疏螺旋體脂蛋白ospa的純化方法

2023-05-29 06:22:06 1

專利名稱：疏螺旋體脂蛋白ospa的純化方法
技術領域：
本發明涉及一種純化疏螺旋體脂蛋白OspA的改進方法。
博氏疏螺旋體(廣義的)是一種通稱，它包括若干疏螺旋體種，這些疏螺旋體種均被認為是萊姆螺旋體病(萊姆病)的病原體。博氏疏螺旋體至少包括博氏疏螺旋體(狹義的)、B.garinii和B.afzelii。該疾病是由多種帶有螺旋體的蜱蝨的叮咬而加以傳播。這種傳染病在美國的主要儲存庫是白腳小鼠，它可以傳播給包括人類在內的多種哺乳動物物種。
OspA是萊姆病螺旋體廣義博氏疏螺旋體的一種保護性抗原。OspA全長基因在疏螺旋體或大腸桿菌中表達可產生一種蛋白，該蛋白可經信號肽酶H翻譯後加工，並且含有一種附屬的脂類部分。由下文可知，目前已能夠對OspA脂蛋白進行適於臨床應用的大規模純化，其實施無需在純化過程中採用熱抽提或酒精抽提方法，並且產生的OspA脂蛋白基本不含去汙劑。
其次，本發明還提供一種方法，用於純化不含去汙劑的疏螺旋體脂蛋白OspA。
另外，本發明提供純淨並且穩定的脂蛋白OspA，該脂蛋白OspA不含去汙劑，並且適於人類的臨床應用。
發明詳述本發明提供一種用於從實驗室規模放大至工業規模的純化博氏疏螺旋體脂蛋白OspA的簡單方法。該方法的優勢在於，其純化無需熱抽提或酒精抽提或雙相抽提，並且可通過單一步驟獲得高水平的純度。本發明的這一方法可產生適於人類臨床應用的OspA蛋白。本發明還提供OspA脂蛋白，該脂蛋白基本不含去汙劑(即只殘存有痕量的去汙劑)並且可長時間保持穩定(2-8℃的PBS中保持2年)。
本發明提供一種方法，用於在存在兩性離子去汙劑以使OspA增溶的情況下對脂蛋白OspA進行純化，該方法在純化過程中無需熱抽提或酒精抽提。這樣可有利地避免對終產物免疫原性的潛在損害(如變性、脫脂化等)。儘管並不希望終產物中含有去汙劑，但只要將OspA脂蛋白溶解，則優選的是在存在去汙劑的情況下進行連續純化，這是因為脂蛋白在不存在去汙劑的情況下傾向於形成脂類聚集體。在離子交換純化過程中，優選的是加入另一種去汙劑，以保持脂蛋白OspA的溶解狀態和非聚集隨機狀態。該去汙劑優選的為非離子型去汙劑，如TritonTM(聚氧乙烯醚)或TweenTM(聚氧乙烯山梨糖醇酯)。脂蛋白OspA一旦被純化，即可在不含有去汙劑(表面活性劑)的PBS(磷酸緩衝鹽溶液)中保持穩定。終產物中的純化OspA脂蛋白無需去汙劑，因為該脂蛋白一旦被純化，還可通過採取微團樣形式而保持穩定。
本發明提供一種用於從廣義的博氏疏螺旋體菌株中純化脂蛋白OspA的有利方法。這些菌株包括狹義的博氏疏螺旋體(如ZS7、B31、N40、JD1、297、Sh-2-82等)、B.garinii(如ZQ1、IP90、NE11H、IP3等)和B.afzelii(如ACA-1、Pko、Bo23等)。
本發明的純化方案包含以下步驟。在存在兩性離子去汙劑的情況下將表達脂蛋白OspA的宿主細胞裂解，藉此使脂蛋白OspA溶解；實施澄清步驟以去除宿主細胞碎片，該步驟包括流化床離子交換法，然後採用透濾法(或選用離心法)；可選的過濾步驟，以去除所有殘留的微粒物質；陰離子交換；陽離子交換；以及凝膠過濾(篩分柱)以從脂化OspA中去除所有非脂化OspA。此外，優選的是在凝膠過濾之後再添加一個除菌過濾步驟。
實施例部分將對脂蛋白OspA的純化做進一步的說明。方案Ⅰ涉及4個層析步驟和1個透濾步驟。該方法包括細胞勻漿(破碎)，可通過，例如，高壓細胞勻漿儀來實現；勻漿的稀釋(如稀釋到光密度(OD)約為20)及勻漿的酸化；然後在流化床上進行陽離子交換(有時稱為膨脹床吸附--如StreamlineTMSP系統，Pharmacia)。把勻漿加載到流化床上，然後清洗並利用逐漸增加的離子強度和/或逐漸增加的pH進行洗脫。作為可選步驟，可將洗脫液過濾除菌並透濾。然後把含有脂蛋白OspA的樣品加載到陰離子交換樹脂上。再把流出物加載到另一陽離子交換樹脂上。將樹脂清洗並利用逐漸增加的離子強度和/或逐漸增加的pH洗脫OspA。使溶解的OspA流經篩分柱，然後過濾除菌。
膨脹床吸附法以流化床為基礎。實際上，它是利用上行液流將吸收顆粒提升，以平衡向下的重力。將顆粒提升到剛剛足以使它們懸浮在液流中，藉此可產生一個穩定的勻化膨脹床。在一項實施方案中，吸附使用的是StreamlineTM(一種用於陽離子交換的磺醯丙基衍生樹脂)。
使用透濾法可去除兩性離子去汙劑，並可濃縮OspA蛋白。在存在非離子型去汙劑(如TritonTMX-100)的情況下把滯留物加載到陰離子交換柱上(如Q-Sepharose)。陰離子交換步驟可去除95％以上的雜質。脂蛋白OspA不與該柱結合，從而把流出物注到陽離子交換柱中(如SP Sepharose)。將柱清洗，再洗脫脂蛋白OspA並將其注到凝膠滲透柱中(如Sephacryl S300HR)，以此來替換緩衝液並將非脂化OspA從脂化OspA中分離，同時去除去汙劑。將純化的脂蛋白OspA稀釋至標準濃度，並用0.2m無菌膜進行有效的過濾以除菌。
離子交換樹脂為該領域所熟知。陽離子交換劑包括CM Sephadex、SP Sephadex、CM Sepharose、S Sepharose、CM纖維素等。用於陽離子交換層析的優選樹脂為SP或CM Sepharose(Pharmacia)。陰離子交換劑包括DEAE Sephadex、QAE Sephadex、DEAE Sepharose、Q Sepharose、DEAE Sephacel等。用於陰離子交換層析的優選樹脂為Q Sepharose(Pharmacia)。凝膠過濾(篩分)樹脂包括Sephadex、Sephacryl、Sepharose、Superdex、Superose等。優選的樹脂為Sephacryl S樹脂，如S-300 HR(Pharmacia)。
所得的純化OspA蛋白即不含去汙劑或表面活性劑。
方案Ⅱ涉及3個純化步驟。在存在兩性離子去汙劑的情況下的細胞裂解(如凍融)步驟；離心步驟以及將含有OspA的上清液(不純溶液)過濾的可選步驟。當實施可選的過濾步驟時，優選的是使用預濾器，如先用1.2m過濾器再用0.45m過濾器然後進行0.22m過濾。然後在存在非離子型去汙劑的情況下把含有脂蛋白OspA的濾出液加載到陰離子交換樹脂上。把流出物加載到陽離子交換樹脂上。將樹脂清洗並利用逐漸增加的離子強度和/或逐漸增加的pH洗脫OspA。使溶解的OspA流經篩分柱，然後過濾除菌。
在方案Ⅱ中，細胞裂解可在存在兩性離子去汙劑的情況下自動發生。而無需進行細胞破碎。也不需實施透濾步驟。與方案Ⅰ相同，陰離子交換步驟可去除95％以上的雜質。OspA在鹼性條件下不與QSepharose結合。一旦在不存在去汙劑(表面活性劑)的情況下被純化，脂蛋白OspA即可在PBS(磷酸緩衝鹽溶液)中保持純淨和穩定性。
兩性離子去汙劑包括N-烷基-N,N-二甲胺基-1-丙磺酸酯(即SB8、10、12、14、16、18)、CHAPS(3-[(3-膽氨丙基)-二甲胺基]-1-丙磺酸酯)和CHAPSO(3-[(3-膽氨丙基)二甲胺基]-2-羥基-1-丙磺酸酯)。優選的兩性離子去汙劑選自N-烷基-N,N-二甲胺基-1-丙磺酸酯。更優選的則為N-十二基-N,N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸酯(稱為SB12，亦稱作月桂基sulfobetain)。SB12在水性溶液中不形成兩個相(雙相)，從而更易於擴大OspA的純化規模。
根據本發明的純化方案，純化脂蛋白OspA溶液(1mg/ml)中的SB12水平低於1000ppb〔十億分率〕(1ppm)。優選的為低於100ppb(0.1ppm)。更優選的則低於10ppb(0.01ppm)，該數值已接近檢出水平。
非離子型去汙劑包括TritonTM(聚氧乙烯醚)、TweenTM(聚氧乙烯山梨糖醇酯)、聚氧乙烯酯和Nonidet P-40。優選的為TritonTM(X-100、X-114、X-405、N-101)或TweenTM(20-80)。更優選的則是TritonTMX-100或TritonTMX-114。由於TritonTMX-100被認為是安全的，並經過FDA認證，因此它是最優選的去汙劑。
根據本發明的純化方案，純化脂蛋白OspA溶液(1mg/ml)中的TritonTMX-100水平低於1000ppm〔百萬分率〕(0.1％)。優選的為低於100ppm。更優選的則低於10ppm。對30g劑量的脂蛋白OspA而言，每劑量的TritonTMX-100水平低於300ng/劑。
本發明的純化脂蛋白OspA不含去汙劑，適於人類臨床應用，並可保持穩定。「純化脂蛋白OspA」是指經SDS-PAGE(Coomassie染色)確定的純度高於95％；優選的則高於98％。
「不含去汙劑」是指純化脂蛋白OspA溶液(1mg/ml)中的去汙劑水平低於1000ppm〔百萬分率〕(0.1％)。優選的為低於100ppm。更優選的則低於10ppm。由此，對30g劑量的脂蛋白OspA而言，每劑量的去汙劑水平(非離子型或兩性離子型)低於300ng/劑。
「適於人類臨床應用」是指由顯色LAL測試法確定的30μg脂蛋白OspA中的內毒素含量少於5EU。此外，每30μg脂蛋白OspA中的DNA水平低於100pg；優選的低於20pg；更優選的則低於2pg。而且每30μg脂蛋白OspA中的大腸桿菌雜質水平低於總蛋白含量的0.100％；優選的為低於0.050％；更優選的則低於0.025％。
「穩定」是指脂蛋白OspA不會出現明顯的降解，即在2-8℃下儲存一年後，經SDS-PAGE檢測有95％或更多的OspA保持單一條帶(優選的為98％或更多)，並且/或其脂類蛋白比率保持約為2(2.0+/0.5)，並且/或其在Balb/C小鼠中的免疫原性保持80％或更高(優選的為90％或更高，更優選的則為95％或更高)。
根據本發明，脂化OspA可從表達OspA的廣義博氏疏螺旋體天然菌株中純化，或可通過該領域熟知的適當重組表達系統來純化。例如可構建一種重組分子或載體，將OspA全長編碼區經操作與異種表達調控序列相連接，以使該蛋白得以表達。獲得此類表達載體的方法已眾所周知。可參考Sambrook et al.，「分子克隆。實驗手冊」，第2版，Cold Spring harbor Laboratory,New York(1989)。
用於轉染的適當寄主細胞或細胞系包括細菌細胞。例如，可作為適當宿主細胞的多種大腸桿菌菌株(如AR58、AR68、HB101、MC1061等)已為該領域所熟知。枯草芽孢桿菌、鏈黴菌和其它芽孢桿菌的多種菌株也可在該方法中使用。
為了能夠更好地理解本項發明而列出了以下實施例。這些實施例僅用於例證的目的，在任何情況下都不應將其理解為是要限制本發明的範圍。
利用管式離心機(Sharpless)將發酵肉湯澄清。從轉筒中回收沉澱並冷凍於-70℃。該沉澱在做進一步處理前可於-70℃下保存12個月。抽提將細胞解凍並重懸於含有SB12去汙劑的細胞裂解緩衝液中(TBRO緩衝液含有25mM乙酸鹽、4mM EDTA,pH6.0,3％SB12)，使其OD650=60(由發酵末期的OD650計算出的理論值——相當於30g乾重量/升)。使細胞通過高壓細胞勻漿儀(Rannie)而將其機械破碎。用TBDI緩衝液(25mM乙酸鹽、4mM EDTA、pH4.8,3％SB12)將細胞勻漿稀釋3倍(至OD650=20)，並把稀釋的勻漿靜置1小時。用乙酸把pH值調至4.8±0.1，把傳導率調至3.8mS±0.2mS(所有的傳導率均轉換為20℃下的值)。如果需要，可通過加入NaCl來增加傳導率，或加H2O以降低傳導率。純化純化是通過4個層析步驟和1個透濾步驟來實現。首先，將脂蛋白-OspA吸附在膨脹床柱中的Streamline SP填料上。清洗膠體以去除細胞碎片。然後將脂蛋白-OspA洗脫並過濾以去除所有的殘留大腸桿菌。第二步，利用透濾法來去除SB12去汙劑並將產物濃縮。第三步，在存在Triton X-100的情況下將滯留物加載到Q Sepharose離子交換柱上。脂蛋白OspA不與該柱結合，從而把流出物注到SPSepharose柱中。將柱清洗，再洗脫脂蛋白OspA並將其注到SephacrylS300HR凝膠滲透柱中，以此來替換緩衝液並去除去汙劑。將純化的脂蛋白OspA稀釋至標準濃度，並過濾除菌(0.2μm)。後面的步驟將於下文做更詳細的描述。
Streamline SP之後的所有純化步驟均在+2-+8℃的冷室中進行。Streamline SP發酵完後，將稀釋的細胞勻漿加載到用TSTA緩衝液(25mM NaCl、25mM乙酸鹽，pH4.8、3％SB12)平衡的膨脹床Streamline SP(Pharmacia,Sweden)柱上。用TSTA緩衝液清洗柱子以去除所有未結合物質。接著通過倒轉流向將柱浸於相同緩衝液中。用TSTC緩衝液(25mM檸檬酸鹽，pH6.0、0.25％SB12)洗脫。根據280nm下的紫外吸光譜將產物收集。
用二乙醇胺溶液將Streamline SP洗出液的pH值調至7.9±0.3，並對0.2μm濾膜(Sartobran 0.45μm+0.2μm,4500cm2)過濾以去除潛在的殘留大腸桿菌。過濾後的Streamline SP洗出液可在透濾前於+2-+8℃保存過夜。透濾透濾使用板框式裝置。濾膜則使用截留值為30Kd的FiltronOmega膜(低結合力聚醚碸)。
第一步是將含有脂蛋白OspA的洗出液濃縮約10倍，通過對至少10體積(約240L)二乙醇胺緩衝液(25mM DEA,pH8.6)的透濾而從約240L濃縮至約24L。在滯留物中加入Triton X-100(以保持脂蛋白OspA的溶解性)至終濃度為1％。
滯留物在流經Q Sepharose柱前可於+2-+8℃靜置過夜。陰離子交換——Q Sepharose用二乙醇胺緩衝液(含有25mM DEA,pH8.6、0.1％Triton X-100的TQA)將Q Sepharose FF(Pharmacia,Sweden)柱平衡。將透濾滯留物加載到柱上，並收集流出物，包括TQA緩衝液的清洗步驟，至280nm的紫外信號返回基值。用乙酸將流出物的pH值調低至pH4.8。陽離子交換——SP Sepharose用TSPA緩衝液(25mM乙酸鹽，pH4.8、0.1％Triton X-100)將SP Sepharose FF(Pharmacia,Sweden)柱平衡，然後將流出物和清洗組分上樣。用2倍柱體積的相同TSPA緩衝液清洗柱子。用25mM檸檬酸pH5.7、0.1％Trition X-100(TSPC緩衝液)將脂蛋白OspA洗脫。凝膠過濾——Sephacryl S300HR將SP Sepharose洗出液注射(最多9.5L)到Sephacryl S300HR(Pharmacia,Sweden)凝膠滲透柱上。使10mM PO4、150 mM NaCl pH6.8緩衝液(THR)流經柱子。收集流出組分樣品，並保存於+2-+8℃以用於在制過程控制分析，或保存於-70℃。根據HPLC的分析結果將脂蛋白OspA峰值組分合併。HPLC使用的是由200mL磷酸鹽緩衝液pH7.6平衡的Zorbax GF450柱。流速為1mL/分鐘，樣品體積10μl。在210nm下測量光密度。當肩峰表面≤1.2％的脂蛋白-OspA峰值時開始合併；當脂蛋白-OspA的濃度＜400g/mL時結束合併。過濾除菌用相同的THR緩衝液將包含脂蛋白OspA峰值的SephacrylS300HR合併組分稀釋至濃度為1mg蛋白/mL(目標值)，並立即過濾除菌。
通過對0.2μm濾膜過濾將稀釋的純化脂蛋白OspA除菌。回收過濾後的樣品並儲存於+2-+8℃，以用於在制過程和QC分析。
無菌的純化抗原在配製前儲存於+2-+8℃。
也可利用以下方法從Borrelia garinii菌株ZQ1或Borreliaafzelli菌株ACA-1中純化脂蛋白OspA，但產量要低於ZS7 OspA的產量，這可能是由於ZQ1和ACA-1的OspA蛋白的pK值較高。去除該方法起始階段的酸化步驟或對其進行改進可使產量提高約3倍。
表1對大腸桿菌表達的ZS7脂蛋白OspA的純化進行了概述。表1OspA的純化
TBDI:25mM乙酸，pH4.8、4mM SB12TSTC:25mM檸檬酸，pH6.0、0.25％SB12TQA:25mM DEA,pH8.6TSPC:25mM檸檬酸，pH5.7、0.1％Triton XTHR:Na2HPO4/K2HPO410mM、NaCl 150mM實施例2脂蛋白OspA的純化——方案Ⅱ發酵
如實施例1所述在大腸桿菌(AR58菌株)中表達全長OspA，其轉化使用的是帶有Borrelia garinii菌株ZQ1脂蛋白OspA(見WO93/04175)編碼序列的pOA15，該編碼序列受熱誘導型pL啟動子調控。在39.5℃+/-2.0℃下誘導約23小時。
利用管式離心機(Sharpless)將發酵肉湯澄清。從轉筒中回收沉澱並冷凍於-70℃。該沉澱在做進一步處理前可於-70℃下保存12個月。
將細胞解凍並重懸於含有SB12去汙劑的細胞裂解緩衝液中(10mMBisTris,pH 6.5,3％SB12)，使其OD650=60(由發酵末期的OD650計算出的理論值——相當於30g乾重量/升)，室溫(20-25℃)下攪拌2小時。
在發酵並進行細胞裂解後，將不純溶液離心(17000×g,30分鐘)並過濾(1.2μm，然後是0.45μm和0.2μm)以去除可能殘留的大腸桿菌。純化純化是通過3個層析步驟來實現。優選的是將含有脂蛋白-OspA的不純溶液離心並過濾，以去除所有殘留的大腸桿菌。然後在存在Triton X-100的情況下將不純溶液加載到陰離子交換(Q SepharoseFF或XL)柱上。脂蛋白OspA不與該柱結合，從而把流出物注到陽離子(SP Sepharose或CM Sepharose)柱中。將柱清洗，再洗脫脂蛋白-OspA並將其注到Sephacryl S300HR凝膠滲透柱中，以此來替換緩衝液並去除Triton X-100。將純化的脂蛋白-OspA稀釋至標準濃度，並過濾除菌(0.2μm)。後面的步驟將於下文做更詳細的描述。
所有純化步驟均在+2-+8℃的冷室中進行。陰離子交換——Q Sepharose用二乙醇胺緩衝液(含有25mM DEA,pH8.8、0.1％Triton X-100的TQA)將Q Sepharose FF(Pharmacia,Sweden)柱平衡。將不純溶液加載到柱上，並收集流出物，包括TQA緩衝液的清洗步驟，至紫外信號返回基值。用乙酸將流出物的pH值調低至pH4.8。陽離子交換——SP Sepharose用TSPA緩衝液(25mM乙酸鹽，pH4.8、0.1％Triton X-100)將SP Sepharose FF(Pharmacia,Sweden)柱平衡，然後將流出物和清洗組分上樣。用2倍柱體積的相同TSPA緩衝液清洗柱子。用25mM檸檬酸、0.2M NaCl,pH4.8、0.1％Trition X-100將脂蛋白OspA洗脫。凝膠過濾——Sephacryl S300HR將SP Sepharose洗出液注射(最多9.5L)到Sephacryl S300HR(Pharmacia,Sweden)凝膠滲透柱上。使10mM PO4、150mM NaClpH6.8的緩衝液(THR)流經柱子。收集流出組分樣品，並保存於+2-+8℃以用於在制過程控制分析，或保存於-70℃。根據HPLC的分析結果將脂蛋白OspA峰值組分合併。HPLC使用的是由200mL磷酸鹽緩衝液pH7.6平衡的Zorbax GF450柱。流速為1mL/分鐘，樣品體積10μl，在210nm下測量光密度。當肩峰表面≤1.2％的脂蛋白-OspA峰值時開始合併；當脂蛋白-OspA的濃度＜400μg/mL時結束合併。過濾除菌用相同的THR緩衝液將包含脂蛋白OspA峰值的SephacrylS300HR合併組分稀釋至濃度為1mg蛋白/mL(目標值)，並立即過濾除菌。
通過對0.2μm濾膜過濾將稀釋的純化脂蛋白OspA除菌。回收過濾後的樣品並儲存於+2-+8℃，以用於在制過程和QC分析。
無菌的純化抗原在配製前儲存於+2-+8℃。實施例3脂蛋白-OspA的純化——方案ⅡA發酵如實施例1所述在大腸桿菌(AR58菌株)中表達全長OspA，其轉化使用的是帶有Borrelia afzelli菌株ACA-1脂蛋白OspA(見美國專利號5,777,095)編碼序列的pOA15，該編碼序列受熱誘導型λpL啟動子調控。在39.5℃+/-2.0℃下誘導約23小時。
利用管式離心機(Sharpless)將發酵肉湯澄清。從轉筒中回收沉澱並冷凍於-70℃。該沉澱在做進一步處理前可於-70℃下保存12個月。
將細胞解凍並重懸於含有SB12去汙劑的細胞裂解緩衝液中(10mMBisTris,pH6.5,3％SB12)，使其OD650=60(由發酵末期的OD650計算出的理論值——相當於30g乾重量/升)，室溫(20-25℃)下攪拌2小時。
在發酵並進行細胞裂解後，將不純溶液離心(17000×g,30分鐘)並過濾(1.2μm，然後是0.45μm和0.2μm)以去除可能殘留的大腸桿菌。純化如實施例2所述，純化是通過3個層析步驟來實現，其中有某些微小的變動。陰離子交換——Q Sepharose用二乙醇胺緩衝液(含有25mM DEA,pH9.1、0.1％Triton X-100的TQA)將Q Sepharose XL(Pharmacia,Sweden)柱平衡。將不純溶液加載到柱上，並收集流出物，包括TQA緩衝液的清洗步驟，至280nm下的紫外信號返回基值。用乙酸將流出物的pH值調低至pH4.8。陽離子交換——CM Sepharose用TSPA緩衝液(25mM乙酸鹽，pH4.8、0.1％Triton X-100)將CM Sepharose FF(Pharmacia,Sweden)柱平衡，然後將流出物和清洗組分上樣。用2倍柱體積的相同TSPA緩衝液清洗柱子。用50mM檸檬酸，pH6.2、0.1％Trition X-100將脂蛋白OspA洗脫。凝膠過濾——Sephacryl S300HR將CM Sepharose洗出液注射(最多9.5L)到Sephacryl S300HR(Pharmacia,Sweden)凝膠滲透柱上。使10mM PO4、150mM NaClpH6.8的緩衝液(THR)流經柱子。收集流出組分樣品，並保存於+2-+8℃以用於在制過程控制分析，或保存於-70℃。根據HPLC的分析結果將脂蛋白OspA峰值組分合併。HPLC使用的是由200mL磷酸鹽緩衝液pH7.6平衡的Zorbax GF450柱。流速為1mL/分鐘，樣品體積10μl。在210nm下測量光密度。當肩峰表面≤1.2％的脂蛋白-OspA峰值時開始合併；當脂蛋白-OspA的濃度＜400μg/mL時結束合併。過濾除菌用相同的THR緩衝液將包含脂蛋白-OspA峰值的SephacrylS300HR合併組分稀釋至濃度為1mg蛋白/mL(目標值)，並立即過濾除菌。
通過對0.2μm濾膜過濾將稀釋的純化脂蛋白OspA除菌。回收過濾後的樣品並儲存於+2-+8℃，以用於在制過程和QC分析。
無菌的純化抗原在配製前儲存於+2-+8℃。
利用方案Ⅱ也曾從狹義博氏疏螺旋體ZS7菌株中純化出脂蛋白OspA。
該多克隆抗體確實對大腸桿菌蛋白具有特異性，並且在EPE與lipo-OspA混合或不混合的情況下顯示出相似的識別模式，這表明lipo-OspA不會對大腸桿菌蛋白的檢測造成幹擾。因此，利用該兔抗大腸桿菌多克隆抗體可特異檢測出大腸桿菌蛋白。4.1.3．蛋白印記分析通過蛋白印記分析對來源於宿主細胞的蛋白水平進行定性評定。在存在β-巰基乙醇的情況下將蛋白樣品還原，並置SDS樣品緩衝液中變性，再以20g/泳道上樣於12.5％的SDS-PAGE凝膠中。同時將一系列稀釋度的EPE(20、10、5和1g/道)上樣。電泳完畢後，利用轉移緩衝液(Tris 0.025M,pH8.3、甘氨酸0.192M並含有20％甲醇和0.1％SDS)將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。然後把膜置於孵育緩衝液(含有0.1％吐溫20的PBS)中阻斷，並在加有稀釋了250倍的抗大腸桿菌多克隆抗血清的孵育緩衝液中保溫1小時。所有步驟均於室溫下在搖動平臺上進行。膜與抗體保溫後，將其置孵育緩衝液中清洗3次(每次5分鐘)，然後與1/500稀釋於孵育緩衝液的生物素標記的種特異性驢抗兔全抗體共保溫1小時。將膜清洗，然後加入抗生蛋白鏈菌素-生物素標記的辣根過氧化物酶試劑(1/1000稀釋於孵育緩衝液)，通過加入4-氯-l-萘酚/甲醇/H2O2溶液使抗原-抗體複合物顯色，加入水使該反應終止。4.1.4．ELISA測定利用酶聯免疫吸附測定(ELISA)方法對來源於宿主細胞的樣品中的蛋白水平進行定量評定。
在37℃下用溶於碳酸氫鹽緩衝液(pH=9.6)的純化兔抗大腸桿菌IgG組分(p-Rb-IgG)將微量滴定板包被2小時。在不同步驟之間均用含有0.1％吐溫20的PBS清洗滴定板。用溶於PBS的1％BSA(牛血清白蛋白)阻斷滴定板。將測試樣品(或對照樣品)逐次稀釋(於含有0.2％BSA的PBS)，並在37℃下保溫90分鐘。然後在37℃下將滴定板與稀釋的生物素標記p-Rb-IgG保溫1小時。每孔中加入抗生蛋白鏈菌素-生物素標記的過氧化物酶試劑(溶於0.2％BSA-PBS),並將滴定板於室溫下保溫30分鐘。然後加入底物(TMB=3,3』,5,5』-四甲聯苯胺)溶液將抗體-抗原複合物顯色，再加入H2SO4以終止反應。在405nm下測定吸光度。
相對於由4參數邏輯方程(Karpinski KF et al.,1987,J.Immunology Methods 103∶189)建立的EPE參照曲線計算出樣品中的大腸桿菌濃度。上下漸進OD值部分則使用一種20％-80％的計算程序(SOFTmaxPRO)。所有樣品都是從200μg蛋白/ml(由Lowry測定法確定)開始進行2倍稀釋。計算出由不同稀釋度獲得的濃度的平均值，其中考慮到所有OD值都屬於參照曲線的線性部分(20％-80％的截至值)。結果亦利用線性回歸方法進行了證實。
已知ELISA測定法的檢測極限(空白樣品〔含有0.2％BSA的PBS〕的平均OD450+3標準偏差)為50ng大腸桿菌蛋白提取物/ml。假設樣品是在200g/ml(第一次稀釋)這一最高濃度下進行測試，那麼可被檢測的最低大腸桿菌蛋白水平為總蛋白含量的0.025％。4.1.5結論根據上述實驗，蛋白印記分析和ELISA測定的結果表明，在實施例1的SPC(SP Sepharose FF(陽離子交換)柱)步驟之後幾乎完全將大腸桿菌蛋白雜質從發酵產物中去除。根據ELISA的結果，估計殘留的大腸桿菌雜質少於0.025％。該純化方法具有可重複性，由20L規模和75L規模獲得的結果均證明了這一點。實施例2和3也得到類似的結果。4.2．DNA定量4.2.1對不同樣品進行DNA定量所使用的方法均為ThresholdTM系統(Molecular Devices Corp.)。該系統包括一個半自動工作站、一臺讀出器、一臺個人電腦、軟體、進行DNA測定所需的所有試劑和可置換件以及一套進行測試的方法。
DNA檢測是以蛋白酶K處理並經熱變性後獲得的單鏈DNA的識別為基礎，它是通過用抗生蛋白鏈菌素進行夾層測定中所使用的兩種DNA結合蛋白來實現。其中一種蛋白，來源於大腸桿菌的單鏈DNA結合蛋白(SSB)，與生物素相結合，可將DNA複合物特異性捕獲到膜上，另一蛋白則是與脲酶結合的一種抗DNA單克隆抗體，用於產生信號。
這兩種蛋白與單鏈DNA均有很高的親和力，但序列特異性很低，並且能夠與DNA和抗生蛋白鏈菌素形成一種抗生蛋白鏈菌素-生物素-SSB-DNA-抗體-脲酶複合物。
該複合物能夠在真空下通過過濾作用被捕獲到生物素標記的膜上。未結合的試劑則可通過清洗而去除。
由於被捕獲的脲酶的量與DNA的量成正比，因此可利用脲酶活性來將DNA定量。脲轉變成氨和二氧化碳的速率可利用對pH敏感的半導體來測定。
樣品中的DNA量可相對於2pg-200pg的小牛胸腺DNA校準器來進行測定。因此，可確定的最小量為2pg。4.2.2樣品處理於55℃下用蛋白酶K(0.1mg/ml)和SDS(0.1％)將終體積500μl的各測試樣品處理16小時，然後於100℃下變性20分鐘，並根據廠商說明對反應進行標記。
為了對預處理進行驗證並監控與樣品相關的所有抑制作用而進行峰值回收測試，方法是在各樣品中加入50pg外源DNA(根據廠商說明)，並與含有50pg小牛胸腺DNA的對照樣品進行比較，以證明回收量。
峰值樣品中的DNA回收量採用以下公式進行計算
回收百分率=(樣品峰值信號-樣品信號)/(緩衝液峰值信號-緩衝液信號)×100對一個有效的測試而言，峰值樣品的DNA回收量必須為80-120％。4.2.3．結果Q-Sepharose柱是DNA取出中最有效的處理步驟。
在實施例1的純化OspA樣品中，100μl未稀釋樣品中的DNA殘留量接近於系統的檢測極限(2pg)。把大批量純化樣品的蛋白濃度(約1mg/ml)考慮在內，則相當於每100μg抗原含2pg。因而相當於30μg劑量lipo-OspA疫苗中的DNA濃度小於2pg。利用實施例2和3的樣品亦得到類似結果。4.3 lipo-OspA純化方法的SB12清除率評定純化蛋白中的SB12殘留水平4.3.1．前言大腸桿菌細胞的lipo-OspA提取物使用一種含有N-十二烷基-N,N-二甲基-3-氨基(ammonio)-1-丙磺酸酯(月桂基sulfobetain或SB12)的緩衝液。在細胞提取物中加入3％(w/v)的該去汙劑可保持lipo-OspA的可溶性，以便於隨後的純化步驟。
通過實驗來評定不同純化步驟對產品中SB12的清除程度，並確定大批量純化產品階段的SB12殘留量。4.3.2．測定SB12的分析方法4.3.2.1．方法的原理通過C18柱的反相HPLC將SB12與緩衝液組分(磷酸鹽)分離，並將洗出液注入ESMS(電噴射質譜儀)。利用SIM(單離子監測)於m/z336下檢測物質的SB12分子離子。4.3.2.2.實驗條件帶有Applied Biosystems 140溶劑輸送系統的HPLC系統、VydacC18柱(250×2.1mm)、ESMS和214nm下的Applied Biosystems 759A吸光度檢測器。按90/10的比率將柱洗出液分離10％用於ESMS,90％用於紫外檢測器。柱後安裝有旁通系統，以去除含鹽的注射峰。使用該系統可提高此方法的可重複性，並可避免供應源的堵塞。流動相(流速為200l/分鐘)含有74∶10的甲醇∶水，並含有0.1％的三氟乙酸。注射量為20μl。
ESMS(VG Platform II,Micromass)的實施採用陽離子方式(ES+)，並且將SB12分子離子(m/z336)作為單離子進行監控，以取代儘可能最高的敏感性。ESMS的調節參數如下離子源毛細管3.5kV,HV透鏡0.5kV，錐體45V，離子源溫度60-120℃MS離子能量1V,LM解析度10,HM解析度10，放大器650VSIR平均質量336，停留時間0.2秒，通道間延擱0.02秒質量標度的校準使用NaI簇。4.3.2.3．標準曲線用含有10ppm SB12的儲液稀釋成濃度為5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.100、0.05、0.025和0.01ppm。標準曲線的數據列於表2。表2由ESMS獲得的SB12校準曲線數據
4.3.2.4．樣品製備
在可能的情況下將不加稀釋的樣品注射，這樣可獲得儘可能最高的敏感性。在該純化過程的第一步中SB12的濃度較高，進行適當的稀釋(1000×、100×或10×)是為了獲得處在校準曲線範圍內的應答。4.3.3．利用該純化方法對SB12的去除進行估價對純化過程中不同批次產物的不同樣品進行SB12含量分析。表3顯示由純化過程的不同階段的75L序批產物獲得的結果。表3不同純化步驟的SB12濃度(ppm)75L批量
由表可見，75L與20L批次的相同純化階段的SB12濃度相一致。SP-Sepharose步驟以後的SB12水平低於100ppb(0.1ppm)。
除Q-Sepharose步驟(該步驟中SB12未去除)之外，其餘所有步驟的清除率均在90％以上。該步驟的濃度較低僅僅是由於處理體積較大(稀釋作用)。


圖1以圖表方式說明了不同純化步驟對SB12濃度降低的作用。研究的75L和20L批次的所有產品的清除率均保持一致。4.3.4結論通過使用一種極為敏感並且精確的檢測SB12的方法，說明大批量純化lipo-OspA中的SB12殘留水平低於10ppb。對20L和75L生產規模的不同純化階段產物的分析結果表明，該純化方法可一貫地將SB12從初始提取物中清除。4.4利用比色法確定Triton X-100的含量4.4.1．前言該部分敘述確認實驗的結果，以證實大批量純化lipo-OspA中Triton含量的測定結果。
比色方法如下所述4.4.2分析方法該方法以Huddleston,R.L.和Allred,R.C.發表的出版物(J.Am.Oil Chemist Soc.,1965,42,983)為基礎。
該測定所基於的方法也可用於非離子型表面活性劑的檢測。表面活性劑能夠與硫氰酸鈷複合。可利用二氯乙烯抽提著色的複合物，並在320nm下測量吸光度。試劑和標準溶液1．試劑二氯乙烯、6 H2O合硝酸鈷、硫氰酸銨、98％甲酸。2．硫氰酸鈷試劑將12.7g硫氰酸銨和2.0g六水合硝酸鈷溶於100ml純水中並充分混勻。3．標準溶液在100ml容量瓶中精確稱量100mg Triton X100。用二氯乙烯溶解並定容。方法A．標定製備一系列將Triton X100以0、2.5、5、10、15、20、25、30和40g/ml的濃度溶於二氯乙烯的標準溶液。在每1ml的各標準溶液中加入100l甲酸和1ml硫氰酸鈷試劑。充分混合約20分鐘。
在約5000rpm下離心約15分鐘，取出上層(水性)部分並拋棄。將下層(二氯乙烯)部分置微量比色池中測定320nm下的吸光度。
將濃度(Triton X100的g/ml數)對吸光度(校準曲線)作圖。B．樣品處理
將1ml樣品轉移到試管中，一式兩份，並在Savant Speed Vac濃縮儀中脫水乾燥。
在殘留物中加入100μl甲酸和1ml二氯乙烯。通過超聲使殘留物懸浮。在1號管中加入1ml硫氰酸鈷試劑(測試管)。在2號管中加入1ml純水(空白管)。充分混合約20分鐘。
在約5000rpm下離心約15分鐘，取出上層(水性)部分並拋棄。將下層(二氯乙烯)部分置微量比色池中測定320nm下的吸光度。
計算測試管O.D.值與空白管O.D.值之間的差。由校準曲線確定樣品的Triton含量。檢測極限2μg/ml。4.4.3．分析方法的確認4.4.3.1．檢測極限(LOD)根據校準曲線進行計算校準曲線已在不同的4天裡(每天做3-5次重複稀釋)確定出來。確定每天所得回歸線的y軸截距的平均值和標準偏差(SD)，並計算出平均值+3 SD。根據每天的平均值和該天的平均校準曲線計算出LOD。這4天的結果均列於表4。這4天所獲得的結果的平均值為1.8μg/ml。4.4.3.2根據標準偏差和斜率進行計算LOD=3.3 SD/SSD=y軸截距的標準偏差S=平均校準曲線的斜率這4天所獲得的結果列於表4。由該表可看出，這4個值的平均值為1.9μg/ml，非常接近於由4.4.3.1．的方法所獲得的值。
根據這些實驗結果，可斷定LOD為2μg/ml。4.4.3.3定量極限(LOQ)定量極限可根據4.4.3.1．所述實驗獲得的結果計算得出。LOQ=10 SD/S1SD=y軸截距的標準偏差S=平均校準曲線的斜率結果分別列於表4。由該表可斷定LOQ為6μg/ml。表4檢測極限和定量極限
4.4.3.4線性度和範圍為了評定比色法的線性度，並以精密而又準確的方式測定Triton含量的濃度範圍，而在每毫升0-40μg Triton的範圍上建立了3條校準曲線。並利用線性回歸對這些數據進行分析。
可以斷定，在測試的濃度範圍內(0-40μg/ml)，比色法呈線性，並且精密而又準確。假設LOQ為6μg/ml，那麼可獲得精密而又準確的結果的範圍為6-40μg/ml。所含Triton濃度在40μg/ml以上的樣品則應稀釋後再進行重複測試。4.4.3.5特異性由於無法獲得不含Triton的完全「純淨的」lipo-OspA，因此通過檢驗是否產物中存在該物質會影響其測定的方法不能對該測定方法的特異性進行驗證。但是，如前所述，通過在各樣品分析中減去由空白樣品(不含鈷試劑的樣品)獲得的結果而將大批量產物中在相同波長(320nm)下具有吸收的所有幹擾成分均考慮在內。
由兩種不同濃度的峰值獲得的回收率均很理想，這也表明除Triton以外的其它成分均不造成重大幹擾。4.4.3.6結論根據以上數據可以斷定，用於測定大批量lipo-OspA中的Triton的該測試方法適用於其預期用途測定大批量lipo-OspA中的殘留Triton，其規格極限最大為10μg/ml。
比色法可在6-40μg/ml的範圍內給出精密而又準確的結果。應該指出的是，兩次測定的最終實驗結果之間有所不同，因此該值可公布為低於6μg/mL。檢測極限為2μg/mL。通過使用空白而消除了可在320nm下具有吸收的樣品成分所造成的所有幹擾。Triton-鈷複合物的顏色至少在2小時內可保持穩定。實施例5脂蛋白OspA的特性內毒素利用顯色LAL方法進行常規測試利用規格≤5EU每30μg的顯色LAL(鱟變形細胞裂解物)試驗對純化OspA抗原進行內毒素含量的常規測試。該試驗是根據《FDA有關人類與動物醫療品及生物製劑的動力學LAL技術暫行指南》來實施並驗證，該技術指南在《用於人類和動物非腸道藥物、生物製劑及醫療設備的終產物內毒素試驗的鱟變形細胞裂解物試驗驗證準則(1987年12月)》中有所描述。Triton X-100利用比色法進行常規測試由於在純化過程的中間步驟(Q-Sepharose柱之前)加入了TritonX-100，因此利用比色法對其在大批量純化抗原中的含量進行常規測試。1mg/ml脂蛋白OspA溶液中的Triton X-100的量不高於10μg/ml(10ppm或更低)。以30μg劑量的OspA而言，終產物中的殘留量低於300ng/劑(接受標準為低於10g/ml)。
對Triton毒性研究進行文獻檢索未見有肌肉毒性的研究。據報導小鼠在Triton X-100靜脈內給藥後的LD50為1200mg/kg。大腸桿菌雜質利用ELISA和蛋白印記方法進行清除率研究利用兩種分析技術進行清除率研究，以評定該純化方法對大腸桿菌雜質的去除效率。蛋白印記和ELISA試驗的結果表明，該純化方法可一貫地去除雜質蛋白，並且在該純化過程結束時只殘留有極少量的大腸桿菌雜質。利用ELISA試驗可估計出大腸桿菌蛋白的殘留量(＜0.025％)。DNA利用閥值法進行清除率研究針對大腸桿菌雜質，通過一項研究來評定不同純化步驟的DNA清除率，並確定大批量純化抗原中的DNA殘留量。可以斷定，利用該純化方法可有效並一貫地將DNA去除(減少量約為5個log)。DNA的殘留量非常低，使得每30μg劑量(OspA)疫苗中的DNA少於2pg。該數值大大低於WHO諮詢委員會的推薦水平，即100pg細胞DNA/劑(WHO技術報告叢書，747,1987)。SB12利用HPLC-ESMS方法進行清除率研究該清除率研究的結果表明，該純化方法可一貫地將SB12從所得流體中清除(清除係數約為7個log)，使得純化產品中的SB12少於10ppb。該數值遠遠低於參考文獻中描述的不具有毒理學作用的值(37.5μg/ml)〔Speijers et al.，疫苗，7∶364,1989；Speijerset al.，疫苗，6∶419,1988；Ernst and Arditti，毒理學，15:233,1980〕。實施例6脂蛋白OspA的純度和穩定性SDS-PAGE利用SDS-PAGE對若干批次(2×75L,3×20L)的ZS7 OspA進行了分析。各批次的分析結果均顯示出一條表觀分子量為31kD的主要條帶。僅檢測到單一的主要條帶可表明OspA的純度和同質性。將75L批次的樣品於37℃下保溫1周，該處理沒有對其SDS-PAGE模式造成影響，這表明了該蛋白的穩定性。利用來源於ZQ1和ACA1菌株的OspA獲得了類似的結果，但來源於這兩種菌株的OspA蛋白的表觀分子量為30kD。另外這兩種蛋白在60kD處還觀測到了一條較小的二聚體條帶。蛋白印記用單克隆抗體LA2，一種OspA特異性抗體，通過蛋白印記方法對若干批次(2×75L,2×20L)的ZS7 OspA進行了分析。各批次的分析結果均顯示出一條表觀分子量為31kD的主要條帶。僅出現單一的主要條帶可表明OspA的純度和同質性。將75L批次的樣品於37℃下保溫1周，該處理沒有對其蛋白印記模式造成影響。N端序列分析對儲存於4℃並已在37℃下保溫7天的2批20L和2批75L來源於ZS7菌株的OspA以及3批來源於ACA-1菌株的OspA進行了N端序列分析。未修飾脂蛋白OspA(即帶有信號序列的原脂蛋白)的N端序列的檢測信號非常微弱。另外也檢測出非脂化OspA的序列，但其水平非常低。利用該技術得出的結果是未修飾OspA和非脂化(不完全修飾)OspA的水平非常低(即少於總量的1％)，並且未發現產物的裂解片段和其它蛋白雜質，這證明了OspA的高純淨度。由所有批次獲得的數據均一致，這進一步支持了該純化方法的連貫性和同質性。雷射散射分析雷射散射檢測器可測量大分子溶液的15度角散射光的強度。由這些強度可測定溶液中大分子的大小和形狀。將檢測器與洗出脂蛋白的HPLC分子排阻柱相連接。通過在線安裝一臺幹涉折光儀可測量洗脫的脂蛋白量。把所有種類的重量乘以其各自分子量的總和除以所有種類的總重量定義為平均分子量(Mw)。
將2批75L來源於ZS7菌株的OspA在37℃保溫7天前和保溫7天後分別進行測試，計算出的平均分子量均約為500kD(411-581kD)。由3批來源於ACA-1的OspA計算出的平均分子量均為約450kD。37℃保溫0和7天的樣品之間沒有明顯的區別。
另外還對已於4℃儲存12個月的3批來源於ZS7菌株的脂蛋白OspA做了進一步的研究。儲存12個月後的主要OspA的分子量為450-550kD，這表明了OspA微團結構的穩定性。質譜測定法通過電噴射電離作用(PlatformⅡ設備)對已於4℃儲存12個月的3批脂蛋白OspA(來源於ZS7菌株)的分子質量進行了測定。主峰的平均分子量為28523.13+/-0.52道爾頓，這與28523.1道爾頓的預期值非常吻合。另外在28284.81+/-1.32道爾頓位置還有一較小的峰，它相應於失去了一條棕櫚醯脂鏈。於4℃儲存1年後，未觀測到相對於其它降解產物的其它質量，這表明了OspA的穩定性。脂含量測定在鹼解後利用氣相色譜法測定已於4℃儲存1年的3批脂蛋白OspA(ZS7菌株)的脂含量。將釋放的脂肪酸進行甲醇酸解，然後將其作為FAME(脂肪酸甲酯)進行分析。數據分析使用的是配有HP7673自動注射器和HP3365 chemstation模塊的HP5890系列Ⅱ型氣相色譜儀。計算4℃儲存1年前和儲存1年後的脂與蛋白的比率。在實驗誤差範圍內，鹼解使0和1年的脂蛋白OspA均釋放出2條脂鏈。這與脂蛋白OspA的脂鏈連接有2分子酯的預測相一致。附加穩定性研究對0、6、12和24個月(2-8℃下)的2批臨床樣品進行SDS-PAGE、蛋白印記、在Balb/C小鼠中的體內效能(12月時的相對效能為90％或更高，0與24個月樣品之間的相對效能為80％或更高)等測試。結論是OspA的穩定性可於2-8℃下保持多達2年。
該說明書引用的所有出版物，其中包括但不局限於專利和專利申請，在此均引入作為參考，如同各出版物分別特定指出可被完全引入作為參考。
權利要求
1．一種純化疏螺旋體脂蛋白OspA的方法，該方法包括(a)將表達脂蛋白OspA的宿主細胞於存在兩性離子去汙劑的情況下裂解，以形成含有脂蛋白OspA的不純溶液；(b)使不純溶液澄清，以去除宿主細胞碎片；(c)於存在非離子去汙劑的情況下將該不純溶液與陰離子交換樹脂接觸；(d)收集該陰離子交換樹脂的流出物並將該流出物與陽離子交換樹脂接觸；以及(e)實施凝膠過濾步驟洗脫OspA，其中該純化方法的實施無需加熱。
2．權利要求1的方法，其中步驟a、b和c包括(ⅰ)於存在兩性離子去汙劑的情況下將細胞破碎，以形成含有OspA的不純溶液；(ⅱ)將該不純溶液與流化床樹脂接觸，該樹脂含有陽離子交換樹脂；(ⅲ)將OspA從該樹脂上洗脫並將洗出液透濾，藉此將OspA滯留；以及(ⅳ)於存在非離子去汙劑的情況下將滯留物與陰離子交換樹脂接觸。
3．權利要求1的方法，其中不純溶液的澄清方法包括離心。
4．權利要求1的方法，其中非離子去汙劑為一種聚氧乙烯醚。
5．權利要求4的方法，其中聚氧乙烯醚為Triton X-100或Triton X-114。
6．權利要求4的方法，其中聚氧乙烯醚為Triton X-100。
7．權利要求1的方法，其中非離子去汙劑為一種聚氧乙烯山梨糖醇酯。
8．權利要求7的方法，其中聚氧乙烯山梨糖醇酯為吐溫20至吐溫80。
9．權利要求1的方法，其中純化OspA蛋白在1mg/ml的濃度下包含的非離子去汙劑少於1000ppm(0.1％)。
10．權利要求9的方法，其中純化OspA蛋白包含的非離子去汙劑少於100ppm。
11．權利要求10的方法，其中純化OspA蛋白包含的非離子去汙劑少於10ppm。
12．權利要求1的方法，其中兩性離子去汙劑為一種N-烷基-N,N-二甲胺基-1-丙磺酸酯。
13．權利要求12的方法，其中N-烷基-N,N-二甲胺基-1-丙磺酸酯為SB8-SB18。
14．權利要求12的方法，其中N-烷基-N,N-二甲胺基-1-丙磺酸酯為SB12。
15．權利要求1的方法，其中純化OspA蛋白在1mg/ml的濃度下包含的所述兩性離子去汙劑少於1000ppb(1ppm)。
16．權利要求15的方法，其中純化OspA蛋白包含的所述兩性離子去汙劑少於100ppb(0.1ppm)。
17．權利要求16的方法，其中純化OspA蛋白包含的所述兩性離子去汙劑少於10ppb(0.01ppm)。
18．權利要求1的方法，其中該方法在凝膠過濾後額外包括過濾除菌。
19．不含去汙劑的純化脂蛋白OspA。
20．權利要求19的OspA，該OspA適於人類臨床應用。
全文摘要
本發明提供一種方法,用於純化適於人類臨床應用的疏螺旋體脂蛋白OspA,該方法是將表達脂蛋白OspA的宿主細胞於存在兩性離子去汙劑的情況下裂解,然後在非離子去汙劑中實施若干層析步驟。
文檔編號C07K1/00GK1311795SQ99809060
公開日2001年9月5日 申請日期1999年5月25日 優先權日1998年5月26日
發明者P·德斯蒙斯, R·利維恩斯, E·默滕斯, B·錢普盧維爾, D·普萊恩錢普, Y·科拉扎 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司