基於人類胚泡來源的幹細胞和祖細胞的新型毒性分析方法

2023-05-26 17:13:56

專利名稱：：基於人類胚泡來源的幹細胞和祖細胞的新型毒性分析方法基於人類胚泡來源的幹細胞和祖細胞的新型毒性分析方法
背景技術：
：人類胚泡來源的幹(hBS)細胞具有分化成所有三種胚層的衍生物的獨特能力。這種特點使得它們在毒理學領域中成為特殊的工具，因為它們可以作為功能性細胞的"細胞工廠"(MoonSY等，MolTher13(1):5-14,2006)。此外，在hBS細胞分化過程中相互作用的化合物的效應可以被檢測，使得它們在發育毒理學領域中特別具有價值。由於新的歐洲化學品政策(EuropeanChemicalsPolicy)(REACH)將在2007年生效，對於每年生產量或進口量超過1噸的3萬種以上的化學物質來說，需要它們的毒理學信息(Anon,2007)。因此，將可能額外使用大約390萬隻試驗動物，對工業界來說，花費估計為大約15億歐元，其中僅用於發育毒性研究的就佔32%(RPA,2002)。因此，對於體外發育毒性測試有緊迫的需求。此外，製藥工業面臨著高通量體外毒性測試的需求，因為在開發階段，新型藥物候選物的可靠毒理學數據必須儘可能早地產生。由於引入早期體外毒性篩選而使高的損耗率降低，將在經濟方面減少相關的花費。此外，已知有大量物質表現出顯著的種間差異，在人類中導致嚴重的畸變，但是在大鼠或小鼠中不明顯，例如用於治療嚴重痤瘡的13-順式視黃酸(異維甲酸)(Accutane,Roche)以及鎮靜劑和抗炎性藥物沙利度胺(Contergan)(Gilbert,2003)。因此，需要人類相關的發育毒性測試。到目前為止，最有希望的體外胚胎毒性測試之一是被批准的胚胎幹細胞測試(EST)，它使用了鼠類胚胎幹(mES)細胞來評估化學物質的胚胎毒性潛力。EST考慮到了mES細胞和鼠類成纖維細胞對胚胎毒性物質的不同敏感性。此外，mES細胞分化成功能性心肌細胞用作毒理學終點(Genschow,2004)。但是，EST的目的仍然在於在動物系統中預測人類毒性。在發育毒性測試中使用人類胚胎幹細胞可以提供可靠的，與人類相關的數據，增加了現有的毒性測試的價值，可用於藥物和化學物質的安全性評估。但是，在毒性測試中使用hBS細胞是一種挑戰，因為這些細胞需要複雜的操作技術。例如，hBS細胞需要以細胞聚集物而不是單一種細胞的形式接種以確保生長，並顯示出可變的與表面結合的能力，從而導致了高的差異。此外，hBS細胞的群體倍增時間是36小時，明顯長於mES細胞的12小時。小鼠和人類BS細胞的另一個重要的差別是它們的培養條件。為了將mES細胞維持在未分化狀態，在培養基中加入白血病抑制因子(LIF)就足夠了。但是對於hBSC細胞株來說，將它們培養在小鼠或人類飼養層上，顯示出是將細胞穩定地維持在未分化狀態的最可靠的方法。正在進行大量的工作以發現不需飼養細胞的培養系統，但這些研究都處於開發的早期階段(Stacey等，2006)。本發明闡述了基於hBS細胞的毒性分析方法，用於預測人類毒性，例如發育毒性和細胞毒性。本發明顯示出了明顯超過mES的優點，能夠提供與人類相關的數據，有助於鑑定人類致畸原，這些致畸原中的一些已知顯示出種間差異，例如13-順式視黃酸。這樣的毒性測試具有成為檢測與人類相關的發育毒性物質的測試策略的一部分的潛力。發明描述定H終"分析方法"或"多個分析方法"用於描述所進行的在基因，蛋白或功能水平上測量細胞毒性和/或發育毒性的體外測試。本文中使用的術語"胚泡來源的幹細胞"是指BS細胞，其人類形式被稱為"hBS細胞"或"hBSC"。本文中使用的術語"祖細胞"或"祖細胞類型的細胞"是指任何源自於hBS細胞的，處於未分化的hBS細胞和完全分化的細胞之間任何分化階段的細胞。術語"飼養細胞"或"詞養物"是指一種類型的細胞，它與另一種類型的細胞共培養，以提供使第二種類型的細胞能夠生長的環境。詞養細胞任選地可以來自與它們支持的細胞不同的物種。典型情況下，飼養細胞在與其它細胞共培養時，可以通過輻照或用抗有絲分裂劑例如絲裂黴素C處理進行失活，以防止它們長得比它們所支持的細胞快。不受上面描述的限制，這樣的飼養細胞的一種具體類型可以是人類詞養細胞，例如人類皮膚成纖維細胞，在本文中稱為hFF。在本發明的上下中，hFF也是成體(adult)細胞類型的例子。另一種飼養細胞類型可以是小鼠胚胎成纖維細胞(mEF)。對術語"物質"的解釋不打算限於治療藥劑(或潛在的治療藥劑)，或被證明具有毒性效應的試劑例如神經毒素，肝臟毒素，造血細胞毒素，肌肉毒素，致癌物，致畸物或針對一種或多種生殖器官的毒素。術語物質還可以是化學組合物，例如農業化學物例如農藥，殺真菌劑，肥料，或者也可以是在化妝品中使用的成分。本文文本中的術語"IC50"表示測試物質在體外導致50%的實驗細胞死亡時的濃度。"效率"或"有效的"，如果沒有特別定義，在本文的分析方法的語境中是指與現有技術中描述的方法或分析方法，例如基於小鼠胚胎幹細胞或小鼠癌細胞的分析方法相比，所述分析方法更可能檢測到在人類中有毒性的物質，和/或毒性濃度，例如可用時，所分析的相應的IC50值更接近已知人類體內數據。發剪銜述本發明涉及用於在人種中檢測和/或預測毒性的，基於人類胚泡來源的幹細胞的體外毒性分析方法，其中該分析方法能夠對物質的毒性進行新型檢測，和/或與非人類分析方法或基於成體人類細胞類型的分析方法相比能夠更有效地檢測毒性。本發明還涉及用於在人種中檢測和/或預測毒性的，基於人類胚泡來源的幹細胞衍生的人類祖細胞的體外毒性分析方法，其中該分析方法能夠對物質的毒性進行新型檢測，和/或與非人類分析方法或基於成體人類細胞類型的分析方法相比能夠更有效地檢測毒性。本發明的另一方面是用於在人種中檢測和/或預測毒性的，包含了選自人類胚泡來源的幹細胞，人類祖細胞和人類成體類細胞中的至少兩種人類細胞類型，例如至少三種，至少四種，至少五種人類細胞類型的體外毒性分析方法，其中該分析方法能夠對物質的毒性進行新型檢測，和/或與非人類分析方法或基於成體人類細胞類型的分析方法相比，能夠更有效地檢測毒性。具體來說，本發明的分析方法可以預測分化毒性例如，對胚胎細胞比對成體細胞更高程度的毒性。本發明的另一方面是用於在人種中檢測毒性的，基於人類胚泡來源的幹細胞的體外毒性分析方法，該分析方法與非人類分析方法相比，更有效地預測人類毒性，例如13-順式視黃酸(13CRA)的胚胎毒性。本發明的另一方面是用於在人種中檢測毒性的，基於從人類胚泡來源的幹細胞衍生的人類祖細胞，例如人類胚泡幹細胞衍生的間充質祖細胞(hBS-MPs)的體外毒性分析方法，該分析方法與成體人類細胞例如hEF相比，更有效地預測全反式視黃酸(ATRA)的人類毒性。本發明還涉及通過將人類胚泡來源的幹細胞的一個或多個群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法/分析方法，該方法包括下列步驟.-(i)將細胞接種在多孔板中(ii)將接種的細胞暴露於一種或多種濃度的一種/或多種物質(iii)分析細胞毒性和/或胚胎毒性終點。(iv)任選地，與已知的體內毒性數據相關聯。本發明還涉及通過將一個或多個人類祖細胞群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的其它的方法，該方法包括下列步驟(i)將細胞接種在多孔板中(ii)將接種的細胞暴露於一種或多種濃度的一種/或多種物質(iii)分析細胞毒性和/或胚胎毒性終點。(W)任選地，與己知的體內毒性數據相關聯。本發明還涉及通過將人類胚泡來源的幹細胞的一個或多個群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法/分析方法，該方法包括下列步驟(i)將人類胚泡來源的幹細胞接種到一個或多個多孔板的一個或多個孔中(ii)將成熟的人類細胞類型接種到(i)中多孔板的不同的孔中或接種到一個或多個不同板的一個或多個孔中(iii)任選地，將一個或多個從人類胚泡來源的幹細胞衍生的祖細胞群接種到(i)和/或(ii)中的多孔板的不同的孔中，和/或接種到一個或多個不同的多孔板的一個或多個孔中，條件是接種的密度使得細胞基本上維持其增殖能力，直到對暴露於細胞的一種或多種物質的一種或多種效應進行測量的時間點。本發明還涉及通過將人類胚泡來源的幹細胞的一個或多個群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法/分析方法，該方法包括下列步驟(i)將從人類胚泡來源的幹細胞衍生的一個或多個祖細胞群各接種到一個或多個多孔板中(ii)將成熟的人類細胞類型接種到(i)中多孔板的不同的孔中或接種到一個或多個不同的板中條件是接種的密度使得細胞能夠基本上維持其增殖能力，直到對暴露於細胞的一種或多種物質的一種或多種效應進行測量的時間點。本發明還涉及通過將人類胚泡來源的幹細胞的一個或多個群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法/分析方法，該方法包括下列步驟(i)將人類胚泡來源的幹細胞接種到一個或多個多孔板的一個或多個孔中(ii)將從人類胚泡來源的幹細胞衍生的一個或多個祖細胞群各接種到(i)中的一個或多個多孔板中，或接種到一個或多個不同的板中條件是接種的密度使得細胞基本上維持其增殖能力，直到對暴露於細胞的一種或多種物質的一種或多種效應進行測量的時間點。發窮拔述人類胚泡幹細胞為發育毒性測試提供了獨一無二的工具，因此，按照本發明，我們開發了基於hBS細胞的發育毒性測試，例如發育毒性分析方法和細胞毒性分析方法。作為概念的驗證，使用了代表三種不同的發育成熟程度的多能hBS細胞，hBS細胞來源的間充質祖細胞(hBSMPs)和人類包皮成纖維細胞(hFFs)，開發了帶有終點存活性的毒性分析方法。使用兩種不同的存活性分析方法，即ATP含量和刃天青(resazurin)(RES)還原，測試了一組具有眾所周知的體內數據的發育毒性物質，即全反式視黃酸(ATRA)和13-順式視黃酸(13CRA)。此夕卜，5-氟尿嘧啶(5-FU)被用作陽性對照，鄰磺醯苯醯亞胺(Saccharin)(糖精)被用作陰性對照。類視色素例如ATRA和13CRA主要用於治療癌症和皮膚病例如痤瘡或牛皮癬。類視色素誘導的畸形的特徵性形式包括顱面結構，包括中樞神經系統，肢體，胸腺和中軸骨骼的缺陷(Ross等，2000)。儘管ATRA和13CRA在人類中都是強致畸物，但它們在鼠類系統中的致畸能力是不同的(Nau等，2001)。與ATRA相比，13CRA在小鼠體內顯示出低得多的致畸能力，在鼠類畸胎癌(P19)細胞中顯示出較低的體外分化誘導能力(Adler等，2005;Soprano和Soprano1995)。因此，這些結構相關的物質被選擇用於挑戰我們的測試系統。抗癌症藥物5-FU在體內和體外都是發育毒性物質(Jacob等，1986)，關於人類中5-FU相關的出生缺陷也有獨立的報導(Stephens等，1980)。本發明的一個實施方案涉及基於hBS細胞，hBS細胞衍生的祖細胞和/或人類包皮成纖維細胞的細胞毒性測試，這些細胞代表了來自不同分化水平的細胞或其組合。該基於細胞毒性作為終點的測試有效檢測某些人類發育毒性物質，包括全反式視黃酸(ATRA)和13-順式視黃酸(13CRA)。這些物質在未分化的胚泡來源的幹細胞和祖細胞中顯示出較低的IC50值，相比而言在成體人類細胞中該值較高。本發明還涉及用於在人種中檢測和/或預測毒性的基於人類胚泡來源的幹細胞的體外毒性分析方法。該分析方法能夠對物質的毒性，特別是物質對胚胎細胞或正在發育的細胞的毒性進行新型檢測，和/或與非人類分析方法或基於成體人類細胞類型的分析方法相比，更有效地在人類中檢測和/或預測毒性。本發明還涉及用於在人種中檢測和/或預測毒性的，基於從胚泡來源的幹細胞衍生的人類祖細胞的體外毒性分析方法，其中該分析方法能夠對物質的毒性進行新型檢測，和/或與非人類分析方法或基於成體人類細胞類型的分析方法相比，能夠更有效地檢測和/或預測在人類中的毒性。本發明的祖細胞可以是介於hBS細胞和完全分化的細胞之間的任一祖細胞。本發明中的適合的祖細胞可以是中胚層，內胚層或外胚層細胞類型。祖細胞還可以是間充質祖細胞，成纖維細胞類祖細胞，心臟祖細胞，肝祖細胞，胰祖細胞或神經祖細胞。在本發明的具體實施方案中，祖細胞是人類胚泡幹細胞來源的間充質祖細胞(hBS-MPs)。IC50值的比較顯示出，hBS細胞和hBS來源的祖細胞與成體的成熟細胞類型例如hFF細胞相比，對毒性物質例如5-FU，ATRA和13CRA更敏感(參見圖3和4)。祖細胞代表了容易被培養的hBS來源的細胞類型，能夠通過酶法傳代進行較大規模的培養，同時仍然維持對有毒物質的較高的敏感性。本發明還涉及含有至少兩種人類細胞類型，例如至少三種，至少四種，至少五種人類細胞類型的分析方法。這些人類細胞類型可以選自hBS細胞，祖細胞和成體類細胞。成體類細胞可以源自於不同的人類組織，例如皮膚和肌肉。成體類細胞也可以源自於不同的發育階段，例如新生兒或成人。在本發明的具體實施方案中，所用的成體類細胞是來自新生男嬰的人類包皮成纖維細胞。本發明還涉及體外毒性分析方法，其中非人種的分析可以是任何非人類哺乳動物來源的分析，例如小鼠，大鼠或豬的分析。小鼠分析又可以舉例如基於小鼠胚胎千細胞的分析或基於小鼠畸胎瘤細胞的分析。作為本申請的參考系統的非人類分析方法，也可以是體內分析方法。這樣的體內分析方法可以是例如小鼠，大鼠，兔，豬或狗的動物模型。更具體來說，本發明涉及用於在人種中檢測和/或預測毒性的，基於人類胚泡來源的幹細胞的體外毒性分析方法，其中分析方法能夠對物質的毒性進行新型檢測，和/或與非人類分析方法相比，能夠更有效地檢測毒性，例如效率高至少50%，至少75%以上，或至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少30倍，至少50倍，至少75倍，至少100倍。在本發明的具體實施方案中，體外毒性分析方法與基於小鼠畸胎瘤細胞的非人類分析方法相比，檢測毒性的效率高123倍。同樣地，本發明涉及用於在人種中檢測和/或預測毒性的，基於人類胚泡來源的幹細胞的體外毒性分析方法，其中分析方法能夠對物質的毒性進行新型檢測，和/或更有效地檢測毒性，例如當比較hBS細胞和祖細胞時，檢測毒性，特別是對胚胎細胞的毒性的效率高至少1.5倍，至少4倍，至少10倍，當比較hBS細胞和成體類成纖維細胞時，檢測毒性的效率高至少2倍，例如至少4倍，至少10倍，當比較祖細胞和成體類成纖維細胞時，檢測毒性的效率高至少1.5倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍。此外，本發明的分析方法可以基於細胞毒性終點，例如測量存活率。用於這些終點的適合的檢測技術可以選自測量代謝活性包括ATP含量分析，MTT鹽分析和刃天青轉化。本發明的其它適合的終點可以選自胚胎毒性終點。可以在基因水平或蛋白水平上對生物分子的表達水平進行分析，例如RNA的基因組和蛋白質組測量，酶和抗體水平。也可以分析微型RNA水平。即測量細胞毒性又測量胚胎毒性的適合的方法可以是比色法(可見光顏色的可定量的變化)或螢光測定法(螢光的可定量的變化)。測量可以在多孔板讀出器中進行，其中幾個孔的內含物可以同時被分析。試驗被設計成可以擴大以用於中到高通量應用。用於檢測和定量測定毒性效應的另一種適合的方案可以在高含量讀出器(HighContentReader)中進行。在本發明的一個實施方案中，使用了有力的篩選技術高含量篩選(HCS)。HCS以一種允許對物質進行快速篩選的方式，擴展了鑑定和定量化合物對多種細胞事件的效應的能力。HCS允許在單一篩選平臺上同時進行多個測量。它可以多孔板樣品製備的通量自動執行與微觀研究有關的任務，例如數據捕獲和分析，同時能夠對特定的細胞事件進行定量。根據本發明，在發育毒性測試中，HSC能夠平行檢測對分化成所有三種胚層的影響，同時在相關的生物學系統中檢測同一個測試板中的細胞毒性。也可以使用HCS為研究毒性動力學和受影響的途徑提供有價值的工具，檢測物質對活細胞的時間依賴性的影響。在本發明的一個實施方案中，當在毒物學測試中使用hBSC時，細胞可能需要以小的聚集體形式接種，以便維持在增殖階段。這一般在毒性測試中將引起幹擾，因為可能發生一個孔與另一個孔中細胞數量的高度變化。使用HCS技術，有可能將測量的信號歸一化(normalize)到每個測試孔的細胞數量。在本發明的具體實施方案中，細胞毒性通過刃天青轉化來測量。在本發明的另一個實施方案中，細胞毒性通過ATP含量分析來測裡。本發明的另一個具體實施方案涉及用於在人種中檢測毒性的，基於人類胚泡來源的幹細胞的體外毒性分析方法，與非人類分析方法相比，能夠更有效地檢測13CRA的人類毒性。在本發明的另一個實施方案中，可以使用遺傳工程化的細胞株，例如未分化的hBS細胞株，hBS衍生的祖細胞類型或體細胞類hBS細胞，衍生的類型。這樣的工程化的細胞株可以是在發育相關啟動子控制之下表達螢光或其它標記物的報告物細胞株。此外，本發明涉及通過將一個或多個人類胚泡來源的幹細胞群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將細胞接種在多孔板中(ii)將接種的細胞暴露於一種或多種濃度的一種/或多種物質中(iii)分析細胞毒性和/或胚胎毒性終點。(iv)任選地，與已知的體內毒性數據相關聯。本發明還涉及通過將一個或多個人類胚泡來源的幹細胞群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法/分析方法，該方法包括下列步驟(i)將人類胚泡來源的幹細胞接種到一個或多個多孔板的一個或多個孔中(ii)將成熟的人類細胞類型接種到(i)中多孔板的不同的孔中或接種到一個或多個不同板的一個或多個孔中。(iii)任選地，將一個或多個從人類胚泡來源的幹細胞衍生的祖細胞群分別接種到(i)和/或(ii)中的多孔板的不同的孔中，或接種到一個或多個不同的多孔板的一個或多個孔中，條件是接種的密度使得細胞能夠基本上維持其增殖能力，直到對暴露於細胞的一種或多種物質的一種或多種效應進行測量的時間點。此外，本發明涉及通過將人類胚泡來源的幹細胞的一個或多個群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將從人類胚泡來源的幹細胞衍生的一個或多個祖細胞群各接種到一個或多個多孔板中(ii)將成熟的人類細胞類型接種到(i)中多孔板的不同的孔中或接種到一個或多個不同的板中條件是接種的密度使得細胞能夠基本上維持其增殖能力，直到對暴露於細胞的一種或多種物質的一種或多種效應進行測量的時間點。此外，本發明涉及通過將人類胚泡來源的幹細胞的一個或多個群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將人類胚泡來源的幹細胞接種到一個或多個多孔板的一個或多個孔中(ii)將從人類胚泡來源的幹細胞衍生的一個或多個祖細胞群各接種到(i)中的一個或多個多孔板中，或接種到一個或多個不同的板中條件是接種的密度使得細胞能夠基本上維持其增殖能力，直到對暴露於細胞的一種或多種物質的一種或多種效應進行測量的時間點。在該時間過程中，可以觀察到被接種的hBS來源的細胞分化成例如，來自所有胚層的祖細胞類型，例如心臟前體細胞，肝細胞類祖細胞和神經元祖細胞。本發明的另一個實施方案還涉及通過將一個或多個人類祖細胞群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將細胞接種在多孔板中(ii)將接種的細胞暴露於一種或多種濃度的一種/或多種物質中(iii)分析細胞毒性和/或胚胎毒性終點。(iv)任選地，與已知的體內毒性數據相關聯。分析可以在1536，384，96，48，24，12，6孔的多孔板中進行。在96孔板的情況下，在步驟(i)中接種的細胞的數量範圍為每個孔一個細胞到一百萬(M)個細胞，優選為1，000-100，000個細胞，更優選為10,000-30,000個細胞。任何步驟(i)中的板的孔還可以用蛋白，肽或細胞外基質成分預先/在後包被。步驟(ii)中細胞的暴露可以進行1分鐘到60天，優選為5分鐘到30天，l天到20天，更優選為5-15天。步驟(iii)中的毒性分析可以通過本文描述的任何適合的終點來進行。在步驟(iv)中，獲得的體外數據可以進一步與體內數據通過數學預測模型或算法進行比較。本發明的一個具體實施方案涉及通過將一個或多個人類胚泡來源的幹細胞群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將細胞接種在未包被的或包被的多孔組織培養皿中(ii)將接種的細胞暴露於幾種濃度的物質中10天(iii)通過測量ATP含量或刃天青轉化進行分析。另一方面，本發明涉及將本文描述的分析方法用於藥物開發和/或用於安全性評估研究。另一方面，本發明涉及將本文描述的分析方法用於胚胎毒性，致畸性研究，和/或用於評估通過歐洲REACH法規鑑定的物質。本發明還涉及用於如本文所述在人類中檢測毒性的試劑盒或使用本文描述的方法的試劑盒，該試劑盒包含(i)人類胚泡來源的幹細胞(ii)(任選的)陽性和陰性對照物質(iii)用戶手冊。本發明的試劑盒還可以包含選自祖細胞和成體類成纖維細胞的至少一種其它類型的人類細胞。本發明還涉及用於如上所述在人類中檢測毒性的試劑盒或使用如上所述的方法的試劑盒，該試劑盒包含(i)從人類胚泡來源的幹細胞衍生的祖細胞(ii)(任選的)陽性和陰性對照物質(iii)用戶手冊。本發明的一個實施方案是試劑盒，其中含有hBS或hBS細胞來源的細胞類型，該細胞類型任選地被遺傳工程化或任選地與胚層特異性抗體組合，並連同算法，例如用於定量檢測一組發育毒性相關終點以及常見細胞毒性終點的高含量篩選算法。圖1.通過在第IO天測量直接與活細胞數量成比例的細胞內ATP含量而確定的hBS細胞(A)，hBSMPs(B)和hFFs(C)的增殖曲線。對於hFFs和hBSMPs來說，進行了四個獨立的增殖試驗(n=4)，對於hBS細胞來說進行了兩個獨立的試驗(n=2)。誤差棒描述了平均值的標準誤差。圖2.在(a)第1天，(b)第4天，(c)第7天和(d)第10天監測到的96孔板中hBS細胞生長和分化的相差顯微鏡照片。在第0天時接種密度為60,000個細胞/孔。圖3.使用三種細胞類型hFFs，hBSMPs和hBS細胞獲得的陰性對照物質糖精(A，B)和陽性對照物質5-FU(C，D)的濃度響應曲線。數據通過測量每個孔的RES還原(A，C)和細胞內ATP含量(B，D)，並按照未處理的/溶劑對照進行歸一而獲得。所有實驗獨立進行三次(n=3)。誤差棒描述了平均值的標準誤差。誤差棒描述了平均值的標準誤差。所有實驗獨立進行三次。圖4.使用三種細胞類型hFFs，hBSMPs和hBS細胞獲得的物質ATRA(A，B)和13-CRA(C，D)的濃度響應曲線。數據通過測量每個孔的RES還原(A,C)和細胞內ATP含量(B，D)，並按照未處理的/溶劑對照進行歸一而獲得。所有實驗至少獨立進行三次(nX3)。誤差棒描述了平均值的標準誤差。對於ATRA和13-CRA來說，hBS細胞和祖細胞顯示出了比hEF更高的對毒性物質的敏感性。hBS和祖細胞之間的IC50比率是10000:1(ATRA)和4000:1(13-CRA)。在hBS細胞和hFF之間，IC50值超過1:4(ATRA)和超過1:6(13-CRA)。圖5a)顯示了使用ATP分析獲得的在暴露10天後未分化的hBS細胞中ATRA禾B13CRA的濃度響應曲線。ATRA和13CRA的IC50值分別為30.38pM和15.85pM。圖5b)顯示了使用ATP分析獲得的在暴露10天後hFFs中ATRA和13CRA(13-順式視黃酸)的劑量響應曲線。ATRA禾卩13CRA的IC50值分別為244.3和301.6pM。實施例實應激人A5S潘應，巡潘應浙W屍潘應遊潛蕎hBS細胞株SA002和SA002.5按照以前的描述確立和表徵(Heins等，2004，WO03055992)，並在NIH(http:〃stemcells.nih.gov/research/registry/cellartis.asp)禾B英國幹細胞庫Chttp:〃www.mrc.ac.uk/Utilities/Documentrecord/index.htmd=MRC003259)登記。細胞株被維持在絲裂黴素C失活的小鼠胚胎成纖維細胞(mEF)上，在添加有4ng/ml人類重組鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)(Invitrogen,Carlsbad，California)的VitroHESTM培養基中(Vitrolife，Kungsbacka,Sweden)。使用Swemed幹細胞工具(SwemedLabInternationalAB,Billdal，Sweden)通過機械解離每4-5天對未分化的hBS細胞進行傳代。通過將hBS細胞集落切成200x200)im的塊，並將塊放置在培養皿中，以在基於KO-DMEM，20%FCS，1%Glutamax，1%NEAA，1%PEST和0.1mM(3-巰基乙醇(都來自GibcoInitrogen)的培養基中聚集，來產生成纖維細胞類的祖細胞。經過4天的時間，漂浮的聚集物形成，然後以每個孔大約IO個聚集體的高密度鋪於用明膠包被的組織培養皿中。觀察到細胞的生長，並在第5-14天進一步將細胞解離，並在第一次傳代時按l:l拆分進行傳代。當培養物達到鋪滿時，一般將拆分比率設置為1:2。在聚集體鋪板後用於傳代培養的培養基包含不帶有丙酮酸鈉+glutamax的DMEM高葡萄糖培養基，10%FCS，4ng/mlbFBF和1%PEST。人類胚泡幹細胞來源的間充質祖細胞(hBS-MPs)通過使用下列方法從hBS細胞株SA002.5衍生來獲得，該方法包括下列步驟i)將未分化的hBS細胞鋪在表面上；ii)溫育2到21天，例如3到10天，優選7天，以允許分化；iii)酶法傳代到新型表面上；iv)重複步驟(iii)，直到獲得均勻的間充質形態；v)培養獲得的hBS-MP細胞。在毒性測試前，將hBS-MPs培養在Dulbecco's修改的Eagle's培養基中，其中添加有io%FCS(二者都來自GibcoInvitrogenCorporation,Paisley,Scotland)禾卩4ng/mlbFGF，每4天以1:10的拆分比率傳代培養。培養在T-25組織培養瓶上進行，使用胰蛋白酶(Invitorgen)進行傳代。具體來說，可擴增的hBSMPs從hBS細胞株SA002.5衍生而來。因此，使用TrypleSelectTM將hBS細胞酶法解離，並在含有添加了10%胎牛血清(FBS)和10ng/mlbFGF的DMEM培養基(都來自Invitrogen)中，以每平方釐米1.5x105個細胞的濃度鋪在用0.1%明膠包被的細胞培養皿上(BDFalcon/BDBiosciences,Bedford,MA,USA)。分化7天後，將hBS細胞作為單個細胞酶法傳代培養到新的明膠包被的培養皿中。該過程每7天重複一次，直到細胞群在形態上變得均勻。該細胞群的全部表徵作為另一項顯示出hBSMPs在形態學和標記物表達方面類似胚胎間充質(投送的稿件)細胞的研究的一部分進行。將hBSMPs培養在未包被的組織培養瓶中(BDFalcon,BDBiosciences)添加有10%FBS，50U/ml青黴素/鏈黴素和4ng/mlbFGF的DMEM中(都來自Invitrogen)，每4天以1:10的拆分比率進行傳代培養。人類包皮成纖維細胞(hFF)從美國典型培養物保藏中心(CRL-2429ATCC,Manassas，VA)獲得，培養在添加有10%FBS的Dulbecco's修改過的Eagle's培養基中，每4天以1:5的拆分比率進行傳代培養。培養在T-25組織培養瓶上進行，使用胰蛋白酶(Invitorgen)進行傳代。實雄2微為了確定在IO天的毒性試驗中每個孔中接種的最適細胞數量，進行了一組增殖試驗。接種的最適細胞數量必須在接種的細胞數量與在試驗的讀數天時的信號成比例的範圍內。將各三份hFFs，hBSMPs和hBS細胞以兩倍的連續稀釋率接種在明膠(Sigma)包被的96孔板中添加有10%FBS禾Q50U/ml青黴素/鏈黴素的DMEM中(都來自Invitrogen)，對於以單細胞懸浮液接種的hFF和hBSMPs來說，最高細胞密度為16,000個細胞/L，對於以50到100個細胞的聚集體接種的hBS細胞來說，最高細胞密度為60,000個細胞/L。在細胞接種後將帶有hBSC的板立即在400g離心5分鐘，以支持hBS細胞聚集體的可繁殖的附著。在第4天和第7天更換培養基。在第10天，使用CellTiterGlo試劑盒(Promega)按照製造商的說明書測量每個孔中的細胞內ATP含量。對於hFF和hBSMPs來說進行4次獨立的試驗，對於hBS細胞來說進行兩次獨立的試驗。此外，使用倒置顯微鏡(Nikon,Diisseldorf,Germany)每天監測hBS細胞的生長，直到第10天。在第1，4，7和10天使用數位相機(Nikon)照相。hBS細胞增殖試驗的結果(圖1A)顯示，在接種密度達到15,000個hBS細胞/孔的情況下，第10天時每個孔的細胞數量與第0天時接種的細胞數量成正比。在更高的接種密度時，曲線變平。hBSMPs細胞增殖試驗的結果(圖IB)表明，在接種密度達到500個hBSMPs/孔的情況下，第10天時每個孔的細胞數量與接種的細胞數量成正比。在更高的接種密度時，曲線變平，甚至從4000個細胞/孔向上，曲線開始下降。hFFs的曲線(圖1C)也顯示出在接種密度達到500個hFFs/孔的情況下，第IO天時的細胞數量與接種的細胞數量之間成正比，在更高的接種密度下曲線變平。但是，當接種密度從4000個細胞/孔向上時，曲線保持在平臺。在比較了這些結果之後，我們從圖的對數期中選擇了合適的接種細胞數，用於隨後的毒性測試，即hFFs為500個細胞/孔，hBSMPs為500個細胞/孔，hBS細胞為5000個細胞/孔。此外，使用相差顯微鏡對hBS細胞的生長進行了IO天的監測(圖2)。照片證實了接種的hBS細胞在IO天的時間內生長和分化成了各種不同的組織類結構。寬潘辨3.瓶媳毒絲#/試將hBS細胞群落分解成大約50到100個細胞的小聚集體，並以5000個細胞/孔的密度接種到明膠包被的96孔板(Nunc,Kamstrupvej,Denmark)中的lOOmL含有敲除DMEM培養基的測試培養基中，該培養基中添加了20%FBS，1%青黴素-鏈黴素，l%Glutamax，0.5mmol/1N-巰基乙醇和1%非必需胺基酸(都來自Invitrog印)。hBSMPs禾卩hFF細胞被解離成單細胞，以500個細胞/孔的密度接種到明膠包被的96孔板(Nunc)中的lOOmL測試培養基中。接種後直接將含有hBSC的板在400g離心5分鐘。祖細胞和hFF細胞被解離成單細胞，並接種到96孔板中的lOOpl測試培養基中。24小時後，通過在測試孔中加入lOOnl具有兩倍所需終濃度的濃度的毒性溶液，開始細胞毒性測試(第O天)。在分析的第4天和第7天更換毒性培養基，並在第IO天對板進行分析，測量不同的檢測方法的細胞毒性，艮P，使用P匪ega的CellTiterGlo試劑盒(P顧ega,Mannheim,Germany)按照製造商的說明書測量ATP含量，以及按照以前的描述(Evans等，2001)測量刃天青(Sigma，Stockholm,Sweden,CAS62758-13-8)還原成發螢光的Resofurin。兩個終點都使用多重檢測讀出器(FluostarOptima,BMGLabtech,Offenburg,Germany)進行分析，測量CellTiterGlo試劑盒的發光，以及對於刃天青分析來說在波長530nm(激發)和590nm(發射)處測量螢光。眾學激廣遊#/試浙統^學分#測試了下面的物質5-FU(Invivogen，Toulouse,France,CAS51-21-8)作為陽性對照，糖精鈉(Sigma,CAS128-44-9)作為陰性對照，ATRA(Sigma,CAS302-79-4)，13CRA(Sigma,CAS4759-48-2)。將糖精在PBS中稀釋到濃度為lg/ml，並分成等份試樣儲存在4°C。將ATRA和13CRA溶解在DMSO中，濃度為0.1M，分成等份試樣儲存在-20。C。將5-FU溶液(Invivogen)和DMSO直接稀釋在測試培養基中。所有化學物質都以3倍的連續稀釋度進行測試，最高濃度為5-FU為27MM，糖精為1mg/ml，ATRA和13CRA為100MM。對於ATRA和13CRA來說，連續稀釋在DMSO中進行，然後將稀釋液加入到測試培養基中以獲得最終測試濃度。這樣做是為了將所有被測試的ATRA和13CRA測試中的DMSO濃度維持在相等的0.1%。所有的實驗至少獨立地進行三次。IC50值通過將四參數的山丘函數(hillfunction)擬合於數據而獲得。所有細胞類型都與5-FU顯示出毒性反應，與糖精不顯示毒性反應(參見圖3)。IC50值的比較顯示出hBS細胞和祖細胞比hFF細胞對物質5-FU，ATRA和13CRA要敏感得多。祖細胞代表了容易培養的hBS細胞類型，能夠使用酶法傳代進行較大規模的培養，同時維持對毒性物質的較高敏感性。更重要的是，在未分化的hBS細胞上，ATRA的IC50值高於13CRA的IC50值，在ATP分析中分別為25.76pM和15.85pM(參見圖4)，在刃天青分析中分別為17.31pM和14.51pM。對於祖細胞來說，發現了同樣的結果，其中IC50值與hFF和hBS細胞相比急劇降低，ATRA為0.0027nM，13CRAS為0.0004pM，在刃天青分析中分別為0.0009nM和0.00002^M。以前報導的在基於多能畸胎瘤P19細胞的小鼠系統中相應的IC50值(Adler等，2005,Thedetectionofdifferentiation-inducingchemicalsbyusinggreenfluorescentproteinexpressioningeneticallyengineeredteratocarcinomacells(使用在遺傳工程化的畸胎瘤細胞中表達的綠色螢光蛋白檢測誘導分化的化學物質)，JtemJw/m.2005Apr;33(2):91-103;Adler的論文(http:〃w3.ub.uni-konstanz.de/vl3/volltexte/2005/1619〃pdf7Adler.pdf)分別為0.005和0.38pM，即小鼠系統不能以123的倍率檢測13CRA，[(IC50小鼠(13CRA)/(IC50小鼠(ATRA))等於76，艮卩0.38/0.005，而(IC50人類(13CRA)/(IC50人類(ATRA))等於0.62，艮卩15.85/25.76)。分別比較人類和小鼠的比率，0.62:76等於123倍)。表l:使用存活率作為人類胚胎幹(hBS)細胞，hBSMP和人類包皮成纖維細胞(hFFs)的終點獲得的測試化學物質的平均IC50值。測量的參數是ATP含量和刃天青還原成resofurin。所有的實驗至少獨立地進行三次(n>3)。tableseeoriginaldocumentpage28tableseeoriginaldocumentpage29兩種類型的測試細胞(hBS細胞和hFF)的IC50值的比較，顯示出hBS細胞比hFF細胞對物質5-FU，ATRA和13CRA敏感得多(對於ATRA和13CRA參見圖4-5)。多能hBS細胞比hFFs對ATRA和13CRA敏感得多。這些發現以前的結果相一致，這些結果通過測量存活性證實鼠類多能細胞比成纖維細胞培養物對已知的致畸物具有更高的敏感性(Laschinski等，1991)。此外，在我們的測試系統中，對於所有測試的細胞類型來說，13-CRA的IC50值總是比ATRA的低。在以前的基於多能鼠類細胞的體外致畸性測試分析中，13CRA顯示出比ATRA明顯低的細胞毒性和致畸性能力(Adler等，2005)。儘管在鼠類系統中13CRA沒有被分類成致畸物，但它在人類中是強的致畸物。因此，我們的結果表明基於人類細胞的測試系統具有超過基於動物細胞的分析方法的檢測人類發育毒性物質的優勢。對於兩種類型的細胞hBS細胞和hFF進行的ATRA和13CRA的ATP測量之間的比較也可以參見圖4。表2和3顯示分別使用ATP分析和刃天青分析測量到的IC50值之間的比率。表2:使用ATP分析方法測量到的IC50值之間的比率tableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30表3:使用刃天青分析方法測量到的IC50值之間的比率tableseeoriginaldocumentpage30兩種不同的終點存活率檢測方法，ATP分析方法和刃天青分析方法的統計學比較顯示在表4中。表4:兩種不同的終點存活率檢測方法的統計學比較。測量的參數是在人類包皮成纖維細胞(hFFs)，hBSMPs和人類胚胎幹(hBS)細胞中用化學物質處理後，每個孔中的細胞內ATP含量和刃天青還原。使用雙向ANOVA檢驗(***p<0.001;**p<0.01;*p<0.05)對濃度響應曲線之間的差異進行了統計學比較。實驗至少獨立進行三次(n23)。tableseeoriginaldocumentpage30在hBS細胞中使用兩種檢測方法獲得的結果的相似性可能是由於它們與hFFs和hBSMPs相比較低的增殖速度。此外，與其它類型的細胞相比，未分化的hBS細胞含有較少的線粒體，而在它們分化過程中線粒體的數量增加(Cho等，2006)。因此，較低的增殖速度以及較低的線粒體數量，為hBS細胞中ATP和RES分析之間差異不顯著，而這種差異在增殖速度高並含有更多線粒體的hFFs和hBSMPs中被擴大，提供了解釋。但是，兩種檢測技術提供的IC50值在同樣的濃度範圍內，因此都適合於測量存活率。實激賴4.嚴選一蘊激廣以務定嚴遊毒絲在多孔板形式的系統中使用hBS細胞或祖細胞或其組合對選定數量的測試化合物進行了測試。作為參比系統，選擇並分析了一組具有不同胚胎潛在影響能力的物質，例如6到10種物質。該組中含有的化學物質從無胚胎毒性，中等胚胎毒性到強胚胎毒性。此外，選擇了一種陰性(例如糖精)和一種陽性對照化合物(例如5-氟尿啼啶)。使用測試方案對參比和測試物質進行了分析，該方案中包含針對參與早期分化和分化成中胚層，內胚層和外胚層的蛋白的抗體，或在遺傳工程化的hBSC中由胚層特異性啟動子驅動的螢光蛋白的表達。正確的時間點對於分析來說是關鍵的，因此建立了選定的發育毒性終點的時間依賴性的表達。為了定量測試板中的螢光信號，使用了高含量讀出器(HighContentReader)。對於細胞毒性終點來說，評估描述了導致50%細胞死亡的化合物濃度的IC50值。從發育毒性終點計算出ID50值，它給出了導致所選標記物被下調50%時的物質的濃度。對這些值進行比較和評估。通過評估每種物質的IC50和ID50值之間的差異來評估化學物質的體外胚胎毒性。對於胚胎毒性物質來說，IC50值明顯高於ID50值。使用這些結果，對參比物質和測試物質的排序可用於與已知的體內數據進行比較。參考文獻AdlerS,PaparellaM,PellizzerC等，Thedetectionofdifferentiation-inducingchemicalsbyusinggreenfluorescentproteinexpressioningeneticallyengineeredteratocarcinomacells.(使用在遺傳工程化的畸胎瘤細胞中表達的綠色螢光蛋白檢測誘導分化的化學物質)Alternativestolaboratoryanimals:ATLA，2005;33(2):91-103.Anon.Regulation(EC)No1907/2006oftheEuropeanparliamentandofthecouncil.(歐洲議會和委員會法規No1907/2006)，歐洲共同體。可以從http:〃eurlex.europa.eu/LexUriServ/site/en/oi/2006/l396/139620061230en00010849.pdf獲得。2007年8月7日評估。ChoYM,KwonS，PakYK等，Dynamicchangesinmitochondrialbiogenesisandantioxidantenzymesduringthespontaneousdifferentiationofhumanembryonicstemcells.(在人類胚胎幹細胞自發分化期間線粒體生物發生和抗氧化劑酶的動態變化)，Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2006;348(4):1472-8.DeSessoJM，ScialliAR,GoeringerGL.Observationsonthehistopathogenesisof5-fluorouracildevelopmentaltoxicityinNewZealandwhiterabbitsanditsameliorationbyTTI,afunctionalanalogofonecarbonmetabolism.(紐西蘭白兔中5-氟尿嘧啶發育毒性的組織病理發生觀察及其被一碳代謝的功能類似物TTI的緩解)，Teratology，1995;51,172.EvansSM,CasartelliA，HerrerosE等，Developmentofahighthroughputinvitrotoxicityscreenpredictiveofhighacuteinvivotoxicpotential.(發展高通量體外毒性篩選來預測高度急性體內毒性可能性)，Toxicologyinvitro.2001;15(4-5):579-84.GenschowE,SpielmannH,ScholzG等，ValidationoftheembryonicstemcelltestintheinternationalECVAMvalidationstudyonthreeinvitroembryotoxicitytests.(在對三種體外胚胎毒性試驗的國際ECVAM證實研究中胚胎幹細胞試驗的證實)，Alternativestolaboratoryanimals:ATLA,2004;32(3):209-44.GilbertSF,DevelopmentalBiology.《發育生物學》，SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,Massachusetts,2003:750pp.GenschowE，SpielmannH,ScholzG等，ValidationoftheembryonicstemcelltestintheinternationalECVAMvalidationstudyonthreeinvitroembryotoxicitytests.(在對三種體外胚胎毒性試驗的國際ECVAM證實研究中胚胎幹細胞試驗的證實)，Alternativestolaboratoryanimals:ATLA，2004;32(3):209-44.HeinsN,EnglundMC,Sj6blomC,DahlU，TomiingA,BerghC,LindahlA,HansonC,SembH."Derivation,characterization,anddifferentiationofhumanembryonicstemcells".(人類胚胎幹細胞的衍生，表徵和分化)，StemCells2004;22:367-376.LaschinskiG,VogelR,SpielmannH.Cytotoxicitytestusingblastocyst-derivedeuploidembryonalstemcells:anewapproachtoinvitroteratogenesisscreening.(使用胚泡來源的整倍體胚胎幹細胞進行細胞毒性試驗體外畸胎生成篩選的新方法)，Reproductivetoxicology(Elmsford，N.Y.),1991;5(l):57-64.RossSA，McCafferyPJ,DragerUC等，Retinoidsinembryonaldevelopment,(胚胎發育中的類視色素)，Physiologicalreviews,2000,80(3):1021-54.RPAundStatisticsSweden.AssessmentoftheBusinessImpactofNewRegulationsintheChemicalsSector.(對新法規在化學品方面的商業影響的評估)最終報告。為歐洲委員會企業總董事會(EuropeanCommissionEnterpriseDirectorateGeneral)準備。London:RPA.2002;-216S.SopranoDR和SopranoKJ.Retinoidsasteratogens.(作為致畸物的類視色素)，Annualreviewofnutrition,1995;15:111-32.StaceyGN,CoboF,NietoA等，Thedevelopmentof'feeder'cellsforthepreparationofclinicalgradehEScelllines:challengesandsolutions.(開發"飼養"細胞用於製備臨床級hES細胞株挑戰和解決方法)，Journalofbiotechnology,2006;125(4):583-8.EpubStephensJD，GolbusMS,MillerTR等，Multiplecongenitalanomaliesinafetusexposedto5-fluorouracilduringthefirsttrimester.(在前三個月期間暴露於5-氟尿嘧啶的胎兒中的多種先天性異常)，Americanjournalofobstetricsandgynecology,1980;15;137(6):747-9.WO03055992,Amethodfortheestablishmentofapluripotenthumanblastocyst-derivedstemcellline,(建立多能人類胚泡來源的幹細胞株的方法)，CellartisAB.權利要求1.用於在人種中檢測和/或預測毒性的基於人類胚泡來源的幹細胞的體外毒性分析方法，其中該分析方法能夠對物質的毒性進行新型檢測，和/或與非人類分析方法或基於成體人類細胞類型的分析方法相比更有效地檢測毒性。2.用於在人種中檢測和/或預測毒性的基於從人類胚泡來源的幹細胞衍生的人類祖細胞的體外毒性分析方法，其中該分析方法能夠對物質的毒性進行新型檢測，和/或與非人類分析方法或基於成體人類細胞類型的分析方法相比更有效地檢測毒性。3.體外毒性分析方法，包括(i)將人類胚泡來源的幹細胞接種到一個或多個多孔板的一個或多個孔中(ii)將成熟的人類細胞類型接種到(i)中多孔板的不同的孔中或接種到一個或多個不同板的一個或多個孔中(iii)任選地，將一個或多個從人類胚泡來源的幹細胞衍生的祖細胞群分別接種到(i)和/或(ii)中的多孔板的不同的孔中，或接種到一個或多個不同的多孔板的一個或多個孔中，條件是接種的密度使得細胞基本上維持其增殖能力，直到對暴露於細胞的一種或多種物質的一種或多種效應進行測量的時間點。4.體外毒性分析方法，包括(i)將從人類胚泡來源的幹細胞衍生的一個或多個祖細胞群分別接種到一個或多個多孔板中(ii)將成熟的人類細胞類型接種到(i)中多孔板的不同的孔中或接種到一個或多個不同的板中條件是接種的密度使得細胞基本上維持其增殖能力，直到對暴露於細胞的一種或多種物質的一種或多種效應進行測量的時間點。5.體外毒性分析方法，包括(i)將人類胚泡來源的幹細胞接種到一個或多個多孔板的一個或多個孔中(ii)將從人類胚泡來源的幹細胞衍生的一個或多個祖細胞群分別接種到(i)中的一個或多個多孔板中，或接種到一個或多個不同的板中條件是接種的密度使得細胞基本上維持其增殖能力，直到對暴露於細胞的一種或多種物質的一種或多種效應進行測量的時間點。6.體外毒性分析方法，其特徵為(i)在多孔板中3,000-20,000個細胞/孔，更優選10,000-15,000個細胞/孔的人類胚泡來源的幹細胞，以及每個單獨的孔100-500個細胞，更優選每個單獨的孔大約250個細胞的從胚泡來源的幹細胞衍生的人類祖細胞(ii)將細胞暴露於一種或多種濃度的一種或多種物質(iii)從細胞毒性和/或胚胎毒性終點來分析效應。7.權利要求2-6的體外毒性分析方法，基於從胚泡來源的幹細胞衍生的人類祖細胞，諸如中胚層，內胚層或外胚層細胞類型，例如成纖維細胞，心肌細胞類祖細胞，肝和胰祖細胞，以及神經祖細胞。8.權利要求2-7的體外毒性分析方法，其中毒性是人類分化毒性(在發育中的人類細胞上測量的)，諸如人類胚胎毒性。9.用於在人種中檢測和/或預測毒性的，包含選自人類胚泡來源的幹細胞，人類祖細胞和人類成體類細胞中的至少兩種人類細胞類型，諸如至少三種，諸如至少四種，諸如至少五種人類細胞類型的體外毒性分析方法，其中該分析方法能夠對物質的毒性進行新型檢測，和/或與非人類分析方法或基於成體人類細胞類型的分析方法相比，更有效地檢測毒性。10.權利要求3-9的體外毒性分析方法，其中人類祖細胞是hBS-MPs。11.前述權利要求任一項的體外毒性分析方法，其中在1539，384，96，48，24，12或6孔板中所用細胞的數量範圍為每孔1到l，OOO,OOO個細胞，優選為1,000-100,000個細胞，優選為10,000-30,000個細胞，更優選為10,000-20，000個細胞。12.前述權利要求任一項的體外毒性分析方法，其中細胞與物質溫育的時間為1分鐘到60天，優選為1分鐘到30天，更優選為5-15天。13.前述權利要求任一項的體外毒性分析方法，其中細胞與物質溫育的時間為10天。14.前述權利要求任一項的體外毒性分析方法，其中非人類分析方法是體外分析方法，諸如使用選自小鼠胚胎幹細胞和小鼠畸胎瘤細胞的基於小鼠細胞的分析方法。15.權利要求1的體外分析方法，其中非人類分析方法是體內分析方法，諸如小鼠，大鼠或豬的體內分析方方。16.前述權利要求任一項的體外毒性分析方法，與非人類分析方法相比，檢測人類胚胎毒性的效率高至少兩倍。17.前述權利要求任一項的體外毒性分析方法，與非人類分析方法相比，檢測人類胚胎毒性的效率高至少ioo倍。18.前述權利要求任一項的體外毒性分析方法，與非人類分析方法相比，檢測人類胚胎毒性的效率高至少123倍。19.前述權利要求任一項的體外毒性分析方法，與人類成體類分析方法相比，檢測人類毒性的效率高至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少7倍，至少10倍。20.前述權利要求任一項的體外毒性分析方法，其中終點是細胞毒性。21.權利要求1-20的體外毒性分析方法，其中終點是胚胎毒性特異性的，諸如分析基因和/或蛋白表達。22.前述權利要求任一項的體外毒性分析方法，其中終點通過比色法或螢光測定法測量。23.前述權利要求任一項的體外毒性分析方法，其中毒性通過刃天青轉化目測。24.前述權利要求任一項的體外毒性分析方法，其中毒性通過ATP含量分析目測。25.用於在人種中檢測毒性的，基於人類胚泡來源的幹細胞的體外毒性分析方法，與非人類分析方法相比，更有效地檢測13CRA的人類毒性。26.通過將人類胚泡來源的幹細胞的一個或多個群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將細胞接種在多孔板中(ii)將接種的細胞暴露於一種或多種濃度的物質(iii)分析細胞毒性和/或胚胎毒性終點(iv)任選地，與已知的體內毒性數據相關聯。27.通過將一個或多個從胚泡來源的幹細胞衍生的人類祖細胞的群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將細胞接種在多孔板中(ii)將接種的細胞暴露於一種或多種濃度的物質(iii)分析細胞毒性和/或胚胎毒性終點(iv)任選地，與已知的體內毒性數據相關聯。28.通過將人類胚泡來源的幹細胞的一個或多個群暴露於物質，在人種中檢測和/或預測該物質的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將細胞接種在多孔板中(ii)將接種的細胞暴露於幾種濃度的物質(iii)通過測量ATP含量或刃天青轉化進行分析。29.篩選物質的方法，包括(a)獲得下列細胞的組合物(i)接種到一個或多個多孔板的一個或多個孔中的人類胚泡來源的幹細胞，和(ii)接種到(i)中的多孔板的不同的孔中，或接種到一個或多個不同的板的一個或多個孔中的成熟的人類細胞類型，以及任選的(iii)接種到(i)和/或(ii)中的多孔板的不同的孔中，或接種到一個或多個不同的多孔板的一個或多個孔中的從人類胚泡來源的幹細胞衍生的祖細胞群；以及(b)任選地使或允許細胞進行分化；(c)然後將細胞與一種和多種物質合併；以及(d)任選地使或允許細胞進行分化；(e)測定物質對細胞的任一效應。30.篩選物質的方法，包括i)獲得包含3,000-20,000個細胞/孔，更優選10，000-15,000個細胞/孔的人類胚泡來源的幹細胞的組合物；ii)任選地使或允許細胞進行分化；然後iii)將細胞與物質合併；以及iv)測定物質對細胞的任一效應。31.篩選物質的方法，包括a)獲得100-5,000個細胞更優選100-500個細胞/孔的從人類胚泡來源的幹細胞衍生的祖細胞的組合物；b)任選地使或允許細胞進行分化；然後iii)將細胞與物質合併；以及iv)測定物質對細胞的任一效應。32.權利要求1-25中描述的分析方法在藥物發現和/或安全性評估研究中的應用。33.權利要求1-25中描述的分析方法在胚胎毒性和/或致畸性研究中的應用。34.權利要求1-25中描述的分析方法在評估由歐洲REACH法規鑑定的物質中的應用。35.用於按照權利要求1-25檢測人類毒性或用於權利要求26-31描述的方法的試劑盒，該試劑盒含有(i)人類胚泡來源的幹細胞(ii)(任選的)陽性和陰性對照物質(iii)用戶手冊(iv)(任選的)培養基。36.權利要求35的試劑盒，該試劑盒還含有選自祖細胞和成體類細胞的至少一種其他的人類細胞類型。37.用於按照權利要求1-25檢測人類中的毒性或用於權利要求22-26描述的方法的試劑盒，該試劑盒含有(i)從人類胚泡來源的幹細胞衍生的祖細胞(ii)(任選的)陽性和陰性對照物質(iii)用戶手冊(iv)(任選的)培養基。全文摘要本發明涉及用於在人種中檢測毒性的，基於人類胚泡來源的幹細胞的體外毒性分析方法，該方法能夠在體外對物質對人類的毒性進行新型檢測，和/或與非人類分析方法相比能夠更有效地檢測對人類的毒性。本發明還可以對已知表現出種間差異，以及毒性效應不能通過小鼠中的毒理學測試檢測到的物質進行毒性檢測。文檔編號G01N33/50GK101622537SQ200780043757公開日2010年1月6日申請日期2007年10月2日優先權日2006年10月2日發明者薩拉·阿德勒,雷蒙德·施特雷爾申請人:塞拉帝思股份公司