一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的製備方法及應用與流程

2023-05-26 14:59:36

本發明屬於免疫分析和生物傳感技術領域，提供了一種負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯實現信號放大的免疫傳感器的製備方法及應用。

背景技術：

腫瘤標誌物的靈敏檢測，在臨床上對於腫瘤的早期發現，腫瘤高危人群的篩選、良性和惡性腫瘤的鑑別診斷、腫瘤發展程度的判斷，腫瘤的治療效果的觀察和評價及腫瘤復發和預後的預測產生極大的影響，引起人們的廣泛關注。

電化學免疫傳感器已經廣泛用於腫瘤標誌物的檢測，夾心型電化學免疫傳感器結合了高特異性的免疫分析技術和高靈敏的電化學分析技術，具有靈敏度高、製備簡單、檢測快速、成本低等優點，在臨床檢驗、環境監測、食品安全控制、生物監測等領域都有重要的應用價值。

本發明中使用的石墨烯是褶皺的二維平面薄膜，具有大的比表面積，良好的電子傳遞能力和催化性能，能有效吸附固載抗體。TaC納米片高溫還原在石墨烯表面，有效地避免了石墨烯片層的堆疊，TaC具有鉑族金屬的電子結構以及在費米能級上的相似性，具有和貴金屬類似的催化活性。此外，相對於過渡金屬氧化物（TMO）和過渡金屬硫化物（TMS），TaC在酸鹼環境中具有更高的穩定性。十面體的銀納米粒子（Ag DeNps）相對於銀納米微球，擁有更多的催化活性位點，但銀納米粒子的穩定性相對較差，均勻包覆的金納米粒子可以有效的提高銀納米粒子的穩定性。

技術實現要素：

本發明提供了一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的製備方法及應用，實現了對腫瘤標誌物的超靈敏檢測。

本發明的目的之一是提供一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的製備方法。

本發明的目的之二是將所製備的基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器應用於腫瘤標誌物的高靈敏、特異性檢測。

本發明的技術方案，包括以下步驟。

1. 一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的製備方法，步驟如下：

（1）將直徑為3 mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗乾淨；

（2）將上述電極置於質量分數為0.8% ~ 1.0%的HAuCl4溶液中，在-0.2V下掃描30s,在電極表面形成電沉積金基底，用超純水衝洗，晾乾；

（3）繼續將6 µL、10 ~ 15 µg/mL的腫瘤標誌物捕獲抗體滴加到電極表面，超純水衝洗，4℃冰箱中乾燥；

（4）繼續將3 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液滴加到電極表面，超純水衝洗電極表面，4 ℃冰箱中晾乾；

（5）滴加6 µL、0.0005 ~ 40 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標誌物抗原溶液，超純水衝洗電極表面，4℃冰箱中乾燥；

（6）將6 µL、3 ~ 5mg/mL的負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液，滴塗於電極表面上，置於4℃冰箱中晾乾，製得一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器。

2. 如權利要求1所述的一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的製備方法，所述金包覆十面體銀納米粒子的製備，步驟如下：

（1）十面體銀納米粒子溶液的製備

取13 ~ 15 mL的超純水加入到20 mL的燒杯中，依次緩慢加入0.05 mol/L 、0.5 mL檸檬酸鈉，0.05 mol/L、22.5 µL聚對苯乙烯磺酸鈉，0.05 mol/L、50µL精氨酸，0.05 mol/L、0.4mL硝酸銀，新配製的0.1mol/L 、0.1 ~ 0.3 mL硼氫化鈉，溶液由淡黃色變為亮黃色；600rpm條件下持續攪拌45 min，加入0.2 ~ 0.4 mL、30% H2O2，繼續攪拌30 min，生成的溶液置於藍色的LED燈光下13 ~ 15 h，製得十面體銀納米粒子的溶液，置於4℃冰箱中保存，備用；

（2）金包覆十面體銀納米粒子的製備

將新配置的質量分數為0.1%、1.0 ~ 2.0 mL氯金酸水溶液緩慢加入到3.0 mL的十面體銀納米粒子的溶液中，震蕩至溶液由黃色變為酒紅色，製得金包覆十面體銀納米粒子的溶液；

3. 如權利要求1所述的一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的製備方法，所述負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液的製備，步驟如下：

（1）負載TaC的石墨烯的製備

①石墨烯的製備

在冰水浴和攪拌條件下，將2.0 ~ 3.0g天然石墨粉緩緩地加入到45 ~ 60 mL濃硫酸中，持續攪拌15 ~ 25 min；邊攪拌邊依次加入10.0 ~ 15.0g KMnO4 和 5.0 ~ 7.5 g NaNO3，保持溶液溫度低於20℃，攪拌10 ~ 15 min，再升溫至40℃，持續攪拌30 ~ 40 min，加入50 ~ 75mL的超純水，將溶液置於油浴鍋中，95℃下加熱30 ~ 40 min；將200mL的超純水和10 ~ 15 mL、30% 的H2O2加入到上述溶液中，反應至溶液由黑褐色變為黃色，分別用1 mol/ L HCl和超純水洗滌三次；65℃真空乾燥12h備用；

②負載TaC的石墨烯的製備

將上述製備的0.1 ~ 0.2 g石墨烯分散在200 mL的超純水中，超聲2 h，加入0.05 ~ 0.1gK2TaF7繼續超聲30 ~ 50 min，將混合液置於油浴鍋中， 90℃下攪拌，蒸發掉大部分的水，直至變為凝膠狀；將凝膠狀液體置於表面皿中，在0℃下冷凍乾燥12~ 16 h，得到疏鬆多孔海綿狀固體產物，將所得固體在氬氣保護、1200℃下煅燒2h，得到負載TaC的石墨烯；

（2）負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的製備

取5~ 7mg 負載TaC的石墨烯加入到3.0 mL 金包覆十面體銀納米粒子的溶液中，超聲30min，形成負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯溶液，離心；分別用無水乙醇及超純水洗滌三次、30℃真空乾燥24h，得到負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯固體粉末；

（3）負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液的製備

將6 ~ 10 mg的負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯固體粉末溶於1 mL的pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液中，震蕩溶解，再加入100 μL、80 ~ 120 μg/mL的腫瘤標誌物檢測抗體溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液，4℃恆溫振蕩培養箱中振蕩，孵化12 h，製得負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液，4℃下保存備用。

4.如權利要求1所述的製備方法製備的一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器，用於腫瘤標誌物的檢測，檢測步驟如下：

（1）使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所製備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0 ~ 8.0磷酸鹽緩衝溶液中進行測試；

（2）用時間-電流法對分析物進行檢測，輸入電壓為-0.4 V，取樣間隔 0.1 s，運行時間400 s；

（3）當背景電流趨於穩定後，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH7.4的磷酸鹽緩衝溶液中注入10 μL、5 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。

上述所述腫瘤標誌物選自下列之一：CA199、CA125。

本發明所用原材料均可在化學試劑公司或生物製藥公司購買。

本發明的有益成果

（1）本發明使用了負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯納米複合材料，石墨烯有大的比表面積，可增加抗體的結合位點，石墨烯氧化得石墨烯，是親水性物質，在水中有優越的分散性，且羧基能與抗體上的氨基有效結合，TaC納米薄片在石墨烯片層上高溫還原能有效避免石墨烯片層的堆疊，TaC具有鉑族金屬的電子結構以及在費米能級上的相似性，具有和貴金屬類似的催化活性，能夠有效地提高對H2O2的催化性能。此外，相對於過渡金屬氧化物和過渡金屬硫化物，TaC在酸鹼環境中具有更高的穩定性。十面體的銀納米粒子相對於銀納米微球，擁有更多的催化活性位點，均勻包覆的金納米粒子可以有效的提高銀納米粒子的穩定性。

（2）採用負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯作為捕獲抗體標記物，石墨烯有極高的強度和良好的導電性，具有較高的穩定性，TaC納米薄片還原在石墨烯表面，由於TaC較高的催化活性，提高了對過氧化氫的催化作用。金包覆十面體銀納米粒子通過物理吸附作用負載在石墨烯表面，實現了電化學信號的多重放大，從而有效提高了構建的傳感器的靈敏度，降低了檢測限；

（3）一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器對腫瘤標誌物CA199的檢測，其線性範圍0.5 pg ~ 40 ng/mL，檢測限最低0.16 pg/mL，對腫瘤標誌物CA125的檢測，其線性範圍0.5 pg ~ 35 ng/mL，檢測限最低0.16 pg/mL表明一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器可以達到準確測定的目的。

具體實施方式

現將本發明通過具體實施方式進一步說明，但不限於此

實施例1一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的製備方法，步驟如下：

（1）將直徑為3 mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗乾淨；

（2）將上述電極置於質量分數為0.8%的HAuCl4溶液中，在-0.2V下掃描30s,在電極表面形成電沉積金基底，用超純水衝洗，晾乾；

（3）繼續將6 µL、10 µg/mL的腫瘤標誌物捕獲抗體滴加到電極表面，超純水衝洗，4℃冰箱中乾燥；

（4）繼續將3 µL、1.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液滴加到電極表面，超純水衝洗電極表面，4 ℃冰箱中晾乾；

（5）滴加6 µL、0.0005 ~ 40 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標誌物抗原溶液，超純水衝洗電極表面，4℃冰箱中乾燥；

（6）將6 µL、3 mg/mL的負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液，滴塗於電極表面上，置於4℃冰箱中晾乾，製得一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器。

實施例2一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的製備方法，步驟如下：

（1）將直徑為3 mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗乾淨；

（2）將上述電極置於質量分數為0.9%的HAuCl4溶液中，在-0.2V下掃描30s,在電極表面形成電沉積金基底，用超純水衝洗，晾乾；

（3）繼續將6 µL、12 µg/mL的腫瘤標誌物捕獲抗體滴加到電極表面，超純水衝洗，4℃冰箱中乾燥；

（4）繼續將3 µL、2.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液滴加到電極表面，超純水衝洗電極表面，4 ℃冰箱中晾乾；

（5）滴加6 µL、0.0005 ~ 40 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標誌物抗原溶液，超純水衝洗電極表面，4℃冰箱中乾燥；

（6）將6 µL、4 mg/mL的負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液，滴塗於電極表面上，置於4℃冰箱中晾乾，製得一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器。

實施例3一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器的製備方法，步驟如下：

（1）將直徑為3 mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗乾淨；

（2）將上述電極置於質量分數為1.0%的HAuCl4溶液中，在-0.2V下掃描30s,在電極表面形成電沉積金基底，用超純水衝洗，晾乾；

（3）繼續將6 µL、15 µg/mL的腫瘤標誌物捕獲抗體滴加到電極表面，超純水衝洗，4℃冰箱中乾燥；

（4）繼續將3 µL、3.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液滴加到電極表面，超純水衝洗電極表面，4 ℃冰箱中晾乾；

（5）滴加6 µL、0.0005 ~ 40 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標誌物抗原溶液，超純水衝洗電極表面，4℃冰箱中乾燥；

（6）將6 µL、5 mg/mL的負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液，滴塗於電極表面上，置於4℃冰箱中晾乾，製得一種基於負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的免疫傳感器。

實施例4所述金包覆十面體銀納米粒子的製備，步驟如下：

（1）十面體銀納米粒子溶液的製備

取13 mL的超純水加入到20 mL的燒杯中，依次緩慢加入0.05 mol/L 、0.5 mL檸檬酸鈉，0.05 mol/L、22.5 µL聚對苯乙烯磺酸鈉，0.05 mol/L、50µL精氨酸，0.05 mol/L、0.4mL硝酸銀，新配製的0.1mol/L 、0.1 mL硼氫化鈉，溶液由淡黃色變為亮黃色；600rpm條件下持續攪拌45 min，加入0.2 mL、30% H2O2，繼續攪拌30 min，生成的溶液置於藍色的LED燈光下13 h，製得十面體銀納米粒子的溶液，置於4℃冰箱中保存，備用；

（2）金包覆十面體銀納米粒子的製備

將新配置的質量分數為0.1%、1.0 mL氯金酸水溶液緩慢加入到3.0 mL的十面體銀納米粒子的溶液中，震蕩至溶液由黃色變為酒紅色，製得金包覆十面體銀納米粒子的溶液。

實施例5所述金包覆十面體銀納米粒子的製備，步驟如下：

（1）十面體銀納米粒子溶液的製備

取14 mL的超純水加入到20 mL的燒杯中，依次緩慢加入0.05 mol/L 、0.5 mL檸檬酸鈉，0.05 mol/L、22.5 µL聚對苯乙烯磺酸鈉，0.05 mol/L、50µL精氨酸，0.05 mol/L、0.4mL硝酸銀，新配製的0.1mol/L 、0.2 mL硼氫化鈉，溶液由淡黃色變為亮黃色；600rpm條件下持續攪拌45 min，加入0.3 mL、30% H2O2，繼續攪拌30 min，生成的溶液置於藍色的LED燈光下14 h，製得十面體銀納米粒子的溶液，置於4℃冰箱中保存，備用；

（2）金包覆十面體銀納米粒子的製備

將新配置的質量分數為0.1%、1.5 mL氯金酸水溶液緩慢加入到3.0 mL的十面體銀納米粒子的溶液中，震蕩至溶液由黃色變為酒紅色，製得金包覆十面體銀納米粒子的溶液。

實施例6所述金包覆十面體銀納米粒子的製備，步驟如下：

（1）十面體銀納米粒子溶液的製備

取15 mL的超純水加入到20 mL的燒杯中，依次緩慢加入0.05 mol/L 、0.5 mL檸檬酸鈉，0.05 mol/L、22.5 µL聚對苯乙烯磺酸鈉，0.05 mol/L、50µL精氨酸，0.05 mol/L、0.4mL硝酸銀，新配製的0.1mol/L 、0.3 mL硼氫化鈉，溶液由淡黃色變為亮黃色；600rpm條件下持續攪拌45 min，加入0.4 mL、30% H2O2，繼續攪拌30 min，生成的溶液置於藍色的LED燈光下15 h，製得十面體銀納米粒子的溶液，置於4℃冰箱中保存，備用；

（2）金包覆十面體銀納米粒子的製備

將新配置的質量分數為0.1%、2.0 mL氯金酸水溶液緩慢加入到3.0 mL的十面體銀納米粒子的溶液中，震蕩至溶液由黃色變為酒紅色，製得金包覆十面體銀納米粒子的溶液。

實施例7所述負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液的製備，步驟如下：

（1）負載TaC的石墨烯的製備

①石墨烯的製備

在冰水浴和攪拌條件下，將2.0 g天然石墨粉緩緩地加入到45 mL濃硫酸中，持續攪拌15 min；邊攪拌邊依次加入10.0 g KMnO4 和 5.0 g NaNO3，保持溶液溫度低於20℃，攪拌10 min，再升溫至40℃，持續攪拌30 min，加入50 mL的超純水，將溶液置於油浴鍋中，95℃下加熱30 min；將200mL的超純水和10 mL、30% 的H2O2加入到上述溶液中，反應至溶液由黑褐色變為黃色，分別用1 mol/ L HCl和超純水洗滌三次；65℃真空乾燥12 h備用；

②負載TaC的石墨烯的製備

將上述製備的0.1 g石墨烯分散在200 mL的超純水中，超聲2 h，加入0.05g K2TaF7繼續超聲30 min，將混合液置於油浴鍋中， 90℃下攪拌，蒸發掉大部分的水，直至變為凝膠狀；將凝膠狀液體置於表面皿中，在0℃下冷凍乾燥12 h，得到疏鬆多孔海綿狀固體產物，將所得固體在氬氣保護、1200℃下煅燒2 h，得到負載TaC的石墨烯；

（2）負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的製備

取5 mg 負載TaC的石墨烯加入到3.0 mL 金包覆十面體銀納米粒子的溶液中，超聲30 min，形成負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯溶液，離心；分別用無水乙醇及超純水洗滌三次、30℃真空乾燥24 h，得到負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯固體粉末；

（3）負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液的製備

將6 mg的負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯固體粉末溶於1 mL的pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液中，震蕩溶解，再加入100 μL、80 μg/mL的腫瘤標誌物檢測抗體溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液，4℃恆溫振蕩培養箱中振蕩，孵化12 h，製得負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液，4℃下保存備用。

實施例8所述負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液的製備，步驟如下：

（1）負載TaC的石墨烯的製備

①石墨烯的製備

在冰水浴和攪拌條件下，將2.5 g天然石墨粉緩緩地加入到55 mL濃硫酸中，持續攪拌20 min；邊攪拌邊依次加入12.5 g KMnO4 和 6.0 g NaNO3，保持溶液溫度低於20℃，攪拌13 min，再升溫至40℃，持續攪拌35 min，加入65 mL的超純水，將溶液置於油浴鍋中，95℃下加熱35 min；將200mL的超純水和12.5 mL、30% 的H2O2加入到上述溶液中，反應至溶液由黑褐色變為黃色，分別用1 mol/ L HCl和超純水洗滌三次；65℃真空乾燥12h備用；

②負載TaC的石墨烯的製備

將上述製備的0.15 g石墨烯分散在200 mL的超純水中，超聲2 h，加入0.075 g K2TaF7繼續超聲40 min，將混合液置於油浴鍋中， 90℃下攪拌，蒸發掉大部分的水，直至變為凝膠狀；將凝膠狀液體置於表面皿中，在0℃下冷凍乾燥14 h，得到疏鬆多孔海綿狀固體產物，將所得固體在氬氣保護、1200℃下煅燒2 h，得到負載TaC的石墨烯；

（2）負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的製備

取6 mg 負載TaC的石墨烯加入到3.0 mL 金包覆十面體銀納米粒子的溶液中，超聲30 min，形成負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯溶液，離心；分別用無水乙醇及超純水洗滌三次、30℃真空乾燥24 h，得到負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯固體粉末；

（3）負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液的製備

將8 mg的負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯固體粉末溶於1 mL的pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液中，震蕩溶解，再加入100 μL、100 μg/mL的腫瘤標誌物檢測抗體溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液，4℃恆溫振蕩培養箱中振蕩，孵化12 h，製得負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液，4℃下保存備用。

實施例9所述負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液的製備，步驟如下：

（1）負載TaC的石墨烯的製備

①石墨烯的製備

在冰水浴和攪拌條件下，將3.0 g天然石墨粉緩緩地加入到60 mL濃硫酸中，持續攪拌25 min；邊攪拌邊依次加入15.0g KMnO4 和 7.5 g NaNO3，保持溶液溫度低於20℃，攪拌15 min，再升溫至40℃，持續攪拌40 min，加入75mL的超純水，將溶液置於油浴鍋中，95℃下加熱40 min；將200mL的超純水和15 mL、30% 的H2O2加入到上述溶液中，反應至溶液由黑褐色變為黃色，分別用1 mol/ L HCl和超純水洗滌三次；65℃真空乾燥12 h備用；

②負載TaC的石墨烯的製備

將上述製備的0.2 g石墨烯分散在200 mL的超純水中，超聲2 h，加入0.1 g K2TaF7繼續超聲50 min，將混合液置於油浴鍋中， 90℃下攪拌，蒸發掉大部分的水，直至變為凝膠狀；將凝膠狀液體置於表面皿中，在0℃下冷凍乾燥16 h，得到疏鬆多孔海綿狀固體產物，將所得固體在氬氣保護、1200℃下煅燒2 h，得到負載TaC的石墨烯；

（2）負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的製備

取7 mg 負載TaC的石墨烯加入到3.0 mL 金包覆十面體銀納米粒子的溶液中，超聲30min，形成負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯溶液，離心；分別用無水乙醇及超純水洗滌三次、30℃真空乾燥24h，得到負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯固體粉末；

（3）負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液的製備

將10 mg的負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯固體粉末溶於1 mL的pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液中，震蕩溶解，再加入100 μL、120 μg/mL的腫瘤標誌物檢測抗體溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液，4℃恆溫振蕩培養箱中振蕩，孵化12 h，製得負載TaC和金包覆十面體銀納米粒子的石墨烯的檢測抗體孵化物溶液，4℃下保存備用。

實施例10 腫瘤標誌物CA199的檢測

1）使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所製備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0 ~ 8.0磷酸鹽緩衝溶液中進行測試；

（2）用時間-電流法對分析物進行檢測，輸入電壓為-0.4 V，取樣間隔 0.1 s，運行時間400 s；

（3）當背景電流趨於穩定後，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH7.4的磷酸鹽緩衝溶液中注入10 μL、5 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化；

（4）根據所得電流與CA199濃度之間的線性關係，繪製工作曲線，測得線性範圍為0.5pg ~ 40 ng/mL，檢測限最低0.16 pg/mL。

實施例11腫瘤標誌物CA125的檢測

按照實施例10的方法對樣品中CA125進行檢測，其線性範圍為0.5 pg ~ 35 ng/mL，檢測限為0.16 pg/mL。