏克隆中編碼全長AIM II蛋白的cDNA序列5′引物的序列為5′GCT CCAGGA TCCGCC ATC ATG GAGGAG AGT GTC GTA CGG C3′(SEQ ID NO1)，它含有由下劃線標出的BamHI限制性酶切位點及隨後的圖1A-C中AIMII蛋白序列內的22個鹼基。如下所述，插入至表達載體後，編碼AIM II的擴增片段的5′末端提供了一種有效的信號肽。如KozakM.，分子生物學雜誌，196947-950(1987)所記載的在真核細胞內用於翻譯起始的有效信號被置於構建體中載體區段內的適當位置；3′引物的序列為5′GA CGCGGT ACCGTC CAA TGC ACCACG CTC CTT CCT TC3′(SEQ ID NO12)，它含有由下劃線標出的Asp 718限制性位點及隨後的與圖1A-C中AIM II內769-795位核苷酸互補的核苷酸。
利用可商購的試劑盒(「Geneclean」，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)，從1％瓊脂糖凝膠中分離擴增片段。然後利用BamHI和Asp 718消化該片段，再在1％瓊脂糖凝膠上對它進行純化。此處將該片段命名為F2。
如Summers等，杆狀病毒載體方法和昆蟲細胞培養技術手冊，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555(1987)所述，通過標準方法，利用載體pA2-GP在杆狀病毒表達載體中表達AIM II蛋白。此表達載體中含有苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcMNPV)的強多角體蛋白基因啟動子，其後還含有便利的限制性位點。包括N-末端甲硫氨酸在內的AcMNPVgp67的信號肽恰好位於BamHI位點上遊。此載體中還使用了猴病毒40(「SV40」)的聚腺苷酸化位點以有效完成聚腺苷酸化。為能簡單進行重組病毒的篩選，此載體中還與多角體蛋白基因啟動子方向一致地插入了大腸桿菌來源的β-半乳糖苷酶基因，隨後是多角體蛋白基因的多聚腺苷酸化信號。多角體蛋白基因序列的兩側都含有病毒序列，以便與野生型病毒DNA進行細胞介導的同源重組，從而產生能表達此克隆多核苷酸的活性病毒。
如本領域技術人員所知，只要構建過程能提供所需的恰當排列的用於轉錄翻譯、運輸等的信號，如讀框一致的AUG和信號肽，則可利用其它多種杆狀病毒載體代替pA2-GP。這類載體與其它載體一起記載於Luckow等，病毒學，17031-39。
通過本領域常規技術，利用限制性酶BamHI和Asp 718消化該質粒，再利用小牛腸道磷酸酯酶對其進行去磷酸化。接著利用可商購的試劑盒(「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca)，從1％瓊脂糖凝膠分離此DNA。此處將該載體DNA命名為「V」。
通過T4 DNA連接酶將片段F2和已去磷酸化的質粒V2連接在一起。利用連接混合物轉化大腸桿菌HB 101細胞，再平鋪於培養平板上。經XbaI消化各個菌落來源的DNA，再經凝膠電泳分析消化產物，鑑定出含有攜帶人AIM II基因的質粒的細菌。通過DNA測序確證克隆片段的序列。此處將該質粒命名為pBac AIM II。
利用Felgner等，美國國家科學院院報，847413-7417(1987)所述的脂質轉染法，將5μg質粒pBac AIM II與1.0μg可商購的線性化杆狀病毒DNA(「Baculo GoldTMbaculovirusDNA」，Pharmingen，San Diego，CA.)一起進行共轉染。在微滴定板上含有50μl無血清的Grace’s培養基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的無菌孔中，混合1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg質粒pBac AIM II，然後加入10μl Lipofectin和90μlGrace’s培養基，混合後於室溫放置15分鐘。然後將轉染混合物逐滴加入至接種於含有1ml不含血清的Grace’s培養基的35mm組織培養板上的Sf9昆蟲細胞(ATCC CRL 1711)。前後搖動此板以混合新加入的溶液，然後將板在27℃培養5小時。5小時後，從板中除去轉染溶液，再加入1ml補充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養基。將板放回至培養箱中，於27℃繼續培養4天。
4天後，收集上清，並按照上文列舉的Summers和Smith所述的方法進行噬斑測定。利用含有「Blue Gal」(Life technologiesInc.，Gaithersburg)的瓊脂糖凝膠以便對表達半乳糖苷酶的克隆進行簡便的鑑定和分離，其中該表達半乳糖苷酶的克隆能產生染成藍色的噬斑(在Life Technologies Inc.，Gaithersburg所提供的昆蟲細胞培養和杆狀病毒學使用說明第9-10頁中也可見到此類「噬斑測定」的詳細說明)。
連續稀釋4天後，將病毒加入至細胞中。進行適當培養後，利用Eppendorf取液器的吸頭挑出染成藍色的噬斑，然後將含有重組病毒的瓊脂重新懸浮於含有200μl Grace’s培養基的Eppendorf管中。通過輕微離心去除其中的瓊脂，再利用含有重組杆狀病毒的上清液感染接種於35mm板的Sf9細胞。4天後，收集這些培養板的上清液，將它們貯於4℃。通過限制性酶譜測定和測序等DNA分析方法鑑定出含有正確插入的hESSBI、II和III的克隆。本文中將此克隆命名為V-AIM II。
在補充有10％加熱滅活FBS的Grace’s培養基中培養Sf9細胞。利用重組杆狀病毒V-AIM II，以2左右(1左右～3左右)的感染複數(「MOI」)感染該細胞。6小時後，除去培養基，再換入無甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900 II培養基(可從LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg獲得)。42小時後，加入5μCi35S-甲硫氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(可從Amersham獲得)。繼續培養細胞16小時，然後經離心收集細胞，進行細胞裂解，並通過SDS-PAGE和放射自顯影觀察已被標記的蛋白質。實施例3哺乳動物細胞中的克隆和表達用於在哺乳動物細胞內瞬時表達AIM II蛋白的絕大部分載體都應攜有SV40複製起始點。這有助於在能表達病毒DNA合成起始所需的T抗原的細胞(如COS細胞)內確保載體複製至高拷貝數。為達此目的，也可使用其它任何的哺乳動物細胞系。
一個典型的哺乳動物表達載體含有可介導mRNA轉錄起始的啟動子元件、蛋白質編碼序列，以及轉錄終止、轉錄本聚腺苷酸化所需的信號。其它的元件包括增強子、Kozak序列及側翼含有RNA剪接所需的供體和受體位點的間插序列。利用SV40的早期、晚期啟動子、逆轉錄病毒如RSV、HTLVI、HIVI的長末端重複區(LTRs)及巨細胞病毒(CMV)的早期啟動子，可獲得高效轉錄。然而，也可使用細胞信號(如人肌動蛋白啟動子)。可用於完成本發明的適當表達載體包括pSVL、pMSG (Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC 67109)等載體。可用的哺乳動物細胞包括人Hela細胞、283細胞、H9細胞和Jurkart細胞、小鼠NIH3T3細胞和C127細胞，Cosl細胞，Cos7細胞和CV1細胞，非洲綠猴細胞、鵪鶉QC1-3細胞，小鼠L細胞和中國倉鼠卵巢細胞。
或者，也可在染色體內整合了該基因的穩定細胞系中表達該基因。通過與選擇性標記如dhfr、gpt、新黴素、潮黴素基因一起共轉染可鑑定和分離出已轉染的細胞。
也可通過擴增轉染基因以大量表達它所編碼的蛋白質。在開發攜有數百或甚至數千拷貝的感興趣基因的細胞系時，DHFR(二氫葉酸還原酶)是一個很有用的標記。另一種有效的選擇性標記是穀氨醯胺合成酶(GS)(Murphy等，生物化學雜誌，227277-279(1991)；Bebbington等，Bio/Technology 10169-175(1992))。利用這些標記，在選擇性培養基中培養這些哺乳動物細胞，篩選出具有最高抗性的細胞。這些細胞系中含有已整合至染色體內的擴增基因。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞常被用來生產蛋白質。
表達載體pC1和pC4含有添加了CMV增強子片段(Boshart等，細胞，41521-530(1985))的勞氏肉瘤病毒強啟動子(LTR)(Cullen等，分子和細胞生物學，438-447(1985年3月))。多克隆位點，如含有BamHI、XbaI和Asp 718限制性酶切位點等，可便於克隆感興趣基因。載體中還含有3′內含子，大鼠前胰島素原基因的多聚腺苷酸化和終止信號。實施例3(a)COS細胞內的克隆和表達通過將編碼AIM II的cNDA克隆至表達載體pcDNA I/Amp(可從Invitrogen Inc.獲得)中可製成表達質粒pAIM II HA。
此表達載體pcDNA I/amp含有(1)可有效用於大腸桿菌和其它原核細胞內擴增的大腸桿菌複製起點；(2)可用於含有質粒的原核細胞篩選的氨苄青黴素抗性基因；(3)可用於真核細胞內擴增的SV40複製起點；(4)CMV啟動子、多位點接頭、SV40內含子和聚腺苷酸化信號，這些序列的排列方式可保證通過多位點接頭內的限制性位點便利地將cDNA置於CMV啟動子的表達調控下，並與SV40內含子和聚腺苷酸化信號有效相連。
將編碼AIM II蛋白及在其3′末端讀框一致地融合了HA標記的DNA片段克隆於載體的多位點接頭區，以便在CMV啟動子的指導下進行重組蛋白質表達。此HA標記對應於Wilson等，細胞，37767(1984)所述的來源於流感血凝素蛋白的一個表位。靶蛋白內HA標記的融合可便於通過識別HA表位的抗體簡便地檢測重組蛋白質。
質粒構建的策略如下。與上述構建在大腸桿菌內表達AIM II的表達載體的過程相似，利用含有便利的限制性位點的引物，擴增出保藏克隆內的AIM II cDNA。為便於對表達的AIM II進行檢測、純化和鑑定，引物之一含有上述的血凝素標記(「HA標記」)。
適當的引物有此實施例中所使用的下述引物含有下劃線標出的BamHI位點和AUG起始密碼子的5′引物，其序列如下5′G CTCGGA TCCGCC ATC ATG 3′(SE Q ID NO13)；含有下劃線標出的XbaI位點、終止密碼子、可形成血凝素HA標記的9個密碼子以及31bp的3′編碼序列(在其3′末端)的3′引物，其序列如下5′GAT GTT CTA GAA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTATGG GTA CAC CAT GAA AGC CCC GAA GTA AGA CCG GGTAC3′(SEQ ID NO14)。
通過HindIII和XhoI消化PCR擴增DNA片段和載體pcDNAI/Amp，再將它們連接起來。將連接混合物轉化至大腸桿菌SURE菌株(可從Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey PinesRoad，La Jolla，CA92037獲得)中，將已轉化的培養物鋪板於含氨苄青黴素培養基的平板上，再培養這些板以確保氨苄青黴素抗性菌落的生長。從抗性菌落中分離質粒DNA，並通過限制性分析和凝膠電泳檢測質粒DNA中AIM II編碼片段的存在。
為了表達重組AIM II，可利用如Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(1989)所述的DEAE-DEXTRAN，通過上述的表達載體轉染COS細胞。在適於載體表達AIM II的條件下培養細胞。
利用如Harlow等，《抗體實驗室手冊》，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(1988)中所記載的方法，通過放射性標記和免疫沉澱測定AIM II HA融合蛋白的表達。為達此目的，轉染2天後，通過在含有35S-半胱氨酸的培養基中培養細胞而對其進行標記。收集細胞和培養基，洗滌細胞，再按照Wilson等(出處同前)所述的方法，利用含有去汙劑的RIPA緩衝液150mM NaCl，1％ NP-40，0.1％ SDS，1％ NP-40，0.5％ DOC，50mM Tris，pH7.5裂解細胞。利用HA特異性單克隆抗體，從細胞裂解物和組織培養基中沉澱蛋白質。再通過SDS-PAGE凝膠和放射顯影分析已沉澱的蛋白質。在細胞裂解物中可觀察到預期大小的表達產物，這在負對照中是不存在的。實施例3(b)CHO細胞內的克隆和表達利用載體pC4表達AIM II蛋白。質粒pC1是質粒pSV2-dhfr[ATCC保藏號37146]的衍生物。兩種質粒都含有在SV40早期啟動子控制下的小鼠DHFR基因。通過在補充有化療劑氨甲喋呤的選擇性培養基(alpyha minus MEM，Life Technologies)中培養細胞可篩選出轉染有這些質粒的無二氫葉酸活性的中國倉鼠卵巢細胞或其它細胞。抗氨甲喋呤(MTX)呤的細胞內DHFR基因的擴增已有很好的記載(參見如Alt F.W.，Kellems R.M.，Bertino J.R.和Schimke R.T.，1978，生物化學雜誌，2531357-1370；Hamlin J.L.和Ma C.，1990，Biochem et Biophys.Acta，1097107-143；Page M.J.和Sydenham M.A.，1991，生物技術，第9卷64-68)。生長於更高濃度的MTX的細胞能通過DHFR基因的擴增、過量表達靶酶DHFR而增強其對此藥物的抗性。如果DHFR基因連接了另一個基因，通常它也被共擴增和過量表達。培育出含有1000多個拷貝的基因的細胞系是本領域的重要工作。因此，撤去氨甲喋呤後，細胞系中仍含有已整合至染色體中的擴增基因。
質粒pC4中含有用於表達目的基因的勞氏肉瘤病毒長末端重複區(LTR)的強啟動子(Cullen等，分子和細胞生物學，1985年3月438-447)以及從人巨細胞病毒(CMV)立即早期基因的增強子中分離出的一個片段(Boshart等，細胞，41521-530(1985))。該啟動子下遊含有可允許基因插入的BamHI、XbaI和Asp 718限制性酶切位點。此質粒在這些克隆位點後還含有大鼠前胰島素原基因的3′內含子和聚腺苷酸化位點。也可使用其它高效啟動子進行表達，如人β-肌動蛋白基因啟動子、SV40的早期或晚期啟動子，或其它逆轉錄病毒如HIV和HTLVI的長末端重複區。可利用Clontech公司的Tet-Off和Tet-On基因表達系統在哺乳動物細胞內以調控方式表達AIM II(Gossen M.和BujardH.，1992，美國國家科學院院報，895547-5551)。至於該mRNA的聚腺苷酸化，也可使用其它的信號，如來源於人生長激素或珠蛋白基因的信號。通過與選擇性標記如gpt、G418或潮黴素共轉化，也可篩選出攜有已整合至染色體內的目的基因的穩定細胞系。最好是開始時使用多個選擇性標記，如同時使用G418和氨甲喋呤。
利用限制性酶BamHI和Asp718消化質粒pC4，然後通過本領域已知方法，利用小牛腸道磷酸酶對其進行去磷酸化處理。再通過1％瓊脂糖凝膠分離該載體。
利用分別對應於該基因的5′和3′序列的PCR寡核苷酸引物擴增編碼完整AIM II蛋白及其前導序列的DNA序列。該5′引物的序列為5′GCT CCAGGA TCCGCC ATC ATG GAG GAG AGTGTC GTA CGG C3′(SEQ ID NO15)，其中含有下劃線表示的BamHI限制性酶切位點和其後的如Kozak M.，分子生物學雜誌，196947-950(1987)所述的真核生物內用於翻譯起始的有效信號，以及圖1A-C(SEQ ID NO1)所示的AIM II編碼序列內的22個鹼基。3′引物的序列為5′GA CGCGGTACCGTC CAA TGC ACC ACG CTC CTT CCT TC3′(SEQ IDNO16)，其中含有下劃線表示的Asp718限制性位點及其後的與圖1A-C(SEQ ID NO1)所示AIM II基因第769-795位核苷酸互補的核苷酸。
該擴增片段經內切核酸酶BamHI和Asp718消化後，再在1％瓊脂糖凝膠上重新純化。然後通過T4 DNA連接酶將該分離片段和去磷酸化載體連接起來，再轉化大腸桿菌HB101或XL1-Blue細胞，並通過如限制性酶切分析鑑定出含有已插入至質粒pC4的該片段的細菌。
使用缺乏活性DHFR基因的中國倉鼠卵巢細胞進行轉化。利用Lipofectin(Felgner等，出處同前)，將5μg表達質粒pC4與0.5μg質粒pSV2-neo一起進行共轉化。質粒pSV2 neo含有一個顯性選擇性標記，即Tn5來源的neo基因，該neo基因編碼可賦予對包括G418在內的一組抗生素的抗性的酶類。將該細胞接種於補加了1mg/ml G418的alpha minus MEM培養基中。2天後，通過胰蛋白酶消化該細胞，並將其接種於含有同時補加了10.25或50ng/ml氨甲喋呤和1mg/ml G418的alpha minus MEM培養基的雜交瘤克隆板(Greiner，Germany)中。大約10-14天後，經胰蛋白酶消化單個克隆，然後將它們接種於6-孔培養皿或10ml錐形瓶中，並使用不同濃度的氨甲喋呤(50nM、100nM、200nm、400nM、800nM)。將在最高濃度氨甲喋呤中生長的克隆轉移至含有更高濃度氨甲喋呤(1μM、2μM、5μM、10mM、20mM)的新6-孔板上。重複此步驟直至獲得能在100～200μM濃度下生長的克隆。通過如SDS-PAGE、Western雜交或反相HPLC分析等方法，對目的基因產物的表達進行分析。實施例4AIM II蛋白表達的組織分布利用Sambrook等人(出處同前)及其它文獻所記載的方法進行Northern印跡分析，以研究人組織中AIM II基因的表達。按照生產商說明，利用rediprimeTMDNA標記系統(Amersham LifeScience)對含有AIM II蛋白全部核苷酸序列(SEQ ID NO1)的cDNA探針進行32P標記。標記後，按照生產商PT1200-1號技術，利用CHROMA SPIN-100TM柱(Clontech Laboratories公司)對該探針進行純化。然後利用該經純化的標記探針分析各種人組織中AIM II mRNA的水平。
從Clontech獲得含有多種人組織(H)或人免疫系統組織(IM)的多組織Northern(Multiple Tissue Northern，MTN)印跡，並按照生產商的PT1190-1號技術方案，利用ExpressHybTM雜交溶液(Clontech)，通過標記探針對這些印跡進行分析。雜交和洗滌後，固定印跡並在-70℃對膠片曝光過夜，再按照標準方法對膠片進行顯影。
顯然，可通過除本文詳細敘述的說明書和實施例外的其它方式操作本發明。
在上文的指導下，可對本發明進行多種改進和改變，因此，它們也在本文附加權利要求的範圍內。
本文所列舉的所有出版物(包括專利、專利申請、雜誌文章、實驗室手冊、書籍或其它文件)的全部公開內容均引入本文作為參考。
序列表(1)一般信息(i)申請人 人類基因組科學公司9410Key West AvenueRockville，MD 20850美國申請人/發明Ebner，Reinhard人 Yu，Guo-LiangRuben，Steven M.(ii)發明名稱編程性細胞死亡誘導分子II(iii)序列數 19(iv)通訊地址(A)收件人Sterne，Kessler，Goldstein Fox，P.L.L.C(B)街道1100 New York Ave.，Suite 600(C)城市Washington(D)州DC(E)國家美國(F)郵編20005-3934(v)計算機可讀形式(A)介質類型Floppy disk(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Patent In Release # 1.0，Version# 1.30(vi)目前的申請信息(A)申請號TBA(B)申請日本文所附(C)分類(vii)在先申請信息(A)申請號60/013,923(B)申請日1996年3月22日(C)分類(viii)代理人/代理機構信息
(A)姓名Goldstein，Jorge A.
(B)登記號29,021(C)資料/文檔號1488.065 PC 01/JAG/EKS/KMT(ix)通訊信息(A)電話202-371-2600(B)電傳202-371-2540(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特徵(A)長度1169個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特性(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置49..768(xi)序列描述SEQ ID NO1GAGGTTGAAG GACCCAGGCG TGTCAGCCCT GCTCCAGAGA CCTTGGGC ATG GAG GAG 57Met Glu Glu1AGT GTC GTA CGG CCC TCA GTG TTT GTG GTG GAT GGA CAG ACC GAC ATC 105Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln Thr Asp Ile5 10 15CCA TTC ACG AGG CTG GGA CGA AGC CAC CGG AGA CAG TCG TGC AGT GTG 153Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser Cys Ser Val20 25 30 35GCC CGG GTG GGT CTG GGT CTC TTG CTG TTG CTG ATG GGG GCT GGG CTG 201Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly Ala Gly Leu40 45 50GCC GTC CAA GGC TGG TTC CTC CTG CAG CTG CAC TGG CGT CTA GGA GAG 249Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu55 60 65ATG GTC ACC CGC CTG CCT GAC GGA CCT GCA GGC TCC TGG GAG CAG CTG 297Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu70 75 80ATA CAA GAG CGA AGG TCT CAC GAG GTC AAC CCA GCA GCG CAT CTC ACA 345Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr85 90 95GGG GCC AAC TCC AGC TTG ACC GGC AGC GGG GGG CCG CTG TTA TGG GAG 393Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu100 105 110 115ACT CAG CTG GGC CTG GCC TTC CTG AGG GGC CTC AGC TAC CAC GAT GGG 441Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly120 125 130GCC CTT GTG GTC ACC AAA GCT GGC TAC TAC TAC ATC TAC TCC AAG GTG 489Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val135 140 145CAG CTG GGC GGT GTG GGC TGC CCG CTG GGC CTG GCC AGC ACC ATC ACC 537Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr150 155 160CAC GGC CTC TAC AAG CGC ACA CCC CGC TAC CCC GAG GAG CTG GAG CTG 585His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu165 170 175TTG GTC AGC CAG CAG TCA CCC TGC GGA CGG GCC ACC AGC AGC TCC CGG 633Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg180 185 190 195GTC TGG TGG GAC AGC AGC TTC CTG GGT GGT GTG GTA CAC CTG GAG GCT 681Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala200 205 210GGG GAG GAG GTG GTC GTC CGT GTG CTG GAT GAA CGC CTG GTT CGA CTG 729Gly Glu Glu Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu215 220 225CGT GAT GGT ACC CGG TCT TAC TTC GGG GCT TTC ATG GTG TGAAGGAAGG778Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val230 235 240AGCGTGGTGC ATTGGACATG GGTCTGACAC GTGGAGAACT CAGAGGGTGC CTCAGGGGAA 838AGAAAACTCA CGAAGCAGAG GCTGGGCGTG GTGGCTCTCG CCTGTAATCC CAGCACTTTG 898GGAGGCCAAG GCAGGCGGAT CACCTGAGGT CAGGAGTTCG AGACCAGCCT GGCTAACATG 958GCAAAACCCC ATCTCTACTA AAAATACAAA AATTAGCCGG ACGTGGTGGT GCCTGCCTGT1018AATCCAGCTA CTCAGGAGGC TGAGGCAGGA TAATTTTGCT TAAACCCGGG AGGCGGAGGT1078TGCAGTGAGC CGAGATCACA CCACTGCACT CCAACCTGGG AAACGCAGTG AGACTGTGCC1138TCAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 1169(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特徵(A)長度240個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln1 5 10 15Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser20 25 30Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly35 40 45Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg50 55 60Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp65 70 75 80Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala85 90 95His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu100 105 110Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr115 120 125His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr130 135 140Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser145 150 155 160Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu165 170 175Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser180 185 190Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His195 200 205Leu Glu Ala Gly Glu Glu Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu210 215 220Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val225 230 235 240(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特徵(A)長度455個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型不相關(D)拓撲結構不相關(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu1 5 10 15Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro20 25 30His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys35 40 45Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys50 55 60Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp65 70 75 80Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu85 90 95Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val100 105 110Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg115 120 125Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe130 135 140Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu145 150 155 160Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu165 170 175Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr180 185 190Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser195 200 205Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val Ile Phe Phe Gly Leu Cys Leu210 215 220Leu Ser Leu Leu Phe Ile Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gln Arg Trp Lys225 230 235 240Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu245 250 255Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser260 265 270Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val275 280 285Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys290 295 300Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gln Gly305 310 315 320Ala Asp Pro Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro Ile Pro Asn325 330 335Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gln Ser Leu Asp340 345 350Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pro Pro355 360 365Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu370 375 380Ile Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gln385 390 395 400Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala405 410 415Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly420 425 430Cys Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro435 440 445Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg450 455Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala225 230 235 240Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His245 250 255Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser260 265 270Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu275 280(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7GCGGGATCCG GAGAGATGGT CACC 24(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特徵(A)長度27個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8CGCAAGCTTC CTTCACACCA TGAAAGC 27(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特徵
(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9GACCGGATCC ATGGAGGAGA GTGTCGTACG GC 32(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特徵(A)長度27個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10CGCAAGCTTC CTTCACACCA TGAAAGC 27(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特徵(A)長度40個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11GCTCCAGGAT CCGCCATCAT GGAGGAGAGTGTCGTACGGC 40(2)SEQ ID NO12信息(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特徵(A)長度205個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型不相關(D)拓撲結構不相關(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Thr Pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg Val Cys Gly Thr Thr1 5 10 15Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala20 25 30Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala35 40 45Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala50 55 60Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg65 70 75 80Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn85 90 95Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln100 105 110Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro115 120 125Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe130 135 140His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln145 150 155 160Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr165 170 175Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val180 185 190Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu195 200 205(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特徵(A)長度205個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型不相關(D)拓撲結構不相關(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Thr Pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg Val Cys Gly Thr Thr1 5 10 15Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala20 25 30Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala35 40 45Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala50 55 60Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg65 70 75 80Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn85 90 95Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln100 105 110Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro115 120 125Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe130 135 140His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln145 150 155 160Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr165 170 175Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val180 185 190Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu195 200 205(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特徵(A)長度281個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型不相關(D)拓撲結構不相關(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp1 5 10 15Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys20 25 30Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro35 40 45Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro50 55 60Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly65 70 75 80Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly85 90 95Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala100 105 110Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu115 120 125Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg130 135 140Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu145 150 155 160Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr165 170 175Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr180 185 190Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser195 200 205His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met210 215 220(i)序列特徵(A)長度37個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12GACGCGGTAC CGTCCAATGC ACCACGCTCC TTCCTTC 37(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO13GCTCGGATCC GCCATCATG 19(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特徵(A)長度71個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14GATGTTCTAG AAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAC ACCATGAAAG CCCCGAAGTA 60AGACCGGGTA C 71(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特徵(A)長度40個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO15GCTCCAGGAT CCGCCATCAT GGAGGAGAGTGTCGTACGGC 40(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特徵(A)長度37個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO16GACGCGGTAC CGTCCAATGC ACCACGCTCC TTCCTTC 37(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO17GACGCCCATG GAGGAGGAGA GTGTCGTACG GC 32(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO18GACCGGATCC CACCATGAAA GCCCCGAAGT AAG 33(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特徵(A)長度27個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO19CGCAAGCTTC CTTCACACCA TGAAAGC 2權利要求
1.一種分離的核酸分子，其含有與選自下組的序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，所述組含有(a)編碼具有圖1A-C中全部胺基酸序列(SEQ ID NO2)的AIM II多肽的核苷酸序列；(b)編碼AIM II多肽的核苷酸序列，所述多肽具有ATCC保藏號NO.97689所含cDNA克隆編碼的全部胺基酸序列；(c)編碼AIM II多肽胞外結構域的核苷酸序列；(d)編碼AIM II多肽跨膜結構域的核苷酸序列；(e)編碼AIM II多肽胞內結構域的核苷酸序列；(f)編碼可溶性AIM II多肽的核苷酸序列，所述可溶性AIM II多肽含有胞外和胞內結構域，但缺乏跨膜結構域；和(g)與上述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中任何一種核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2.權利要求1的核酸分子，其中所說的多核苷酸具有圖1A-C中全部的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。
3.權利要求1的核酸分子，其中所說的多核苷酸具有圖1A-C(SEQ ID NO1)中編碼AIM II多肽的核苷酸序列，所述AIM II多肽具有圖1A-C中全部胺基酸序列(SEQ ID NO2)。
4.權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有ATCC保藏號97689中所含cDNA克隆的全部核苷酸序列。
5.權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有編碼AIM II多肽的核苷酸序列，該AIM II多肽具有ATCC保藏號97689中所含cDNA克隆編碼的全部胺基酸序列。
6.一種分離的核酸分子，其含有的一段多核苷酸在嚴格雜交條件下可跟含有與權利要求1的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中一個核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸雜交，其中所說的多核苷酸在嚴格雜交條件下與僅含A殘基或僅含T殘基的核苷酸序列不能雜交上。
7.一種分離的核酸分子，其含有編碼AIM II多肽中具有表位的區段的胺基酸序列的多核苷酸，所述AIM II多肽具有權利要求1的(a)、(b)、(c)、(d、)(e)或(f)中的胺基酸序列。
8.權利要求7的分離的核酸分子，其編碼AIM II多肽具有表位的區段，所述區段選自下述的組中含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第13位至大約第20位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ IDNO2)中大約第23位至大約第36位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第69位至大約第79位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第85位至大約第94位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第167位至大約第178位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第184位至大約第196位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第221至大約第233位胺基酸殘基的多肽。
9.一種製備重組載體的方法，所述方法包括將權利要求1的分離的核酸分子插入至載體中。
10.按權利要求9的方法製備的重組載體。
11.一種製備重組宿主細胞的方法，所述方法包括將權利要求10的重組載體導入宿主細胞中。
12.按權利要求11的方法製備的重組宿主細胞。
13.一種重組生產AIM II多肽的方法，所述方法包括在所述多肽能表達的條件下培養權利要求12的重組宿主細胞；以及回收所述多肽。
14.一種分離的AIM II多肽，其含有與選自下述組的一個序列具有至少95％同一性的胺基酸序列，該組含有(a)具有圖1A-C(SEQ ID NO2)中全部胺基酸序列的AIM II多肽的胺基酸序列；(b)具有ATCC保藏號NO.97689所含cDNA克隆所編碼的全部胺基酸序列的AIM II多肽的胺基酸序列；(c)AIM II多肽的胞外結構域的胺基酸序列；(d)AIM II肽的跨膜結構域的胺基酸序列；(e)AIM II多肽的胞內結構域的胺基酸序列；(f)可溶性AIM II多肽的胺基酸序列，所述可溶性AIM II多肽具有全部或部分胞外和胞內結構域，但缺乏跨膜結構域；和(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中任一種多肽的含有表位的區段的胺基酸序列。
15.一種含有AIM II蛋白中具有表位的區段的分離的多肽，其中所述區段選自由下述組成之組含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第13位至大約第20位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ IDNO2)中大約第23位至大約第36位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第69位至大約第79位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第85位至大約第94位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第167位至大約第178位胺基酸殘基的多肽；含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第184位至大約第196位胺基酸殘基的多肽；以及含有圖1A-C(SEQ ID NO2)中大約第221位至大約第233位胺基酸殘基的多肽。
16.一種分離的抗體，其能特異性結合權利要求14的AIM II多肽。
17.一種治療選自由下述組成之組的狀態或疾病的方法淋巴結病、自身免疫疾病和移植物抗宿主疾病，所述方法包含對需相應治療的病人服用有效量的權利要求14的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽。
18.一種抑瘤的方法，其包含對需相應治療的病人服用有效量的權利要求14的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽。
19.一種預防選自由下述組成之組的狀態或疾病的方法敗血病性休克、感染、腦型瘧、HIV-病毒活化、骨吸收、類風溼性關節炎和惡病質，所述方法包括對需相應治療的病人服用有效量的權利要求14的多肽的拮抗物。
全文摘要
本發明涉及TNF－配基超家庭的一個新成員，編程性細胞死亡誘導分子II(AIM II)。具體地說，本發明提供了編碼人AIM II蛋白的分離的核酸分子。本發明也提供了AIM II多肽，以及生產該多肽的載體、宿主細胞和重組方法。本發明還涉及篩選用於鑑定AIM II活性激動劑和拮抗劑的方法。本發明還提供了治療淋巴結病，自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病及抑制症如腫瘤細胞生長的治療方法。
文檔編號A61P33/00GK1428426SQ0213221
公開日2003年7月9日 申請日期2002年8月30日 優先權日1996年3月22日
發明者R·埃伯納, S·M·魯賓, 餘國良 申請人:人類基因組科學公司