結構型核酸指導的化學合成的製作方法

2023-05-29 08:38:51

專利名稱：結構型核酸指導的化學合成的製作方法
技術領域：
本發明提供了用於體外DNA展示技術的組合物和方法，所述技術允許展示各種分子，例如非天然的聚合物和小分子。此類方法的優點是可以構建組合文庫並對其實施關於所需活性的選擇、擴增和多樣化的循環，從而允許分子進化。
背景已開發了展示技術以組合核酸的信息儲存和擴增能力與其他化合物的功能活性。展示技術依賴於功能實體和提供關於功能實體結構信息的核酸序列之間的關聯。此類方法的優點是可以構建非常大型的文庫，並就功能實體的所需活性進行探查。然後，具有所需活性的文庫成員可以與不具有所需活性的文庫成員分開，從而形成富集文庫(enriched library)，其具有更大部分的具有所需活性的成員。這種方法被稱為選擇。隨後，富集文庫中的文庫成員的結構可以通過其同族(cognate)核酸序列進行鑑定，從而甚至允許從微量的材料進行鑑定。
一些展示技術進一步允許擴增富集文庫而無需知道其成員的同一性；不僅是核酸序列而且還有功能實體。此類展示技術被稱為「可擴增的展示技術」。當處理大型文庫時這些技術特別有利，因為可以進行選擇和擴增的重複循環，允許所需活性的富集增加。可擴增的展示技術的另一優點是可以進行選擇、擴增和多樣化的循環，從而利用與自然選擇相同的原理進化具有所需功能的分子。這個過程被稱為分子進化。
已開發出了利用生物系統的展示技術，其中最著名的是噬菌體展示技術(Smith，Science，228，1315-7，1985)。然而，此類系統局限於展示天然發生的產物例如蛋白質和肽。
利用有機化學的靈活性(flexibility)的體外展示技術已得到描述。一個實例公開於US5723598中。該方法利用雙官能團的分子；一個官能度能夠接受化學基團和另一個官能度能夠接受核酸序列。用於合成此類文庫的方法通常稱為「拆開(split)和混合」，由將雙官能團分子混合和拆開為隔間(compartment)的循環組成。加入隔間特異性的化學基團和核酸序列對。從而使得核酸序列編碼化學基團。隨後將所有的雙官能團分子混合併重複該過程以產生大型的組合文庫。隨後對文庫實施選擇並通過PCR擴增所選擇的核酸序列，所述核酸序列可以用於通過常規分子生物學方法進行鑑定；克隆和DNA測序。
另一實例公開於WO04/039825A2中，其中如此來製備組合文庫，即循環進行在接近度(proximity)指導下向雙官能團分子添加化學基團和核酸密碼的同族對；所述雙官能團分子具有1個能夠接受化學基團的官能度和1個能夠接受核酸序列的官能度。此外，使用所謂的轉移單元的集合(repertoire)，其中化學基團與寡核苷酸聯接(attach)，所述寡核苷酸包含編碼區段(segment)和能夠與雙官能團分子退火的區段。轉移單元的集合與雙官能團分子退火，這允許密碼被酶促轉移給雙官能團分子，以及指導化學基團與完全相同的雙官能團分子反應。這個過程可以重複以形成大型組合文庫。
可以對上述文庫實施選擇以形成富集文庫。隨後通過編碼性核酸可以推導出富集文庫成員的合成史。然而，這些方法的局限性是不能擴增富集文庫。
已經描述了利用有機化學的靈活性以及選擇、擴增和多樣化的循環的體外展示技術。這些方法依賴模板的使用。
一個利用「拆開和混合」原理的實例描述於WO00/23458中。使用ssDNA模板文庫，每個模板包含化學反應位點和幾個位置的密碼子區段。通過與對於給定密碼子位置的反密碼子序列的集合雜交來分隔模板。隨後，進行隔間特異性的化學反應以修飾模板上的反應位點。隨後將模板混合，並通過使用其他密碼子位置重複該過程以形成組合文庫。
另一個利用「單罐(single-pot)」原理的實例描述於WO02/074929A2中。使用寡核苷酸模板文庫，每個模板包含化學反應位點和幾個位置的密碼子區段。此外，利用轉移單元的集合，該方法由寡核苷酸反密碼子序列和化學反應性基團組成。模板文庫與對於給定密碼子位置的轉移單元的集合雜交。這使在雜交的轉移單元上的化學基團與在雜交的模板上的反應位點接近，因此這指導同族對的化學反應。隨後，利用其他密碼子位置來重複這個過程以形成組合文庫。
上述用接近度來指導密碼和化學基團的同族對的局限性在於模板寡核苷酸的線性結構。作為線性的結果，密碼子和化學反應位點之間的距離將會隨著密碼子位置不同而不同。對於離反應位點較遠的密碼子位置，接近度指導變弱，因為局部濃度作為距離的函數以三次方的方式下降。對於含有較多密碼子位置和較複雜密碼子的複雜文庫，這個缺點變得更為明顯。這個問題在WO04/016767A2中得到解決，其中轉移單元除反密碼子區段外還包含恆定區段，所述恆定區段與模板上靠近反應位點的恆定序列互補。因此，通過使轉移單元與模板雜交導致所討論的密碼子位置和恆定區段之間的模板序列被凸出，以形成所謂的ω結構。構想是，密碼子區段負責特異性和恆定區段負責接近度。WO04/016767A2還提出了所謂的模板的T-構造，其中模板上的反應位點位於模板中間，密碼子位置散布在每一側。因此，距離問題是所謂的「切成兩半(cut in half)」。
WO2004/056994A2公開了與WO02/074929A2或WO04/016767A2相似的方法，差別是將模板切成較小的序列，在申請中稱為連接性多核苷酸。連接性多核苷酸連接轉移單元以使這些達到反應接近度。在某些實施方案中，連接性多核苷酸可以包括反應化學基團。為了獲得編碼的分子，該方法依賴於反應前的密碼子/反密碼子識別。
隨後，對上述模板指導的文庫實施選擇以形成富集文庫。然後，通過編碼性核酸可以推導出富集文庫成員的合成史。通過例如易錯PCR還可以擴增富集文庫並使其多樣化，從而允許分子進化。
這些方法的局限性是，必須產生大量模板，這是繁瑣的，因為模板必須具有相當的長度以確保正確的密碼子/反密碼子雜交。在使用多個較小序列來進行最終經指導的合成的方法中，待合成的序列的數目比實際的文庫大小高得多。
利用模板的現有技術方法具有這樣的缺點，即編碼依賴於密碼子和反密碼子序列的雜交。有時，單鏈寡核苷酸之間的雜交將無需精確的互補性而進行。在文庫構建的情況下，結果是編碼和合成史之間的關聯喪失。因此，在選擇時，正密碼可以是被取消選擇的和負密碼可以是被選擇的。對於較複雜的文庫，這個缺點變得更為明顯，因為相對於數目、長度和序列，單鏈寡核苷酸的複雜性也增加。這使得該過程更難以控制。
如上所述，允許展示各種化合物種類、選擇、擴增和多樣化的體外展示技術已得到開發。然而，仍需要不斷改進，特別是關於文庫構建和多樣化的質量。本發明提供了用於產生所編碼的分子的方法，其中該方法不需要預先合成大量模板。此外，本方法不依賴於密碼子/反密碼子識別來形成所編碼的分子。
發明概述本發明涉及體外展示技術，其利用有機化學的靈活性，並允許選擇、擴增和多樣化的循環。
特別地，本發明涉及包含核酸和化學化合物的組合物，所述組合物形成限定從反應中心延伸的3個或更多個幹的星形結構，其中所述幹由核酸雙鏈體形成，並且所述化學化合物已作為3個或更多個化學基團的反應產物在反應中心形成。
核酸形成超級結構，其中不同的區段互相雜交從而形成類似星的的結構。星形結構包括反應中心和多個幹。在反應中心內，化學化合物已作為3個或更多個化學基團的反應產物進行製備。幹是核酸雙鏈體，即幹包括2個互相互補的雜交區段，它們的互補性足以在有利於化學基團反應的條件下形成雙鏈體以便形成化學化合物。
至少一個幹從中心放射狀延伸。適當地，3個或更多個幹從反應中心放射狀向外延伸。認為幹的雙鏈體核酸將化學基團聚集在一起以便獲得反應接近度。化學基團之間建立的接近度增加了局部濃度並提高了反應發生的機會。星形結構中3個或更多個幹的存在創造了強的超級結構，它甚至在其中單個雙鏈體將分開成為兩個分離的單鏈核酸的條件下也是穩定的。因此，星形結構使得能夠使用通用的反應條件以促進化學基團之間的反應。本文報導的實驗顯示，3個幹的星形結構對於指導介質中的有機合成來說足夠穩定，所述介質包含過量的35％乙腈和四氫呋喃和過量的40％DMF。在本發明的某些實施方案中，星形結構包括4、5、6、7個或更多個與共同的反應中心相連的幹。當幹的數目增加時，星形結構的穩定性也增加。
核酸被劃分為具有某功能的各個部分。在本發明的某一方面，核酸包括鑑定所述一種或多種化學基團的一種或多種密碼子，所述化學基團已參與所形成的化學化合物的形成。密碼子區段的存在使得不僅能夠利用核酸來促進反應接近度，還能夠利用核酸來編碼已參與化學化合物形成的一種或多種化學基團。一種或多種密碼子的存在對於解碼目的特別有用。當所形成的化學化合物以少量存在或以與其他化合物的混合物形式存在時，通過分子生物學技術可以很容易地進行鑑定。
鑑定化學基團的密碼子可以存在於形成星形結構的核酸的任何地方，即密碼子可以存在於反應中心或存在於反應中心附近，存在於雜交區段中或存在於星形結構的其他部分中。在本發明的某一方面，密碼子位於幹的末端。位於幹的指向遠離中心的末端的密碼子允許更自由地設計核酸星形結構，因為末端的密碼子無需參與雙鏈體的形成或反應中心環境的形成。
幹可以具有平頭末端、粘性末端，或可以存在環。當它計劃連接幹與另一核酸時，具有平頭末端或粘性末端的幹可能是優選的。在某一實施方案中，環在幹的末端形成。環在兩條鏈之間形成物理連接，從而在核酸超級結構的各個部分之間形成共價鍵。在某一實施方案中，環存在於幹的所有末端以便形成環狀核酸。在另一實施方案中，環存在於除了一個以外的所述幹的所有末端上，以便形成鄰接的核酸序列。適當地，鄰接的序列包括引發位點以利用聚合酶或另一種核酸活性酶來酶促延伸核酸。在適當的情況下，引發位點存在於沒有環的幹上。適當地，核酸包含用於DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶的引發位點。因此，環使得能夠製備展示所形成的化學化合物的雙鏈延伸產物。
重要地，延伸產物包括通常線性的雙鏈體，即互補性鏈已通過延伸反應形成。延伸反應破壞反應中心，因此先前通過反應中心中的反應而形成的化學化合物展示於介質中。如本說明書稍後討論的，化學化合物的展示使得能夠利用關於延伸產物文庫的各種選擇策略。
選擇後，擴增核酸的可能性與鑑定目的特別相關，因為化學化合物可以被鑑定甚至在其中它只以微量濃度出現的情況下。鄰接的核酸序列適當地包括所有反應物的密碼子，所述反應物已參與所編碼的化學化合物的形成。
在本發明的一個特別優選的實施方案中，密碼子位於幹-環結構的非鹼基配對部分。在環中密碼子的存在允許在設計中利用核苷酸的任何組合，因為密碼子的特異性序列對於雜交和反應能力沒有實質影響。
在本發明的一些方面，限制酶切位點存在於幹-環結構中。取決於所使用的特異性核酸內切酶，可以打斷幹-環結構的一條或兩條鏈。在某一實施方案中，只有靠近環的一條鏈是有缺口的，由此形成單鏈核酸區段。所述單鏈核酸區段合適地包含密碼子。對於這個目的有用的酶是N.Bbvc IA。在另一實施方案中，打斷兩條鏈，並形成粘性末端，即單鏈核酸突出部分。適當地，密碼子存在於單鏈突出部分中。在本發明的一個方面，優選加入至少與環的部分核酸序列互補的輔助寡核苷酸。在適當的條件下，輔助寡核苷酸與環序列雜交並形成適合於限制性內切酶的底物。
星形結構的幹可以具有任何合適的長度。一般地，幹包括具有至少80％互補性的2個雜交區段，並且每個雜交區段由12個或更多個核苷酸組成。互補性一般為90％或以上，例如95％或以上。對於某些應用雜交區段可以包含少於12個核苷酸，在所述應用中星形結構的穩定性可以分給例如11、10、9、8、7或6個核苷酸。然而，一般而言，高穩定性是希望的。在大多數條件下的適當穩定性一般在每個雜交區段包含18個或更多個核苷酸時獲得。當使用不利於雜交的條件時，即遠高於環境的溫度、高鹽濃度、或存在有機溶劑，通常使用含20個或更多個核苷酸的雜交區段。
單個的化學基團反應後，所形成的化學化合物優選與核酸共價聯接。在某些應用中，可能希望利用雜交將所形成的化學化合物與星形結構的核酸聯接；然而，共價聯接確保化學化合物和核酸部分在後續選擇過程中仍在一起。
在反應中心反應的化學基團可以以任何適當的方式與核酸締合(associate)。例如，反應前的化學基團與核酸共價聯接。通常地，一個或多個共價聯接在與反應同時或在反應後進行切割。共價鍵可以設計為可切割的或耐久的。此外，可切割的鍵可以設計為緊在反應後被切割或設計為在反應後的步驟中被切割。
通常地，化學化合物通過聯接在核酸上的化學基團與任選的一種或多種另外的反應物反應而形成。所述反應物可以來源於任何來源，包括作為不與核酸締合的游離反應物加入到介質中的化合物。所述另外的反應物可以是支架、交聯劑、活化劑、脫保護劑等。
根據本發明的星形結構可用於產生與遺傳密碼相關聯的不同化學化合物的文庫。因此，本發明還涉及星形結構文庫。每個星形結構可以以幾個拷貝的形式存在於介質中，並且介質一般包括包含不同化學化合物的星形結構。例如，本發明的文庫可以包括至少1000種不同的化學化合物，優選106種不同的化學化合物，和更優選109種不同的化學化合物。
在另一方面，本發明還可以描述為涉及例如用於合成大型文庫的方法，所述文庫通過由互相互補的寡核苷酸所形成的「星形結構」與編碼性核酸相關聯。這通過使包含2個區段的寡核苷酸雜交來獲得，其中一個寡核苷酸的朝向3′末端的區段與下一個寡核苷酸中朝向5′末端的區段雜交，等等。最終，最後一個寡核苷酸的朝向3′末端的區段與第一個寡核苷酸的朝向5′末端的區段雜交。因此，每個寡核苷酸上的2個雜交區段之間的中間部分指向所形成的環的中心，而末端指向外面，得到星形結構。因此，當使用3種類型的寡核苷酸時，形成3個幹，當使用4種類型的寡核苷酸時，形成4個幹，等等。化學反應性基團與每個寡核苷酸上的中間部分締合，從而允許由接近度指導在中心發生化學反應。此外，密碼子方便地位於每個寡核苷酸上的雜交區段的外部，從而允許參與形成反應產物的化學基團的編碼。具有締合的化學基團的寡核苷酸在本文中被稱為載體模塊(carriermodule)。因此，載體模塊含有化學基團、2個位置特異性區段和密碼子。當使用對於每個位置的載體模塊的集合時，允許形成編碼的組合文庫。根據某一實施方案，當每個幹中除了一個末端以外的末端經環形成而進行連接以形成具有5′和3′末端的連續的寡核苷酸時，使經裝配的寡核苷酸變得可延伸或可擴增。因此，由1個幹和多個幹-環組成的星形結構可以通過PCR進行擴增或用合適的酶進行延伸。因此，可以對組合的展示文庫實施選擇，並通過其編碼性寡核苷酸來鑑定富集文庫成員。
相應地，本發明的一個方面涉及用於形成一種或多種化學結構的方法，其包括下列步驟(i)提供N(N＝3至100)個載體模塊，其包括(1)第1個位置的載體模塊，具有i)能夠與第N個位置的載體模塊的核酸區段雜交的核酸區段，和ii)能夠與第2個位置的載體模塊的區段雜交的核酸區段，(2)第n個位置的載體模塊(n＝2至N-1)，具有能夠與第n-1個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與第n+1個載體模塊的區段雜交的核酸區段，和(3)第N個位置的載體模塊，具有能夠與所述第N-1個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與所述第1個載體模塊的區段雜交的核酸區段，其中至少3個所述載體模塊包含位於在所述雜交區段之間的中間部分或其附近的締合的化學基團(CG)，和任選地包含位於所述雜交區段之一的外部的密碼子區段；(ii)在允許所述雜交區段進行雜交的條件下使所述載體模塊接觸，從而使所述化學基團接近，其中所述形成的化學化合物與至少一個所述載體模塊締合。
N指在化學結構的形成中使用的載體模塊的總數目。因此，當在化學結構的形成中使用3個載體模塊時，N為3，當在化學結構的形成中使用4個載體模塊時，N為4，等等。n指載體模塊的特定位置。
因此，當N為3時，(1)使用的第1個位置的載體模塊具有能夠與第3個位置的載體模塊的核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與第2個位置的載體模塊的區段雜交的核酸區段；(2)(n＝2)使用的第2個位置的載體模塊具有能夠與第1個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與第3個載體模塊的區段雜交的核酸區段；和(3)使用的第3個位置的載體模塊具有能夠與所述第2個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與所述第1個載體模塊的區段雜交的核酸區段。
當N為4時，(1)使用的第1個位置的載體模塊具有能夠與第4個位置的載體模塊的核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與第2個位置的載體模塊的區段雜交的核酸區段；(2)(n＝2)使用的第2個位置的載體模塊具有能夠與第1個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與第3個載體模塊的區段雜交的核酸區段；和(n＝3)使用的第3個位置的載體模塊具有能夠與第2個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與第4個載體模塊的區段雜交的核酸區段；和(3)使用的第4個位置的載體模塊具有能夠與所述第3個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與所述第1個載體模塊的區段雜交的核酸區段。
當N為5時，(1)使用的第1個位置的載體模塊具有能夠與第5個位置的載體模塊的核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與第2個位置的載體模塊的區段雜交的核酸區段；(2)(n＝2)使用的第2個位置的載體模塊具有能夠與第1個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與第3個載體模塊的區段雜交的核酸區段；和(n＝3)使用的第3個位置的載體模塊具有能夠與第2個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與第4個載體模塊的區段雜交的核酸區段；和(n＝4)使用的第4個位置的載體模塊具有能夠與第3個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與第5個載體模塊的區段雜交的核酸區段；和(3)使用的第5個位置的載體模塊具有能夠與所述第4個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與所述第1個載體模塊的區段雜交的核酸區段。
上述方法隨後可以是下列步驟提供允許第n-1個模塊與第n個模塊以及第N-1個模塊與第N個模塊的末端進行連接的條件，從而形成具有幹-環結構和締合的化學化合物的鄰接的核酸分子。因此，當N為3時，允許第1個模塊的末端與第2個模塊的末端連接，並且允許第2個模塊的末端與第3個模塊連接。當N為4時，(n＝2)允許第1個模塊的末端與第2個模塊的末端連接，(n＝3)允許第2個模塊的末端與第3個模塊連接，並且允許第3個模塊的末端與第4個模塊連接。當N為5時，(n＝2)允許第1個模塊的末端與第2個模塊的末端連接，(n＝3)允許第2個模塊的末端與第3個模塊連接，(n＝4)允許第3個模塊的末端與第4個模塊連接，並且允許第4個模塊的末端與第5個模塊的末端連接。
根據本發明的進一步的方面，第N個位置的載體模塊可以與第1個載體模塊連接，以便形成環狀核酸。
根據上述方法製備的包含核酸結構和締合的化學化合物的組合物是新型的，因為載體模塊形成的新型「星形結構」不同於現有技術形成的結構。參見例如在上文的背景部分中所討論的現有技術。
在本發明的一個優選方面，提供了方法，它確保反應化學基團之間的高度接近度和所形成的化學化合物的合成史的完整遺傳密碼的擴增。因此，在一個優選方面，本方法包括在允許雜交區段進行雜交的條件下使載體模塊接觸，從而使反應性基團達到反應接近度；和提供允許反應性基團進行反應的條件，其中所形成的化學化合物與至少一個載體模塊締合；和允許第n-1個模塊與第n個模塊以及第N-1個模塊與第N個模塊的末端進行連接的條件，從而形成具有幹-環結構和締合的化學化合物的鄰接的核酸分子。
根據一個優選實施方案，N為3、4、5、6、7。還優選地，每個載體模塊包含位於在雜交區段之間的中間部分或其附近的締合的化學基團(CG)，和位於雜交區段之一的外部的密碼子區段。
載體模塊的接觸可以順次進行，即載體模塊可以以任何順序在單個載體模塊之間進行接觸，或接觸可以同時進行，即所有的載體模塊或至少實質量的載體模塊在雜交條件下混合在一起以便形成超分子複合物。當進行化學基團的順次反應並且只使用裝配整個星形結構所需的載體模塊總量的一部分時，可以使用輔助性寡核苷酸來裝配星形結構，由此形成反應中心。因此，當在化學化合物形成中的步驟涉及通過各自雜交區段的雜交來裝配2個載體模塊時，可以加入具有與未雜交的雜交區段逆向互補的區段的輔助性寡核苷酸以形成星形結構。
在聯接至載體模塊的化學基團已在反應中心中緊密接近後，實施反應。可以設計化學基團從而使得當基團進入互相的反應距離時反應立即發生，或可以設計基團從而使得外部組分是反應發生所必需的。外部組分可以是實現反應的反應物、光子、電磁或任何其他刺激。在本發明的某一方面，使用正交化學(orthogonal chemistry)，即設計化學基團從而使得反應順序是被指導的。
反應中心由環繞所述中心的幹限定。已提出，反應中心中2個反應物之間的距離少於10nm。假定反應中心是球形的；則可以計算出反應物的濃度為1mM。在生物學的情況下，這種大小的濃度被視為高濃度，並且可以假定反應在合理的時間內進行。此外，當載體模塊已按經調整的摩爾量進行給予時，介質中游離反應物的濃度非常低，因此反應中心中的反應比非指導的反應要有利得多。
載體模塊的中間部分可以包含任何適當的化學基團。為了允許通過例如聚合酶進行酶促延伸，載體模塊的中間部分合適地包含化學鍵或1-20個核苷酸。可以修飾核苷酸以在反應中心中獲得某些反應條件。例如，可以用親脂性基團修飾中間部分的核苷酸以提供締合的化學基團的高可動性和反應性。化學基團可以與各種不同位置處的載體模塊相締合。在一個方面，化學基團與中間部分的核鹼基(nucleobase)締合。在另一方面，化學基團與中間部分的磷酸二酯鍵締合。
當化學基團與主鏈聯接時，聯接點一般在核苷間鍵的磷上。當核鹼基用於聯接化學基團時，聯接點通常在嘌呤或7-脫氮-嘌呤的第7位上或在嘧啶的第5位上。核苷酸可以通過間隔物部分而與化學基團的反應性基團隔開。可以設計間隔物從而使得由該反應性基團所取樣的構象空間對於與在反應中心中的另一化學基團的反應性基團的反應來說是優化的。一般而言，化學基團通過一個或多個共價鍵與中間部分締合。
連接可以在反應前、反應同時或反應後進行，並且連接可以根據實驗者的選擇而酶促或化學地進行。為了減少介質中游離的未雜交的載體模塊的量，一般希望在反應前連接載體模塊。
所形成的化學化合物可以通過各種化學相互作用與核酸締合。根據一個優選方面，所形成的化學化合物與至少一個所述載體模塊或連續的核酸分子共價締合。在所形成的化學化合物和核酸之間的相對較強的締合，例如共價連結，在篩選文庫的過程中是有用的，因為我們可能需要嚴苛的條件，所述嚴苛的條件可以破壞較弱的鍵，例如氫鍵。
在本發明的一個優選方面，提供具有用於DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶的引發位點的一個或多個載體模塊。引發位點的存在幫助擴增對於化學基團的遺傳密碼，所述化學基團已在化學化合物的形成中發生反應。當不存在連接時，即對於每個化學基團的遺傳密碼保留了通過雜交聚攏的分開的實體，優選地每個載體模塊包含引發位點。在已進行文庫選擇後，可以獲得關於哪些化學基團已參與成功的化學化合物形成的信息，所述成功的化學化合物即具有所需特性的化學化合物。獲得這種信息的一種方法是通過眾所周知的方法例如QPCR或與微陣列相組合的標準PCR來定量擴增產物。該信息可以在多樣性減少的第2代文庫的形成中使用，因為只需要在文庫中包括成功的載體模塊。多樣性減少的文庫也是集中的(focused)文庫，因為具有所需特性的化學化合物的豐度更高。
當2個或更多個載體模塊連接在一起時，可以獲得反應物的信息，所述反應物已一起參與具有所需特性的化學化合物的形成。優選地，所有的載體模塊連接在一起以便形成線性核酸或環狀核酸。因此，當2個或更多個載體模塊連接在一起時，需要單個引發位點以擴增包含2個密碼子的鄰接的核酸。根據一個優選實施方案，本發明方法包括至少在第1個載體模塊和/或第N個載體模塊中的用於DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶的引發位點。當所有的載體模塊連接在一起時，即第1個載體模塊與第n(n＝2至N-1)個載體模塊連接，所述第n個載體模塊與第N個載體模塊連接，當引發位點位於末端之一時，可以延伸核酸。為了減少所形成的化學化合物仍隱藏在反應中心中的風險，優選在選擇過程前進行延伸。鄰接核苷酸的延伸有效地將所形成的化學化合物展示給介質和可能存在於其中的任何靶。
優選地，用於正向引物雜交的引發位點位於一個末端，和用於反向引物雜交的引發位點位於另一個末端，從而允許根據聚合酶鏈式反應(PCR)的規程進行擴增。合適地，在已進行選擇後進行PCR擴增以產生具有所需特性的結構的遺傳材料的更多拷貝。
因此，本發明的第二個方面涉及組合物，其包含核酸和締合的化學化合物的結構或超過一種此類結構的文庫，所述結構可通過上述方法獲得。
通過使用一個或多個位置上的載體模塊的集合可以形成與編碼化學基團的核酸締合的化學化合物的文庫，所述化學基團已參與所述化學化合物的形成。
如本文所述的文庫可以用於篩選目的化合物。一般希望文庫儘可能大以增加發現具有所需特性的化合物的可能性。在本發明的某一方面，目的化合物的特性是與靶結合的能力。一般地，假定發現對於靶具有高親和力和特異性的化合物的可能性隨著文庫大小增加而增加。因此，根據本發明的文庫合適地包括超過103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014個與編碼合成史的核酸締合的不同化學化合物。
為了獲得文庫，可以使用在許多位置上的載體模塊的集合。在本發明的一個方面，至少一個位置上的集合包括至少10個不同的載體模塊。在某一方面，至少2個位置上的集合包括至少10個不同的載體模塊。為了在同一容器中獲得含一百萬種不同化學化合物的文庫，利用在3個不同位置上的100個載體模塊可以形成本發明的多重結構。換言之，正好300個載體模塊的合成使得能夠形成含一百萬種化學化合物的文庫。類似地，利用在4個不同位置上的100個載體模塊可以形成含一億種化學化合物的文庫。
本發明還涉及用於執行模塊置換的方法。該方法包括下列步驟a)提供單鏈的鄰接核酸序列，其包含N個雜交區段和互補性雜交區段以及N-1個在所述雜交區段與所述互補性雜交區段之間的非雜交性區段，b)在有利於分子內雜交的條件下使核酸雜交，從而形成至少包含N-1個幹-環和1個幹的連續的核酸；c)在所述幹或環中導入斷口(break)，從而產生至少包含密碼子區段的突出部分；d)提供第1組載體模塊，其至少具有能夠與所述幹雜交的核酸區段、能夠與相鄰的幹-環的幹雜交的核酸區段、任選的締合的反應性基團、和反密碼子區段；d)提供允許密碼子和反密碼子區段雜交的條件；和e)提供允許所述雜交的載體模塊與所述突出部分的隱性(recessive)末端進行酶促或化學連接的條件；並施行下列步驟
i)用限制性內切酶消化與所述密碼子序列相鄰的幹-環的幹或環，從而製成至少包含下一個密碼子區段的突出部分；和ii)使核酸變性；和iii)在有利於分子內雜交的條件下進行雜交，從而形成N-1個幹-環和具有至少包含所述下一個密碼子區段的突出部分的1個幹；和iv)任選地提供允許所述反應性基團進行反應的條件，其中所形成的化學化合物與至少一個所述載體模塊締合；和v)提供下一組載體模塊，其至少具有能夠與所述幹雜交的核酸區段，和能夠與所述相鄰的幹-環的幹雜交的核酸區段，和任選地具有締合的反應性基團，和具有反密碼子區段；和vi)提供允許雜交的載體模塊與所述突出部分的隱性末端進行酶促或化學連接的條件；和將步驟i)至vi)重複N-1次；和f)在部分由所述第1組載體模塊組成的所述幹-環結構中導入斷口，至少讓所述反密碼子區段與所述第1個載體模塊相連；和g)使核酸變性；和h)在有利於分子內雜交的條件下進行雜交，從而形成N-1個幹-環和1個幹；和i)任選地，提供允許所述反應性基團進行反應的條件，其中所形成的化學化合物與至少一個所述載體模塊締合。
步驟a)中使用的鄰接的核酸序列可以由許多來源提供。根據第一個方面，核酸通過上述方法提供，然而使用不攜帶化學基團的偽載體模塊。當表示載體模塊的這些核酸連接在一起時，形成線性或環狀核酸。根據第二個方面，步驟a)的鄰接的核酸序列可通過施行酶促延伸反應而獲得以展示所形成的化學化合物。因此，在星形結構形成後，在步驟a)中可以使用單鏈延伸產物或與延伸產物互補的鏈。必要時，可以對延伸產物實施多核苷酸擴增，例如PCR，以擴增所述核酸的拷貝數。
在某一方面，步驟a)、b)或c)中的鄰接的核酸序列通過下列步驟獲得將所述PCR產物的有義鏈固定在固體支持物上，分離所述固體支持物，允許所述有義鏈自雜交以便形成所述星形結構，和任選地，打斷聯接所述自雜交的星形結構與所述固體支持物的幹，從而從所述固體支持物釋放出所述星形結構。
固定有義鏈的一種合適的方法是將生物素聯接在產生有義鏈的引物上。然後，可以將有義鏈聯接在固體支持物上，例如用鏈黴抗生物素蛋白包被的珠。取決於固體支持物的特性，它可以通過多種方法從剩餘介質中分離。目前，優選使用磁性珠，其可以容易地通過磁體進行分離。在將固體支持物洗滌過多次後，允許有義鏈自雜交以重新形成星形結構。在一個優選的方面，通過瞬間冷卻來進行重摺疊。星形結構可以在模塊置換過程中自始至終保留在固體支持物上，或星形結構可以從固體支持物上切割下來。合適地，用限制性內切酶來切割聯接固體支持物與重摺疊的星形結構的幹。限制性內切酶進行切割的能力實際上是確定分子內摺疊的測試。
在本發明的某些方面，在環中切割星形結構可能是合適的。因為大多數限制性內切酶只識別雙鏈核酸作為底物，所以不可能利用限制性內切酶立即在環中切割。因此，本發明包括在消化步驟前加入與環序列互補的輔助寡核苷酸的另外步驟，以在環中形成適合於限制性內切酶的雙鏈底物。
本發明還涉及用於篩選含有超過一種化學化合物的文庫的方法，其包括在所述文庫中探查有著具有所需特性的化學化合物的文庫成員；將具有所需特性的文庫成員與不具有所需特性的文庫成員分開；和從而獲得具有所需特性的文庫成員的富集匯集物(enrichedpool)。
必要時，可以分離並表徵具有所需特性的文庫成員的富集匯集物。然而，這種方法的優點之一是無需分離富集匯集物。在一個優選實施方案中，對富集匯集物實施核酸擴增法以增加指示具有所需特性的化學化合物的合成史的遺傳材料。經擴增的核酸匯集物(pool)代表了具有所需特性的化合物的富集文庫，所述匯集物可以被解碼以便鑑定參與合成具有所需特性的化學化合物的反應物。然而，如果富集匯集物大於能夠容易解碼的核酸總量時，則本發明提供了利用上述執行模件置換的方法來重新裝配由富集文庫成員或代表此類富集文庫的核酸編碼的化學化合物的可能性。
在一個實施方案中，本發明提供了用於擴增具有所需特性的文庫成員的富集匯集物的方法。該方法包括允許經PCR擴增的寡核苷酸在有利於分子內雜交的條件下進行雜交，由此重新形成由一個幹和多個幹-環組成的星形結構。沒有環的幹優選包含限制性內切酶的識別位點，所述酶在其識別序列外部切割並在消化後產生突出部分。可以方便地使用在所形成的突出部分中的序列冗餘性以包含密碼子。隨後，幹的限制性內切酶消化產生關於這個第1個位置的密碼子特異性突出部分。經限制性內切酶消化的星形結構隨後與載體模塊的集合雜交，所述載體模塊包含關於第1個位置的2個恆定區段以及化學基團和反密碼子的同族對。因此，密碼子/反密碼子雜交允許通過DNA連接酶來連接合適的載體模塊和星形結構的對。鄰近的幹-環同樣包含另一種限制性內切酶的識別位點，所述另一種限制性內切酶能夠留下關於這個第2個位置的密碼子特異性突出部分。因此，利用這個第二種限制性內切酶的消化消除了經PCR擴增的第1個模塊與所述結構的其餘部分的共價鍵。使星形結構變性，隨後允許其在有利於分子內雜交的條件下雜交。由此重新形成星形結構，但現在在位置1(具有締合的化學基團)上具有新的載體模塊，並且沒有環的幹現在位於位置2上。這個過程可以循環進行以置換所有的位置，以允許在接近度指導下進行化學基團的正確組合的化學反應。因此，可以進行選擇和擴增循環直至完成所需的富集。
幹中的斷口可以通過多種方法導入，例如通過限制性內切酶，例如RNA酶、核酸內切酶III、核酸內切酶VIII、APE1、Fpg，或通過化學切割或光切割。
在上述模塊置換方法的步驟a)中使用的鄰接的核酸序列可以通過「培育(breeding)」來提供。在某一實施方案中，培育方法包括下列步驟用2種連續的限制性內切酶消化來源於富集文庫的、分子間雜交的核酸結構，所述酶消除了在所討論的模塊和其餘結構之間的共價鍵，使所述經消化的結構變性，允許來自所述經消化的結構的核酸片段再雜交，從而允許交換指定所討論的模塊的核酸部分以獲得培育，和連接所述合適的末端。
根據這種方法，載體模塊或表示載體模塊的核酸部分可以進行改組。所述改組允許基因匯集物的多樣化，類似於在減數分裂生物系統中的培育。當在允許再雜交之前加入在第1代文庫形成中不存在的、表示載體模塊的核酸區段時，這種方法可以被修飾。可替代地，在允許再雜交之前可以就這樣加入載體模塊。當將新的遺傳材料加至基因匯集物時，這類似於在生物系統中的突變。執行文庫世代之間的培育和突變操作的可能性允許在尋找新的藥物候選物中進行與自然進化過程非常類似的進化。
因此，在某一實施方案中，本發明提供了用於富集文庫多樣化的方法，從而允許分子進化。在關於擴增展示文庫的上述方法中，在每一輪模塊置換循環中文庫的一部分用2種連續的限制性內切酶消化，所述限制性內切酶消除了所討論的模塊和其餘結構之間的共價鍵。使星形結構變性並與所討論位置的載體模塊的集合雜交。因此，位置特異性恆定區段指導雜交，相當於形成原始文庫。連接合適的末端，並且將所形成的產物與密碼子指導裝配的文庫的一部分合併，導致多樣化。因此，可以進行選擇、擴增和多樣化的循環，從而允許分子進化。
在另一實施方案中，本發明提供了用於培育富集文庫，從而允許分子進化的方法。在用於擴增展示文庫的上述方法中，在每一輪模塊置換循環中文庫的一部分用2種連續的限制性內切酶消化，所述限制性內切酶消除了所討論的模塊和其餘結構之間的共價鍵。使星形結構變性並雜交。因此，位置特異性恆定區段指導雜交，並允許所討論的模塊進行交換，即培育。連接合適的末端，並且將所形成的產物與密碼子指導裝配的文庫的一部分合併，導致多樣化。因此，可以進行選擇、擴增、多樣化和培育的循環，從而允許分子進化。
在另一實施方案中，本發明提供了用於形成聚合物或小分子的組合展示文庫的方法。通過利用例如正交化學、保護/掩蔽基團、順次混合載體模塊或不含CRG的載體模塊，化學反應可以同時或順次進行。
在一個實施方案中，本發明提供了用於形成催化活性的組合展示文庫的方法。在這一方面，載體模塊與反應位點的官能團締合，並且星形結構提供關於這些官能團三維排列的框架。
上述方面和實施方案顯示了超過現有技術的明顯優點。為了列舉一些，本發明的各種可能的實施方案顯示出一個或多個下列優點1)用於裝配組合展示文庫的獨特方法，2)用於接近度指導化學反應的獨特結構，3)化學反應高度獨立於密碼子序列，因為這些通過恆定區段而與反應位點隔開，4)在擴增展示文庫方面的高度精確性，因為只有在相關位置上的密碼子能夠指導新的載體模塊，因為只有這些包含促進連接的末端，和5)如果偶然發生了不正確的密碼子/反密碼子指導，則編碼和展示之間的關聯仍將存在，因為新的載體模塊提供了CRG和密碼。
附圖簡述

圖1a公開了星形結構形成中的步驟，其中化學基團同時進行反應。
圖1b顯示了星形結構形成中的步驟，其中化學基團順次進行反應。
圖1c公開了採用化學化合物的會聚合成(convergent synthesis)的方法。
圖1d顯示了用於形成文庫的5步驟法，在所述文庫中每個成員有效展示所形成的化學化合物。
圖1e公開了其中在化學基團反應後添加環的方法。
圖2a公開了通過雙特異性寡核苷酸的集合來自裝配組合文庫的方法。
圖3顯示了親和力選擇中的5個步驟。
圖4a公開了文庫形成中的步驟。
圖4b公開了富集文庫的培育和突變的原理。
圖5公開了在導致形成富集文庫的方法中的步驟。
圖6顯示了分子進化的原理。
圖7顯示了涉及固定的底物的一個本發明實施方案。
圖8公開了實施例1的實驗結果。
圖9描述了在實施例2中報導的實驗的結果。
圖10顯示了根據實施例3的實驗的結果。
圖11公開了在實施例4中報導的實驗的結果。
圖12顯示了在實施例5中描述的實驗中獲得的凝膠。
圖13描述了來自實施例6的非變性PAGE凝膠。
圖14顯示了來自在實施例7中報導的實驗的凝膠。
圖15公開了實施例8的重摺疊實驗的凝膠。
圖16是實施例9的設計示意圖。
圖17顯示了由在實施例9中報導的實驗產生的凝膠。
圖18公開了由在實施例9中報導的實驗產生的凝膠。
圖19顯示了在實施例10中報導的反應設計的各種結構。
圖20顯示了由在實施例12中公開的實驗產生的2個凝膠。
圖21公開了來自在實施例13中報導的實驗的凝膠。
圖22顯示了來自在實施例14中報導的實驗的凝膠。
圖23顯示了來自在實施例15中報導的實驗的凝膠。
圖24公開了來自在實施例16中公開的實驗的凝膠。
圖25顯示了在實施例17中顯示的實驗的結果。
圖26公開了在實施例18中所使用的實驗策略的概括略圖。
圖27顯示了在實施例18中所使用的方法的單個步驟的變性PAGE凝膠。
圖28顯示了在實施例18中報導的結合測定的變性PAGE凝膠。
圖29顯示了在實施例18中報導的PCR擴增凝膠。
圖30顯示證明還原性氨化發生的凝膠圖像。
圖31公開了證明脲聯接發生的凝膠圖像。
圖32顯示了關於星形結構的電遷移率的研究的凝膠。
圖33顯示了轉變過程的示意性圖示。
圖34顯示了在實施例22中報導的實驗的結果。
圖35顯示了在實施例22中報導的實驗的結果。
圖36顯示了在實施例22中報導的實驗的結果。
發明詳述核酸如本文所述的由核酸編碼的化學合成允許生產組合展示文庫和進行廣泛多樣的化學化合物例如小分子和非天然聚合物的選擇、擴增和進化。核酸起多重功能的作用，例如，它使化學反應物聚在一起，指導化學反應物的三維排列，儲存關於化學合成史的信息，指導所選擇的化學反應物組合的正確匹配，和允許化學化合物的多樣化和培育。
該方法可以用於同時裝配一個分子、萬億個分子或甚至更多的分子。
該方法允許分離配體或藥物，所述配體或藥物的特性優於通過傳統合理設計和組合的藥物發現方法而分離的那些，因為可以在化學空間內系統搜索具有所需特性的配體。
已顯示，核酸指導的化學合成為廣泛的現象，不僅限於核酸性質的化合物，還可應用於指導在廣泛條件下的廣泛化學反應(WO2004/016767，WO 2002/074929A2)。這特別重要，因為大多數目的分子不類似於核酸或核酸類似物。參與最終化學化合物形成的化學基團可以在一個步驟中轉移至支架上的接受性化學實體，或者化學基團可以在兩個步驟中進行轉移，其中第一個步驟包括化學基團和接受性實體之間的交聯，和第二個步驟包括從載體模塊上切割下化學基團以完成轉移。前一反應類型的反應的例子是已聯接有充當活化劑的經取代的5元N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)環的載體模塊，即在與NHS環相連的氧原子和待轉移的化學基團之間形成不穩定的鍵。化學基團可以轉移給受體親核基團，一般為胺基團，它可以存在於支架上。將其餘片段轉化為反應的離去基團。當化學基團通過羰基與活化劑相連並且受體基團是胺時，支架上形成的鍵將是醯胺鍵。
兩步反應的例子是所謂的烯丙基甘氨酸反應。在第1個步驟中，包括羧酸或其衍生物的化學基團與親核基團例如胺反應。化學基團與烯丙基甘氨酸基團聯接，所述烯丙基甘氨酸基團可以在第2個步驟中被碘切割開以釋放化學基團。兩步反應法更詳細地公開於WO2004/039825中，其內容引入本文作為參考。兩步反應策略的另一例子更詳細地顯示於實施例10中。
在核酸指導下合成組合展示文庫的關鍵重要性是反應物的接近度指導，這確保了反應有效性以及編碼和展示的正確關聯。通過用某種類型的連接體將反應物締合在一起而獲得反應物的接近。接近度也可以描述為局部濃度，這取決於連接體的長度和靈活性(flexibility)。如果假定了連接體的自由靈活性，則通過利用以連接體長度作為半徑的球的體積可以計算出局部濃度。計算球體積的公式為4/3*π*r3。因此，接近度或局部濃度作為連接體長度的函數以三次方的方式下降。例如約10nm的連接體長度將會相當於約1mM的濃度，而100nm的連接體將會相當於約1μM的濃度。有效的有機化學一般在mM至M的濃度範圍內進行。因此，為了確保化學反應的有效性，連接體長度不應明顯地大於10nm。
優選地，反應性基團被帶至小於100nm的反應接近度，更優選小於50nm，更加優選少於25nm，更加優選少於10nm，並最優選少於5nm。
在允許擴增的單罐合成由DNA編碼的展示文庫的現有技術中，使用具有在整個模板長度上分布的密碼子的單鏈DNA模板(WO2004/016767，WO 2002/074929A2)。模板負責從轉移單元集合中募集具有正確的反密碼子序列的轉移單元，從而將模板和轉移單元上的化學基團聚在一起。因此，單鏈模板還充當在模板上的化學基團和與模板雜交的轉移單元上的化學基團之間的連接體。因此，連接體長度以及由此反應物的局部濃度將依賴於所使用的密碼子位置。具有例如20個核苷的未摺疊的(延展的)寡核苷酸將具有約10nm的長度，(6-鍵主鏈間距為約0.63nm)，並且具有200個核苷的寡核苷酸將具有約100nm的長度。因此，明顯長於20個核苷的未摺疊的寡核苷酸(10nm，相當於約1mM的濃度)一般而言將不適合於形成化學反應的接近度指導。
在一個實施方案中，本發明避開了用於使反應物達到反應接近度的延長的核酸結構。這通過選擇合適的寡核苷酸序列來完成，所述寡核苷酸序列能夠摺疊為穩定的三維結構，並從而允許通過被許多核苷分隔的序列位置來進行接近度指導。如圖1a中所示，這通過使用雙特異性寡核苷酸(互相互補的)來完成，其可以雜交為「星形結構」。雙特異性寡核苷酸包含2個區段一個寡核苷酸的朝向3′末端的區段與下一個寡核苷酸中朝向5′末端的區段雜交，等等。最終，最後一個寡核苷酸的朝向3′末端的區段與第一個寡核苷酸的朝向5′末端的區段雜交。因此，每個寡核苷酸上的2個區段之間的中間部分指向中心。該中間部分可以是鍵或區段。相反地，末端指向外部，從而產生星形結構。因此，當使用3種類型的寡核苷酸時，形成3個幹，當使用4種類型的寡核苷酸時，形成4個幹，等等。化學反應性基團(CRG)方便地締合至每個寡核苷酸上的中間部分或其附近。化學反應性基團因此被帶至反應接近度，因為DNA雙螺旋的直徑為約2nm，從而允許在中心或其附近發生接近度指導的化學反應。
進行化學反應從而使得所形成的產物與至少一個寡核苷酸締合。此外，密碼子方便地位於在每個寡核苷酸上的1個或2個雜交的區段的外部，從而允許編碼化學基團。具有締合的化學基團、2個位置特異性雜交區段和密碼子的寡核苷酸被稱為載體模塊。
為了製備可通過例如PCR進行擴增的寡核苷酸的所形成的組合，除了一個以外的每個幹的末端經由環形成而進行連接以形成含有5′和3′末端的連續的寡核苷酸。在一個方面，該結構由1個幹和多個幹-環組成，其可以通過在末端具有PCR引發位點來擴增(圖1d和1e)。可替代地，所有末端被連接從而形成閉合環，其可以通過使用不具有鏈置換活性的DNA聚合酶的引物延伸來擴增。
圖1b中顯示了利用化學基團分步反應的方法。最初，2個載體模塊在雜交條件下接觸。載體模塊A包含雜交區段a，其與載體模塊B的雜交區段a′退火。該退火步驟後，允許載體模塊A上的化學基團CA和載體模塊B上的CB之間發生化學反應。在第3個步驟中，在雜交條件下加入載體模塊C。載體模塊C包含雜交區段b′，其與載體模塊B的雜交區段d互補。產物CA-CB與化學基團CC的反應接近度使得化學反應能夠繼續進行以便產生產物CA-CB-CC。在雜交條件下加入第4個載體模塊D。允許載體模塊D與正在生長的星形結構雜交，以便使反應物CD緊密接近前述反應的反應產物，由此促進反應以產生最終的化學化合物CA-CB-CC-CD。
圖1c公開了會聚合成法，其中起始反應步驟遵循2個分開的途徑。在第1系列反應中，分開地，在第1個容器中載體模塊A和B在雜交條件下接觸。載體模塊A的雜交區段a和載體模塊B的雜交區段a′將互相退火，並且進行反應性基團CA和CB之間的反應。在第2個容器中，載體模塊C和D在雜交條件下混合以便形成雜交產物，其中載體模塊C的雜交區段c與載體模塊D的雜交區段c′退火。隨後，在化學基團CC和化學基團CD之間發生反應以產生中間產物CC-CD。允許中間產物在雜交條件下互相退火，由此形成星形結構。在星形結構形成後，或與此同時，允許2個中間反應產物CA-CB和CC-CD之間的反應以產生最終的化學化合物CA-CB-CC-CD。當執行分步或會聚合成時，在化學基團反應前提供輔助性寡核苷酸對於形成反應中心可能是有用的。
在一個實施方案中，本發明涉及在由圖1d中顯示的載體模塊提供的幹-環結構中環的形成。可替代地，環通過連接由圖1e中顯示的其他寡核苷酸所提供的幹-環，或通過圖1d和1e中顯示的實施方案的其任何組合而形成。末端的載體模塊可以包含PCR引發位點，或引發位點可以通過連接其他寡核苷酸來提供。
圖1d中公開的實施方案顯示了5個步驟。在第1個步驟中，各自攜帶反應性基團R和雙特異性寡核苷酸的4個載體模塊在雜交條件下接觸。載體模塊與星形結構相平衡。在第2個步驟中，雜交複合物連接在載體模塊末端以便形成連續的核酸。位於星形結構中心的化學基團的接近度促進反應，並且在步驟3中形成產物，所述產物通過連接實體與編碼化學基團的核酸聯接，所述化學基團已參與化學化合物的形成。在步驟4中，用於聚合酶的引發位點與星形結構連接以使得能夠延伸核酸。最後一個步驟顯示了延伸產物，其中利用星形結構的核酸作為模板形成了雙鏈DNA。
在圖1e中，顯示了圖1d的實施方案的變化方案，因為幹-環被分開添加並與星形結構連接。在第1個步驟中，將4個載體模塊混合。由於雜交區段的存在，星形結構在雜交條件下形成。在雜交複合物形成後，實施反應以形成化學化合物。在通過4個化學基團的反應來形成化合物後，加入3個幹-環和用於聚合酶的引發位點。幹-環和引發位點包含與星形結構的突出部分互補的突出部分。當加入連接酶時，幹-環和引發位點與星形結構連接，以便形成連續的核酸。
在某些實施方案中，本發明涉及例如利用酶或通過化學連接來連接載體模塊，所述酶例如為T4 DNA連接酶、Taq DNA連接酶、T4 RNA連接酶或大腸桿菌(E.coli)DNA連接酶(Shabarova等人，NucleicAcids Res，19，4247-51，1991)。
載體模塊-寡核苷酸部分在本發明中，寡核苷酸用於指導化學反應。在這個上下文中，寡核苷酸被稱為載體模塊，它包含至少2個位置特異性的雜交寡核苷酸區段、任選的寡核苷酸密碼子區段和反應性化學基團。
在一個實施方案中，本發明涉及載體模塊，其中寡核苷酸部分由DNA、RNA或其類似物和以其任何組合組成。寡核苷酸部分至少在修飾後能夠成為在關於核酸複製和/或擴增的標準規程中的合適模板。
載體模塊可以利用本領域已知的方法來合成。例如寡核苷酸可以通過本領域已知用於合成寡核苷酸的任何方法來製備，例如利用自動化合成儀的固相合成。必要時利用本領域已知的標準偶聯化學可以將合成後的寡核苷酸與目的CRG締合(例如共價或非共價偶聯)。
在一個實施方案中，本發明涉及載體模塊，其中CRG與寡核苷酸締合至在雜交區段之間的中間部分或其附近。中間部分可以是磷酸二酯鍵、其衍生物或核酸區段。中間部分的附近涉及在雙鏈體核酸幹上的區域，優選靠近中間部分的區域。優選地，中間部分的附近涉及少於20個核苷酸，更優選少於10個核苷酸，更加優選少於5個核苷酸，和最優選少於2個核苷酸。
在一個實施方案中，本發明涉及載體模塊，其中CRG與寡核苷酸的締合經由連接體或間隔物而發生，所述連接體或間隔物足夠長且靈活以允許反應物達到反應接近度。連接體優選具有允許在由寡核苷酸配對的反應物之間發生反應的長度和組成，但還使與未配對的實體的反應最小化。此外，寡核苷酸和CRG之間的締合可以通過共價鍵。在某些實施方案中，共價鍵可以超過1個。所述鍵可以通過例如光、氧化作用、水解作用、暴露於酸、暴露於鹼或還原作用進行切割。本發明實踐中有用的各種鍵在現有技術中進行了描述(Fruchtel and Jung，Angew Chem Int Ed Engl，35，17，1996)。連接體幫助反應物接觸，並且在某些實施方案中，取決於所需反應，決定作為離去基團的DNA的位置，其中連接體作為反應的自然結果而被切割。在某些實施方案中，取決於所需環境，在一個反應性基團的反應後接著為與第2個反應性基團聯接的連接體的切割，以產生不留下能夠提供化學官能度的另外原子的產物。
在一個實施方案中，本發明涉及載體模塊，其中CRG與寡核苷酸的締合通過核酸主鏈而發生。
在一個實施方案中，本發明涉及載體模塊，其中CRG與寡核苷酸的締合通過鹼基。在一個優選實施方案中，CRG與非Watson-Crick氫鍵鍵合部分締合。
在一個實施方案中，本發明涉及載體模塊，其中CRG與寡核苷酸的締合至少在其去除後允許由DNA聚合酶進行閱讀。
在一個實施方案中，本發明涉及載體模塊，其中CRG與寡核苷酸的締合是非共價的。例如，如果生物素與寡核苷酸聯接，並且鏈黴抗生物素蛋白與CRG連接，則生物素和鏈黴抗生物素蛋白之間的相互作用使寡核苷酸和CRG互相非共價地締合。
載體模塊-化學利用本文所述方法可以製備廣泛範圍的化合物和/或化合物文庫。在某些實施方案中，不是或不類似核酸或其類似物的化合物根據本發明的方法合成。在某些其他實施方案中，不是或不類似蛋白質或其類似物的化合物根據本發明的方法合成。
在一個實施方案中，本發明涉及接近度指導的反應物的順次化學反應，例如，利用正交化學或利用正交的保護/掩蔽基團，或者通過載體模塊的順次裝配和反應。
沒有形成環即形成鄰接核酸的載體模塊的裝配，本身可以使合適定位的CRG達到接近度，因為雙螺旋的直徑為約2nm，從而允許在反應接近度內確定幾個連續CRG的位置。選擇反應條件、連接體、反應物和反應位點以避免非寡核苷酸指導的反應並加速寡核苷酸指導的反應。取決於待合成的具體化合物可以採用載體模塊的順次或同時接觸。在具有特定目的的某一實施方案中，考慮了化學化合物的多步驟合成，其中3個或更多個載體模塊順次接觸以促進複雜化學化合物的多步驟合成。
在一個實施方案中，本發明涉及載體模塊的退火，其允許以比許多常規有機合成中使用的濃度更低的濃度來使用載體模塊。因此，可以以亞毫摩爾濃度來使用載體模塊。優選地，可以採用在少於100μM的亞毫摩爾濃度內的載體模塊濃度，更優選少於10μM，更加優選少於1μM，更加優選少於100nM，和最優選少於10nM。
在一個實施方案中，本發明涉及形成小分子或聚合物的CRG。用於合成聚合物或小分子的已知化學反應可以用於本發明的實踐中。所選擇的反應優選與核酸例如DNA和RNA或其類似物相容。有用的反應包括例如取代反應、碳-碳鍵形成反應、消除反應和加成反應。
CRG或反應物包括各種反應物，並且可以是化學領域中已知的任何化學基團或反應性部分(例如，親電子體、親核體)。在利用本發明方法來合成小分子中，載體模塊可以締合的支架，小分子裝配在所述支架上。該支架可以是具有2個或更多個官能化位點的任何化學化合物。所述位點可以通過本領域已知的方法和保護基團進行保護。保護基團可以是互相正交的從而使得它們可以單個地去除。修飾支架的反應物可以是例如親電子體(例如乙醯基、醯胺、醯基氯、酯、亞胺)、親核體(例如胺、羥基、硫醇)或側鏈。
在某些實施方案中，根據本發明的方法來合成聚合物，特別是非天然的聚合物。可以利用本發明方法和系統來合成的非天然的聚合物包括任何非天然的聚合物。例如，非天然的聚合物包括，但不限於，肽核酸(PNA)聚合物、聚氨基甲酸酯、聚脲類、聚酯類、聚丙烯酸酯(例如聚乙烯、聚丙烯)、聚碳酸酯、具有非天然立體化學的多肽、含有非天然胺基酸的多肽及其組合。在某些實施方案中，聚合物包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、25個單體單元或更多。在某些實施方案中，單體單元可以包括二聚體、三聚體或四聚體或者寡聚物。利用本發明系統合成的聚合物可以用作例如催化劑、藥物或診斷親和力配體。在製備某些非天然聚合物時，單體單元與載體模塊聯接。單體單元可以是例如氨基甲酸酯類、D-胺基酸、非天然的胺基酸、PNAs、脲類、羥酸、酯類、碳酸酯類、丙烯酸酯類或醚類。在某些實施方案中，單體單元含有2個反應性基團以用於將單體單元連接到正在生長的聚合物鏈中。優選地，2個反應性基團不是相同的，從而使得單體單元可以以定性方式整合到聚合物中，例如在一端可以是親電子體和在另一端是親核體。反應性基團可以包括，但不限於，酯類、醯胺類、羧酸、活化的羰基、醯基氯、胺類、羥基和硫醇。在某些實施方案中，CRG是被掩蔽的或被保護的(Green等人，(1999)Protective Groupsin Organic Synthesis，第三版，Wiley)，從而使得聚合不發生直至當CRG脫保護時的所需時間。一旦單體經由載體模塊裝配而聚集在一起，開始聚合就會導致聚合和脫保護步驟的級聯，其中聚合導致反應性基團脫保護以用於後續的聚合步驟。待聚合的單體單元可以包括2個或更多個單體。單體單元可以包含本領域已知的任何化學基團。反應性化學基團，特別是將會干擾聚合、雜交等的那些，優選地用已知的保護基團進行掩蔽(Green等人，(1999)Protective Groups inOrganic Synthesis，第三版，Wiley)。一般而言，用於掩蔽這些反應性基團的保護基團與用於保護在聚合步驟中使用的基團的那些正交。
在一個實施方案中，本發明涉及載體模塊，其中反應位點與用於所有化學反應的相同載體模塊締合。例如，小分子支架與一個載體模塊締合，和其餘的載體模塊提供修飾支架的實體。
在一個實施方案中，本發明涉及載體模塊，其中反應位點將會在化學反應過程中改變位置。
在一個實施方案中，本發明涉及所形成的化學化合物與寡核苷酸的締合，而同時保持至少在其去除後可例如由DNA聚合酶進行閱讀。
組合文庫的製備傳統的和核酸指導的文庫合成之間的重要的實際差異是每次操作的規模。由於篩選和化合物鑑定所需的材料量，傳統的組合合成一般在納摩爾至微摩爾/文庫成員的規模上進行。相反地，核酸指導的文庫合成可以發生在飛摩爾至皮摩爾的規模上，因為選擇和PCR擴增只需要微量的(例如約10-20摩爾)每種與核酸連接的合成分子。規模上的極大差異，與核酸指導的文庫合成中的單一解決形式相組合，明顯簡化了所需材料的製備。
在一個實施方案中，本發明涉及組合展示文庫的形成。文庫可以利用在一些或所有位置上的載體模塊的集合來產生(圖2a)。在第1個步驟中，提供了每個位置的載體模塊的集合。當載體模塊在雜交條件下混合時，它們將會在雜交區段的序列指導下裝配成星形結構。在載體模塊裝配後，以任何順序來進行連接和反應。在本發明的一個方面，在反應前進行連接以增加星形結構的穩定性。在接近度指導的反應後，聚合酶引發位點與星形結構連接，並施行延伸反應以將所形成的化學化合物展示給外部環境。
如本領域技術人員將理解的，小分子和聚合物文庫可以利用本文所公開的原理進行合成。因此，可以對組合展示文庫實施選擇，並通過其編碼性寡核苷酸來鑑定富集文庫成員。
根據情況，最初組合2個或更多個位置的載體模塊的集合，並對其實施在聯接的CRG之間的由核酸指導的化學反應。根據情況，文庫可以通過多重化學反應來形成，其中在後續的反應循環前純化每種中間產物。優選地，需要少於20個化學反應步驟來形成文庫。在其他實施方案中，需要少於10個化學反應步驟，並更優選地，需要3-9個步驟來形成文庫。
選擇可以根據任何標準規程來進行具有所需活性(例如催化活性、結合親和力、結合特異性、或在活性測定中的特殊效應)的反應產物的選擇和/或篩選。例如，可以根據基於文庫的方法中的原理來進行親和力選擇(參見圖3)，例如噬菌體展示(Smith，Science，228，1315-7，1985)、核糖體展示(Hanes等人，Proc Natl Acad Sci USA，95，14130-5，1998)、mRNA展示(Roberts和Szostak，Proc Natl AcadSci USA，94，12297-302，1997)或DNA編碼的化學文庫(WO2004/016767，WO 2002/074929A2)。例如通過在過渡態類似物親和柱上的親和力選擇(Baca等人，Proc Natl Acad Sci USA，94，10063-8，1997)或通過基於官能團的選擇方案(Pedersen等人，Proc Natl AcadSci USA，95，10523-8，1998)可以進行催化活性的選擇。因為可以通過PCR擴增微量DNA(～100個分子)，因此這些選擇可以在這個量級的規模上進行以允許經濟且有效地真正廣泛地搜尋所需活性。
根據與靶分子的結合可以選擇或劃分(partition)展示文庫。在這個上下文中，選擇或劃分指由此將與靶分子結合的文庫成員與不與靶分子結合的文庫成員分開的任何方法。選擇可以通過本領域已知的各種方法來完成。在大多數應用中，與靶分子的結合優選是選擇性的，從而使得相對於其他結合事件來說更有利於與靶結合。最後，利用本發明鑑定的結合分子可以用作治療試劑和/或診斷試劑。
可以執行所述選擇策略以允許針對幾乎任何靶進行選擇。重要的是，所述選擇策略不需要關於靶分子或關於展示文庫成員的任何詳細的結構信息。整個過程由在文庫成員與給定的靶分子結合中所牽涉的結合親和力和特異性驅動。
利用標準分子生物學，通過其編碼性核酸可以容易地鑑定經選擇的文庫成員。本發明廣泛地允許鑑定對於任何已知靶分子的結合分子。此外，通過分離所選文庫成員的結合分子並使用這些來鑑定和確認靶分子可以發現新型的未知靶。
從展示文庫中選擇結合分子可以以任何形式進行以鑑定結合性文庫成員。結合選擇一般包括固定所需靶分子，加入展示文庫，允許結合，並通過洗滌去除非結合物/弱結合物。利用例如酸、離液序列高的鹽、熱、與已知配體的競爭洗脫、高鹽、鹼、靶的蛋白水解釋放、核酸的酶促釋放可以洗脫與靶保持結合的富集文庫。在一些實施方案中，利用相同或更嚴謹的條件或利用不同的結合方式對洗脫的文庫成員實施更多輪的結合和洗脫循環，這將增加富集。在其他實施方案中，不從靶上洗脫結合性文庫成員。為了選擇與在細胞表面上表達的蛋白質(例如離子通道或跨膜受體)結合的文庫成員，可以使用細胞自身作為選擇試劑。選擇程序還可包括就與細胞表面受體結合進行選擇，所述細胞表面受體被內在化從而使得受體與結合分子一起通過細胞質、細胞核或其他細胞區室，例如高爾基體或溶酶體。所討論的區室的分離導致將被內在化的文庫成員與非內在化的文庫成員分開(Hart等人，J Biol Chem，269，12468-74.，1994)。選擇程序還可包括體內選擇。例如通過體內器官靶向，其中將文庫注射到動物中，隨後分離目的器官，從而獲得被靶向那個器官的文庫成員的富集匯集物(Pasqualini和Ruoslahti，Nature，380，364-6，1996)。富集文庫的核酸部分可以通過例如PCR進行擴增，導致許多級的擴增，允許通過例如克隆和DNA測序進行鑑定。
根據圖3中顯示的親和力選擇的具體實施方案，將從圖2a中顯示的實施方案產生的反應產物文庫在結合條件下與靶接觸。如果一種或多種所形成的化學化合物具有對靶的親和力，則將產生結合。在後續步驟中，分開結合性文庫成員或來源於其中的核酸。與所形成的化學化合物聯接的核酸隨後通過例如PCR進行擴增以產生多個拷貝的核酸，所述核酸編碼展示出所需親和力的化合物的合成史。擴增出的核酸可以通過多種已知技術進行測序以譯解哪些化學基團已參與成功的化合物的形成。可替代地，擴增出的核酸可以用於形成下一代文庫。
其他選擇還可進行其他特性的選擇，例如催化或其他功能活性。一般地，應當設計選擇，從而使得具有所需活性的文庫成員可以與其他文庫成員分開。例如，具有催化鍵切割的能力的文庫成員的選擇可以通過將生物素經所討論的鍵與每個文庫成員聯接來進行。隨後，利用鏈黴抗生物素蛋白的劃分可以將具有催化活性的文庫成員與其他文庫成員分開。另一例子是選擇具有鍵形成能力的文庫成員。這可以通過下列步驟進行將底物聯接到每個文庫成員上，並隨後加入聯接有生物素的底物。2種底物之間形成鍵的反應將使生物素聯接在催化性文庫成員上。隨後，利用鏈黴抗生物素蛋白的劃分可以將具有催化活性的文庫成員與其他文庫成員分開。還可進行其他特性的選擇，例如二聚作用和/或聚合作用。在這種情況下，利用例如HPLC、丙烯醯胺或瓊脂糖凝膠或大小排阻柱，通過所形成的複合物的大小可以劃分文庫成員。
核酸擴增通過用於核酸擴增的標準規程可以進行富集文庫成員的核酸部分的擴增。這些方法包括，例如聚合酶鏈式反應(PCR)(Saiki等人，Science，230，1350-4，1985)、基於核酸序列的擴增(NASBA)(Compton，Nature，350，91-2，1991)、鏈置換擴增(Nycz等人，Anal Biochem，259，226-34，1998)、自動維持序列複製(Mueller等人，HistochemCell Biol，108，431-7，1997)、引物延伸、和質粒擴增(參見例如Sambrook，J.，Fritsch，EF和Maniatis，T.(1989)，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory)。
通過模塊置換來裝配展示文庫在一個實施方案中，本發明涉及富集文庫成員或富集文庫成員的第二代文庫的重新裝配/擴增以重新形成展示。在富集文庫的情況下，形成富集展示文庫，因此，允許進行選擇和擴增和重新裝配的循環。例如，如圖4a中所示，允許富集文庫成員的上述經PCR擴增的寡核苷酸在有利於分子內雜交的條件下雜交，由此重新形成由一個幹和多個幹-環組成的星形結構。沒有環的幹可以包含限制性內切酶的識別位點，所述限制性內切酶產生含有不確定鹼基的突出部分。方便地，利用在所形成的突出部分中序列的不確定鹼基以包含密碼子。因此，幹的限制性內切酶消化產生關於該第1個位置的密碼子特異性突出部分。隨後，經限制性內切酶消化的星形結構與載體模塊的集合雜交，所述載體模塊包含關於第1個位置的2個恆定區段以及CRG和反密碼子的同族對。因此，密碼子/反密碼子雜交允許連接合適的載體模塊與星形結構對。鄰近的幹-環還可包含用於另一種限制性內切酶的識別位點，所述另一種限制性內切酶能夠留下關於這個第2個位置的密碼子特異性突出部分。因此，利用這個第二種限制性內切酶的消化消除了經PCR擴增的第1個模塊與所述結構的其餘部分的共價鍵。使星形結構變性，隨後允許其在有利於分子內雜交的條件下雜交。由此重新形成星形結構，但現在在位置1(具有CRG)上具有新的載體模塊，並且沒有環的幹現在位於位置2上。這個過程可以循環進行以置換所有的位置，以允許在接近度指導下進行CRGs的正確組合的化學反應；展示文庫從而被擴增並重新裝配。最後PCR引發位點可以與星形結構連接。因此，可以進行選擇和擴增和重新裝配循環直至完成所需的富集(參見圖5)。
在一個實施方案中，本發明涉及由限制性內切酶所造成的密碼子特異性突出部分的形成。合適的限制性內切酶能夠形成具有超過一個特異性序列的突出部分。此類酶包括i)在其識別序列中含有不確定鹼基的限制性內切酶，ii)在其識別序列之外進行切割的限制性內切酶，和iii)形成切口的限制性內切酶(缺刻性核酸內切酶(nickingendonuclease))。此類限制性內切酶的例子有AlwNI、ApaBI、AsuI、BbvI、BbvII、BccI、Bce83I、BcefI、BciVI、BglI、BinI、BseMII、BseRI、BsgI、BsiYI、BsmAI、BspMI、BsrDI、BstEII、BstXI、BtgZI、DdeI、DraII、DraIII、DrdI、Eam1105I、EciI、Eco31I、Eco57I、Eco57MI、EcoNI、EspI、Esp3I、Fnu4HI、FokI、GsuI、HinfI、Hpy178III、Hpy188I、Ksp632I、MaeIII、MboII、MmeI、MwoI、PflMI、PfoI、PleI、SapI、SauI、ScrFI、SecI、SfaNI、SfiI、Sth132I、Tsp4CI、TspDTI、TspGWI、TspRI、Tth111I、Tth111II、XcmI、N.AlwI、N.BstNBI、N.BbvCIA和N.BbvCIB。
突出部分的編碼能力(可能的不同密碼子的數目)由通過限制性內切酶而形成的突出部分中的不確定鹼基的數目給定。因此，對於每個N(N＝A、T、G或C)，可以選擇4種不同的殘基，對於每個H(H＝A、C或T)、V(V＝A、C或G)、B(B＝C、G或T)和D(D＝A、G或T)，可以選擇3種不同的殘基，以及對於每個R(R＝A或G)、K(K＝G或T)、Y(Y＝C或T)、S(S＝C或G)和M(M＝A或C)和W(W＝A或T)，可以選擇2種不同的殘基。因此，通過將每個位置上的不同殘基的數目相乘可計算出編碼能力。例如，SfiI；
5』-...GGCCNNNN/NGGCC...-3』3』-...CCGGN/NNNNCCGG...-5』，形成突出部分5′-NNN-3′，因此由3個N組成，因此編碼能力為64(＝4×4×4)。
另一例子，Ava II；5』-...G/GWCC...-3』3』-...CCWG/G...-5』，形成突出部分5′-GWC-3′，因此編碼能力為2。
另一例子是Bbs I；5』-...GAAGACNN/NNNN...-3』3』-...CTTCTGNNNNNN/...-5』，形成由4個N組成的突出部分，因此編碼能力為256(＝4×4×4×4)。
一組特殊的限制性內切酶是只切割一條鏈的那些限制性內切酶(缺刻性核酸內切酶)。這些酶在原則上可以具有無限的編碼能力；例如，當i)識別序列位於幹-環結構的幹中，或ii)用於形成末端突出部分，或iii)與另一種限制性內切酶相組合。這是因為所形成的突出部分的長度在原則上可以具有無限的長度。
例如，N.BbvC IA位於幹-環結構的幹中；5』-...CC/TCAGCNNN3』-...GGAGTCGNNN，3′-...GGAGTCGNNN消化產生；5』-...CC-3』3』-...GGAGTCGNNNNNNCGACT-5』，在這個例子中，6個N存在於所形成的突出部分中，從而得到1024(＝4×4×4×4×4×4)的編碼能力。然而，顯然可以任意選擇N的數目，從而得到無限的編碼能力。在這個例子中，可能序列的總數目中的小部分不能使用。即，形成所使用的限制性內切酶的識別序列的那些序列。
此外，缺刻性核酸內切酶可以形成任意長度的末端突出部分，例如N.BbvC IA5』-...CC/TCAGCNNNNNNNN-3』3』-...GGAGTCGNNNNNNNN-5』，消化產生；5』-...CC-3』3』-...GGAGTCGNNNNNNNN-5』，和5』-TCAGCNNNNNNNN-3』，在這個例子中，8個N存在於所形成的突出部分中，從而得到65536(＝4的8次方)的編碼能力。然而，顯然可以任意選擇N的數目，從而得到無限的編碼能力。在這個例子中，可能序列的總數目中的小部分不能使用。即，形成所使用的限制性內切酶的識別序列的那些序列。
此外，可以使用與限制性內切酶相組合的缺刻性核酸內切酶以形成對於幹-環結構沒有任何要求的任意長度的突出部分。例如N.BbvC IA與Eco RI組合；5』-...CC/TCAGCNNNNNNNNG/AATTC...-3』3』-...GGAGTCGNNNNNNNNCTTAA/G...-5』，消化產生；5』-...CC-3』3』-...GGAGTCGNNNNNNNNCTTAA-5』，和；5』-TCAGCNNNNNNNNG-3』，和
5』-AATTC-3』3』-G-5』，在這個例子中，8個N存在於所形成的突出部分中，從而得到65536(＝4的8次方)的編碼能力。然而，顯然可以任意選擇N的數目，從而得到無限的編碼能力。在這個例子中，可能序列的總數目中的小部分不能使用。即，形成所使用的限制性內切酶的識別序列的那些序列。
儘管密碼子區段的長度可以改變，但密碼子區段可以是1-50、1-40、1-30、1-15、1-10個核苷酸。然而，優選地，密碼子區段的長度是2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。
儘管形成幹的區段的長度可以改變，但幹區段優選可以是5-50、5-40、5-30、5-15、5-10個核苷酸。然而，優選地，幹區段的長度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。
在形成幹的區段之間的中間部分的長度可以改變。中間部分優選為單個磷酸二酯鍵(或類似鍵)至20個核苷酸的一段序列。然而，中間部分優選為單個磷酸二酯鍵或具有1、2、3、4、5或6個核苷酸的長度。
在一個實施方案中，本發明涉及用於重新裝配/擴增展示文庫的方法，其中星形結構在限制性內切酶消化後進一步用去除5′磷酸的磷酸酶進行處理，從而阻止2個星形結構的連接。幾種合適的磷酸酶是本領域已知的，例如南極磷酸酶和牛小腸鹼性磷酸酶。
在一個實施方案中，本發明涉及用於重新裝配/擴增展示文庫的方法，其中載體模塊包含5′磷酸以促進與星形結構的連接。
在一個實施方案中，本發明涉及用於重新裝配/擴增展示文庫的方法，其中載體模塊在與星形結構連接後進行磷酸化。這阻止了游離的載體模塊之間的連接。
在某些實施方案中，本發明涉及用於重新裝配/擴增展示文庫的方法，其中經PCR擴增的星形結構的5′末端可以通過除限制性內切酶以外的其他方法來形成，例如RNA酶、核酸內切酶III、核酸內切酶VIII、APE1、Fpg、化學切割或光切割。PCR產物由5′末端的引物和由DNA聚合酶形成的其餘序列組成。該引物可以包含在由DNA聚合酶形成的區段中沒有發現的殘基，例如dUTP或RNA。此類殘基可以通過合適的手段特異性地識別和切割，這將產生限定的末端(Smith等人，PCRMethods Appl，2，328-32，1993)。
在一個實施方案中，本發明涉及用於重新裝配/擴增展示文庫的方法。經PCR擴增的富集文庫的末端可以在星形結構形成前通過上述任何方法進行修飾。
多樣化在一個實施方案中，本發明考慮了這樣的方法，其用於使展示的化合物或展示的化合物的文庫多樣化，從而允許分子進化。這可以以不超過本發明範圍的多種方式來完成。例如(參見圖4b)，在模塊置換循環中的部分分子用2種連續的限制性內切酶進行消化，所述限制性內切酶消除了所討論的模塊和其餘結構之間的共價鍵。使星形結構變性並與所討論位置的載體模塊的集合雜交。因此，以與形成原始文庫時相同的方式，位置特異性恆定區段指導雜交。使合適的末端連接，並將所形成的產物與密碼子指導裝配的部分合併，導致多樣化。這可以在模塊置換的一個、一些或所有循環中進行。在另一例子中，對於在模塊置換循環中的部分分子實施去除所討論位置的密碼子特異性突出部分，例如通過核酸外切酶。隨後，使所討論位置的載體模塊的集合進行雜交和連接。將隨後形成的非密碼子指導的產物與密碼子指導裝配的部分合併，導致多樣化。這可以在模塊置換的一個、一些或所有循環中進行。多樣化還可通過在模塊置換過程前改組/重組(培育)文庫成員之間的模塊來進行。例如，擴增富集文庫成員的核酸部分，並用切割恆定區段的限制性內切酶消化，從而產生2個或更多個片段。所述片段可以與來源於其他文庫成員的片段相連接以形成全長產物，由此發生改組/重組。用於改組/重組的方法的另一例子是通過使用星形結構(參見圖4b)。星形結構通過2種連續的限制性內切酶進行消化，使其變性，並允許其雜交，導致所討論的模塊交換。因此，可以進行選擇、擴增和多樣化的循環，從而允許分子進化(參見圖6)。
催化活性的選擇所述原理還可應用於選擇催化活性。在這種情況下，載體模塊包含反應位點官能團，並且星形結構提供這些官能團三維排列的框架，從而模擬蛋白質酶。
考慮了各種催化活性的選擇方案。例如i)選擇與過渡態類似物結合，ii)選擇鍵形成，通過使一種底物與星形結構締合，而其他底物固定在例如珠上，(因此，與珠締合的文庫成員能夠形成鍵)，或iii)選擇鍵切割，通過具有與星形結構和珠締合的底物，(因此，不與珠締合的文庫成員能夠切割鍵)(參見圖7)。
密碼子特異性分隔化(compartmentalization)通過使用例如合適的限制性內切酶，星形結構允許任何密碼子位置成為末端和單鏈，從而允許通過對於特定密碼子位置的雜交和任選的連接來進行高度特異性的分隔化。用於分隔化的各種方法是本領域已知的，例如，反密碼子序列的微陣列(Lockhart等人，NatBiotechnol，14，1675-80，1996)，反密碼子序列的柱(Halpin和Harbury，PLoS Biol，2，E173，2004)，或使用珠，其中單個珠包含反密碼子序列和螢光標籤，所述螢光標籤隨後允許通過例如螢光活化細胞分類來進行分類(Iannone等人，Cytometry，39，131-40，2000)。此類分隔化在本發明的實踐中可能是有用的，例如i)在文庫合成過程中用於化學反應後修飾，ii)單個克隆的分析，iii)選擇進程的分析，或iv)多樣性分析。因此，情況ii)-iv)中的分隔化可以是DNA測序的快速且經濟的可替代方法，以用於單個序列或序列文庫的去褶積(deconvolution)。
在本說明書中，組合物被描述為具有、包含或含有特定組分，或方法被描述為具有、包含或包括特定過程步驟，貫穿整個說明書，預期本發明的組合物同樣也基本上由或由所述組分組成，並且本發明的方法同樣也基本上由或由所述過程步驟組成。此外，應當理解，步驟的順序或執行某些操作的順序並不重要，只要本發明仍是可操作的。此外，可以同時進行2個或更多個步驟或操作。
本發明的方法和組合物代表了產生具有所需特性的分子的新方法。這種方法將極其靈敏且有效的分子生物學技術與有機化學的靈活性相組合。通過分子進化來製備、擴增和進化非天然聚合物和小分子的能力可以導致產生新的催化劑種類、新型配體、或藥物，它們具有的性質優於用較慢的傳統發現方法分離的那些。
本發明還提供了在本發明方法中使用的試劑盒和組合物。
定義如本文所使用的，術語「核酸」或「寡核苷酸」指核苷酸聚合物。所述聚合物可以包括，但不限於，天然的核苷(即腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)、核苷類似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯並嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-urouridine、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代烏苷、O(6)-甲基烏嘌呤和2-硫代胞苷)、化學修飾的鹼基、生物學修飾的鹼基(例如甲基化的鹼基)、插入的鹼基、修飾的糖(例如，2′-氟核糖、核糖、2′-脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)、或修飾的磷酸基團(例如硫代磷酸酯和5′，-N-亞磷醯胺鍵)。核酸和寡核苷酸還可包括鹼基的其他聚合物，其具有修飾的主鏈，例如鎖定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、蘇糖核酸(TNA)和能夠充當用於使用擴增技術的擴增反應的模板的任何其他聚合物，所述擴增技術例如為聚合酶鏈式反應或連接酶鏈式反應。
如本文所使用的，術語「區段(segment)」指寡核苷酸序列的連續部分。
如本文所使用的，術語「密碼子」和「反密碼子」指編碼與所述密碼子或反密碼子締合的某一化學基團的寡核苷酸序列。一系列密碼子編碼特定化學反應物的組合，所述化學反應物已參與了所編碼的分子的形成。
如本文所使用的，術語「幹-環」指包括至少核苷酸部分的任何二級結構，在所述核苷酸部分中核酸序列的鏈經由分子內氫鍵與同一核酸分子的另一部分結合，以便構成具有大部分雙鏈性質的被稱為「幹」的「自身配對」區域，和位於所述幹的一個末端的未配對「環」區域。當環的長度為零時，它產生被稱為「髮夾」或迴文結構的特殊情況的幹-環。
如本文所使用的，術語「小分子」指在實驗室中合成的或在自然界中發現的有機化合物，其分子量小於10,000克/摩爾，任選小於5,000克/摩爾，和任選小於2,000克/摩爾，例如小於1,000克/摩爾。優選的小分子適合於口服施用。
如本文所使用的，術語「小分子支架」或「分子支架」指具有至少一個適合於官能化的位點或化學部分的化學化合物。小分子支架或分子支架可以具有2、3、4、5個或更多個適合於官能化的位點或化學部分。如本領域技術人員所理解的，這些官能化位點可以被保護或掩蔽。所述位點還可以存在於隱含的環結構或主鏈中。
如本文所使用的，術語「化學反應性基團」或「化學基團」或「反應單元」指能夠修飾另一化學部分、添加至另一化學部分或從另一化學部分上取走的任何化學部分。包括，例如，但不限於，構建塊(building block)、單體、單體單元、分子支架、或在由接近度介導的化學合成中有用的其他反應物。在某些情況下，化學基團不是核苷酸或其衍生物。在另一方面，已參與所形成的化學化合物的合成的化學基團中至少一個不是天然發生的胺基酸。
如本文所使用的，術語「與......締合」描述了2個或更多個基團、部分、化合物、單體等之間或之中的相互作用。當2個或更多個實體如本文所述互相「締合」時，它們通過直接或間接的共價或非共價相互作用連接。優選地，締合是共價的。共價締合可以是例如，但不限於，經由醯胺、酯、碳-碳、二硫鍵、氨基甲酸酯、醚、硫醚、脲、胺或碳酸酯鍵。共價締合還可包括連接體部分，例如，光可切割的連接體。希望的非共價相互作用包括氫鍵、範德華相互作用、偶極-偶極相互作用、π堆疊相互作用(pi stacking interaction)、疏水相互作用、磁性相互作用、靜電相互作用等。此外，2個或更多個實體或試劑可以通過一起存在於同一組合物中而互相「締合」。
如本文所使用的，術語「載體模塊」指與寡核苷酸締合的化學基團，和可以與第2個寡核苷酸中朝向5′末端的區段雜交的朝向3′末端的區段，和可以與第3個寡核苷酸的朝向3′末端的區段雜交的朝向5′末端的區段。載體模塊任選包含密碼子或反密碼子區段。如本文所使用的，術語「雜交區段」指所述寡核苷酸區段。
如本文所使用的，術語「星形結構」指包括至少3個具有大部分雙鏈性質的幹的任何二級結構。0、1、2、3、5、6、7、8、9或更多個核苷酸殘基可以將幹分隔開。在0個核苷酸殘基分隔開4個幹的特殊情況下，連結體(junction)被稱為霍利迪連結體。星形結構可以由1個核酸分子組成，或它可以由多個核酸分子組成。
如本文所使用的，術語「反應接近度」指反應物之間的距離，通過這一距離所述反應物的反應可以以受控的、有效的且及時的方式發生。
如本文所使用的，術語「接近度指導的化學反應」指反應物之間的化學反應，所述反應物通過使與反應物締合的核酸進行雜交而被帶至反應接近度。
實施例實施例1證實了通過互相互補的雙特異性寡核苷酸而形成三聚和四聚的DNA星形結構如在圖8中顯示的表中所表明的，DNA寡核苷酸(由DNATechnology rhus，Denmark製備)各自在1×連接酶緩衝液(NewEngland Biolabs)、50mM NaCl中以2μM的濃度進行混合。混合物在80攝氏度下孵育2分鐘並在水浴中緩慢冷卻至室溫。利用標準規程(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″MolecularCloninga Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring，Harbor，New York)，通過非變性PAGE(7.5％聚丙烯醯胺)，隨後用溴化乙錠染色來分析產物。
oligo6和oligo7(分別對應於vip006和vip007)、oligo6和oligo8(對應於vip006和vip008)、以及oligo7和oligo8(分別對應於vip007和vip008)各自具有互相互補的區段，從而能夠形成經退火的二聚物。因此，在泳道1-3中觀察到對應於二聚物的條帶。vip006、vip007和vip008各自具有與2個鄰近的oligo互相互補的區段，從而能夠形成閉合的經退火的三聚體結構(參見圖8)。因此，在泳道4中觀察到對應於三聚體的條帶。oligo6、oligo7和oligo9(分別對應於vip006、vip007和vip009)各自具有與鄰近的oligo互相互補的區段，從而能夠形成經退火的三聚體結構。然而，該結構是開放的，因為vip008和vip006不具有互補區段(參見圖8)。因此，在泳道5中觀察到對應於三聚體的條帶。預期開放的三聚體在凝膠中具有比更緊密閉合的三聚體形式更低的遷移率。事實上，當比較泳道4和5時，觀察到遷移率的差異。
通過使用oligo6、oligo7和oligo10(分別對應於vip006、vip007和vip010)同樣觀察到緩慢遷移的三聚體條帶，其中vip006和vip010互相不直接退火(比較泳道4和6)。為了評估閉合的三聚形式的形成效率，oligo6、oligo7和oligo8(分別對應於vip006、vip007和vip008)在2倍過量的oligo9或oligo10(分別對應於vip009或vip010)存在下進行退火。有趣的是，泳道7和8中的主要條帶對應於由vip006、vip007和vip008組成的閉合的三聚體快速遷移種類。閉合的四聚體的成功形成通過使oligo6、oligo7、oligo9和oligo10(分別對應於vip006、vip007、vip009和vip010)退火來實現，並在泳道9中被觀察為1個主要條帶。注意，在所有尋覓(chases)中的預期的價(valency)以高效率獲得；被觀察為單個主要條帶。
實施例2通過T4 DNA連接酶將三聚體DNA星形結構轉化為DNA的單條鄰接鏈在這個實施例中證實，成功形成了由DNA的單條不間斷鏈組成的3幹的DNA星形結構。使互相互補的雙特異性寡核苷酸退火，並隨後連接以形成DNA連續鏈。
如圖9中顯示的，DNA oligo(由DNA Technology rhus，Denmark製備)各自在1×連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl中以2μM的濃度進行混合。混合物在80攝氏度下孵育2分鐘並在水浴中緩慢冷卻至室溫。
寡核苷酸的5′末端通過T4 DNA多核苷酸激酶進行磷酸化。製備由1.67μM星形結構、1×DNA連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl和0.2u/μl T4 DNA多核苷酸激酶(New England Biolabs，cat#M0201)組成的混合物，並在37℃孵育30分鐘。
通過T4 DNA連接酶(New England Biolabs，cat#M0202)在經退火的寡核苷酸的並列末端之間形成磷酸二酯鍵。向上述經激酶處理的混合物中加入1/3×體積的連接酶混合物、1×DNA連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl和100u/μl T4 DNA連接酶(New England Biolabs，cat#M0202)，並在室溫下孵育2小時。利用標準規程(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″Molecular Cloninga Laboratory Manual″，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring，Harbor，New York)，通過變性PAGE(7.5％聚丙烯醯胺，8M尿素)，隨後用溴化乙錠染色來分析產物。
vip076(25nt)和vip017(42nt)各自具有互相互補的區段，它們在退火後使vip076的3′末端與vip017的5′末端相鄰，從而製成用於T4 DNA連接酶的底物。因此，在泳道1中觀察到對應於vip076-vip017(67nt)的顯著條帶。類似地，在泳道3中觀察到形成了對應於vip017-vip078(100nt)的顯著條帶。相反地，vip076和vip078(58nt)各自具有互相互補的區段但不形成經退火的相鄰末端，並且被預期不進行連接。因此，在泳道2中只觀察到對應於vip076和vip078單體的條帶。注意到對應於vip076的條帶較微弱，這是預料中的，因為vip076較小並且寡核苷酸為等摩爾濃度。此外，vip078(58nt)在凝膠中遷移得比vip076-vip017(67nt)更慢，這不是預料中的，因為vip076-vip017包含用於形成給出更緊密摺疊的幹-環結構，因此在凝膠中具有更高的遷移率。
vip076、vip017和vip078各自具有互相互補的區段，它們在退火後使vip076的3′末端與vip017的5′末端相鄰，並使vip017的3′末端與vip078的5′末端相鄰，從而製成用於T4 DNA連接酶的2種底物。因此，在泳道4中觀察到對應於vip076-vip017-vip078的顯著條帶。
因此，據此證實，形成了由DNA的一條鄰接鏈組成的三聚體DNA星形結構。
實施例33幹的DNA星形結構的擴增在這個實施例中證實，成功擴增了由DNA的一條鄰接鏈組成的三聚體DNA星形結構。使互相互補的雙特異性寡核苷酸退火，連接，並隨後在引物延伸反應中用作模板。
如下文所述，DNA oligo(由DNA Technology rhus，Denmark製備)各自在1×連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl中以2μM的濃度進行混合。混合物在80攝氏度下孵育2分鐘並在水浴中緩慢冷卻至室溫。
寡核苷酸的5′末端通過T4 DNA多核苷酸激酶進行磷酸化。製備由1.67μM星形結構、1×DNA連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl和0.2u/μl T4 DNA多核苷酸激酶(New England Biolabs，cat#M0201)組成的混合物，並在37℃孵育30分鐘。
通過T4 DNA連接酶(New England Biolabs，cat#M0202)在經退火的寡核苷酸的並列末端之間形成磷酸二酯鍵。向上述經激酶處理的混合物中加入1/3×體積的連接酶混合物、1×DNA連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl和100u/μl T4 DNA連接酶(New England Biolabs，cat#M0202)，並在室溫下孵育過夜。
通過向1體積的連接反應中加入3體積的延伸混合物、1.33×Vent緩衝液(New England Biolabs)、1.33μM vip038、2.67mM dNTP，並且連同或不連同1.33u/μl Vent(exo-)DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，cat#M0257)一起，來進行引物延伸反應。溶液在92℃孵育1分鐘、在50℃孵育1分鐘、在74℃孵育10分鐘，並置於冰上。
利用標準規程(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″Molecular Cloninga Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring，Harbor，NewYork)，通過非變性PAGE(7.5％聚丙烯醯胺)，隨後用溴化乙錠染色來分析反應。
圖10中顯示了實驗結果。vip038與vip078中20個最5′末端的鹼基逆向互補，因此可以利用vip078或vip078融合物(fusions)作為模板來引發延伸反應。因此，在包含vip038、vip076和vip078的延伸反應中得到對應於雙鏈的vip078的單個顯著條帶(泳道2)。注意到，這個條帶不存在於泳道6中，所述泳道6是等價的但不包含DNA聚合酶。相反地，泳道6包含2個條帶，推測它們由退火的vip076/vip078/vip038和退火的vip078/vip038組成。
通過vip038、vip076和vip017證實了反應的特異性，其中比較泳道1和5，在含或不含DNA聚合酶之間沒有觀察到明顯差異。
利用連接反應vip017-vip078也觀察到成功的引物延伸，由泳道3中的顯著條帶說明。注意到，還觀察到對應於雙鏈的vip078的較微弱條帶，說明並非所有的vip078都與vip017連接。在相應的不含DNA聚合酶的泳道7中，觀察到具有與雙鏈的vip017-vip076幾乎相同的遷移率的較微弱條帶。推測該條帶由退火的vip038/vip017-vip078組成。
利用vip076-vip017-vip078連接反應作為模板也觀察到成功的引物延伸。在凝膠中觀察到遷移率比雙鏈的vip017-vip078更低的2個條帶。當與不含DNA聚合酶的等價泳道8相比較時，如所看到的，較低的條帶對應於退火的vip038/vip076-vip017-vip078。然而，泳道4中較高的條帶是獨特的，因此由雙鏈的vip076-vip017-vip078組成。因此，這個實施例證實了，DNA結構可以轉化為雙鏈DNA，從而可進行擴增。
實施例4在星形結構中心處的化學反應性通過使用下列三官能交聯劑(TSAT、Tris-氨基三乙酸琥珀醯亞胺酯(Tris-succinimidyl aminotriacetate)，Pierce cat.No 33063)來實現在星形結構中心處的化學反應性
TSATM.W.482.36間隔臂4.2DNA oligo全都具有氨基經修飾的內部dT(GlenResearch，cat.No.10-1038-××)的vip016/vip017或vip016/vip017/vip018(由DNA Technology rhus，Denmark製備)在150mM NaCl、100mM磷酸鈉(pH 7.2)中混合，得到20μM的總oligo濃度。混合物在80攝氏度下孵育2分鐘並在水浴中緩慢冷卻至室溫。將TSAT溶解於DMF中。製備在DMF中的10倍連續稀釋液。將1體積的DMF或TSAT稀釋液與9體積的緩衝液混合，得到的最終緩衝液濃度為150mM NaCl、100mM磷酸鈉，pH 7.2。將1體積的緩衝的DMF或緩衝的TSAT稀釋液與1體積的退火的DNA oligo混合物進行混合，得到最終的oligoTSAT比為1∶0、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000，並允許在室溫下孵育2小時。利用標準規程(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″Molecular Cloninga Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring，Harbor，NewYork)，通過非變性PAGE(7.5％聚丙烯醯胺)，以及變性PAGE(7.5％聚丙烯醯胺，8M尿素)，隨後用溴化乙錠染色來分析反應。

vip016和vip017各自具有互相互補的區段，因此能夠形成退火的二聚體結構。vip016、vip017和vip018各自具有與鄰近的oligo互相互補的區段，因此能夠形成閉合的經退火的三聚體結構(參見圖12)。
如所預期的，在非變性凝膠中的泳道1-5中，主要條帶對應於二聚體結構，而在非變性凝膠中的泳道6-10中，主要條帶對應於三聚體結構。在變性凝膠中，退火被破壞。如所預期的，在變性凝膠中的泳道1和6中觀察到對應於單體的條帶。然而，當包括TSAT時，觀察到更高級的結構(泳道2-5、7-10，變性凝膠)，表明TSAT的確使oligo交聯。有趣的是，當只存在vip016和vip017時，最高級的交聯結構是二聚的(變性凝膠，泳道2-5)，而當vip016、vip017和vip018存在時，觀察另外的三聚體結構(變性凝膠，泳道7-10)，從而表明交聯不依賴於DNA寡核苷酸的退火。還值得注意的是，如所預期的，觀察到鍾型的劑量應答在低TSAT濃度時，反應將是緩慢的導致低得率，隨著TSAT濃度增加反應將更快速地進行，導致產生更多的交聯產物，然而在較高的TSAT濃度下，交聯將與只與一個DNA oligo反應的TSAT分子進行競爭，導致產生較少的交聯產物。因此，利用1000 TSAT當量觀察到交聯產物的最高得率(泳道4和9，變性凝膠)。此外，當與具有相同TSAT濃度的泳道2-5中的其相似物(counterpart)相比較時，泳道7-10中獲得的高得多的總得率舉例說明了在閉合的經退火的結構中的交聯優勢。
實施例5由DNA星形結構指導的化學反應通過同雙官能連接體BSOCOES((雙[2-(琥珀醯亞氨基氧基羰基氧基)乙基]碸)，Piercecat#21600)，通過將胺基酸(L-Leu或Gly，Fluka#61820和#50052)經α-胺與vip017中修飾的內部dT上的伯胺交聯而對寡核苷酸vip017進行官能化，其步驟為在200mM pH 7.4磷酸鈉溶液(200μl)中用0.1體積的在DMF中的100mM BSOCOES溶液於25℃處理所述寡核苷酸(5nmol)10分鐘，隨後用0.3體積的在300mM NaOH中的300mM胺基酸(Leu或Gly)溶液於25℃處理2小時。反應總體積為200μl。粗連接的胺基酸試劑通過EtOH沉澱來分離，並且無需進一步純化即可使用。根據(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″Molecular Cloninga Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring，Harbor，New York)通過NaOAc/EtOH來沉澱DNA。將粒狀沉澱重懸浮於水中。
寡核苷酸通過製備下列物質來進行退火3.125μM每種寡核苷酸、125mM MES pH 6.0、187.5mM NaCl。混合物在80攝氏度下孵育2分鐘並在水浴中緩慢冷卻至室溫。通過將EDC和sNHS加入至預退火的寡核苷酸中來進行DNA指導的化學反應(醯胺鍵形成)；2.5μM形成的星形結構、100mM MES pH 6.0、150mM NaCl、20mM EDC和15mM sNHS(終濃度)。混合物在室溫下孵育過夜並如上所述進行EtOH沉澱。
利用標準規程(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″Molecular Cloninga Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring，Harbor，NewYork)，通過非變性PAGE(7.5％聚丙烯醯胺)，以及變性PAGE(7.5％聚丙烯醯胺，8M尿素)，隨後用溴化乙錠染色來分析反應。
通過同雙官能連接體BSOCOES，通過將胺基酸Leu或Gly經α-胺與vip017中修飾的內部dT上的伯胺交聯而對寡核苷酸vip017進行官能化。經修飾的dT位於vip017中的2個雜交區段之間。vip076具有包含伯胺的經修飾的dT，隨後為與vip017中5′雜交區段互補的3′雜交區段。因此，通過使vip017和vip076退火，在與vip017綴合的胺基酸和vip076上的伯胺之間創造了接近度。因此，在非變性凝膠的泳道4-6中觀察到對應於二聚體的條帶。vip008具有與vip076和vip017互補的區段，因此能夠形成閉合的三聚體星形結構，並在星形結構中心的反應室內排列vip017和vip077的化學官能團。因此，在非變性凝膠的泳道1-3中觀察到對應於三聚體的條帶。
在經EDC/sNHS進行活化後，在與vip017綴合的胺基酸和vip076中的伯胺之間可以形成醯胺鍵，並由此使vip017和vip076交聯。如所預期的，當星形結構形成時(vip008存在)，對應於交聯的vip076/vip017的獨特條帶的確與vip017-Gly和vip017-Leu一起出現(分別為變性PAGE的泳道2和3)，當沒有EDC/sNHS活化(變性PAGE的泳道8和9)或具有未乙醯化的vip017(變性PAGE的泳道1)時所述條帶不存在。有趣的是，當vip008不存在時，無法檢測到所述獨特條帶(變性PAGE的泳道5和6)。這舉例說明了，通過星形結構可以指導化學反應，並且在指導化學反應方面星形結構似乎比2個退火的oligo更有效。
實施例6星形結構的裝配和連接在這個實施例中證實了，由dsDNA組成的三聚體DNA星形結構的成功擴增。使互相互補的雙特異性寡核苷酸退火，連接，並隨後在PCR反應中用作模板。使用下列寡核苷酸vip029-vip031-vip0132-vip0133-vip030。圖13圖解顯示了寡核苷酸的雜交。
DNA寡核苷酸(由DNA Technology rhus，Denmark製備)各自在1×連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl中以2μM的濃度進行混合。混合物如下進行孵育94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃直至下一步驟。退火操作過程在Applied Biosystems AB2720 PCR機器上進行。
寡核苷酸的5′末端通過T4 DNA多核苷酸激酶進行磷酸化。製備由1.5μM星形結構、1×DNA連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl和0.17U/μl T4 DNA多核苷酸激酶(New England Biolabs，cat#M0201)組成的混合物，並在37℃孵育30分鐘。
通過在10μl體積的1×DNA連接酶緩衝液(New EnglandBiolabs)、50mM NaCl和200U T4 DNA連接酶(New England Biolabs，cat#M0202)中的T4 DNA連接酶(New England Biolabs，cat#M0202)，並在16℃孵育過夜，而在經退火的寡核苷酸的並列末端之間形成磷酸二酯鍵。
利用下列條件進行PCR擴增反應在1×ThermoPol緩衝液(New England Biolabs B9004S)中用0.2mM dNTPs(New England Biolabs O447S)、8mM MgSO4、0.2μM有義引物和0.2μM反義引物、1M甜菜鹼(Sigma B0300)、1U/100μl Vent(exo-)(New England Biolabs M0257L)來進行。使用的引物是vip027和vip028。這2種引物的生物素化的形式分別是vip034和vip038。利用下列循環條件進行PCR擴增95℃2分鐘，和95℃/30秒、60℃/30秒、74℃/30秒的20個循環。下文實施例7中報導的用於摺疊和ssDNA純化的PCR產物用vip034和vip028引物來製備。通過非變性PAGE來分析PCR產物。201bp的條帶在圖13中描繪的凝膠中清晰可見。
實施例7PCR產物的重摺疊PCR產物的摺疊如下進行。利用PerfectPrep(Eppendorf，cat#00320 07.740)根據試劑盒說明書進行PCR淨化操作。在10μl體積(5μl/產物與5μl 2×緩衝液/引物混合物混合)的0.1M NaCl、0.1％Triton X-100、0.1μM vip027、0.1μM vip028中進行摺疊。使用4種不同濃度的PCR產物(1∶2稀釋度-1∶20稀釋度)。在一個系列中，混合物在沸水中孵育2分鐘，隨後在冰/水浴中冷卻。在第二個系列中，混合物利用下列程序在ABI2720 PCR機器上進行加熱和冷卻94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃直至下一步驟。在第三個系列中，不進行加熱或冷卻。
產物在20％TBE尿素凝膠(Invitrogen)上進行分析。凝膠用SYBRGreen(Molecular Probes S7563，根據說明書在1×TBE緩衝液中作1∶10000稀釋)進行染色。
在圖14中，凝膠泳道包括下列內容物泳道11∶2稀釋的PCR產物，快速冷卻泳道21∶4稀釋的PCR產物，快速冷卻泳道31∶10稀釋的PCR產物，快速冷卻泳道41∶20稀釋的PCR產物，快速冷卻泳道51∶2稀釋的PCR產物，逐步冷卻泳道61∶4稀釋的PCR產物，逐步冷卻泳道71∶10稀釋的PCR產物，逐步冷卻泳道81∶20稀釋的PCR產物，逐步冷卻泳道91∶2稀釋的PCR產物，不處理泳道101∶4稀釋的PCR產物，不處理泳道111∶10稀釋的PCR產物，不處理泳道121∶20稀釋的PCR產物，不處理泳道13隻有PCR產物。
實驗顯示，單鏈星形結構DNA以大約1000bp遷移，與201bp dsDNA產物形成對比。看起來，星形結構形成的最佳條件是加熱後將反應混合物快速冷卻。
實施例8重摺疊的星形結構的純化利用經鏈黴抗生物素蛋白包被的磁性珠(Dynal，cat#650.02)純化ssDNA星形結構。10μl珠用2×BWT(2M NaCl，10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，0.2％Triton X-100)洗滌2次。最後1次洗滌後，將珠懸浮於1體積的2×BWT中，並加入1體積的重摺疊的PCR產物。懸浮液在室溫下孵育15分鐘，不時地進行混合。將管置於磁體中，並在收集了珠後去除上清液。將珠懸浮於50℃溫熱的洗滌緩衝液(2M尿素，0.1％Triton X-100)中，並在50℃孵育2分鐘。將管置於磁體上，並總共進行3次洗滌操作。最後1次洗滌在1×BWT(1M NaCl，5mM Tris-HCl，pH 8.0，0.5mM EDTA，0.1％TritonX-100)中進行。去除最後的洗滌緩衝液後，將珠懸浮於1.5ml NT(10mM NaCl、0.1％Triton X-100)中，並在50℃孵育5分鐘。將管轉移到冰/水浴中快速冷卻，這個操作導致固定在經鏈黴抗生物素蛋白包被的磁珠上的星形結構形成。將管在快速冷卻後置於磁體中，並去除上清液。將珠懸浮於50μl NT中，準備用BsaI消化以從珠中釋放出ssDNA。
將17μl珠加入至2μl 10×NEB3緩衝液和1μl BsaI(10U/μl；NEB R0535L)中。反應混合物在50℃孵育1個半小時。消化產物通過下列方法進行分析施行變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(10％TBE-尿素凝膠，Invitrogen)，向樣品中加入變性上樣緩衝液，並在凝膠孔中加入包含珠的整個混合物。凝膠用SYBR Green(Molecular ProbesS7563，根據說明書在1×TBE緩衝液中作1∶10000稀釋)進行染色。
在圖15中，在泳道1即(+BsaI)泳道中觀察到1個條帶，而在泳道2即『-BsaI』泳道中沒有看到條帶。因此，通過酶切割下單鏈產物的能力證實，ssDNA在經鏈黴抗生物素蛋白包被的磁性珠上進行摺疊從而形成用於BsaI的底物。
實施例9環形式的消化設計2個基因組，兩者均使得能夠在星形結構的環中進行消化。限制性內切酶通常不能消化ssDNA。然而，10-聚體的寡核苷酸對環的退火產生適合於酶的底物，由此酶的識別序列將成為雙鏈。圖16中圖解顯示了本實驗的設計。
裝配了2種結構，s129和s149。s129由下列寡核苷酸組成vip029-vip161-vip162-vip163-vip070。s149由下列寡核苷酸組成vip029-vip161-vip192-vip193-vip070。vip162、vip163、vip192和vip193全都包含用於2種限制性內切酶的識別序列(vip162ApaI和BamHI；vip163EcoRI和KpnI；vip192PvuII和SacI；vip193SmaI和VspI)。
DNA oligo(由TAGC，Copenhagen，Denmark製備)各自在1×連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl中以2μM的濃度進行混合。混合物如下進行孵育94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃直至下一步驟。退火操作在Applied Biosystems AB2720 PCR機器上進行。
寡核苷酸的5′末端通過T4 DNA多核苷酸激酶進行磷酸化。製備由1.5μM星形結構、1×DNA連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl和0.17U/μl T4 DNA多核苷酸激酶(New England Biolabs，cat#M0201)組成的混合物，並在37℃孵育30分鐘。
通過在10μl體積的1×DNA連接酶緩衝液(New EnglandBiolabs)、50mM NaCl和200U T4 DNA連接酶(New England Biolabs，cat#M0202)中的T4 DNA連接酶(New England Biolabs，cat#M0202)，並在16℃孵育過夜，而在經退火的寡核苷酸的並列末端之間形成磷酸二酯鍵。
利用下列條件進行PCR擴增反應在1×ThermoPol緩衝液(NEB B9004S)中用0.2mM dNTPs(NEB O447S)、8mM MgSO4、0.2μM有義引物和0.2μM反義引物、1M甜菜鹼(Sigma B0300)、1U/100μl Vent(exo-)(NEB M0257L)來進行。使用的引物是vip027和vip028。所述引物的生物素化的形式分別是vip034和vip038。利用下列循環條件進行PCR擴增95℃2分鐘，和95℃/30秒、60℃/30秒、74℃/30秒的20個循環。
實驗結果顯示於圖17中。
在泳道1和3中，可以看出2個基因組均成功擴增。泳道2和4是沒有添加用於所述2個基因組的連接酶的陰性對照。
s129和s149的ssDNA結構的純化。
利用PerfectPrep(Eppendorf，cat#0032 007.740)根據試劑盒說明書純化每個基因組的80μl PCR產物(利用vip034和vip028引物製得)。洗脫在40μl洗脫緩衝液中進行。為了重摺疊PCR產物，進行下列操作對於40μl PCR產物，加入750μl 0.2M NaCl、0.2％Triton X-100、7.5μl vip027和7.5μl vip028、和695μl H2O。將混合物在沸水中孵育5分鐘，並在冰-水浴中快速冷卻。
將20μl鏈黴抗生物素蛋白珠(Dynal，650.02)用2×BWT(2MNaCl、10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA、0.2％Triton X-100)洗滌2次。最後一次洗滌後，將珠懸浮於1體積的2×BWT中，並加入1體積的重摺疊的PCR產物。懸浮液在室溫下孵育15分鐘，不時地進行混合。將管置於磁體中，並在收集了珠後去除上清液。將珠懸浮於50℃溫熱的洗滌緩衝液(2M尿素，0.1％Triton X-100)中，並在50℃孵育2分鐘。將管置於磁體上，並總共進行3次洗滌操作。最後一次洗滌在1×BWT(1M NaCl，5mM Tris-HCl，pH 8.0，0.5mM EDTA，0.1％Triton X-100)中進行。在磁體上分開後，將珠懸浮於50μl 10mM NaCl、0.1％Triton X-100中。
將每個製備物的20μl珠在磁體上分開，並懸浮於10μl 100mMNaCl、0.1％Triton X-100中。將每個製備物分成各為5μl的2管，並且如下添加消化oligo1s129-vip164-ApaI2s129-vip165-KpnI3s149-vip194-PvuII4s149-vip195-VspI。
加入0.25μl oligo(20μM儲液)，得到的終濃度為1μM。退火在AB2720 PCR機器上利用下列程序進行50℃-2分鐘；40℃-2分鐘；35℃-2分鐘；30℃-2分鐘；30℃-2分鐘；25℃-2分鐘；20℃-2分鐘。
珠在100μl 100mM NaCl、0.1％Triton X-100中進行洗滌。隨後，將珠懸浮在18μl 1.1×消化緩衝液中。將反應混合物分為2管，各為9μl，並向每個管中加入1μl酶(10單位)，得到用於消化的1×消化緩衝液。一組消化體系在30℃孵育，和另一組在37℃孵育。孵育進行5小時，不時地進行混合以使珠從管底部懸浮起來。
消化後，產物在10％TBE-尿素凝膠(Invitrogen)上進行分析。向消化產物中加入上樣緩衝液，並且在凝膠上加入包含珠的整個反應混合物。凝膠用SYBR Green(Molecular Probes S7563，根據說明書在1×TBE緩衝液中作1∶10000稀釋)進行染色。
實驗結果顯示於圖18中。
泳道1顯示在37℃經ApaI消化的s129，泳道2顯示在37℃經KpnI消化的s129，泳道3顯示在37℃經PvuII消化的s149，泳道4顯示在37℃經VspI消化的s149，泳道5顯示在30℃經ApaI消化的s129，泳道6顯示在30℃經KpnI消化的s129，泳道7顯示在30℃經PvuII消化的s149，泳道8顯示在37℃經VspI消化的s149。
預期的條帶大小如下ApaI163nt，KpnI80nt，PvuII165nt，VspI83nt。
在凝膠上的確出現了關於所有4種酶的預期大小的條帶。注意到，包含生物素的片段沒有進入凝膠，因為它們與珠結合。兩種溫度均得到產物，顯示了該操作的堅固性。
實施例10以各種拓撲結構，DNA指導了醯胺鍵的形成通過同雙官能連接體BSOCOES((雙[2-(琥珀醯亞氨基氧基羰基氧基)乙基]碸)，Pierce cat#21600)，通過將胺基酸(甘氨酸，Flukacat#50052)經α-胺與vip017中修飾的內部dT上的伯胺交聯而對寡核苷酸vip017進行官能化，其步驟為在200mM pH 7.4磷酸鈉溶液(200μl)中用0.1體積的在DMF中的100mM BSOCOES溶液於25℃處理所述寡核苷酸(5nmol)10分鐘，隨後用0.3體積的在300mM NaOH中的300mM胺基酸(甘氨酸)溶液於25℃處理2小時。反應總體積為200μl。粗連接的胺基酸試劑通過EtOH沉澱來分離，並且無需進一步純化即可使用。
根據(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″Molecular Cloninga Laboratory Manual″，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring，Harbor，New York)通過NaOAc/EtOH來沉澱DNA。將粒狀沉澱重懸浮於水中。
寡核苷酸通過製備下列物質來進行退火0.556μM每種寡核苷酸、111mM MOPS pH 6.5(Fluka 69947)、1.11M NaCl(Fluka 71376)，並隨後如下進行孵育94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃直至下一步驟。退火操作在AppliedBiosystems AB2720 PCR機器上進行。
通過向預退火的寡核苷酸加入100mM DMTMM(Acros，cat#A017657001)來進行DNA指導的化學反應(醯胺鍵形成)。DMTMM以1M的濃度溶解於水中。在加入DMTMM前，將反應混合物預熱至50℃。每種寡核苷酸的終濃度為0.5μM。反應在20μl體積的100mM MOPS pH6.5、1M NaCl、100mM DMTMM(終濃度)中於50℃進行3小時。
通過非變性PAGE(20％聚丙烯醯胺，Invitrogen)和變性PAGE(10％聚丙烯醯胺，7M尿素，Invitrogen)，隨後用SYBR Green(Molecular Probes S7563，根據說明書在1×TBE緩衝液中作1∶10000稀釋)進行染色來分析反應。所有結果顯示於圖19中。
通過同雙官能連接體BSOCOES，通過將胺基酸(甘氨酸)經α-胺與vip017中修飾的內部dT上的伯胺交聯而對寡核苷酸vip017進行官能化。經修飾的dT位於vip017中的2個雜交區段之間。vip008不包含在經修飾的dT上的受體胺，它包含1個雜交區段，藉助其它將與vip017雜交，並且因此在加入DMTMM後它將不與vip017-Gly共價交聯。因此，在泳道1中沒有觀察到可見條帶。
vip018-NH2具有包含伯胺的經修飾的dT，隨後為與vip017中5′雜交區段互補的3′雜交區段。因此，通過使vip017-Gly和vip018-NH2退火，在與vip017綴合的胺基酸和vip018上的伯胺之間創造了接近度。因此，在泳道2中觀察到對應於由交聯的vip017-Gly/vip018-NH2組成的二聚體的條帶。
vip006具有與vip017-Gly和vip018-NH2互補的區段，因此它能夠形成閉合的三聚體星形結構，並在星形結構中心的反應室內排列vip017-Gly和vip018-NH2的化學官能團。因此，在泳道3中觀察到對應於由交聯的vip017-Gly/vip018-NH2組成的二聚體的條帶。此外，泳道3包含比泳道2更多的著色，表明閉合的三聚體星形結構創造了比開放的二聚體結構更好的反應條件。
vip020-NH2具有包含伯胺的經修飾的dT，但它不包含與vip017-Gly雜交的區段。因此，在泳道4中沒有出現條帶，因為vip020-NH2和vip017-Gly的反應物沒有通過鹼基配對而被帶至接近度。
vip006具有一個能夠與vip017-Gly的區段雜交的雜交區段，和另一個能夠與vip020-NH2雜交的雜交區段，它在其2個雜交區段之間具有包含伯胺的經修飾的dT。因此，vip006將官能團帶至接近度，並且在泳道5中可以看見由交聯的vip017-Gly和vip020-NH2構成的條帶。
vip009具有一個能夠與vip017-Gly的區段雜交的雜交區段，和另一個能夠與vip020-NH2雜交的雜交區段，它在其2個雜交區段之間具有包含伯胺的經修飾的dT。因此，vip009將官能團帶至接近度。因此，在泳道6中觀察到由交聯的vip017-Gly和vip020-NH2構成的條帶。
vip006具有一個能夠與vip017-Gly的區段雜交的雜交區段，和另一個能夠與vip020-NH2雜交的雜交區段，它在其2個雜交區段之間具有包含伯胺的經修飾的dT。vip009具有一個能夠與vip017-Gly的區段雜交的雜交區段，和另一個能夠與vip020-NH2雜交的雜交區段，它在其2個雜交區段之間具有包含伯胺的經修飾的dT。這4種寡核苷酸的雜交導致形成四聚體星形結構。在泳道7中觀察到條帶，顯示vip017-Gly和vip020上的官能團通過這4種寡核苷酸的雜交而被帶至互相接近。此外，泳道7包含比泳道5和6更多的著色，表明閉合的四聚體星形結構創造了比開放的三聚體結構更好的反應條件。
vip048-NH2具有包含伯胺的經修飾的dT，和一個能夠與vip017-Gly結合的雜交區段。在具有伯胺的經修飾的dT和能夠對vip017-Gly退火的雜交區段之間插入了不參與雜交的6個核苷酸(擺動核苷酸(wobble nucleotide))。在泳道8中觀察到條帶，由此表明這2種寡核苷酸的交聯。然而，通過比較泳道8和2可以看出，導入的6個額外的核苷酸降低了得到的交聯產物的量。
vip006具有一個能夠與vip017-Gly的區段雜交的雜交區段，和另一個能夠與vip048雜交的雜交區段。vip048-NH2具有包含伯胺的經修飾的dT，和一個能夠與vip017-Gly結合的雜交區段。在具有伯胺的經修飾的dT和能夠對vip017-Gly退火的雜交區段之間插入了不參與雜交的6個核苷酸(擺動核苷酸)。
vip006的存在將2個反應性基團帶至接近度，並且如泳道9中所見形成了產物。條帶強度比在泳道8中見到的更強，表明vip006使結構(三聚體星形結構)穩定並且反應比在二聚體形式的反應中所發現的進行得更好。
vip048-NH2具有包含伯胺的經修飾的dT，和一個能夠與vip017-Gly結合的雜交區段。在具有伯胺的經修飾的dT和能夠對vip017-Gly退火的雜交區段之間插入了不參與雜交的6個核苷酸(擺動核苷酸)。vip056包含一個能夠與vip017-Gly雜交的雜交區段，和另一個能夠與包含6個擺動核苷酸的vip048-NH2的區段雜交的雜交區段。因此，在這3種寡核苷酸退火後，vip048上經修飾的dT上的伯胺離反應室6個核苷酸，並且現在位於雙鏈臂上。與單鏈DNA相反，雙鏈DNA非常堅固，從而阻止綴合的部分自由移動並由此降低其反應性。因此，在泳道10中只觀察到非常微弱的染色。
vip018-NH2具有包含伯胺的經修飾的dT，隨後為與vip017-Gly中的5′雜交區段互補的3′雜交區段。
vip056包含一個能夠與vip017-Gly雜交的雜交區段，和另一個能夠與vip018-NH2的區段雜交的雜交區段。在這2個雜交區段之間，vip056包含6個額外的核苷酸(擺動核苷酸)。在泳道11中可見二聚體條帶，表明反應性基團被帶至互相接近以使化學反應發生，並且vip056中的6個擺動核苷酸不損害這個實驗中當前結構的接近度。
實施例11各種寡核苷酸的化學製備實施例11.1具有經修飾的內部dT(胺-C6-dT)的寡核苷酸的乙醯化(位置n＝1)利用由DMT-MM促進的Fmoc-AA-OH進行並乙醯化利用由DMT-MM(4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽，Fluka#74104)促進的Fmoc-Leu-OH來乙醯化具有內部胺-C6-dT的寡核苷酸vip068，方法為用一種下列緩衝液處理溶解於DMF和300mM NaCl的1∶1混合物中的寡核苷酸(500pmol)磷酸鈉400mM，pH 7.0，MOPS 400mM，pH 7.5，HEPES 400mM pH 8.0，磷酸鈉400mM，pH 8.8，含DMT-MM 50mM。反應總體積為20μL。反應體系在25℃孵育16小時。將反應混合物稀釋至50μL，並根據廠商規程在旋轉柱(spincolumn)(Amersham Biosciences#27-5325-01)上純化，隨後為HPLC純化和質譜分析。
概括的純化方法通過具有自動採樣器和級分收集器的Hewlett Packard AgilentHPLC裝置在XTerra C18柱(Waters#186000602)上純化官能化的寡核苷酸，使用乙腈/TEAA 100mM pH 7.0混合物作為洗脫劑。將合適的級分凍幹，並用水稀釋至20mM。
概括的質譜分析通過MALDI-TOF質譜法，在Bruker AutoFlex裝置上，於HPA/檸檬酸銨基質中分析官能化的寡核苷酸，採用陰離子反射器模式(negative ion reflector mode)。
DNA 計算出的質量測得的質量vip068-LeuFmoc6843.3406844.5實施例11.2具有經修飾的內部dT(胺-C6-dT)的寡核苷酸的乙醯化(位置n＝1)利用Fmoc-AA-OSu的乙醯化利用Fmoc-AA-OSu(AA＝Gly或Leu)來醯化寡核苷酸vip046，方法為用25mM Fmoc-Gly-OSu(ChemImpex#02420)或Fmoc-Leu-OSu(ChemImpex#02429)在25℃處理溶解於DMF和100mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.4)的1∶1混合物中的寡核苷酸(125pmol)2小時。根據(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，″MolecularCloninga Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring，Harbor，New York)通過NH4OAc/EtOH來沉澱官能化的寡核苷酸。將粒狀沉澱重懸浮於水中，並通過MALDI-TOF質譜法進行分析。
DNA 計算出的質量測得的質量vip046-LeuFmoc6932.3642 6932.1
vip046-GlyFmoc6876.3016 6876.1實施例11.3具有經修飾的內部dT(胺-C6-dT)的寡核苷酸的乙醯化(位置n＝1)肽-寡核苷酸綴合物的合成(使用胺基酸的單字母縮寫)YGGFL-Vip068、GLFYG-Vip068、YGGFL-PEG-Vip068、GLFYG-PEG-Vip068、GFL-Vip016和GFL-PEG-Vip016利用Fmoc-AA-OSu乙醯化，隨後在Sepharose上脫保護。
從吸收在DEAE Sepharose(Sigma#DFF100)上的寡核苷酸的經修飾的內部dT上的伯胺合成肽。根據Halpin和Harbury的操作(PlosBiology 2004，2，1-8)，通過利用Fmoc-AA-OSu(AA＝Gly、Leu、Phe、Tyr、C6、PEG)(Fmoc-L-甘氨酸N-羥基琥珀醯亞胺酯，ChemImpex#02420；Fmoc-L-亮氨酸N-羥基琥珀醯亞胺酯，ChemImpex#02429；Fmoc-L-苯丙氨酸N-羥基琥珀醯亞胺酯，ChemImpex#02446；Fmoc-L-酪氨酸N-羥基琥珀醯亞胺酯，ChemImpex#11972；Fmoc-6-氨基己酸N-羥基琥珀醯亞胺酯，ChemImpex#7296；Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸羥基琥珀醯亞胺酯，通過與N-羥基琥珀醯亞胺的EDC偶聯而從Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸(ChemImpex#7310)合成)的醯化以及隨後Fmoc脫保護的循環，使胺基酸偶聯。從Sepharose上洗脫DNA後，混合物在旋轉柱(Amersham Biosciences#27-5325-01)上根據廠商規程進行脫鹽，隨後通過HPLC純化。通過HPLC測定得率。
DNA 分離的得率YGGFL-Vip068 19％YGGFL-PEG-Vip068 32％GLFYG-Vip068 11％GLFYG-PEG-Vip068 18％GFL-Vip016 30％GFL-PEG-Vip016 36％
實施例11.4具有經修飾的內部dT(胺-C6-dT)的寡核苷酸的乙醯化(位置n＝1)具有C6-NH2、PEG-NH2和Gly-NH2連接體的受體寡核苷酸的合成根據Halpin和Harbury的操作(Plos Biology 2004，2，1-8)，利用FmocNH-C6-CO2Su(Fmoc-6-氨基己酸N-羥基琥珀醯亞胺酯，ChemImpex#7296)、FmocNH-PEG-OSu(Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸羥基琥珀醯亞胺酯，通過與N-羥基琥珀醯亞胺的EDC偶聯而從Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸(ChemImpex#7310)合成)或Fmoc-Gly-OSu(Fmoc-L-甘氨酸N-羥基琥珀醯亞胺酯，ChemImpex#02420)，在vip016的經修飾的內部dT上的伯胺處，對吸收在DEAESepharose(Sigma#DFF100)上的寡核苷酸vip016進行醯化，隨後切割Fmoc保護基團。對1nmol DNA進行反應。從Sepharose上洗脫DNA後，混合物在旋轉柱(Amersham Biosciences#27-5325-01)上根據廠商規程進行脫鹽，隨後通過HPLC純化。通過HPLC測定得率。
DNA分離的得率H2N-PEG-vip016 39％H2N-C6-vip016 39％H-G-vip016 45％實施例11.5胺基酸與具有經修飾的內部dT(胺-C6-dT)的寡核苷酸經由BSOCOES或DSS在n≠1的位置上綴合通過同雙官能連接體BSOCOES((雙[2-(琥珀醯亞氨基氧基羰基氧基)乙基]碸)，Pierce cat#21600)和DSS(辛二酸二琥珀醯亞胺酯(Disuccinimidyl suberate)，Pierce#21655)，通過將胺基酸(Gly、L-Leu、L-Phe、L-Tyr，Fluka，#50052、#61820、#78020、#93829)經α-胺與寡核苷酸中修飾的內部dT上的伯胺交聯而對寡核苷酸vip046、vip017、vip047和vip048進行官能化，其步驟為在具有連接體(10mM)的DMF和400mM pH 8.4磷酸鈉緩衝液的1∶1混合物中處理所述寡核苷酸(0.5nmol)和所述胺基酸(15mM)。反應總體積為20μL。反應體系在25℃孵育4小時。將反應混合物稀釋至50μL，並根據廠商規程在旋轉柱(Amersham Biosciences#27-5325-01)上進行純化，隨後通過HPLC進行純化。通過HPLC測定得率。通過MALDI-TOF質譜法確定同一性。
DNA 分離的得率 計算出的質量 測得的質量vip046-BSOCOES-Gly32％6878.2325 6879.3vip046-BSOCOES-Leu48％6934.2951 6936.1vip046-BSOCOES-Phe49％6968.2795 6969.0vip046-BSOCOES-Tyr51％6984.2744 6985.5實施例12在不同溫度下，在反應中心中的醯化反應的穩定性在這個實施例中證實了，在三聚體星形結構中，1個胺基酸的轉移如何能夠在升高的溫度下進行。結果顯示於圖20中。
將oligo vip006、vip018和vip017-Leu(DNA Technology Arhus，Denmark，如實施例11中所述進行衍生的vip017)以20mM儲液在緩衝液中混合，所述緩衝液包含嗎啉代丙磺酸(MOPS，100mM，pH 7.0)和NaCl(1M)的最終組成。對溶液實施退火程序(PCR機器94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。每個反應加入化學活化劑(DMTMM，Fluka #74104，100mM水溶液，終濃度為5mM)，並在25℃或70℃孵育指定的時間。
通過變性(10％)PAGE分析反應混合物，並通過SYBR Green染色而顯現出條帶(凝膠在50％EtOH中固定5分鐘，在水浴中洗滌5分鐘，隨後在SYBR Green的DMSO儲液於1×TBE緩衝液中的10000倍稀釋液中孵育10分鐘)。
對於在25℃進行的反應，在第一個2小時後觀察到不可檢測量的產物(反應1-5)。在4小時反應(反應6)中，觀察到少的量。在過夜孵育後觀察到顯著的量，當加入更多活化劑時觀察到最高強度。
對於在70℃進行的反應，在5分鐘(反應2)後觀察到第一種痕量產物。直至240分鐘觀察到量逐漸增加，隨後對於過夜反應觀察到量降低。
在25℃和70℃都明顯形成了所希望的vip017-Leu和vip018的交聯產物，從而證實星形結構在升高的溫度下能夠介導反應進行。在這個實驗中使用的兩種溫度下，反應速度明顯不同。然而，這被預期為DMTMM對於胺基酸羧酸的最初激活僅受分子間碰撞控制，而不受DNA操縱。
實施例13在不同pH下，在反應中心中的醯化反應的穩定性在這個實施例中證實了，在三聚體星形結構中，1個胺基酸如何能夠在5.2-8.0的pH範圍內進行轉移。在低pH下，受體氨基可以部分質子化，從而使其失活為潛在的親核體。在較高pH下，由胺基酸羧酸活化而產生的反應中間體可以被水解，從而使其減活並破壞化學活化劑。兩者均可阻礙所需醯胺鍵的形成。結果顯示於圖21中。
將oligo vip016、vip008和vip017-Tyr(DNA Technology Arhus，Denmark，如實施例11中所述進行衍生的vip017)以20mM儲液在2MNaCl中混合，並對其實施退火程序(PCR機器94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。這個退火混合物在緩衝液中進行稀釋直至含有嗎啉代丙磺酸(MOPS，100mM，pH 5.2、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0)、NaCl(1M)和化學活化劑(DMTMM，Fluka#74104，1.0M水溶液，終濃度為75mM)的最終組合物，並在50℃孵育1小時。DNA終濃度為0.5mM。通過變性PAGE(10％凝膠)來分析反應混合物，所述變性PAGE凝膠用SYBR Green(由DMSO儲液在TBE-EtOH(96％)1∶1中作10000倍稀釋)孵育10分鐘。
涵蓋了pH 5.2-8.0的所有7個泳道顯示出關於交聯的oligovip016-vip017-Tyr的強條帶，表明具有在其中可進行操作的寬的pH窗。因此，使用上述條件，受體胺的質子化或反應中間體的水解不是嚴重問題。
實施例14在不同水平的有機溶劑下，在反應中心中的醯化反應的穩定性為了證實DNA星形結構的穩定性，在H2O和有機溶劑的混合物中進行1個胺基酸的轉移，從而類似於在有機化學合成中使用的條件。如果鹼基配對和星形結構在這些條件下被破壞，則交聯產物不能形成。根據與水的可混性以及在有機合成中的一般適用性選擇溶劑二烷、乙腈和四氫呋喃。
將oligo vip016、vip008和vip017-Phe(DNA Technology Arhus，Denmark，如實施例11中所述進行衍生的vip017)以20μM儲液在含MOPS(200mM，pH 6.5；Fluka#69947)和NaCl(2M；Fluka#71376)的緩衝液中混合，並對其實施退火程序(PCR機器94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。該退火混合物在溶劑和水的混合物中進行稀釋直至含有嗎啉代丙磺酸(MOPS，100mM，pH 6.5)、NaCl(1M)、溶劑(0、10、20、30或35vol％)和化學活化劑(DMTMM，Fluka#74104，1.0M水溶液，終濃度為75mM)的最終組合物，將其在50℃孵育1小時。DNA終濃度為0.5mM。通過變性PAGE(10％凝膠)來分析反應混合物，所述變性PAGE凝膠根據廠商說明書用SYBR Green(Molecular Probes，#S7563)進行染色。結果顯示於圖22中。
對於二烷，用高達20％的溶劑形成交聯產物。另一方面，對於包含乙腈或四氫呋喃的所有反應，形成的產物量相似，從而表明至少高達35％的有機溶劑的存在是被良好耐受的，並且DNA鹼基配對是完好無損的。
實施例15在不同水平的DMF下，反應中心的穩定性為了證實DNA星形結構的穩定性，在H2O-DMF混合物中進行1個胺基酸的轉移，從而類似於在有機化學合成中使用的條件。如果鹼基配對和星形結構在這些條件下被破壞，則交聯產物不能形成。
將oligo vip016、vip008和vip017-Phe(DNA Technology Arhus，Denmark，如實施例11中所述進行衍生的vip017)以20μM儲液在含MOPS(500mM，pH 6.5；Fluka#69947)和NaCl(4M；Fluka#71376)的緩衝液中混合，並對其實施退火程序(PCR機器94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。該退火混合物在DMF和水的混合物中進行稀釋直至含有嗎啉代丙磺酸(MOPS，12.5mM，pH 6.5)、NaCl(100mM)、DMF(0、10、20、30、40、50、60或70vol％的DMF)和化學活化劑(DMTMM，Fluka#74104，1.0M水溶液，終濃度為75mM)的最終組合物，其在25℃孵育過夜。DNA終濃度為0.5μM。通過變性PAGE(10％凝膠)來分析反應混合物，所述變性PAGE凝膠根據廠商說明書用SYBR Green(Molecular Probes，#S7563)進行染色。結果顯示於圖23中。
在前5個泳道中產生的產物條帶具有類似的強度，從而表明至少高達40％的有機溶劑DMF的存在是被良好耐受的，並且DNA鹼基配對是完好無損的。在50％的DMF時，仍可觀察到微弱條帶，但從60％開始及以上，沒有檢測到交聯產物。
實施例16介導化學反應的不同活化劑這個實施例用於舉例說明各種化學活化劑和輔助性親核體如何能夠用於介導受體胺與胺基酸的醯化。由肽化學已知，添加輔助性親核體可以極大地提高醯化的速度和/或改變反應的最終結果。在這個實施例中，反應不使用輔助性親核體來進行，使用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS，例如Fluka#56480)、N-羥基硫代琥珀醯亞胺鈉鹽(s-NHS，Fluka#56485)或N-羥基苯並三唑水合物(例如Fluka#54804)，使用DMTMM(Fluka#74104)或EDC(例如Fluka#03449)作為活化劑。
將oligo vip016、vip008和vip017-Tyr(DNA Technology Arhus，Denmark，如實施例11中所述進行衍生的vip017)以20mM儲液在含MOPS(200mM，pH 6.5)和NaCl(2M)的緩衝液中混合，並對其實施退火程序(PCR機器94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。該退火混合物用水和添加劑溶液進行稀釋直至含有嗎啉代丙磺酸(MOPS，100mM，pH 6.5)、NaCl(1M)、輔助性親核體(終濃度25mM)和化學活化劑(DMTMM或EDC，0.5M水溶液，終濃度為75mM)的最終組合物。DNA終濃度為0.5mM。反應在50℃孵育1小時。
通過變性PAGE(10％凝膠)分析反應混合物，所述變性PAGE凝膠用SYBR Green(由DMSO儲液在TBE-EtOH(96％)1∶1中作10000倍稀釋)孵育10分鐘。結果顯示於圖24中。
反應1-4利用DMTMM作為活化劑，使用添加劑或不使用添加劑沒有觀察到差異。只有對於EDC的觀察是最明顯的，在這種情況下，沒有觀察到產物或只微弱地觀察到產物。然而，任何一種輔助性親核體的添加再次得到相當量的交聯產物。這證實，當使用EDC作為活化劑時輔助性親核體是必需的，否則它在反應混合物中是被良好耐受的。
實施例17胺基酸向其他受體的轉移這個實施例證實了，胺基酸如何能夠有效地轉移至以各種方式連接的眾多受體胺上。如前使用攜帶C6-NH2的vip016作為對照。其他受體是三肽GFL-vip016、連接有PEG的三肽GFL-PEG-vip016、氨基官能化的NH2-PEG-vip016、氨基官能化的NH2-C6-vip016和在G-vip016中的甘氨酸(所有均如在實施例XX中所述進行製備)。
將oligo vip016-X-NH2、vip008和vip017-Gly(DNA TechnologyArhus，Denmark，如實施例XX中所述進行衍生的vip017)以20mM儲液在含MOPS(200mM，pH 6.5)和NaCl(2M)的緩衝液中混合，並對其實施退火程序(PCR機器94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。該退火混合物用水和活化劑溶液進行稀釋直至含有嗎啉代丙磺酸(MOPS，100mM，pH6.5)、NaCl(1M)和化學活化劑(DMTMM，Fluka#74104，1.0M水溶液，終濃度為75mM)的最終組合物。DNA終濃度為0.5mM。反應體系在50℃孵育1小時。
通過變性PAGE(10％凝膠)來分析反應混合物，所述變性PAGE凝膠用SYBR Green(由DMSO儲液在TBE-EtOH(96％)1∶1中作10000倍稀釋)孵育10分鐘。結果顯示於圖25中。
所有6個反應均顯示出來自交聯產物的強條帶。觀察到，由於具有更大的肽(四肽)，泳道4和5與其他泳道相比在邊上走得更慢。因此，將1個甘氨酸轉移給經由三肽+/-PEG連接體、PEG連接體本身、C6連接體或直接甘氨酸進行連接的氨基給出了一致的結果。這證實了由星形結構形成的反應器的堅固性。受體大小的增加對交聯結果有很小的影響或沒有影響。
實施例182種結構型DNA展示產物的裝配和後續結合形成2種結構型DNA展示產物亮啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-DNA)和亂序的(scrambled)亮啡肽(Gly-Leu-Phe-Tyr-Gly-DNA)。後者被包括作為陰性對照，以用於利用亮啡肽特異性單克隆抗體3E7的劃分性測定。圖26中舉例說明了該方法的關鍵步驟。
DNA寡核苷酸從DNA Technology(Aarhus，Denmark)購買並如實施例11中所述進行官能化。
該方法的第1個步驟涉及在2個分開的反應中進行下列oligo的退火，以分別形成亮啡肽-DNA和亂序的亮啡肽。在反應1(R1)中Gly-Phe-Leu-PEG-vip231、Gly-BSOCOES-vip262和vip088(分別在3-向的DNA星形結構的位置1、2和3上)，和在反應2(R2)中Gly-Tyr-Phe-PEG-vip238、Leu-BSOCOES-vip269和vip088(分別在3-向的DNA星形結構的位置1、2和3上)。反應中的3種oligo將互相雜交，從而形成3-向連結體，其中所聯接的胺基酸位於結構的中心。注意到，vip088沒有聯接化學官能團。vip088的功能僅僅是與來自閉合的3-向連結體的其他兩種oligo雜交。
將200pmol的每種oligo在總體積為370μl的100mM嗎啉代丙磺酸(MOPS，Fluka#69947)(pH 6.5)和1M NaCl中混合。通過在95℃孵育5分鐘來進行oligo的退火，然後冷卻至室溫大約30分鐘。將活化劑DMT-MM(Fluka#74104)溶解於水中，並添加直至終濃度為75mM。最終的反應體積為400μl。該化學反應體系在50℃孵育1小時。然後，通過向每個反應體系中加入2.5體積的乙醇和1μlGenElute(Sigma 56575)，並於4℃以20000×g將管離心30分鐘，而對產物進行乙醇沉澱。粒狀沉澱用70％乙醇洗滌，隨後進行空氣乾燥，並重懸浮於水中。
然後，根據廠商說明書對樣品實施製備型變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)10％TBE-尿素凝膠(Invitrogen)。切下對應於交聯產物的條帶，並通過「壓碎和浸泡(crush and soak)」法(Sambrook，J.，Fritsch，EF和Maniatis，T.(1989)，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory)來提取產物將凝膠塊壓碎並在400TBE緩衝液中浸泡過夜。樣品如上所述進行乙醇沉澱。將沉澱物溶解於1×連接酶緩衝液(New EnglandBiolabs)，50mM NaCl中。然後，5′端通過多核苷酸激酶進行磷酸化將50單位的多核苷酸激酶(NEB M0201)包含在200μl的總反應體積中。反應體系在37℃孵育30分鐘。
然後，將兩種交聯的oligo通過DNA連接酶轉化為連續的DNA鏈，所述DNA連接酶對於R1在並列的vip231的3′端和vip262的5′端之間形成磷酸二酯鍵，和對於R2在並列的vip238的3′端和vip269的5′端之間形成磷酸二酯鍵。在1×連接酶緩衝液，50mM NaCl中加入T4 DNA連接酶(NEB M0202L)，並加入5單位/μl的酶，得到的最終反應體積為300μl。連接體系在16℃孵育過夜。
然後，消除可切割的BSOCOES連接體。在600μl的最終反應體積中加入3-(環己氨基)-1-丙磺酸(CAPS，Fluka#29338)(pH 11.8)緩衝液和2-巰基乙醇(Fluka#63689)，分別得到100mM和60mM的終濃度。反應體系在37℃孵育2小時。然後通過添加200μl 1M MOPS緩衝液(pH 6.5)來中和反應體系。然後，DNA根據標準操作來進行乙醇沉澱。在將粒狀沉澱空氣乾燥後，DNA準備用於下一步驟，這是在位置3上導入官能化的寡核苷酸。注意到，通過消除BSOCOES連接體，形成了兩種伯胺一種位於在原始位置1寡核苷酸上的正在生長的肽鏈的末端，和另一種位於原始位置2寡核苷酸上。所謂的「擺動(wobbling)」策略用於促進在正在生長的肽鏈和下一步驟中位置3上引進的胺基酸之間的後續反應位置2上的oligo在經修飾的鹼基上遊包含一段鹼基(擺動鹼基)，它們在第一次化學轉移過程中是未配對的，然而在第二次轉移過程中它們與位置3的oligo進行鹼基配對。因此，現在，原始位置2寡核苷酸上的伯胺通過一段dsDNA與結構中心分隔開，這將降低其與星形結構中心部分的反應性，因為dsDNA是剛性的。
在下列條件下，R1產物與Tyr-BSOCOES-vip263退火，而R2產物與Gly-BSOCOES-vip270退火200pmol oligo，在總體積為240μl的100mM MOPS(pH 6.5)，1M NaCl中。混合物在95℃孵育5分鐘，然後冷卻至室溫大約30分鐘。然後，加入活化劑DMT-MM(Fluka#74104)至終濃度為75mM，用於促進胺基酸之間的化學反應。化學反應體系在50℃孵育1小時。樣品通過乙醇進行沉澱，並隨後對其實施製備型變性PAGE(如上所述)，其中從凝膠上切下對應於交聯產物的條帶。然後，每種交聯產物通過DNA連接酶轉化為連續的DNA鏈，分別地，所述DNA連接酶對於R1在並列的原始vip232的3′端和vip263的5′端之間形成磷酸二酯鍵，和對於R2在並列的原始vip269的3′端和vip270的5′端之間形成磷酸二酯鍵。
此外，在相同反應中通過DNA連接酶導入末端PCR引發位點。將具有PCR引發位點的DNA oligo(對於R1和R2分別為vip029/vip070和vip029/vip030)在下列條件下進行預退火在總體積為40μl的1×連接酶緩衝液和50mM NaCl中的200pmol每種oligo，並在PCR機器中在95℃孵育5分鐘和在下列溫度下孵育30秒80℃、65℃、50℃、45℃、30℃、20℃。
當vip070與vip029退火時，vip070的4個最5′末端的核苷酸是突出的。這4個與vip231中4個最5′末端的核苷酸逆向互補，當vip231與vip263退火時所述核苷酸同樣也是突出的。因此，突出末端可以退火併形成用於DNA連接酶的底物。同樣地，當vip030與vip029退火時，vip070的4個最5′末端的核苷酸是突出的。這4個與vip238中4個最5′末端的核苷酸逆向互補，當vip238與vip270退火時所述核苷酸同樣也是突出的。將交聯的、經凝膠純化的產物重懸浮於1×連接酶緩衝液、50mM NaCl中，並與預退火的包含PCR位點的DNA oligo(對於R1和R2分別為vip029/vip070和vip029/vip030)混合。DNA5′末端首先通過在200μl的最終體積中的50單位多核苷酸激酶(NEB0201L)進行磷酸化。允許反應體系在37℃孵育30分鐘。
然後，將DNA通過T4 DNA連接酶轉化為連續的DNA鏈，其在R1和R2中分別由vip029-vip231-vip262-vip263-vip070和vip029-vip238-vip269-vip270-vip030組成。向反應體系中加入在1×連接酶緩衝液、50mM NaCl中的1500單位T4 DNA連接酶(NEB0201L)，得到的最終反應體積為300μl。連接反應體系在16℃孵育過夜。然後，如上所述消除BSOCOES連接體。樣品通過乙醇進行沉澱，並隨後對其實施製備型變性PAGE，再次乙醇沉澱，並如上所述溶解於20μl水中。經裝配的產物現在準備用於引物延伸。
在上述操作過程中，如上所述通過變性PAGE取出小樣品以用於分析。凝膠圖像顯示於圖27中。泳道1和2顯示了，分別對於R1和R2，成功形成的、交聯的、官能化的oligovip-231(35nt)/vip262(68nt)和交聯的vip-238(35nt)/vip-269(68nt)。交聯產物以約200bp的表觀大小遷移。觀察到的由於所形成的產物中的強二級結構而造成的實際大小和表觀大小之間的差異是意料中的，所述強二級結構由於逆向互補序列甚至在變性凝膠中也存在。此外，觀察到尺寸較小的條帶，它最可能來源於全長種類的降解。
泳道3和4分別對於R1和R2顯示了在連接2種oligo和消除BSOCOES連接體後的產物。主要產物以150bp的表觀大小遷移。此外，還觀察到最可能由於全長種類降解而產生的尺寸較小的條帶。注意到，泳道1和3(以及泳道2和4)中的種類的大小几乎相等，但在凝膠中的遷移明顯不同。這是意料中的因為泳道1和2中的種類基本上是支化的DNA分子，而泳道3和泳道4中的種類是線性DNA分子。
泳道5和6分別對於R1和R2顯示了位置3的oligo交聯後的產物。在這兩個反應中，位置3的oligo為74nt。因此，預期產物為177nt。然而，交聯種類在凝膠中的表觀大小為約600bp。這是意料中的，因為該種類由具有非常強的二級結構的、交聯的線性DNA分子組成，所述二級結構由於DNA星形結構的臂中的逆向互補序列而引起。甚至包含尿素的PAGE都不能使該結構變性。
泳道7和8，分別對於R1和R2，包含在連接位置3的oligo與包含PCR位點的oligo以及消除BSOCOES連接體後的產物。包含PCR引發位點的oligo總共添加了64nt，因此所需產物為241nt。觀察到表觀大小超過1000bp的兩條顯著的條帶。較高的條帶最可能包含全長產物，而較低的條帶最可能包含缺少所述兩個包含PCR位點的oligo之一的分子。此外，在泳道8中，可見以600bp的表觀大小遷移的條帶。該條帶最可能表示連接有不包含PCR位點的oligo的種類(比較泳道8和6)。
泳道9包含100bp DNA梯(Fermentas，SM0248)。
引物延伸對經裝配的產物實施引物延伸，這使在中心有化學產物的星形結構中摺疊的DNA轉化為在表面上展示有化學產物的線性雙鏈分子。反應由vip038引發，所述vip038與經裝配的分子的3′逆向互補。反應在1×Thermopol緩衝液、0.2mM dNTPs、8mM MgSO4、1M甜菜鹼(Sigma、B-0300)、0.4μM vip038、0.2U/10μl Vent(exo-)(NEB M0259L)、和5μl作為模板的裝配分子中進行，在10μl引物延伸反應體系中。反應混合物在95℃孵育2分鐘、在60℃孵育30秒和在74℃孵育5分鐘。
結合測定展示合成肽的DNA在電泳遷移率變動分析法(EMSA)中進行分析。結合的證實將確定由結構型DNA指導從載體模塊正確合成化合物的能力。
這個測定法改編自文獻(Halpin和Harbury，PLoS Biol，2，E174，2004)。將10μL R1(亮啡肽-DNA)或R2(亂序的亮啡肽-DNA)的引物延伸產物各自置於4個管中。向管R1-1和R2-1中加入1μL 0.5mg/ml 3E7抗亮啡肽單克隆抗體(Chemicon，cat#MAB5276)、1μL 1MTris-HCl pH 7.2和1μL 0.1％Triton-X/PBS。向管R1-2和R2-2中加入1μL 0.5mg/ml W6/32單克隆抗體(Sigma，H1650)、1μL 1MTris-HCl pH 7.2和1μL 0.1％Triton-X/PBS。向管R1-3和R2-3中加入1μL 0.5mg/ml 3E7抗亮啡肽單克隆抗體、1μL 20μM亮啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)(Schafer-N，Denmark)和1μL 1MTris-HCl pH 7.2。向管R1-4和R2-4中加入1μL 0.5mg/ml 3E7抗亮啡肽單克隆抗體、1μL 20μM亂序的亮啡肽(Gly-Leu-Phe-Tyr-Gly)(Schafer-N，Denmark)和1μL 1M Tris-HCl pH 7.2。所有樣品在室溫下攪拌孵育1小時。向每個樣品中加入1.4μL 10×上樣染料(Invitrogen，cat#10816-015)，並將整個量上樣到凝膠上。還上樣了1μL的100bp和1kb梯(Fermentas#SM0248和#SMO318)。10％PAGE TBE凝膠(Invitrogen)在220mV和15mA下冷運行45分鐘。根據廠商說明書，將凝膠在SYBR GreenTM核酸染料(MolecularProbes)中顯色20分鐘。凝膠圖像顯示於圖28中。結果是在所有泳道中均觀察到表觀大小為200-250bp的2個顯著條帶。該條帶最可能包含具有雙鏈DNA的種類(進一步的證據可以在例如實施例21中找到)。較高的條帶很好地對應於所預期的241bp的全長產物，而較低的條帶最可能包含缺少vip029的種類，它將給出30bp的較小產物。在所有泳道中均觀察到表觀大小為約1000bp的2個顯著條帶。該條帶最可能包含具有摺疊為星形結構的DNA的種類較高的條帶最可能包含全長產物，而較低的條帶最可能包含缺少所述兩個包含PCR位點的oligo之一的分子。
在包含R1-1的泳道1中，觀察到表觀大小為約1500bp的條帶。這個條帶最可能包含與3E7抗體結合的亮啡肽-DNA產物，這減緩了整個複合物的電泳遷移。如泳道2(R1-2)中所顯示的，當將R1產物用IgG2A同種型匹配的陰性對照抗體進行孵育時，這個條帶不存在。通過游離的可溶性亮啡肽的競爭結合而進一步增強了相互作用的特異性在泳道3中，當R1產物、3E7和游離的亮啡肽共孵育時，所述凝膠-變動條帶不存在。當游離的可溶性亂序亮啡肽存在時，在包含R1-4的泳道4中沒有看到競爭。包含R2-1、R2-2、R2-3和R2-4的泳道5-8分別顯示，如所預期的，陰性對照R2產物(亂序的亮啡肽-DNA)不與3E7結合。
擴增為了證實凝膠-變動條帶和其他條帶的DNA是完整，切下凝膠塊並提取DNA用作PCR的模板。切下圖29中在框中的凝膠塊，並通過「壓碎和浸泡」法(Sambrook，J.，Fritsch，EF和Maniatis，T.(1989)，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Springs HarborLaboratory)來提取產物壓碎凝膠塊並在400μl TE緩衝液中浸泡過夜。將管在20000×g下旋轉10分鐘，並將上清液轉移到新管中。然後利用5μl在20μl反應體系中稀釋200倍的上清液進行PCR[1×聚合酶緩衝液、0.2mM dNTP、6mM MgSO4、0.2μM vip027、0.2μM vip028、0.5M甜菜鹼(Sigma，B-0300)、0.1mg/ml BSA、0.08單位/μl Vent(exo-)(NEB M0259L)]。在熱循環儀中進行95℃30秒、60℃30秒、74℃30秒的20個循環，和將2μl樣品在10％的非變性PAGE(Invitrogen)上進行分析，並且根據廠商說明書用SYBRGreen(Molecular Probes)染色並攝像。結果顯示於圖29中。泳道M包含100bp DNA梯(Fermentas，SM0248)。泳道1-5包含具有經凝膠純化的模板的反應體系；在所有泳道中，觀察到對應於預期大小的全長產物的約250bp的顯著條帶。相反地，在包含無模板的陰性對照的泳道6中，沒有觀察到條帶。因此，據此證實可以形成、劃分和擴增結構型DNA展示產物。
總之，R1產物與3E7抗-亮啡肽抗體的特異性結合最終證實了，亮啡肽通過該方法被正確裝配。此外，已顯示，將展示配體的產物與不展示配體的產物劃分開確實是可行的。例如，如本文通過分離凝膠變動條帶而簡單舉例說明的。此外，劃分出的產物可以進行擴增以用於隨後通過例如DNA測序進行鑑定，或在轉變(translation)過程中用作模板，從而允許進行選擇和擴增的循環。
實施例19DNA星形結構指導的還原性氨化本實施例用於舉例說明結構型DNA可以指導還原性氨化。選擇還原性氨化作為重要且廣泛應用的化學選擇反應的例子。
oligo從DNA Technology(Arhus，Denmark)獲得。寡核苷酸vip046用DST(二琥珀醯亞胺酒石酸鹽，Pierce#20589)在寡核苷酸中經修飾的內部dT上的伯胺處進行乙醯化，隨後用NaIO4(Aldrich#31，144-8)進行氧化切割，以產生乙醛酸官能化的oligo。寡核苷酸(2.5nmol)在包含400mM pH 8.8磷酸鈉緩衝液的40％DMF/水混合物中用DST(10mM)進行處理。反應總體積為100μL。反應體系在25℃孵育2小時。隨後加入NaIO4(50μL的150mM溶液)並在25℃再孵育2小時。將反應混合物稀釋至200μL，並根據廠商規程在旋轉柱(Amersham Biosciences#27-5325-01)上進行純化，隨後根據實施例11通過HPLC進行純化和進行質譜分析。得率36％。
DNA 計算出的質量測得的質量vip046-NHCOCHO6653.2026656.1具有經修飾的內部dT(胺-C6-dT)的苯甲醛-官能化的oligo的合成(位置n＝1)(vip046-NHCOC6H4CHO)利用由DMT-MM(4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽，Fluka#74104)促進的4-羧基苯甲醛(Lancaster#8192)對寡核苷酸vip046進行醯化，方法為用50mM DMT-MM處理溶解於包含150mM NaCl、200mM pH 8.8磷酸鈉緩衝液的40％DMF/水混合物中的寡核苷酸(2.5nmol)。總反應體積為100μL。反應體系在25℃孵育4小時。反應混合物根據廠商規程在旋轉柱(AmershamBiosciences#27-5325-01)上進行純化，隨後根據實施例11通過HPLC進行純化和進行質譜分析。得率53％。
DNA 計算出的質量測得的質量vip046-NHCOC6H4CHO 6729.2336729.9結構型DNA指導的還原性氨化在反應1和5中，將分別攜帶乙醛酸和4-甲醯基苯甲酸的醯胺的兩種vip046衍生物與等摩爾量(各為10pmol)的vip017和vip008在緩衝液中混合，所述緩衝液包含嗎啉代丙磺酸(Fluka#69947；MOPS，100mM，pH 5.2)和NaCl(Fluka#71376，1M)的最終組成。對溶液實施退火程序(PCR機器94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。將反應物(NaCNBH3；Sigma#156159，1M水溶液，終濃度為100mM；反應總體積為20μL)加入退火混合物，並在30℃孵育2小時。
對於兩種醛的平行運行的對照●將vip017調換為不攜帶胺的vip007(反應2+6)；●省去vip008以便測試與三聚體相比的二聚體的有效性(反應3+7)；●vip046-CHO嘗試與vip019交聯，從而執行不能鹼基配對的oligo之間的反應(反應4+8)。
將所有8種反應混合物稀釋至50μl並進行EtOH沉澱(加入GenElute(0.5μL；Sigma 56575)和96％EtOH(生物化學級；250μl))。在冰上孵育15分鐘，隨後在14000rpm下於4℃旋轉4分鐘。傾析出上清液，使管短暫旋轉，通過移液管去除剩餘的液體，並允許粒狀沉澱在空氣流中乾燥。
將粗製的DNA溶解於水中，並通過10％變性PAGE(Invitrogen)進行分析，並隨後根據廠商說明書用SYBR Green(Molecular Probes)進行染色。凝膠圖像顯示於圖30中。遷移率相應於60-70nt的新條帶的形成證實了預期的vip046(21nt)和vip017(42nt)的交聯(泳道5和9)。在使用vip007(所述vip007等同於vip017，除了前者在內部dT上沒有胺之外)的對照實驗中沒有觀察到交聯，表明選擇性反應(泳道6和10)。在二聚體中形成相同產物，但觀察到強度略低的條帶(泳道7+11)。對於不能鹼基配對的oligo沒有觀察到產物，表明匹配的序列是產物形成所必需的(泳道8+12)。
因此，結構型DNA能夠以高度特異性的方式指導還原性氨化。
實施例20結構型DNA指導的脲形成本實施例用於舉例說明結構型DNA可以指導脲形成。選擇2個胺之間的脲形成作為重要且廣泛應用的反應的例子。脲類是醫學化學中已知的電子等排體(isoster)。
oligo從DNA Technology Arhus，Denmark獲得。
由3-向DNA連結體組成的DNA星形結構被裝配成包含2個氨基官能化的oligo和1個輔助性oilgo。oligo vip046、vip017和vip008以等摩爾量(各為10pmol)在緩衝液中混合，所述緩衝液包含嗎啉代丙磺酸(Fluka#69947；MOPS，100mM，pH 8.0)和NaCl(Fluka#71376；1M)的最終組成。對溶液實施退火程序(PCR機器94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃30秒)。退火混合物是終濃度為10、50或100mM(反應總體積為20μL)的脲形成試劑(碳酸N，N′-二琥珀醯亞胺酯(N，N′-Disuccinimidyl carbonate)，Aldrich#225827(在DMF中為0.45M)；或雙(4-硝基苯基)碳酸酯，Aldrich#161691(在DMF中為1.0M))，並在37℃孵育90分鐘。
通過10％變性PAGE(Invitrogen)來分析每種反應混合物的等分試樣。根據廠商說明書通過SYBR Green染料(Molecular Probes，#S7563)來顯現條帶。
PAGE圖像顯示於圖31中。遷移率相應於60-70nt的新條帶的形成證實了預期的vip046(21nt)和vip017(42nt)的交聯(泳道5-10)。有趣的是，隨著偶聯試劑的量增加，形成的產物量減少。然而，這種觀察結果可以如此來解釋試劑分子與2個氨基反應，從而將2個胺轉化為親核體。因此，較低濃度的試劑可以允許正好一個胺形成中間體氨基甲酸酯，它與另一個胺快速反應從而形成預期的脲。
因此，結構型星形DNA能夠指導脲形成。
實施例21DNA星形結構的電遷移率這個實施例證實了結構型DNA在非變性聚丙烯醯胺凝膠中的電遷移率。
結構型DNA具有與雙鏈DNA明顯不同的構象。後者是線性延長的分子，而結構型DNA具有更為球形的結構。因此，預期到這兩種構象在凝膠中的不同遷移樣式結構型DNA具有遠遠超過雙鏈線性DNA相似物的表觀大小。為了證實這種現象進行下列實驗通過5種oligo vip029、vip161、vip192、vip193和vip207的連接而形成具有末端PCR引發位點的三聚體DNA星形結構。這種組織構造的示意圖顯示於圖32中。
DNA oligo(由DNA Technology rhus，Denmark製備)各自以2μM的濃度在1×連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl中混合。混合物如下進行孵育94℃5分鐘、80℃30秒、65℃30秒、50℃30秒、35℃30秒、20℃30秒、10℃直至下一步驟。退火操作在Applied Biosystems AB2720 PCR機器上進行。寡核苷酸的5′末端通過T4 DNA多核苷酸激酶進行磷酸化。製備由1.5μM星形結構、1×DNA連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl和0.17u/μl T4 DNA多核苷酸激酶(New England Biolabs，cat#M0201)組成的混合物，並在37℃孵育30分鐘。通過在10μl體積的1×DNA連接酶緩衝液(New England Biolabs)、50mM NaCl和200U T4 DNA連接酶(New England Biolabs，cat#M0202)中的T4 DNA連接酶(NewEngland Biolabs，cat#M0202)並在16℃孵育過夜，而在經退火的寡核苷酸的並列末端之間形成磷酸二酯鍵。
PCR擴增0.04μl連接反應產物在400μl PCR反應混合物[1×ThermoPol緩衝液(New England Biolabs B9004S)、0.2mM dNTPs(New EnglandBiolabs O447S)、8mM MgSO4、0.2μM vip202和vip224μM、0.5M甜菜鹼(Sigma B0300)、1U/100μl Vent(exo-)(New England BiolabsM0257L)]中用作模板。採用下列循環條件在50μl等分試樣中進行PCR擴增92℃30秒，和92℃/15秒、50℃/15秒、70℃/30秒的25個循環。
樣品通過加入1ml乙醇和1/10的3M乙酸鈉(pH 5.2)進行乙醇沉澱，在冰上孵育30分鐘，並以20000×g離心30分鐘，棄去上清液並將粒狀沉澱重懸浮於1×上樣緩衝液(Invitrogen)中，和對其實施製備型10％非變性PAGE(Invitrogen)，並根據廠商說明書用SYBRGreen(Molecular Probes，S7563)進行染色。凝膠圖像顯示於圖32中。泳道M包含100bp DNA梯(Fermentas，SM0248)。分離出2個條帶約250bp的條帶(A)和表觀大小超過1000bp的條帶(B)。切下圖32中在框中的凝膠塊，並通過「壓碎和浸泡」法(Sambrook，J.，Fritsch，EF和Maniatis，T.(1989)，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory)來提取產物壓碎凝膠塊，並在400μl TE緩衝液中浸泡過夜。將管在20000×g下旋轉10分鐘並將上清液轉移到新管中，如上所述進行乙醇沉澱並重懸浮於100μl水中。
引物延伸隨後執行利用分離出的DNA作為模板的引物延伸。在包含[1×ThermoPol緩衝液(New England Biolabs B9004S)、0.2mM dNTPs(New England Biolabs O447S)、8mM MgSO4、0.5M甜菜鹼(SigmaB0300)、1U/100μl Vent(exo-)(New England Biolabs M0257L)]的20μl反應體系中使用2μl模板。對於反應1和5不包括引物，在反應2和6中包括0.2μM vip202，在反應3和7中包括0.2μM vip224，和在反應4和8中包括0.2μM vip202和224。引物延伸如下進行將樣品在95℃孵育1分鐘，在50℃孵育15秒和在70℃孵育30秒。如上所述，10μl反應產物通過10％PAGE進行分析。
討論和結論首先，利用含末端PCR引發位點的三聚體DNA星形結構作為模板來進行PCR。其次，對樣品實施製備型PAGE，其中分離出2個條帶表觀大小為約250bp(雙鏈PCR產物的預期大小為241bp)的條帶(A)和表觀大小超過1000bp的條帶(B)。最後，分離出的DNA在引物延伸反應中用作模板並通過PAGE進行分析。如圖32中所示，使用正向引物(泳道2和6)和反向引物(泳道3和7)，兩種模板均產生大小為約250bp的雙鏈產物。此外，當存在兩種引物時，形成更多的產物(泳道4和8)。這舉例說明了，條帶A和B均包含預期的241bp產物，因此凝膠中遷移率的差異是由於摺疊推測A為雙鏈線性產物，而B為摺疊為星形結構的DNA。
有趣的是，如泳道1中所示，在引物延伸反應中不存在任何引物時，只觀察到有限的約250bp的雙鏈條帶，甚至當起始物為雙鏈DNA時。這完全是由於樣品經歷了熱變性和復性循環，這將導致形成雙鏈DNA和摺疊為星形結構的DNA的混合產物。在起始材料是條帶B的泳道5中觀察到相同現象。
因此，據此證實，長度為241個核苷酸的DNA分子可以摺疊為構象(星形結構)，這導致在非變性凝膠中出現超過1000bp的表觀大小。
實施例22DNA星形結構的轉變這個實施例證實了DNA星形結構的轉變過程的原理。在這個上下文中，轉變過程是其中各個位置上的單個模塊由新模塊置換的過程，並且置換過程由密碼子/反密碼子識別指導。新模塊可以具有以這樣的方式聯接的化學反應物，即使得在新模塊將是其一部分的新DNA星形結構進行正確摺疊後，它將位於中心或中心附近。因此，轉變允許合成由DNA星形結構編碼的化學化合物。
用於轉變過程的起始材料可以是使用選擇過程的輸出物作為模板的PCR產物，例如如實施例18中所示。這將允許選擇和擴增的反覆循環，這反過來又會允許不同的文庫轉變為用於所應用的選擇壓力的解決方案。
轉變過程的概要圖33中顯示了使用PCR產物作為起始材料的轉變過程的主要步驟的示意圖。
首先，通過利用生物素化的反向引物的PCR來擴增DNA星形結構，這允許分開兩條鏈。通過使用鏈黴抗生物素蛋白磁性珠來進行分離。將目的鏈(上鏈)從珠上洗脫並摺疊為具有2個幹-環和幹的DNA星形結構。隨後位置1的幹(不含環)通過限制性內切酶BsaI消化，所述酶在其識別序列外進行消化並形成5′突出部分。這個突出部分是對於位置1的密碼子。
然後，將具有合適的5′反密碼子序列的對於位置1的新載體模塊與星形結構連接。為了幫助連接和下遊純化，包括了生物素化的輔助oligo。輔助oligo與新位置1載體模塊以這樣的方式雜交，即使得它產生5′突出部分，其是反密碼子。因此，隨後的連接(輔助oligo/星形結構/模塊1)由密碼子/反密碼子雜交指導。
然後，將位置1上的原始模塊從星形結構中釋放出來，方法為首先執行變性步驟，其中新載體模塊替代星形結構中的原始位置1模塊，隨後在起初位於第2個幹的遠端環中的序列中進行限制性內切酶消化。通過這個過程，去除了原始位置1模塊和與星形結構配對的鹼基之間的共價鍵。在被捕獲於經鏈黴抗生物素蛋白包被的磁性珠上的星形結構上進行限制性內切酶消化。因此，從珠上釋放出的星形結構成功地進行了關於位置1的轉變。
注意到，在摺疊為星形結構後，新位置1模塊的3′末端參與形成第二個幹和緊在處於位置2上的密碼子前的幹末端。因此，使新模塊1的3′末端排直以用於接受位置2的新載體模塊，由位置2的密碼子/反密碼子相互作用指導。因此，該結構準備用於第二個密碼子/反密碼子指導的模塊置換。因此，通過重複關於星形結構中所有位置的所述置換過程，實現了完全轉變。
星形結構的形成第1個步驟包括5種oligo的退火vip206、vip161、vip192、vip193和vip207。圖34A顯示了該組織構造的示意圖。反應中的5種oligo將互相雜交，從而形成3-向連結體，它由在遠離3-向連結體中間的末端處具有5′和3′未雜交序列的2個幹-環和1個幹組成。未雜交序列表示PCR引發序列(vip206的5′區段和vip207的3′區段)。在體積為10μl的1×連接酶緩衝液(NEB B0202S)、50mM NaCl中將oligo與20pmol的每種寡核苷酸進行混合。通過在PCR機器中進行孵育來實施退火在95℃孵育5分鐘，和在下列溫度下孵育30秒80℃、65℃、50℃、45℃、30℃、20℃。
然後，5′末端通過多核苷酸激酶進行磷酸化將2.5單位的多核苷酸激酶(NEB M0201)包括在1×連接酶緩衝液、50mM NaCl中，反應體積為15μl。反應體系在37℃孵育30分鐘。
經退火的oligo通過DNA連接酶轉化為連續的DNA鏈，所述DNA連接酶分別在並列的vip206的3′末端和vip161的5′末端之間，和在並列的vip161的3′末端和vip192的5′末端之間，和在並列的vip192的3′末端和vip193的5′末端之間，和在並列的vip193的3′末端和vip207的5′末端之間形成磷酸二酯鍵。在1×連接酶緩衝液、50mMNaCl中加入T4 DNA連接酶(NEB M0202L)，並加入20單位/μl的酶，得到的最終反應體積為20μl。連接體系在16℃孵育過夜。DNA星形結構以400μl的反應總體積在1×Thermopol緩衝液(NEBM0257L)、8mM MgCl2、0.2mM dNTPs、0.5M甜菜鹼(Sigma B0300)、1μg/ml BSA(NEB B9001S)、0.1μM引物(vip202和vip224)和32單位的Vent(exo-)(NEB M257L)中進行PCR擴增。vip224在5′末端含有生物素部分，使得能夠在經鏈黴抗生物素蛋白包被的磁性珠上捕獲PCR產物。進行擴增，條件為92℃ 30秒的初始變性，隨後為在92℃孵育30秒、在60℃孵育15秒和在70℃孵育30秒的25個循環。最後在70℃延伸1分鐘。
在PCR擴增後，根據說明書用Eppendorf試劑盒(0032 007.740)對PCR產物進行淨化。使用兩種柱。對於每種柱用150μl TE進行洗脫。然後，將經淨化的PCR產物加到經鏈黴抗生物素蛋白包被的磁性珠(Dynal MyOne，605.02)上。100μl珠在2×BWT緩衝液(10mMTris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，2M NaCl，0.1％Triton X-100)中洗滌兩次。將珠懸浮於300μl 2×BWT中，並將300μl經淨化的PCR產物加到珠中。將珠在室溫下於緩慢振蕩的同時孵育15分鐘。在磁體上捕獲珠，並去除上清液。珠用1×BWT(2×BWT的一半強度)洗滌三次。通過加入50μl 10mM NaOH而從在磁性珠上捕獲的互補性生物素化的DNA鏈洗脫出DNA，並在室溫下孵育5分鐘。在磁體上捕獲珠，並去除包含上部的DNA鏈的上清液，並立即用20μl 1M Tris-HCl(pH 7.2)中和。
通過在分開的反應中使用正向和反向引物的引物延伸反應來測試洗脫出的DNA的純度。在10μl反應體系中，在1×Thermopol緩衝液、8mM MgCl2、0.2mM dNTPs、1M甜菜鹼和0.2單位的Vent(exo-)以及0.2μl模板和0.4μM vip202或0.4μM vip203/反應中，利用Vent(exo-)(NEB)進行引物延伸反應。引物延伸反應如下95℃2分鐘、60℃30秒和74℃5分鐘。
圖34A中顯示了該操作過程的概要。在整個該操作過程中，取出樣品以用於通過PAGE進行分析。凝膠圖像顯示於圖34B中。該凝膠還包含質量控制引物延伸反應。在泳道2中觀察到預期大小為241bp的條帶，它不存在於沒有添加模板的陰性對照中(泳道1)。因此，DNA星形結構已被成功裝配和擴增。此外，在泳道2中觀察到表觀大小超過1000bp的2個條帶，其表示摺疊的DNA星形結構(參見實施例21)。泳道3顯示了PCR淨化後的產物。
產物經由在PCR產物的下鏈上的生物素部分而被捕獲。流出物(flow through)顯示於泳道4中。在此發現了表觀大小超過1000bp的2個條帶中的較低條帶，因此其既不含生物素也不與生物素化的鏈雜交。在洗滌珠後，通過破壞鹼基配對的高pH來洗脫非生物素化的鏈。洗脫產物顯示於泳道5中。觀察到相當於表觀大小超過1000bp的2個條帶中的較低條帶的單個條帶，表明PCR產物的非生物素化的上鏈的成功分離。有趣的是，當PCR的兩條鏈都存在時，只觀察到表觀大小超過1000bp的2個條帶中的較高條帶(泳道1和2)。因此，較高的條帶最可能表示2個雜交的DNA星形結構分子，其經由末端PCR引發位點雜交。
作為純化的DNA的質量對照，執行2次引物延伸。在一個反應中使用正向引物(vip202)，和在第二個反應中使用反向引物(vip203)，它們分別在下部和上部的PCR鏈上進行引發。因此，如果分離的DNA是純的，那麼只有第二個反應應當產生引物延伸產物。因此，只在泳道7中觀察到對應於預期大小為241bp的條帶，而在泳道6中沒有觀察到引物延伸產物。因此，非常純的製備物形式，實現了PCR產物的所需鏈的成功純化。
位置1上的密碼子的暴露DNA星形結構包含2個幹-環和1個幹。不含環的幹包含對於位置1的密碼子。所述密碼子通過Bsa I限制性內切酶消化而暴露，所述限制性內切酶在其識別序列外進行切割並形成4個核苷酸的5′突出部分，這個序列可以沒有限制地進行選擇，因此對於編碼目的很理想。在這個上下文中，突出部分被稱為對於位置1的密碼子。
對星形結構DNA實施Bsa I消化。在由vip161的5′末端和vip193的3′末端雜交而產生的第1個幹(不含環的幹)中發現了用於Bsa I的雙鏈底物。注意到，Bsa I消化後獲得的產物對應於在這個實施例開始時描述的vip161-vip192-vip193的序列。
將110μl純化的星形結構DNA與20μl 10×NEB3緩衝液和200單位的BsaI(NEB R0535L)混合，總體積為200μl。將消化體系在50℃孵育2.5小時。對DNA實施標準的乙醇沉澱，然後將其施加至10％TBE-尿素凝膠(Invitrogen)以用於凝膠純化。在圖35中顯示了SYBR Green染色後的凝膠圖像。將未切割的DNA上樣到泳道1中作為參照。觀察到以超過1000bp的表觀大小遷移的顯著條帶(注意，在泳道M中加入的標記的「溢出(spil over)」)。在加入了Bsa I消化物的泳道2-7中觀察到多個條帶，從而表明Bsa I消化不完全。但是，從凝膠上切下目的條帶(在圖中被框中的)，並且如前所述，通過「壓碎和浸泡」法從凝膠塊中提取出DNA，進行乙醇沉澱，並再溶解於40μl H2O中。
由密碼子/反密碼子相互作用指導的新位置1模塊的連接將新位置1模塊vip271連接在經Bsa I消化並純化的DNA星形結構上。將vip066包括在連接反應中作為連接助劑，並將生物素分子導入連接產物中，從而促進下遊的純化。vip271和vip066的退火將產生具有4個核苷酸的5′突出部分(vip271)的產物，其在這個上下文中被稱為反密碼子。因此，該序列以這樣的方式選擇，即使得它與DNA星形結構中位置1上的密碼子逆向互補。因此，密碼子/反密碼子雜交能夠指導2個新引進的oligo與DNA星形結構的連接。將vip271和vip066在10μl體積的1×連接酶緩衝液(NEB B0202S)、50mM NaCl中與50pmol的每種寡核苷酸混合。退火在PCR機器上利用上述退火程序進行。
然後，將經退火的vip271/vip066與經Bsa I消化並純化的DNA星形結構(30μl)混合，並且5′末端通過多核苷酸激酶進行磷酸化將12.5單位的多核苷酸激酶(NEB M0201)包括在1×連接酶緩衝液、50mM NaCl中，反應體積為15μl。反應體系在37℃孵育30分鐘。
然後，所述分子的同族末端通過DNA連接酶進行連接，所述DNA連接酶在並列的vip066的3′末端和經Bsa I消化的DNA的5′末端之間、和在並列的經Bsa I消化的DNA的3′末端和vip271的5′末端之間形成磷酸二酯鍵。將T4 DNA連接酶(NEB M0202L)加入1×連接酶緩衝液、50mM NaCl中，並加入20單位/μl的酶，得到60μl的最終反應體積。連接體系在16℃孵育過夜。
置換下一個步驟是從星形結構中消除起始位置1模塊。是所述分子進行重摺疊，以允許新位置1模塊成為3-向連結體的一部分，並消除起始位置1和DNA星形結構之間的共價鍵。此外，導入輔助oligo(vip194)，它與第2個幹遠端的起始環中的Pvu II位點退火(參見圖36)，從而形成用於Pvu II的雙鏈底物。因此，原始位置1模塊和星形結構之間的共價鍵和鹼基配對均被破壞。此外，導入新位置1模塊作為3-向連結體的一部分。
將43μl的連接反應產物在10mM Tris-HCl pH 8、1mM EDTA、100mM NaCl、0.1％Triton X-100中與200pmol vip194進行混合，總體積為60μl。變性和退火在PCR機器上進行，條件為在95℃孵育5分鐘，和在下列溫度下孵育30秒80℃、65℃、50℃、45℃、30℃、20℃。
然後，在經鏈黴抗生物素蛋白包被的磁性珠(Dynal)上捕獲DNA。將30μl珠在2×BWT(2M NaCl，10mM Tris-HCl，pH 8，1mM EDTA，0.1％Triton X-100)中洗滌兩次。最後一次洗滌後，將珠懸浮於60μl 2×BWT中，並加入60μl vip194/星形結構退火反應產物。孵育在室溫下於輕輕振蕩的同時進行15分鐘。在磁體上捕獲現在具有與其聯接的DNA的珠，隨後懸浮於Pvu II消化緩衝液中將22μl H2O和3μl 10×Pvu II消化緩衝液加入至珠中，並加入5μl Pvu II(10單位/μl；Fermentas ER0637)。消化體系在37℃孵育6小時。消化後，在磁體上將珠與上清液分離。
在整個該操作過程中，保存等分試樣以用於通過10％TBE-尿素凝膠(Invitrogen)進行分析，所述凝膠根據廠商規程用SYBR Green(Molecular Probes)進行染色。凝膠圖像顯示於圖36中。
在泳道1中上樣純化的經Bsa I消化的星形結構；觀察到預期的表觀大小為600nt的顯著條帶。在泳道2中上樣經Bsa I消化的星形結構與對於位置1的新模塊/輔助gligo(vip066)的連接產物。觀察到表觀大小超過1000nt的顯著條帶，從而表明成功連接。在泳道4中上樣在Pvu II消化後的珠。觀察到表觀大小超過1000nt的條帶。通過與泳道2的比較看出，這個條帶對應於未消化的DNA。然而，在來自Pvu II消化的上清液中(泳道5)，觀察到表觀大小為約600nt的條帶。這個條帶對應於預期表觀大小為約600nt的成功置換產物。它在上清液中存在這一事實顯示，位置1上的新模塊已置換了星形結構中位置1上的原始模塊。
因此，證實了成功的轉變，即密碼子/反密碼子指導的模塊置換。
實施例中使用的寡核苷酸的列表
序列表110Vipergen Pharmaceuticals Aps120結構型核酸指導的化學合成13013063616049170PatentIn version 3.3210121141212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature2235』P4001ctcgttttcg agaccgactc tggaagtgtc accggatctg g 41210221142212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature2235』P4002ttggaaaaac caaccagatc cggtgactgt caaggctgag gt42
210321142212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature2235』P4003gagggagagc ctcacctcag ccttgactct tccagagtcg gt42210421142212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature2235』P4004gagggagagc ctcacctcag ccttgactgg agaacgcatt ct42210521142212DNA213人工220
223人工合成
220
221misc_feature2235』P4005acacaagaag tgtagaatgc gttctcctct tccagagtcg gt42210621141212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature222(27)..(27)223n＝胺-C6-dT4006ctcgttttcg agaccgactc tggaagngtc accggatctg g 41210721142212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature222(28)..(28)223n＝胺-C6-dT4007ttggaaaaac caaccagatc cggtgacngt caaggctgag gt 42
210821142212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature222(28)..(28)223n＝胺-C6-dT4008gagggagagc ctcacctcag ccttgacnct tccagagtcg gt42210921142212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature222(28)..(28)223n＝胺-C6-dT4009gagggagagc ctcacctcag ccttgacngg agaacgcatt ct422101021142212DNA213人工220
223人工合成
220
221misc_feature222(28)..(28)223n＝胺-C6-df40010acacaagaag tgtagaatgc gttctccnct tccagagtcg gt422101121120212DNA213人工220
223人工合成40011actatgaggg ctgtctgtgg 202101221120212DNA213人工220
223人工合成40012tagcaagccc aataggaacc 202101321130212DNA213人工220
223人工合成40013
actatgaggg ctgtctgtgg cagtcacgag 302101421134212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature2235』P40014aaaactcgtg actgggttcc tattgggctt gcta 342101521137212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature2235』P40015ttttcgagac cgactctgga agtgtcaccg gatctgg 372101621120212DNA213人工220
223人工合成
220
221misc_feature2235』生物素化的40016actatgaggg ctgtctgtgg 202101721120212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature2235』生物素化的40017tagcaagccc aataggaacc 202101821121212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature222(11)..(11)223n＝胺-C6-dT40018actctggaag ngtcaccgga t 21
2101921148212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature2235』P220
221misc_feature222(34)..(34)223n＝胺-C6-dT40019gagggagagc ctcacctcag ccttgacaca cacncttcca gagtcggt 482102021148212DNA213人工220
223人工合成40020ctcgttttcg agaccgactc tggaagagtg tgttgtcacc ggatctgg 482102121121212DNA213人工220
223人工合成
220
221misc_feature222(11)..(11)223n＝胺-C6-dT40021cagccttgac ncttccagag t 212102221134212DNA213人工220
223人工合成40022ctctctcgtg actgggttcc tattgggctt gcta 342102321125212DNA213人工220
223人工合成220
221misc_feature222(11)..(11)223n＝胺-C6-dT40023actctggaag ngtcaccgga tctgg 252102421158212DNA213人工
220
223人工合成40024gagggagagc ctcacctcag ccttgactct tccagagtgg ttcctattgg gcttgcta 582102521148212DNA213人工220
223人工合成40025ttggaaaaac caaccagatc cggtgactgt gtgtgtcaag gctgaggt 482102621152212DNA213人工220
223人工合成40026gagggagagc ctcacctcag ccttgacaca cactcttcca gagtcggtct cg 522102721135212DNA213人工220
223人工合成40027agagcgagac cgactctgga agtgtcaccg gatct3521028
21168212DNA213人工220
223人工合成40028ggttggcagg gcccactagc tcaggatcca cccaaccaga tccggtgact gtgtgtgtca 60aggctgag 682102921174212DNA213人工220
223人工合成40029gtgaggctga attctctgta cctggtacct ccctcacctc agccttgaca cacactcttc 60cagagtcggt ctcg 742103021110212DNA213人工220
223人工合成40030gtgggccctg102103121110212DNA213人工
220
223人工合成40031gtggatcctg102103221168212DNA213人工220
223人工合成40032ggttggcaca gctgactagc tcagagctca cccaaccaga tccggtgact gtgtgtgtca 60aggctgag 682103321174212DNA213人工220
223人工合成40033gtgaggctcc cgggtctgta cctattaatt ccctcacctc agccttgaca cacactcttc 60cagagtcggt ctcg 742103421110212DNA213人工220
223人工合成40034
gtcagctgtg102103521110212DNA213人工220
223人工合成40035gtgagctctg102103621119212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸220
2215』生物素222(1)..(1)220
221misc_feature222(1)..(1)223n is a，c，g，or t40036ncttccagag tcggtctcg 192103721122212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸
220
221misc_feature222(1)..(1)223n＝5』生物素40037ncagccttga ctcttccaga gt 222103821120212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸40038caggtcgctg agaggttgac 202103921120212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸40039acgtccgagt cagaagtgtg 202104021130212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸40040
caggtcgctg agaggttgac cagtcacgag 302104121134212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸40041ctctctcgtg actgcacact tctgactcgg acgt 342104221121212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸220
221misc_feature222(1)..(1)223n＝5』生物素40042nacgtccgag tcagaagtgt g 212104321135212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸220
221misc_feature
222(23)..(23)223n＝NH2-C6-dT40043agagcgagac cgactctgga agngtcaccg gatct352104421135212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸220
221misc_feature222(23)..(23)223n＝NH2-C6-dT40044ttttcgagac cgactctgga agngtcaccg gatct352104521168212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸220
221misc_feature222(56)..(56)223n＝NH2-C6-dT40045ggttggcaca gctgactagc tcagagctca cccaaccaga tccggtgact gtgtgngtca 60aggctgag 68
2104621174212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸220
221misc_feature222(56)..(56)223n＝NH2-C6-dT40046gtgaggctcc cgggtctgta cctattaatt ccctcacctc agccttgaca cacacncttc 60cagagtcggt ctcg 742104721168212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸220
221misc_feature222(56)..(56)223n＝NH2-C6-dT40047ggttggcaca gctgacaaaa acagagctca cccaaccaga tccggtgact gtgtgngtca 60aggctgag 682104821174212DNA
213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸220
221misc_feature222(56)..(56)223n＝NH2-C6-dT40048gtgaggctcc cgggtcgaga gctattaatt ccctcacctc agccttgaca cacacncttc 60cagagtcggt ctcg 742104921151212DNA213人工220
223化學合成的、任選衍生的寡核苷酸220
221misc_feature222(23)..(23)223n＝NH2-C6-dT40049ctctcgagac cgactctgga agngtcaccg gatctggttg ggtgagctct g 5權利要求
1.包含核酸和化學化合物的組合物，所述組合物形成限定從反應中心延伸的3個或更多個幹的星形結構，其中所述幹由核酸雙鏈體形成，並且所述化學化合物已作為3個或更多個化學基團的反應產物在反應中心形成。
2.權利要求1的組合物，其中所述3個或更多個幹從反應中心放射狀向外延伸。
3.權利要求1或2的組合物，其中所述核酸包含鑑定一種或多種化學基團的一種或多種密碼子，所述化學基團已參與所形成的化學化合物的形成。
4.根據權利要求3的組合物，其中密碼子位於幹的末端。
5.根據權利要求1-4中任一項的組合物，其中在所述幹的末端形成環。
6.根據權利要求1-5中任一項的組合物，其中密碼子位於所述幹-環結構的非鹼基配對部分。
7.根據權利要求1-6中任一項的組合物，其中限制酶切位點存在於所述幹-環結構中。
8.根據權利要求1-7中任一項的組合物，其中所述環能夠與輔助寡核苷酸雜交，從而形成用於限制性內切酶的底物。
9.根據權利要求1-8中任一項的組合物，其中環存在於除了一個以外的所述幹的所有末端上，以便形成鄰接的核酸序列。
10.根據權利要求1-9中任一項的組合物，其中所述鄰接的核酸序列是酶促可延伸的。
11.根據權利要求10的組合物，其中所述核酸包含用於DNA聚合酶、RNA聚合物或逆轉錄酶的引發位點。
12.根據權利要求9-11中任一項的組合物，其中所述引發位點存在於不具有環的幹上。
13.根據權利要求1-12中任一項的組合物，其中幹包含具有至少80％互補性的2個雜交區段，並且每個雜交區段由12個或更多個核苷酸組成。
14.根據權利要求13的組合物，其中每個雜交區段包含18個或更多個核苷酸。
15.根據權利要求1的組合物，其中所述化學化合物與所述核酸共價聯接。
16.根據權利要求1-15中任一項的組合物，其中所述化學基團在反應前與所述核酸共價聯接。
17.根據權利要求16的組合物，其中所述共價聯接中的一個或多個在與反應同時或在反應後進行切割。
18.根據權利要求1-17中任一項的組合物，其中除一個共價聯接以外的所有共價聯接在與反應同時或在反應後進行切割。
19.根據權利要求1-18中任一項的組合物，其中所述化學化合物通過聯接在所述核酸上的所述化學基團與任選的一種或多種其他反應物反應而形成。
20.根據權利要求1-19中任一項的組合物，其中所述一種或多種反應物是不與核酸締合的游離反應物。
21.組合物文庫，其包括許多不同的根據權利要求1-20中任一項的組合物。
22.形成一種或多種化學結構的方法，其包括下列步驟(i)提供N(N＝3至100)個載體模塊，其包括(1)第1個位置的載體模塊，具有i)能夠與第N個位置的載體模塊的核酸區段雜交的核酸區段，和ii)能夠與第2個位置的載體模塊的區段雜交的核酸區段，(2)第n個位置的載體模塊(n＝2至N-1)，具有能夠與第n-1個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與第n+1個載體模塊的區段雜交的核酸區段，和(3)第N個位置的載體模塊，具有能夠與所述第N-1個載體模塊的所述核酸區段雜交的核酸區段，和能夠與所述第1個載體模塊的區段雜交的核酸區段，其中至少3個所述載體模塊包含位於在所述雜交區段之間的中間部分或其附近的締合的化學基團(CG)，和任選地包含位於所述雜交區段之一的外部的密碼子區段；(ii)在允許所述雜交區段進行雜交的條件下使所述載體模塊接觸，從而使所述化學基團接近，其中所述形成的化學化合物與至少一個所述載體模塊締合。
23.根據權利要求22的方法，其進一步包括下列步驟提供允許第n-1個模塊與第n個模塊以及第N-1個模塊與第N個模塊的末端進行連接的條件，從而形成具有幹-環結構和締合的化學化合物的鄰接的核酸分子。
24.權利要求22或23的方法，其中所形成的化學化合物與至少一個所述載體分子或所述鄰接的核酸分子共價締合。
25.根據權利要求22-24中任一項的方法，其包括在允許雜交區段進行雜交的條件下使載體模塊接觸，從而使反應性基團達到反應接近度；和提供允許反應性基團進行反應的條件，其中所形成的化學化合物與至少一個載體模塊締合；和允許第n-1個模塊與第n個模塊以及第N-1個模塊與第N個模塊的末端進行連接的條件，從而形成具有幹-環結構和締合的化學化合物的鄰接的核酸分子。
26.根據權利要求22的方法，其中所述載體模塊的接觸順次或同時進行。
27.根據權利要求22和26的方法，其中所述化學反應順次或同時進行，和/或其中所述連接以酶促或化學的方式並且順次或同時進行。
28.根據權利要求22-27中任一項的方法，其進一步包括至少在所述第1個載體模塊中和/或至少在所述第N個載體模塊中的用於DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶位點的引發位點。
29.根據權利要求22-28中任一項的方法，其包括實施酶促延伸反應以展示所形成的化學化合物的進一步步驟。
30.根據權利要求22-29中任一項的方法，其中N為3、4、5、6或7，並且特別地其中每個所述載體模塊包含位於在所述雜交區段之間的中間部分或其附近的締合的化學基團(CG)，和位於所述雜交區段之一的外部的密碼子區段。
31.根據權利要求22-30中任一項的方法，其中超過一種化合物的文庫通過具有在一個或多個位置上的載體模塊的集合而合成。
32.根據權利要求31的方法，其中所述在至少一個位置上的集合包括至少10個不同的載體模塊。
33.根據權利要求31或32的方法，其中所述在至少兩個位置上的集合包括至少10個不同的載體模塊。
34.根據權利要求22-24中任一項的方法，其中所述中間部分包括化學鍵或1-20個核苷酸。
35.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述化學基團與所述中間部分的核鹼基締合。
36.根據權利要求22-34中任一項的方法，其中所述化學基團與所述中間部分的磷酸二酯鍵締合。
37.根據權利要求22-36中任一項的方法，其中所述化學基團通過一個或多個共價鍵與所述中間部分締合。
38.實施模塊置換的方法，其包括下列步驟a)提供單鏈的鄰接核酸序列，其包含N個雜交區段和互補性雜交區段以及N-1個在所述雜交區段與所述互補性雜交區段之間的非雜交性區段，b)在有利於分子內雜交的條件下使核酸雜交，從而形成至少包含N-1個幹-環和1個幹的連續的核酸；c)在所述幹或環中導入斷口，從而產生至少包含密碼子區段的突出部分；d)提供第1組載體模塊，其至少具有能夠與所述幹雜交的核酸區段、能夠與相鄰的幹-環的幹雜交的核酸區段、任選的締合的反應性基團、和反密碼子區段；d)提供允許密碼子和反密碼子區段雜交的條件；和e)提供允許所述雜交的載體模塊與所述突出部分的隱性末端進行酶促或化學連接的條件；並施行下列步驟i)用限制性內切酶消化與所述密碼子序列相鄰的幹-環的幹或環，從而製成至少包含下一個密碼子區段的突出部分；和ii)使核酸變性；和iii)在有利於分子內雜交的條件下進行雜交，從而形成N-1個幹-環和具有至少包含所述下一個密碼子區段的突出部分的1個幹；和iv)任選地提供允許所述反應性基團進行反應的條件，其中所形成的化學化合物與至少一個所述載體模塊締合；和v)提供下一組載體模塊，其至少具有能夠與所述幹雜交的核酸區段，和能夠與所述相鄰的幹-環的幹雜交的核酸區段，和任選地具有締合的反應性基團，和具有反密碼子區段；和vi)提供允許雜交的載體模塊與所述突出部分的隱性末端進行酶促或化學連接的條件；和將步驟i)至vi)重複N-1次；和f)在部分由所述第1組載體模塊組成的所述幹-環結構中導入斷口，至少讓所述反密碼子區段與所述第1個載體模塊相連；和g)使核酸變性；和h)在有利於分子內雜交的條件下進行雜交，從而形成N-1個幹-環和1個幹；和i)任選地，提供允許所述反應性基團進行反應的條件，其中所形成的化學化合物與至少一個所述載體模塊締合。
39.根據權利要求38的方法，其中步驟a)的鄰接的核酸序列可通過權利要求22-37的方法獲得，但不包括所述化學基團(偽文庫)。
40.根據權利要求38的方法，其中步驟a)的鄰接的核酸序列可通過權利要求29的方法獲得。
41.根據權利要求40的方法，其中權利要求29的延伸產物通過PCR進行擴增。
42.根據權利要求38-41中任一項的方法，其中步驟a)、b)或c)中的鄰接的核酸序列通過下列步驟獲得將所述PCR產物的有義鏈固定在固體支持物上，分離所述固體支持物，允許所述有義鏈自雜交以便形成所述星形結構，和任選地，打斷聯接所述自雜交的星形結構與所述固體支持物的幹，從而從所述固體支持物釋放出所述星形結構。
43.根據權利要求42的方法，其中所述自雜交通過瞬間冷卻來進行。
44.根據權利要求42或43的方法，其中用限制性內切酶來打斷聯接所述固體支持物與所述重摺疊的星形結構的幹。
45.根據權利要求38-44中任一項的方法，其進一步包括下述步驟在消化步驟前添加與環序列互補的輔助寡核苷酸，以在所述環中形成用於所述限制性內切酶的雙鏈底物。
46.組合物，其包含核酸和締合的化學化合物的結構或超過一種此類結構的文庫，所述結構可通過權利要求22-37中任一項的方法獲得。
47.用於篩選超過一種化學化合物的文庫的方法，所述化學化合物如權利要求29中所公開的進行製備，所述方法包括下列步驟在所述文庫中探查有著具有所需特性的化學化合物的文庫成員；將具有所需特性的文庫成員與不具有所需特性的文庫成員分開；和從而獲得具有所需特性的文庫成員的富集匯集物。
48.根據權利要求47的方法，其中所述方法進一步包括擴增所述富集匯集物的成員的核酸，所述核酸表明所述化學反應的歷史。
49.根據權利要求38的方法，其進一步包括重新裝配由根據權利要求47或48的所述富集文庫成員編碼的化學化合物。
50.根據權利要求38的方法，其中在幹或環中的斷口通過限制性內切酶、RNA酶、核酸內切酶III、核酸內切酶VIII、APE1、Fpg、化學切割或光切割來導入。
51.根據權利要求49或50的方法，其進一步包括所述化學反應順次或同時進行。
52.根據權利要求49-51中任一項的方法，其進一步包括至少在所述第1個載體模塊或所述第N個載體模塊中的用於DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶的引發位點。
53.根據權利要求38-52中任一項的方法，其中步驟a)的鄰接的核酸序列包括通過下列步驟製備的核酸序列用2種連續的限制性內切酶消化來源於富集文庫的、分子間雜交的核酸結構，所述酶消除了在所討論的模塊和其餘結構之間的共價鍵，使所述經消化的結構變性，允許來自所述經消化的結構的核酸片段再雜交，從而允許交換指定所討論的模塊的核酸部分以獲得培育，和連接所述合適的末端。
54.權利要求53的方法，其中在允許再雜交之前加入在所述第1代文庫形成中不存在的、表示載體模塊的核酸片段。
55.權利要求53的方法，其中在允許再雜交之前加入在所述第1代文庫形成中沒有使用的載體模塊的集合。
56.權利要求53的方法，其中對富集文庫的一部分施行權利要求53的步驟，並將培育的結果與所述富集文庫的其餘部分匯集在一起。
全文摘要
本發明公開了包含核酸和化學化合物的組合物，所述組合物形成限定從反應中心延伸的3個或更多個幹的星形結構。幹由核酸雙鏈體形成，並且化學化合物已作為3個或更多個化學基團的反應產物在反應中心形成。該組合物的優點是，在反應中心的化學基團之間提供了緊密的接近度，從而促進反應。本發明還涉及用於製備組合物的方法。該方法的優點是，它不需要預先合成大量的模板，並且它不依賴於密碼子/反密碼子識別來形成所編碼的分子。
文檔編號C07B61/00GK101056980SQ200580038052
公開日2007年10月17日 申請日期2005年11月8日 優先權日2004年11月8日
發明者N·J·V·漢森, P·布拉克斯克雅爾, M·H·漢森, L·K·彼特森, T·R·赫特尼爾 申請人:威泊根私人有限公司