用於校正檢測器間頻帶增寬效應的方法

2023-06-19 00:39:16

專利名稱：用於校正檢測器間頻帶增寬效應的方法
技術領域：
本發明涉及用於校正頻帶增寬效應的方法，尤其涉及用於校正檢測器間頻帶增寬效應的方法。
背景技術：
用液相色譜技術對溶液中的大分子物質進行分析，通常是通過在適當的溶劑中製備樣品，然後將它的小等份注射進入色譜儀來完成的。該色譜儀包括各種類型的分級器件，它們在樣品經過它們時將其分離。一旦通過這些通常是基於尺寸、質量或柱親和力的方法將樣品分離後，便用光散射、折光指數、紫外線(UV)、粘度響應等方法對其進行分析。例如，為了確定通過尺寸排阻色譜柱進行分離的特定樣品的質量和尺寸分布，色譜儀將先後用多角度光散射MALS和差動式折射計(differential refractometer)dRI測量樣品。dRI確定濃度，而MALS儀器測定超瑞利比(excess Rayleigh ratio)，將它作為每個洗脫級分的角度函數。對於比入射光波長小得多的分子，通常在一個單一的角度上進行光散射測量就足夠了。
當各個級分經過檢測器時，便產生了通常稱之為「頻帶(band)」或者「波峰(peak)」的信號。由於擴散和混合效應，樣品每次穿過不同的器件時，這些頻帶便會增寬一些。考慮由單分散性蛋白的低濃度等分樣品。在這種情況下，瑞利逾量比與摩爾質量和濃度成正比。光散射信號和濃度信號應該具有相同的形狀，並且當這兩種響應被歸一化而具有相等面積時，它們將完全重疊。然而，當樣品從MALS檢測器經過而進入dRI檢測器時，它要經過中間區域和連接部位，這會導致樣品的擴散和混合。由John Wiley Sons於1979年出版的Yau等人所著的《Modern size exclusion liquid chromatography》一書中詳細討論了頻帶增寬的許多因素和一些與其有關的補救措施。在上述例子中，dRI信號與MALS信號相比，總是顯得略寬。
圖1清楚地顯示了增寬效應，該圖表示了水緩衝液中的牛血清蛋白BSA樣品的色譜圖以及未校準增寬效應的計算出的摩爾質量。跡線1示出沒有校準的摩爾質量。該摩爾質量是用除以單體的摩爾質量Mw0後的結果表示，因此對於單體，縱軸上的讀數為1，二聚體的讀數為2，等等。跡線2反映作為時間函數的90°光散射信號。跡線3反映dRI信號。聚集狀態已經被分級，於是，最右邊從16分鐘到18分鐘的波峰區域是來自純單體的數據，從14分鐘到16分鐘的波峰區域來自二聚體，等等。在每個波峰中，增寬導致波峰中心處的濃度降低，而在「兩翼」處的濃度增高。將此變寬的dRI信號和MALS信號結合起來確定各個洗脫時間處的摩爾質量，導致了在波峰中心附近確定的摩爾質量被系統地高估，而兩翼處的卻被低估。當濃度檢測器在MALS檢測器上遊時，情況就反過來。假如沒有頻帶增寬，數據將由一系列平臺組成，對於單體來說是1，對於二聚體來說是2，等等。當被分級的樣品變成更加多分散性時，頻帶增寬效應變得不那麼明顯(但是仍然存在)。對於被恰當地分級的具有離散的聚集狀態的樣品，該問題是明顯的。在圖1中，單體的波峰被很好地分辨出來，所以增寬問題是最清楚的。聚集體逐漸變得不能很好地分辨出來，所以它們顯現出該問題的程度就輕些。
人們採用了各種方法來補償這些變形。大多數方法都是基於L.H.Tung在其1969年的論文中介紹的成果，該論文發表在《the Journal ofApplied Polymer Science》，第13卷，第775等頁。在前面提到的Yau等人的著作討論了一些校正頻帶增寬的方法。在整個色譜技術文獻中，許多論文都提出了實施這些校正的方法，即，將變寬的頻帶恢復到假如沒有增寬因素時它所具有的形狀。這些技術中的大多數在數值上是不穩定的，可能導致實質上不合理的結果，例如負的濃度，或者負的散射強度，因此很少被使用。通過MALS測量得到的蛋白質特徵表現為一個相當重要的面積，然而即便在這裡，由於存在與實施相關的困難，因此很少見到對頻帶增寬進行校正。
頻帶增寬效應出現在液相色譜的各種多檢測器操作中。例如，如果要使用在線粘度計測量樣品以獲得它的特性粘度，那麼也需要使用dRI。當樣品從dRI移動到粘度計時，便會出現頻帶增寬，這導致比粘度曲線相對於由dRI測量獲得的濃度曲線出現擴展。另外，在將變寬的信號恢復為符合在沒有增寬的情況下它所具有的信號時，所存在的計算上的困難常常導致有問題的結果，特別是當樣品確實是單分散性的，例如非聚集的蛋白質時。

發明內容
本發明的目的是提供一種分析方法，通過該方法可以用軟體既容易又精確地校正頻帶增寬效應。本發明的另一個目標是為這些校正提供一種新的方法，該方法與傳統方法的不同之處使其明顯區別於傳統方法。認為本發明用於分析蛋白質樣品的分離最為有效。該應用的一個結果將是更精確地表徵蛋白質綴合物及其聚集態。本發明的進一步應用在於它能夠改進特性粘度測量值的確定方法，這是通過校正樣品在經過濃度檢測器和粘度計之間時發生的頻帶增寬效應來實現的。本發明的一個重要應用是它可以用於快速測定不分級樣品的第二維裡係數，例如在美國專利第6,411,383號中以及Trainoff和Wyatt於2002年7月24日提交的、現在正處於公布階段的美國專利申請第10/205,637號中所討論的樣品。該方法的成功實施關鍵取決於能夠準確地確定每個洗脫體積處濃度的平方。這要求對每個洗脫體積處的濃度進行準確測量。後面的測定一般是在不分級樣品上進行的，該不分級樣品的檢測器響應是一個單峰，它的質量組成在所選擇的每個時間間隔都是相同的。當它從一連串檢測器經過時，這個單峰變寬，如果不對增寬效應進行校正，則在獲得的結果中出現了系統誤差。
本發明包括一種對在液相色譜儀的檢測器之間出現的頻帶增寬效應進行校正的方法。該方法擴寬第一檢測器的頻帶使其與第二檢測器處變寬了的頻帶相一致，而不是將在第二檢測器處的頻帶恢復為第一檢測器處的形式來校正第二檢測器處所產生的頻帶增寬。由此獲得一種更簡單、更適用和更易實施的方法來校正所有檢測器處的頻帶增寬效應。儘管這種方法在波峰部分重疊時會導致波峰的分離度下降，但是大多數應用領域都是針對具有被很好地被分離和分辨的波峰的單分散性樣品。本發明還可應用於任何數目的串連的檢測器。
還應說明，本發明所披露的方法特別與本發明的受讓人和發明人的多個專利和專利申請相關，這些專利和專利申請包括Steven P.Treainoff和Philip J.Wyatt於2002年7月24日提交的美國專利申請第10/205,637號「Method for determining average solutionproperties of macromolecules by the injection methjod」。
Philip J.Wyatt於2002年6月25日獲得授權的美國專利第6,411,383，25號「Method for measuring the 2nd virial coefficient」。
Steven P.Trainoff於2001年1月30日獲得授權的美國專利第6,180,906號「Electrode design for electrical field flow fractionation」。
Steven P.Trainoff等人於2000年10月3日獲得授權的美國專利第6,128,080號「Extended range interferometric refractometer」。
Gary R Janik等人於1999年5月4日獲得授權的美國專利第5,900,152號「Apparatus to reduce inhomogeneities in optical flow cells」。
Gary R Janik等人於1997年10月14日獲得授權的美國專利第5,676,830號「Method and apparatus for reducing band broadening inchromatographic detectors」。
Philip J.Wyatt等人於1996年6月25日獲得授權的美國專利第5,530,540號「Light scattering measurement cell very small volumns」。
David W.Shortt於1996年6月18日獲得授權的美國專利第5,528,366號「Precision determination for molecularweights」。
Philip J.Wyatt於1994年4月19日獲得授權的美國專利第5,305,071號「Differential refractometer」。


圖1顯示了BSA樣品摩爾質量的未經校正的曲線，dRI檢測器在MALS檢測器下遊。
圖2顯示了對注射量為5μl，溶於甲苯的200kD聚苯乙烯的90°光散射跡線進行擬合的混雜增寬模型。
圖3顯示了用本發明的方法校正的圖1的數據。
圖4顯示了BSA樣品的特性粘度對洗脫體積的未經校正的曲線，dRI檢測器在粘度計下遊。
圖5顯示了用本發明的方法校正的圖4的數據。跡線11是校正後的特性粘度。
圖6顯示了BSA樣品摩爾質量的未經校正的曲線，其中紫外檢測器在MALS下遊。
圖7顯示了用本發明的方法校正的圖6的數據。
具體實施例方式
溶液中的分子通常是用它們的重均摩爾質量Mw、它們的均方半徑rg2和第二維裡係數A2來表徵。後者是分子與溶劑之間的相互作用的量度。對於不分級的溶液，這些性質可以通過測量它們的光散射行為來確定，其中可以使用Bruno Zimm於1948年發表在《the Journal ofChemical Physics》，第16卷，第1093至1099頁的開創性論文中描述的方法。最近，在由Trainoff和Wyatt於2002年7月24日提交的處於公布階段的審理中的申請10/205,637中討論的方法代表著一種將取代更傳統的Zimm方法的先進技術。
在某個角度和濃度範圍內測量來自小體積溶液的散射光。由光散射測量得到的性質的關係符合Zimm的下列公式R(θ)＝K≠MwcP(θ)[1-2A2MwcP(θ)]+O(c3)(1)其中，R(θ)是在(θ)方向上測到的每單位立體角的超瑞利比，定義為R(θ)＝[Is(θ)-Isolv(θ)]r2/I0V；Is(θ)是每單位立體角的由溶液散射的光強度；Isolv(θ)是每單位立體角的由溶劑散射的光強度；I0是入射光強度；r是該散射體積到檢測器的距離；V是由檢測器看到的被照射的體積；P(θ)是發生散射的分子的形狀因子，定義為P=limc0R/R(0);]]>K=42(dn/dc)2no2/(Na04),]]>其中Na是阿伏加德羅常數，dn/dc是折光指數增量，no是溶劑折光指數，c是濃度，λ0是入射光在真空中的波長。設定入射的準直光束相對於含有光散射檢測器的平面為垂直偏振。形狀因子與均方半徑rg2的關係滿足P=1-162no2302rg2>sin2(/2)+O(sin4/2)---(2)]]>多角度光散射儀測量來自流體樣品的散射光的量，它是角度和時間的函數。對於小到可以與入射光的波長相比較的分子來說，光散射測量可以限制在一個單一的散射角，例如90°，原因在於測量不到散射光強度隨角度的變化，但是，在這種限度內，可以測量摩爾質量卻不能測量均方半徑。
當該儀器被用來分析一個分離系統例如尺寸排阻色譜儀SEC的洗脫物時，樣品的組成和濃度隨時間變化。進一步地，SEC柱通常稀釋該樣品的濃度，以致於等式(1)的右邊的第二和第三項與第一項相比可以忽略。這種情況在形式上表示為2A2cMw＜＜1(3)對於與光散射儀器聯合使用的色譜分離來說，通常設定上述條件，除非從先前的實驗已經知道A2，在這種情況下該數值可以在式1中直接使用。另外，如果恰當地實施了分離，在每一個時間點該樣品的大小基本上是單分散性的，其質量通常也是單分散性的。如果該樣品在質量上也是單分散性的，我們可以進一步簡化得到R(θ，t)＝K≠Mc(t)P(θ，t) (4)所以，光散射信號應該與濃度信號成正比，摩爾質量可以通過下述比例式計算M=1Kc(t)lim0R(,t)----(5)]]>對於一個MALS系統的正確操作而言，一種普通的實驗是注射近單分散性的樣品使其通過分離柱，然後測量光散射和濃度信號，得到單分散性的波峰。假如進行歸一化，則它們就應該在所有的洗脫時間都精確地重疊，與等式(5)表達的常數對應。然而，如果濃度檢測器在MALS檢測器的下遊，兩種效應將會改變波峰的形狀混合和擴散。在這種情況下，波峰會變寬；波峰的中心變低，而「兩翼」增高。所以，當計算式(5)中的比值時，不會得到常數，從波峰附近得到的摩爾質量將被系統地高估，而在兩翼附近得到的摩爾質量將被低估。當濃度檢測器在MALS檢測器上遊時，情況相反。
應該指出，未經分級而注射進入色譜儀的樣品，常常被描述為流式注射，在它們從一個檢測器到達另一個檢測器的過程中，也發生帶的增寬。儘管期望每個連續的洗脫體積的摩爾質量分布都保持固定，但是頻帶增寬效應會影響從在所選擇的檢測器處發生增寬的下遊獲得的各種重均性質。所以，當被注射的樣品經過，例如，光散射檢測器和dRI濃度檢測器之間時，具有多分散性摩爾質量分布的樣品波峰將會變寬。當未分級的光散射信號與變寬的濃度檢測器信號結合時，在波峰的中心附近獲得的重均摩爾質量的計算結果將偏大，而在兩翼獲得的對應數值將偏小。這個結果和在分級樣品中看到的結果是完全一樣的。
樣品的混合主要取決於系統的幾何性質管的長度和直徑、連接器的數目、表面的粗糙程度和機械缺陷導致的夾雜物的數目，以及測量池的幾何性質。混合效應在一定限度內基本上與樣品的組成無關，在該限度內，體流體性質例如粘度不隨樣品而發生明顯的變化。相反，擴散明顯地取決於樣品的性質。
估計樣品在兩個檢測器之間流動時擴散和混合的相對重要性是具有指導意義的。對於均一的球體，Stokes-Einstein關係式DT=kBTcr----(6)]]>將擴散常數DT和球體半徑r聯繫在一起，其中kB是波耳茲曼常數，T是絕對溫度，η是溶劑粘度。
存在許多導致混合的因素，但是，為了估計範圍，考慮被充分混合的儲水器的簡單模型。假定光散射流動池是一個體積為V的混合室。用f表示流速，並假定進入該室的樣品的濃度為ci(t)。從流動室流出的樣品的濃度用下式給出c′(t)＝[ci(t)-c(t)]/tf(7)其中tf＝V/f，是充滿該儲水器的時間。考慮到窄脈衝效應，在該脈衝中有質量為m0的樣品進入流動池，結果即有ci(t)＝m0δ(t)。從該池流出的樣品的濃度則是c(t)=m0tfexp(-t/tf)(t)----(8)]]>其中，當t＜0時，θ(t)＝0；t≥0時，θ(t)＝1。結合上下文來看，假定流動池的體積V＝80μl，該池的進樣流速f＝1.0ml/min。增寬的指數時間常數tf＝4.8sec。假如流體通過內直徑為0.25mm的毛細管流入和流出混合室，最初的局部濃度脈衝要在管長超過1.6m以上才會逐漸消失。當然，當樣品流經光散射池時，它並沒有「充分混合」，但是這仍然能夠恰當地估計混合的長度範圍。
接著，考慮小分子的擴散效應。平均來說，分子將擴散一定距離x>=2DTt----(9)]]>其中，DT是分子的平移擴散常數，而t是時間。結合上下文，考慮蛋白質牛血清蛋白，BSA，它的擴散常數為7.7×10-7cm2/sec。濃度峰信號在4.8sec內能擴散多遠呢？等式(9)指出，它將沿著管子擴散僅僅27μm！所以，可得出結論，根本性的主要混合機理是非擴散性的，因此它不依賴於分子的擴散常數及其大小。檢測器間增寬的主要機理是混合，而與樣品無關。所以，如果能用一種參照樣品來表徵系統的幾何增寬，由此獲得的增寬參數就能用來校正所有後續數據處理。
考慮檢測器間增寬的一種簡單線性模型。出於討論的目的，假定濃度檢測器位於MALS檢測器的下遊。而且，假定滿足等式(3)，並已經收集到一種單分散性的參照樣品的數據。所以，被測量的濃度是以在MALS檢測器中的濃度作為基礎，通過使用用參數表示的增寬函數B(α0，α1，...，αn，τ)進行卷積積分獲得。可以得到cm(t)=-c(t-)B(0,1,n,)d,----(10)]]>其中，cm(t)是發生增寬後在下遊檢測器處測量到的濃度，c(t)是樣品通過光散射檢測器時它的濃度。參數αn則視具體模型而定，包括增寬函數的寬度和檢測器間的滯留體積。增寬校正的目標是找到這些參數的最佳擬合值。根據式(5)，可以得到cm(t)=1KM-R(0,t-)B(0,1,,n,)d----(11)]]>其中R(0,t)=lim0R(,t).]]>這裡，已經利用了這個事實波峰是單分散性的，以致於在該波峰的範圍內摩爾質量M不變，可挪到積分之外。為了確定最佳的擬合參數，計算在下遊測到的濃度信號cm(t)和被增寬的上遊光散射信號之間的χ2差，並在整個單分散性樣品的波峰內對其積分(0,1,,n,)2=-(cm(t)-1KM-R(0,t-)B(0,1,,n,)d)2dt---(12)]]>然後可以用標準的非線性最小二乘方擬合程序包來尋找使χ2最小化的最佳擬合參數K≠M和αi。將這些最佳的參數表示為αi′。
在實踐中，可以在上述擬合中引入其他系統特定的參數。例如，在等式(12)中的超瑞利比被定義為帶有樣品的溶劑的瑞利比與純溶劑的瑞利比之間的差值。純溶劑的瑞利比可以作為可調整的擬合參數被引入，由此取代通過設定溶劑基線來手工地確定它。類似地，假如濃度檢測器有一個緩慢的漂移，那麼該漂移的偏移量和斜率同樣可以引入該擬合中。重要的是，要注意到基本的一點是，在整個波峰範圍內摩爾質量是固定的，所以，等式(12)中的內部積分-R(0,t-)B(0,1,,n,)d]]>只含有被測到的瑞利比和增寬函數。假如質量不是固定的，就不可能唯一地確定最佳擬合參數αi′。
一旦確定了最佳擬合參數，在隨後的分析中有兩種方法可以使用。可以試圖通過對式(10)進行去卷積積分來「變窄」濃度測量，並且由此試圖回答這樣的問題假如濃度檢測器與光散射檢測器一致，那麼該濃度檢測器測量到的是多少？作為選擇，可以人工地使光散射的結果變寬，從而回答概念上的問題假如光散射在下遊與濃度檢測器一致地進行，光散射的結果會是什麼？我們將證明前一種方法，即構成傳統途徑的方法，在數值上是不穩定的，常常給出不合理的結果，而後一種方法在數值上是穩定的，但是要以降低測量的分離度作為代價。既然增寬通常是一種小的校正，那麼分離度的損失是次要的，後一種方法是優選的。
考慮傳統的去卷積積分的方法。可以通過作傅立葉變換，由已知的cm(t)重新構建c(t)c(t)=12-e-ic~mB~(1,,n,)d,----(13)]]>其中，c~m=12-eitcm(t)dt---(14)]]>是被測量的濃度的傅立葉變換，B~(1,,n,)]]>類似地是用上面發現的擬合參數評估的增寬核函的傅立葉變換。然後可以用式(5)計算作為時間函數的摩爾質量。這個步驟的問題在於計算比值c~m/B~(1,,n,).]]>當ω→±∞時， 和B~(1,,n,)]]>都趨向於零。所以，比值趨向於0/0，它是不定的。因為 含有實驗噪音，對於大的ω，比值將有更大的波動。所以，當使用式(13)計算c(t)時，結果會含有更高頻噪音和不合理的「震蕩效應(ringing)」，包括負的濃度。噪音可以被濾去，不合理的震蕩效應卻不能被濾去。
第二種方法，即是本發明的主題，是增寬光散射波峰。
表示為M(t)=1Kcm(t)lim0-R(,t-)B(1,,n,)d,----(15)]]>這構成了作為時間函數的摩爾質量的測量，它對檢測器間的增寬作了校正。注意，等式(15)的右邊只含有可被測量的量和用前面確定的參數估算的增寬函數。增寬函數的模型上面描述的算法允許人們針對檢測器間頻帶增寬效應校正光散射的結果，只要給出了參數化增寬核函模型。然而，為了應用該算法，必須選擇要使用的模型。在這一部分，我們將描述一種具體的模型，它對於由美國加利福尼亞州Santa Barbara的懷雅特技術公司所構建的DAWN儀器的MALS硬體來說工作良好。然而，重要的是，要注意到該算法同樣適用於任何確定的模型。
在懷雅特技術公司的Wyatt MALS儀器中使用的光散射池是一個直徑為1.25mm的圓筒，它通過直徑為0.1mm的毛細管以90度進樣，通過直徑為0.2mm的毛細管排出液體。典型的流速是1ml/min的數量級。可以通過計算雷諾數(Reynolds number)來確定流動是層流還是紊流，雷諾數Re＝vd/v，其中v是平均流動速率，d是系統的表徵尺寸，v是樣品粘度。對於在入口毛細管中的流動，v＝127mm/sec，d＝0.1mm，v＝0.89cm2/sec，由此Re＝14。流體流動直到雷諾數達到幾百時才會變得不穩定。因此，可斷定在入口毛細管中的流動是層流。接著，考慮流體進入流動池時它的噴射。流動速率不變，但是表徵尺寸增加到d＝1.25mm。所以，雷諾數增加到Re＝178。由此，可推斷在該池的進入口附近有一些紊流混合，其混合體積為該池體積的一小部分。同樣地，在濃度檢測器流動池的進入口處有一些混合。
還存在著一些儀器增寬，這是由於系統測量有限體積的流體，以及測量系統有某一固有的過濾時間常數。所以，我們將要考慮的模型是指數增寬與高斯項的卷積，前者代表在流動池中的混合，後者代表儀器的增寬。增寬核函的模型是B(,w,)=12e-r2/221we-/w,-----(16)]]>其中，δ是儀器的高斯寬度，w是由在池子的進入口處的混合產生的增寬，卷積被定義為a(t)b(t)-a(t-t)b(t)dt----(17)]]>為了測試該模型是否恰當，可進行了下面的試驗。用溶於甲苯的200kD聚苯乙烯填充5μm的注射環，並將它直接注射到光散射流動池。流動速率是0.5ml/min，樣品的收集間隔是0.25sec。將數據建模成δ函數與增寬模型的卷積，該δ函數代表注射環。為了將其與90°光散射信號比較，計算χ2為 其中，t0是樣品從注射器流到流動池所需的時間，而a是將無量綱的單位轉換為瑞利比的標度因子。有四個擬合參數a、t0、σ和w。
圖2顯示了擬合的結果。光散射數據點4被歸一化，所以波峰具有單位振幅。增寬函數的擬合結果是5。這僅僅包括在注射環和進行測量的流動池中心之間發生的增寬。明顯地，增寬函數很好地對數據進行了擬合。這個增寬模型將在下面描述的示例中被使用。將所述方法應用於任意串列的檢測器在這一部分，將針對兩個或更多個串連連接的任意的檢測器，對該方法進行推廣。定義在樣品順次流經D1，到D2，...，到Dn時檢測器的響應為Di(t)。一般來說，在樣品穿過該系統洗脫時，樣品波峰逐漸地變寬。對數據(D1(t)，D2(t)，...，Dn(t))所作的任何分析都要考慮到這種逐漸的變寬。如前所述，變寬上遊的檢測器使其與具有最寬響應的檢測器一致，在數值上更加穩定。具有最寬響應的檢測器通常會是這條鏈中的最後一個檢測器。然而，假如中間的某個檢測器具有大的儀器增寬，這些結果可以轉而以它作為參照。出於討論的目的，假定上遊檢測器信號被變寬以配合Dn。
該步驟分為兩個階段。在第一階段，通過測量單分散性的樣品來確定增寬參數，該單分散性的樣品具有足夠低的濃度，以致於在沒有增寬時檢測器信號之間成正比。在實踐中，注射近單分散性的樣品讓其穿過色譜儀，並選擇單聚體子峰來確定增寬參數。對於從1到n-1的每個檢測器i，計算i2(i,i,ij)=peak(Dn(t)-i-Di(t-)B(ij,-i)d)2dt,----(19)]]>其中χi2(βi，τi，αij)是第i個檢測器的χ2參數。參數βi是把檢測信號化為同樣標度的比例因子，τi是與樣品從一個檢測器流到下一個檢測器所用的時間有關的檢測器間延遲，而αij是第i個檢測器的j個增寬參數。使用標準的非線性最小二乘方擬合算法最小化χ2，由此確定最佳的擬合參數，βi′、τi′和αij′。能夠進行這種擬合的軟體很容易在各種商業程序包中獲得。這些步驟和各種軟體方法中的一些已經在Hiebert於1981年發表在《the ACM Transactions on Mathematical software》第7卷，第1-16頁的論文「An Evaluation of Mathematical Software That SolvesNonlinear Least Squares Problems」中被詳細地討論。
在第二階段，應用在第一階段確定的增寬參數來校正所有後續數據處理。在這個階段，所有的上遊檢測器信號都被變寬，就像它們重合於該鏈中最後一個檢測器似的。然後，可以將它們直接與最後一個檢測器Dn比較。被變寬的數據是Dib(t)=-Di(t-)B(ij,-i)d----(20)]]>然後在數據組(D1b(t)，...，Dn-1b(t)，Dn(t))上繼續進行原來的分析。
算法示例本部分將針對下面的儀器組合在樣品數據上說明該算法MALS+dRI、粘度計+dRI和UV+MALS。圖1顯示了來自注射進入由日本ShowaDenko製造的Shodex OH pack KW蛋白分離柱的100μl BSA的數據。流動速率是0.5ml/min。被分級的樣品首先經過光散射檢測器，然後經過dRI檢測器。BSA樣品主要由單體組成，但是也有一定含量的聚集體，它們通過該柱被分離。在16min和18min之間的波峰主要由純單體組成。在14.4min和16min之間的波峰是純二聚體，隨後的波峰是更高的聚集體，它們的分離要差一些。橫軸是時間，單位是分鐘(min)。跡線1是算出的摩爾質量Mw(t)除以單體的摩爾質量Mw0的結果。所以，對於單體，縱軸上的讀數為1，二聚體的讀數為2，等等。跡線2是90°光散射信號，跡線3是折光指數信號。折光指數和光散射已經被歸一化，因此它們的波峰具有同樣的最大高度。跡線2和3的縱軸標度是任意的。
該算法的第一步是選擇增寬模型。對於圖1中的數據，使用了式(16)所描述的混雜模型。該算法的第二步是選擇一個用來確定擬合參數的單分散性的波峰。在16min和18min之間的單體峰被使用。當計算式(19)中的χ2時，將有四個參數通過非線性最小二乘方擬合被確定。增加一個額外的參數來解釋在兩套數據之間可能存在的基線偏移。所以，被最小化的χ2是2(,0,,w,x0)=peak(dRI(t)--LS(t-)B(,w,-0)d+x0)2dt---(21)]]>其中，LS(t)是作為時間函數的90°光散射信號，dRI(t)是作為時間函數的dRI數據。這個模型可以通過使用商業上的馬夸特(Marquart)非線性最小二乘方程序包最小化，例如在D.W.Marquart於1963年發表在《the Journal of the Society of Industrial and Applied Mathematics》第11卷，第431-441頁的論文「An algorithm for least squares estimationof nonlinear parameters」中描述的。注意，進行式(20)所描述的增寬校正，並不需要β或者x0，所以它們沒有出現在下面的結果表格中，但是，為了確保正確地進行非線性最小化，需要將它們引入。

可以這樣來解釋這些結果，注意到δ＜＜w，這意味著主導性的增寬效應是混合，而非高斯擴散或儀器增寬，正如被預料的那樣。參數τ0僅僅說明樣品在兩個儀器之間穿行需要21秒。結合上下文，式(20)還可以寫成LSb(t)=-LS(t-)B(,w,-t0)d---(22)]]>圖3顯示了採用在上面第一步中得到的擬合參數，使用等式(22)算出的變寬的光散射信號7。使用跡線7代替最初的光散射數據，如前面一樣地繼續進行光散射分析。結果如跡線6所示。有許多需要注意的特徵。首先是跡線7現在和跡線2在單體峰處重疊。這說明模型是正確的，並且非線性最小化恰當地起到了作用。觀察到的第二點是在14.5min和16min之間的二聚體峰現在也是一個平臺，正如所期望的。在13.5min和14.5min之間的三聚體峰也變得更平，但是由於它與鄰近的峰沒有被基線分離，所以結果不太清晰。接著可以看到，這些平臺現在彼此成整數倍關係。這是預料之中的，因為二聚體的摩爾質量應該正好是單體的摩爾質量的兩倍。類似地，三聚體平臺現在是單體平臺的三倍。
圖4顯示了來自注射進入Shodex OH pack KW蛋白分離柱的100μlBSA的數據。流動速率是0.5ml/min。被分級的樣品首先經過一個在線橋式粘度計，然後經過一個dRI檢測器。該粘度計測量比粘度，比粘度被定義為ηsp(t)＝η(t)/η0-1(23)其中，η(t)是流體樣品聯合物的粘度，而η0是純流體的粘度。dRI檢測器測量樣品的折光指數，如果已知樣品dn/dc，該折光指數可轉換為濃度。然後，可以計算出特性粘度int(t)=limc0sp(t)/c(t)----(24)]]>假如濃度足夠低，那麼特性粘度近似為ηint(t)≈ηsp(t)/c(t). (25)跡線9是比粘度，跡線10是dRI信號。跡線9和10已經被歸一化，由此具有相同的最大高度。這兩條跡線的縱軸標度是任意的。測量結果如跡線8所示，跡線8以ml/g為單位在縱軸上表示特性粘度。每個樣品峰範圍內的特性粘度應該是固定的。所看到的彎曲是由於檢測器間的增寬，但是，在這種情況中，粘度信號實際上要比dRI信號寬。這是因為與dRI相比，粘度計在大得多的流體體積範圍內測量粘度。在這個實施例中，佔主導地位的增寬是粘度計所固有的儀器增寬。事實上，樣品在兩個檢測器之間通過使得dRI信號變寬，這降低了峰寬的總體差別。可以和前面一樣地應用本發明的這個方法，但是，在這種情況中，要將dRI信號變寬以配合粘度信號。該算法的第一步是選擇增寬模型。依然選用混雜高斯-混合模型。在該算法中的第二步是選擇一個用來確定擬合參數的單分散性的波峰。在15.2min和16.2min之間的單體峰被使用。如上所述，式(19)可以改寫成2(,0,,w,x0)=peak(sp(t)--dRI(t-)B(,w,-0)d+x0)2dt----(26)]]>對於可調整的參數，通過最小化χ2來確定這些擬合參數。得到的擬合參數為

在這種情況中，參數w是9.04秒，該參數出現如此大的值不是因為檢測器間的混合，而是因為相對於dRI流動池的體積而言，粘度計毛細管具有一個巨大的內部體積。高斯項是極小的，它再次說明擴散是不重要的。通過將等式(20)改寫為下式，可以將dRI信號變寬，dRIb(t)=-dRI(t-)B(,w,-0)d----(27)]]>可以用變寬的dRI信號繼續進行分析。圖5的跡線12顯示了變寬的dRI信號，跡線11顯示了被校正的特性粘度信號。現在這些結果由代表每個波峰的平臺組成。
如圖6所示，最後一個實施例由濃度為3.0mg/ml的BSA的100μl樣品所組成，該樣品依次由UV檢測器和MALS檢測器測量。在這種情況中，用14表示的LS信號明顯要比15表示的UV信號寬，從而得到了用13表示的彎曲的摩爾質量跡線。對於這個實施例，將UV信號變寬以配合LS信號。等式(19)被改寫為2(,0,,w,x0)=peak(LS(t)--UV(t-)B(,w,-0)d+x0)2dt,---(28)]]>
混雜混合和高斯模型再次被使用，在13.5min和15min之間單體峰被用來確定擬合參數。最小化χ2，得到這些擬合參數的值

同樣，增寬的主要因素是內部混合。現在將等式(20)改寫為下式，通過計算將UV數據變寬，如圖7中所示。
UVb(t)=-UV(t-)B(,w,-0)d----(29)]]>變寬的UV信號如跡線17所示，摩爾質量如跡線16所示。和前面兩種情況一樣，數據由平臺組成，檢測器間的增寬效應明顯降低了。
本發明方法的上述示例僅僅說明了可以用本說明書所公開的發明方法實施和修正的頻帶增寬校正的一些可能類型。對於色譜技術領域的技術人員而言，明顯的是，在本發明之前，頻帶增寬效應嚴重阻礙著提高多檢測器使用時的測量精度。本發明的方法和各種變化都實現了明顯降低頻帶增寬效應這一期望。
權利要求
1.一種確定增寬模型的最佳擬合參數的方法，該增寬模型用於對其中含有一個分離器件且該分離器件後有兩個或兩個以上檢測器的色譜分離中的頻帶增寬效應進行校正，所述方法包括以下步驟a)選擇一個含有一套可調參數的增寬模型；b)注射一種含有單分散性成分的樣品；c)從每個所述的檢測器收集對應於所述單分散性成分的信號；d)利用變得最寬的檢測器信號的所述收集到的信號作為所述其他檢測器信號增寬的參照，形成χ2模型，該χ2模型將在所述單分散性成分的波峰上進行最小化；最小化χ2模型，為每一個將被增寬的所述檢測器信號確定所述最佳擬合參數，由此使它們的增寬和歸一化的形狀最符合產生所述最寬暫時響應的檢測器的形狀。
2.根據權利要求1的方法，其中所述χ2模型的最小化是通過使用非線性最小二乘方算法實現的。
3.根據權利要求2的方法，其中所述非線性最小二乘方算法屬於由馬夸特開發的類型。
4.根據權利要求1的方法，其中所述被最小化的χ2模型是xi2(i,i,ij)=pcak(Dn(t)-i-Di(t-)B(ij,-i)d)2dt,]]>其中所述的最佳擬合參數是βi、αij和τi；作為時間的函數的i-檢測器的響應表示為Di(t)；並且所述的模型是在所述波峰上進行最小化的。
5.根據權利要求1的方法，其中所述頻帶增寬是由稀釋引起的。
6.根據權利要求1的方法，其中所述增寬是由混合引起的。
7.根據權利要求6的方法，其中所述混合是由在檢測池和/或連接器內的機械缺陷導致的夾雜物引起的。
8.根據權利要求1的方法，所述增寬是由內在的儀器效應引起的。
9.根據權利要求8的方法，所述內在的儀器效應是由電子濾波引起的。
10.根據權利要求8的方法，所述內在的儀器效應是由每個檢測器所測量的樣品體積差別引起的。
11.一種獲得連續地經過一組檢測器的樣品的選定物理性質的方法，其在某些所述的檢測器表現出信號頻帶增寬時，採用由所述檢測器產生的響應於所述流經樣品的信號組合，所述方法包括以下步驟a)將參數化的增寬函數應用於所述的檢測器組，由此獲得一組對應的檢測器信號，所有這些檢測器信號都具有可比較的增寬；和b)在應用了所述的增寬函數之後，利用所述的此時已變寬的檢測器信號來獲得被測樣品的選定物理性質。
12.根據權利要求11的方法，其中所述參數化增寬函數的應用由Dib(t)=-Di(t-)B(ij,-i)d]]>給出，其中Dib(t)是所述的此時已變寬的檢測器信號，α′ij和τ′i是權利要求2所述的最佳擬合參數。
13.根據權利要求11的方法，其中所述選定物理參數是利用關係式R(θ)＝K≠MwcP(θ)[1-2A2MwcP(θ)]+O(c3)而從濃度信號c(t)和超瑞利比R(θ，t)獲得的所述樣品的重均摩爾質量Mw和均方根半徑rg，其中超瑞利比R(θ，t)和濃度信號c(t)由來自含有光散射檢測器的檢測器組的第i個光散射信號Di(t)和dRI檢測器依次獲得，所述dRI檢測器產生的濃度信號相對於所述光散射檢測器信號出現增寬，而其中所述的光散射檢測器信號已經發生了增寬。
14.根據權利要求11的方法，其中所述檢測器信號來自紫外檢測器，該紫外檢測器之後有一多角度光散射檢測器，且所述多角度光散射信號發生增寬。
15.根據權利要求11的方法，其中所述檢測器信號來自折光指數檢測器，該折光指數檢測器之後有一粘度檢測器，且所述折光指數檢測器信號發生增寬。
16.根據權利要求11的方法，其中所述的增寬函數由B(t)=-12e-2/221wU(t-)e-(t-)/d]]>給出，其中當t≥τ時，U(t-τ)＝1，而當t＜τ時，U(t-τ)＝0。
17.根據權利要求16的方法，其中所述增寬函數的最佳參數已經通過權利要求1的方法確定。
18.一種確定在色譜分離系統中的N個檢測器之間的滯留體積τi的方法，其中i＝1至N-1，在所述色譜分離系統中應用了權利要求2所述的方法。
全文摘要
本發明公開了一種新方法，可由此校正大多數類型的頻帶增寬以便對這些物理性質作更精確計算。校正頻帶增寬效應的傳統方法是基於試圖使已變寬的波峰變窄為它變寬前的形式的數學方法，缺點是非常不穩定，而且常常得出不合理的結果。本發明所公開的方法則可用於表徵在色譜系統中出現的增寬，由此可以將上遊檢測器的窄峰變寬，從而使其可與下遊檢測器的變寬的波峰相互比較。雖然本技術會導致部分損失分離度，但是它的穩定性和普適性使其能得到廣泛應用。
文檔編號G01N30/74GK1598571SQ20041006267
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月6日 優先權日2003年9月18日
發明者S·P·特拉伊諾夫 申請人:懷雅特技術公司