產生肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)莢膜多糖的縮短的純化方法

2023-06-18 23:42:41

專利名稱：產生肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae)莢膜多糖的縮短的純化方法
技術領域：
本發明涉及自肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)血清型的細胞溶解產物去除過多可溶蛋白和其它雜質的方法，所述方法用於產生純化的肺炎球菌多糖。

背景技術：
肺炎鏈球菌是革蘭氏(Gram)陽性刀形球菌，其通常成對出現(雙球菌)，但也可以短鏈形式或單細胞形式出現。其易於在血液瓊脂板上生長為閃光菌落並表現α溶血，而在厭氧生長時其表現β溶血。其對可裂解細胞壁的膽汁鹽以及細胞自身的酶(自溶素)的存在敏感。所述有機體是兼性厭氧菌並且由於其具有複雜營養需求，因此其需要複雜營養。
大多數肺炎球菌血清型的細胞具有莢膜，其為每個細胞周圍的多糖包衣。由於此莢膜可通過阻止抗體附接至細菌細胞來幹擾吞噬作用，因此其為人類的毒力決定因素。現已確認90種莢膜血清型，其中23種血清型引發約90％的侵襲性疾病。多糖作為疫苗可賦予具有已發育或未受損免疫系統的個體以適當程度的針對肺炎鏈球菌的免疫力。然而，當使多糖與諸如CRM197等高分子量蛋白質偶聯並將其調配為含有多血清型偶聯物的疫苗時，所述偶聯疫苗使得可在肺炎球菌感染的風險同樣為最高的嬰兒和老人體內引發免疫應答。
用於疫苗產品的每種肺炎鏈球菌血清型的莢膜多糖都是通過在液體培養基中生長有機體來產生。經常使所述有機體種群自一個種瓶放大至多個種瓶，並使其通過一或多個可增加體積的種發酵罐直至發酵體積達到生產規模。可通過一或多種方式來確定生長周期的終點，在此時通過添加洗滌劑或其它可幫助裂解細胞壁並釋放自溶素的試劑來溶解細胞，所述自溶素可在細胞到達靜止期時導致細胞溶解。然後收穫培養液用於下遊(純化)處理。主要汙染物是細胞蛋白、核酸、C-多糖和培養基組份。對於當前市售7-價肺炎球菌偶聯(7vPnC)疫苗(普雷夫那(Prevnar)

)以及新研發的13-價肺炎球菌偶聯(13vPnC)疫苗的大多數血清型來說，現有純化方法需要十六個步驟，其涉及許多昂貴的、勞動密集的並且需要技術性的操作，例如色譜法和多膜分離。先前改良用於肺炎鏈球菌多糖的純化方法的嘗試包括(例如)在發酵和回收期間調節pH(參見美國專利申請公開案第2006/0228381號)和溶劑與洗滌劑沉澱。然而，在這些方法中去除雜質仍需要多個勞動密集的高成本步驟。由於可溶蛋白的物理和化學特性，蛋白質含量是最難滿足的技術要求。
因此，業內需要可降低肺炎鏈球菌溶解產物中的可溶蛋白質含量並且不具有現有純化方法無效性的經簡化純化方法，以產生適合納入肺炎球菌偶聯疫苗中的基本上純化的莢膜多糖。


發明內容
本發明涉及自肺炎鏈球菌細胞溶解產物產生基本上純化的莢膜多糖的方法。所述方法包含以下步驟 (a)提供包含可產生所選肺炎鏈球菌血清型的細菌細胞的發酵培養液； (b)用溶解劑溶解步驟(a)中的細菌細胞，由此產生包含細胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細胞溶解產物； (c)使用離心或過濾來去除細胞碎片以澄清步驟(b)中的細胞溶解產物，由此產生澄清細胞溶解產物； (d)超濾並透析過濾步驟(c)中的澄清細胞溶解產物以去除低分子量雜質並提高多糖濃度，由此產生滲餘物； (e)使步驟(d)中滲餘物的pH降低至4.5以下以使蛋白質與核酸沉澱，由此形成酸化滲餘物溶液； (f)將步驟(e)中形成的酸化滲餘物溶液保持足夠長時間以使沉澱物沉降，之後過濾或離心酸化滲餘物溶液，由此產生澄清多糖溶液； (g)通過活性炭過濾器過濾步驟(f)中的澄清多糖溶液； (h)超濾並透析過濾步驟(g)產生的經過濾溶液，由此產生經濃縮純化多糖溶液；和 (i)使用無菌過濾器過濾步驟(h)產生的經濃縮純化多糖溶液； 由此產生呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。本發明此實施例中所選實例性非限制性肺炎鏈球菌血清型是1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一特定實施例中，步驟(e)的pH降低至約3.5。在另一實施例中，步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約5.5至約7.5之間。在另一實施例中，步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約7.0至約7.5之間。在另一實施例中，步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約7.4。在又一實施例中，步驟(e)自步驟(d)的滲餘物去除至少98％的蛋白質。在另一實施例中，步驟(g)自步驟(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質。在另一實施例中，步驟(g)的活性炭過濾器包含木質磷酸-活性炭。在另一實施例中，步驟(f)包含將步驟(e)中形成的酸化滲餘物溶液保持至少2小時。在又一實施例中，步驟(b)中的溶解劑為脫氧膽酸鈉(DOC)。在另一實施例中，步驟(b)中的溶解劑為非動物源性溶解劑。在又一實施例中，步驟(b)中的溶解劑為非動物源性溶解劑N-月桂醯肌氨酸鈉(NLS)。
通過本發明方法自肺炎鏈球菌細胞溶解產物產生的基本上純化的莢膜多糖可用於產生肺炎球菌疫苗，優選地產生含有與蛋白質載體偶聯的多糖的肺炎球菌疫苗。
本發明也涉及自包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的肺炎鏈球菌細胞溶解產物產生基本上純化的莢膜多糖的方法。所述方法包含以下步驟 (a)提供包含可產生肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的細菌細胞的發酵培養液； (b)用溶解劑溶解步驟(a)中的細菌細胞，由此產生包含細胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細胞溶解產物； (c)使用離心或過濾來去除細胞碎片以澄清步驟(b)中的細胞溶解產物，由此產生澄清細胞溶解產物； (d)在室溫和中性pH下於無鹽介質中超濾並透析過濾步驟(c)中的澄清細胞溶解產物以去除低分子量雜質並提高多糖濃度，由此產生無鹽滲餘物； (e)使步驟(d)中無鹽滲餘物的pH降低至4.5以下以使蛋白質與核酸沉澱，由此形成酸化滲餘物溶液； (f)將步驟(e)中形成的酸化滲餘物溶液在室溫下保持至少2小時以使沉澱物沉降，之後過濾或離心酸化滲餘物溶液，由此產生澄清多糖溶液； (g)通過活性炭過濾器過濾步驟(f)中的澄清多糖溶液； (h)超濾並透析過濾步驟(g)產生的經過濾溶液，由此產生經濃縮純化多糖溶液；和 (i)使用無菌過濾器過濾步驟(h)產生的經濃縮純化多糖溶液； 由此產生包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。在一特定實施例中，步驟(e)的pH降低至約3.5。在另一實施例中，步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約5.5至約7.5之間。在另一實施例中，步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約7.0至約7.5之間。在另一實施例中，步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約7.4。在又一實施例中，步驟(e)自步驟(d)的滲餘物去除至少98％的蛋白質。在另一實施例中，步驟(g)自步驟(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質。在另一實施例中，步驟(g)的活性炭過濾器包含木質磷酸-活性炭。在又一實施例中，步驟(b)中的溶解劑為脫氧膽酸鈉(DOC)。在另一實施例中，步驟(b)中的溶解劑為非動物源性溶解劑。在又一實施例中，步驟(b)中的溶解劑為非動物源性溶解劑N-月桂醯肌氨酸鈉(NLS)。
本發明也涉及自包含血清型19A的肺炎鏈球菌細胞溶解產物產生基本上純化的莢膜多糖的方法。所述方法包含以下步驟 (a)提供包含可產生肺炎鏈球菌血清型19A的細菌細胞的發酵培養液； (b)用溶解劑溶解步驟(a)中的細菌細胞，由此產生包含細胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細胞溶解產物； (c)使用離心或過濾來去除細胞碎片以澄清步驟(b)中的細胞溶解產物，由此產生澄清細胞溶解產物； (d)在約4℃和約6的pH下於磷酸鈉緩衝液中超濾並透析過濾步驟(c)中的澄清細胞溶解產物以去除低分子量雜質並提高多糖濃度，由此產生滲餘物； (e)使步驟(d)中滲餘物的pH降低至4.5以下以使蛋白質與核酸沉澱，由此形成酸化滲餘物溶液； (f)將步驟(e)中形成的酸化滲餘物溶液在約4℃下保持至少2小時以使沉澱物沉降，之後過濾或離心酸化滲餘物溶液，由此產生澄清多糖溶液； (g)將步驟(f)中的澄清多糖溶液的pH調節至約6，由此產生pH經調節的澄清多糖溶液； (h)通過活性炭過濾器過濾步驟(g)中的pH經調節的澄清多糖溶液； (i)超濾並透析過濾步驟(h)中產生的經過濾溶液，由此產生經濃縮純化多糖溶液；和 (j)使用無菌過濾器過濾步驟(i)中產生的經濃縮純化多糖溶液； 由此產生包含血清型19A的呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。在一特定實施例中，步驟(e)的pH降低至約3.5。在另一實施例中，步驟(i)的透析過濾包含將pH調節至約5.5至約7.5之間。在另一實施例中，步驟(i)的透析過濾包含將pH調節至約7.0至約7.5之間。在另一實施例中，步驟(i)的透析過濾包含將pH調節至約7.4。在又一實施例中，步驟(e)自步驟(d)的滲餘物去除至少98％的蛋白質。在另一實施例中，步驟(h)自步驟(g)的pH經調節的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質。在另一實施例中，步驟(h)的活性炭過濾器包含木質磷酸-活性炭。在另一實施例中，步驟(d)中的磷酸鈉緩衝液為25mM磷酸鈉。在又一實施例中，步驟(b)中的溶解劑為脫氧膽酸鈉(DOC)。在另一實施例中，步驟(b)中的溶解劑為非動物源性溶解劑。在又一實施例中，步驟(b)中的溶解劑為非動物源性溶解劑N-月桂醯肌氨酸鈉(NLS)。



圖1展示使用本發明縮短的純化方法時血清型5的平均工序間多糖(PS)產率、蛋白質/PS比率、和核酸(NA)/PS比率。展示每個純化步驟的結果。
圖2展示得自現有純化方法的血清型4 PS NMR波譜(A)與得自縮短純化方法的血清型4PS NMR波譜(B)的對比。在兩個波譜間未觀察到顯著差異。兩個波譜中從右邊數第二個峰都為丙酮酸鹽，並且在兩個波譜中丙酮酸鹽基團的峰高相當。
圖3展示使用本發明縮短純化方法時血清型4的平均工序間PS產率、蛋白質/PS比率、和NA/PS比率。展示每個純化步驟的結果。
圖4展示使用本發明縮短純化方法時血清型19A的平均工序間PS產率、蛋白質/PS比率、和NA/PS比率。展示每個純化步驟的結果。
圖5展示使用本發明縮短純化方法時血清型7F的平均工序間PS產率、蛋白質/PS比率和NA/PS比率。展示每個純化步驟的結果。
圖6展示使用本發明縮短純化方法時血清型6B的平均工序間PS產率、蛋白質/PS比率和NA/PS比率。展示每個純化步驟的結果。
圖7展示使用本發明縮短純化方法時血清型6A的平均工序間PS產率、蛋白質/PS比率和NA/PS比率。展示每個純化步驟的結果。
圖8展示使用本發明縮短純化方法時血清型1的平均工序間PS產率、蛋白質/PS比率和NA/PS比率。展示每個純化步驟的結果。
圖9展示使用本發明縮短純化方法時血清型14的平均工序間PS產率、蛋白質/PS比率和NA/PS比率。展示每個純化步驟的結果。
圖10展示使用本發明縮短純化方法純化的血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F的工序間PS產率的對比。
圖11展示使用本發明縮短純化方法純化的血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F的蛋白質/PS比率的對比。比較每個純化步驟的結果。
圖12展示使用本發明縮短純化方法純化的血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F的NA/PS比率的對比。比較每個純化步驟的結果。
圖13展示本發明縮短純化方法中酸化步驟產生的蛋白質去除效率。相對於酸化前初始蛋白質濃度繪示血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F批次酸化前後蛋白質濃度(SDS-PAGE)的差異。用蛋白質濃度差異除以初始蛋白質濃度來反應酸化步驟的蛋白質去除率。
圖14展示本發明縮短純化方法中炭吸附步驟產生的蛋白質去除效率。相對於初始蛋白質載量繪示血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F批次的蛋白質去除(吸附在炭上)量。用蛋白質去除量除以初始蛋白質載量來反映炭吸附步驟的蛋白質去除率。

具體實施例方式 本發明涉及可在肺炎鏈球菌細胞溶解產物中降低可溶蛋白質含量以產生適合納入肺炎球菌偶聯疫苗中的基本上純化的莢膜多糖的縮短純化方法。對於當前市售7-價肺炎球菌偶聯(7vPnC)疫苗(普雷夫那

)以及新研發的13-價肺炎球菌偶聯(13vPnC)疫苗的大多數血清型來說，現有多糖純化方法需要多達十六個步驟。這些步驟涉及許多昂貴的、勞動密集的並且需要技術性的操作，例如色譜法和多膜分離。本發明方法在達成相同純化的同時取消了這些步驟中的多達八個步驟，並且不需要實施色譜法。因此，本發明涉及更有效的純化方法，其成本較低，用時較短，並且涉及的步驟較少。
本發明縮短的純化方法涉及以下發現超濾並透析過濾澄清肺炎鏈球菌細胞溶解產物培養液，之後將經濃縮溶解產物培養液的pH酸化至4.5以下，優選地酸化為約3.5，從而可沉澱溶液中至少98％的蛋白質而不嚴重影響多糖產率。通過超濾並透析過濾經溶解的澄清發酵培養液，之後將pH酸化至4.5以下、優選地約3.5，可消除蛋白質的「鹽溶」效應並提高「鹽析」蛋白質的比例。「鹽溶」是指蛋白質的溶解度提高，而「鹽析」是指在溶液中的蛋白質到達其等電點時發生沉澱。超濾和透析過濾步驟也可阻止當將經碳酸鈉處理的培養液酸化至甚至pH 5.0時觀察到的起泡(參見美國專利申請公開案第2006/0228381號)。因此，對澄清溶解產物培養液實施超濾和透析過濾使得可在肺炎鏈球菌血清型發酵期間使用任何諸如碳酸鈉等低分子量pH滴定劑，並在將pH酸化至4.5以下時阻止澄清溶解產物培養液起泡。
「澄清溶解產物培養液「是指已進行離心或過濾來去除細胞碎片的溶解產物培養液。
「透析過濾(diafiltering、diafiltration、DF)「和類似術語是指(例如)使用具有適當物理和化學特性的半透膜自溶液中去除小分子。
「超濾(ultrafiltering、ultrafiltration、UF)」和類似術語是指(例如)使用具有適當物理和化學特性的半透膜區分溶液中的各種分子，並將相同分子濃縮至較小體積溶液中。
在本發明方法中，超濾和透析過濾通常包含「橫向流」或「切向流」過濾以避免阻塞濾膜。在「橫向流」過濾中，使欲過濾溶液橫向經過膜表面。將穿過膜的物質稱作滲透物。未穿過膜的物質稱作滲餘物。將滲餘物再循環至進料庫中以供再過濾。
只要可達成低於4.5、具體來說約3.5的pH，本文所用任何酸都可用於降低經超濾和透析過濾的溶解產物培養液的pH。因此，有機和礦物酸二者都可用於本發明方法中。本文所用術語「礦物酸」是指通過化學反應衍生自無機礦物質的與有機酸相反的酸。可用於本發明方法中的礦物酸的實例性非限制性實例包括鹽酸、硝酸、磷酸、和硫酸。在特定實施例中，使經濃縮溶解產物培養液的pH降低至低於4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1或3.0。在其它實施例中，使經濃縮溶解產物培養液的pH降低至約4.4、約4.3、約4.2、約4.1、約4.0、約3.9、約3.8、約3.7、約3.6、約3.5、約3.4、約3.3、約3.2、約3.1、約3.0、約2.9、約2.8、約2.7、約2.6、約2.5、約2.4、約2.3、約2.2、約2.1或約2.0。
本發明縮短的純化方法也涉及以下發現結合上述濃縮和降低pH的步驟，使用活性炭過濾可使剩餘蛋白質中的至少90％沉澱而不嚴重影響多糖產率。在特定實施例中，發現使用得自鋸末或其它木質產品並且經磷酸活化的炭實施炭過濾可比現有炭過濾方法中所用的炭更有效地減少或去除蛋白質雜質。
因此，本發明涉及自肺炎鏈球菌細胞溶解產物產生基本上純化的莢膜多糖的方法，其包含以下步驟 (a)提供包含可產生所選肺炎鏈球菌血清型的細菌細胞的發酵培養液； (b)用溶解劑溶解步驟(a)中的細菌細胞，由此產生包含細胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細胞溶解產物； (c)使用離心或過濾來去除細胞碎片以澄清步驟(b)中的細胞溶解產物，由此產生澄清細胞溶解產物； (d)超濾並透析過濾步驟(c)中的澄清細胞溶解產物以去除低分子量雜質並提高多糖濃度，由此產生滲餘物； (e)使步驟(d)中滲餘物的pH降低至4.5以下、具體來說約3.5以使蛋白質與核酸沉澱，由此形成酸化滲餘物溶液； (f)步驟(e)中形成的酸化滲餘物溶液在攪拌或不攪拌的情況下保持足夠長時間、具體來說至少2小時以使沉澱物沉降，之後過濾或離心酸化滲餘物溶液，由此產生澄清多糖溶液； (g)通過活性炭過濾器、具體來說包含木質磷酸-活性炭的活性炭過濾器來過濾步驟(f)中的澄清多糖溶液； (h)超濾並透析過濾步驟(g)產生的經過濾溶液，由此產生經濃縮純化多糖溶液；和 (i)使用無菌過濾器過濾步驟(h)產生的經濃縮純化多糖溶液； 由此產生呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。步驟(i)中的無菌過濾可用於自經濃縮純化多糖溶液去除細菌和顆粒。本發明此實施例中所選實例性非限制性肺炎鏈球菌血清型為1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一特定實施例中，步驟(e)自步驟(d)中的滲餘物去除至少98％的蛋白質。在另一實施例中，步驟(g)自步驟(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質。在另一實施例中，步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約5.5至約7.5之間。然而，為改良在長期儲存期間基本上純化的莢膜多糖的穩定性，步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約7.0至約7.5，並且更具體來說調節至約7.4。
本文所用術語「含有基本上純化的莢膜多糖的溶解產物「或」含有基本上純化的莢膜多糖的溶液「是指肺炎鏈球菌細胞溶解產物或溶液，其中已去除蛋白質從而使得蛋白質與多糖的百分比比率(蛋白質/PS)小於10％、小於9％、小於8％、小於7％、小於6％、小於5％、小於4％、小於3％、小於2％或小於1％並且核酸與多糖的百分比比率(NA/PS)小於5％、小於4％、小於3％、小於2％或小於1％。在特定實施例中，在包含指定血清型並含有基本上純化的莢膜多糖的溶解產物或溶液中，蛋白質/PS和NA/PS的百分比比率如下所述對於血清型1，蛋白質/PS比率小於2％並且NA/PS比率小於2％；對於血清型4，蛋白質/PS比率小於3％並且NA/PS比率小於2％；對於血清型5，蛋白質/PS比率小於或等於7.5％並且NA/PS比率小於或等於2％；對於血清型6A，蛋白質/PS比率小於2％並且NA/PS比率小於2％；對於血清型6B，蛋白質/PS比率小於4％並且NA/PS比率小於1％；對於血清型7F，蛋白質/PS比率小於5％並且NA/PS比率小於2％；對於血清型9V，蛋白質/PS比率小於2％並且NA/PS比率小於1％；對於血清型14，蛋白質/PS比率小於3％並且NA/PS比率小於2％；對於血清型18C，蛋白質/PS比率小於2％並且NA/PS比率小於2％；對於血清型19A，蛋白質/PS比率小於2％並且NA/PS比率小於2％；對於血清型19F，蛋白質/PS比率小於3％並且NA/PS比率小於2％；並且對於血清型23F，蛋白質/PS比率小於2％並且NA/PS比率小於2％。量化細胞溶解產物或溶液中蛋白質、多糖和核酸濃度的方法為業內所熟知並且包括(例如)SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)分析、HPLC(高效液相色譜)和SEC(尺寸排阻色譜)、修改的勞裡(Lowry)分析、分光光度法、SEC-MALLS(分子排阻色譜/多角度雷射散射)、和NMR(核磁共振)。
在本發明方法中，可使用任何溶解劑來溶解細菌細胞。「溶解劑「是包括(例如)洗滌劑在內的任何可幫助細胞壁裂解並釋放自溶素的試劑，所述自溶素可導致細胞溶解。本文所用術語「洗滌劑」是指能誘導細菌細胞溶解的任何陰離子型或陽離子型洗滌劑。用於本發明方法中的所述洗滌劑的代表性實例包括脫氧膽酸鈉(DOC)、N-月桂醯肌氨酸(NLS)、鵝脫氧膽酸鈉和皂苷。
在本發明一實施例中，用於溶解細菌細胞的溶解劑為DOC。DOC是膽汁酸脫氧膽酸的鈉鹽，其一般得自諸如母牛或公牛等生物來源。DOC活化LytA蛋白，其為肺炎鏈球菌細胞壁生長和分裂中涉及的自溶素。LytA蛋白在其C-末端部分具有膽鹼結合結構域，並且已知lytA基因的突變可產生對DOC溶解具有抗性的LytA突變體。
儘管沒有證據表明在肺炎鏈球菌多糖純化期間使用DOC會造成健康危險，但使用所述生物源試劑可能會產生潛在的調控問題。因此，在本發明一實施例中，用於溶解細菌細胞的溶解劑是非動物源性溶解劑。用於本發明方法中的非動物源性溶解劑包括作用模式與DOC類似(即影響LytA功能並導致肺炎鏈球菌細胞溶解)的來自非動物源的試劑。所述非動物源性溶解劑包括(但不限於)DOC類似物、表面活性劑、洗滌劑和膽鹼的結構類似物，並且可使用下文實驗部分中所述的程序來確定。在一實施例中，非動物源性溶解劑選自由以下組成的群組癸烷磺酸、叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇(例如伊格保(Igepal)

CA-630，CAS編號9002-93-1，購自西格瑪-奧德裡奇(SigmaAldrich)，密蘇裡州聖路易斯(St.louis，MO))、辛基苯酚氧化乙烯縮合物(例如曲拉通(Triton)

X-100，購自西格瑪-奧德裡奇，密蘇裡州聖路易斯)、N-月桂醯肌氨酸鈉(NLS)、亞氨基二丙酸月桂酯、十二烷基硫酸鈉、鵝脫氧膽酸鹽、豬脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、牛磺脫氧膽酸鹽、牛磺鵝脫氧膽酸鹽、和膽酸鹽。在另一實施例中，非動物源性溶解劑是NLS。
本發明也涉及對上述方法的血清型特異性修改。例如，由於血清型19A多糖不穩定並且其分子量在純化期間發生變化，因此發現對所述方法進行修改可用於穩定19A多糖。這些修改包括在酸化前在約4℃和約6的pH下於磷酸鈉緩衝液中實施超濾和透析過濾步驟，在約4℃下將酸化滲餘物溶液保持至少2小時以使沉澱物沉降，以及在實施活性炭過濾步驟之前將澄清多糖溶液的pH調節至6。相反，人們發現對於血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F來說，當在酸化前於諸如水等無鹽介質中實施超濾和透析過濾步驟時，可達成較少多糖損失和較高蛋白質去除，並且此步驟可在室溫和中性pH下實施。
因此，本發明也涉及自包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的肺炎鏈球菌細胞溶解產物產生基本上純化的莢膜多糖的方法，其包含以下步驟 (a)提供包含可產生肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的細菌細胞的發酵培養液； (b)用洗滌劑溶解步驟(a)中的細菌細胞，由此產生包含細胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細胞溶解產物； (c)使用離心或過濾來去除細胞碎片以澄清步驟(b)中的細胞溶解產物，由此產生澄清細胞溶解產物； (d)在室溫和中性pH下於無鹽介質中超濾並透析過濾步驟(c)中的澄清細胞溶解產物以去除低分子量雜質並提高多糖濃度，由此產生無鹽滲餘物； (e)使步驟(d)中無鹽滲餘物的pH降低至4.5以下、具體來說約3.5以使蛋白質與核酸沉澱，由此形成酸化滲餘物溶液； (f)將步驟(e)中形成的酸化滲餘物溶液在室溫和攪拌或不攪拌的情況下保持至少2小時以使沉澱物沉降，之後過濾或離心酸化滲餘物溶液，由此產生澄清多糖溶液； (g)通過活性炭過濾器、具體來說包含木質磷酸-活性炭的活性炭過濾器來過濾步驟(f)中的澄清多糖溶液； (h)超濾並透析過濾步驟(g)產生的經過濾溶液，由此產生經濃縮純化多糖溶液；和 (i)使用無菌過濾器過濾步驟(h)產生的經濃縮純化多糖溶液； 由此產生包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。在一特定實施例中，步驟(e)自步驟(d)中的無鹽滲餘物去除至少98％的蛋白質。在另一實施例中，步驟(g)自步驟(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質。在另一實施例中，步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約5.5至約7.5之間。然而，為改良在長期儲存期間基本上純化的莢膜多糖的穩定性，步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約7.0至約7.5，並且更具體來說調節至約7.4。
本發明也涉及自包含血清型19A的肺炎鏈球菌細胞溶解產物產生基本上純化的莢膜多糖的方法，其包含以下步驟 (a)提供包含可產生肺炎鏈球菌血清型19A的細菌細胞的發酵培養液； (b)用洗滌劑溶解步驟(a)中的細菌細胞，由此產生包含細胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細胞溶解產物； (c)使用離心或過濾來去除細胞碎片以澄清步驟(b)中的細胞溶解產物，由此產生澄清細胞溶解產物； (d)在約4℃和約6的pH下於磷酸鈉緩衝液(25mM磷酸鈉)中超濾並透析過濾步驟(c)中的澄清細胞溶解產物以去除低分子量雜質並提高多糖濃度，由此產生滲餘物； (e)使步驟(d)中滲餘物的pH降低至4.5以下、尤其約3.5以使蛋白質與核酸沉澱，由此形成酸化滲餘物溶液； (f)將步驟(e)中形成的酸化滲餘物溶液在約4℃和攪拌或不攪拌的情況下保持至少2小時以使沉澱物沉降，之後過濾或離心酸化滲餘物溶液，由此產生澄清多糖溶液； (g)將步驟(f)中的澄清多糖溶液的pH調節至約6，由此產生pH經調節的澄清多糖溶液； (h)通過活性炭過濾器、具體來說包含木質磷酸-活性炭的活性炭過濾器來過濾步驟(g)中的pH經調節的澄清多糖溶液； (i)超濾並透析過濾步驟(h)中產生的經過濾溶液，由此產生經濃縮純化多糖溶液；和 (j)使用無菌過濾器過濾步驟(i)中產生的經濃縮純化多糖溶液； 由此產生包含血清型19A的呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。在一特定實施例中，步驟(e)自步驟(d)中的滲餘物去除至少98％的蛋白質。在另一實施例中，步驟(h)自步驟(g)的pH經調節的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質。在另一實施例中，步驟(i)的透析過濾包含將pH調節至約5.5至約7.5之間。然而，為改良在長期儲存期間基本上純化的19A多糖的穩定性，步驟(i)的透析過濾包含將pH調節至約7.0至約7.5，並且更具體來說調節至約7.4。
提供以下實例以舉例說明而非限制本發明。
實驗 以下實例闡述使用本發明經改良方法以10L的規模純化肺炎鏈球菌多糖血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F的結果，並將所述結果與現有純化方法的結果進行比較。
實例1.用於肺炎鏈球菌多糖血清型1、4、5、6A、6B、7F、14和19A的縮短的純化方法 用脫氧膽酸鈉(DOC)溶解的肺炎鏈球菌發酵培養液是在其收穫或儲存於4℃下之後兩天內獲得，並在隨後一周內加以處理。如下所述，本發明純化方法相對於現有純化方法包括以下變化 1)將酸化步驟自開始時移至第一超濾/透析過濾(UF/DF)步驟後，並且將pH調節至3.5而非5； 2)將透析過濾緩衝液自0.025M磷酸鹽變為去離子(DI)水；3)將炭吸附變為使用木質磷酸-活性炭的2CUNO R32SP碳盤(坤諾(CUNO)公司，韋恩(Wayne)，NJ)，並且將吸附時間自4次翻轉延長至12次反轉(每次反轉為22分鐘)；和4)在最後的30K透析過濾步驟期間當透析過濾約5次時將pH調節至7.4。相同純化程序適用於血清型1、4、5、6A、6B或7F。對於血清型19A，進一步修改所述步驟並且在冷凍室中實施純化，如下所述。
純化步驟 所有步驟都是在室溫下實施，但19A型例外，在此情況下所述方法是在4℃下於冷凍室中實施。
溶解產物的澄清此步驟的目的是去除細胞碎片並澄清培養液。此步驟是通過離心或過濾來完成的。在20℃下(19A型為4℃)將培養液以10,000g離心30min或直至培養液變澄清，或用添加有賽普爾(Celpure)

助濾劑(美理勤公司(AdvancedMinerals)，聖巴巴拉，CA)的微孔預濾器(Millipore Prefilter)(密理博(Millipore)公司，比爾裡卡，MA)將其過濾。收集澄清溶解產物以供進一步處理並棄去沉澱。
第一UF/DF(超濾/透析過濾)此步驟提供體積降低和緩衝液交換並且也去除低分子量雜質。將澄清溶解產物濃縮為初始體積的大約1/8。使用約10體積DI水(pH 6，19A為25mM磷酸鹽)來實施透析過濾。
酸化在此步驟中去除超過98％的蛋白質。將濃磷酸謹慎地攪拌添加至滲餘物中。將滲餘物的pH調節至pH 3.5的目標值。將酸化滲餘物攪拌半小時並在室溫下陳化過夜(將19A在4℃下陳化2小時)，導致蛋白質和核酸沉澱。
酸化滲餘物的澄清此步驟是在酸化後去除沉澱的澄清步驟。在20℃下於轉子中以10,000rpm(17,000相對離心力或RCF)將酸化溶液的漿液離心一小時(6B例外，在此情況下於37℃下離心6小時)。收集上清液並棄去沉澱。在此步驟中也可使用以添加有賽普爾

助濾劑(美理勤公司，聖巴巴拉，CA)的微孔預濾器(密理博公司，比爾裡卡，MA)實施的深度過濾。
炭吸附在大多數情況下，在對酸化100K滲餘物實施離心後其為淡黃色。使用木質磷酸-活性炭通過炭吸附來達成顏色去除。此步驟也去除在酸化後剩餘的殘留蛋白。使澄清多糖溶液經5-6小時或過夜再循環經過炭過濾器(對於19A，在炭吸附前將pH調節至6)。
最終30K UF/DF這是將溶液濃縮為＞2g/L的最終多糖(PS)濃度的另一次濃縮和緩衝液交換步驟，其中將所述溶液透析過濾至去離子(DI)水中。濃縮炭過濾PS溶液。然後用DI水將濃縮物透析過濾10X。在透析過濾期間將pH調節至7.4。
最終0.2μm無菌過濾用0.22μm過濾器或可棄式無菌過濾器單元對最終PS溶液實施無菌過濾並將其儲存於4℃冰箱中。
分析方法 蛋白質、PS、和核酸濃度的量化是使用業內熟知的方法來實施，包括SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)分析、HPLC(高效液相色譜)和SEC(尺寸排阻色譜)、修改的勞裡分析、分光光度法、SEC-MALLS(分子排阻色譜/多角度雷射散射)、和NMR(核磁共振)。
結果與討論 5型經縮短純化批次表1中展示使用經縮短方法純化5型的三個批次與使用現有方法的最終PS產率、PS分子量和主要雜質水平的對比。所有起始培養液皆為DOC溶解的高細胞密度發酵批次，其多糖濃度(約0.5g/L)高於標準SOP發酵培養液(約0.3g/L)。使用30K或50K膜來進行第一UF/DF步驟。使用雜質/PS比率來計算雜質水平。使用相同方法來量化本文所述所有其它血清型。

如表1中的數據所示，所有使用經縮短純化方法的三個批次的蛋白質比率都滿足≤7.5％的技術要求，並且也與現有方法相當。核酸(NA)以及C-多糖(C-PS)比率也分別遠低於≤2.0％和≤35％的技術要求，並且與現有方法相當。表1中所示三個批次的最終PS產率和雜質水平的結果表明經縮短方法具有可再現性和穩定性。
令人關心的是多糖在3.5的較低pH下是否會水解。因此在純化方法期間監測PS保留時間的變化，並測量最終經純化PS的分子量。在HPLC色譜中未觀察到血清型5的PS保留時間有顯著變化。根據MALLS測量，通過經縮短方法與現有方法(284kg/mol)純化的PS的分子量也沒有顯著差異。因此可斷定經縮短純化方法對經純化PS的分子量無不良影響。
三個經縮短方法批次中每個處理步驟的工序間多糖產率、蛋白質/多糖比率和核酸/多糖比率概述於表2中。



在任一純化方法中的每個步驟期間產物總會有所損失。對於這三個經縮短方法的批次來說，PS損失主要發生在第一UF/DF步驟和酸化步驟中。在第一UF/DF步驟中，PS因膜表面對PS或PS-蛋白質複合物的吸附而損失。可通過在透析過濾後用DI水衝洗膜的滲餘物側並將衝洗物與初始滲餘物合併來將這種損失降至最低。在酸化步驟中PS可能因以下兩種原因而損失沉澱固體對PS的物理吸附，以及在酸化期間多糖與蛋白質結合而共沉澱。進一步研究此第二種可能性並且結果證實了PS/蛋白質的結合。
圖1展示在每個純化步驟中蛋白質/PS比率的降低。儘管離心步驟去除小部分蛋白質，但大部分蛋白質是在酸化步驟中去除。甚至蛋白質含量最高的批次在pH 3.5下處理後也僅檢測到痕量的蛋白質。
與蛋白質/PS比率類似，核酸/PS比率表明各批次的雜質水平之間具有差異性。與相同步驟中的蛋白質去除相比，30/50K UF/DF步驟可去除大量核酸。不希望受限於理論，這種情況可能是因核酸的分子大小小於蛋白質所致，從而使其相對更容易通過30/50K UF/DF步驟來去除。第一離心和酸化步驟也去除大量核酸。
表2顯示，活性炭吸附步驟也可降低蛋白質/PS和NA/PS水平。所述百分比降低不如最初兩個步驟顯著，但此步驟對去除溶液顏色具有重要作用並確保雜質水平符合技術要求。
4型經縮短純化批次4型的三個經縮短純化批次概述於表3中。所有三個批次的進料培養液都經DOC溶解。

4型的PS產率也在50-60％之間。蛋白質/PS比率和核酸/PS比率完全符合其技術要求。C-PS比率也完全符合技術要求。所有三個批次的分子量都接近約300kg/mol。通過現有方法使用類似發酵培養液純化的血清型4PS也具有285kg/mol的較低分子量。來自發酵培養液與最終純化溶液的PS的HPLC色譜對比顯示，PS保留時間沒有差異。這表明，分子量差異的差異不是由於方法改變所致，而是由發酵方法的內在性質所致。
4型PS在經純化分子中含有丙酮酸鹽基團，並且此丙酮酸鹽對用於肺炎球菌偶聯疫苗中的偶聯具有重要作用。為確保酸處理對丙酮酸鹽數量無有害影響，實施NMR分析。圖2展示標準4型PS與批次L29276-47的NMR波譜。兩個波譜之間未觀察到顯著差異。兩個波譜中從右邊數第二個峰都為丙酮酸鹽，並且在兩個波譜中丙酮酸鹽基團的峰高相當。所有三個經縮短方法批次的丙酮酸鹽比率都為0.8mol/mol，並且符合＞0.7mol/mol的技術要求。
三個4型批次的工序間PS產率、蛋白質/PS和NA/PS比率概述於表4中。PS損失主要發生在第一離心、酸化和活性炭吸附步驟中，平均分別損失10％、8％和20％。總PS產率與5型接近，約為55％。


圖3展示表4所示三個批次中每個純化步驟的平均PS產率、蛋白質/PS和NA/PS比率變化。正如人們所預期，蛋白質去除主要發生在酸化步驟中。第一離心和UF/DF步驟也共同去除了一定量的蛋白質，但蛋白質減少量小於酸化步驟。
與5型類似，核酸/PS比率降低主要發生在50/100K UF/DF、第一離心和酸化步驟中，並且第一UF/DF步驟中的NA降低遠大於蛋白質降低。同樣，如圖3所示，活性炭步驟去除一定量的蛋白質和NA並且使雜質水平低於技術要求。其同樣去除溶液顏色。
19A型經縮短純化批次在純化期間19A型多糖不穩定並且分子量有所變化。稍微修改經縮短純化方法以穩定19A多糖。這些修改概述如下1)主要在4℃下於冷凍室中實施純化步驟；2)使用25mM磷酸鹽緩衝液(4℃，pH 6)而非使用具有室溫的水來冷凍第一100K透析過濾物；3)將酸化保持時間自過夜縮短至2小時；和4)在澄清經酸化100K滲餘物後，將pH調節至6並在pH 6而非pH 3.5下實施活性炭吸附。
通過經縮短純化方法純化的兩個19A批次的結果展示於表5中。

兩個經縮短純化批次的PS產率分別為62％和76％。最終蛋白質/PS比率、核酸比率和C-PS比率都符合其各自的技術要求。兩個批次多糖的最終分子量分別為525kg/mol和488kg/mol，並且接近於用於III期臨床試驗中的19A PS的分子量(486kg/mol)。
兩個批次的蛋白質/PS比率都符合＜2％的技術要求。兩個批次的NA和C-PS比率二者都完全符合其技術要求。
每個純化步驟中的PS產率、蛋白質和NA的降低展示於表6和圖4中。結果顯示，除第一離心步驟外每個純化步驟中都發生PS損失。與血清型5和4類似，蛋白質和NA去除主要發生在最初三個步驟中，並且在酸化後幾乎檢測不到任何蛋白質和NA殘留。儘管活性炭吸附步驟不能大量去除蛋白質和NA(可能是因為在酸化後蛋白質和NA濃度極低)，但顏色去除仍需要這個步驟。

7F型經縮短純化批次7F型是非離子型多糖，與上述血清型相比，其在使用現有方法純化期間通常需要改變步驟。然而，本發明經縮短純化方法可成功適用於血清型7F而不需修改方法。使用經縮短方法來純化兩個批次的7F型培養液。一個批次是標準發酵培養液(L29276-107)並且另一個批次是高細胞密度培養液(L29276-157)。兩個批次的結果概述於表7中。

7F型的PS產率實際上高於其它血清型，這可能是因為非離子型聚合物與帶電荷蛋白質分子結合較少。最終蛋白質、NA和C-PS比率都完全符合其技術要求。7F型的分子量與標準批次相當，並且即使7F分子量相當高，PS溶液也不會非常粘稠，因為非離子型聚合物的排除體積較小。
各純化步驟中的7F型PS產率、蛋白質和NA比率展示於表8中並且兩個批次的平均值繪示於圖5中。

在每個純化步驟中都發生一些7F型PS損失。總之，PS損失少於血清型5和4。主要通過第一離心、100K UF/DF和酸化步驟來降低蛋白質和NA比率。與其它血清型類似，100K UF/DF去除NA比率去除蛋白質更有效。儘管活性炭吸附步驟因酸化後雜質水平極低而不能大量去除蛋白質和NA，但顏色去除仍需要此步驟。
6B型經縮短純化批次使用經縮短純化方法來純化兩個批次的6B。人們發現澄清經酸化100K滲餘物需要消耗比其它血清型更長的時間(6小時而非1小時)。除此差異外，所述純化方法與血清型的純化方法類似。兩個批次的結果展示於表9中。


所有雜質水平(蛋白質、NA和C-PS)都完全符合其技術要求。與其它血清型相比，PS產率相對較高，並且蛋白質和NA比率也相對較高。
各純化步驟中的工序間PS產率、蛋白質和NA比率展示於表10和圖6中。

與19A類似，在每個純化步驟中都發生PS損失，但第一離心步驟除外，其中PS稍微增加。主要通過第一離心、第一100K UF/DF和酸化步驟來達成蛋白質和NA的去除。然而，在活性炭吸附步驟中蛋白質和NA比率也有所降低。
6A型經縮短純化批次使用經縮短純化方法來純化兩個批次的6A型。最終溶液的PS產率、雜質水平和分子量概述於表11中。

兩個6A批次的最終PS產率都＞70％，這是使用經縮短方法處理的血清型中最高的產率。蛋白質、NA和C-PS比率都完全符合技術要求。
表12和圖7展示各純化步驟中的工序間PS產率、蛋白質和NA比率變化。在第一離心和100K UF/DF步驟中幾乎沒有任何PS損失。在酸化和活性炭吸附步驟中發生約10-15％的PS損失，這與其它血清型接近。主要通過第一離心、100K UF/DF和酸化來降低蛋白質和NA比率。在酸化後，蛋白質和NA比率二者都已低於其技術要求。對於蛋白質，酸化是最有效的步驟，而對於NA，100K UF/DF降低NA/PS比率的程度最大。儘管活性炭吸附步驟因酸化後雜質水平極低而不能大量去除蛋白質和NA，但顏色去除仍需要此步驟。

1型經縮短純化批次通過經縮短方法純化的兩個批次的1型概述於表13中。自高細胞密度發酵培養液來純化批次L29276-170並且自標準發酵培養液來純化L29276-173。

兩個批次的PS產率為約50％，並且蛋白質、NA和C-PS的雜質水平完全符合其技術要求。
每個純化步驟後的工序間PS產率、蛋白質和NA比率展示於表14和圖8中。其趨勢與所純化的其它血清型類似。PS損失主要發生在酸化和活性炭吸附步驟中，並且蛋白質和NA去除主要發生在最初三個步驟中。在100K UF/DF步驟中去除的NA多於蛋白質。儘管活性炭吸附步驟因酸化後雜質水平極低而不能大量去除蛋白質和NA，但顏色去除仍需要此步驟。


14型經縮短純化批次使用方法未修改的經縮短純化方法來純化兩個批次的血清型14。最終PS產率和雜質水平概述於表15中。

與血清型7F類似，血清型14是非離子型多糖，並且其現有純化方法與其它血清型略有不同。然而，本發明經縮短純化方法可成功適用於血清型14而不需要所述額外步驟。兩個經縮短純化方法批次的PS產率為50-60％，並且蛋白質和NA比率完全符合其技術要求。經純化PS的分子量也符合技術要求。
工序間PS產率、蛋白質和NA比率概述於表16和圖9中。觀察到與上述所測試其它血清型類似的PS損失、蛋白質和NA去除趨勢。



實例2不同血清型(血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F)的比較 為比較使用本發明經縮短純化方法對不同血清型進行的純化，在圖10的一個圖中繪示實例1中所述所有血清型以及血清型9V、18C和19F的PS去除。大多數血清型在每個純化步驟中遵循類似的PS損失趨勢。6B型在第一離心步驟中的PS產率和14型在酸化步驟中的PS產率有所提高。不同血清型的PS損失百分比各不相同。5型似乎在酸化步驟中損失最多PS，4型則在活性炭吸附步驟中損失最多。
每種血清型在每個純化步驟中的蛋白質/PS比率展示於圖11中。所述圖顯示，不同血清型的初始蛋白質/PS比率各不相同，其中1、4、5、9V、19F、和18C型具有最高初始蛋白質/PS比率。即使在第一UF/DF步驟後1、4、5、9V、19F和18C型的蛋白質/PS比率遠高於其它血清型，酸化步驟也可顯著降低蛋白質/PS比率，並且在此步驟後蛋白質殘留很少。
如圖12中所示，不同血清型的NA/PS比率也各不相同。1和5型具有最高NA/PS比率，18C和4型次之。第一離心和UF/DF步驟去除這些血清型中的大量NA，並且對於1型似乎最有效。在酸化步驟後僅殘留極少量NA。
實例3酸化和活性炭吸附步驟效率分析(血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F)。
對於PnC多糖的純化，最多最難去除的雜質是蛋白質。為更好地理解經縮短方法的雜質去除效率，分析兩個主要純化步驟酸化和活性炭吸附的蛋白質去除。對於酸化步驟，相對於使用本發明經縮短純化方法酸化血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A和19F之前的初始蛋白質濃度來繪示酸化前後的蛋白質濃度(SDS-PAGE)差異(圖13)。
由於在酸化步驟前後溶液體積變化相對較小，因此用蛋白質濃度差異除以初始蛋白質濃度可反映酸化步驟的蛋白質去除率。圖13展示相對於初始蛋白質濃度(通過SDS-PAGE分析來測量)線性擬合蛋白質濃度差異的斜率。觀察到在蛋白質濃度變化與初始濃度之間存在極明確的線性關係，其中R2接近於1。斜率為0.9876，其對應於98.76％的蛋白質去除(假定可忽略溶液體積變化)。因此，對於所研究的所有血清型來說，酸化步驟極為有效並且其平均去除超過98％的蛋白質。
與酸化步驟類似，同樣通過相對於初始蛋白質載量繪示所去除的蛋白質數量(吸附在炭上)來評估活性炭吸附步驟的效率(圖14)。觀察到在所去除蛋白質與初始蛋白質載量之間存在明確的線性關係，但R2(0.9723)不如酸化步驟高。因為此線性擬合的斜率對應於蛋白質去除率，所以活性炭吸附步驟導致93.87％的蛋白質去除。
根據對酸化和活性炭吸附步驟的分析，在實施所述兩個步驟後溶液中僅殘留約0.1％的蛋白質。
實例1-3的結論 人們研發出經縮短純化方法來代替用於肺炎鏈球菌莢膜多糖的現有純化方法。經縮短純化方法可直接應用於血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C和19F，並且稍加修改即可應用於血清型19A。所述方法是以10L的規模使用經DOC溶解的發酵培養液來實施。包括蛋白質/PS、NA/PS和C-PS/PS比率在內的雜質水平都符合其各自的技術要求。PS產率超過50％並且與現有純化方法相當。繪示工序間PS產率、蛋白質/PS和NA/PS比率以比較不同血清型的性質。根據實施100K UF/DF步驟前後的蛋白質/PS比率，人們發現血清型1、5、9V、19F和18C最難純化。
步驟分析顯示，酸化和活性炭吸附步驟分別去除超過98％和90％的蛋白質(通過SDS-PAGE來測量)。
實例4.在多糖產生中用非動物源性溶解劑取代脫氧膽酸鈉 此實例研究是否可在上述產生基本上純化的肺炎鏈球菌莢膜多糖的方法中使用非動物源性溶解劑作為脫氧膽酸鈉(DOC)的取代物。如上所述，DOC活化LytA蛋白，其為肺炎鏈球菌細胞壁生長和分裂中所涉及的自溶素。LytA蛋白在其C-末端部分具有膽鹼結合結構域，並且已知lytA基因的突變可產生對DOC溶解具有抗性的LytA突變體。
實施快速微量滴定板分析來確定通過與DOC類似的機制導致細胞溶解的化合物。已確定若干種DOC的非動物源性替代物，其在殺滅肺炎鏈球菌細胞並釋放多糖方面與DOC同等有效。在使用標準條件處理後，用非動物源性化合物產生的多糖的大小和純度與用DOC產生的多糖相同。
方法 細胞溶解以0.1-0.01％(v/v)的終濃度將欲測試化合物添加至發酵培養液中，並將溶液在37℃下培育一小時。然後將溶液在2-8℃下儲存過夜。第二天早上將溶液離心以去除所有細胞碎片。通過SEC-HPLC來分析無細胞培養液以測定所釋放多糖的濃度。可在2-37℃之間的任一溫度下、優選地在6.0-7.5的pH範圍下實施溶解。根據具體洗滌劑，洗滌劑的濃度通常介於0.05-0.2％之間。
微量滴定分析實施快速微量滴定板分析以檢驗不同洗滌劑或表面活性劑對肺炎球菌的lytA依賴性溶解。在分析中使用兩對肺炎鏈球菌的等基因菌株；每對中的一個成員具有野生型lytA基因，而另一種菌株的lytA基因中有缺失。因此，如果溶解依賴於活性lytA功能，那麼所述洗滌劑不能溶解突變體菌株。在Hy-大豆(HySoy)培養基中將四種菌株R6X、R6X ΔlytA、D39和D39 ΔlytA大致培養至對數中期(OD600為約0.2-0.8；OD600＝600nm下的光密度)。然後離心細胞並使細胞沉澱再懸浮於Hy-大豆培養基中。向微量滴定板的各孔中添加100μL細胞懸浮液以及10μL洗滌劑原液或對照用水。在36℃下保持約15分鐘後，用斯白麥克斯(Spectramax)

分光光度計(分子裝置公司(Molecular Devices)，森尼韋爾，CA)來測量樣品的OD600。對於新製備的細胞或冷凍並解凍的細胞觀察到以下結果暴露於DOC、十二烷基硫酸鈉、曲拉通

X-100和N-月桂醯肌氨酸中的野生型細胞的OD值都與培養基空白相當，這表明發生溶解。另一方面，在這些洗滌劑存在下ΔlytA細胞未溶解，這表明這些洗滌劑溶解細胞需要LytA的功能。
用於對比分析研究的PS的分離使培養物在10L生物反應器中於Hy-大豆培養基內生長。使用NaOH或Na2CO3將pH控制在7.0左右。在生長結束時(表現為光密度不再進一步增加)，用0.12％DOC或0.1％NLS處理培養物。將培養物培育12-16小時。通過將經處理培養液的樣品平鋪於TSA-血液瓊脂板上來證實殺滅細胞的效力。自澄清溶解產物使用標準程序(如上所述)來純化多糖。使用各種適合測定物質純度和性質的標準分析技術來檢驗經純化多糖。
使用與折射率(RI)檢測器偶聯的SEC-HPLC來測定溶解產物的PS含量。
使用血清型1和6B來篩選非動物源性溶解劑 使肺炎鏈球菌血清型1和6B在基於Hy-大豆的培養基中分開生長。分開收穫各培養物並將其分別分配於試管中。為了篩選與DOC具有相當的溶解活性的非動物源性化合物，將其製備為原液(存於適宜溶劑中)並添加至培養物中。在培育過夜後，對各試管實施離心並通過SEC-HPLC來測定每種血清型溶解產物中的PS含量，並將其與DOC對比。
使用lytA突變體來篩選非動物源性溶解劑 使含有lytA突變的成對等基因菌株在基於Hy-大豆的培養基中生長。收穫細胞並將其分配於微量滴定板的各孔中。添加測試化合物並培育培養物。在36℃下保持15min後，使用斯白麥克斯

板讀數器(分子裝置公司，森尼韋爾，CA)來測定各孔的光密度(OD600)(參見表17和18，其概述實例性化合物的兩個單獨測試的結果)。



根據上述篩選研究，確定DOC的以下非動物源性溶解劑替代物癸烷磺酸、伊格保

CA-630(叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇；CAS編號9002-93-1；可購自西格瑪-奧德裡奇，密蘇裡州聖路易斯)、N-月桂醯肌氨酸鈉(NLS)、亞氨基二丙酸月桂酯、十二烷基硫酸鈉、曲拉通

X-100、鵝脫氧膽酸鹽、豬脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、牛磺脫氧膽酸鹽、牛磺鵝脫氧膽酸鹽、和膽酸鹽。
DOC溶解的PS與NLS溶解的PS的對比 以10L的規模根據實例1和2中所述使用本發明經改良方法來純化肺炎鏈球菌多糖血清型1、4、5、6A、6B和7F。然而，在一組中使用NLS(0.1％)作為溶解劑，而在另一組中使用DOC(0.12％)作為溶解劑。
如上所述來測量PS產率、蛋白質/PS比率、NA/PS比率和PS分子量，並且結果概述於表19中。這些結果顯示，在本發明純化方法中使用NLS作為溶解劑可獲得相對較高的PS產率和相對較低的蛋白質和核酸水平。事實上，對於大多數所測試血清型來說，使用NLS作為溶解劑獲得的PS產率高於使用DOC。

說明書中所提及的所有出版物和專利申請案均表現出本發明所屬領域技術人員的水平。所有出版物和專利申請案均以引用方式併入本文中，其程度如同表明將每一個別出版物或專利申請案明確地分別以引用方式併入本文中一般。
儘管為了清晰理解起見上文已通過闡釋和實例的方式對本發明進行較詳細的描述，但是顯然可在隨附權利要求的範圍內實施某些改變或修改。
權利要求
1、一種自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)細胞溶解產物產生基本上純化的莢膜多糖的方法，所述方法包含以下步驟
(a)提供包含可產生選定肺炎鏈球菌血清型的細菌細胞的發酵培養液；
(b)用溶解劑溶解所述步驟(a)中的細菌細胞，由此產生包含細胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細胞溶解產物；
(c)使用離心或過濾去除細胞碎片來澄清所述步驟(b)中的細胞溶解產物，由此產生澄清細胞溶解產物；
(d)超濾並透析過濾所述步驟(c)中的澄清細胞溶解產物以去除低分子量雜質並提高多糖濃度，由此產生滲餘物；
(e)使所述步驟(d)中的滲餘物的pH降低至4.5以下以使蛋白質與核酸沉澱，由此形成酸化滲餘物溶液；
(f)將所述步驟(e)中形成的酸化滲餘物溶液保持足夠長時間以使所述沉澱物沉降，之後過濾或離心所述酸化滲餘物溶液，由此產生澄清多糖溶液；
(g)通過活性炭過濾器過濾所述步驟(f)中的澄清多糖溶液；
(h)超濾並透析過濾所述步驟(g)產生的經過濾溶液，由此產生經濃縮純化多糖溶液；和
(i)使用無菌過濾器過濾所述步驟(h)產生的經濃縮純化多糖溶液；
由此產生呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。
2、如權利要求1所述的方法，其中所述選定肺炎鏈球菌血清型選自由以下組成的群組1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。
3、如權利要求1或2所述的方法，其中使所述步驟(e)的pH降低至約3.5。
4、如權利要求1、2或3所述的方法，其中所述步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約5.5至約7.5之間。
5、如權利要求1、2或3所述的方法，其中所述步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約7.0至約7.5之間。
6、如權利要求1、2或3所述的方法，其中所述步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約7.4。
7、如權利要求1至6中任一權利要求所述的方法，其中步驟(e)自所述步驟(d)中的滲餘物去除至少98％的蛋白質。
8、如權利要求1至7中任一權利要求所述的方法，其中步驟(g)自所述步驟(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質。
9、如權利要求1至8中任一權利要求所述的方法，其中所述步驟(g)中的活性炭過濾器包含木質磷酸-活性炭。
10、如權利要求1至9中任一權利要求所述的方法，其中步驟(f)包含將所述步驟(e)中形成的酸化滲餘物溶液保持至少2小時。
11、如權利要求1至10中任一權利要求所述的方法，其中所述步驟(b)中的溶解劑是脫氧膽酸鈉。
12、如權利要求1至10中任一權利要求所述的方法，其中所述步驟(b)中的溶解劑為非動物源性溶解劑。
13、如權利要求12所述的方法，其中所述非動物源性溶解劑選自由以下組成的群組癸烷磺酸、叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇、辛基苯酚氧化乙烯縮合物、N-月桂醯肌氨酸鈉(NLS)、亞氨基二丙酸月桂酯、十二烷基硫酸鈉、鵝脫氧膽酸鹽、豬脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、牛磺脫氧膽酸鹽、牛磺鵝脫氧膽酸鹽、和膽酸鹽。
14、如權利要求12所述的方法，其中所述非動物源性溶解劑是N-月桂醯肌氨酸鈉。
15、一種自包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的肺炎鏈球菌細胞溶解產物產生基本上純化的莢膜多糖的方法，所述方法包含以下步驟
(a)提供包含可產生肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的細菌細胞的發酵培養液；
(b)用溶解劑溶解所述步驟(a)中的細菌細胞，由此產生包含細胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細胞溶解產物；
(c)使用離心或過濾去除細胞碎片來澄清所述步驟(b)中的細胞溶解產物，由此產生澄清細胞溶解產物；
(d)在室溫和中性pH下於無鹽介質中超濾並透析過濾所述步驟(c)中的澄清細胞溶解產物以去除低分子量雜質並提高多糖濃度，由此產生無鹽滲餘物；
(e)使所述步驟(d)中的無鹽滲餘物的pH降低至4.5以下以使蛋白質與核酸沉澱，由此形成酸化滲餘物溶液；
(f)將所述步驟(e)中形成的酸化滲餘物溶液在室溫下保持至少2小時以使所述沉澱物沉降，之後過濾或離心所述酸化滲餘物溶液，由此產生澄清多糖溶液；
(g)通過活性炭過濾器過濾所述步驟(f)中的澄清多糖溶液；
(h)超濾並透析過濾所述步驟(g)產生的經過濾溶液，由此產生經濃縮純化多糖溶液；和
(i)使用無菌過濾器過濾所述步驟(h)產生的經濃縮純化多糖溶液；
由此產生包含血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F或23F的呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。
16、如權利要求15所述的方法，其中使所述步驟(e)中的pH降低至約3.5。
17、如權利要求15或16所述的方法，其中所述步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約5.5至約7.5之間。
18、如權利要求15或16所述的方法，其中所述步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約7.0至約7.5之間。
19、如權利要求15或16所述的方法，其中所述步驟(h)的透析過濾包含將pH調節至約7.4。
20、如權利要求15至19中任一權利要求所述的方法，其中步驟(e)自所述步驟(d)中的無鹽滲餘物去除至少98％的蛋白質。
21、如權利要求15至20中任一權利要求所述的方法，其中步驟(g)自所述步驟(f)的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質。
22、如權利要求15至21中任一權利要求所述的方法，其中所述步驟(g)中的活性炭過濾器包含木質磷酸-活性炭。
23、如權利要求15至22中任一權利要求所述的方法，其中所述步驟(b)中的溶解劑是脫氧膽酸鈉。
24、如權利要求15至22中任一權利要求所述的方法，其中所述步驟(b)中的溶解劑為非動物源性溶解劑。
25、如權利要求24所述的方法，其中所述非動物源性溶解劑選自由以下組成的群組癸烷磺酸、叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇、辛基苯酚氧化乙烯縮合物、N-月桂醯肌氨酸鈉(NLS)、亞氨基二丙酸月桂酯、十二烷基硫酸鈉、鵝脫氧膽酸鹽、豬脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、牛磺脫氧膽酸鹽、牛磺鵝脫氧膽酸鹽、和膽酸鹽。
26、如權利要求24所述的方法，其中所述非動物源性溶解劑是N-月桂醯肌氨酸鈉。
27、一種自包含血清型19A的肺炎鏈球菌細胞溶解產物產生基本上純化的莢膜多糖的方法，所述方法包含以下步驟
(a)提供包含可產生肺炎鏈球菌血清型19A的細菌細胞的發酵培養液；
(b)用溶解劑溶解所述步驟(a)中的細菌細胞，由此產生包含細胞碎片、可溶蛋白、核酸和多糖的細胞溶解產物；
(c)使用離心或過濾去除細胞碎片來澄清所述步驟(b)中的細胞溶解產物，由此產生澄清細胞溶解產物；
(d)在約4℃和約6的pH下於磷酸鈉緩衝液中超濾並透析過濾所述步驟(c)中的澄清細胞溶解產物以去除低分子量雜質並提高多糖濃度，由此產生滲餘物；
(e)使所述步驟(d)中的滲餘物的pH降低至4.5以下以使蛋白質與核酸沉澱，由此形成酸化滲餘物溶液；
(f)將所述步驟(e)中形成的酸化滲餘物溶液在約4℃下保持至少2小時以使所述沉澱物沉降，之後過濾或離心所述酸化滲餘物溶液，由此產生澄清多糖溶液；
(g)將所述步驟(f)中的澄清多糖溶液的pH調節至約6，由此產生pH經調節的澄清多糖溶液；
(h)通過活性炭過濾器過濾所述步驟(g)中的pH經調節的澄清多糖溶液；
(i)超濾並透析過濾所述步驟(h)中產生的經過濾溶液，由此產生經濃縮純化多糖溶液；和
(j)使用無菌過濾器過濾所述步驟(i)中產生的經濃縮純化多糖溶液；
由此產生包含血清型19A的呈溶液形式的基本上純化的莢膜多糖。
28、如權利要求27所述的方法，其中使所述步驟(e)中的pH降低至約3.5。
29、如權利要求27或28所述的方法，其中所述步驟(i)的透析過濾包含將pH調節至約5.5至約7.5之間。
30、如權利要求27或28所述的方法，其中所述步驟(i)的透析過濾包含將pH調節至約7.0至約7.5之間。
31、如權利要求27或28所述的方法，其中所述步驟(i)的透析過濾包含將pH調節至約7.4。
32、如權利要求27至31中任一權利要求所述的方法，其中步驟(e)自所述步驟(d)中的滲餘物去除至少98％的蛋白質。
33、如權利要求27至32中任一權利要求所述的方法，其中步驟(h)自所述步驟(g)的pH經調節的澄清多糖溶液去除至少90％的蛋白質。
34、如權利要求27至33中任一權利要求所述的方法，其中所述步驟(h)中的活性炭過濾器包含木質磷酸-活性炭。
35、如權利要求27至34中任一權利要求所述的方法，其中所述步驟(d)中的磷酸鈉緩衝液為25mM磷酸鈉。
36、如權利要求27至35中任一權利要求所述的方法，其中所述步驟(b)中的溶解劑是脫氧膽酸鈉。
37、如權利要求27至35中任一權利要求所述的方法，其中所述步驟(b)中的溶解劑為非動物源性溶解劑。
38、如權利要求37所述的方法，其中所述非動物源性溶解劑選自由以下組成的群組癸烷磺酸、叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇、辛基苯酚氧化乙烯縮合物、N-月桂醯肌氨酸鈉(NLS)、亞氨基二丙酸月桂酯、十二烷基硫酸鈉、鵝脫氧膽酸鹽、豬脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、牛磺脫氧膽酸鹽、牛磺鵝脫氧膽酸鹽、和膽酸鹽。
39、如權利要求37所述的方法，其中所述非動物源性溶解劑是N-月桂醯肌氨酸鈉。
40、一種製造肺炎球菌疫苗的方法，其包含通過如權利要求1至39中任一權利要求所述的方法自肺炎鏈球菌細胞溶解產物產生基本上純化的莢膜多糖，以及將所述基本上純化的莢膜多糖用於肺炎球菌疫苗的製造中。
41、如權利要求40所述的方法，其中所述肺炎球菌疫苗含有與蛋白質載體偶聯的多糖。
全文摘要
本文闡述自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)細胞溶解產物培養液產生含有基本上純化的莢膜多糖的溶液的經縮短方法。超濾並透析過濾澄清肺炎鏈球菌溶解產物，之後將pH調節至4.5以下、優選地約3.5，從而使溶液中至少98％的蛋白質沉澱而不嚴重影響多糖產率。此外，在超濾和透析過濾並酸化至低於4.5的pH後，使用活性炭進行過濾，使至少90％的剩餘蛋白質沉澱而不嚴重影響多糖產率。可使用本發明經縮短方法來純化的實例性非限制性肺炎鏈球菌血清型為1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一個實施例中，使用脫氧膽酸鈉(DOC)溶解肺炎鏈球菌細胞；而在另一實施例中溶解劑為非動物源性溶解劑，例如N-月桂醯肌氨酸鈉(NLS)。
文檔編號C08B37/00GK101663327SQ200880012946
公開日2010年3月3日 申請日期2008年3月20日 優先權日2007年3月23日
發明者袁詠惠, 馬克·魯彭, 孫偉強, 玲 楚, 約翰·辛普森, 詹姆斯·帕奇, 帕梅拉·芬克沙博諾, 賈斯廷·K·莫蘭 申請人:惠氏公司