一種蛭弧菌製劑及其發酵方法和應用的製作方法

2023-06-26 18:59:21

專利名稱：一種蛭弧菌製劑及其發酵方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及發酵技術領域，具體涉及一種蛭弧菌製劑及其發酵方法與應用。
背景技術：
目前控制、消除致病菌的主要手段仍是各種物理和/或化學的方法，包括各種抗 生素的使用。物理和/或化學的方法都存在著明顯的弊端，首先，抗生素大量濫用，會導致 一些副作用的產生，如病原菌的抗藥性、抑制有益菌群等。其次，酸鹼處理的方法雖可達到 一定的滅菌/殺菌效果，但在有害菌形成生物膜後，這些方法的效果就極不理想。最後，物 理的方法對各種致病菌的消除作用只能應用於相關領域的某一環節，而難以擴展到整個領 域的所有環節。生物防治的方法則可具有強大的優越性，極有可能使其服務於日常生活的 病害防治以及生物戰和恐怖襲擊中大規模的水源性、食源性汙染的處理等。近年來微生物生態製劑的研究開發受到各方關注，特別是蛭弧菌的研究受到人們 的青睞。蛭弧菌自1963年被發現以來，因其是一種寄生菌，能裂解大腸桿菌、沙門氏菌、嗜 水氣單胞菌、弧菌等革蘭氏陰性致病菌且對人和動物無害，而備受關注。將蛭弧菌應用於防治致病菌的關鍵是獲得濃度高、裂解能力強的蛭弧菌製劑。為 此，人們對蛭弧菌製劑的製備方法進行了不懈的研究，譬如專利申請號為93111749. 6、名稱 為「生物制菌王及其生產方法」的國家發明專利申請提出用高溫(70 150°C )或化學藥物 (氯仿等)將大腸桿菌殺死，製造滅活的宿主菌，接著用其培養蛭弧菌，得到蛭弧菌製劑；專 利申請號200810145709. 5、名稱為「蛭弧菌微生態製劑的生產方法」提供了蛭弧菌微生態制 劑的生產方法，主要和傳統方法不同的是將宿主大腸桿菌凍幹成菌粉使用。上述兩份專利 申請都採用活的大腸桿菌作為宿主菌，最終會影響生態環境。而本發明所用的宿主菌均為 有益菌或是對環境無害的菌，不會對環境構成威脅。專利申請號200810202809. 7、名稱為 「雙效蛭弧菌的發酵生產方法」的國家發明專利申請提供了一種雙效蛭弧菌的發酵生產方 法，即先發酵製備宿主菌的混懸液，再加入宿主菌混懸液和蛭弧菌液到配製好的培養液中 進行發酵。雖然該生產方法生產出的蛭弧菌含量較高(5X108pfu/mL)，但是其宿主菌選用 了致病性的嗜水氣單胞菌，而且發酵時間較長(72 120h)，會導致其生產成本的增加。另 外，此技術也可能存在著所得的蛭弧菌裂解活性不高的問題。而本發明採用的是革蘭氏陽 性菌為宿主，實驗證明，以此宿主發酵製得的蛭弧菌能夠維持，甚至提高對其他革蘭氏陰性 菌和陽性菌的裂解能力。

發明內容
為了克服現有方法所製備的蛭弧菌製劑含量低以及裂解活性低的問題，本發明的 首要目的在於提供一種蛭弧菌製劑的發酵方法。本發明的另一目的在於提供一種由上述發酵方法製備得到的蛭弧菌製劑。本發明的再一目的在於提供上述蛭弧菌製劑的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種蛭弧菌製劑的發酵方法，包括以下步驟(1)宿主菌懸液的製備將宿主菌培養至對數生長期，收集菌體，接著用磷酸鹽緩衝液調整濃度，得到濃度 為1017 1022cfu/mL的宿主菌懸浮液，然後置於2 15°C中保存備用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鹽緩衝液中加入步驟(1)製備的宿主菌懸浮液，調整宿主菌的濃度為 1010 1015cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然後將此培養液在20 40°C培養20 60h，再在2 15°C，5000 8000rpm離心15 35min，保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在2 15°C， 12000 20000rpm離心15 40min，保留沉澱棄去上清液，沉澱為蛭弧菌遊泳體，在沉澱 中加入磷酸鹽緩衝液調整蛭弧菌遊泳體的濃度為106 109pfu/mL，得到蛭弧菌遊泳體濃縮 液，置於2 15°C保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備將氯化鈉溶於溶劑中形成質量體積比濃度為0 30g/L的氯化鈉溶液，滅菌，得 到發酵培養基；在發酵培養基中加入步驟(1)製備的宿主菌懸浮液和步驟(2)製備的蛭弧 菌遊泳體濃縮液，使宿主菌起始濃度為 1015cfu/mL，蛭弧菌遊泳體起始濃度為101 103pfu/mL，進行發酵；發酵溫度控制在28 30°C，pH值控制在7. 2 7. 6 ；設置攪拌轉速 與溶氧聯動，使溶氧水平控制在20% 30%;發酵過程中加1 3次宿主菌懸浮液，每次加 入宿主菌懸浮液的間隔時間12 18h，每次加入宿主菌懸浮液的量以新加入的宿主菌在發 酵培養基中的濃度為101Q 1015cfu/mL為準；發酵培養36 48h即製成蛭弧菌製劑；所述 溶劑為DNB液體培養基、蒸餾水或磷酸鹽緩衝液。步驟⑴所述宿主菌為有益的或對環境無害的革蘭氏陽性菌，優選為枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)、兩歧雙歧桿菌 (Bifidobacterium bifidum)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、保力口禾丨J 亞乳桿菌 (Lactobacillus bulgaricus)、季L酸片王求菌(Pediococcus acidilactici) > ？LStlillif (Streptococcus lactis)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei) lif (Lactobacillus lactis)(Lactobacillusplantarum) gJc 戊糖片球菌(Pediococcus pentasaceus)；步驟(2)所述蛭弧菌為BDF01、BDF02、BDF03、BDJO 1、BDJ02、BDM01、BDS01、BDS02、 BDSM08 或 BDFM05。所述BDF01於2008年1月13日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養 物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208008 ；所述BDF02於2008年1月13日保藏於中 國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208009;所述 BDF03於2008年1月13日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏 編號為CCTCC NO :M 208010 ；所述BDJ01於2008年1月14日保藏於中國武漢市武漢大學 內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208011 ；所述BDJ02於2008年1 月14日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M208012 ；所述BDM01於2008年4月28日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物 保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208066 ；所述BDS01於2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 209169 ；所述BDS02 於2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO =M 209170 ；所述BDSM08於2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國 典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 209171 Jy^iBDFMOS於2009年8月7日保 藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO :M 209172。步驟(1)所述收集菌體的方式優選為通過離心分離得到，離心條件為2 15°C， 5000 8000rpm 離心 15 35min ；步驟⑴所述宿主菌懸浮液的濃度優選為IO17 IO22CfuAiL ；步驟(2)所述蛭弧菌斑採用常規方法(根據申請號為200910042274. 6，名稱為「一 種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請)進行分離得到。步驟(1) (3)任一項所述磷酸鹽緩衝液優選為濃度是0. 1 0. 3mol/L, pH是 7. 2 7. 6的磷酸鹽緩衝液；步驟(2)所述蛭弧菌遊泳體濃縮液的濃度優選為IO6 109pfu/mL ；步驟(3)所述蛭弧菌來源於鹹水環境時，所述溶劑為DNB液體培養基或蒸餾水，所 述氯化鈉溶液的質量體積比濃度為25 30g/L ；步驟(3)所述蛭弧菌來源於鹹淡水環境時，所述溶劑為DNB液體培養基或蒸餾水， 所述氯化鈉溶液的質量體積比濃度為5 10g/L ；步驟(3)所述蛭弧菌來源於淡水環境時，不加氯化鈉；步驟(3)所述滅菌的條件優選為121°C滅菌20min ；步驟(3)所述蛭弧菌製劑的濃度為IO8 1012pfu/mL ；步驟(3)所述DNB液體培養基是將營養肉湯0. Sg、酪蛋白酸水解物0. 5g和酵母精 提物0. Ig溶於IOOOmL蒸餾水中，調節pH值至7. 2 7. 6。一種蛭弧菌製劑，由所述的蛭弧菌製劑的發酵方法製備得到；所述蛭弧菌製劑可以通過裂解其它致病菌或潛在致病菌而達到防治病菌害的目 的。所述的蛭弧菌製劑不僅可以直接製成製劑，也可通過進一步的離心，製成單純的遊泳體 製劑、蛭質體製劑以及它們的按比例混合的製劑。本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果(1)本發明所述的發酵方法中採用的宿主菌均為有益的或對環境無害的革蘭氏陽 性菌。這樣，一方面，可以保持、甚至提高蛭弧菌裂解一些革蘭氏陰性菌的能力，而且實驗證 明，用該方法製得的蛭弧菌製劑對致病菌的裂解能力有了一定的提高；另一方面，所製得的 蛭弧菌製劑可以直接使用，無需經過更多的發酵後處理；再者，因為宿主都是有益菌或是對 環境無害的菌株，該製劑的使用範圍也大大的增加。(2)本發明在得到高濃度蛭弧菌菌液的同時，相對也縮短了發酵周期，這樣有效的 解決了發酵時間過長而導致的能源消耗過大，生產成本過高的問題，得到的蛭弧菌製劑不 僅成本低，而且活性高。


圖1是以兩種不同宿主(枯草芽孢桿菌和大腸桿菌)發酵製得的蛭弧菌製劑對鼠 傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的裂解能力_時間圖。
圖2是以兩種不同宿主(納豆芽孢桿菌和大腸桿菌)發酵製得的蛭弧菌製劑對單 核增生李斯特菌和豬霍亂沙門氏菌的裂解能力_時間圖。圖3是以兩種不同宿主(兩歧雙歧桿菌和鼠傷寒沙門氏菌)發酵製得的蛭弧菌制 劑對豬鏈球菌II型和乳房鏈球菌的裂解能力-時間圖。圖4是以兩種不同宿主(糞腸球菌和豬霍亂沙門氏菌)發酵製得的蛭弧菌製劑對 表皮葡萄球菌和大腸桿菌的裂解能力_時間圖。圖5是以兩種不同宿主(保加利亞乳桿菌和大腸桿菌)發酵製得的蛭弧菌製劑對 類馬鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌的裂解能力_時間圖。圖6是以兩種不同宿主(乳酸片球菌和嗜水氣單胞菌)發酵製得的蛭弧菌製劑對 乳房鏈球菌和大腸桿菌的裂解能力_時間圖。圖7是以兩種不同宿主(乳酸鏈球菌和豬鏈球II型)發酵製得的蛭弧菌製劑對 豬霍亂沙門氏菌和表皮葡萄球菌的裂解能力_時間圖。圖8是以兩種不同宿主(屎腸球菌和大腸桿菌)發酵製得的蛭弧菌製劑對鼠傷寒 沙門氏菌和單核增生李斯特菌的裂解能力_時間圖。圖9是以兩種不同宿主(地衣芽孢桿菌和大腸桿菌)發酵製得的蛭弧菌製劑對嗜 水氣單胞菌和類馬鏈球菌的裂解能力_時間圖。圖10是以兩種不同宿主(嗜酸乳桿菌和大腸桿菌)發酵製得的蛭弧菌製劑對金 黃色葡萄球菌和豬霍亂沙門氏菌的裂解能力_時間圖。圖11是以兩種不同宿主(乾酪乳桿菌和嗜水氣單胞菌)發酵製得的蛭弧菌製劑 對類馬鏈球菌和大腸桿菌的裂解能力_時間圖。圖12是以兩種不同宿主(乳酸乳桿菌和豬鏈球II型)發酵製得的蛭弧菌製劑對 表皮葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的裂解能力_時間圖。圖13是以兩種不同宿主(植物乳桿菌和豬霍亂沙門氏菌)發酵製得的蛭弧菌制 劑對無乳鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌的裂解能力_時間圖。圖14是以兩種不同宿主(戊糖片球菌和大腸桿菌)發酵製得的蛭弧菌製劑對乳 房鏈球菌和鏈球菌II型的裂解能力-時間圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 於此。實施例1分別以枯草芽孢桿菌(菌種編號GIM 1. 136，來源於廣東省微生物菌種保藏中 心)和大腸桿菌(Escherichia coli，菌種編號GIM 1. 137，來源於廣東省微生物菌種保藏 中心)為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如下(1)枯草芽孢桿菌懸液的製備將枯草芽孢桿菌接種於營養肉湯培養基中(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉 5g，pH 7. 4士0. 2)，置於33°C搖床中培養18h，使其處於對數生長期，培養液在4°C條件 下，5000rpm離心25min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鈉鉀鹽緩衝液(濃度為 0. 2mol/L,pH 7. 6)，得到濃度為1019cfu/mL的枯草芽孢桿菌懸浮液，然後置於4°C冰箱中保存備用；同上方法，製備濃度為IO19CfuAiL的大腸桿菌懸液，置於4°C冰箱中保存備用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鈉鉀鹽緩衝液(濃度為0.2mol/L，pH 7.6)中加入步驟(1)製備的大 腸桿菌懸浮液，調整大腸桿菌的濃度為1012cfu/mL，再接入用常規方法(根據申請號為 200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具體 為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫培養箱中培 養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離自海水的蛭弧菌BDJ02(於 2008年1月14日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCCNO :M 208012)斑，然後將此培養液在30°C培養48h，再在4°C，5000rpm離心35min，保 留上清液棄去沉澱，然後將上清液在4°C，13000rpm離心30min，保留沉澱棄去上清液，沉澱 為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. 2mol/L、pH 7. 6的磷酸鈉鉀鹽緩衝液，調整蛭弧菌遊泳 體的濃度為108pfu/mL，得到蛭弧菌BDJ02遊泳體濃縮液，置於2°C冰箱保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備在DNB液體培養基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質量為DNB液體培養基體積的 2.5%，裝入發酵罐，1211滅菌20min，得到發酵培養基；在30°C的發酵培養基中加入步驟
(1)製備的枯草芽孢桿菌懸浮液和步驟(2)製備的蛭弧菌BDJ02遊泳體濃縮液，發酵培養基 中的枯草芽孢桿菌的起始濃度為1012cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進行發酵；發 酵各參數條件如下溫度控制在28°C ；加入枯草芽孢桿菌懸浮液和蛭弧菌遊泳體濃縮液的 發酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 6 ；設置攪拌轉速與溶氧聯動，使溶氧水平控制 在28% ；培養過程中加兩次枯草芽孢桿菌懸浮液，每次加入枯草芽孢桿菌懸浮液的間隔時 間15h，每次加入枯草芽孢桿菌懸浮液的量以新加入的枯草芽孢桿菌在發酵培養基中的濃 度為IO12CfuAiL為準，發酵培養48h即製成濃度為1 X 109pfU/mL的蛭弧菌製劑A。同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的大腸桿菌懸浮液和步驟
(2)製備的蛭弧菌BDJ02遊泳體濃縮液，製得濃度為1X 109pfU/mL的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等 致病菌均有很好的裂解效果。分別以對革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium，菌株編號GIM1. 237，來源於廣東省微生物菌種保藏中心)和對革蘭氏為陽 性的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，菌株編號GIM1. 142，來源於廣東省微生物 菌種保藏中心)的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩衝液，分別加入常規培 養方法得到鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的菌體沉澱，每種菌各有兩瓶。調節4瓶緩 衝液的菌體濃度一致(IO11CfuAiL)。在兩瓶含有鼠傷寒沙門氏菌的緩衝體系中，分別各加入 蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL;同樣，在兩瓶含有金黃色葡萄球菌的緩衝體系中， 分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B lmL，於30°C，200rpm的搖床上培養。在Oh、 6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h這九個時刻分別取樣，按10—1 10—11的稀釋倍數進行稀 釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板塗布，30°C條件下培養24h後，計算菌落數。實驗結果如圖1所示。從圖1可知，與用大腸桿菌發酵得到的蛭弧菌製劑B相比，用枯草芽孢杆 菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門氏菌有更強的裂解效果，而且對 革蘭氏為陽性的金黃色葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌製劑B好。另外，由枯草芽孢桿菌 製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接製成製劑，也可通過進一步的離心，製成單純的遊泳體、 蛭質體製劑。實施例2以納豆芽孢桿菌(菌種編號CGMCC 1. 1086，來源於中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心)和大腸桿菌為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如 下(1)納豆芽孢桿菌懸液的製備將納豆芽孢桿菌接種於營養肉湯培養基(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置於35°C搖床中培養15h，使其處於對數生長期，培養液在4°C條件下， 6000rpm離心25min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鈉鹽緩衝液(濃度為0. Imol/ L，pH 7. 4)，得到濃度為IO18CfuAiL的納豆芽孢桿菌懸浮液，然後置於2°C冰箱中保存備用；同上方法，製備濃度為IO18CfuAiL的大腸桿菌懸液，置於2°C冰箱中保存備用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鈉鹽緩衝液(濃度為0. lmol/L, pH 7.4)中加入步驟(1)製備的大腸 桿菌懸浮液，調整大腸桿菌的濃度為1013cfu/mL，再接入用常規方法(根據申請號為 200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具體 為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫培養箱中培 養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離自淡水的蛭弧菌BDF02(於 2008年1月13日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M208009)斑，然後將此培養液在30°C培養45h，再在4°C，6000rpm離心25min，保 留上清液棄去沉澱，然後將上清液在4°C，HOOOrpm離心28min，保留沉澱棄去上清液，沉澱 為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. lmol/L、pH 7. 4的磷酸鈉鹽緩衝液，調整蛭弧菌遊泳體 的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDF02遊泳體濃縮液，置於4°C冰箱保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備將DNB液體培養基裝入發酵罐，121°C滅菌20min，得到發酵培養基；在30°C的發 酵培養基中加入步驟(1)製備的納豆芽孢桿菌懸浮液和步驟(2)製備的蛭弧菌BDF02遊 泳體濃縮液，發酵培養基中的納豆芽孢桿菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為 102pfu/mL，進行發酵；發酵各參數條件如下溫度控制在29°C;加入納豆芽孢桿菌懸浮液和 蛭弧菌遊泳體濃縮液的發酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 4;設置攪拌轉速與溶氧 聯動，使溶氧水平控制在28% ；培養過程中加兩次納豆芽孢桿菌懸浮液，每次加入納豆芽孢 桿菌懸浮液的間隔時間16h，每次加入納豆芽孢桿菌懸浮液的量為以新加入的納豆芽孢杆 菌在發酵培養基中的濃度為IO13CfuAiL為準，發酵培養45h即製成濃度為lXliTpfu/mL的 蛭弧菌製劑A。
9
同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的大腸桿菌懸浮液和步驟 (2)製備的蛭弧菌BDF02遊泳體濃縮液，製得濃度為1 X 1010pfu/mL的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌等 致病菌都有很好的裂解效果。分別以對革蘭氏為陽性的單核增生李斯特菌(Listeria monocytohenes，菌株編號GIM1. 228，來源於廣東省微生物菌種保藏中心)的裂解和對革 蘭氏為陰性的豬霍亂沙門氏菌(Salmonella enterica，菌株編號GIM1. 244，來源於廣東省 微生物菌種保藏中心)的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩衝液中，分別 加入常規培養方法得到單核增生李斯特菌和豬霍亂沙門氏菌的菌體沉澱，每種菌各兩瓶， 調節4瓶緩衝液的菌體濃度一致(lCTcfu/mL)。在兩瓶含有單核增生李斯特菌的緩衝體系 中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL;同樣，在兩瓶含有豬霍亂沙門氏菌 的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B Im,於30°C，200rpm的搖床上 培養。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211這八個時刻分別取樣，按10-1 10,的稀釋倍 數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板塗布，30°C條件下培養24h後，計算菌落 數。實驗結果如圖2所示。從圖2可知，與用大腸桿菌發酵的蛭弧菌製劑B相比，用納豆芽 孢桿菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭氏為陰性的豬霍亂沙門氏菌有更強的裂解效果，而 且對革蘭氏為陽性的單核增生李斯特菌的裂解效果也比蛭弧菌製劑B更好。另外，由納豆 芽孢桿菌製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接製成製劑，也可通過進一步的離心，製成單純 的遊泳體、蛭質體製劑。實施例3分別以兩歧雙歧桿菌(菌種編號GIM 1. 169，來源於廣東省微生物菌種保藏中 心)和鼠傷寒沙門氏菌為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如下(1)兩歧雙歧桿菌懸液的製備將兩歧雙歧桿菌接種於PTYG培養基中，置於37°C搖床中培養24h，使其處於對數 生長期，培養液在8°C條件下，7000rpm離心20min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷 酸鉀鹽緩衝液(濃度為0. 3mol/L,pH 7. 5)，得到濃度為1022cfu/mL的兩歧雙歧桿菌懸浮液， 然後置於8°C冰箱中保存備用；同上方法，用營養肉湯培養基製備濃度為IO22CfuAiL的鼠傷寒沙門氏菌懸液，置 於8°C冰箱中保存備用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0. 3mol/L, pH 7. 5)中加入步驟(1)製備的鼠傷寒沙 門氏菌懸浮液，調整鼠傷寒沙門氏菌的濃度為101(lCfU/mL，再接入用常規方法(根據申請號 為200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具 體為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸 桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2， 瓊脂粉3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母 精提物0. lg，蒸餾水lOOOmL，pH7.2，瓊脂粉17g)中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫培 養箱中培養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離自土壤的蛭弧菌 BDS02 (於2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏 編號為CCTCC NO =M 209170)斑，然後將此培養液在30°C培養50h，再在8°C，7000rpm離心20min，保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在8°C，16000rpm離心20min，保留沉澱棄去上 清液，沉澱為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. 3mol/L、pH 7. 5的磷酸鉀鹽緩衝液，調整蛭弧 菌遊泳體的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDS02遊泳體濃縮液，置於15°C冰箱保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備在DNB液體培養基加入氯化鈉，氯化鈉的加入質量為DNB液體培養基體積的 0.7%，裝入發酵罐，121°C滅菌20min，得到發酵培養基；在30°C的發酵培養基中加入步驟 (1)製備的兩歧雙歧桿菌懸浮液和步驟(2)製備的蛭弧菌BDS02遊泳體濃縮液，發酵培養基 中的兩歧雙歧桿菌的起始濃度為1015cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為103pfu/mL，進行發酵；發 酵各參數條件如下溫度控制在30°C ；加入兩歧雙歧桿菌懸浮液和蛭弧菌遊泳體濃縮液的 發酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 2 ；設置攪拌轉速與溶氧聯動，使溶氧水平控制 在22% ；培養過程中加一次兩歧雙歧桿菌懸浮液，每次加入兩歧雙歧桿菌懸浮液的間隔時 間12h，每次加入兩歧雙歧桿菌懸浮液的量以新加入的兩歧雙歧桿菌在發酵培養基中的濃 度為1015Cfu/mL為準，發酵培養36h即製成濃度為5X IO11PfuAiL的蛭弧菌製劑A。同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的鼠傷寒沙門氏菌懸浮液和 步驟(2)製備的蛭弧菌BDS02遊泳體濃縮液，製得濃度為5 X IO11PfuAiL的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對乳房鏈球菌、沙門氏菌、豬鏈球菌等致病菌 均有裂解效果。分別以對革蘭氏為陰性的豬鏈球菌II型(Str印tococcus suis，菌株編 號CVCC 3306，來源於國家獸醫微生物菌種保藏中心)和對革蘭氏為陽性的乳房鏈球菌 (Streptococcus uberis，菌株編號700407，來源於上海三踏科技有限公司)的裂解為例。 配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩衝液中，分別加入常規培養方法得到豬鏈球菌II型 和乳房鏈球菌的菌體沉澱，每種菌各兩瓶，調節4瓶緩衝液的菌體濃度一致(IO11CfuAiL)。 在兩瓶含有豬鏈球菌II型的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL ；同樣，在兩瓶含有乳房鏈球菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌 製劑 B ImL,於 30°C，200rpm 的搖床上培養。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h 這九 個時刻分別取樣，按10—1 10—11的稀釋倍數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平 板塗布，30°C條件下培養24h後，計算菌落數。實驗結果如圖3所示。從圖3可知，與用鼠 傷寒沙門氏菌發酵的蛭弧菌製劑B相比，用兩歧雙歧桿菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭 氏為陰性的豬鏈球菌II型有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的乳房鏈球菌的裂解 效果也比蛭弧菌製劑B更好。另外，由兩歧雙歧桿菌製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接制 成製劑，也可通過進一步的離心，製成單純的遊泳體、蛭質體製劑。實施例4分別以糞腸球菌(Enterococcus faecal is，菌種編號CGMCC 1.131，來源於中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)和豬霍亂沙門氏菌為宿主菌製備蛭弧菌制 劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如下(1)糞腸球菌懸液的製備將糞腸球菌接種於營養肉湯培養基(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH 7. 4士0. 2)中，置於30°C搖床中培養24h，使其處於對數生長期，培養液在4°C條件下， 6000rpm離心20min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鈉鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 4)，得到濃度為102°cfu/mL的糞腸球菌懸浮液，然後置於2 4°C冰箱中保存備用；
11
同上方法，製備濃度為102°cfu/mL的豬霍亂沙門氏菌懸液，置於2 4°C冰箱中保 存備用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鈉鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/L, pH 7. 4)中加入步驟(1)製備的豬霍亂沙 門氏菌懸浮液，調整豬霍亂沙門氏菌的濃度為1012cfu/mL，再接入用常規方法(根據申請號 為200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具 體為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸 桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2， 瓊脂粉3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵 母精提物0. lg，蒸餾水lOOOmL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫 培養箱中培養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離自土壤的蛭弧 菌BDFM05(於2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心， 保藏編號為CCTCC NO =M 209172)斑，然後將此培養液在30°C培養38h，再在4°C，6000rpm 離心20min，保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在4°C，15000rpm離心22min，保留沉澱棄 去上清液，沉澱為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. 2mol/L、pH 7. 4的磷酸鈉鹽緩衝液，調整 蛭弧菌遊泳體的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDFM05遊泳體濃縮液，置於4°C冰箱保存備 用；(3)蛭弧菌製劑的製備在磷酸鈉鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/L,pH 7. 6)，裝入發酵罐，121°C滅菌20min，得 到發酵培養基；在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的糞腸球菌懸浮液和步驟(2)制 備的蛭弧菌BDFM05遊泳體濃縮液，發酵培養基中的糞腸球菌的起始濃度為1014cfu/mL，蛭 弧菌起始濃度為102pfu/mL，進行發酵；發酵各參數條件如下溫度控制在30°C;加入糞腸球 菌懸浮液和蛭弧菌遊泳體濃縮液的發酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 2 ；設置攪拌 轉速與溶氧聯動，使溶氧水平控制在30% ；培養過程中加兩次糞腸球菌懸浮液，每次加入糞 腸球菌懸浮液的間隔時間18h，每次加入糞腸球菌懸浮液的量以新加入的糞腸球菌在發酵 培養基中的濃度為IO14CfuAiL為準，發酵培養48h即製成濃度為5 X 1010pfu/mL的蛭弧菌制 劑A。同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的豬霍亂沙門氏菌懸浮液和 步驟(2)製備的蛭弧菌BDFM05遊泳體濃縮液，製得濃度為5X liTpfu/mL的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對大腸桿菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均 有裂解效果。分別以對革蘭氏為陽性的表皮葡萄球菌(Staphylococcus印idermidis，菌株 編號GIM1. 143，來源於廣東省微生物菌種保藏中心)和對革蘭氏為陰性的大腸桿菌的裂 解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩衝液中，分別各加入常規培養方法得到表皮 葡萄球菌和大腸桿菌的菌體沉澱，每種菌兩瓶，調節4瓶緩衝液的菌體濃度一致(IO12Cfu/ mL)。在兩瓶含有表皮葡萄球菌的緩衝體系中，分別加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL ；同樣，在兩瓶含有大腸桿菌的緩衝體系中，分別加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL，於 30°C，200rpm 的搖床上培養。在 Oh、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h 這九個時刻 分別取樣，按10—1 10_12的稀釋倍數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板塗布， 30°C條件下培養24h後，計算菌落數。實驗結果如圖4所示。從圖4可知，與用豬霍亂沙門氏菌發酵的蛭弧菌製劑B相比，用糞腸球菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭氏為陰性的大 腸桿菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制 劑B更好。另外，由糞腸球菌製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接製成製劑，也可通過進一步 的離心，製成單純的遊泳體、蛭質體製劑。實施例5分別以保加利亞乳桿菌(菌種編號GIM 1. 80，來源於廣東省微生物菌種保藏中 心)和大腸桿菌為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如下(1)保加利亞乳桿菌懸液的製備將保加利亞乳桿菌接種於營養肉湯培養基(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7.4 士 0.2)中，置於37°C搖床中培養20h，使其處於對數生長期，培養液在10°C條件下， 6000rpm離心25min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0. 3mol/ L，pH 7. 3)，得到濃度為IO17CfuAiL的保加利亞乳桿菌懸浮液，然後置於2 4°C冰箱中保 存備用；同上的方法，製備濃度為IO17CfuAiL的大腸桿菌懸液，置於2 4°C冰箱中保存備 用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0.3mol/L，pH 7.3)中加入步驟⑴製備的大腸 桿菌懸浮液，調整大腸桿菌的濃度為1013cfu/mL，再接入用常規方法(根據申請號為 200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具體 為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫培養箱中培 養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離自海水的蛭弧菌BDJ02(於 2008年1月14日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 208012)斑，然後將此培養液在30°C培養40h，再在10°C，6000rpm離心25min， 保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在15°C，15000rpm離心20min，保留沉澱棄去上清液， 沉澱為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. 3mol/L、pH 7. 3的磷酸鉀鹽緩衝液，調整蛭弧菌遊 泳體的濃度為108pfu/mL，得到蛭弧菌BDJ02遊泳體濃縮液，置於2°C冰箱保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備在蒸餾水中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質量為蒸餾水體積的2.8%，裝入發酵罐， 121°C滅菌20min，得到發酵培養基；在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的保加利亞 乳桿菌懸浮液和步驟(2)製備的蛭弧菌BDJ02遊泳體濃縮液，發酵培養基中的保加利亞乳 桿菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為10pfU/mL，進行發酵；發酵各參數條件如 下溫度控制在28°C ；加入保加利亞乳桿菌懸浮液和蛭弧菌遊泳體濃縮液的發酵培養基在 發酵過程中的PH值控制在7. 6 ；設置攪拌轉速與溶氧聯動，使溶氧水平控制在21% ；培養 過程中加2次保加利亞乳桿菌懸浮液，每次加入保加利亞乳桿菌懸浮液的間隔時間18h，每 次加入保加利亞乳桿菌懸浮液的量以新加入的保加利亞乳桿菌在發酵培養基中的濃度為 1013Cfu/mL為準，發酵培養40h即製成濃度為1 X IO11PfuAiL的蛭弧菌製劑A。
同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的大腸桿菌懸浮液和步驟 (2)製備的蛭弧菌BDJ02遊泳體濃縮液，製得濃度為1 X IOllPfuAiL的蛭弧菌製劑B。本製劑對氣單胞菌、沙門氏菌、類馬鏈球菌等致病菌都有很好的裂解效果。分別以 對革蘭氏為陽性的類馬鏈球菌(Str印tococcus equinus，菌株編號cvcc 1925，來源於國 家獸醫微生物菌種保藏中心)和對革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門氏菌的裂解為例。配備4瓶 各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩衝液中，分別各加入常規培養方法得到類馬鏈球菌和鼠傷寒 沙門氏菌的菌體沉澱，每種菌兩瓶，調節兩瓶緩衝液的菌體濃度一致(IO11CfuAiL)t5在兩瓶 含有類馬鏈球菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL;同樣， 在兩瓶含有鼠傷寒沙門氏菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL菌，於30°C，200rpm的搖床上培養。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h這八個時刻分 別取樣，按10—1 10,的稀釋倍數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板塗布， 30°C條件下培養24h後，計算菌落數。實驗結果如圖5所示。從圖5可知，與用大腸桿菌發 酵的蛭弧菌製劑B相比，用保加利亞乳桿菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭氏為陰性的鼠 傷寒沙門氏菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的類馬鏈球菌類馬鏈球菌裂解效果 也比蛭弧菌製劑B更好。另外，由保加利亞乳桿菌製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接製成 製劑，也可通過進一步的離心，製成單純的遊泳體、蛭質體製劑。實施例6分別以乳酸片球菌(菌種編號GIM 1. 263，來源於廣東省微生物菌種保藏中心) 和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，菌種編號GIM 1. 172，來源於廣東省微生物菌種 保藏中心)為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如下(1)乳酸片球菌懸液的製備將乳酸片球菌接種於營養肉湯培養基(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置於30°C搖床中培養18h，使其處於對數生長期，培養液在5°C條件下， 7000rpm離心15min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鈉鹽緩衝液(濃度為0. Imol/ L，pH 7. 4)，得到濃度為IO22CfuAiL的乳酸片球菌懸浮液，然後置於15°C冰箱中保存備用；同上方法，製備濃度為IO22CfuAiL的嗜水氣單胞菌懸液，置於15°C冰箱中保存備 用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鈉鹽緩衝液(濃度為0. lmol/L, pH 7. 4)中加入步驟(1)製備的嗜水氣單 胞菌懸浮液，調整嗜水氣單胞菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規方法(根據申請號為 200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具體 為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000!^4!17.2，瓊脂粉170中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫培養箱中培 養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離自淡水的蛭弧菌BDF03(於 2008年1月13日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 208010)斑，然後將此培養液在30°C培養54h，再在5°C，7000rpm離心20min， 保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在5°C，15000rpm離心25min，保留沉澱棄去上清液，沉
14澱為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. lmol/L、pH 7. 4的磷酸鈉鹽緩衝液，調整蛭弧菌遊泳 體的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDF03遊泳體濃縮液，置於10°C冰箱保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備將蒸餾水裝入發酵罐，121°C滅菌20min，得到發酵培養基；在30°C的發酵培養基 中加入步驟(1)製備的乳酸片球菌懸浮液和步驟(2)製備的蛭弧菌BDF03遊泳體濃縮液， 發酵培養基中的乳酸片球菌的起始濃度為1014cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為10pfU/mL，進行 發酵；發酵各參數條件如下溫度控制在30°C ；加入乳酸片球菌懸浮液和蛭弧菌遊泳體濃 縮液的發酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 4 ；設置攪拌轉速與溶氧聯動，使溶氧水 平控制在24% ；培養過程中加兩次乳酸片球菌懸浮液，每次加入乳酸片球菌懸浮液的間隔 時間15h，每次加入乳酸片球菌懸浮液的量以新加入的乳酸片球菌在發酵培養基中的濃度 為1014cfu/mL，發酵培養45h即製成濃度為5 X IO8的蛭弧菌製劑A。同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的嗜水氣單胞菌懸浮液和步 驟(2)製備的蛭弧菌BDF03遊泳體濃縮液，製得濃度為5 X IO8的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對大腸桿菌、沙門氏菌、乳房鏈球菌等致病菌都有 很好的裂解效果。分別以對乳房鏈球菌和大腸桿菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的 磷酸鈉鉀鹽緩衝液中，分別各加入常規培養方法得到乳房鏈球菌和大腸桿菌的菌體沉澱， 每種菌2瓶，調節4瓶緩衝液的菌體濃度一致(lCTcfu/mL)。在兩瓶含有乳房鏈球菌的緩衝 體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL;同樣，在兩瓶含有大腸桿菌的 緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL,於30°C，200rpm的搖床上 培養。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211、4811這九個時刻分別取樣，按10-1 10,的稀 釋倍數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板塗布，30°C條件下培養24h後，計算 菌落數。實驗結果如圖6所示。從圖6可知，與用嗜水氣單胞菌發酵的蛭弧菌製劑B相比， 用乳酸片球菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭氏為陰性的大腸桿菌有更強的裂解效果，而 且對革蘭氏為陽性的乳房鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌製劑B更好。另外，由乳酸片球菌 製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接製成製劑，也可通過進一步的離心，製成單純的遊泳體、 蛭質體製劑。實施例7分別以乳酸鏈球菌(菌種編號GIM 1. 156，來源於廣東省微生物菌種保藏中心) 和豬鏈球菌II型為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如下(1)乳酸鏈球菌懸液的製備將乳酸鏈球菌接種於營養肉湯培養基(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置於37°C搖床中培養18h，使其處於對數生長期，培養液在4°C條件下， 6000rpm離心27min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 5)，得到濃度為102°cfu/mL的乳酸鏈球菌懸浮液，然後置於4°C冰箱中保存備用；同上方法，製備濃度為102°cfu/mL的豬鏈球菌II型懸液，置於4°C冰箱中保存備 用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/L, pH 7. 5)中加入步驟(1)製備的豬鏈球菌 II型懸浮液，調整豬鏈球菌II型的濃度為1015cfU/mL，再接入用常規方法(根據申請號為
15200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具體 為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫培養箱中培 養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離土壤的蛭弧菌BDSM08(於 2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 209171)斑，然後將此培養液在30°C培養60h，再在4°C，6000rpm離心20min， 保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在4°C，16000rpm離心25min，保留沉澱棄去上清液，沉 澱為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸鉀鹽緩衝液，調整蛭弧菌遊泳 體的濃度為107pfu/mL，得到蛭弧菌BDSM08遊泳體濃縮液，置於4°C冰箱保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備在pH值為7. 2的DNB液體培養基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質量為DNB液體培 養基體積的1.5%，裝入發酵罐，121°C滅菌20min，得到發酵培養基；在30°C的發酵培養基 中加入步驟(1)製備的乳酸鏈球菌懸浮液和步驟(2)製備的蛭弧菌BDSM08遊泳體濃縮液， 發酵培養基中的乳酸鏈球菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進行 發酵；發酵各參數條件如下溫度控制在30°C ；加入乳酸鏈球菌懸浮液和蛭弧菌遊泳體濃 縮液的發酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 5 ；設置攪拌轉速與溶氧聯動，使溶氧水 平控制在27% ；培養過程中加2次乳酸鏈球菌懸浮液，每次加入乳酸鏈球菌懸浮液的間隔 時間14h，每次加入乳酸鏈球菌懸浮液的量以新加入的乳酸鏈球菌在發酵培養基中的濃度 為1013Cfu/mL為準，發酵培養42h即製成濃度為5 X 109pfu/mL的蛭弧菌製劑A。同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的豬鏈球菌II型懸浮液和步 驟(2)製備的蛭弧菌BDSM08遊泳體濃縮液，製得濃度為5 X 109pfu/mL的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均 有裂解效果。分別以對豬霍亂沙門氏菌和表皮葡萄球菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL 的磷酸鈉鉀鹽緩衝液中，分別各加入常規培養方法得到豬霍亂沙門氏菌和表皮葡萄球菌的 菌體沉澱，每種菌2瓶，調節4瓶緩衝液的菌體濃度一致(IOltlCfuAiL)。在兩瓶含有豬霍 亂沙門氏菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL;同樣，在兩 瓶含有表皮葡萄球菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B lmL，於 30°C,200rpm的搖床上培養。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h這九個時刻分別取 樣，按10—1 IO-"1的稀釋倍數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板塗布，30°C 條件下培養24h後，計算菌落數。實驗結果如圖7所示。從圖7可知，與用豬鏈球菌II型 發酵的蛭弧菌製劑B相比，用乳酸鏈球菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭氏為陰性的豬霍 亂沙門氏菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧 菌製劑B更好。另外，由乳酸鏈球菌製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接製成製劑，也可通過 進一步的離心，製成單純的遊泳體、蛭質體製劑。實施例8分別以屎腸球菌(菌種編號CGMCC 1. 2136，來源於中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心)和大腸桿菌為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如下(1)屎腸球菌懸液的製備將屎腸球菌接種於營養肉湯培養基(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH 7. 4士0. 2)中，置於32°C搖床中培養24h，使其處於對數生長期，培養液在4°C條件下， 5000rpm離心20min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 5)，得到濃度為IO18CfuAiL的屎腸球菌懸浮液，然後置於4°C冰箱中保存備用；同上方法，製備濃度為IO18CfuAiL的大腸桿菌懸液，置於4°C冰箱中保存備用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0.2mol/L，pH 7.5)中加入步驟⑴製備的大腸 桿菌懸浮液，調整大腸桿菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規方法(根據申請號為 200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具體 為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫培養箱中培 養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離自海水的蛭弧菌BDJ02(於 2008年1月14日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 208012)斑，然後將此培養液在30°C培養60h，再在4°C，6000rpm離心20min， 保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在4°C，16000rpm離心25min，保留沉澱棄去上清液，沉 澱為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸鉀鹽緩衝液，調整蛭弧菌遊泳 體的濃度為106pfu/mL，得到蛭弧菌BDJ02遊泳體濃縮液，置於4°C冰箱保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備在pH值為7. 2的DNB液體培養基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質量為DNB液體培 養基體積的2. 7%，裝入發酵罐，121°C滅菌20min，得到發酵培養基；在30°C的發酵培養基 中加入步驟⑴製備的屎腸球菌懸浮液和步驟⑵製備的蛭弧菌BDJ02遊泳體濃縮液，發 酵培養基中的屎腸球菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為103pfu/mL，進行發酵； 發酵各參數條件如下溫度控制在30°C ；加入屎腸球菌懸浮液和蛭弧菌遊泳體濃縮液的發 酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 3 ；設置攪拌轉速與溶氧聯動，使溶氧水平控制在 26% ；培養過程中加兩次屎腸球菌懸浮液，每次加入屎腸球菌懸浮液的間隔時間14h，每次 加入屎腸球菌懸浮液的量以新加入的屎腸球菌在發酵培養基中的濃度為IO13CfuAiL為準， 發酵培養42h即製成濃度為1 X 109pfU/mL的蛭弧菌製劑A。同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的大腸桿菌懸浮液和步驟 (2)製備的蛭弧菌BDJ02遊泳體濃縮液，製得濃度為1 X 109pfU/mL的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌等致病 菌均有裂解效果。分別以對單核增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的裂解為例。配備4瓶各 裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩衝液中，分別各加入常規培養方法得到單核增生李斯特菌和鼠 傷寒沙門氏菌的菌體沉澱，每種菌2瓶，調節4瓶緩衝液的菌體濃度一致(IO11CfuAiL)t5在 兩瓶含有單核增生李斯特菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL ；同樣，在兩瓶含有鼠傷寒沙門氏菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭
17弧菌製劑 B ImL,於 30°C，200rpm 的搖床上培養。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h 這八 個時刻分別取樣，按10—1 10—11的稀釋倍數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平 板塗布，30°C條件下培養24h後，計算菌落數。實驗結果如圖8所示。從圖8可知，與用大 腸桿菌發酵的蛭弧菌製劑B相比，用屎腸球菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭氏為陰性的 鼠傷寒沙門氏菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的單核增生李斯特菌的裂解效果 也比蛭弧菌製劑B更好。另外，由屎腸球菌製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接製成製劑，也 可通過進一步的離心，製成單純的遊泳體、蛭質體製劑。實施例9分別以地衣芽孢桿菌(菌種編號GIM1. 182，來源於廣東省微生物菌種保藏中心) 和大腸桿菌為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如下(1)地衣芽孢桿菌懸液的製備將地衣芽孢桿菌接種於營養肉湯培養基中(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉 5g，pH 7. 4士0. 2)，置於33°C搖床中培養18h，使其處於對數生長期，培養液在4°C條件 下，5000rpm離心25min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鈉鉀鹽緩衝液(濃度為 0. 2mol/L,pH 7. 6)，得到濃度為1019cfu/mL的地衣芽孢桿菌懸浮液，然後置於4°C冰箱中保 存備用；同上方法，製備濃度為IO19CfuAiL的大腸桿菌懸液，置於4°C冰箱中保存備用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鈉鉀鹽緩衝液(濃度為0.2mol/L，pH 7.6)中加入步驟⑴製備的大 腸桿菌懸浮液，調整大腸桿菌的濃度為1012cfu/mL，再接入用常規方法(根據申請號為 200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具體 為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫培養箱中培 養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離自海水的蛭弧菌BDMOl (於 2008年4月28日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCCNO :M 208066)斑，然後將此培養液在30°C培養48h，再在4°C，5000rpm離心30min，保 留上清液棄去沉澱，然後將上清液在4°C，13000rpm離心30min，保留沉澱棄去上清液，沉澱 為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. 2mol/L、pH 7. 6的磷酸鈉鉀鹽緩衝液，調整蛭弧菌遊泳 體的濃度為108pfu/mL，得到蛭弧菌BDMOl遊泳體濃縮液，置於4°C冰箱保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備在DNB液體培養基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質量為DNB液體培養基體積的 3.0%，裝入發酵罐，121°C滅菌20min，得到發酵培養基；在30°C的發酵培養基中加入步驟 (1)製備的地衣芽孢桿菌懸浮液和步驟(2)製備的蛭弧菌BDMOl遊泳體濃縮液，發酵培養基 中的地衣芽孢桿菌的起始濃度為1012cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進行發酵；發 酵各參數條件如下溫度控制在30°C ；加入地衣芽孢桿菌懸浮液和蛭弧菌遊泳體濃縮液的 發酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 2 ；設置攪拌轉速與溶氧聯動，使溶氧水平控制 在28% ；培養過程中加兩次地衣芽孢桿菌懸浮液，每次加入地衣芽孢桿菌懸浮液的間隔時
18間15h，每次加入地衣芽孢桿菌懸浮液的量以新加入的地衣芽孢桿菌在發酵培養基中的濃 度為IO12CfuAiL為準，發酵培養48h即製成濃度為1 X 1012pfU/mL的蛭弧菌製劑A。同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的大腸桿菌懸浮液和步驟 (2)製備的蛭弧菌BDMOl遊泳體濃縮液，製得濃度為1 X 1012pfU/mL的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌 均有很好的裂解效果。分別以對革蘭氏為陰性的嗜水氣單胞菌和對革蘭氏為陽性的類馬鏈 球菌(Sti^ptococcus equinus，菌株編號CVCC 1925，來源於國家獸醫微生物菌種保藏中 心)的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩衝液，分別加入常規培養方法得到 嗜水氣單胞菌和類馬鏈球菌的菌體沉澱，每種菌各有兩瓶。調節4瓶緩衝液的菌體濃度一 致(liTcfu/mL)。在兩瓶含有嗜水氣單胞菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和 蛭弧菌製劑B ImL ；同樣，在兩瓶含有類馬鏈球菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL 和蛭弧菌製劑 BlmL，於 30°C，200rpm 的搖床上培養。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、 42h、48h這九個時刻分別取樣，按10—1 10,的稀釋倍數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋 液分別進行平板塗布，30°C條件下培養24h後，計算菌落數。實驗結果如圖9所示。從圖9 可知，與用大腸桿菌發酵得到的蛭弧菌製劑B相比，用地衣芽孢桿菌發酵的蛭弧菌製劑A不 僅對革蘭氏為陰性的嗜水氣單胞菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的類馬鏈球菌 的裂解效果也比蛭弧菌製劑B好。另外，由地衣芽孢桿菌製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直 接製成製劑，也可通過進一步的離心，製成單純的遊泳體、蛭質體製劑。實施例10分別以嗜酸乳桿菌(菌種編號GIM1. 208，來源於廣東省微生物菌種保藏中心)和 大腸桿菌為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如下(1)嗜酸乳桿菌的製備將嗜酸乳桿菌接種於營養肉湯培養基(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置於32°C搖床中培養24h，使其處於對數生長期，培養液在4°C條件下， 5000rpm離心20min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 5)，得到濃度為IO17CfuAiL的嗜酸乳桿菌懸浮液，然後置於8°C冰箱中保存備用；同上方法，製備濃度為IO17CfuAiL的大腸桿菌懸液，置於8°C冰箱中保存備用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0.2mol/L，pH 7.5)中加入步驟⑴製備的大腸 桿菌懸浮液，調整大腸桿菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規方法(根據申請號為 200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具體 為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸杆 菌懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊 脂粉3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. 8g，酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母 精提物0. lg，蒸餾水lOOOmL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫培 養箱中培養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離自土壤的蛭弧菌 BDS02 (於2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏 編號為CCTCC NO =M 209170)斑，然後將此培養液在30°C培養60h，再在4°C，6000rpm離心 20min，保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在15°C，13000rpm離心20min，保留沉澱棄去上
19清液，沉澱為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸鉀鹽緩衝液，調整蛭弧 菌遊泳體的濃度為107pfu/mL，得到蛭弧菌BDS02遊泳體濃縮液，置於6°C冰箱保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備將pH值為7. 2的DNB液體培養基中裝入發酵罐，121°C滅菌20min，得到發酵培養 基；在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的嗜酸乳桿菌懸浮液和步驟(2)製備的蛭弧 菌BDS02遊泳體濃縮液，發酵培養基中的嗜酸乳桿菌的起始濃度為101(lCfU/mL，蛭弧菌起始 濃度為10pfU/mL，進行發酵；發酵各參數條件如下溫度控制在30°C ；加入嗜酸乳桿菌懸浮 液和蛭弧菌遊泳體濃縮液的發酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 5 ；設置攪拌轉速與 溶氧聯動，使溶氧水平控制在20% ；培養過程中加兩次嗜酸乳桿菌懸浮液，每次加入嗜酸乳 桿菌懸浮液的間隔時間14h，每次加入嗜酸乳桿菌懸浮液的量以新加入的嗜酸乳桿菌在發 酵培養基中的濃度為IO13CfuAiL為準，發酵培養42h即製成濃度為1 X 108pfU/mL的蛭弧菌 製劑A。同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的大腸桿菌懸浮液和步驟 (2)製備的蛭弧菌BDS02遊泳體濃縮液，製得濃度為1 X 108pfU/mL的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌 均有裂解效果。分別以對金黃色葡萄球菌和豬霍亂沙門氏菌的裂解為例。配備4瓶各裝有 50mL的磷酸鈉鉀鹽緩衝液中，分別各加入常規培養方法得到金黃色葡萄球菌和豬霍亂沙門 氏菌的菌體沉澱，每種菌2瓶，調節4瓶緩衝液的菌體濃度一致(IO11CfuAiL)t5在兩瓶含有 金黃色葡萄球菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL;同樣， 在兩瓶含有豬霍亂沙門氏菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B lmL，於30°C，200rpm的搖床上培養。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h這八個時刻分別 取樣，按10—1 10—11的稀釋倍數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板塗布，300C 條件下培養24h後，計算菌落數。實驗結果如圖11所示。從圖11可知，與用大腸桿菌發酵 的蛭弧菌製劑B相比，用嗜酸乳桿菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭氏為陰性的豬霍亂沙 門氏菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的金黃色葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌 製劑B更好。另外，由嗜酸乳桿菌製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接製成製劑，也可通過進 一步的離心，製成單純的遊泳體、蛭質體製劑。實施例11分別以乾酪乳桿菌(菌種編號GIM1. 159，來源於廣東省微生物菌種保藏中心)和 嗜水氣單胞菌為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如下(1)乾酪乳桿菌的製備將乾酪乳桿菌接種於營養肉湯培養基(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置於30°C搖床中培養18h，使其處於對數生長期，培養液在5°C條件下， SOOOrpm離心15min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鈉鹽緩衝液(濃度為0. Imol/ L，pH 7. 4)，得到濃度為IO22CfuAiL的乾酪乳桿菌懸浮液，然後置於15°C冰箱中保存備用；同上方法，製備濃度為IO22CfuAiL的嗜水氣單胞菌懸液，置於15°C冰箱中保存備 用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鈉鹽緩衝液(濃度為0. lmol/L, pH 7. 4)中加入步驟(1)製備的嗜水氣單胞菌懸浮液，調整嗜水氣單胞菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規方法(根據申請號為 200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具體 為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000!^4!17.2，瓊脂粉170中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫培養箱中培 養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離自淡水的蛭弧菌BDF02(於 2008年1月13日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 208009)斑，然後將此培養液在30°C培養54h，再在5°C，7000rpm離心20min， 保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在5°C，20000rpm離心15min，保留沉澱棄去上清液，沉 澱為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. lmol/L、pH 7. 4的磷酸鈉鹽緩衝液，調整蛭弧菌遊泳 體的濃度為107pfu/mL，得到蛭弧菌BDF02遊泳體濃縮液，置於2°C冰箱保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備將蒸餾水裝入發酵罐，121°C滅菌20min，得到發酵培養基；在30°C的發酵培養基 中加入步驟⑴製備的乾酪乳桿菌懸浮液和步驟⑵製備的蛭弧菌BDF02遊泳體濃縮液， 發酵培養基中的乾酪乳桿菌的起始濃度為1014cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為103pfu/mL，進行 發酵；發酵各參數條件如下溫度控制在29°C ；加入乾酪乳桿菌懸浮液和蛭弧菌遊泳體濃 縮液的發酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 2 ；設置攪拌轉速與溶氧聯動，使溶氧水 平控制在30% ；培養過程中加兩次乾酪乳桿菌懸浮液，每次加入乾酪乳桿菌懸浮液的間隔 時間15h，每次加入乾酪乳桿菌懸浮液的量以新加入的乾酪乳桿菌在發酵培養基中的濃度 為IO14CfuAiL為準，發酵培養45h即製成濃度為1 X 109pfU/mL的蛭弧菌製劑A。同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的嗜水氣單胞菌懸浮液和步 驟(2)製備的蛭弧菌BDF02遊泳體濃縮液，製得濃度為IX 109pfU/mL的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對大腸桿菌、沙門氏菌、類馬鏈球菌等致病菌都有 很好的裂解效果。分別以對類馬鏈球菌和大腸桿菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的 磷酸鈉鉀鹽緩衝液中，分別各加入常規培養方法得到類馬鏈球菌和大腸桿菌的菌體沉澱， 每種菌2瓶，調節4瓶緩衝液的菌體濃度一致(1012cfU/mL)。在兩瓶含有類馬鏈球菌的緩 衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL;同樣，在兩瓶含有大腸桿菌 的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL,於30°C，200rpm的搖床 上培養。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211這八個時刻分別取樣，按10-1 10_12的稀釋 倍數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板塗布，30°C條件下培養24h後，計算菌 落數。實驗結果如圖12所示。從圖12可知，與用嗜水氣單胞菌發酵的蛭弧菌製劑B相比， 用乾酪乳桿菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭氏為陰性的大腸桿菌有更強的裂解效果，而 且對革蘭氏為陽性的類馬鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌製劑B更好。另外，由乾酪乳桿菌 製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接製成製劑，也可通過進一步的離心，製成單純的遊泳體、 蛭質體製劑。實施例12分別以乳酸乳桿菌(菌種編號ATCC12315，來源於American Type Culture Collection)和豬鏈球菌II型為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如下
(1)乳酸乳桿菌懸液的製備將乳酸乳桿菌接種於營養肉湯培養基(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置於37°C搖床中培養18h，使其處於對數生長期，培養液在4°C條件下， 6000rpm離心20min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 5)，得到濃度為102°cfu/mL的乳酸乳桿菌懸浮液，然後置於4°C冰箱中保存備用；同上方法，製備濃度為102°cfu/mL的豬鏈球菌II型懸液，置於4°C冰箱中保存備 用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/L, pH 7. 5)中加入步驟(1)製備的豬鏈球菌 II型懸浮液，調整豬鏈球菌II型的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規方法(根據申請號為 200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具體 為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫培養箱中培 養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑。)培養出來的分離土壤的蛭弧菌BDSOl (於 2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 209169)斑，然後將此培養液在40°C培養20h，再在4°C，6000rpm離心20min， 保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在4°C，12000rpm離心40min，保留沉澱棄去上清液，沉 澱為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸鉀鹽緩衝液，調整蛭弧菌遊泳 體的濃度為108pfu/mL，得到蛭弧菌BDSOl遊泳體濃縮液，置於4°C冰箱保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備在pH值為7. 2的DNB液體培養基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質量為DNB液體培 養基體積的0. 5%，裝入發酵罐，121°C滅菌20min，得到發酵培養基；在30°C的發酵培養基 中加入步驟⑴製備的乳酸乳桿菌懸浮液和步驟⑵製備的蛭弧菌BDSOl遊泳體濃縮液， 發酵培養基中的乳酸乳桿菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進行 發酵；發酵各參數條件如下溫度控制在30°C ；加入乳酸乳桿菌懸浮液和蛭弧菌遊泳體濃 縮液的發酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 2 7. 6 ；設置攪拌轉速與溶氧聯動，使 溶氧水平控制在23% ；培養過程中加1次乳酸乳桿菌懸浮液，每次加入乳酸乳桿菌懸浮液 的間隔時間18h，每次加入乳酸乳桿菌懸浮液的量以新加入的乳酸乳桿菌在發酵培養基中 的濃度為IO13CfuAiL為準，發酵培養42h即製成濃度為5 X 109pfu/mL的蛭弧菌製劑A。同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的豬鏈球菌II型懸浮液和步 驟(2)製備的蛭弧菌BDSOl遊泳體濃縮液，製得濃度為5 X 109pfU/mL的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均 有裂解效果。分別以對嗜水氣單胞菌和表皮葡萄球菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL 的磷酸鈉鉀鹽緩衝液中，分別各加入常規培養方法得到嗜水氣單胞菌和表皮葡萄球菌的菌 體沉澱，每種菌2瓶，調節4瓶緩衝液的菌體濃度一致(IO11CfuAiL)tj在兩瓶含有嗜水氣單 胞菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL;同樣，在兩瓶含有 表皮葡萄球菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL,於30°C，200rpm的搖床上培養。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h這九個時刻分別取樣，按 ΙΟ"1 10—11的稀釋倍數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板塗布，30°C條件下 培養24h後，計算菌落數。實驗結果如圖13所示。從圖13可知，與用豬鏈球菌II型發酵 的蛭弧菌製劑B相比，用乳酸乳桿菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭氏為陰性的嗜水氣單 胞菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌製劑 B更好。另外，由乳酸乳桿菌製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接製成製劑，也可通過進一步 的離心，製成單純的遊泳體、蛭質體製劑。實施例13分別以植物乳桿菌(菌種編號GIM 1. 140，來源於廣東省微生物菌種保藏中心) 和豬霍亂沙門氏菌為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程如下(1)植物乳桿菌的製備將植物乳桿菌接種於營養肉湯培養基(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置於30°C搖床中培養24h，使其處於對數生長期，培養液在8°C條件下， 6000rpm離心20min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鈉鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 4)，得到濃度為102°cfu/mL的植物乳桿菌懸浮液，然後置於4°C冰箱中保存備用；同上方法，製備的濃度為102°cfu/mL豬霍亂沙門氏菌懸液，置於4°C冰箱中保存備 用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鈉鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/L, pH 7. 4)中加入步驟(1)製備的豬霍亂沙 門氏菌懸浮液，調整豬霍亂沙門氏菌的濃度為1012cfu/mL，再接入用常規方法(根據申請號 為200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具 體為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸 桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2， 瓊脂粉3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵 母精提物0. lg，蒸餾水lOOOmL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫 培養箱中培養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離自淡水的蛭弧 菌BDF01 (於2008年1月13日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心， 保藏編號為CCTCC NO =M 208008)斑，然後將此培養液在30°C培養20h，再在2°C，8000rpm 離心15min，保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在4°C，15000rpm離心22min，保留沉澱棄 去上清液，沉澱為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. 2mol/L、pH 7. 4的磷酸鈉鹽緩衝液，調整 蛭弧菌遊泳體的濃度為106pfu/mL，得到蛭弧菌BDF01遊泳體濃縮液，置於15°C冰箱保存備 用；(3)蛭弧菌製劑的製備在磷酸鈉鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/L，pH 7. 6)，裝入發酵罐，121°C滅菌20min，得 到發酵培養基；在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的植物乳桿菌懸浮液和步驟(2) 製備的蛭弧菌BDF01遊泳體濃縮液，發酵培養基中的植物乳桿菌的起始濃度為101(lCfU/mL， 蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進行發酵；發酵各參數條件如下溫度控制在30°C;加入植物 乳桿菌懸浮液和蛭弧菌遊泳體濃縮液的發酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 4;設置 攪拌轉速與溶氧聯動，使溶氧水平控制在30% ；培養過程中加兩次植物乳桿菌懸浮液，每次
23加入植物乳桿菌懸浮液的間隔時間18h，每次加入植物乳桿菌懸浮液的量以新加入的植物 乳桿菌在發酵培養基中的濃度為101QCfU/mL為準，發酵培養48h即製成濃度為5 X101Qpfu/ mL的蛭弧菌製劑A。同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的豬霍亂沙門氏菌懸浮液和 步驟(2)製備的蛭弧菌BDFOl遊泳體濃縮液，製得濃度為5 X IOuiPfuAiL的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對大腸桿菌、沙門氏菌、無乳鏈球菌等致病菌均有 裂解效果。分別以對無乳鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷 酸鈉鉀鹽緩衝液中，分別各加入常規培養方法得到無乳鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌的菌體沉 澱，每種菌兩瓶，調節4瓶緩衝液的菌體濃度一致(liTcfu/mL)。在兩瓶含有無乳鏈球菌的 緩衝體系中，分別加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL;同樣，在兩瓶含有鼠傷寒沙 門氏菌的緩衝體系中，分別加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL,於30°C，200rpm的 搖床上培養。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211這九八個時刻分別取樣，按10-1 IO-10 的稀釋倍數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板塗布，30°C條件下培養24h後， 計算菌落數。實驗結果如圖14所示。從圖14可知，與用豬霍亂沙門氏菌發酵的蛭弧菌制 劑B相比，用植物乳桿菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門氏菌有更 強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的無乳鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌製劑B更好。另 外，由植物乳桿菌製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接製成製劑，也可通過進一步的離心，制 成單純的遊泳體、蛭質體製劑。實施例14分別以戊糖片球菌(菌種編號CGMCC 1. 2695，來源於中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心)和大腸桿菌為宿主菌製備蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B，具體過程 如下(1)戊糖片球菌的製備將戊糖片球菌接種於營養肉湯培養基(蛋白腖10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置於32°C搖床中培養24h，使其處於對數生長期，培養液在4°C條件下， 5000rpm離心20min，保留沉澱棄去上清液，往沉澱中加入磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 5)，得到濃度為IO18CfuAiL的戊糖片球菌懸浮液，然後置於8°C冰箱中保存備用；同上方法，製備濃度為IO18CfuAiL的大腸桿菌懸液，置於8°C冰箱中保存備用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鉀鹽緩衝液(濃度為0.2mol/L，pH 7.5)中加入步驟⑴製備的大腸 桿菌懸浮液，調整大腸桿菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規方法(根據申請號為 200910042274. 6，名稱為「一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用」的專利申請，具體 為採用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌遊泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注於DNB下層平板(營養肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中並鋪平。將雙層平板置於28°C恆溫培養箱中培 養，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現噬菌斑)培養出來的分離自海水的蛭弧菌BDJOl (於 2008年1月14日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M208011)斑，然後將此培養液在30°C培養60h，再在8°C，5000rpm離心30min，保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在4°C，16000rpm離心25min，保留沉澱棄去上清液，沉澱 為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸鉀鹽緩衝液，調整蛭弧菌遊泳體 的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDJOl遊泳體濃縮液，置於4°C冰箱保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備在pH值為7. 2的DNB液體培養基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質量為DNB液體培 養基體積的2. 5%，裝入發酵罐，121°C滅菌20min，得到發酵培養基；在30°C的發酵培養基 中加入步驟⑴製備的戊糖片球菌懸浮液和步驟⑵製備的蛭弧菌BDJOl遊泳體濃縮液， 發酵培養基中的戊糖片球菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為103pfu/mL，進行 發酵；發酵各參數條件如下溫度控制在30°C ；加入戊糖片球菌懸浮液和蛭弧菌遊泳體濃 縮液的發酵培養基在發酵過程中的PH值控制在7. 6 ；設置攪拌轉速與溶氧聯動，使溶氧水 平控制在25% ；培養過程中加3次戊糖片球菌懸浮液，每次加入戊糖片球菌懸浮液的間隔 時間12h，每次加入戊糖片球菌懸浮液的量以新加入的戊糖片球菌在發酵培養基中的濃度 為IO13CfuAiL為準，發酵培養48h即製成濃度為1 X 109pfU/mL的蛭弧菌製劑A。同樣方法，在30°C的發酵培養基中加入步驟(1)製備的大腸桿菌懸浮液和步驟 (2)製備的蛭弧菌BDJOl遊泳體濃縮液，製得濃度為1 X 109pfU/mL的蛭弧菌製劑B。本蛭弧菌製劑A和蛭弧菌製劑B對乳房鏈球菌、沙門氏菌、豬鏈球菌II型等致病 菌均有裂解效果。分別以對乳房鏈球菌和豬鏈球菌II型的裂解為例。配備4瓶各裝有 50mL的磷酸鈉鉀鹽緩衝液中，分別各加入常規培養方法得到乳房鏈球菌和豬鏈球菌II型 的菌體沉澱，每種菌2瓶，調節4瓶緩衝液的菌體濃度一致(IOltlCfuAiL)。在兩瓶含有乳 房鏈球菌的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL;同樣，在兩瓶 含有豬鏈球菌II型的緩衝體系中，分別各加入蛭弧菌製劑A ImL和蛭弧菌製劑B ImL，於 30°C，200rpm的搖床上培養。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h這八個時刻分別取樣，按 ΙΟ"1 10,的稀釋倍數進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板塗布，30°C條件下 培養24h後，計算菌落數。實驗結果如圖15所示。從圖15可知，與用大腸桿菌發酵的蛭弧 菌製劑B相比，用戊糖片球菌發酵的蛭弧菌製劑A不僅對革蘭氏為陰性的豬鏈球菌II型有 更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的乳房鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌製劑B更好。 另外，由戊糖片球菌製得的蛭弧菌製劑A不僅可以直接製成製劑，也可通過進一步的離心， 製成單純的遊泳體、蛭質體製劑。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
一種蛭弧菌製劑的發酵方法，其特徵在於包括以下步驟(1)宿主菌懸液的製備將宿主菌培養至對數生長期，收集菌體，用磷酸鹽緩衝液調整濃度，得到濃度為1017～1022cfu/mL的宿主菌懸浮液，然後置於2～15℃中保存備用；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備在磷酸鹽緩衝液中加入步驟(1)製備的宿主菌懸浮液，調整宿主菌的濃度為1010～1015cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然後將此培養液在20～40℃培養20～60h，再在2～15℃，5000～8000rpm離心15～35min，保留上清液棄去沉澱，然後將上清液在2～15℃，12000～20000rpm離心15～40min，保留沉澱棄去上清液，沉澱為蛭弧菌遊泳體，在沉澱中加入磷酸鹽緩衝液調整蛭弧菌遊泳體的濃度為106～109pfu/mL，得到蛭弧菌遊泳體濃縮液，置於2～15℃保存備用；(3)蛭弧菌製劑的製備將氯化鈉溶於溶劑中形成質量體積比濃度為0～30g/L的氯化鈉溶液，滅菌，得到發酵培養基；在發酵培養基中加入步驟(1)製備的宿主菌懸浮液和步驟(2)製備的蛭弧菌遊泳體濃縮液，使宿主菌起始濃度為1010～1015cfu/mL，蛭弧菌遊泳體起始濃度為101～103pfu/mL，進行發酵；發酵溫度控制在28～30℃，pH值控制在7.2～7.6；設置攪拌轉速與溶氧聯動，使溶氧水平控制在20％～30％；發酵過程中加1～3次宿主菌懸浮液，每次加入宿主菌懸浮液的間隔時間12～18h，每次加入宿主菌懸浮液的量以新加入的宿主菌在發酵培養基中的濃度為1010～1015cfu/mL為準；發酵培養36～48h即製成蛭弧菌製劑；所述溶劑為DNB液體培養基、蒸餾水或磷酸鹽緩衝液。
2.根據權利要求1所述的一種蛭弧菌製劑的發酵方法，其特徵在於步驟(1)所述宿 主菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)、兩歧雙歧 桿菌(Bifidobacterium bifidum)、獎腸球菌(Enterococcus faecalis)、{呆;!j口禾亞杆 菌(Lactobacillus bulgaricus)、季L酸片王求菌(Pediococcusacidilactici) >lif (Streptococcus lactis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、植物乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum)或 戊糖片球菌(Pediococcus pentasaceus)；步驟(2)所述蛭弧菌為 BDF01、BDF02、BDF03、BDJ01、BDJ02、BDM01、BDS01、BDS02、 BDSM08 或 BDFM05。
3.根據權利要求2所述的一種蛭弧菌製劑的發酵方法，其特徵在於所述BDF01於 2008年1月13日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 208008 ；所述BDF02於2008年1月13日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國 典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208009 ；所述BDF03於2008年1月13日保 藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208010 ； 所述BDJ01於2008年1月14日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心， 保藏編號為CCTCC NO :M 208011 ；所述BDJ02於2008年1月14日保藏於中國武漢市武漢 大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208012 ；所述BDM01於2008 年4月28日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO :M 208066 ；所述BDS01於2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培 養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 209169 ；所述BDS02於2009年8月7日保藏於中 國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 209170;所述 BDSM08於2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏 編號為CCTCC NO :M 209171 ；所述BDFM05於2009年8月7日保藏於中國武漢市武漢大學 內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 209172。
4.根據權利要求1所述的一種蛭弧菌製劑的發酵方法，其特徵在於步驟(1)所述 收集菌體的方式為通過離心分離得到，離心條件為2 15°C，5000 8000rpm離心15 35min ；所述宿主菌懸浮液的濃度為1017 1022cfu/mL ；步驟(1) (3)任一項所述磷酸鹽 緩衝液的濃度為0. 1 0. 3mol/L, pH為7. 2 7. 6 ；步驟(2)所述蛭弧菌遊泳體濃縮液的 濃度為 108 1012pfu/mL。
5.根據權利要求1所述的一種蛭弧菌製劑的發酵方法，其特徵在於步驟(3)所述蛭 弧菌來源於鹹水環境時，所述溶劑為DNB液體培養基或蒸餾水，所述氯化鈉溶液的質量體 積比濃度為25 30g/L。
6.根據權利要求1所述的一種蛭弧菌製劑的發酵方法，其特徵在於步驟(3)所述蛭 弧菌來源於鹹淡水環境時，所述溶劑為DNB液體培養基或蒸餾水，所述氯化鈉溶液的質量 體積比濃度為5 10g/L。
7.根據權利要求1所述的一種蛭弧菌製劑的發酵方法，其特徵在於步驟(3)所述蛭 弧菌來源於淡水環境時，不加氯化鈉。
8.根據權利要求1所述的一種蛭弧菌製劑的發酵方法，其特徵在於步驟(3)所述滅 菌的條件為121°C滅菌20min ；所述蛭弧菌製劑的濃度為108 1012pfu/mL ；所述DNB液體培 養基是將營養肉湯0. 8g、酪蛋白酸水解物0. 5g和酵母精提物0. lg溶於1000mL蒸餾水中， 調節pH值至7. 2 7.6。
9.一種蛭弧菌製劑，由權利要求1 8任一項所述方法製備得到。
10.根據權利要求9所述的蛭弧菌製劑應用於製備防治病菌害藥物。
全文摘要
本發明公開了一種蛭弧菌製劑及其發酵方法和應用。發酵方法包括以下步驟(1)宿主菌懸液的製備；(2)蛭弧菌遊泳體濃縮液的製備；(3)蛭弧菌製劑的製備。本發明所述的發酵方法中採用的宿主菌均為有益的或對環境無害的革蘭氏陽性菌，既可以保持、甚至提高蛭弧菌裂解一些革蘭氏陰性菌的能力，用該方法製得的蛭弧菌製劑對致病菌的裂解能力有了一定的提高；所製得的蛭弧菌製劑又可以直接使用，無需經過更多的發酵後處理，該製劑的使用範圍也大大的增加。本發明在得到高濃度蛭弧菌菌液的同時，相對也縮短了發酵周期，這樣有效的解決了發酵時間過長而導致的能源消耗過大，生產成本過高的問題，得到的蛭弧菌製劑不僅成本低，而且活性高。
文檔編號A61K35/74GK101948784SQ20101027077
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者蔡俊鵬, 陳小紅 申請人:華南理工大學