採用小分子捕獲技術的同型半胱氨酸檢測方法

2023-06-07 20:50:41

專利名稱：：採用小分子捕獲技術的同型半胱氨酸檢測方法
技術領域：
：本發明涉及到成分和檢測方法，主要是針對於小分子的待檢測物。基於小分子捕獲技術研製生產同型半胱氨酸的檢測方法，該方法使用基因突變酶與待測小分子物質結合，這種基因突變酶稱為小分子捕獲酶，這些經過突變、修飾的小分子捕獲酶保留甚至增強其對底物或待測小分子物質的親和力，但是削弱其對底物或待測小分子物質的親和力的催化、分解能力。基於小分子捕獲技術研製生產同型半胱氨酸(HCY)診斷試劑盒的方法提供這種，也提供突變的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，特異性S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)捕獲酶可以充分地保留甚至增強其對或S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的親和力，但是削弱了其對HCY或S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的催化能力。
背景技術：
：檢測物質的方法有廣闊的應用範圍。許多被檢測物質包括一些小分子量的被檢測物是生物體和生物運行過程的基本成分或是參與者。檢測這些物質可用於監測生物體系及其反應過程或者用於診斷由於這些物質的不均衡或缺乏引起的肌體失調或疾病以及預後。例如，同型半胱氨酸Hcy，一個帶硫基的胺基酸；葉酸，一種有機酸；膽固醇，一種對於診斷和預示廣泛的心血管疾病有重要作用的脂類。維生素對於診斷和預示維生素缺乏或紊亂症是重要的。血糖，一種單糖，用於診斷和預示糖尿病的血糖水平。乙醇，監測濫用酒精和潛在的肝臟損傷。膽汁酸或膽鹽是一種診斷和預示一些腫瘤如結腸癌的重要指標。監測尿酸是很重要的，因為異常高濃度的尿酸是診斷高尿酸血症導致痛風的指標，對腎臟有害。另外這種預示和診斷的應用，這種檢測方法也適用於農業，工業或環境保護方面，監測目前的，特定區域的和被檢測物的濃度。同型半胱氨酸的檢測同型半胱氨酸是一種含硫基的胺基酸，來源於蛋氨酸通過S-腺苷蛋氨酸依賴的轉甲基作用。細胞內的同型半胱氨酸再甲基化形成蛋氨酸或者進行一系列的分解代謝生成半胱氨酸。細胞內的同型半胱氨酸可以從細胞內溢出細胞外的液體中如血液和尿液中，大多數以氧化形勢參加循環，多數與血漿中的蛋白結合(Refsumetal.，Annu.Rev.Medicine，4931-62(1998)).。血漿和尿中的同型半胱氨酸含量反應同型半胱氨酸的生成和利用平衡狀態。這種平衡被破壞可能由於相關酶的遺傳缺陷包括同型半胱氨酸轉硫基和再甲基化的缺陷(例如胱硫醚β合成酶和N5，N10亞甲基四氫葉酸脫氫酶)或者同型半胱氨酸代謝需要的維生素飲食中缺乏(例如，維生素B6，B12和葉酸)(Baual，etal.，ClevelandClinicJournalofMedicine，64543-549(1997))。另外，血漿中的同型半胱氨酸水平同時受到一些治療癌症或關節炎藥物的影響例如抗葉酸藥物甲基蝶呤(Foody，etal.，ClinicianReviews，8203-210(1998))。嚴重的高同型半胱氨酸血症由於同型半胱氨酸新陳代謝方面的基因編碼出現了缺陷。這種情況中，這種酶的缺陷既包括HCY再甲基化中也包括轉硫基的酶類，從而導致血中和尿中的Hcy升高至50倍。最嚴重的HCY代謝紊亂，先天性的高同型半胱氨酸血症由於缺乏遺傳編碼胱硫醚β合成酶的同合子。這些個體在早年時即出現血管栓塞，從而發生動脈硬化，心肌梗死，腎血管高壓，間歇性跛行，腸繫膜缺血和肺部栓塞。一些病人還存在智力缺陷和其它異常象器官異位和骨骼畸形(PerryT.，HomocysteineSelectedaspectsinNyhamW.L.ed.Hertabledisordersofaminoacidmetabolism.NewYork，JohnWileySons，pp.419-451(1974))。眾所周知，孕婦體內含有高濃度的Hcy會導致嬰兒出現神經管關閉不全(Scottetal.，″Theetiologyofneuraltubedefects″inGraham，I.，Refsum，H.，Rosenberg，I.H.，andUrelandP.M.ed.″Homocysteinemetabolismfrombasicsciencetoclinicalmedicine″KluwerAcademicPublishers，Boston，pp.133-136(1995))。因此，Hcy的診斷應用價值在臨床上有很多好的文獻。研究證明即使輕微或中度Hcy的水平升高也會導致冠心病的危險，腦及外周動脈和心血管疾病危險的增加。(Boushey，etal.，JAMA，2741049-1057(1995)).。高同型半胱氨酸血症的流行調查表明高Hcy病人中分別有42％，28％，30％的腦血管疾病，外周血管疾病和心血管疾病。(Moghadasian，etal.，Arch.Intern.Med.，1572299-2307(1997))。其中27個臨床研究中表明每增高5mu.M的Hcy水平，男性的冠心病發病率升高60％，女性升高80％，相對於血漿膽固醇升高20mg.multidot.dl.sup.-1(0.5mmol.multidot.dl.sup.-1)。因此Hcy做為一個危險因子，與普通人中的膽固醇水平同樣危險。從這項研究中發現高同型半胱氨酸血症是心血管疾病的新的獨立的危險因子，可能是那些無任何血管疾病危險因素的心血管病人的原因。(e.g.，hypertension，hypercholesterolemia，cigarettesmoking，diabetesmellitus，markedobesityandphysicalactivity)。輕微的高同型半胱氨酸血症主要由於酶基因是雜合子治病。四氫葉酸還原酶的基因上的多態性導致葉酸的缺乏從而影響同型半胱氨酸水平的靈敏(Boers，etal.，J.Inher.Metab.Dis.，20301-306(1997))。而且，血漿中的Hcy水平在心臟和腎臟移植的病人(Ueland，etal.，J.Lab.Clin.Med.，114473-501(1989))，帕金森氏綜合症病人中(Jacobsen，etal.，Clin.Chem.，442238-2239(1998))，和非胰島素依賴的病人中急劇升高(Ducloux，etal.，Nephrol.Dial.Transplantl，132890-2893(1998))。越來越多的關於高同型半胱氨酸水平與心血管疾病關係的研究證據促進了通過降低血漿中的Hcy水平來防止心血管疾病的雙盲隨機性有控制的多中心實驗的開始(Diaz-Arrastia，etal.，Arch.Neurol，551407-1408(1998))。在不久的將來血漿中Hcy的檢測會成為一種常規的臨床檢驗項目。現在，心臟病專家已經開始建議他們的病人檢測Hcy水平，尤其對於那些有心血管家族史的病人或患有心血管疾病但是其膽固醇水平正常並且沒有其它危險因子存在的病人，還有那些超過60歲的病人。血清或血漿中的總Hcy以複雜的形式存在，70％的血漿中的Hcy以蛋白結合形式，20-30％以均衡的或不均衡的混合二硫化合物形式存在，游離形式的Hcy只有很少量的存在(Stehouwer，etal.，KidneyInternational，55308-314(1999))。做為心血管疾病的危險因子，建議臨床檢測血漿中總Hcy(包括游離的，氧化型的，蛋白結合型的)(Hornberger，etal.，AmericanJ.ofPublicHealth，8861-67(1998))。自從1982年以來，出現了幾種檢測血漿中總Hcy的方法。(Mansoor，etal.，Anal.BioChem.，200218-229(1992)；Steir，etal.，Arch.Intern.Med.，1581301-1306(1998)；Ueland，etal.，Clin.Chem.，391764-177901993)；andUeland，etal.，″Plasmahomocysteineandcardiovasculardisease″inFrancis，R.B.Jr.eds.AtheroscleroticCardiovascularDisease，Hemostasis，andEndothelialFunction.NewYork，MarcelDokker，pp.183-236(1992)；see，also，Ueland，etal.，″Plasmahomocysteineandcardiovasculardisease″inFrancis，R.B.Jr.eds.AtheroscleroticCardiovascularDisease，Hemostasis，andEndothelialFunction.NewYork，MarcelDokker，pp.183-236(1992))。大多數方法需要精密的層析技術例如高壓液相技術，毛細管氣體層析技術，或者集合光譜測定技術(GC/MS)直接或間接(例如通過HPLC或TLC使SAH水解酶水解Hcy為SAH)檢測Hcy。另外還使用在薄層層析分離法TLC分離之前SAH水解酶水解放射性的Hcy轉化為放射性標記的SAH。所有這些檢測方法的普遍特點包括以下4個步驟(1)氧化型Hcy轉化為還原性的Hcy；(2)進層析分離柱之前Hcy誘導或酶反應為SAH；(3)層析分離；(4)檢測Hcy衍生物或SAH。在這些檢測中層析分離是分析方法中最關鍵的步驟，這種方法通常浪費時間，操作煩瑣。更特殊地是，這些方法需要高度專業化和精密的儀器以及受過良好訓練的專業技術人員。普通的臨床科室一般沒有這種專門的儀器。眾所周知，免疫方法檢測Hcy使用單克隆抗SAH(Araki，etal.，J.Chromatog.，42243-52(1987)。這種方法基於Hcy轉化為SAH，然後使用單克隆抗體檢測SAH。研究單克隆抗白蛋白結合型Hcy從而能夠檢測血漿以主要形式存在的白蛋白結合型Hcy(Stabler，etal.，J.Clin.Invest.，81466-474(1988))。其它的免疫反應方式也同樣其它的免疫物質也同樣適用(see，e.g.，U.S.Pat.No.5,885,767andU.S.Pat.No.5,631,127)。雖然免疫檢測方法避免了浪費時間的層析分離步驟和實現了自動化，但是單克隆抗體很昂貴，並且不容易得到經常需要二抗或三抗參與檢測。不論免疫檢測方法是多麼重要多麼廣泛圍的應用，目前這種方法面臨著下面幾種問題。第一，對於許多方法來說，特異性地結合物不好製備，並且缺乏特異性從而影響檢測的特異性。雖然這個缺陷可以通過製備高分子物抗體，製備抗體尤其純化均一的單克隆抗體來彌補，但是這個過程需要大量的時間並且花費很大。另外，對於一些小分子量的被檢測物，製備抗體的選擇變得不可行，因為小分子物質具有微弱的抗原性。小分子物質抗體的製備通常需要大分子物質與小分子物質結合，這樣導致抗體的表達更無效，更。第二，許多檢測方法尤其對於小分子物質的檢測中，包括化學誘導轉化和層析分離步驟都需要大量的時間。第三，許多諸如此類的檢測方法需要使用精密、昂貴的專業分析儀器例如高壓液相色譜儀(HPLC)和氣相色譜儀(GC/MS)。因此，需要一種快速、簡單的檢測方法來彌補這種缺陷。同樣需要一種快速、簡單的定量檢測體液、組織中Hcy的好方法。
發明內容本檢測方法基於免疫的反應格式，但是使用變異的檢測物結合酶代替抗體，這種酶充分保留甚至加強其對檢測物或即時酶反應轉化的產物的親和力，但是削弱其催化能力。這種方法稱為小分子捕獲技術，這種酶稱為小分子捕獲酶。我們可以提供小分子捕獲酶和製備小分子捕獲酶的方法。小分子捕獲酶用於代替單克隆、多克隆、以及任何混合性的抗體，抗體在反應中可以是反應物。底物捕獲酶還可以扮演被檢測物的競爭性抑制劑，去結合實體例如受體、其它的抗配基和其它的被檢測物。因此，底物捕獲酶可以代替例如競爭性受體或受體活性調節器用於競爭性抑制反應中。在檢測過程或方法中尤其免疫分析方法中，抗體用於檢測目標分析物，象上面所述被底物捕獲酶代替抗體。底物捕獲酶可以通過充分的削弱或清除其催化反應而不影響或不會很影響修飾酶的對於被檢測物的親和力的技術製備。這種方法尤其適用於檢測一些用於指示新陳代謝疾病，先天性代謝缺陷疾病的物質如甲狀腺機能減退，半乳糖血症，苯丙酮尿症，茶色尿疾病；以及檢測一些疾病的標記物例如血糖水平，膽固醇水平，Hcy水平和其它哺乳動物包括人類的體液和組織中的物質。這種方法也可用於檢測食物中的汙染，檢測食物的營養價值，檢測血液。這種方法已經可以實現自動化。因此，在此方法中，抗體參與反應，其中使用底物捕獲酶來代替抗體。這種方法依賴於修飾酶與目標檢測物的競爭性抑制反應。更具體地說，這種方法檢測檢測樣本中的分析物尤其檢測小分子物質的步驟a)變異的被檢測結合酶與樣本結合，此酶充分保留甚至加強其對檢測物或酶反應轉化的直接產物的親和力，但是削弱其催化能力；b)檢測分析物或酶反應轉化的直接產物結與變異的被檢測物結合酶結合物。小分子物質的檢測方法可以檢測任何物質包括無機物和有機物分子。做為特殊地是，檢測小分子物質分子量大約或小於10,000道爾頓，尤其是分子量大約或小於5,000道爾頓。無機小分子包括但不局限於無機離子例如；鈉、鉀、鎂、鈣、氯、鐵、銅、鋅、錳、鈷、碘、鉬、釩、鎳、鉻、氟、矽、錫、硼、砷離子。有機分子物包括但是不局限於下列項目胺基酸、多肽、代表性地包含低於10個胺基酸的多肽，核苷，包括低於10個核苷的低聚核苷，維生素，單糖，包括低於10個單糖的低聚糖或脂類。胺基酸包括但是不限於下列項目D-型或L-型胺基酸，包括組成自然多肽和蛋白質的胺基酸Ala(A)，Arg(R)，Asn(N)，Asp(D)，Cys(C)，Gln(Q)，Glu(E)，Gly(G)，His(H)，Ile(I)，Leu(L)，Lys(K)，Met(M)，Phe(F)，Pro(P)Ser(S)，Thr(T)，Trp(W)，Tyr(Y)andVal(V)。核苷酸包括但是不限於下列項目腺苷，鳥嘌呤核苷，胞啶核苷，胸腺嘧啶核苷，尿嘧啶核苷。核苷包括但是不限於下列項目AMP，GMP，CMP，UMP，ADP，GDP，CDP，UDP，ATP，GTP，CTP，UTP，dAMP，dGMP，dCMP，dTMP，dADP，dGDP，dCDP，dTDP，dATP，dGTP，dCTPanddTTP。維生素包括但是不局限於下列項目，水溶性維生素例如，維生素B1，核黃素，菸鹼酸，泛酸，維生素B6，維生素H，葉酸，維生素B12和維生素C；脂溶性維生素例如維生素A，維生素D，維生素E，維生素K。單糖包括但是不局限於下列項目，D-型或L-型單糖，三碳糖例如甘油醛，四碳糖例如赤蘚糖和蘇糖，五碳糖例如核糖，乳膠醛糖，木糖，來蘇糖，核酮糖，六碳糖例如阿洛糖，阿桌糖，葡萄糖，艾杜糖，半乳糖，塔羅糖，果糖，七碳糖例如景天庚酮糖。脂類包括但是不局限於下列項目，三醯甘油例如三硬脂酸甘油酯，棕櫚酸甘油酯，三油精，蠟；磷酸甘油酯例如磷脂醯乙醇胺，卵磷脂，磷脂醯絲氨酸，磷脂醯肌醇，心磷脂；鞘脂類例如神經鞘磷脂，腦苷脂，神經節苷脂；固醇例如膽固醇和豆甾醇，固醇酸脂；脂肪酸可以是飽和性的脂肪酸例如月桂酸，肉豆蔻酸，棕櫚酸，硬脂酸，花生酸，二十四酸；或者可以是不飽和性的脂肪酸例如棕櫚炔酸，油酸，亞油酸，亞麻酸，花生四烯酸。更具體的表述來說，變異的SAH水解酶，此酶充分保留甚至加強其對Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化能力。另外也可以提供方法，結合物，試劑盒和分析物檢測的商品化產品，尤其是小分子物質的檢測例如無機離子，胺基酸(Hcy)，多肽，核苷酸，核苷，低聚核苷酸，維生素，單糖(如葡萄糖)，低聚糖，脂類(如膽固醇)，有機酸(如葉酸，膽汁酸，尿酸)。另外一個表述，如果變異性的SAH水解酶被純化，變異的SAH水解酶此酶充分保留甚至加強其對Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化能力。例如，變異的SAH水解酶削弱其催化作用是由於在SAH水解酶的NAD結合位點或SAH的催化位點變異或者在兩處同時變異；變異的SAH水解酶削弱5』-端SAH的水解作用但是充分保留3』-端的氧化作用；固定的結合SAH，對SAH的酶切速率大約或低於10.0.mu.M，對SAH的催化活性大約或低於0.1S-1；變異的SAH水解酶有一個或多個可插入，缺失或點突變的位點。更具體地說，變異的SAH水解酶來源於SEQIDNo.1表述的胺基酸序列或者由SEQIDNo.2表述的核酸序列編碼的胺基酸但是包括下列一處或多處變異Phe302ofPhe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F82R，T157K，N181A，R431H和K426A的兩次變異，或者在低度，中度或高度的雜交，其酶切速率是野生型的10％最多的可達50％，但是削弱了其催化活性。單獨的核苷酸片段編碼上面所述的變異的SAH水解酶，更適宜質粒和向量的表達。可以提供重組幹細胞，尤其重組細菌細胞，酵母細胞，真菌細胞，植物細胞，昆蟲細胞，動物細胞包括質粒和向量。可以提供利用重組幹細胞植被變異性SAH水解酶的方法。檢測Hcy及其相關代謝物的方法。Hcy，如上所述，是心血管疾病和其他疾病的危險因子，我們可以提供檢測方法。同型半胱氨酸具體為，被檢測的小分子為Hcy，變異的檢測物結合酶是變異的Hcy結合酶，此酶充分甚至增強了對Hcy或Hcy的直接轉化物的親和力但是削弱了其催化能力。檢測中的變異的Hcy結合酶的變異包括削弱其催化活性由於在酶與輔酶的結合位點或與非Hcy底物結合位點發生了變異或者在酶的催化活性位點發生了變異。具體表述，變異的酶為變異的胱硫醚β合成酶，削弱的催化活性由於誘變了胱硫醚β合成酶與吡哆醛5』-磷酸或L-絲氨酸結合的催化位點發生了變異或兩個位點均發生了變異。具體表述，變異的酶為蛋氨酸合成酶，削弱的催化活性是由於誘變的蛋氨酸合成酶催化位點與維生素B12或5-甲基四氫葉酸結合的催化位點發生了變異，或兩個位點均發生了變異。更值得一提的是，變異的蛋氨酸合成酶是一種大腸桿菌蛋氨酸合成酶，此酶有下列一個或多個變異His759Gly，Asp757Glu，Asp757Asn，andSer801。具體表述，變異的酶為蛋氨酶，削弱的催化活性是由於誘變的蛋氨酸合成酶的催化位點，此催化位點與R』SH混合物的結合位點，R』SH是指硫醇，R是烷基或炔基尤其指低鏈烷基或炔基(1-6個碳原子，尤其指1-3個碳原子，直鏈或支鏈)，雜芳環，這裡雜原子是指氧原子O，硫原子S，氮原子N或者芳基等上述基團被下列基團取代烷基或炔基，尤其指低鏈烷基或炔基，或者hal，或者未被取代尤其指芳基或含有一環或兩環、三環的雜環基尤指環中每個環中含有4-7個原子的基團，或者變異發生在以上基團組合中。更明白地表述，變異的酶為SAH水解酶，變異的SAH水解酶充分保留甚至加強其對Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化能力。變異的SAH水解酶在檢測體系中的應用包括削弱其催化活性由於誘變的SAH水解酶的與NAD+或SAH水解酶的催化位點或者兩個位點均發生了變異；削弱了5』端的水解活性但是充分地保留了3』端的氧化活性；固定的結合SAH，對SAH的酶切速率大約或低於10.0.mu.M，對SAH的催化活性大約或低於0.1S-1；變異的SAH水解酶有一個或多個可插入，缺失或點突變的位點。更具體地說，變異的SAH水解酶來源於SEQIDNo.1表述的胺基酸序列或者由SEQIDNo.2表述的核酸序列編碼的胺基酸但是包括下列一處或多處變異Phe302ofPhe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F82R，T157K，N181A，R431H和K426A的兩次變異，或者在低度，中度或高度的雜交，其酶切速率是野生型的10％最多的可達50％，但是削弱了其催化活性。應用SAH水解酶的表述，在樣本與變異的SAH水解酶結合之前，氧化型的Hcy要轉化為還原型的Hcy，氧化型Hcy轉化為還原型的Hcy使用的還原劑可以使用下面列出的還原劑但是不局限於僅僅使用下列還原劑磷酸三丁醇(TBP)，巰基乙醇(β-ME)，二硫赤蘚醇(DTT)，二硫赤蘚糖醇，巰基乙酸，穀胱甘肽，腈硼氫鈉，NaBH，KBH，金屬離子。具體表述使用SAH水解酶，在樣本與變異的SAH水解酶結合之前，樣本中的Hcy需要轉化為SAH。樣本中的Hcy轉化為SAH需要未變異的SAH水解酶水解。樣本中的SAH與變異的SAH水解酶結合過程中存在著SAH水解酶催化抑制劑例如，neplanocinA或thimersol，但不局限於上述兩種物質。具體表述變異的SAH水解酶的應用，在SAH與變異的SAH水解酶結合之前，需要去除或降解游離的腺苷，這種降解作用可以通過腺苷脫氨酶，嘌呤核苷磷酸化酶，黃嘌呤氧化酶來完成。具體表述變異的SAH水解酶的應用，SAH與變異的SAH水解酶結合時，存在的標記的SAH或其衍生物、類似物競爭性地與SAH水解酶結合，競爭程度與標記的SAH的含量和樣本中的SAH的含量相關。必須指出，標記的SAH衍生物或類似物是螢光標記的腺苷半胱氨酸。具體表述變異的SAH水解酶的應用，變異的SAH水解酶是標記的SAH水解酶，標記的SAH水解酶是由螢光標記。具體表述，變異的酶為變異的甜菜鹼—同型半胱氨酸轉甲基酶，削弱其催化活性是由於甜菜鹼—同型半胱氨酸轉甲基酶與甜菜鹼的結合位點及它的催化位點或者兩個位點同時發生了變異。具體表述，Hcy的檢測應與其它心血管檢測項目結合檢測，和或Hcy相關水平例如膽固醇或葉酸聯合檢測。葉酸具體表述，變異的酶為變異的蛋氨酸合成酶。在這個例子中，葉酸是5-甲基四氫葉酸中的元素，變異的含葉酸的結合酶是變異的蛋氨酸合成酶，削弱蛋氨酸合成酶的催化活性是由於其催化位點的誘變，及其結合位點結合維生素B12，Hcy的變異或者這兩個位點均發生了變異。具體表述，其中的葉酸是四氫葉酸，變異的含葉酸的結合酶為變異的四氫葉酸轉甲基酶，削弱了四氫葉酸轉甲基酶催化活性是由於其催化位點的誘變，及其此結合位點結合絲氨酸的變異或兩個位點均發生了變異。具體表述，含葉酸的物質為5，10-亞甲基四氫葉酸，變異的含葉酸的結合酶為變異的亞甲基四氫葉酸還原酶，其催化活性的削弱由於其催化位點的變異。具體表述，含葉酸的物質是5，10-亞甲基四氫葉酸，變異的含葉酸的結合酶為變異的葉酸多聚穀胱甘肽合成酶，其催化活性的削弱由於其催化位點的變異，以及結合ATP，L-穀氨酸，Mg2+的結合位點的變異或者兩者同時發生了變異。更具體地說，含葉酸的物質是二氫葉酸，變異的含葉酸的結合酶為變異的二氫葉酸還原酶，其催化活性的削弱由於其催化位點的變異，以及結合NAHPH的結合位點的變異或者兩者同時發生了變異。再具體地說，變異的二氫葉酸還原酶是一種乳酸菌酪蛋白的二氫葉酸還原酶，發生了Arg43Ala到Trp21的變異(Basranetal.，ProteinEng.，10(7)815-2691997))。另外的例子，含葉酸的物質是5，10-亞甲基四氫葉酸(5，10-亞甲基FH4)，變異的含葉酸的結合酶為變異的胸苷酸合成酶，其催化活性的削弱由於催化位點的變異，以及結合dUMP的結合位點變異或兩者均發生了變異。更具體地說，變異的胸苷酸合成酶是人類胸苷酸合成酶，下列位點發生了變異Tyr6His，Glu214Ser，Ser216Ala，Ser216Leu，Asn229Ala和His199X，這裡的X是指除了組氨酸以外的任何胺基酸(Schifferetal.，Biochemistry，34(50)16279-87(1995)；Steadmanetal.，Biochemistry，377089-7095(1998)；Williamsetal.，Biochemistry，37(20)7096-102(1998)；Finer-Mooreetal.，J.Mol.Biol.，276(1)113-29(1998)。再具體地說，變異的胸苷酸合成酶是大腸桿菌胸苷酸合成酶，在Arg126Glu發生了變異(Stropetal.，ProteinSci.，6(12)2504-11(1997))oraLactobacilluscaseithymidylatesynthasehavingaV316Ammutation(Carrerasetal.，Biochemistry，31(26)6038-44(1992))。膽固醇具體表述，檢測中的膽固醇，變異的被檢測物結合酶是變異的膽固醇結合酶，此酶充分地保留甚至增強了對膽固醇的親和力，但是削弱了其催化能力。更具體地說，變異的膽固醇結合酶是變異的膽固醇酯酶，其催化活性的削弱由於其催化位點的變異，以及結合H2O的位點的變異，或者兩者同時變異。再具體地說，膽固醇酯酶是胰膽固醇酯酶，發生變異的位點是Ser194ThrorSer194Ala(DiPersioetal.，J.Biol.Chem.，265(28)16801-6(1990))。另外一個具體地說，變異的膽固醇結合酶是膽固醇氧化酶，其催化活性的削弱由於其催化位點的變異，以及結合O2的結合位點的變異，或者兩者同時變異，更具體地說，膽固醇氧化酶是sterolicum短桿菌膽固醇氧化酶，發生變異的位點是膽汁酸(鹽)具體地表述，小分子檢測物為膽汁酸(鹽)，變異的被檢測物結合酶是變異的膽汁酸結合酶，此酶充分保留甚至增強了與膽汁酸(鹽)的結合能力，但是削弱了其催化活性。更具體地說，變異的膽汁酸(鹽)結合酶是變異的3-α-羥基類固醇脫氫酶，其催化活性的削弱由於其催化位點的變異，以及結合NAD+結合位點的變異或者兩者均發生變異。糖代謝紊亂的檢測AssaysforDisordersAssociatedwithGlucoseMetabolism具體地表述，小分子被檢測物是葡萄糖，變異的檢測物結合酶是變異的葡萄糖結合酶，變異的酶充分保留甚至增強了與血糖的結合，但是削弱了催化活性。更具體地說，葡萄糖結合酶是thermosulfurogenes梭菌葡萄糖異構酶，其變異位點從下列中產生His101Phe，His101Glu，His101Gln，His101AspandHis101Asn(Leeetal.，J.Biol.Chem.，265(31)19082-90(1990))。另一個具體的變異酶是變異的己糖激酶或葡萄糖激酶，其催化活性的削弱由於其催化位點的變異，以及結合ATP、Mg2+或者兩者均發生變異。另外一個具體的變異酶是葡萄糖氧化酶，其催化活性的削弱是由於其催化位點的變異，以及結合H2O或O2的結合位點發生了變異，或者兩者均發生變異。任何與葡萄糖代謝相關的代謝紊亂均可監測。乙醇具體地表述，小分子被檢測物是乙醇，變異的檢測物結合酶是變異的乙醇結合酶，此酶充分保留甚至增強與乙醇的結合力，但是削弱了其催化活性。更具體地說，變異的乙醇結合酶為變異的乙醇脫氫酶，其催化活性的削弱由於其催化位點的變異，以及結合NAD+或Zn2+的結合位點的變異，或者兩者均發生了變異。再具體地說，變異的乙醇脫氫酶是人肝臟乙醇脫氫酶，在下列位點發生變異His51Gln(Ehrigetal.，Biochemistry，30(4)1062-8(1991))。另外一個具體說明，變異的乙醇脫氫酶是馬的肝臟乙醇脫氫酶，在下列位點發生變異Phe93Trp或者Val203Ala(Bahnsonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，94(24)12797-802(1997)；Colbyetal.，Biochemistry，37(26)9295-304(1998))。一些代謝紊亂如痛風病，與尿酸代謝有關。具體地表述，小分子檢測物是尿酸，變異的檢測物結合酶是變異的尿酸結合酶，此酶充分保留甚至增強與尿酸的結合力，但是削弱了其催化活性。更具體地說，變異的尿酸結合酶是變異的尿酸氧化酶，其催化活性的削弱由於其催化位點的變異，以及結合O2，H2O，Cu的結合位點的變異或者兩者均發生變異。再具體地說，變異的尿酸氧化酶是兔尿酸氧化酶，其變異位點為下列位點H127Y，H129Y和F131S(Chuetal.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，804781-6(1996))。所有上面所述中，有代表性的檢測樣本是體液或組織包括但是不限於下列項目血液，尿液，腦脊液，滑膜液，羊水，組織細胞如活檢組織細胞。再具體地說，體液指血液或尿液。更具體地說，血液應該分離出血漿或血清。在這裡提到的結合物包括a)變異的檢測物結合酶，此變異酶充分保留甚至增強其親和力但是削弱其催化活性；b)試劑或變異的檢測結合酶與檢測物或者檢測物的酶轉化物結合的方法。更具體地說，檢測物或檢測物的酶轉化物與變異的檢測物結合酶使用標記檢測物，檢測標記的檢測物直接轉化物或其衍生物或類似物，檢測標記的變異的檢測物結合酶。再具體地說，檢測中的結合物是Hcy甚至包括檢測膽固醇和或葉酸的試劑。最後，可以提供試劑盒和檢測說明包括上面提到的結合物和及其說明書。生產的程序包括標記的變異的酶可以指示檢測系統中使用的酶，也可指示檢測系統中包含的酶類。特殊的合成物，結合物，試劑盒和檢測說明書，尤其對於小分子物質在下面分段介紹。A.說明除非另外說明，這裡所用的所有的技術、科學術語與普通
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的理解有相同的含義。所有專利，申請表，公布的表格以及其他出版物和序列、其他數據全部由GenBank公司提供。這裡所用的分析物指能特異結合到酶上的分子，它即可作為輔酶，也可作為輔助因子或者底物。這裡所用的酶指一種特殊的蛋白質，它可以催化和促進特定的代謝反應。一般地，酶是作為催化劑，但在這裡，還包括酶在反應中被修飾。酶被修飾後可使其催化活性清除或相當大的清除。有些酶並不被如此修飾。這裡所用的分析物結合酶是指用分析物作為其輔酶，輔助因子，唯一底物或者底物之一的酶。如同型半胱氨酸結合酶指用同型半胱氨酸作為它的輔酶，輔助因子，唯一底物或者底物之一的酶。同型半胱氨酸結合酶包括SAH水解酶，胱硫醚，beta-合成酶，蛋氨酸合成酶，甜菜鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶，蛋氨酶，用不改變酶活性的保守胺基酸替代作用圍繞同型半胱氨酸結合酶。適當的胺基酸的保守替代是眾所周知的技術，胺基酸的保守替代可以不改變變異後的物質的生物活性。這是科技界所認可的。(see，e.g.，Watsonetal.MolecularBiologyoftheGene，4thEdition，1987，TheBejacmin/CummingsPub.co.，p.224)。胺基酸替代如表1表1原始殘基保守替代Ala(A)Gly；SerArg(R)LysAsn(N)Gln；HisCys(C)SerGln(Q)AsnGlu(E)AspGly(G)Ala；ProHis(H)Asn；GlnIle(I)Leu；ValLeu(L)Ile；ValLys(K)Arg；Gln；GluMet(M)Leu；Tyr；IlePhe(F)Met；Leu；TyrSer(S)ThrThr(T)SerTrp(W)TyrTyr(Y)Trp；PheVal(V)Ile；Leu其它由經驗決定或已知的保守替代也是允許的。這裡所用的胺基酸是指各種胺基酸序列，可根據常規已知的3字母縮寫或1字母縮寫識別，不同DNA片段中的核苷可根據通用的標準單字母法指定。這裡所用的變異分析物結合酶指修飾酶和底物捕獲酶，其在反應過程中能充分保留甚至增強分析物或分析物酶直接產物的結合力，具有代表性的相對於野生型配體至少保留結合力的10％，適宜地，保留了少於50％的結合力，更適宜地保留了對分析物或分析物酶的直接轉化產物結合力的60％，70％，80％，90％，甚至100％，或者比其野生型配體具有更高的結合力。這裡的變異分析物結合酶如「底物誘導酶」，特定結合於所選擇的分析物或目標分子，但並不能促進它們的轉化。分析物酶的直接轉化產物通過特定分析物結合酶催化分析物而得到，例如SAH水解酶的直接轉化產物是SAH，胱硫醚β-合成酶的Hcy酶直接轉化產物是胱硫醚，蛋氨酸合成酶和甜菜鹼-高半胱氨酸轉甲基酶的直接轉化產物是蛋氨酸這裡所指的評價包括對分析物濃度和數量絕對值的定量的和定性的判斷，例如樣本中的同型半胱氨酸底物複合物，可通過其指標數，所佔比率，百分比，以及視覺或者其它數值指標表示樣本中分析物的水平，評定可以是直接或間接的。這裡所指的削弱催化活性是指變異分析物結合酶用做假抗體時僅保留非常低的催化活性，即在免疫實驗中以小分子代替抗體。每個測試中所需降低催化活性的準確度可由以往的經驗決定。有代表性的，酶類可保留其野生型所有催化活性或者催化活性之一的50％，或者不到50％；可取地，變異分析物結合酶僅保留不到其野生型總催化活性或催化活性之一的40％，30％，20％，10％，1％，0.1％，或0.01％，更適宜的，變異分析物結合酶喪失其所有催化活性或其催化活性之一。例如需要保留其催化活性或進一步降低的催化活性，催化抑制劑可以影響反應步驟，這些催化抑制劑包括重金屬，螯合劑或其它物質。這裡所指的大分子指不用結合其他分子就能產生與大分子結合的抗體。這裡所指的小分子指不經高度聚合或結合高分子或經輔佐作用就不能產生能與其結合的抗體。小分子的分子量約為10,000D或小於10,000D，甚至一些小分子的分子量為5,000D或少於5,000D。這裡所指的無機分子指不含碳氫化合物的分子族。這裡所指的有機分子指含碳氫化合物的分子族。這裡所指的維生素指生物體所需有機物，大部分的維生素可作為某些輔酶的組成成分。這裡所指的生物分子通常指構成生物體的有機化合物。這裡所指的脂質指非水溶性的，油狀的物質，它可溶於非極性有機溶劑中，如氯仿。這裡所指的同型半胱氨酸指由分子式為HSCH2CH2CH(NH2)COOH.的分子構成。Hcy由蛋氨酸脫甲基生成，是蛋氨酸生成半胱氨酸的中間產物，Hcy包括游離Hcy和結合Hcy，Hcy能結合蛋白質，肽，自身或二硫化物結合物的硫醇。這裡所指的SAH水解酶指普遍存在於真核生物中的一種酶，在一些原核生物中也可發現。它可催化SAH水解為Hcy和Ado，SAH水解酶同時也促進Hcy和Ado合成SAH。SAH水解酶有各種催化活性，它的輔酶是NAD+/NADH.，在水解作用方面，首先包括SAH的3-羥基族被NAD+(E-NAD+)氧化，接著將L-Hcy的β基傳給3′-酮-4′，5′-didehydro-5′-脫氧-Ado。5』-端的水基團的緊密結合的中間產物提供給3』-酮-腺嘌呤的氫離子，從而使得3』-酮-腺嘌呤被NADH結合的酶還原為腺嘌呤。這裡所指的SAH水解酶催化抑制劑是指抑制SAH水解酶一個或整個催化活性的作用物，例如，3′-氧化活性，5′-水解活性或3′-還原活性，但不影響SAH水解酶對Hcy和/或SAH的親和力。這裡所指的胱硫醚-β-合成酶指不可逆的催化Hcy和絲氨酸合成胱硫醚的酶，胱硫醚-beta.-合成酶的輔酶是磷酸吡哆醛，用不改變酶活性的保守胺基酸圍繞胱硫醚-beta.-合成酶。這裡所指的蛋氨酸合成酶是指不可逆催化Hcy和5-甲基四氫酸(5-CH3-THF)生成蛋氨酸的酶，胱硫醚-β-合成酶的輔酶是維生素B12，用不改變酶活性的保守胺基酸圍繞蛋氨酸合成酶。這裡所指的甜菜鹼-同型半胱氨酸-轉甲基酶指不可逆催化Hcy和甜菜鹼生成蛋氨酸和二甲基-氨基乙酸的酶。用不改變酶活性的保守胺基酸圍繞甜菜鹼-同型半胱氨酸-轉甲基酶。這裡所指的蛋氨酶是指可催化S-替代胺基酸生成α.，β-和α，.leftbrkt-top-清除，也可催化各種β-和左端brkt-top-置換反應的酶，根據下列平衡RSCH2CH(NH2)COOH+R′SH平衡R′SCH2CH(NH2)COOH+RSH(β-轉換)和RSCH2CH2CH(NH2)COOH+R′SH平衡R′SCH2CH2CH(NH2)COOH+RSH(.leftbrkt-top-exchange)，R′SH代表烷烴或取代硫基。獨立的R和R′從烷基，芳香基，炔基，環烷基，雜芳基，鏈烯基，胺基酸，蛋白質或其混合物中被選擇。典型的，被替代或不替代的R和R′包少於50個原子。碳鏈可以是直鏈，有支鏈或環狀的。雜環原子含S，N，O。芳香基和雜芳基或其它環族可含有一個環，兩個環或者更多環。這裡所指的腺苷脫氨酶指催化次黃苷脫氨基生成腺苷的酶，用不改變酶活性的保守胺基酸圍繞腺苷脫氨酶。這裡所指的嘌呤核苷磷酸化酶指可催化水和次黃苷生成次黃嘌呤和D-核糖的酶，用不改變酶活性的保守胺基酸替代作用圍繞嘌呤核苷磷酸化酶。這裡所指的黃嘌呤氧化酶指催化次黃嘌呤生成尿酸和黃嘌呤的酶，用不改變酶活性的保守胺基酸替代圍繞黃嘌呤氧化酶。這裡所指的葉酸族指葉酸或維他命B族，化學式為N-[4-[[2-氨基1，4-二氫-4-氧-6-蝶啶)甲基]氨基]-benzxoyl]-L-穀氨酸或它的衍生物。葉酸衍生物包括二氫葉酸脫氫酶，四氫葉酸脫氫酶，5-甲基-四氫葉酸和5，10-亞甲基-四氫葉酸。這裡所指的四氫葉酸轉甲基酶指一種可催化四氫葉酸和絲氨酸生成5，10-亞甲基-四氫葉酸和氨基乙酸的酶。用不改變酶活性的保守胺基酸通過替代圍繞四氫葉酸轉甲基酶。這裡所指的亞甲基四氫葉酸還原酶指可催化5，10-亞甲基-四氫葉酸生成5-甲基-四氫葉酸的酶，用的不改變酶活性的保守胺基酸通過替代作用包圍亞甲基四氫葉酸還原酶。這裡所指的葉酸多聚穀胱甘肽合成酶指可催化5，10-亞甲基四氫葉酸-雙穀氨酸衍生物的生成的酶，其催化5，10-亞甲基四氫葉酸，L-穀氨酸鹽和ATP反應生成ADP和磷酸。它的輔助因子是Mg.2+，用不改變酶活性的保守胺基酸通過替代圍繞葉酸多聚穀胱甘肽合成酶。這裡所指的二氫葉酸還原酶指催化二氫葉酸，NADPH和H..+生成四氫葉酸和NADP+的酶，用不改變酶活性的保守胺基酸通過置換反應包圍二氫葉酸還原酶。這裡所指的胸苷酸合成酶是指催化5，10-亞甲基-四氫葉酸和dUMP生成二氫葉酸和dTMP的酶，用不改變酶活性的保守胺基酸通過替代作用包圍胸苷酸合成酶。這裡所指的膽固醇酯酶是指催化膽固醇和水生成脂肪酸和膽固醇酯的酶，用不改變酶活性的保守胺基酸通過替代作用包圍膽固醇酯酶。這裡所指的膽固醇氧化酶是指催化氧和膽固醇生成膽固醇-4-en-3-one和水的酶，用不改變酶活性的保守胺基酸通過替代作用包圍膽固醇氧化酶。這裡所指的膽汁酸是指膽固醇在肝內生成的酸性甾酮，膽汁酸隨膽汁進入小腸，脂溶性維他命有利於脂質的吸收，人體中膽汁酸含量最大的是膽酸膽酸鹽指膽汁酸的鹽類，人體膽酸鹽大部分的是肝膽酸鹽和牛黃膽酸鈉。這裡所指的3-α-羥基-類固醇脫氫酶是指可催化3-alpha-羥基-類固醇和NAD+生成3-氧-膽汁酸和H.+和NADH的酶，用不改變酶活性的保守胺基酸通過替代作用包圍3-alpha-羥基-類固醇脫氫酶。這裡所指的葡萄糖異構酶指一種可催化D-葡萄糖和D-果糖之間的相互轉化的酶，用保守的不改變其活性的胺基酸替代作用包圍葡萄糖異構酶。這裡所指的己糖激酶或葡萄糖氧化酶是指可催化α.-D-葡萄糖和ATP生成D-葡萄糖-6-磷酸的酶，己糖激酶或葡萄糖氧化酶輔助因子是Mg.2+，用不改變酶活性的保守胺基酸替代包圍己糖激酶或葡萄糖氧化酶。這裡所指的葡萄糖氧化酶是一種可催化葡萄糖，水和氧生成葡糖酸的酶，用不改變酶活性的保守胺基酸替代包圍葡萄糖氧化酶。這裡所指的乙醇脫氫酶催化乙醇和NAD+生成乙醛，NADH和H+的酶，用不改變酶活性的保守胺基酸替代包圍乙醇脫氫酶。這裡所指的尿酸鹽氧化酶和尿酸酶催化尿酸，氧和水生成尿曩素的酶，輔助因子是銅，用不改變酶活性的保守胺基酸通過替代包圍尿酸鹽氧化酶和尿酸酶。這裡所指的血清指血液除去血球和纖維蛋白的液體部分。它區別於循環血中的血漿。這裡所指的血漿指一種液體組織，是血液中非細胞成分液體。它區別於離心做得的血清。這裡所指的高純度″substantiallypure″是指高度相似，高度均一通過一些檢測純度的標準方法，如薄層層吸法，凝膠電泳和高效液相層吸法不能檢測到雜質，或者指進一步純化時不能檢測到其物理和化學性能的改變，如它的酶活性和生物活性。。。。但是化學純度高的物質可以是立體異構體，同分異構體的混合，因此，進一步純化可以增強合成物的特異性。這裡所指的生物活性指化合物，合成物，混合物。生物活性也包括化合物，合成物，混合物的療效和藥物活性。生物活性在體外的試驗可觀察到，如利用螢光素酶的氧化活性氧化底物，可以產生螢光。這裡所指的受體指可結合特定配體的一種分子，受體可以是自然的或人工合成的。受體也可以作為抗-配體，受體和抗-配體可以相互轉變。受體可單獨使用或與其它種類結合為聚合體使用。受體可與其結合物進行直接/間接的共價或非共價結合，或者是物理性結合。受體包括抗體，胞膜受體或胞內受體，單克隆抗體，藥物，多核苷酸，核酸，肽，輔助因子，外源凝集素，糖，多糖，細胞，細胞膜，細胞器。受體的例子和應用如下a)酶特異運輸供微生物生存的蛋白質或基礎酶，也可作為抗體(配體)的結合目標。b)抗體通過辨認抗體上與抗原表位結合的位點，確定擬抗原表位序列，可以發展疫苗或其它診斷產品以及自身免疫疾病治療的藥物。c)核酸配體的鑑定，如蛋白質，RNA，結合點。d)具有催化作用的多肽聚合體，多肽，具有促進化學反應的能力。多肽通常對一個反應物或反應中間產物和活性功能基團至少有一個特異結合點。[see，e.q.，U.S.Pat.No.5,215,899]。e)激素受體與受體有高度親和力的配體可用於激素替代療法的開發，例如控制血壓藥物的開發。f)麻醉劑受體測定結合大腦鎮靜受體的配體可用於開發嗎啡和相關的低成癮藥物。抗體包括抗體片段，如組成輕鏈和重鏈可變區的Fab片段。類人化抗體修飾包含「人」胺基酸序列的抗體以便使其不能激發人體的免疫反應。例如單克隆抗體表達的雜交瘤通過基因重組技術所得而來，此技術表達的抗體的不變的胺基酸區域是人類抗體的區域。重組產品利用分子生物學的DNA基因重組技術生成的蛋白質非常相同″substantiallyidentical″指產品非常相似，特性幾乎不變，因而，可用非常相似的產品取代這種產品。相同的，等價的″equivalent，″用於兩個序列的核酸，是指這兩個序列的核酸可以編譯出相同序列的胺基酸或相同的蛋白質，也包括中度嚴格或高度嚴格條件下編碼所需蛋白質的雜交。相同的，等價的″equivalent″用於指兩種蛋白質或肽類，指兩種蛋白質或肽類這含有充分相同的胺基酸序列只有被保守的胺基酸所取代，不會完全改變蛋白質或肽類的活性或功能[see，e.g.，Table1，above]相同的，等價的″equivalent″指性能，特點時，特性不一定相同程度的出現(兩個肽分子的相同類型的酶活性可能表現出不同的速度)，但是活性非常相似。另外，可指兩列核苷酸的雜交能力。適宜的可以少於25％的錯配，較適宜的，少於15％的錯配，甚至可少於10％，最適宜的，在高度嚴格條件下雜交，兩個相對胺基酸之間沒有錯配。雜交的嚴格性由錯配百分率決定，如下1)高度嚴格0.1.times.SSPE，0.1％SDS，65℃。2)中度嚴格0.2.times.SSPE，0.1％SDS，50℃。3)低嚴格性1.0.times.SSPE，0.1％SDS，50℃。嚴格度equivalentstringencies可以通過選擇緩衝液，鹽類和溫度來獲得。充分地，非常的″substantially″文章中相同的，相應的或類似的改變是指至少70％，更進一步指至少80％，再進一步指至少90％，最多指95％。合成物指兩種或更多種產物或化合物組成的一種混合物，可以是一種溶液，懸乳液，粉劑，糊劑，水劑或是它們的任意組合。結合指兩種或更多物質之間的結合作用。流體指任何能流動的成分，包括，半固體，糊劑，溶液，水劑，凝膠體，洗劑，膏體和其他混合物的形態。載體(質粒)指在細胞內引入異種DNA進行基因的轉錄或表達。例如質粒，重組病毒或其他載體可以插入適合的宿主細胞中，引起DNA的克隆。載體基因的表達包括在原核細胞和/或真核細胞和其他殘餘游離基因或那些併入宿主細胞的基因。啟動區或啟動因素指可控制DNA或RNA轉錄的DNA或RNA片段，啟動區包含能被RNA聚合酶識別，結合併啟動轉錄的特定序列。啟動區的一部分作為啟動子。另外，啟動區還包括調節這些RNA聚合酶識別，結合併啟動轉錄活性的序列。受體受自然法則的調控，效仿啟動子被用於原核生物，包括抗菌素T7和T3啟動子等。有效連接和有效結合指核酸序列影響和調節的DNA的功能的關係，核酸序列如，啟動子，增強子，轉錄和翻譯的終止位點和其它信號序列。例如DNA與啟動子的有效連接是指DNA和啟動子的物理和功能關係，RNA聚合酶結合DNA啟動區，通過特異辨認並結合啟動子，啟動DNA的轉錄。在體外轉錄或表達中為了使其達到最優化，需要除去，增加，或改變克隆5′-端非翻譯部分從而去除額外的、潛在地、不恰當的具有選擇性的翻譯起始密碼子或其它序列，這些序列可能干擾或降低基因的表達，轉錄或翻譯。做為可選擇的，核糖體結合點(see，e.g.，Kozak，J.Biol.Chem.，26619867-19870(1991))直接插入起始密碼的5′-端可以增強表達。上述所希望的修飾也可根據經驗進行改變。樣本指實驗中的分析物，可以是生物樣本，如生物的體液樣本或組織樣本。體液樣本包括尿液，血液，血漿，唾液，精液，大便，痰，腦脊液，淚液，黏液，羊水等。生物組織是由細胞和細胞間質構成的集合體，可構成人類，動物，植物，細菌，真菌或病毒的結構，包括接締組織，上皮細胞，肌肉和神經組織，也包括瘤，器官，淋巴結，動脈等。對於保護基團，胺基酸和其他化合物的縮寫，如果不另行指出，均根據其通用公認的縮寫或IUPAC-IUB組織關於生物化學命名法。.B.檢測項目的方法這裡提供檢測樣本中項目的方法。任何把抗體作為一種試劑的檢測都可以用這裡給出的方法加以修改用一種已被修改的酶來代替該抗體，這樣，它結合檢測項的能力得以保持，而催化活力大大降低(如，底物捕獲酶)。這裡提供的檢測步驟包括a)樣品與結合於檢測項的變異或修改酶接觸；和b)用變異檢測項結合酶探測檢測項或直接檢測項酶轉化產物間的結合。變異或修改酶仍然保留了結合力，對檢測項或直接檢測項酶轉化產物的結合力較原始型或未修改酶更為提高，但催化活性被削弱。1.檢測項任何能夠作為輔酶、輔助因子或底物特異結合於酶的檢測項，都可以用這個剛宣布的方法檢測。檢測項可以是任何分子，包括生物大分子和小分子、配子、反配子和其他種類。最好是小分子。比如，該小分子檢測項是個無機分子，那麼最好是個無機離子，如鈉、鉀、鎂、鈣、氯、鐵、銅、鋅、錳、鈷、碘、鉬、釩、鎳、鉻、氟、矽、錫、硼或砷離子。另一個特別的例子是，小分子檢測項是個有機分子，那麼最好是胺基酸、少於10個胺基酸的多肽、維生素、單糖、少於10個單糖的低聚糖或脂類。本法可檢測所有胺基酸。例如，可檢測D-和L-胺基酸。例外，還可檢測所有的自然界多肽和蛋白質基團，包括Ala(A)，Arg(R)，Asn(N)，Asp(D)，Cys(C)，Gln(Q)，Glu(E)，Gly(G)，His(H)，Ile(I)，Leu(L)，Lys(K)，Met(M)，Phe(F)，Pro(P)Ser(S)，Thr(T)，Trp(W)，Tyr(Y)andVal(V)。以及自然界胺基酸的所有衍生物，如Cys的衍生物Hcy。本法可檢測所有的核苷。如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。本法可檢測所有的核苷酸。這樣的例子有，AMP，GMP，CMP，UMP，ADP，GDP，CDP，UDP，ATP，GTP，CTP，UTP，dAMP，dGMP，dCMP，dTMP，dADP，dGDP，dCDP，dTDP，dATP，dGTP，dCTP和dTTP。例外，還可檢測所有的少於10個這樣的或其他核苷酸的寡核苷酸。本法可檢測所有的維生素。如水溶性維生素有B1、核黃素(B2)、煙酸、泛酸(B3)、B6、生物素(H)、葉酸、維生素B12和抗壞血酸(C)，同樣檢測脂溶性維生素如，維生素A、D、E和K。本法可檢測所有單糖，無論D-還是L-單糖，醛糖還是酮糖。單糖的例子有丙糖如甘油醛、四糖如赤蘚糖和蘇糖，戊糖如核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖和核酮糖，己糖如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖和果糖，庚糖如景天庚酮糖。本法可檢測所有的脂類。包括三醯甘油如(三)硬脂酸甘油酯、三甘油棕櫚酸酯、甘油三油酸酯、臘，磷脂如磷脂醯乙醇胺、卵磷脂、磷脂醯肌醇和心磷脂，鞘脂類如鞘磷脂、腦苷脂、神經節苷脂，固醇類如膽固醇和豆甾醇以及脂肪酸酯甾酮。脂肪酸可以是飽和脂肪酸如十二(烷)酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸和二十四烷酸，或可以是不飽和脂肪酸如棕櫚油酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸。還有其他特別的實例中，被檢測小分子的分子量大約或小於10,000道爾頓。分子量等於或小於5,000道爾頓更佳。本法可以檢測的(但不限於此)項目還包括，Hcy、葉酸族、膽固醇、葡萄糖、乙醇和尿酸。2.變異檢測項結合酶(「底物捕獲酶」)任何能保留結合力或降低催化活力的變異檢測項結合酶都可以用在本法。例如，如果Hcy作為待檢測項，可使用變異Hcy結合酶如變異胱硫醚-β-合酶、變異蛋氨酸合酶、變異甜菜鹼-同型半胱氨酸轉甲基酶、變異蛋氨酸酶和變異SAH水解酶。用常規變異方法可準備有理想特性的變異酶。變異殘餘可被系統變異殘餘識別為不同殘餘，且把催化活性降低理想的並對特殊底物保留有親和力的識別出來。另外，變異也可能基於預知或已知的酶3D結構，包括預知各種變異的影響(見，如Turneretal.(1998)NatureStructuralBiol.5369-376；Ault-Richieetal.(1994)J.Biol.Chem.26931472-31478；Yuanetal.(1996)J.Biol.Chem.27128009-28016；Williamsetal.(1998)Biochemistry377096；Steadmanetal.(1998)Biochemistry377089-7095；Finer-Mooreetal.(1998)J.Mol.Biol.276113-129；Stropetal.(1997)ProteinSci.62504-2511；Finer-Mooreetal.(1996)Biochemistry355125-5136；Schifferetal.(1995)Biochemistry3416279-16287；Costietal.(1996)Biochemistry353944-3949；Gravesetal.(1992)Biochemistry3115-21；Carrerasetal.(1992)Biochemistry316038-6044)。這些預知也可以由化學計算技巧中取得。因此，對任何選定的酶，再試驗決定變異需要抑制催化活力而保留結合力。a.核酸編碼檢測項結合酶核酸編碼檢測項結合酶可由已知方法中取得。檢測項結合酶的已知核酸序列可被用於從自然界或其他來源分離核酸編碼檢測項結合酶。另外，完整或部分的核酸編碼檢測項結合酶可通過已知序列化學合成或商業及其他途徑獲得。真核細胞和原核細胞可作為核酸編碼檢測項結合酶的核酸來源。其DNA可由已知的克隆DNA(如DNA「庫」)的標準程序、化學合成、cDNA克隆或染色體DNA或片斷克隆、從目標細胞提純取得。(見，例如，Sambrooketal.，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2dEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.；Glover，D.M.(ed.)，1985，DNACloningAPracticalApproach，MRLPress，Ltd.，Oxford，U.K.Vol.I，II.)。從染色體DNA中克隆提取除了編碼區，還可含有特定的和內DNA區；從cDNA或RNA中克隆提取僅含有外部序列。不管來源哪裡，基因總按分子克隆為基因繁殖的適當載體。從cDNA中基因分子克隆，cDNA可由已知的總細胞RNA或mRNA產生。也可從染色體DNA中獲得基因，DNA片斷即由染色體產生(如，用限制酶或機械剪)，有些DNA可編碼成理想基因。然後，線性DNA片斷可通過標準技術被重排分離，包括但不限於，瓊脂糖和聚丙烯醯胺凝膠電泳和柱狀色譜分離。一旦生成DNA片斷，識別含所有或部分檢測項結合酶的基因的特異性DNA片斷，有很多方法來完成。分離一個檢測項結合酶基因的較好方法是用聚合酶鏈反應(PCR)，從染色體或cDNA庫，或未統一入庫的染色體DNA或cDNA擴增理想的檢測項結合酶序列，寡核苷酸引物與檢測項結合酶序列雜交後可作為PCR的引物。另外，一部分(任何物種的)檢測項結合酶基因或特異性RNA、或其片斷可被純化(或寡核苷酸合成)和標記，生成的DNA片斷可用核酸雜交到標記的探針來過篩。(Benton，W.andDavis，R.，1977，Science196180；Grunstein，M.AndHogness，D.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.723961)。那些與探針同族的DNA片斷則雜交。檢測項結合酶核酸也可被表達克隆識別和分離，比如利用選擇性抗檢測項結合酶抗體。除了以克隆或擴增來獲得檢測項結合酶DNA，包括但不僅限於，由已知檢測項結合酶核酸序列化學合成，或使cDNA變成具有檢測項結合酶編碼的mRNA。任何已知的適當的方法都可以使用。得到克隆之後，其特徵可由核酸序列(用已知方法)以及與已知檢測項結合酶序列比較來證實。DNA序列分析可用已知的方法，包括但不限於，Maxam和Gilbert的方法(1980，Meth.Enzymol.65499-560)，theSangerdideoxy方法(Sanger，F.，etal.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.745463)，使用T7DNA聚合酶(TaborandRichardson，U.S.Pat.No.4,795,699)，使用自動DNA序列器(e.g.，AppliedBiosystems，FosterCity，Calif.)。與檢測項結合酶核酸或核酸編碼檢測項結合酶衍生物雜交的核酸，可在低、高或中等嚴格條件下，用核酸雜交分離出來。(ShiloandWeinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA786789-6792).b.選擇和生產變異檢測項結合酶一旦獲得核酸編碼檢測項結合酶，這些核酸可根據檢測項結合酶被誘變、過篩和/或選擇，要求檢測項結合酶保留或增強對檢測項或檢測項酶直接轉化產物的結合力，而削弱了催化活力。插入、剪除或點突變都可以用來使核酸編碼出檢測項結合酶。可使用已知的突變技術，包括但不限於，體外定點誘變(Hutchinsonetal.，1978，J.Biol.Chem2536551)，使用TAB.RTM.接頭(Pharmacia)，含突變的PCR引物，等等。不同的基因產物表型檢測可在突變發生後進行。需要時，定點誘變程序可利用提供單鏈及雙鏈DNA的載體。一般來說，帶這樣載體的突變程序如下合成突變引物，如補充欲改變序列的引物，但包括一個或幾個改變的、添加的或去除的鹼基。引物在體外進行DNA聚合酶擴展，經過一些附加操作之後，雙鏈DNA被轉到細菌細胞中。接著，用各種方法識別理想的突變DNA，理想的蛋白從含突變序列的克隆中純化出來。對於長序列，經常需要額外的克隆步驟，因為在那些載體上插入長序列(長於2,000鹼基)不易穩定。很多生物技術公司提供已知的定點突變程序，例如美國的LifeScience，Inc.(ArlingtonHeights，III.)和StratageneCloningSystems(LaJolla，Calif.)。關於檢測項結合酶的結構-功能資料，可用於檢測項結合酶的突變和選擇，該酶應保留或增強對檢測項酶或檢測項酶直接轉化產物的結合力而削弱催化活性。例如，突變可對其輔酶、輔助因子、非檢測項底物的酶結合位點或突變酶催化點或其合成物上形成。一旦一個突變檢測項結合酶具有理想特性，如保留或增強了對檢測項酶或檢測項酶直接轉化產物的結合力而削弱催化活性，被識別出來，該突變檢測項結合酶可以由任何已知的方法獲得，包括重組表達、化學合成或兩者綜合。突變檢測項結合酶最好由重組表達取得。為了重組表達，突變檢測項結合酶基因或部分基因被插入到適當的克隆載體，在特殊的宿主細胞上表達。大量已知的載體宿主都可以使用。可能的載體包括但不限於，質體或被修改的病毒體，但載體系統必須和使用的宿主細胞相兼容。這樣的載體包括但不限於，噬菌體如λ衍生物，或質體如pBR322或pUC質體衍生物或Bluescript載體(Stratagene)。克隆載體的插入，例如，可通過把DNA片斷綁入具有相應粘著點的克隆載體。但是，克隆載體上如果不存在相應的DNA片斷粘著點，DNA分子末尾可被酶解改變。另外，綁入核苷(接頭)序列到DNA粘著點可產生理想位點；這些被綁入的接頭可包括特殊的編碼限制核酸內切酶識別序列的寡核苷酸。重組分子可通過轉化、轉染、傳染、電穿孔等方法導入宿主細胞，這樣就產生了很多的基因序列。另一種方法中，理想的基因用「鳥槍」法插入到適當的克隆載體後可被識別並分離。在插入到克隆載體之前，理想基因可先增殖，例如按大小分級。在一些特例中，帶重組DNA分子與被分離的突變檢測項結合酶基因、cDNA或合成DNA序列的宿主細胞的轉化使基因成倍複製。這樣，轉化株成長、重組DNA分子自轉化株分離出來，並在必要時，從分離的重組DNA上找回插入基因，可以獲得大量基因。編碼突變檢測項結合酶或功能活性類似物或片斷或其他延伸物的核苷序列，可被插入到一個適當的表達載體，如一個含有插入蛋白解碼序列的轉錄和翻譯必要因子。必要的轉錄和翻譯信號也可由本族突變檢測項結合酶基因和/或其旁側區提供。不少宿主-載體系統可利用於蛋白解碼序列表達。這些系統包括但不限於，感染了病毒的哺乳動物細胞系統(如牛痘病毒、腺病毒等)；感染了病毒的昆蟲細胞系統(如杆狀病毒)；微生物如帶酵母載體的酵母菌，或轉化了耐藥力和特性的細菌。根據利用的宿主-載體系統，可以使用適當的轉錄和翻譯因子。前面描述過把DNA片斷插入到載體的方法，可以用於建立含有未知的含適當轉錄/翻譯控制信號和蛋白解碼序列的基因表達的載體。這些方法可包括體外重組DNA和合成技術以及體內重組(基因重組)。編碼一個突變檢測項結合酶或多肽的核酸表達，可用第二個核酸序列來調整，這樣，突變檢測項結合酶或多肽就被表達到經重組DNA分子的宿主中。例如，一個突變檢測項結合酶的表達用被促進因子/增強因子來控制。可用來控制突變檢測項結合酶表達的促進因子包括但不限於，SV40早期促進區(BernoistandChambon，1981，Nature290304-310)，含於魯斯氏肉瘤病毒的重複3′長端促進因子(Yamamoto，etal.，1980，Cell22787-797)，皰疹腺嘧啶激酶促進因子(Wagneretal.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)，金屬硫蛋白基因的調整序列(Brinsteretal.，1982，Nature29639-42)；原核表達載體如β-內醯胺酶促進因子(Villa-Kamaroff，etal.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)，或tac促進因子(DeBoer，etal.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)；也見於″Usefulproteinsfromrecombinantbacteria″inScientificAmerican，1980，24274-94；酵母或其他真菌的促進因子如Gal4促進因子，ADC(乙醇脫氫酶)促進因子，PGK(磷酸甘油激酶)促進因子，鹼性磷酸酶促進因子和某些動物的轉錄控制區。例如，可使用載體如含有與核酸編碼有可用連接的促進因子，具有一個或多個的複製起點，也可以是一個或多個可選的標記(如一個抗生素耐藥基因)。具體地表述，表達構造可用亞克隆一個突變檢測項結合酶解碼序列為EcoRI限制位點，三個pGEX載體中任意一個。(GlutathioneS-Transferaseexpressionvectors；SmithandJohnson，1988，Gene731-40)。這使突變檢測項結合酶的表達可以在正確的讀碼時，由亞克隆生產。含一個突變檢測項結合酶基因插入的表達載體可被三種普通途徑識別(a)核酸雜交，(b)「標記」基因功能的存在或缺少，和(c)插入序列的表達。第一種途徑中，突變檢測項結合酶基因插入到表達載體的存在，可用含與插入突變檢測項結合酶同源的探針，通過核酸雜交來檢測。第二種途徑中，重組載體/宿主系統可被識別和選擇出來，基於某些「標記」基因功能的存在或缺少(如腺嘧啶激酶活性，抗生素耐藥性，轉錄表型，杆狀病毒的封閉體型等)，在載體中插入突變檢測項結合酶基因使這些功能產生變化。例如，如果突變檢測項結合酶基因插在載體的標記基因序列內，含突變檢測項結合酶插入的重組無可因缺少標誌基因功能而被識別出來。第三種途徑中，重組表達載體可由分析突變檢測項結合酶產物通過重組表達識別出來。舉例說明，這些分析可基於在體外分析系統中，突變檢測項結合酶的物理或功能特性，如與抗突變檢測項結合酶抗體結合。一旦一種特定的重組DNA分子被識別和分離出來，可用多種已知的方法來增殖它。一旦建立起適宜的宿主系統和生長環境，重組表達載體就可被定量增殖和準備。如前所述，可用的表達載體包括但不限於一下載體和其衍生物人體和動物病毒如牛痘病毒或腺病毒；昆蟲病毒如杆狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(如λ)，以及質體和粘粒DNA載體和其他。另外，宿主細胞株可被選擇，按照特殊需要方式調整插入序列的表達，或修改和處理基因產物。從某些促進因子來的表達，在某些引導物存在時可被提高。這樣，基因工程突變檢測項結合酶的表達可被控制。而且，不同的宿主細胞對蛋白的翻譯和後翻譯的處理和修改(如糖基化、磷酸化)有不同的特性和特殊機制。適當的細胞線或宿主系統可被選用以保證外來蛋白表達的理想修改和處理。例如，在細菌系統中表達可以用來生產無糖基化核心蛋白產物。在酵母中表達則生產糖基化產物。在適當的動物細胞中表達可以用來保證異體蛋白的「本地」糖基化。而且，不同的載體/宿主表達系統可以影響反應處理到不同程度。3.樣本收集以上所述的方法可以用來分析任何樣本檢測項。在此例中，待測標本是從哺乳動物，尤其是人的生物學樣本，如體液或組織。生物學體液包括但不限於，尿液、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、毛髮和其他角蛋白樣本、腦脊液、眼淚、粘液和羊水。生物學組織可能包括但不限於，細胞集合，通常為一種特別的細胞和其用以形成支架結構的胞間物質，而形成的人類、動物、植物、細菌、真菌或病毒的結構，包括關節、上皮、肌肉和神經組織、器官、腫瘤、淋巴結、動脈以及單個細胞。在一個特例中，待測體液為尿液。在另一個特例中，待測體液為學業。血液樣本最好再分離為血漿或血清成分。血清或血漿可用任何已知的方法從採集的血液中取得。在一個特例中，血清和血漿通過離心採集血獲得。離心最好在有封閉劑的條件下進行，封閉劑具有比血清和血漿重而比血球輕的重力特性，這樣血球會沉底，而經過離心，封閉劑在血清或血漿之下、血球之上形成一個阻斷層。封閉劑可用於但不限於以下過程，苯乙烯粉(JapanesePatentPublicationNo.38841/1973)、交鏈聚合水凝膠小球或盤(U.S.Pat.No.3,647,070)、表面帶抗栓劑或溼潤劑的聚苯乙烯小珠(U.S.Pat.No.3,464,890)和矽樹脂液(U.S.Pat.Nos.3,852,194and3,780,935)。最好的情況是，封閉劑為非替代的丙烯酸烷和/或異丁烯酸烷聚合物，其烷鏈應不超過18個碳原子，聚合物重量約為1.03至1.08且在切變速度約1s-1粘度為5,000至1,000,000cps(25℃測量)(U.S.Pat.No.4,140,631)。具體地表述，過篩血液區的血清或血漿。血液最好用一層平均直徑約0.2-5mu密度約0.1-0.5g/cm3的玻璃纖維過濾，分離的血漿或血清總量最多約為玻璃纖維吸收量的50％；收集穿過玻璃纖維層的血清和血漿(U.S.Pat.No.4,477,575)。用灌注了聚丙烯酯衍生物和聚乙烯乙二醇的平均直徑0.5-2.5mu的玻璃纖維也不錯(U.S.Pat.No.5,364,533)。聚丙烯酯衍生物為丁基丙烯酸聚合物、甲基丙烯酸聚合物或乙烷基丙烯酸聚合物，以及(a)丁基丙烯酸聚合物，(b)甲基丙烯酸聚合物或乙烷基丙烯酸聚合物和(c)聚乙烯乙二醇以(10-12)∶(1-4)∶(1-4)的比例混合使用更好。還有一個更好的實例，用含氧側鏈或側環的木脂體架(U.S.Pat.No.4,803,153)來處理血液獲得血清或血漿，如用d-芝麻素、l-芝麻素、泡桐素、d-asarinin，l-asarinin、2α-泡桐素、6α-泡桐素、pinoresinol，d-eudesmin，l-pinoresinol.beta.-D-glucoside，l-pinoresinol，l-pinoresinolmonomethylether.beta.-D-glucoside，epimagnolin，lirioresinol-B，syringaresinol(dl)，lirioresinonB-dimethylether，phillyrin，magnolin，lirioresinol-A，2.alpha.，6.alpha.-d-sesamin，d-diaeudesmin，lirioresinol-Cdimethylether(ddiayangambin)和sesamolin。凝血劑用量從約0.01至50g/L血。C.同型半胱氨酸檢測方法目前也是檢測樣本中的HCY的方法。這個方法至少包含以下步驟a)使用突變的HCY結合酶與樣本結合，此突變的HCY結合酶充分保留或增強其與HCY的親和力，但是削弱其催化活性。b)檢測與突變的HCY結合酶結合的HCY或由HCY轉化酶即時轉化的產物1.同型半胱氨酸的代謝同型半胱氨酸是蛋氨酸代謝為半胱氨酸的中間胺基酸產物。人體內有兩條同型半胱氨酸快速代謝途徑(1)與絲氨酸縮合成胱硫醚，(2)重新轉化為蛋氨酸。如上所述，樣本中的同型半胱氨酸水平具有重要的臨床意義。同型半胱氨酸在含巰基胺基酸代謝中扮演著重要的角色；代謝產物在代謝路徑中提示有不同的問題，包括特殊的先天的代謝問題。因此，例如高胱氨酸尿(尿中不正常的HCY)是由於缺乏胱硫醚酶β-合成酶或轉甲基四氫葉酸甲基轉移酶促使HCY甲基化生成蛋氨酸，第二條路徑附有插圖##STR1##Inthesecondpathway，whichisillustratedasfollows##STR1##1是亞甲基合酶；2是四氫葉酸(FH4)轉甲基酶；3是甲基四氫葉酸還原酶；4是二氫葉酸還原酶；5是胸腺嘧啶合成酶；四氫葉酸和二氫葉酸與HCY水平是相關的，另外和維生素B12的水平也是相關的，在這條路徑中不同的酶可以影響HCY的水平。巰基胺基酸代謝與維生素B12和葉酸有著密切的關係，在很多生化反應中做為底物或輔助因子，HCY堆積指示依賴維生素B12和葉酸代謝的酶紊亂，或其它的功能紊亂，或與維生素B12和葉酸有關的疾病。HCY代謝也可能受到其它抗葉酸的藥物影響，如做為抗癌和治療哮喘的藥物氨甲葉酸，因為HCY轉化成蛋氨酸需要S-甲基四氫葉酸提供甲基。HCY也可被用來監測治療惡性疾病所用的抗葉酸藥物。血液中的同型半胱氨酸水平動脈粥樣硬化有關(見Clarkeetal.，NewEng.J.Med.3241149-1155(1991))，中度高同型半胱氨酸血症是動脈和心臟疾病的風險因子。因此檢測血液中的HCY對於檢測和治療心血管疾病是非常重要的。2.MutantHcy-bindingEnzymes突變的HCY結合酶在HCY實驗中，任何突變的HCY結合酶充分保留或增強其與HCY或HCY酶的直接轉化產物的親和力但卻消弱了催化活性。例如突變型HCY結合酶包括胱硫醚β-合成酶，突變蛋氨酸合成酶，突變甜菜鹼HCY轉甲基酶，突變蛋氨酶和突變SAH合成水解酶。a.選擇和生產HCY結合酶SelectingandProducingHcy-bindingEnzymes一旦HCY結合酶核酸編碼被破譯，這些核酸已經能夠被誘變或遮蔽獲得，或直接由HCY或HCY酶轉化而篩選保持高親和力或提高親和力的突變HCY結合酶但是削弱催化活性。利用常用的技術和在C2c中敘述的方法插入、缺失或點突變可能被引入到核酸編碼的HCY結合酶中與結構功能相關的HCY結合酶用於突變，選擇的Hcy變異酶充分保留甚至增強了其結合Hcy或Hcy酶轉化直接產物的親和力，但削弱了其催化活性。例如，酶的變異位點是與下列物質結合的位點輔酶，輔助因子，非Hcy底物，變異的酶催化位點，或上述的聯合位點。具體地表述，誘變胱硫醚β-合成酶，突變可能發生在胱硫醚β-合成酶的維生素B65′-磷酸或L絲氨酸或兩者同時變異(Kimetal.，Proc.Nat.Acad.Sci.，71(2)4821-4825(1974))。例如，人類胱硫醚β-合成酶的Lys119可能被刪除或誘變成一個中性或酸性的胺基酸殘基(Keryetal.，Biochemistry，38(9)2716-24(1999))。另外地具體表述中，蛋氨酸合成酶被誘變，可能被突變發生在蛋氨酸合成酶的VB12或5甲基四氫葉酸(5-CH3-THF)或兩者同時變異，例如人類蛋氨酸合成酶的Asp946，Glu1097，Arg1134，Ala1136，Gly1138，Tyr1139andTyr1189可能被刪除或突變成不同的胺基酸殘基，Asp和Glu被突變成中性或基礎殘基i.e，Arg被突變成中性或酸性殘基，Ala和Glu被突變成有大側鏈的中性殘基，Tyr被突變成沒有芳香族側鏈的殘基(Dixonetal.，Structure，4(11)1263-75(1996))。包含有下列胺基酸序列(在SEQIDNo.3中有表述)的大腸桿菌蛋氨酸合成酶用於Hcy的檢測His759Gly，Asp757Glu，Asp757Asn，或Ser810Ala(Amaratungaetal.，Biochemistry，35(7)2453-63(1996))。另外的具體表述，SAH水解酶被誘變，突變可能生成在SAH合成水解酶的NAD+或SAH水解催化酶，如5′-水解活性位點，或兩者同時變異。另外具體表述，甜菜鹼Hcy甲基轉移酶被誘變，突變可能發生在甜菜鹼Hcy甲基轉移酶的Zn.+甜菜鹼位點上。例如人類甜菜鹼Hcy甲基轉移酶的Cys299和Cys300可能缺失或突變成沒有SH-側鏈的胺基酸殘基，如絲氨酸(MillianandGarrow，Arch.Biochem.Biophys.，356(1)93-8(1998)).。另外的具體表述，蛋氨酶被誘變，突變可能發生在蛋氨合成酶的R′SH位點上，增加一個硫醇烷基或取代一個硫羥基(Itoetal.，J.Biochem.，(Tokyo)80(6)1327-34(1976))。一旦HCY結合酶發生預先設定的突變，則保留或增強對Hcy和Hcy酶直接轉化產物的親和力，而削弱其催化活性，突變的HCY結合酶就可以用B章節敘述的包括基因重組，化學合成，或兼用二種方法製備，用基因重組的方法獲得突變的Hcy結合酶。b.變異的SAH水解酶和核酸編碼變異的SAH水解酶SAH水解酶存在於哺乳動物，分子量大約180-190KD，包含有4分子的作為輔酶的緊密結合NAD+，酶的催化過程包括2個連續的反應，伴隨著NAD+轉變成NADH，底物由3′氧轉變成3′酮；然後5′-水解生成Hcy和腺嘧啶Ado(Refsum，etal.，Clin.Chem.，31624-628(1985))。SAH水解酶C端非常容易被保存，包含有水解酶催化作用所必需的胺基酸殘基。最近檢測與底物類似物抑制劑混合的人類SAH水解酶的晶體結構。SAH水解酶的X-線結構表明最少20個胺基酸殘基直接或間接的與底物類似物抑制劑有關，胺基酸殘基的輔酶NAD+變異可以是位點的直接變異，此殘基直接或間接的與底物結合，直接影響其催化活性，變異的酶的基因序列可以與野生型的酶的序列比較，從而來確證此酶為所希望的變異的酶。假設這裡是純化的變異的SAH水解酶，充分保留甚至增強它對Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化活性。具體地表述，變異的SAH水解酶結合NAD+的結合位點或催化位點發生了變異，或兩者均發生了變異，可以導致充分保留甚至增強它對Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化活性。另外具體地表述，變異型SAH水解酶削弱了5′端的水解活性，但保留了3′端的氧化活性。在其他的特異表型中，變異的SAH水解酶固定的結合SAH。具體的表述，變異的SAH水解酶的酶切速率大約或低於10.0mu.M，變異的SAH水解酶對SAH的酶切速率大約為或低於1.0mu.M。具體的表述，變異的SAH水解酶對SAH的酶催化活性大約或低於0.1S-。具體的表述，變異的SAH水解酶有一個或多個可插入，缺失或點突變的位點。更具體地說，變異的SAH水解酶來源於SEQIDNo.1表述的胺基酸序列或者由SEQIDNo.2表述的核酸序列編碼的胺基酸但是包括下列一處或多處變異Phe302ofPhe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F82R，T157K，N181A，R431H和K426A的兩次變異。提供單獨的核酸片斷或者DNA，或者RNA，包括編碼變異的SAH水解酶的核酸序列，變異的SAH水解酶充分保留甚至增強它對Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化活性。具體地表述，獨立的核酸片斷編碼變異的SAH水解酶，其催化活性的削弱由於結合NAD+的結合位點或其催化位點發生了變異或兩者同時發生變異。具體地表述，變異型SAH水解酶，變異的SAH水解酶削弱了5′水解，活性；但仍保留3′端的氧化活性具體地表述，獨立的核酸片斷編碼變異型SAH水解酶，其固定的結合SAH。具體地表述，獨立的核酸片斷編碼變異型SAH水解酶，變異的SAH水解酶的酶切速率大約或低於10.0mu.M，變異的SAH水解酶對SAH的酶切速率大約為或低於1.0mu.M。具體地表述，獨立的核酸片斷編碼變異型SAH水解酶，變異的SAH水解酶對SAH的酶催化活性大約或低於0.1S-。具體地表述，獨立的核酸片斷編碼變異型SAH水解酶，變異的SAH水解酶有一個或多個可插入，缺失或點突變的位點。更具體地說，變異的SAH水解酶來源於SEQIDNo.1表述的胺基酸序列或者由SEQIDNo.2表述的核酸序列編碼的胺基酸但是包括下列一處或多處變異Phe302ofPhe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F82R，T157K，N181A，R431H和K426A的兩次變異。進一步還提供質粒，包括編碼上述變異水解酶的核酸片斷。更具體地說，此質粒是一種表達載體包含有下列核酸編碼的序列a)啟動子區域，b)變異的SAH水解酶，其充分保留甚至增強它對Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化活性。核酸編碼變異的SAH水解酶的序列與啟動子相關，表達SAH水解酶。更具體地說，此質粒包括可選擇的標記。本發明提供包含上述質粒的重組宿主細胞。重組的宿住細胞可以是下列宿主細胞但不局限於細菌細胞，酵母細胞，真菌細胞，植物細胞，昆蟲細胞，動物細胞。本發明提供製備變異的SAH水解酶方法。重組的宿主細胞可以在一定的環境中生長，變異的SAH在其中通過細胞表達。表達的變異的SAH水解酶被分離或復原。另外變異的SAH水解酶，按照已知的技術製備，包括B部分的舉例中。上述的變異的SAH水解酶此酶充分保留甚至增強它對Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化活性可用於樣本中Hcy的檢測。3.使用變異的SAH水解酶檢測Hcy具體地表述，變異的Hcy結合酶在Hcy實驗中使用的是變異的SAH水解酶，它保留或增強對Hcy和SAH的親和力，但是催化活性被削弱。這個實驗下面具體表述。Hcy檢測系統可以降解Hcy，可以利用變異的SAH水解酶與Hcy的結合來定量或檢測，野生型的SAH水解酶使得Hcy轉化為SAH。如上面所述，使用底物捕獲技術來代替使用單克隆抗體來定量檢測(見，e.g.，U.S.Pat.No.5,885,767andU.S.Pat.No.5,631,127)。使用螢光標記的捕獲目標S-腺苷半胱氨以競爭形式結合，變異的SAH用來捕獲底物。任何合適的標記物的合適的定量檢測都可以使用底物捕獲方法。下面有舉例以微孔板形式的反應；以及使用螢光標記腺苷半胱氨酸的標記舉例。具體地表述，SAH水解酶的催化活性由於變異的SAH水解酶的結合NAD+的位點或其催化位點發生了變異或兩者同時發生變異。具體地表述，變異的SAH水解酶削弱5′水解活性，但仍保留3′氧化活性。具體地表述，變異的SAH水解酶可以固定結合SAH。具體地表述，變異的SAH水解酶的酶切速率Km小於或等於為10.0.mu.M.，更具體地說，變異的SAH水解酶對SAH的酶切速率大約或小於1.0.mu.。具體地表述，變異的SAH水解酶對SAH的酶催化活性大約或低於0.1S-1。具體地表述，變異的SAH水解酶有一個或多個可插入，缺失或點突變的位點。更具體地說，變異的SAH水解酶來源於SEQIDNo.1表述的胺基酸序列或者由SEQIDNo.2表述的核酸序列編碼的胺基酸但是包括下列一處或多處變異Phe302，Phe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F82R，T157K，N181A，R431H和K426A的兩次變異。樣品和變異的SAH水解酶反應前，必須預先用還原劑將氧化型Hcy轉化成還原型Hcy，還原劑如磷酸三丁酯(TBP)，β-ME(巰基乙醇)，二硫赤鮮醇(DTT)，二硫赤鮮糖醇，巰基乙酸，穀胱苷肽，Tris磷酸，腈硼氫鈉，NaBH4，KBH4和金屬離子。具體地表述，樣品和變異的SAH水解酶接觸反應前，需要去除或降解游離的腺苷，腺苷通過腺苷脫氨酶，嘌呤核苷磷酸酶和黃嘌呤氧化酶被降解。具體實施例方式下面舉例說明但是不僅僅局限於下面發明的範圍。例一準備變異的SAH水解酶編碼核酸人類的SAH水解酶基因編碼(SEQIDNo.1)EcoRI作用重組複製表達質粒PKK223-3(PharmaciaBiotech，Piscataway，N.J.)。質粒PKK223-3包括強的TAC啟動子，此啟動子位於多克隆位點的上遊，還包括強的rrnB核醣體終端，此終端位於下遊，控制蛋白質的表達。包含SAH水解酶基因的表達質粒轉錄到E.coli單鏈JM109上(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)。SAH水解酶位點的直接變異通過下列兩種形式1)M13方法單鏈DNA變異2)PCP方法雙鏈DNA變異。單鏈DNA變異單鏈DNA變異是Tayloretal，NucleicAcidsRes.，138765-8785(1985)創建的方法，使用無活性的Ncil解開含硫基的DNA鏈。使用了Sculptor.TM.體外變異系統RPN1526(AmershamLifescience，UK)。pKK223-3質粒包含包含有SAH水解酶野生基因，此質粒準備用於減弱鹼性的方法中，此方法用Promega’sDNA純化試劑盒純化質粒(WizardplusMinipreps，Promega，MadisonWis.)。純化的質粒由限制性內切酶水解，37℃孵育2小時，使PromegaDNA用PromegaDNA純化試劑盒通過瓊脂糖凝膠電泳得EcoRI切隔片斷。純化的EcoRI切隔片斷由T4DNA連接酶克隆到M13mp19DNA中(PharmaciaBiotechPiscataway，N.J.)。連接酶在One-phor-All緩衝液(10mMtris-Ac，pH7.5，10mMMg(Ac)2，50mMKAc；PharmaciaLKBBiotechnologyAB，Uppsala，Sweden)中4℃過夜。90.mu.l的TG1細胞與10.mu.l的M13在0℃孵育30分鐘，42℃孵育75秒，連接產物轉錄到TG1細胞中(Stratagene，LaJolla，Calif.)。冷卻到0℃2分鐘，500.mu.l的2XYT加入到細胞中，37℃孵育10分鐘。200.mu.l未轉錄的TG1細胞於轉錄的TG1細胞混合，加入2.5ml的42℃的軟瓊脂中。混合的細胞立即加入預熱的LB瓊脂盤中，37℃孵育過夜。噬菌體克隆株用於檢測SAH水解酶的插入，定位DNA的序列，從而限制酶的分析活性。選擇的噬菌體克隆株用於準備單鏈DNA的模版的準備。包含有SAH水解酶基因的M13噬菌體TG1細胞在3ml的2XYT界質中孵育過夜。在30ml的2XYT中加入一滴對數成長的TG1細胞。細胞孵育8小時並且不斷振搖。離心，收集上清液，即是純化的單鏈模版DNA。根據Amersham生命科學的操作程序進行純化。點突變的引體通過CruaChem(Sterling，Va.)合成低聚核酸(15-30個鹼基)，低聚核酸的順序預計用於補充包括變異位點的區域的順序，例如，Lys變異為glu426。用於引子的低聚核酸包含下列順序GGCCCCTTCGAGCCGGATCACTACCGC(SEQIDNo.63)，其中的GAG編碼glu，從而代替原始的AAG編碼lys。Oligonucleotides(15-30bases)weresynthesizedbyCmaChem(Sterling，Va.)。變異位點的選擇基因人類SAH水解酶的X線照射的底物結合位點和輔酶結合位點(Tumeretal.，NatureStructuralBiology，5369-376(1998))。胺基酸殘基例如Thr157，Asp131，His301，Lys186，Asn191，Glu156，Asp190，Phe362，Phe302，Asn181，His353，Glu59，Ser83，His55，Leu54，Cys79，His301，Arg343，Asp303，Leu344，Asn80，Asn346，Asp107和完整的C端殘基能夠成為變異的靶子(請看下列Table2的特殊變異發生表)結合輔酶的區域包括從Tyr193到Asn346的殘基。低聚核酸在水中被溶解濃度為5ng/ml。低聚核酸溶液在多聚核酸激酶的催化下5』端被磷酸化，磷酸化作用與下列物質混合2.5ml的低聚核酸(5ng/ml)，3ml的One-phor-all10倍濃度的激酶緩衝液(PharmaciaBiotech)，21.5ml的水，2ml的10mM的ATP，1ml多聚核酸激酶(100000U/ml)(PharmaciaBiotech)。反應混合液37℃孵育30分鐘，加熱到70℃10分鐘，滅活酶的活性。表2人SAH水解酶的核酸變異位點密碼子MutantMutagenicoligonucleotide改變SEQIDK186AGACTTCGTCACCGCCAGCAAGTTTGGGAAG.fwdarw.GCC64F302SAACATTGGACACTCTGACGTGGAGATCTTT.fwdarw.TCT65H301DTGTAACATTGGAGACTTTGACGTGGAGCAC.fwdarw.GAC66H353STGTGCCATGGGCTCCCCCAGCTTCGTGCAC.fwdarw.TCC67R343ACTGGCCGAGGGTGCGCTGGTCAACCTGCGG.fwdarw.GCG68D190AAAGAGCAAGTTTGCCAACCTCTATGGCGAC.fwdarw.GCC69F82AAGCTGCAACATCGCCTCCACCCAGGACTTC.fwdarw.GCC70N181DAACCTCTATGGCGACCGGGAGTCCCTCAAT.fwdarwGAC71R431ACCGGATCACTACGCCTACTGAGAATTCCGC.fwdarw.GCC72K426RTGTGATGGCTTCCGCCCGGATCACTACAAG.fwdarw.CGC73C195SAACCTCTATGGCTCCCGGGAGTCCCTCTGC.fwdarw.TCC74.sub..DELTA.432GATCACTACCGCTGATGAGAATTCGAGATC.fwdarw.TGA75在低聚核酸∶模版為2∶1的比例中的退火緩衝液中，5』-磷酸化低聚核酸DNA與單鏈DNA(M13噬菌體包含有野生的SAH水解酶基因)退火，退火反應70℃孵育3min，然後37℃30min，然後轉到55℃微量離心試管中打碎，冷卻到室溫。退火混合液17ml，19mldNTPA(α-S)混合，加入1.5mlT7DNA，室溫10分鐘，37℃30分鐘，加熱70℃15分鐘，使其喪失活性停止反應，在反應液中加入T5核酸外切酶(2000單位)和核酸外切酶緩衝液37℃，30分鐘從而去除單鏈非變異的DNA。然後加入70℃的Ncil中15min，然後在37℃，90min基因組合非變異的單鏈。非變異的單鏈被加入16單位外切酶III消化，37℃孵育30min，失去活性。多聚切口的DNA，dNTP混合B，3.5單位的DNA聚合酶I和2.5單位的T4DNA連接酶加入反應中，37℃孵育1小時。M13噬菌體包含有SAH水解酶基因，通過熱振搖方法轉入目的TG1宿主細胞中。10ml的變異的M13噬菌體加入90ml水中，與目的TG1細胞在冰中混勻40min，TG1細胞42℃振勻孵育45秒，立即冷卻到0℃，5min。轉錄的TG1細胞升到室溫，與200ml正在生長期的非轉錄TG1細胞(象菌胎細胞一樣切斷)，加入3ml熔化的熱瓊脂，混勻，立即倒入在L-型盤子的細胞中，37℃過夜。用牙籤挑起菌落放入3ml的2XYT的試管中，混勻過夜，離心收集細胞。雙鏈DNAM13噬菌體使用PromegaDNA純化試劑盒純化(WizardplusMinipreps)。離心得到的上清液用於純化單鏈M13DNA。使用SEQ2.0(UnitesStatesBiochemical)的單鏈M13DNA發生變異。選擇雙鏈M13DNA包含正確的變異順序，用EcorI限制性內切酶消化。EcorI限制性內切酶包含有SAH水解酶基因，利用瓊脂糖電泳使用QlaquickGelExtractionkit清除法純化。純化的EcoRI片段使用T4連接酶克隆表達Pkk223-3載體，在10ml純化的變異插入DNA中，處理過的2ml的EcoRI和5』-脫磷酸Pkk223-3載體孵育10分鐘，在載體中以2∶1比例插入。連接酶反應在包含0.01M的ATP的One-phore-All緩衝液中，16℃過夜。包含有SAH水解酶基因的連接載體通過熱振搖的方法轉入目標E.ColiJM109細胞中。選擇抗氨苄青黴素的轉錄細胞。挑取耐氨苄青黴素菌株，在10ml含有35ml/mi的氨苄青黴素的2XYT界質中，37℃生長2小時，1mM的IPTG中誘變，37℃過夜生長。離心收集細胞，加入0.8ml，50mM的Tris-Hcl，PH7.5的緩衝液中，含有2mM的EDTA的緩衝液中。細胞由於快速凍融而溶解。4℃，13500轉離心1小時，收集上清夜；通過SDS-PAGE分析表達SAH水解酶變異蛋白。大約分子量圍47000道爾頓的重蛋白帶即為SAH水解酶蛋白質的表達。利用PCR技術變異方法使用ExSitePCR直接位點變異試劑盒(Stratagene，LaJolla，Calif.)利用PCR技術變異。ExSite方法使用增高的模板濃度，進行小於10個循環的PCR擴增。使用DpnI和PfuDNA聚合酶處理模板DNA，重新合成的DNA，雜合親代或重新合成的DNA混合物。DpnI外部消化甲基化的親代模板和雜交的DNA，PfuDNA聚合酶修飾末端產生鈍端PCR產物。末端修飾的PCR產物分子內連接轉錄到E.coli細胞中。具體的實驗產物如下描述在微量離心管中加入0.5pmol的DNA模板，2.5ml的10倍濃度的變異緩衝液，1ml的25mM的dNTP混合，每個啟動子15pml，加水使容量達到24ml。在反應混合液中然後加入1ml的ExsiteDNA聚合酶混合物(5U/ml)。反應液用20ml的石油覆蓋，然後經過7012次熱循環擴增DAN。擴增參數見表3。表3突變生成的循環參數(MutagenesisCyclingParameters)片段循環溫度(攝氏度)時間11944min.502min.722min.28941min.562min.721min.725min.3725min.擴增後，反應管放到冰中2分鐘，冷卻反應降到低於37℃，在反應管中加入1ml的DpnI限制酶(10IU/ml)和0.5ml的克隆PfuDNA聚合酶(2.5U/ml)，37℃孵育30分鐘，加熱到72℃，30分鐘終止擴增。連接產物，在反應管中加入100ml重蒸水，10ml10倍濃度的變異緩衝液，5ml10mM的rATP。10ml上述反應液轉移到新的離心管中，加入1ml的T4DNA連接酶(4U/ml)，連接液37℃孵育1小時。2ml的連接DNA加入80ml的EpicurianColiXL1-Blue冰的上清夜細胞中，孵育30分鐘，然後42℃孵育45秒，冰中2分鐘。轉移細胞立即轉入LB氨苄青黴素瓊脂培養基中，此培養基其中有20ml10％X-galDMF和20ml100M的IOTG的水中，37℃過夜，選取蘭色菌落，此菌落含有變異的噬菌體。選取的菌落含有DNA序列，蛋白質表達和底物捕獲的篩選如上所述。含有SAH水解酶的雙鏈PKK233-3用PromegaDNA純化試劑盒(WizardplusMinipreps)從50ml的E.coliJM109培養基中純化。純化的質粒被包含有希望變異序列的PCP啟動子退火。使用ExSitePCR直接位點變異試劑盒進行缺失和插入變異。兩種變異或混合變異使用變異的或缺失DNA的模版來進行，對於第二次變異或缺失使用M13的突變或PCP突變方法。鑑別底物捕獲SAH水解酶從可誘導表達SAH水解酶蛋白的菌株中萃取的細胞，利用FPLC系統進行套色複製。使用0到1M的10mM的磷酸鈉洗滌。在同一或相近的時間中，洗滌的主要蛋白峰是野生型的SAH水解酶收集。收集了大部分的SAH水解酶(1-10.mu.g)與SAH(10mCi/mmole，200.mu.M)，30mM的DTNB室溫孵育5-30分鐘。反應液通過一種分界限30000的；濾過膜離心過濾，過濾液經1ml50mM的PH7.0的磷酸緩衝液洗滌，在412nm處測定HCY(酶活性)，膜上3H的放射活性的檢測，既在膜上有高放射活性，在與野生型酶類過濾液中有低的吸光度的變性水解酶被選為候選者。因為其特性有酶速率的檢測活性下能夠結合酶。變異型SAH水解酶於SAH反應低於(10mCi/mmole，200.mu.M)的酶切速率，酶活性低於0.1kat/s，這樣的酶可以有高量的表達(1-2L的大腸桿菌培養基)酶蛋白的純化結合SDA-PAGE來判斷。例2大批量表達和純化野生型和變異型的SAH水解酶純化IPTG誘變E.ColiJM109培養基在(PKK-223-3載體中結合SAH水解酶基因)的細胞萃取液與DEAE-cellulose(Sigma，St.Louis，Mo.)混合，與0.1M鈉磷酸，PH7.2，包含1mM的EDTA的緩衝液平衡細胞萃取液和DEAE-cellulose的混合液真空過濾，用3體積的BufferA衝洗。用胺基酸鹽沉澱過濾液。過濾蛋白用13000轉離心收集，重新溶於50mMPH7.2含1mMEDTA的磷酸緩衝液中。此蛋白通過DEAE-sephrose離子交換柱(2.5times，100cm)(PharmacialBiotech，Piscataway，N.J.)層染，然後用不通梯度濃度的NaclDEAE-Sepharose離子交換柱(2.5.times.30cm)衝洗，從DEAE-Sepharose離子交換洗脫的主要的蛋白峰通過SDS-PAGE檢測，大多數情況下純化後的反應液在通過SDS-PAGE檢測應該得到單一的蛋白帶，有些情況下可以分析其他小的蛋白帶，如果出現這種情況，應重新通過DEAE-sephrose離子交換柱層染，從而保證得到純化的蛋白質。SAH水解酶活性或3HSAH結合活性通過蛋白峰來確定。純化後SAH水解酶的保存純化的野生型和變異型SAH水解酶在5mM的PH7.2的PB中，4℃透析6小時。然後在液氮中冷凍，真空或凍乾粉保存。凍乾粉在-70℃保存可以穩定2年。純化後的蛋白也可在20％的甘油中-20℃保存。對於野生型酶類，加入含有5mol腺嘌呤的20％的甘油，酶活性會更加的穩定。酶活性的檢測直接檢測水解反應來檢測SAH水解酶活性(Yuanetal.，J.BiolChem.，27128008-28016，1996).檢測SAH水解腺嘌呤和Hcy的能力。反應產物Hcy由硫代的DTNB發生有色的變化，在412nm處檢測。SAH水解酶可以利用HPLC檢測(see，Yuanetal.，J.Biol.Chem.，26817030-17037(1993)。一個單位的酶活性定義為水解或合成1μmol的min/mgSAH酶量。親和力活性的檢測對於變異型酶，酶活性完全喪失，親和力使用濾膜分析平衡技術檢測，此檢測使用3H標記的SAH和Spectrum5-cellEquilibrium分析儀(Spectrum，Houston，Tex.)。過濾膜為25000。例3試劑準備準備螢光標記的腺嘌呤和SAH類似物方法1ADO-5′-羧酸(Sigma，St.Louis，Mo.)來源於9-羥甲基蒽(HMA)(Fluka，Buchs，Switzerland)，加入50mgHOBT，在氮氣中進行幹化學染色，加入300mgN-ethyl-N′(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride在300ml氯仿中，在加入5ml的三乙胺。上述液體在0℃放置30分鐘，加入200mgHMA、100ml氯仿，混合液室溫放置10分鐘，在氮氣流中乾燥，殘渣溶於10mlHPLC流動液相中(甲醇∶水＝90∶10)。1ml的上述液體注入一個半-prepative柱中(Econosphere，C18，7.times.300mm，Alltech，Dearfield，Ill.)，使用平衡過濾方法，流速為2m/min，260nm為檢測峰，螢光分析在415nm和365nm，在260nm和螢光吸收峰處的物質為HMA標記的Ado-5′-酯。方法2Ado-5′caroboxylicacid和4-bromomethyl-7-methoxycoumarin(Br-Mmc)(Sigma，St.Louis，Mo.)以1∶3比例溶於乙醯乙酸(ethylacetate)中，25ml反應液中加入2gK2CO3，然後冷卻，反應液中加入到C18柱中(Econosphere，C18，7.times.300mm，Alltech，Dearfield，Ill.)HPLC分離，過濾，使用不通梯度甲醇洗脫20-100％的濃度，洗脫30分鐘，流速2ml/min。方法3腺苷-L-半胱氨酸和4-溴甲基-7-甲基氧化香豆素以1∶3比例溶於乙醯乙酸中，最後溶液為25ml(ca，1mgAdo-Cys)，加入200mg的K2CO3，此溶液在80℃回流1小時，冷卻，反應液中加入到C18柱中(Econosphere，C18，7.times.300mm，Alltech，Dearfield，Ill.)HPLC分離，過濾，使用不通梯度甲醇洗脫20-100％的濃度，洗脫30分鐘，流速2ml/min。方法4Ado-Cys溶液PH9.0，1mmol/l的CB中，異硫氰酸螢光素(FITC)，溶於5ml的DMSO中，用PH9.0，1M的CB稀釋等體積的Ado-Cys和FITC，混勻，室溫溫育1小時。Ado-Cys-FITC結合物用C18標記，用HPLC分離(Econsphere，C18，Alltech，Dearfield，Ill.)，過濾液在260nm處檢測，484nm，520nm用螢光檢測。流動相是水和甲酚的不同梯度濃度溶液，從0到80％，35分鐘洗脫。微孔板上包被變異的SAH水解酶變異的SAH水解酶(F302S)包被於96微孔板上(DynexTechnologies，Chantilly，Va.)，每孔200μl，F302S水解酶20μg/ml，磷酸緩衝液50mmol/l，PH7.6，4℃過夜，倒空，用10mM的PBS(NaCL0.05％，0.05％的T-20)洗滌3次，排乾。4℃保存備用。標準和化學試劑的準備1.製作標準曲線人白蛋白(FractionVpowder，Sigma)溶於PBS中，白蛋白的濃度於血漿中的濃度相同。10ml的白蛋白加入4ml的1％的TBP，室溫孵育15分鐘，經過一定大小的(Sephacryl-S100，2.times.90cm)凝膠過濾，白蛋白濃度使用白蛋白濃度調整儀調整到於人血漿類似的濃度。L-Hcy的系列濃度已知，L-Hcy加入TBP處理人血漿白蛋白中的最終濃度為0-50μM，37度孵育1h後，L-Hcy結合的白蛋白每管中70ml，作為標準品，使用前-20℃保存。2.野生型SAH水解酶溶液野生型SAH水解酶溶液(20mU/50.mu.l)溶解於50mM磷酸緩衝液，PH7.2，1mMEDTA，0.25mMAdo和1mg/mlBSA.3.TBP溶液TBP(Sigma)溶於1％的DMF中。4.異硫氰酸螢光素溶液(FLAC)Br-Mmc-labeledAdo-Cys或FITC標記的腺苷半胱氨酸溶於50mM磷酸緩衝液，PH7.2，濃度為0.5mM。5.SAH水解酶抑制劑稀釋液NeplanocinA，一種SAH水解酶抑制劑，腺苷脫氨酶的底物，溶於50mMPH7.2的PB中抑制劑溶液(50.mu.M)以1∶1.5使用。6.多酶溶液腺苷(0.2U/.mu.l)，核苷磷酸酶(0.2U/l)，黃嘌呤氧化酶(0.2U/.mu.l)溶解於50mM磷酸鹽緩衝液，PH7.2，所有的酶均來源於Sigma。7.洗液洗板液成分10mMPBS，pH7.2，，0.1MNaCl和0.05％Tween20。例4使用變異的SAH酶檢測血漿中的HCY檢測程序步驟1.HCY轉化為SAH微量離心管或未包被的96孔板中，50ul的血漿樣本加入20ulTBP和50ul稀釋液，25℃孵育15分鐘，加入20ul酶抑制劑，孵育10分鐘後加入無活性SAH水解酶。步驟2移去剩餘的ADO和酶抑制劑。在步驟1的溶液中加入30ul的多酶稀釋液，室溫孵育15分鐘。步驟3使用變異的SAH水解酶誘捕SAH。150ul步驟2的溶液轉移到包被有變異的SAH水解酶的微孔板中，室溫孵育30分鐘，倒掉液體。步驟4，清洗液洗滌3遍，拍幹。步驟5螢光標記的Ado-Cys與變異的酶結合100ul螢光標記的Ado-Cys或螢光標記的Ado-5′酯加入到步驟4的微孔板中，室溫孵育20分鐘，清洗液清洗3次。步驟6檢測螢光標記的Ado-Cys與變異的酶結合物。將200ulPH7.2，50mM的磷酸緩衝液加入到步驟4的微孔板中，使用螢光儀讀取(MolecularDevices，fmax)，依據吸光度血漿中Hcy的濃度，可以依據標準曲線中查找。選擇的Hcy檢測有選擇的，Hcy檢測可以用於預先包被SAH於微孔板中，使用螢光標記變異的SAH水解酶，去競爭性結合檢測，下面是詳細闡述1.預先包被SAH在微孔板上。2.在PCL3中50℃環境下，通過激活SAH3羧基基團，SAH與多聚賴氨酸結合，SAH-多聚賴氨酸結合物通過HPLC純化，然後溶於溶於0.1MPH9.6的碳酸緩衝液中，每孔加入300ul100g/ml的SAH多聚核酸溶液，37℃孵育6小時，10mMPBS，0.1MNaCL洗板3次，然後拍幹，使用前保存於4℃。螢光標記的變異SAH水解酶Fluorophore-labeledMutantSAHHydrolase變異的SAH水解酶(e.g.，F302S)特異性標記在Cys421的一個非本質的半胱氨酸殘基，他位於蛋白質表層，不包括在底物的結合和催化位點。Cys421殘基是硫代活化基團，不影響酶結合活性的情況下被修飾。硫代反應探針例如7-diethylamino-3(4′-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin(CPM)能夠標記蛋白。變異的SAH水解酶(F302S)(0.5mg/ml)，加入PH7.250mM的PB緩衝液中用於保護其他底物結合位點的硫基的腺苷2ml，共同孵育使其最後濃度為50mM，反應液室溫孵育30分鐘，加入一定大小的分離柱中進行分離凝膠過濾(SephacrylS-300，4.5mm.times.60cm)，去除腺嘌呤和多餘的CPM。CPM標記的F302S變異的SAH水解酶(2mg/ml)放入50mMPB緩衝液中-20℃保存，其中含有20％的甘油。野生型的SAH與變異的F302S酶切速率和催化活性比較如下表4表4野生型的SAH與變異的F302S酶切速率和催化活性比較typeSAH水解酶酶Km(SAH)Kcat(SAH)野生型7.9.mu.M3.8S.sup.-1F302S1.0.mu.M0.1S.sup.-1血漿中Hcy的檢測程序2步驟1，Hcy轉化為SAH微量離心管或未包被的96孔板中，50ul的血漿樣本加入20ulTBP和50ul稀釋液，25℃孵育15分鐘，加入20ul酶抑制劑，孵育10分鐘後加入無活性SAH水解酶。步驟2，移去剩餘的ADO和酶抑制劑。在步驟1的溶液中加入30ul的多酶稀釋液，室溫孵育15分鐘。步驟3，競爭性地SAH與變異的SAH水解酶。100ul步驟2的溶液轉入預先包被多聚賴氨酸-SAH結合物的微孔板中，加入150ul的螢光標記的變異的SAH水解酶。室溫孵育30分鐘，用清洗液清洗3遍，拍幹。步驟4檢測微孔板中螢光標記的SAH水解酶的結合。200ul的10nM的磷酸鹽緩衝液加入步驟3中的微孔板中，在390nm和460nm處用讀板機(MolecularDevices，fmax)讀數。血漿中的Hcy的濃度依照標準曲線求得。序列表110北京九強生物技術有限公司210SEQIDNO1211長度432212類型PRT213人223人S-腺苷同型半胱氨酸水解酶蛋白MetSerAspLysLeuProTyrLysValAlaAspIleGlyLeuAlaAla151015TrpGlyArgLysAlaLeuAspIleAlaGluAsnGluMetProGlyLeu202530MetArgMetArgGluArgTyrSerAlaSerLysProLeuLysGlyAla354045ArgIleAlaGlyCysLeuHisMetThrValGluThrAlaValLeuIle505560GluThrLeuValThrLeuGlyAlaGluValGlnTrpSerSerCysAsn65707580IlePheSerThrGlnAsnHisAlaAlaAlaAlaIleAlaLysAlaGly859095IleProValTyrAlaTrpLysGlyGluThrAspGluGluTyrLeuTrp100105110CysIleGluGlnThrLeuTyrPheLysAspGlyProLeuAsnMetIle115120125LeuAspAspGlyGlyAspLeuThrAsnLeuIleHisThrLysTyrPro130135140GlnLeuLeuProGlyIleArgGlyIleSerGluGluThrThrThrGly145150155160ValHisAsnLeuTyrLysMetMetAlaAsnGlyIleLeuLysValPro165170175AlaIleAsnValAsnAspSerValThrLysSerLysPheAspAsnLeu180185190TyrGlyCysArgGluSerLeuIleAspGlyIleLysArgAlaThrAsp195200205ValMetIleAlaGlyLysValAlaValValAlaGlyTyrGlyAspVal210215220GlyLysGlyCysAlaGlnAlaLeuArgGlyPheGlyAlaArgValIle225230235240IleThrGluIleAspProIleAsnAlaLeuGlnAlaAlaMetGluGly245250255TyrGluValThrThrMetAspGluAlaCysGlnGluGlyAsnIlePhe260265270ValThrThrThrGlyCysIleAspIleIleLeuGlyArgHisPheGlu275280285GlnMetLysAspAspAlaIleValCysAsnIleGlyHisPheAspVal290295300GluIleAspValLysTrpLeuAsnGluAsnAlaValGluLysValAsn305310315320IleLysProGlnValAspArgTyrArgLeuLysAsnGlyArgArgIle325330335IleLeuLeuAlaGluGlyArgLeuValAsnLeuGlyCysAlaMetGly340345350HisProSerPheValMetSerAsnSerPheThrAsnGlnValMetAla355360365GlnIleGluLeuTrpThrHisProAspLysTyrProValGlyValHis370375380PheLeuProLysLysLeuAspGluAlaValAlaGluAlaHisLeuGly385390395400LysLeuAsnValLysLeuThrLysLeuThrGluLysGlnAlaGlnTyr405410415LeuGlyMetSerCysAspGlyProPheLysProAspHisTyrArgTyr420425430110北京九強生物技術有限公司210SEQIDNO2211長度2211212類型DNA213人223人S-腺苷同型半胱氨酸水解酶cDNActgaggcccagcccccttcgcccgtttccatcacgagtgccgccagcatgtctgacaaac60tgccctacaaagtcgccgacatcggcctggctgcctggggacgcaaggccctggacattg120ctgagaacgagatgccgggcctgatgcgtatgcgggagcggtactcggcctccaagccac180tgaagggcgcccgcatcgctggctgcctgcacatgaccgtggagacggccgtcctcattg240agaccctcgtcaccctgggtgctgaggtgcagtggtccagctgcaacatcttctccaccc300agaaccatgcggcggctgccattgccaaggctggcattccggtgtatgcctggaagggcg360aaacggacgaggagtacctgtggtgcattgagcagaccctgtacttcaaggacgggcccc420tcaacatgattctggacgacgggggcgacctcaccaacctcatccacaccaagtacccgc480agcttctgccaggcatccgaggcatctctgaggagaccacgactggggtccacaacctct540acaagatgatggccaatgggatcctcaaggtgcctgccatcaatgtcaatgactccgtca600ccaagagcaagtttgacaacctctatggctgccgggagtccctcatagatggcatcaagc660gggccacagatgtgatgattgccggcaaggtagcggtggtagcaggctatggtgatgtgg720gcaagggctgtgcccaggccctgcggggtttcggagcccgcgtcatcatcaccgagattg780accccatcaacgcactgcaggctgccatggagggctatgaggtgaccaccatggatgagg840cctgtcaggagggcaacatctttgtcaccaccacaggctgtattgacatcatccttggcc900ggtaggtgccagatggggggtcccggggagtgagggaggagggcagagttgggacagctt960tctgtccctgacaatctcccacggtcttgggctgcctgacaggcactttgagcagatgaa1020ggatgatgccattgtgtgtaacattggacactttgacgtggagatcgatgtcaagtggct1080caacgagaacgccgtggagaaggtgaacatcaagccgcaggtggaccggtatcggttgaa1140gaatgggcgccgcatcatcctgctggccgagggtcggctggtcaacctgggttgtgccat1200gggccaccccagcttcgtgatgagtaactccttcaccaaccaggtgatggcgcagatcga1260gctgtggacccatccagacaagtaccccgttggggttcatttcctgcccaagaagctgga1320tgaggcagtggctgaagcccacctgggcaagctgaatgtgaagttgaccaagctaactga1380gaagcaagcccagtacctgggcatgtcctgtgatggccccttcaagccggatcactaccg1440ctactgagagccaggtctgcgtttcaccctccagctgctgtccttgcccaggccccacct1500ctcctccctaagagctaatggcaccaactttgtgattggtttgtcagtgtcccccatcga1560ctctctggggctgatcacttagtttttggcctctgctgcagccgtcatactgttccaaat1620gtggcagcgggaacagagtaccctcttcaagccccggtcatgatggaggtcccagccaca1680gggaaccatgagctcagtggtcttggaacagctcactaagtcagtccttccttagcctgg1740aagtcagtagtggagtcacaaagcccatgtgttttgccatctaggccttcacctggtctg1800tggacttatacctgtgtgcttggtttacaggtccagtggttcttcagcccatgacagatg1860agaaggggctatattgaagggcaaagaggaactgttgtttgaattttcctgagagcctgg1920cttagtgctgggccttctcttaaacctcattacaatgaggttagtacttttagtccctgt1980tttacaggggttagaatagactgttaaggggcaactgagaaagaacagagaagtgacagc2040taggggttgagaggggccagaaaaacatgaatgcaggcagatttcgtgaaatctgccacc2100actttataaccagatggttcctttcacaaccctgggtcaaaaagagaataatttggccta2160taatgttaaaagaaagcaggaaggtgggtaaataaaaatcttggtgcctgg權利要求1.檢測樣本中同型半胱氨酸(Hcy)的方法，包括a)樣本與變異的S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶結合，SAH水解酶在核苷酸序列NO.1中明確描述其胺基酸順序，包含一次或多次選擇性的變異，Phe302突變為Lys(F302K)，Lys186突變為Ser(K186S)，His301突變為Asn(H301N)，His353突變為Thr(H353T)，Arg343突變為Phe(R343F)，Asp190突變為Arg(D190R)，Phe82突變為Arg(F82R)，Thr157突變為Lys(T157K)，Asn181突變為Ala(N181A)，和兩次突變Arg431突變為His(R431H)andLys426突變為Ala(K426A)；b)檢測與變異的SAH水解酶結合的HCY，SAH；從而檢測樣本中的Hcy的含量。2.如權利要求1所述的方法，其中在樣本與變異的SAH水解酶結合之前，樣本中的氧化型或結合型的Hcy需要轉化成游離型的Hcy。3.如權利要求1所述的方法，其中在樣本與變異的SAH水解酶結合之前，樣本中的游離型的Hcy需要轉化成SAH。4.如權利要求1所述的方法，其中樣本中的Hcy被野生型的SAH水解酶轉化成SAH。5.如權利要求1所述的方法，其中的SAH與變異的SAH水解酶結合過程中存在著SAH水解酶催化抑制劑。6.如權利要求1所述的方法，其中SAH與變異的SAH水解酶結合過程中標記SAH或其派生物或類似物，因此標記的SAH數量競爭性地抑制變異性SAH水解酶與樣本中的SAH數量的作用。7.如權利要求1所述的方法，其中的標記SAH衍生物或類似物是一種螢光標記。8.如權利要求1所述的方法，其中變異的SAH水解酶是一種標記變異的SAH水解酶。9.如權利要求1所述的方法，其中標記的變異性SAH水解酶是一種螢光標記或酶標記的變異的SAH水解酶。10.如權利要求1所述的方法，其中的樣本是體液或生物組織。11.如權利要求1所述的方法，其中體液應從下列中選擇尿液，血液，血漿，血清，唾液，精液，糞便，唾液，腦脊液，淚液，粘液和羊水。12.如權利要求11所述的方法，其中的體液是血液。13.如權利要求12所述的方法，其中的血液樣本需要進一步分離出血漿或血清。14.如權利要求13所述的方法，其中的生物組織應從下列組織中選擇關節組織，上皮組織，肌肉組織，神經組織，器官，腫瘤，淋巴結，動脈和單獨的細胞。15.如權利要求14所述的方法，其中的標記SAH或其衍生物或類似物是固定的。16.如權利要求1所述的方法，其中的變異的SAH水解酶是固定的。全文摘要基於小分子捕獲技術研製生產同型半胱氨酸診斷試劑盒的方法，該方法使用基因突變酶與待測小分子物質結合，這種基因突變酶稱為小分子捕獲酶，這些經過突變、修飾的小分子捕獲酶保留甚至增強其對底物或待測小分子物質的親和力，但是削弱其對底物或待測小分子物質的親和力的催化、分解能力。基於小分子捕獲技術研製生產同型半胱氨酸(HCY)診斷試劑盒的方法提供這種，也提供突變的S－腺苷同型半胱氨酸水解酶，特異性S－腺苷同型半胱氨酸(SAH)捕獲酶可以充分地保留甚至增強其對或S－腺苷同型半胱氨酸(SAH)的親和力，但是削弱了其對HCY或S－腺苷同型半胱氨酸(SAH)的催化能力。該方法尤其適用於小分子物質，如無機離子，胺基酸，多肽，核苷，寡核苷酸，維生素，單糖，低聚糖，脂類，有機酸。文檔編號G01N33/68GK1570135SQ0314597公開日2005年1月26日申請日期2003年7月18日優先權日2003年7月18日發明者餘凱茜申請人:北京九強生物技術有限公司