蛋白的熱穩定化的製作方法

2023-06-24 16:14:16 2

專利名稱：：蛋白的熱穩定化的製作方法
技術領域：
：本申請一般地涉及抗古柯鹼治療。
背景技術：
：古柯鹼的濫用是棘手的社會和醫療問題，其難於通過藥物療法進行補救。古柯鹼阻斷單胺、多巴胺、去甲腎上腺素和血清素的重攝取，從而延長並增強這些神經遞質在中樞神經系統中的作用(BenOWitZ，1993)。古柯鹼毒性表現為驚厥和心臟功能障礙(例如，心肌梗死，心臟心律不齊，血壓增加，中風或壁間動脈瘤，和心肌需氧量增加)，這歸因於對神經遞質系統和心肌鈉通道阻斷的作用(BaumanandDiDomenico,2002；WilsonandShelat,2003；Knu印fer，2003)。因為古柯鹼具有輕易穿越血腦屏障的能力並且其作用廣泛分布於中樞和外周神經系統，過度劑量可能導致猝死(綜述參見BaumanandDiDomenico,2002)0儘管已經完全清楚古柯鹼的作用機制，但該信息還沒有促成開發出可在濫用和過度劑量情況下使用的有效的古柯鹼拮抗劑。古柯鹼快速和多效作用為急性古柯鹼毒性的治療提出了一個複雜的問題(CarrollandKuhar，1999)。現有的治療阿片樣物質濫用的兩類療法，拮抗法(例如，納曲酮)和替代法(例如，美沙酮)，與古柯鹼的情況不具有相似之處，儘管正在考慮對後者的嘗試(例如，Grabowskietal，2004)。一種方法是通過施用內源性酯酶、古柯鹼特異抗體或催化抗體來阻止或減少古柯鹼到達作用位點。天然存在的古柯鹼是通過血清丁醯膽鹼酯酶(BChE)水解苯甲醯酯產生無毒的芽子鹼甲酯和安息香酸。在肝臟中，羧酸酯酶hCE-2水解甲酯產生苯甲醯芽子鹼和甲醇。血液中古柯鹼的清除半衰期範圍為0.5到1.5小時(Inaba，1989)。曾經有數次嘗試使用天然存在的BChE或遺傳改造的BChE來增加古柯鹼降解(參見，例如，Carmonaetal，2000；Xieetal,1999；Sunetal,2002a；Sunetal,2002b；Duysenetal,2002；GaoandBrimijoinS,2004；Gaoetal，2005)。其他研究人員使用單克隆抗體Mab15A10作為古柯鹼的催化抗體(參見例如，Landryetal，1993；Metsetal，1998)，而其他人探究了古柯鹼疫苗的使用(參見例如，Kostenetal，2002)。古柯植物周圍土壤中固有的一種細菌，紅球菌屬物種MB1(Rhodococcussp.MB1)，已經進化出利用古柯鹼作為其唯一碳和氮源的能力。該細菌表達與BChE作用類似的古柯鹼酯酶(CocE)，其水解古柯鹼的苯甲醯酯，產生芽子鹼甲酯和安息香酸(圖1)(Bresleretal,2000；Turneretal,2002；Larsenetal，2002)。已經分離並克隆出CocE的基因(Bresleretal，2000)，CocE的晶體結構也已經被確定(Turneretal,2002；Larsenetal，2002)。純化的酶(MW65kDa)非常高效的催化古柯鹼，其Michaelis-Menten動力學kcal=7.2s-1和Km=640nM(Turneretal,2002；Larsenetal，2002)，幾乎比內源性酯酶大三個數量級，很可能，足夠快速的為服用古柯鹼過量的人解毒(Landryetal,1993；Metsetal，1998)。此外，酯酶還代謝乙基苯醯愛康因(cocaethylene)(古柯鹼和醇的潛在代謝產物)，幾乎與其代謝古柯鹼一樣有效(kcat=9.4s—1和Km=1600nM)(Turneretal，2002；Larsenetal，2002)o限制紅球菌屬CocE有效性的--個方面是其低熱穩定性-在37°C其t1/2為約15分在326鍾，而在4°C其t1/2>6個月(PCT專利申請PCT/US2007/015762，在此通過援引併入)CocE中針對熱穩定性進行遺傳改造，得到數種突變蛋白，其在37X的t1/2增加至最多-分鐘(上文)。還需要用於CocE的熱穩定化的其他方法和組合物。本發明解決所述需要。概述本發明人發現一些化合物熱穩定化(thermostabilize)野生型CocE，並且進一步熱穩定化CocE突變體(它們比野生型CocE的熱穩定性更高)。因此，本申請涉及包括古柯鹼酯酶(CocE)和化合物的組合物，其中所述化合物存在條件下的CocE比所述化合物不存在條件下的CocE更加熱穩定(thermostable)。本申請還涉及熱穩定化古柯鹼酯酶(CocE)的方法。所述方法包括將CocE與下列化合物組合本申請還涉及治療患有古柯鹼誘導狀況的哺乳動物的方法。所述方法包括以足以降低所述古柯鹼誘導狀況對哺乳動物的影響的方式給所述哺乳動物施用上述組合物。此外，本申請還涉及治療服用古柯鹼過量的哺乳動物的方法。所述方法包括以足以降低所述古柯鹼對哺乳動物的影響的方式給所述哺乳動物施用上述組合物。本申請進一步涉及治療患有古柯鹼依賴的哺乳動物的方法。所述方法包括以足以降低所述古柯鹼依賴對哺乳動物的影響的方式給所述哺乳動物施用上述組合物。此外，本申請涉及確定化合物是否是蛋白熱穩定劑(thermostabilizingagent)的方法。所述方法包括在有和沒有所述化合物的條件下檢測蛋白的熱穩定性。利用這些方法，使蛋白熱穩定性更高的化合物是該蛋白的熱穩定劑。本申請還涉及上述組合物在製備用於治療古柯鹼誘導狀況的藥物中的用途。本申請還涉及上述組合物用於治療古柯鹼誘導狀況的用途。還發現CocE突變體L169K/G173Q具有意料之外的高度熱穩定性。參見實施例5。因此，本申請還涉及編碼CocE多肽的分離的核酸，所述CocE多肽包括與SEQIDNO1的多肽具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，其中編碼的CocE多肽具有(a)取代L169K和G173Q，和(b)與野生型CocE相比，在37°C具有熱穩定性增加的酯酶活性。本申請還涉及包括與SEQIDNO1的多肽具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的CocE多肽，其中編碼的CocE多肽具有取代L169K和G173Q，以及與野生型CocE相比在37°C熱穩定性增加的酯酶活性。還提供位於藥學上可接受的載體中的包括所述多肽的組合物。在其他實施方案中，本申請涉及治療患有古柯鹼誘導狀況的哺乳動物的方法。所述方法包括以足以降低所述古柯鹼誘導狀況對哺乳動物的影響的方式給所述哺乳動物施用剛在上文描述的組合物。還提供所述組合物在製備用於治療古柯鹼誘導狀況的藥物中的用途，以及所述組合物用於治療古柯鹼誘導狀況的用途。附圖簡述圖1顯示紅球菌屬古柯鹼酯酶(CocE)催化的古柯鹼代謝。圖2是存在和不存在CocE的條件下古柯鹼隨時間變性的圖示。圖3顯示CocE催化的4-硝基苯基乙酸酯(4NPA)代謝以及存在和不存在CocE的條件下4NPA隨時間變性的圖示。圖4是非變性凝膠的照片，顯示在各種條件下溫育1小時後以及存在或不存在底物或產物的情況下CocE的聚集。圖5是存在各種濃度古柯鹼的條件下，4NPA切割期間對古柯鹼穩定化進行分光光度分析的圖示。圖6顯示CocE的安息香酸、芽子鹼甲酯或乙酸鈉穩定化作用的動力學分光光度分析。圖7顯示化學結構，酶促反應的示意圖，以及顯示苯基硼酸(PBA)對CocE熱穩定化作用的非變性凝膠的照片。圖8顯示CocE的安息香酸熱穩定化作用。圖9顯示針對熱穩定化CocE的能力對40種化合物進行篩選的結果，以及最有效化合物的化學結構。圖10顯示針對化合物6031818抑制CocE的能力進行研究的結果，以及該化合物的結構。圖11顯示使用4NPA或古柯鹼作為底物時，化合物6031818熱穩定化CocE的能力，以及該化合物的結構。圖12顯示針對化合物6169221抑制CocE的能力進行研究的結果，以及該化合物的結構。圖13顯示使用4NPA或古柯鹼作為底物時，化合物6169221熱穩定化CocE的能力，以及該化合物的結構。圖14顯示針對化合物5804236抑制CocE的能力進行研究的結果，以及該化合物的結構。圖15顯示使用4NPA或古柯鹼作為底物時，化合物5804236熱穩定化CocE的能力，以及該化合物的結構。圖16顯示通過圓二色性進一步表徵野生型CocE和突變體T172R的穩定性。圖17顯示通過圓二色性進一步表徵存在安息香酸或苯基硼酸條件下，野生型CocE的穩定性。圖18顯示通過圓二色性進一步表徵不存在或存在苯基硼酸條件下，CocE突變體L169K的穩定性。圖19顯示通過圓二色性進一步表徵存在或不存在化合物6031818條件下，野生型CocE的穩定性。圖20是非變性凝膠的照片，顯示存在各種小分子的條件下在37°C溫育各個時間點後野生型CocE和CocE突變體L169K的分析結果。圖21是顯示對圖20所示凝膠進行點光密度半衰期分析的結果的圖和表格。圖22是顯示古柯鹼酯酶結構的示意圖。欄A.古柯鹼酯酶由分開的3個不同結構域組成。欄B.將通過計算方法預測的點突變疊加到Wt-CocE的晶體結構上。坐標來自RCSB資料庫(pdb:1JU4)，由Larsen等人(2002)提供。結構模型用PyMol(DeLanoScientific,PaloAlto,CA)產生和提供。圖23顯示37°CCocE活性的衰減。將50ng/ml野生型CocE和突變體在37°C溫育，並隨時間檢測活性(Xieetal，1999)。根據所獲曲線計算半衰期。野生型CocE，T172R，L169K和T172R/G173Q分別顯示12分鐘，46分鐘，274分鐘和326分鐘的半衰期。圖24顯示DTT以濃度依賴性方式抑制wt-CocE，其IC5tl為390μΜ。圖25顯示DTT(IOmM)的存在縮短wt-CocE的體外τinact。圖26顯示酯酶活性溫度依賴性的衰減。將50ng/ml野生型CocE和突變體在指定溫度CC)預溫育30分鐘，並檢測活性(Xieetal，1999)。顯示預溫育後各種突變體剩餘的活性(作為最大活性Vmax(無預溫育)的百分比)。野生型CocE(空心柱圖)看起來在30-35°C之間滅活，而T172R/G173Q(陰影柱圖)和L169K(實心)均顯示增強熱穩定性(在40-45°C滅活)。圖27顯示CocE抗古柯鹼誘導毒性的保護作用。在施用古柯鹼(mg/kg，i.p.)前1分鐘靜脈內施用CocE(Img)。繪製存在或不存在CocE或突變體條件下古柯鹼誘導致死性的劑量反應曲線。每個數據點代表顯示古柯鹼誘導致死率的小鼠(每種給藥條件η=6)百分比。圖28顯示CocE抗古柯鹼毒性的保護作用的時程。每個數據點代表顯示古柯鹼誘導致死性的小鼠(每種給藥條件η=6)百分比。在施用古柯鹼(180mg/kg，i.p.)前不同的時間點施用CocE或突變體(0.Img,0.3mg,Imgi.v.)。圖29顯示50%致死率的估算保護持續時間。根據圖28的數據計算CocE和各種突變體達到50%致死率所需時間，並對劑量作圖。圖30是顯示CocE和熱穩定化突變概貌的示意圖。CocE的H2和H3螺旋用線圈表示，CocE的其餘部分作為分子表面。觀察到結合於我們的晶體結構的DTT分子指示活性位點相對位置，在接近於H2螺旋的腔中。顯示3種鑑定的穩定化突變。T172R突變導致R172(H2螺旋)和F189(H3螺旋)之間的範德華相互作用。G173Q突變利用新的氫鍵(虛線)橋連活性位點裂隙。L169K突變影響活性位點。在這種晶體結構的活性位點中觀察到DTT和甘油，其中K169顯示多種構象並與甘油形成氫鍵。注意到在天然結構中L169晶序較差。K169與Y44形成另外的直接接觸。甘油在古柯鹼的託烷環預期結合的位置結合，而DTT佔據苯甲基部分的結合位點。結構模型用PyMol(DeLanoScientific，PaloAlto,CA)產生和提供。圖31顯示熱穩定突變體的結構示意圖。將T172R(B)、G173Q(D)和L169K(F)的高分辨晶體結構與Wt-CocE(分別為A，C和C)進行比較。突變體的整體作用看起來源自結構域II的螺旋1和2(R172和F189)之間的相互作用增強或結構域間相互作用(Q173與P44和K169與活性位點)。顯示活性位點存在2-氧代-二氧戊環丁醯碳酸酯(DBC)的條件下與Wt-CocE比較的L169K結構，其增強賴氨酸殘基與水和活性位點的相互作用。1sigma的2F。F。電子密度被勾畫。圖32顯示R172穩定化結構域II中的H1-H2環。通過增強與F189的相互作用，精氨酸取代殘基172的蘇氨酸穩定化螺旋1和螺旋2。儘管在Wt-CocE中發現『in」(暗)和「out」(亮)構象，但在Tl72R中只發現「out」構象。圖33顯示Wt-CocE的活性位點中DBC與苯基硼酸的比較。發現DBC與晶體(從利用DTT分離的蛋白生長而成)的活性位點117的絲氨酸共價結合。DBC分子的omit圖(左)顯示位於5sigma的碳密度，位於12sigma的氧密度，和位於20sigma的硫密度。右欄顯示先前報導的過渡態類似物苯基硼酸的結合位點(Pdb:1JU3)，其類似於DBC結合位點。顯示L169K突變體的omit圖密度，其配位了與DBC環形成氫鍵的水分子。圖34是顯示Wt-CocE和兩種雙突變體催化參數的圖和表格。圖35顯示wt-CocE、兩種CocE突變體(T172R和L169K)以及組合兩種單突變的雙突變體的體外活性損失。圖36顯示CocEL169K/G173Q突變體保護小鼠免受致命古柯鹼劑量的傷害。圖37顯示CocEL169K/G173Q突變體保護小鼠免受致命古柯鹼劑量的傷害的時程。詳細說明本發明人發現一些化合物熱穩定化野生型CocE，並且進一步熱穩定化CocE突變體(它們比野生型CocE的熱穩定性更高)。參見實施例1-3。因此，本申請涉及包括古柯鹼酯酶(CocE)和化合物的組合物，其中所述化合物存在條件下的CocE比所述化合物不存在條件下的CocE更加熱穩定。所述化合物存在條件下CocE熱穩定性的所獲增加延長酶在37°C的半衰期至少約5分鐘，優選的至少約10，15，20，25，30，35或40分鐘，或更長。指定多肽的熱穩定性可以通過本領域已知的各種方法進行評價，包括例如測量圓二色性(CD)光譜法(例如下文的實施例2中)或差示掃描量熱計。還可參見PCT專利申請PCT/US2007/015762，公開為W0/2008/008358，通過援引併入。優選的，在有和沒有所述化合物的條件下通過隨時間測量低溫和高溫下的酶活性來確定熱穩定性，以確定相對於沒有所述化合物的情況，該化合物在更高的溫度下是否導致酶維持酶活性以及維持到何種程度。優選的低溫是室溫(即，25°C)；優選的高溫是37°C。但是，可以使用任何溫度範圍。技術人員無需過度實驗就可以確定針對任意具體應用的最佳溫度範圍。如本文使用的，CocE是具有與SEQIDNO1至少80%相同的胺基酸序列的酶，能夠特異性催化將古柯鹼裂解為芽子鹼甲酯和安息香酸。優選的，CocE具有與SEQIDNO1至少90%相同的胺基酸序列，更優選的，95%，甚至更優選的99%。在一些優選的實施方案中，CocE具有與SEQIDNO1相同的胺基酸序列。在其他實施方案中，CocE具有突變，諸如描述於PCT專利申請PCT/US2007/015762中的那些，包括相對於野生型(SEQIDNO1)熱穩定性增加的突變體以及熱穩定性不增加的突變體。優選的突變體是除了以下取代外CocE具有SEQIDN0:1的胺基酸序列的那些突變體:L163V,V225I,I218L,A310D,A149S,S159A,S265A,S56G,W220A,S140A,F189L,A193D,T254R,N42V,V262L,L508G,Y152H,V160A,T172R,Y532F,T74S,W285T,L146P,D533S,A194R,G173Q,C477T,K531A,R41I,L119A,K46A,F84Y,T172R/G173Q,L169K,F189A,N197K,R182K，F189K，V190K,Q191K，或A194K，或這些突變胺基酸殘基的任意組合。在一些實施方案中，CocE具有SEQIDNO1的胺基酸序列，除了取代T172R，S159A，m97K，L169K，F189K，G173Q，或T172R/G173Q之外。在這些實施方案的另外一些中，CocE具有SEQIDNO:1的胺基酸序列，除了取代L169K/G173Q之外。屬於這些實施方案範圍的化合物可以增加如上所述的野生型或突變CocE的熱穩定性。CocE還可以被聚乙二醇化或另外處理以增加作用持續時間、熱穩定性和/或降低免疫原性。聚乙二醇化可以進一步增強CocE-化合物組合物的熱穩定性和，當體內使用時，通過降低腎清除率、蛋白水解、巨噬細胞攝取和免疫應答增加血清半衰期。CocE-化合物組合物可以被包裹入紅細胞(RBC)以便增加作用的持續時間和熱穩定性，並降低免疫原性。在優選的組合物中，所述化合物是Br更優選的，所述化合物是甚至更優選的，所述化合物是在其他優選的實施方案中，所述化合物是化合物也可以是化合物還可以是此外，化合物可以是另外，化合物可以是化合物也可以是本發明的組合物可以包括上述鑑定的熱穩定化CocE的任意化合物中的不止一種。在這些組合物的一些實施方案中，尤其是當它們用於治療目的時，所述組合物位於藥學上可接受的載體中。可以使用一種或更多種藥學上可接受的載體和/或賦形劑(參見例如，Gennaro(2005)RemingtontheScienceandPracticeofPharmacy21sted.Lippincottffilliams&ffilkins,ISBN0781746736)通過任意常規方法配製本文描述的CocE-化合物組合物。這類製劑將包含治療有效量的CocE-化合物組合物(優選的以純化形式)，以及合適量的載體以便提供用於給受試者正確施用的形式。所述製劑應當適合施用的方式。可以通過已知的方法配製用於本申請的CocE-化合物組合物，以便使用數種途徑給受試者施用，所述途徑包括但不限於，腸胃外，肺，口服，局部，皮內，肌內，腹膜內，靜脈內，皮下，鼻內，硬膜外，眼，口腔，和直腸。CocE-化合物組合物還可以與本文公開的一種或更多種其他藥劑聯合施用和/或與其他生物活性劑或生物惰性劑一起施用。這類生物活性劑或惰性劑可以與所述藥劑產生流體或機械聯繫，或通過離子、共價、範德華、疏水、親水或其他物理力與所述藥劑連接。本文描述的CocE-化合物組合物可以腸胃外施用，包括通過靜脈內、肌內、皮下或腹膜內注射。生物分子製劑還可包括通常用於小藥物分子的腸胃外輸送的賦形劑，其包括溶解增強劑，滲透劑，緩衝劑和防腐劑。當配製和輸送生物分子時包括抗聚集劑和抗吸附劑，諸如表面活性劑和白蛋白，可以增加穩定性和降低活性生物分子與界面相互作用的風險(這有可能導致解摺疊，聚集和/或沉澱)。可以將CocE-化合物組合物凍幹以增加保存期間的穩定性，然後在腸胃外施用前再處理。還預期CocE-化合物組合物的肺部輸送。此外，可以配製控釋(或緩釋)製劑以延長突變CocE多肽的活性並減少給藥頻率，就如本領域已知的一樣。可以將CocE-化合物組合物包入膠囊，並在各種載體輸送系統中施用。用於本文描述的突變CocE多肽的載體輸送系統的實例包括微球(參見例如，Varde&Pack(2004)ExpertOpin.Biol.4(1)35-51)，水凝膠(一般地參見，Sakiyamaetal(2001)FASEBJ.15，1300-1302)，聚合植入物(一般地參見，Tengetal(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.99，3024-3029)，智能(smart)聚合載體(一般地參見，Staytonetal(2005)OrthodCraniofacialRes8,219-225；Wuetal(2005)NatureBiotech(2005)23(9)，1137-1146)，和脂質體(參見例如，Galovicetal(2002)Eur.J.Pharm.Sci.15,441-448；Wagneretal(2002)J.LiposomeRes.12，259—270)。本申請還涉及熱穩定化古柯鹼酯酶(CocE)的方法。所述方法包括將CocE與下列化合物組合優選的，所述化合物是更優選的，所述化合物是在其他優選的實施方案中，所述化合物是O(安息香酸)<所述化合物也可以是所述化合物還可以是此外，所述化合物可以是另外，所述化合物可以是(6169221),(F6460),所述化合物也可以是在這些方法中，CocE可以與不止一種熱穩定化(thermostabilizing)化合物組合，例如如上所述化合物中的一種，或與任意其他化合物組合。優選的，CocE包括與SEQIDNO:1至少90%相同的胺基酸序列；更優選的，與SEQIDNO:1至少95%相同，甚至更優選的與SEQIDNO:1至少99%相同。在其他優選的實施方案中，CocE包括SEQIDNO:1的胺基酸序列。在另外的實施方案中，CocE是具有SEQIDNO1的胺基酸序列的野生型CocE的熱穩定突變體。這類熱穩定突變體的優選實例是具有SEQIDNO1的胺基酸序列的CocE,除了取代T172R,S159A,N197K,L169K,F189K,G173Q或T172R/G173Q之外。此外，CocE可以具有SEQIDNO:1的胺基酸序列，除了取代L169K/G173Q之外。當CocE位於體外時，可以進行這些實施方案的方法例如在純化時或保存期間熱穩定化CocE。但是，優選的，CocE位於活的哺乳動物中。針對所述實施方案，本申請的一方面涉及抗古柯鹼治療的催化降解方法。提供古柯鹼誘導狀況的預防性和治療性療法，通過給需要其的受試者施用熱穩定的、具有酯酶活性的CocE-化合物組合物。由熱穩定化化合物(其使得對古柯鹼毒性症狀的應答快得多和有效得多)提供的熱穩定性增加使得如上所述的CocE-化合物組合物不同於其他治療選擇。本申請還涉及治療患有古柯鹼誘導狀況的哺乳動物的方法。所述方法包括以足以降低所述古柯鹼誘導狀況對哺乳動物的影響的方式給所述哺乳動物施用上述CocE-化合物組合物。治療需要的確定通常通過符合古柯鹼誘導狀況的病史和身體檢查來評價。預期可以使用本方法治療任意古柯鹼誘導狀況，包括但不限於，服用古柯鹼過量，古柯鹼毒性，以及古柯鹼依賴和/或成癮。這類狀況的診斷屬於本領域的技能範圍內。例如，古柯鹼毒性的診斷可包括評價驚厥，癲癇大發作，心動停止，心肌梗死，心臟心律不齊，血壓增加，中風，藥物誘導的精神病，壁間動脈瘤，和心肌需氧量增加。作為另一實例，就古柯鹼依賴和/或成癮來說，戒斷症狀包括輕度到重度煩躁不安、抑鬱、焦慮或過敏(irritability)的主觀感覺。被確定需要治療的受試者包括以下那些患有確診的古柯鹼誘導狀況，具有古柯鹼誘導狀況的症狀，以及已經接受、正在接受或將要接受針對古柯鹼誘導狀況的治療的受試者。這些方法可用於治療任意哺乳動物，包括但不限於，嚙齒類動物，兔，豚鼠，馬，牛，狗，貓，羊和豬，和最優選的是人。本文描述的CocE-化合物組合物的有效量通常是能夠降低古柯鹼毒性或古柯鹼誘導狀況的嚴重性的量。嚴重性的減輕包括，例如，症狀、生理指標、生化標記物或代謝指標的停滯或降低。當用於本發明的方法時，治療有效量的本文所述CocE-化合物組合物可以使用純化形式或當存在這種形式時採用藥學上可接受的鹽形式並且包含或不包含藥學上可接受的賦形劑。例如，CocE-化合物組合物可以適用於任意醫學治療的合理利益/風險比例進行施用，採用足以實質上降低受試者血液和/或組織中古柯鹼濃度的量。可以通過細胞培養物和/或實驗動物中測定LD50(導致50%群體死亡的劑量)和ED50(在50%群體中治療有效的劑量)的標準藥學步驟來確定CocE-化合物組合物的毒性和治療效率，與藥學上可接受的載體組合產生單劑型的CocE-化合物組合物的量將根據接受治療的宿主和具體的施用方式而變化。本領域技術人員將理解，每種劑型的單獨劑量包含的藥劑單位含量無需自身構成治療有效量，因為可以通過施用若干單獨劑量達到必需的治療有效量。CocE-化合物組合物的施用可以作為單個事件發生，或隨著治療的時程發生。例如，CocE-化合物組合物可以是每天，每周，每兩周，或每月施用。對於一些狀況來說，治療可以持續數周到數月或甚至一年或更長。對於任意具體受試者來說，特定的治療有效量水平將取決於各種因素，包括正接受治療的古柯鹼誘導狀況和所述古柯鹼誘導狀況的嚴重性；使用的突變CocE多肽的活性；使用的具體組成；患者的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食；施用時間；施用途徑；突變CocE多肽的血漿半衰期；使用的突變CocE多肽的排洩率；治療持續時間；與所用突變CocE多肽組合或同時使用的藥物；以及醫藥領域公知的類似因素(參見例如，Koda-Kimbleetal(2004)App1iedTherapeutics:TheClinicalUseofDrugs,Lippincottffilliams&ffilkins,ISBN0781748453；Winter(2003)BasicClinicalPharmacokinetics,4thed.,Lippincottffilliams&ffilkins,ISBN0781741475；Sharqel(2004)AppliedBiopharmaceutics&Pharmacokinetics,McGraw-Hill/Appleton&Lange,ISBN0071375503)。有經驗的醫師應當知道，主治醫師在合理醫學判斷範圍內無需過度實驗就能夠確定用於本文公開的本發明實施方案的CocE-化合物組合物的每日總用量。本文描述的CocE-化合物組合物還可以與其他治療形式聯用。因此，除了本文描述的療法外，還可以給受試者提供已知對具體的古柯鹼誘導狀況有效的其他療法。因此，在這些方法的一些實施方案中，哺乳動物對古柯鹼成癮。在其他實施方式中，哺乳動物服用古柯鹼過量。用於這些方法的CocE可以是具有SEQIDNO=I的胺基酸序列的野生型CocE的熱穩定突變體。優選的這類突變體具有SEQIDN0:1的胺基酸序列，除了取代T172R，S159A，N197K,L169K,F189K,G173Q,T172R/G173Q,或L169K/G173Q之外。具有不止一種突變，優選的不止一種熱穩定化突變的CocE突變體，也可用於這些治療方法。這些方法不限於使用任意具體的熱穩定化化合物。優選的，所述化合物是更優選的，所述化合物是(6031818).在其他優選的實施方案中，所述化合物是1丨^yoh5(安息香酸)<所述化合物也可以是(5804236),所述化合物還可以是(6169221).另外，所述化合物可以是此外，所述化合物可以是所述化合物也可以是在這些方法中，CocE可以與不止一種熱穩定化化合物組合，例如如上所述化合物-種，或與任意其他化合物組合。此外，本申請還涉及治療服用古柯鹼過量的哺乳動物的方法。所述方法包括以足以降低所述古柯鹼對哺乳動物的影響的方式給所述哺乳動物施用上述組合物。這些方法可用於治療任意哺乳動物，包括但不限於，嚙齒類動物，兔，豚鼠，馬，牛，狗，貓，羊和豬，和最優選的是人。就像如上所述的治療方法一樣，所述組合物可以通過本領域已知的任意方法施用。技術人員無需過度實驗就可以確定針對任意特定個體的最佳施用方式。在一些優選的實施方案中，給哺乳動物靜脈內施用CocE-化合物組合物。用於這些方法的CocE可以是具有SEQIDNO=I的胺基酸序列的野生型CocE的熱穩定突變體。優選的這類突變體具有SEQIDN0:1的胺基酸序列，除了取代T172R，S159A，N197K，L169K，F189K，G173Q，或T172R/G173Q之外。在另一熱穩定突變體中，CocE具有SEQIDN0:1的胺基酸序列，除了取代L169K/G173Q之外。具有不止一種突變，優選的不止一種熱穩定化突變的CocE突變體，也可用於這些治療方法。這些方法不限於使用任意具體的熱穩定化化合物。優選的，所述化合物是更優選的，所述化合物是在其他優選的實施方案中，所述化合物是所述化合物也可以是所述化合物還可以是另外，所述化合物可以是此外，所述化合物可以是(G230460).所述化合物也可以是NH(G330390)。在這些方法中，CocE可以與不止一種熱穩定化化合物組合，例如如上所述化合物中的一種，或與任意其他化合物組合。本發明進一步涉及治療患有古柯鹼依賴的哺乳動物的方法。所述方法包括以足以降低所述古柯鹼依賴對哺乳動物的影響的方式給所述哺乳動物施用上述組合物。這些方法可用於治療任意哺乳動物，包括但不限於，嚙齒類動物，兔，豚鼠，馬，牛，狗，貓，羊和豬，和最優選的是人。就像如上所述的治療方法一樣，所述組合物可以通過本領域已知的任意方法施用。技術人員無需過度實驗就可以確定針對任意特定個體的最佳施用方式。在一些優選的實施方案中，給哺乳動物靜脈內施用CocE-化合物組合物。用於這些方法的CocE可以是具有SEQIDNO=I的胺基酸序列的野生型CocE的熱穩定突變體。優選的這類突變體具有SEQIDN0:1的胺基酸序列，除了取代T172R，S159A，N197K，L169K，F189K，G173Q，或T172R/G173Q之外。在另一熱穩定突變體中，CocE具有SEQIDN0:1的胺基酸序列，除了取代L169K/G173Q之外。具有不止一種突變，優選的不止一種熱穩定化突變的CocE突變體，也可用於這些治療方法。這些方法不限於使用任意具體的熱穩定化化合物。優選的，所述化合物是更優選的，所述化合物是在其他優選的實施方案中，所述化合物是所述化合物也可以是所述化合物還可以是另外，所述化合物可以是此外，所述化合物可以是所述化合物也可以是在這些方法中，CocE可以與不止一種熱穩定化化合物組合，例如如上所述化合物中的一種，或與任意其他化合物組合。此外，本申請涉及確定化合物是否是蛋白熱穩定劑的方法。所述方法包括在有和沒有所述化合物的條件下檢測蛋白的熱穩定性。利用這些方法，使蛋白熱穩定性更高的化合物是該蛋白的熱穩定劑。優選的，所述蛋白是CocE。利用這些方法，可以分離(即，在活細胞外的試管中)蛋白或通過培養或體內的細胞產生蛋白用於熱穩定性測定。可以在一個或更多個溫度下測量有和沒有化合物情況下分離的蛋白的活性，以確定所述化合物給予該蛋白的熱穩定性。進行活性分析的溫度決定熱穩定性檢測的程度。因此，起始篩選可以例如在30°C進行，在起始化合物挑選後，可以逐漸升高溫度(例如，34°C，37°C，4(TC，42.5°C，45°C，等等)進行篩選，直至獲得具有合適熱穩定性的化合物。在該過程中溫度的遞增通過經驗確定，這受特定溫度時的命中(hit)數以及確定的起始化合物Tm的影響。當所述蛋白是CocE時，可以使用各種方法進行酯酶活性的檢測，其中底物通常與特異性檢測系統偶聯。用於測定酯酶活性的合適底物可以包括古柯鹼，氚化(3H)古柯鹼，古柯鹼底物衍生物諸如硫_古柯鹼衍生物，和/或報告一般性酯酶活性的底物諸如4-硝基苯基乙酸酯。所述檢測系統可以直接偶聯底物的特異性，例如未修飾古柯鹼的裂解可以通過以下方法檢測，監測240nm處古柯鹼吸光度的變化，或監測源於酸性安息香酸產物積聚的PH變化，或使用古柯鹼適體(參見例如，Stojanovic,M.N.，dePrada,P.&Landry,D.W.(2001)JAmChemSoc123,4928-4931；Stojanovic,M.N.&Landry,D.W.(2002)JAmChemSoc124,9678-9679)，監測古柯鹼降解時螢光的變化；氚化(3H)古柯鹼的裂解可以通過層析分離的氚化安息香酸產物的酸化和檢測進行測定；古柯鹼衍生物諸如硫_古柯鹼的裂解可以通過活性巰基的檢測進行監測，通過添加Ellman's試劑並測定412nm處的吸光度變化，或通過添加導致巰基沉澱的反應性重金屬並將其顯影；4-硝基苯基乙酸酯的裂解可以通過監測420nm處的吸光度變化進行檢測(參見例如，Halgasova,N.etal(1994)BiochemJ298Pt3,751-755;0，Conner,C.J.Manuel,R.D.(1993)JDairySci.76，3674-3682)。還可參見PCT公開W0/2008/008358對上述內容的進一步詳細描述。可以使用在本文以及PCT公開WCV2008/008358中描述的體外步驟進一步評價通過上述步驟或類似的高通量分析鑑定的蛋白-化合物組合物(例如，K。at*Km值，37°C的穩定性，熔解溫度(Tm)，內毒素水平，在血漿中降解底物的能力)。當恰當的使用本文以及PCT公開W0/2008/008358中描述的體內步驟時，可以進一步評價相對於蛋白本身顯示熱穩定性的蛋白-化合物組合物(例如，功效，作用的持續時間，重複給藥的效果，和/或免疫鑑定)。因此，對於這些篩選方法來說，所述蛋白優選的是酶。更優選的，所述蛋白是蛋白酶。甚至更優選的，所述蛋白是酯酶。最優選的，蛋白是古柯鹼酯酶(CocE)，其具有與SEQIDNO1至少80%相同的胺基酸序列，能夠特異性催化將古柯鹼裂解為芽子鹼甲酯和安息香酸。優選的，CocE具有與SEQIDNO:1至少90%相同的胺基酸序列，更優選的，95%，甚至更優選的99%。在一些優選的實施方案中，CocE具有與SEQIDNO=I相同的胺基酸序列。因為希望熱穩定化化合物在低濃度也有效，所以優選的在這些篩選方法中，存在於所述組合物中的化合物濃度低於約ImM。更優選的，存在於所述組合物中的化合物濃度低於約0.ImM。最優選的，存在於所述組合物中的化合物濃度低於約0.025mM。優選的在這些篩選方法中，在所述化合物存在和不存的條件下通過測量低溫和高溫下的蛋白功能來檢測熱穩定性，其中低溫接近於蛋白功能的最適溫度，並且蛋白在高溫下要比在低溫下更不穩定。優選的，高溫是約37°C，尤其當蛋白是CocE時。但是，對於其他酶來說，高溫可以是大於約40°C，大於約50°C，大於約60°C，大於約70°C，大於約80°C，大於約90°C，大於約95°C，或甚至大於約98°C，例如，對於用於PCR的熱穩定聚合酶來說。可以檢測蛋白功能的任意方面以確定有和沒有化合物條件下的熱穩定性。用於該目的蛋白功能優選實例是酶活性和配體結合。本申請還涉及上述組合物在製備用於治療古柯鹼誘導狀況的藥物中的用途。優選的，古柯鹼誘導狀況是服用古柯鹼過量，古柯鹼毒性，古柯鹼成癮，或古柯鹼依賴。最優選的，古柯鹼誘導狀況是服用古柯鹼過量。用於這些用途的CocE可以是具有SEQIDNO=I的胺基酸序列的野生型CocE的熱穩定突變體。優選的這類突變體具有SEQIDN0:1的胺基酸序列，除了取代T172R，S159A，N197K,L169K，F189K，G173Q，或T172R/G173Q之外。在另一熱穩定突變體中，CocE具有SEQIDN0:1的胺基酸序列，除了取代L169K/G173Q之外。具有不止一種突變，優選的不止一種熱穩定化突變的CocE突變體，也可用於這些治療方法。這些用途不限於使用任意具體的熱穩定化化合物。優選的，所述化合物是更優選的，所述化合物是在其他優選的實施方案中，所述化合物是所述化合物也可以是所述化合物還可以是另外，所述化合物可以是此外，所述化合物可以是所述化合物也可以是(G330390)在這些用途中，CocE可以與不止一種熱穩定化化合物組合，例如如上所述化合物中的一種，或與任意其他化合物組合。本申請還涉及上述組合物用於治療古柯鹼誘導狀況的用途。優選的，古柯鹼誘導狀況是服用古柯鹼過量，古柯鹼毒性，古柯鹼成癮，或古柯鹼依賴。最優選的，古柯鹼誘導狀況是服用古柯鹼過量。用於這些用途的CocE可以是具有SEQIDNO=I的胺基酸序列的野生型CocE的熱穩定突變體。優選的這類突變體具有SEQIDN0:1的胺基酸序列，除了取代T172R，S159A，N197K,L169K，F189K，G173Q，或T172R/G173Q之外。在另一熱穩定突變體中，CocE具有SEQIDN0:1的胺基酸序列，除了取代L169K/G173Q之外。具有不止一種突變，優選的不止一種熱穩定化突變的CocE突變體，也可用於這些治療方法。這些用途不限於使用任意具體的熱穩定化化合物。優選的，所述化合物是更優選的，所述化合物是在其他優選的實施方案中，所述化合物是所述化合物也可以是所述化合物還可以是另外，所述化合物可以是此外，所述化合物可以是所述化合物也可以是在這些用途中，CocE可以與不止一種熱穩定化化合物組合，例如如上所述化合物中的一種，或與任意其他化合物組合。本申請還涉及一種編碼CocE多肽的分離的核酸，所述CocE多肽包括與SEQIDNO1的多肽具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。在這些實施方案中，編碼的CocE多肽具有(a)取代L169K和G173Q，和(b)與野生型CocE相比，在37°C熱穩定性增加的酯酶活性。參見實施例5，確認這種多肽在37°C的半衰期為約72小時，這是具有SEQIDNO1的序列的野生型酶的300X。優選的，所述胺基酸序列具有與SEQIDNO:1的多肽至少90%序列同一性。更優選的，所述胺基酸序列具有與SEQIDNO:1的多肽至少95%序列同一性。甚至更優選的，所述胺基酸序列具有與SEQIDNO:1的多肽至少99%序列同一性。在最優選的實施方案中，核酸編碼CocE多肽，所述CocE多肽具有SEQIDNO1的序列，除了取代L169K和G173Q之外。本申請還涉及由上述編碼具有L169K和G173Q取代的CocE多肽的核酸中任意一種編碼的CocE多肽。在一些實施方案中，CocE多肽位於藥學上可接受的載體中。在其他實施方案中，本申請涉及治療患有古柯鹼誘導狀況的哺乳動物的方法。所述方法包括以足以降低所述古柯鹼誘導狀況對哺乳動物的影響的方式給所述哺乳動物施用上述包括具有L169K和G173Q取代的CocE多肽的組合物。此外，本申請涉及上述包括具有L169K和G173Q取代的CocE多肽的組合物在製備用於治療古柯鹼誘導狀況的藥物中的用途。本申請還涉及上述包括具有L169K和G173Q的CocE多肽的組合物用於治療古柯鹼誘導狀況的用途。本發明的優選實施方案在下面實施例中進行描述。根據此處公開的本發明的說明或實踐，本領域技術人員將很清楚屬於本文權利要求範圍內的其他實施方案。應理解說明以及實施例只是作為示例，本發明的範圍和精神由實施例後的權利要求確定。實施例1.熱穩定化CocE的化合物。古柯鹼酯酶是一種細菌表達的蛋白，其催化將古柯鹼裂解為兩種無活性的副產物芽子鹼甲酯和安息香酸。該蛋白理論上可用於古柯鹼服用過量和成癮的體內治療，但是野生型蛋白在37°C是不穩定的。利用古柯鹼的光譜特性(其在240nm波長處吸收光最大)分析CocE對古柯鹼裂解的作用。通過監測A240處信號的減弱，使用各種濃度的古柯鹼並確定減弱的初速度，測量CocE活性。根據這些值可以確定酶的Vmax。在監測活性前將酶在37°C預溫育不同時間，可以計算CocE在37°C的半衰期。在正在進行的提高CocE熱穩定性的嘗試中，製備該蛋白的數種突變體並檢測其體外半衰期。凝膠電泳的後續分析顯示，自然條件下在37°C預溫育不同時間後觀察到蛋白發生聚集(PCT公開W0/2008/008358)。初始產物的消失可以通過光密度分析來檢測，這種分析支持以下光譜數據所述突變體的體外半衰期相對於WT和S167A突變體被延長。儘管預溫育不同時間顯示WTCocE在37°C的半衰期較短(5分鐘)，還注意到如果分光光度測定在37°C進行，則CocEWT將繼續以線性速率裂解超過60分鐘(圖2，中間)或直至古柯鹼底物被耗盡(圖2，底部)。這表明在古柯鹼或其副產物存在的條件下WT酶被穩定化。CocE還能裂解另一底物，4-硝基苯基乙酸酯(圖3)。通過檢測4_硝基苯酚反應產物(其在400nm處吸收光)的出現監測裂解。對該底物在37°C的裂解分析顯示，所述產物最初很快產生，但反應隨著時間減慢(圖3，中間和底部)。這提示4-硝基苯基乙酸酯和產物有可能不穩定化酶，或至少達不到古柯鹼反應的程度。為了分析底物和產物對CocEWT的穩定化作用，在37°C溫育1小時後檢測每種化合物抑制CocE蛋白聚集體形成的能力。古柯鹼和安息香酸在一些濃度下抑制聚集體的形成，但芽子鹼甲酯和乙酸鈉無法抑制(圖4)。進一步對古柯鹼穩定化作用進行分光光度分析，通過在各種濃度的古柯鹼存在條件下，在37°C預溫育不同時間後，分析CocE裂解4-硝基苯基乙酸酯的能力。發現古柯鹼是更高濃度下(62.5和125μM)4-硝基苯基乙酸酯裂解的抑制劑(圖5)。發現比這低的濃度在37°C不是穩定化的。但是，在37°C將更高濃度的CocE預溫育不同時間顯示，該酶被足夠穩定化，能夠裂解4-硝基苯基底物(圖5)。安息香酸、芽子鹼甲酯和乙酸鈉對CocE穩定化作用的動力學分光光度分析未顯示低於125μm的任何穩定化作用(圖6)。但是發現在更高的濃度安息香酸既起抑制作用又起穩定化作用。為了進一步研究小分子對CocE的穩定化作用，考慮了CocE裂解反應的其他抑制劑。苯基硼酸(CocE的不可逆抑制劑)，能夠在37°C將CocEWT聚集作用穩定化1小時，其50%穩定化濃度為大約0.2μm(圖7)。上述數據表明，可以通過添加酶的底物、產物或抑制劑來穩定化野生型CocE。但是所有這些小分子都將酶活性抑制到一定程度。將鑑定是否存在小分子，其能夠阻止CocE聚集，但不抑制酶活性。這類分子在體外(例如，酶製備期間)和體內可以用做穩定劑。設計一種能夠針對CocE的穩定化作用篩選20，000個小分子的文庫的分析法。在這種分析法中，將酶與化合物在96孔板中混合，然後在37°C溫育1小時。該分析法的對照通常是化合物稀釋劑(例如，DMS0)，未加熱的酶，以及與2000μM安息香酸混合的酶。在37°C溫育後，檢測酶/化合物混合物裂解4-硝基苯基乙酸酯的能力(圖8)。在這種溫育後只有被穩定化的化合物能夠裂解。首先檢測40種化合物。利用合適的對照將所述化合物重複分析兩次。利用復板(duplicateplate)(不含酶)作為陰性對照，以檢查在沒有CocE的條件下化合物是否造成400nm吸光度的增加。發現數種化合物也增加400nm處的吸光度。一些會在沒有CocE的條件下增加吸光度。將這些作為假陽性捨去。圖9是在去除「無酶」裂解背景後，全部化合物的4-硝基苯基乙酸酯裂解的初始速率圖。具有顯著活性(高於只有DMSO的對照2個標準偏差)的化合物用星號標記，並顯示這些化合物的化學結構。該分析法中最有效的化合物是化合物6031818(圖10)。該化合物是4_硝基苯基乙酸酯裂解的弱抑制劑(16μπι;圖10，左圖)，並且完全不抑制古柯鹼裂解(圖10，右圖)。高酶濃度條件下的穩定化分析顯示，在37°C60分鐘後酶活性開始降低(圖11)。這個時間之後，6031818能夠穩定化野生型酶半衰期，在20μM使得半衰期從12-14分鐘增加到60-70分鐘。另一有效的化合物，6169221，具有與6031818非常類似的結構。該化合物也不抑制4-硝基苯基乙酸酯或古柯鹼底物的裂解(圖12)。6169221化合物穩定化酶的作用較弱，將半衰期從7-12分鐘增加到13-17分鐘。另一熱穩定化化合物是5804238。該化合物也不抑制4-硝基苯基乙酸酯或古柯鹼的裂解(圖14)。5804238穩定化酶的作用較弱，將半衰期從9_10分鐘增加到22-25分鐘(圖15)。實施例2.野牛型和突變CocE的圓二餼件。野生型(WT)CocE和熱穩定突變體的穩定性的進一步表徵通過圓二色性進行，其檢測蛋白構象和結構的微小變化。通過遞增溫度下重複CD檢測的分析法能夠分析蛋白的熱力學和熔解溫度(Tm)，只要熔解是可逆的(即冷卻時蛋白恢復其初始構象)。令人遺憾地，CocEWT的熔解不是可逆的，所以無法確定真實的熱力學。但是CD在確定解摺疊的溫度中仍是有價值的。在這些分析法中，CocEWT(圖16，頂部)在大約39°C熔解，而T172R突變體(圖16，底部)在42°C熔解，顯示該突變體在37°C提供的熱穩定性歸因於比WT高2-3度的熔解溫度。過量安息香酸存在條件下的WTCocE(圖17，頂部)將CocE的熔解溫度增加到53°C，比T172R突變體高整整10度。這種濃度的安息香酸分子稍微具有光譜性，影響蛋白的光譜，但不影響熔解的光譜。5X摩爾濃度苯基硼酸存在條件下的WTCocE分析(圖17，底部)增加熔解溫度到73°C，也就是說，比WT和T172R突變體高超過30度。另一CocE突變體L169K的⑶分析，證實單獨的熔解溫度為65°C，苯基硼酸存在條件下的熔解溫度為85°C(圖18)，即苯基硼酸為L169K已經較高的初始熔解溫度再增加20°C的熔解溫度。6031818存在條件下的CocEWT的CD分析證實其熔解溫度為42°C，類似於T172R突變體。實施例3.各種化合物與野生型和突變CocE的熱穩定性分析。在37°C各種小分子存在的條件下將野生型CocE或CocE突變體L169K溫育不同的時間點，然後在非變性凝膠上進行電泳。結果顯示於圖20。使用點光密度法分析凝膠以確定這些條件下的CocE酶半衰期。參見圖21。苯基硼酸增加CocE的半衰期最多，其次是安息香酸。化合物6041818增加野生型酶的半衰期約50%。實施例4.通過基於結構的分析鑑定CocE熱穩定突變體實施例概述儘管在開發以多巴胺轉運蛋白作為靶標的治療中取得進展，但是在鑑定抗擊古柯鹼濫用和服用過量的療法中卻收穫較少。抗古柯鹼濫用和服用過量的治療發展的更傳統方法具有固有的挑戰，即結合轉運蛋白的古柯鹼競爭和變構抑制劑顯示與古柯鹼類似的性能功效抑制多巴胺的攝取。古柯鹼酯酶已經被開發用做抗古柯鹼誘導致死性的保護性療法。通過外源添加古柯鹼酯酶加速酶介導的全身性古柯鹼消化代表了古柯鹼濫用療法的顯著模式變化。此處報導了使用計算方法設計和產生顯著更穩定的酶製劑。提供來自體外和體內研究的證據來表明，與野生型酶相比，改造的酶顯示延長的半衰期(最高至30倍)和提高的熱穩定性。此外已經獲得X射線結晶證據，這提供了酶穩定性提高的結構原理。使用基於結構的和計算學方法來產生在37°C穩定性增加的CocE突變體。使用CocE的晶體結構(Larsenetal，2002)以及利用RosettaDesign程序(Kirjegianetal,2005；KuhlmanandBaker,2000)和AMBER程序(Caseetal，2004)的分子建模、能量最低化和分子動力學(MD)模擬的組合。使用體外分析法評價表達和純化的突變體的內在穩定性的提高。重要地是，36種預測的取代中有3種顯示酶半衰期的顯著提高，這通過體外分析法和體內保護免於古柯鹼誘導致死性來評價。確定這些突變體的X射線晶體結構以便研究熱穩定性提高的結構基礎。在每種情況下，取代增加酶的結構域間接觸。突變CocE在體內穩定性的顯著提高顯示這種實驗性方法以及CocE在古柯鹼濫用和成癮中使用的前途。材料和方法材料。古柯鹼購自MallinckrodtInc.，St.Louis，M0。所有其他試劑都是分析級的，獲自FisherBiosciences禾ΠSigma-AldrichCorp0熱穩定突變的設計。基於細菌古柯鹼酯酶(CocE)的X射線晶體結構(PDB編號1JU3)(Larsonetal，2002)，利用AMBER程序(Caseetal，2004)內嵌有的能量最低化和分子動力學(MD)模擬構建結合(-)_古柯鹼的CocE的完整3D模型。為了增加CocE的熱穩定性，使用在RosettaDesign程序(KuhlmanandBaker,2000)中實施的計算法，其能夠預測指定摺疊內的熱穩定化突變，並且將可能結構性破壞活性位點結構或抑制其柔性的主鏈任意變化降到最低。RosettaDesign程序中實施的方法使用能量函數評價指定摺疊的特定序列的擬合度，並使用MonteCarlo檢索算法用於對序列空間進行取樣。相同方法被其他研究人員成功用於增加酶的熱穩定性並且不降低催化效率(Korkegianetal,2005；KuhlmanandBaker,2000)0使用RosettaDesign程序的計算建模能夠預測可潛在降低能量從而增加CocE熱穩定性的一組突變。作為合理設計的第一輪，簡化計算法，只考慮與古柯鹼相距6-25A的胺基酸殘基上的可能突變。定點誘變。使用改進的QuickChange(Stratagene)誘變方案和單寡核苷酸引物，利用克隆入細菌表達載體pET-22b(+)的CocEcDNA作為模板產生點突變。為了產生雙突變體，具有單個點突變的cDNAs被用作第二輪誘變的模板。雙向測序所有突變體的完整編碼區。野生型和CocE突變體在37°C生長的大腸桿菌BL-21Gold(DE3)細胞中表達為C端6XHis標記的蛋白。在18°C用ImM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG，Fisher)誘導蛋白表達12小時。古柯鹼酯酶和突變體的純化。沉澱細胞，將其重懸於含蛋白酶抑制劑(亮抑酶肽和利馬豆或大豆胰蛋白酶抑制劑各3μg/ml)的50mMTrispH8.0,150mMNaCl中，然後利用Frenchpress(ThermoFisherScientificCorp,USA)裂角軍。使用Talon金屬親禾口層析(ClontechLaboratories，Inc,MountainViewCA)富集野生型或突變的CocE，然後使用陰離子交換(Q-S印harose，GEHealthcare,PiscatawayNJ)層析進行純化。利用包含20mMHepespH8.0,2mMMgCl2,ImMEDTA和ImMDTT的150_450mMNaCl線性梯度緩衝液從Q-S印harose柱洗脫CocE。合併峰組分，通過Centricon-30(Mi11ipore)進行濃縮，迅速在液氮中冰凍，然後保存於-80°C。古柯鹼水解的Michaelis-Menten動力學。使用古柯鹼水解的分光光度法實時分析來監測古柯鹼的水解(Landryetal,1993)。利用SOFTmaxPro軟體(Version3.1.2)，使用SpectraMaxPlus384UV板讀數器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)通過跟蹤240nm處古柯鹼內在吸光度的變化(6700M1CH11)(Xieetal，1999)來確定(衰變的)初始速率。通過向IOOyL2X古柯鹼溶液(50μg/mL酶，IOOmM磷酸鹽緩衝液，pH7.4和300mMNaCl)中添加IOOyL2X酶溶液(IOOmM磷酸鹽緩衝液，pH7.4和300mMNaCl)起始反應。所有進行的分析均用ΙΟΟμΜDTT，除非另作說明。最終古柯鹼濃度如下125，62.5，31.25，15·63，7·81，3·91，1·95，*0·977μΜ。利用Prism(GraphPadSoftware,SanDiego)計算Vmax和Km值。對於穩定性測量，將野生型和突變的酶稀釋到2X濃度，並在37°C溫育指定的時間。在每個時間點結束時，取出等分試樣，如上所列觀察動力學特性。體內針對古柯鹼致死件的保護。雄件NIH-Swiss小鼠(25_32g)獲自HarlanInc.(Indianapolis,IN)，按照每籠6隻小鼠的組飼養。所有小鼠都能夠任意獲得食物和水，並按照12小時光照-黑暗循環飼養，早晨6點半開燈，室溫保持在21-22°C。按照國立衛生研究院採用和頒布的實驗動物管理和使用指南(GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)進行實驗。實驗方案獲得密西根大學動物使用和管理大學委員會的批准。古柯鹼誘導毒性的特徵表現為致死性的發生，如觀察到的活動和呼吸的終止所定義。在藥物施用前將小鼠分別置於Plexiglas觀察室(16X28X20cm高)中使其習慣15分鐘。在腹膜內(i.P.)施用古柯鹼後，立即分別將小鼠置於相同室中進行觀察。在古柯鹼施用後記錄致死性的有或無60分鐘。將小鼠置於小的限制室(外管直徑30mm;內管直徑24mm)中，只暴露尾部。通過酒精擦拭將尾部淨化，將30G1/2精密滑動針頭(FisherScientific,Pittsburgh,PA)插入一條側靜脈用於輸注。CocE或CocE突變體的i.v.注射體積是0.2mL每隻小鼠。使用消毒紗布按壓注射部位止血。在i.p.施用數種劑量的古柯鹼(180，320，560，和1000mg/kg,η=8/劑量)前1分鐘，i.v.施用酶(0.3或Img)後評價CocE突變體抗古柯鹼誘導毒性的保護功效。確定有或無單劑量酶條件下古柯鹼誘導致死率的劑量反應曲線，以顯示CocE突變體的體內保護作用。通過監測i.p.施用古柯鹼(LD100,180mg/kg)前i.v.施用酶(0.1，0·3和Img)後的致死率來評價CocE和CocE突變體提供的抗古柯鹼毒性的保護持續時間。在施用酶後1，5，10，或30分鐘，或1，2，3，4，5小時注射後監測致死率。每次治療使用8隻小鼠評價在單個時間點用單劑量酯酶預治療的小鼠的致死率百分比(即，保護)。在功效研究中，利用跨越50%致死率發生的劑量反應曲線的一部分，通過最小二乘回歸法計算組LD5tl值。使用這些值比較在有或無酶預治療的條件下古柯鹼劑量反應曲線的右移程度。在時程研究中，通過穿過50%致死率發生的每個時程曲線估算保護(即，50%的致死率)持續時間的時間點。將鹽酸古柯鹼(MallinckrodtInc.，St.Louis,M0)溶於無菌水，按照0.01mL/g的體積腹膜內施用。將CocE或CocE突變體用磷酸鹽緩衝鹽水稀釋為不同的濃度，按照0.2mL/小鼠的體積靜脈內施用。結晶和結構確定。桉照先前的描沭(Larsenetal.2002)，利用懸滴蒸汽擴散法生長晶體。對於收集來說，向每個懸滴中添加2μL冷凍保護劑(5mMTrispH7.0，1.5M硫酸銨，IOmMHEPESpH7.5,2mMMgCl2,ImMEDTA,825mMNaCl，25%甘油和當標明的時候ImMDTT)，然後將晶體轉移到100%冷凍保護劑中，在液氮中快速冰凍。在盤設置(trayset-up)後3天內收集晶體。在由GM/CA-和LS-CAT提供光束線的AdvancedPhotonSource中收集衍射強度，然後利用HKL2000處理(reduce)和標定(scale)(Otwinowskietal,1997)。初相(initialphases)來自於利用先前公開的CocE結構的直接分子取代(Larsenetal，2002)。REFMAC5用於最大似然完善和模型構建，利用0和C00T進行水添加。提供所有的突變側鏈的明確密度。收集總共23個數據集，每個晶體類型都有多個數據組，從而可以比較H2-H3環的特性。利用PyMol[http://www.pymol.org]作圖。坐標和結構因子儲存於PDB，登錄號為2QAY(T172R)，2QAX(G173Q)，2QAW(T172R/G173Q)，2QAV(L169K)，2QAT(無配體的野生型)和2QAU(具有DTT加合物的野生型)。MM熱穩定突變的設計。古柯鹼酯酶包含3個不同的結構域。結構域1(殘基1-144和241-354)構成典型的α/β-水解酶摺疊。結構域II(殘基145-240)是插入結構域I的鏈β6-β7之間的一系列7個α-螺旋。結構域111(355-574)主要由β-片層組成，包括總的來說凝膠捲樣拓撲結構(圖22Α)。進行計算機研究，包括MD模擬以及後續的能量分析以鑑定圍繞活性位點6-25人的殼內的將穩定化CocE的取代。這種基於結構和機理的CocE突變體設計組合了以下方法能量最低化和利用AMBER(Caseetal,2004)的MD模擬以及利用RosettaDesign程序的建模研究(KuhlmanandBaker，2000)。儘管CocE在溶液和晶體中是二聚體，但建模是利用單體進行的。表1總結的數據表明，下列突變可以在熱力學上穩定化CocE結構:R41I,N42V,K46A,S56G,T74S,F84Y,L119A,V121D,T122A,Q123E,S140A,L146P,A149S,Y152H,S159A,L163V,V160A,S167A,T172R,G173Q,F189L,A193D,A194R,I218L,W220A,V225I,T254R,V262L,S265A,W285T,A310D,C477T,L508G,K531A,Y532F，和D533S。CocE結構上的突變位置顯示於圖22A。根據預測這些單突變中的每一種將穩定化CocE結構2.1到4.5kCal/mol，表明該蛋白的半衰期時間在室溫下將延長至約30到1000倍(表1)。為了檢驗這些預測，在大腸桿菌中表達編碼CocE中突變的cDNAs，然後通過動力學和穩定性分析表徵所獲蛋白。在檢測的36種突變體中，圍繞結構域II的螺旋2聚集的3種突變看起來提高酶在37°C的穩定性，並且沒有顯著降低催化效率，如下所述。表1.顯示在37°C溫育後穩定性提高的突變CocE。通過將酶在37°C預溫育不同時間來確定τ1/2。在RT(25°C)確定活性測量值。τ1/2為12分鐘(即野生型[wt]CocE的τ1/2)或更短的突變酶被認為不是熱穩定的。W0/2008/008358中也有該表。體外動力學分析。為了評價野牛型和突變CocE的酶活性，利用分光光度分析法在37°C直接檢測古柯鹼的水解(Xieetal，1999)。初始速率然後用於確定Michaelis-Menten參數。為了評價熱穩定性，在測量剩餘活性前，將酶製劑在37°C預溫育不同的時長(表1和圖23)。37°C的滅活以時間依賴性的衰變方式發生。在沒有DTT的情況下，Wt-CocE在37°C的預溫育按照指數規律降低酶活性，滅活半衰期(τinact)大約為25分鐘。36種預測突變體中的3種增加CocE的酶穩定性:T172R(τinact=46分鐘)，G173Q(τinact=35分鐘；數據未顯示)和L169K(τinact274分鐘)。儘管T172R和G173Q突變體未顯示對酶催化效率的不利影響(kcat分別為1XIO8和2XIO8)，但L169K的kcat被降低，很可能是其對於古柯鹼酯酶的Km增加至5倍的結果(表2)。有趣的是，看起來在37°C顯示顯著穩定性的突變體都位於結構域II的螺旋2(圖22B)。結構域II還接近活性位點，很有可能，至少就L169K來說，導致對k。at的影響。還值得注意的是觀察到將酶與DTT溫育看起來加速野生型酶的衰變，但對T172R/G173Q和L169K沒有作用(圖24)。還確定了DTT可以採用看起來混合競爭和非競爭的方式(未顯示)抑制古柯鹼水解，其Ki為380mM(圖25)。當將所述突變組合看起來進一步增強酶在37°C的穩定性時，未觀察到DTT的作用(未顯示)。表2.野牛型和重新設計CocE突奪體的動力學特件。桉照方法部分的描沭，檢測wt-CocE，T172R，T172R/G173Q或L169K的純化製品對古柯鹼的代謝作用。利用Prism(Graphpad,SanDiego,CA)估算Michaelis常數，Km禾口KcatoT172R/G173Q的活性(儘管仍然對37°C的溫育敏感)，但顯示增強的穩定性和衰變τinact326分鐘。但是，觀察到的催化活性穩定化在其最大催化速率的大約35%(即在t=10小時)。這種失活模式在性質和數量上不同於T172R和G173Q單突變體以及wt-CocE的表現，但類似於L169K的表現。出人意料的是，三突變體(L169K/G173Q/T172R)未顯示增強的穩定化(數據未顯示)。為了檢驗37°C酶穩定性的提高是否表示蛋白摺疊的熱穩定性提高，在逐漸增高的溫度下評價CocE的能力(圖26)。在大約30-35°C30分鐘後，wtCocE的活性突然直降。L169K和T172R/G173Q均在更高的溫度(40-45°C)下失活。不同溫度下比較wt-CocE和T172R/G173Q的圓二色性分析(近UV分析)具有與催化活性的損失一致的熔解溫度。體內分析。在施用古柯鹼前1分鐘用wt-CocE、L169K、T172R或T172R-G173Q預治療保護小鼠免於古柯鹼誘導的致死性(圖27)。酶保護作用(按照0.3mg，或9mg/kg)將100mg/kg古柯鹼的LD5tl值(對於載體治療組來說)改變為560和670mg/kg(對於wt-CocE、T172R或T172R-G173Q來說)(圖28)。L169K的功效稍低，需要更大的劑量(lmg,或30mg/kg)來產生類似的古柯鹼劑量反應曲線向右遷移6-7倍，與體外分析中觀察到的催化效率降低吻合。儘管利用低劑量(0.Img)的任一種酶的預治療(大於30分鐘)不能有效抵抗古柯鹼的致死效應，但是更大的劑量(0.3mg和lmg)看起來是有效的，其持續時間取決於突變(圖28，並概述於圖29)。在試驗的最大劑量(Img)下，對於wt-CocE來說保護至50%致死率所需的酶預治療時間(LT50)是大約14分鐘。對於T172R(LT5tl1.8小時)、L169K(LT503.3小時)和T172R-G173Q(LT5tl4.5小時)來說觀察到顯著更長的LT5(1s，與體外數據一致。穩定化突變體的結構分析。測定Wt-CocE(1.5人)，以及熱穩定突變體L169K(1.6A)、T172R(2.0A)、G173Q(2.5A)和T172R/G173Q(2.0A)的高解析度X射線晶體結構。圖30概述了一些結果。關於無配體Wt-CocE的結構的描述先前沒有報導，這是我們研究中用於比較所必需的。L169K、T172R、G173Q和T172R/G173Q的結構都顯示對於它們突變側鏈的有序密度(圖31)。在所有情況下，取代看起來增加CocE結構域之間接觸/掩藏表面區域的數量。側基烷基鏈的延伸和在T172R通過精氨酸取代添加胍鹽部分產生與螺旋H3中F189芳香環的範德華接觸以及胍鹽部分與F189的主鏈氧之間的氫鍵(圖31A，B)。胍鹽側鏈還對著二聚體相關亞單位提供的1205側鏈堆積。G173Q的側鏈與結構域I中P43的主鏈羰基形成跨結構域的氫鍵，以及與Y44(其羥基促成活性位點的氧陰離子洞)的範德華接觸(圖31C，D)。L169K取代還與結構域I中Y44的苯基環形成接觸(圖31E，F)。賴氨酸的更長側鏈可以影響古柯鹼託烷環的結合位點，可能導致該突變體顯示的更高Km。在先前報導的結構(1JU3和1JU4)和我們的結構中，對於包括H2和H2-H3環C端的區域(殘基171-183，如圖32所示)來說，我們觀察到多種不同的構象。這兩種構象在溶液中有可能是平衡的，但這兩種狀態的群看起來受H2內突變的影響。因為穩定化突變體發現於H2螺旋中，所以假設突變體可能有助於降低該區域的構象柔性，從而熱保護酶的摺疊。對於該分析來說，該區域的「out」構象被定義為由1JU3苯基硼酸加合物晶體結構代表，其中與「in」構象(由1JU4安息香酸晶體結構代表)相比，該區域彎曲遠離結構域I的H5-H6螺旋直至3.3人。還觀察到該環區的第三種構象，其類似於1JU4的構象，除了殘基178-181具有獨特的構象外。H2-H3的表觀球狀柔性控制每個螺旋內的獨特側鏈構象。例如，在『out』構象中，1175向H3移動，迫使F189離開H2和H3之間的疏水界面，而『in，構象允許F189在該界面的裡或外。T172R突變體的結構顯示F189傾向於通過R172和F189側鏈的緊密接觸採用「out」位，這是一種在T172R/G173Q突變體中更佔優勢的傾向。這些數據表明鎖定F189的平面構象可能有助於T172R取代的熱穩定化效應。在T172R或野生型背景下，丙氨酸取代189位的苯丙氨酸未顯示熱穩定性的任何增強或減弱。因此，R172與H3螺旋自身或或許與二聚體相關亞單位的相互作用看起來導致穩定性的增強。CocE活性位點中DTT-碳酸酯加合物的形成。導致該研究複雜化的是活性位點中格外強的密度，這看起來對應於與CocE的催化絲氨酸(Serll7)的共價加合物。這類密度先前未被報導(圖33)(Larsenetal，2002)。電子密度對應於具有兩個取代臂的五元環。異常差異Fourier圖證實了每條臂中硫的存在，2F。-F。omit圖描繪了不同水平上鑑定的加合物中的氧原子(圖33)。因此，可以總結得出，所述密度對應於DTT，其包括在結晶和收集液(IOmM)中，與活性位點的重碳酸鹽反應。2-氧代-二氧戊環顯示被捕獲為四面體中間體末端(dead-end)複合物，其中四面體氧中的一個佔據氧陰離子洞形成加合物，2_氧代-二氧戊環丁醯碳酸酯或DBC。在最高解析度的結構(L169K)中，二氧戊環中估計由碳酸酯提供的碳是距S117Y-氧(氧陰離子洞中的氧)1.6人(距離不受高解析度結構精修(refinement)的限制)，距氧陰離子洞中的氧和DTT提供的兩個氧原子1.4-1.5人，最符合共價鍵。這種四面體碳的電子密度低於DTT配體中其他碳的電子密度，表明電子退出。2-氧代-二氧戊環加合物採用與含CocE的2苯基硼酸鹽加合物類似的構象(Larsenetal,2002)，除了四面體中心是轉動的以外。為了證明這種加成複合物的形成不是我們的穩定化突變體的結果，確定有和沒有DTT條件下的Wt-CocE結構，並且還確定沒有DTT條件下CocE穩定化突變體的結構。在DTT與CocE共結晶的所有情況下，觀察加合物，在有或沒有DTT的條件下H2-H3插入物的位置基本上是一樣的。在本文測試的體外條件下，即與DTT相對較短的溫育時間(<60分鐘)，DTT與底物競爭性地抑制CocE活性。應注意隨著溫育時間從數天到數周(可想像地允許DBC加合物形成的時間尺度)晶體生長條件是顯著不同的。加合物形成還應展示顯著不同的抑制模式，表現為非競爭性的抑制劑。有DTT或沒有DTT條件下生長並且隨後浸入古柯鹼類似物阿託品(看起來取代加合物)的晶體反而顯示水分子靠近S117和高B-因子(針對包括催化三聯體的Sl17和H287的活性位點殘基)。迄今為止，CocE是最有效的水解古柯鹼和降低古柯鹼體內水平的催化劑，用於在小鼠和大鼠中保護免於古柯鹼誘導的致死性(Turneretal,2002；Koetal,2007；Cooperetal,2006；Garreraetal,2005；Gasioretal,2000；Danielsetal,2006；TO/2008/08358)。齧齒動物中古柯鹼毒性這種「解毒劑」的有效性提示CocE是人類中的潛在治療劑。但是，Wt-CocE顯示相當的不穩定性，因為其在血流中的有效半衰期是10分鐘。比較起來，四聚體BchE，在小鼠血漿中維持16小時，直至注射後7小時仍有活性(Duysenetal，2002)，而抗古柯鹼Ab在小鼠循環中維持8.1天(Normanetal，2007)。即使如此，Wt-CocE的臨床潛力表明其保護作用的持續時間在急性過量情況下(諸如由嗅吸或注射造成的過量)有可能是足夠的(Landryetal，1993)。在涉及嚴重過量的情況下，就如「cocainemules」(其中大量古柯鹼將釋放入血流很長一段時間)的情況一樣，需要作用時間更長的CocE。因此CocE較短的有效血漿半衰期代表了在開發用於古柯鹼誘導致死性的急性治療和古柯鹼濫用的慢性治療的基於該蛋白的治療劑中的主要障礙。此處，提供體外數據來證明相對較短的體內半衰期可能是體外容易觀察到的CocE熱滅活的結果。CocE的熱靈敏性可能反映以下事實，紅球菌屬物種(分離CocE的微生物)在大約20°C的中等溫度下在古柯植物下的土壤中生長茂盛(Mackay，1886；Martin,1952)，遠遠低於齧齒動物的體溫(37-38°C)。在計算預測的36種突變體中，3種突變顯示增強的熱穩定性。許多突變體是不穩定的，不能被過表達和純化為功能性酶(表1)。通過組合熱穩定點突變體中的兩種，產生相當熱穩定的CocE突變體G173Q/T172R，這將37°C的體外τinact從10分鐘延長到4-1/2小時，或大約27倍。在齧齒動物中作為突變體保護免於急性古柯鹼誘導的致死性的能力的函數的突變體體內分析與體外分析一致。計算建模研究的結果是驚人的，因為在574個胺基酸殘基的酶中鑑定出數種穩定的突變體。令人遺憾地是，這些方法的解析度不足以闡明突變體熱穩定化效應的準確機制。但是，結合X射線結晶法有可能在原子解析度弄清導致增強穩定性的合理模型。通常更大的或帶電荷的殘基的取代諸如穀氨醯胺(取代甘氨酸)，賴氨酸(取代亮氨酸)或精氨酸(取代蘇氨酸)有助於穩定化結構域-結構域相互作用。酶中最不熱穩定的結構域經鑑定是結構域II，其包含H2和H3螺旋。H2-H3螺旋中熱穩定取代的位置，和H2-H3環自身的結構異質性表明，H2-H3螺旋區是固有不穩定的，可能最終成核或至少很大程度上導致CocE的聚集或解摺疊。來自李斯特氏菌屬(Listeria)和假單胞菌屬(Pseudomonas)物種(兩種都能夠在37°C存活)的CocE直向同源物具有顯著更短的H2M13螺旋，因此具有有可能更穩定的結構域2(Genbank登錄號分別為ZP01928677和YP660510)。但是，CocE中H2和H3螺旋之間環的平截或完全去除將酶滅活(參見表1)。CocE活性位點中DTT-碳酸酯加合物的存在顯然由酶催化。其他碳酸酯，諸如碳酸丙烯酯(4-甲基-2-氧代-1，3-二氧戊環)據報導在水中被分解成丙二醇和C02。從DTT的逆向合成，鄰位二醇和CO2因此是可以想像得到的。DTT加合物看起來與催化性S117共價結合，大部分以如苯基硼酸的總的方式(Larsenetal，2002)，儘管其1.6人的鍵長(與1.43人的預期距離形成對照)表明部分共價特性。DBC二氧戊環的環平面與CocE的苯基硼酸和安息香酸結合形式的苯環平面重疊(Larsenetal，2002)。因為結合DBC的wt-CocE的活性位點殘基的構象與苯基硼酸的結合形式相差很小，Larson等(2002)在晶體結構中未觀察到加合物有可能歸因於安息香酸或苯基硼酸鹽的互斥結合。CocE的晶體結構表明酶作為二聚體存在，初步研究表明該二聚體在低濃度是足夠穩定的可以通過凝膠過濾分辨，儘管37°C的預處理誘導蛋白聚集並從尺寸排阻柱的柱空隙中洗脫。有趣地是，T172R/G173Q和L169K失活的動力學仔細分析顯示，活性在第一相位按指數規律降低，但看起來在其最大活性的大約35%處達到平臺期。與wt-CocE、G173Q和T172R(其中活性在90分鐘內衰變至低於10%活性)相反，這種活性甚至在大於8小時後仍然保持。對於這種特性(T172R/G173Q和L169K的)的貌似合理的解釋是，仍然存在酶的熱敏感部分，其不導致完全的酶失活。剩餘的熱敏感區可以位於二聚體界面，該二聚體界面的破壞可能導致聚集。先前提及的凝膠過濾層析數據與該觀點一致。實際上，正在進行二聚體界面內其他突變體的進一步研究和表徵。或許突變最引入注目的效果是由它們體內保護免於古柯鹼誘導的致死性的能力顯示的。突變的效果相應於通過延長酶能夠抵禦的預處理持續時間的我們的體外數據。就T172R/G173Q而言，酶仍然能夠保護免於古柯鹼誘導的致死率達到50%的預治療持續時間被延長至大於20倍，或延長直至4.5小時。這有力表明CocE體內不穩定性的原因與體外觀察到的酶不穩定性的原因相同。總之，本工作顯示組合計算、生化和結構分析的多管齊下(multi-pronged)方法可用於合理開發比天然酶顯著更穩定的CocE變體。實施例5.CocE實變體L169K/G173Q如下製備和表徵CocE的突變體L169K/G173Q。熱穩定突變的設計。基於細菌古柯鹼酯酶(CocE)的X射線晶體結構(PDB編號1JU3)(Larsenetal，2002)，利用AMBER程序(Caseetal，2004)(參見上面的實施例4)內嵌有的能量最低化和分子動力學(MD)模擬構建結合(-)_古柯鹼的CocE的完整3D模型。為了增加CocE的熱穩定性，使用在RosettaDesign程序中實施的計算法(KuhlmanandBaker,2000；Korkegianetal，2005)。該方法能夠預測指定摺疊內的熱穩定化突變，並將有可能結構性破壞活性位點結構或抑制其柔性的主鏈任意變化降至最低。RosettaDesign程序中實施的方法使用能量函數評價指定摺疊的特定序列的擬合度，並使用MonteCarlo檢索算法用於對序列空間進行取樣。相同方法被其他研究人員成功用於增加酶的熱穩定性並且不降低催化效率(KuhlmanandBaker,2000；Korkegianetal，2005)。使用RosettaDesign程序的計算建模能夠預測潛在降低能量從而增加CocE熱穩定性的一組突變。作為合理設計的第一輪，簡化計算法，只考慮與催化部位相距6-25人的胺基酸殘基上的可能突變。定點誘變。將169和173位的點突變導入CocEcDNA，所述CocEcDNA被克隆入細菌表達載體pET_22b(+)。使用改進的QuickChange(Stratagene)誘變方案和單寡核苷酸引物產生突變。為了產生雙突變體，具有單個G173Q點突變的cDNAs被用作導入L169K的第二輪誘變的模板。雙向測序突變體的完整編碼區。野生型和CocE突變體在37°C生長的大腸桿菌BL-21Gold(DE3)細胞中表達為C端6XHis標記的蛋白。在18°C用ImM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG，Fisher)誘導蛋白表達12小時。古柯鹼酯酶和突變體的純化。沉澱細胞,將其重懸於含蛋白酶抑制劑(亮抑酶肽和利馬豆或大豆胰蛋白酶抑制劑各3μg/ml)的50mMTrispH8.0,150mMNaCl中，然後利用Frenchpress(ThermoFisherScientificCorp,USA)裂角軍。使用Talon金屬親禾口層析(ClontechLaboratories,Inc,MountainViewCA),U^^^Μ(Q-Sepharose,GEHealthcare,PiscatawayNJ)層析富集野生型或突變的CocE。利用包含20mMHepespH8.0,2mMMgCl2,ImMEDTA和ImMDTT的150_450mMNaCl線性梯度緩衝液從Q-S印harose柱洗脫CocE。合併峰組分，通過Centricon-30(Millipore)進行濃縮，迅速在液氮中冰凍，然後保存於-80°C。催化效率的確定。為了確定催化活件，講行分光光度分析。向包含遞增古柯鹼濃度(0.5,2.5,5,12.5，25，50，100，和150μM)的96孔UV可透過平板中添加L169K/G173QCocE的樣品得到10ng/mlCocE的終濃度，終體積為200μ1。使用SOFTmaxPro軟體(Version3.1.2)，通過SpectraMaxPlus384UV板讀數器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)檢測20分鐘內240nm處的吸光度變化，每10秒讀一次。將吸光度的變化轉化為濃度的變化，然後確定每摩爾酶的衰變速率(Keat)。利用Prism(GraphPadsoftware,SanDiego)確定酶的Kcat和Km。L169K/G173Q突變使得每分子酶每分鐘能夠將大約6000個古柯鹼分子轉化為無活性的代謝產物。Keat相對於野生型和先前的T172R/G173Q突變的增加伴隨Km的增加，這導致與野生型和T172R/G173Q突變類似的催化效率(圖34)。體外半衰期的確定。為了模擬NIHSwiss小鼠中的體溫和酶濃度，在37°C水浴中溫育濃度為60μg/ml的CocE，其溶於人血漿或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)pH7.4中。將在-80°C保存不同時間(O，24，48，77，96，120小時)的樣品直接添加到37°C水中，然後在如上所述的lOng/ml終濃度下分析所有樣品。169和173位賴氨酸和穀氨酸的分別取代將體外半衰期延長到大約72小時，這是野生型酶的332倍，是T172R/G173Q突變的17倍(圖35)。體內功效的確定。體內也顯示Kcat的增加。L169K/G173Q突變的CocE劑量依賴性地保護小鼠免於遞增的致命劑量古柯鹼的傷害(圖36)。將0.2ml體積的CocEIV施用入NIHSwiss小鼠的尾靜脈。1分鐘後將不同濃度的古柯鹼輸送到腹膜內腔。這種突變體被證明比先前的CocE突變體更有效，在低至0.Olmg的劑量仍維持一定程度的保護。功效的增加將允許使用更少的酶，從而減輕動物對蛋白的先天性免疫應答。在與其他酶突變相同的濃度下，功效的增加使得該酶能夠更加有效的抵抗極端劑量的古柯鹼(可見於人服用過量的情況下)。體內半衰期的鑑定。將0.2ml體積的CocEIV施用到尾靜脈。在CocE施用後指定時間用腹膜內輸送的180mg/kg古柯鹼攻擊動物。在Img檢測CocE的L169K/G173Q突變體與其他突變體，因為在初步研究中不同CocE突變體的體內熱穩定性之間Img的CocE顯示最大的區別(數據未顯示)。CocE(Img)的L169K/G173Q突變體保護50%的NIHSwiss小鼠不死亡直至7.5小時。與先前的突變相比，更低劑量的L169K/G173Q突變也顯示延長的免於致死性的保護(圖37)。SEQIDNO1~紅球菌屬CocE胺基酸序列1mvdgnysvasnvmvpmrdgvrlavdlyrpdadgpvpvllvrnpydkfdvfawstqstnwl61efvrdgyavviqdtrglfasegefvphvddeadaedtlswileqawcdgnvgmfgvsylg121vtqwqaavsgvgglkaiapsmasadlyrapwygpggalsveallgwsaligtglitsrsd181arpedaadfvqlaailndvagaasvtplaeqpllgrlipwvidqvvdhpdndeswqsisl241ferlgglatpalitagwydgfvgeslrtfvavkdnadarlvvgpwshsnltgrnadrkfg301iaatypiqeattmhkaffdrhlrgetdalagvpkvrlfvmgidewrdetdwplpdtaytp361fylggsgaantstgggtlstsisgtesadtylydpadpvpslggtllfhngdngpadqrp421ihdrddvlcystevltdpvevtgtvsarlfvsssavdtdftaklvdvfpdgraialcdgi481vrmryretlvnptlieageiyevaidmlatsnvflpghrimvqvsssnfpkydrnsntgg541viareqleemctavnrihrgpehpshivlpiikr參考文獻Administration,S.A.a.Μ.H.S.DrugAbuseWarningNetwork,2005NationalEstimatesofDrug-RelatedEmergencyDepartmentVisits,(ed.OfficeofAppliedStudies,U.D.o.H.a.H.S.)(2005)·Baird,T.J.，Deng,S.X.，Landry,D.W.，Winger,G.&Woods，J.H.Naturalandartificialenzymesagainstcocaine.I.Monoclonalantibody15A10andthereinforcingeffectsofcocaineinrats.JPharmacolExpTher295,1127-34(2000).BaumanJLandDiDomenicoRJ.JCardiovascPharmacolTher7,195-202(2002).Benowitz,N.L.Clinicalpharmacologyandtoxicologyofcocaine.PharmacolToxicol72,3—12(1993).Bresler,Μ.Μ.,Rosser,S.J.,Basran,A.&Bruce,N.C.GenecloningandnucleotidesequencingandpropertiesofacocaineesterasefromRhodococcussp.strainMBl.ApplEnvironMicrobiol66，904—8(2000).Browne,S.P.,Slaughter,Ε.A.,Couch,R.A.,Rudnic,Ε.M.&McLean,A.M.TheinfluenceofplasmabutyryIcholinesteraseconcentrationontheinvitrohydrolysisofcocaineinhumanplasma.BiopharmDrugDispos19，309-14(1998)·Carmona,G.N.etal.PlasmabutyryIcholinesteraseactivityandcocainehalf-lifediffersignificantlyinrhesusandsquirrelmonkeys.LifeSci59，939-43(1996).Carmonaetal.DrugMetabolism&Disposition28,367-371(2000).Carrera,M.R.，Ashley,J.A.，Wirsching,P.，Koob,G.F.&Janda,K.D.Asecond-generationvaccineprotectsagainstthepsychoactiveeffectsofcocaine.ProcNatlAcadSciUSA98，1988-92(2001).Carrera,M.R.etal.Treatingcocaineaddictionwithviruses.ProcNatlAcadSciUSA101，10416-21(2004).Carrera，M.R.，Trigo,J.M.，Wirsching,P.，Roberts，A.J.&Janda，K.D.EvaluationoftheanticocainemonoclonalantibodyGNC92H2asanimmunotherapyforcocaineoverdose.PharmacolBiochemBehav81，709-14(2005)·CarrollFI，HowellLLandKuharM.J.JMedChem42,2721-2736(1999).Case，D.A.etal.AMBER8.UniversityofCalifornia,SanFrancisco(2004).TheCCP4suite-programsforproteincrystallography.ActaCrystallogrDBiolCrystallogr50，760-3(1994).Comer，S.D.etal.Depotnaltrexone:long-lastingantagonismoftheeffectsofheroininhumans.Psychopharmacology(Berl)159,351-60(2002).Cooper,Z.D.etal.Rapidandrobustprotectionagainstcocaine-inducedlethalityinratsbythebacterialcocaineesterase.MolPharmacol70，1885-91(2006).Daniels，A.，Ayala，E.，Chen，W.，Coop,A.&Matsumoto，R.R.N-[2-(m-methoxyphenyl)ethyl]-N-ethyl-2-(1-pyrrolidinyl)ethylamine(UMB116)isanovelantagonistforcocaine-inducedeffects.EurJPharmacol542,61-8(2006).Deng，S.X.，dePrada,P.&Landry,D.W.Anticocai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化合物中的不止一種組合。22.權利要求17-21中任意一項的方法，其中CocE包括與SEQIDNO1至少90%相同的胺基酸序列。23.權利要求17-21中任意一項的方法，其中CocE包括與SEQIDNO1至少95%相同的胺基酸序列。24.權利要求17-21中任意一項的方法，其中CocE包括與SEQIDNO1至少99%相同的胺基酸序列。25.權利要求17-21中任意一項的方法，其中CocE包括SEQIDNO1的胺基酸序列。26.權利要求17-24中任意一項的方法，其中CocE是野生型CocE的熱穩定突變體，所述野生型CocE具有SEQIDNO1的胺基酸序列。27.權利要求26的方法，其中CocE具有SEQIDNO=I的胺基酸序列，除了取代T172R，S159A,N197K,L169K,F189K,G173Q,或T172R/G173Q之外。28.權利要求26的方法，其中CocE具有SEQIDNO=I的胺基酸序列，除了取代L169K/G173Q之外。29.權利要求17-28中任意一項的方法，其中CocE位於體外。30.權利要求29的方法，其中所述化合物在CocE純化期間與CocE組合。31.權利要求29的方法，其中所述化合物在CocE保存期間與CocE組合。32.權利要求17-27中任意一項的方法，其中CocE位於活的哺乳動物中。33.權利要求32的方法，其中所述哺乳動物是人。34.一種治療患有古柯鹼誘導狀況的哺乳動物的方法，所述方法包括以足以降低所述古柯鹼誘導狀況對哺乳動物影響的方式給所述哺乳動物施用權利要求16的組合物。35.權利要求34的方法，其中所述哺乳動物是人。36.權利要求34或35的方法，其中所述古柯鹼誘導狀況是服用古柯鹼過量，古柯鹼毒性，古柯鹼成癮，或古柯鹼依賴。37.權利要求36的方法，其中所述哺乳動物對古柯鹼成癮。38.權利要求36的方法，其中所述哺乳動物服用古柯鹼過量。39.權利要求34-38中任意一項的方法，其中CocE是野生型CocE的熱穩定突變體，所述野生型CocE具有SEQIDNO1的胺基酸序列。40.權利要求39的方法，其中CocE具有SEQIDNO=I的胺基酸序列，除了取代T172R，S159A,N197K,L169K,F189K,G173Q,或T172R/G173Q之外。41.權利要求39的方法，其中CocE具有SEQIDNO=I的胺基酸序列，除了取代L169K/G173Q之外。42.權利要求34-41中任意一項的方法，其中所述化合物是43.權利要求42的方法，其中所述化合物是44.權利要求42的方法，其中所述化合物是45.權利要求42的方法，其中所述化合物是46.權利要求42的方法，其中所述組合物包括所述化合物中的不止一種。47.一種治療服用古柯鹼過量的哺乳動物的方法，所述方法包括以足以降低所述古柯鹼對哺乳動物影響的方式給所述哺乳動物施用權利要求16的組合物。48.權利要求47的方法，其中所述哺乳動物是人。49.權利要求47或者48的方法，其中將所述組合物給哺乳動物靜脈內施用。50.權利要求47-49中任意一項的方法，其中CocE是野生型CocE的熱穩定突變體，所述野生型CocE具有SEQIDNO1的胺基酸序列。51.權利要求50的方法，其中CocE具有SEQIDNO:1的胺基酸序列，除了取代T172R，S159A,N197K,L169K,F189K,G173Q,或T172R/G173Q之外。52.權利要求50的方法，其中CocE具有SEQIDNO=I的胺基酸序列，除了取代L169K/G173Q之外。53.權利要求47-52中任意一項的方法，其中所述化合物是54.權利要求53的方法，其中所述化合物是55.權利要求53的方法，其中所述化合物是56.權利要求53的方法，其中所述化合物是57.權利要求53的方法，其中所述組合物包括所述化合物中的不止一種。58.一種治療患有古柯鹼依賴的哺乳動物的方法，所述方法包括以足以降低所述古柯鹼依賴對哺乳動物影響的方式給所述哺乳動物施用權利要求16的組合物。59.權利要求58的方法，其中所述哺乳動物是人。60.權利要求58或者59的方法，其中將所述組合物給哺乳動物靜脈內施用。61.權利要求60的方法，其中通過小輸液泵施用所述組合物。62.權利要求58-61中任意一項的方法，其中CocE是野生型CocE的熱穩定突變體，所述野生型CocE具有SEQIDNO1的胺基酸序列。63.權利要求58-62中任意一項的方法，其中CocE具有SEQIDNO1的胺基酸序列，除了取代T172R,S159A,N197K,L169K,F189K,G173Q或T172R/G173Q之外。64.權利要求58-62中任意一項的方法，其中CocE具有SEQIDNO1的胺基酸序列，除了取代L169K/G173Q之外。65.權利要求58-64中任意一項的方法，其中所述化合物是66.權利要求65的方法，其中所述化合物是67.權利要求65的方法，其中所述化合物是68.權利要求65的方法，其中所述化合物是69.70.權利要求65的方法，其中所述組合物包括所述化合物中的不止一種。一種確定化合物是否是蛋白熱穩定劑的方法，所述方法包括在有和沒有所述化合物的條件下檢測蛋白的熱穩定性，其中使蛋白熱穩定性更高的化合物是該蛋白的熱穩定劑。71.權利要求70的方法，其中所述蛋白是酶。72.權利要求70的方法，其中所述蛋白是蛋白酶。73.權利要求70的方法，其中所述蛋白是酯酶。74.權利要求70的方法，其中所述蛋白是古柯鹼酯酶。75.權利要求70-74中任意一項的方法，其中存在於組合物中的所述化合物的濃度低於約ImM。76.權利要求70-75中任意一項的方法，其中存在於組合物中的所述化合物的濃度低於約0.ImM。77.權利要求70-77中任意一項的方法，其中存在於組合物中的所述化合物的濃度低於約0.025mMo78.權利要求70-77中任意一項的方法，其中在所述化合物存在和不存在的條件下通過測量低溫和高溫下的蛋白功能來檢測熱穩定性，其中低溫接近於蛋白功能的最適溫度，和其中該蛋白在高溫下要比在低溫下更不穩定。79.權利要求78的方法，其中所述蛋白功能是酶活性。80.權利要求78的方法，其中所述蛋白功能是配體結合。81.權利要求78的方法，其中所述高溫是約37°C。82.權利要求78的方法，其中所述高溫是大於約50°C。83.權利要求78的方法，其中所述高溫是大於約95°C。84.權利要求78的方法，其中所述蛋白是酯酶，所述高溫是約37°C。85.權利要求84的方法，其中所述酯酶是古柯鹼酯酶。86.權利要求16的組合物在製備用於治療古柯鹼誘導狀況的藥物中的用途。87.權利要求86的用途，其中所述古柯鹼誘導狀況是服用古柯鹼過量，古柯鹼毒性，古柯鹼成癮，或古柯鹼依賴。88.權利要求86的用途，其中所述古柯鹼誘導狀況是服用古柯鹼過量。89.權利要求86-88中任意一項的用途，其中CocE是野生型CocE的熱穩定突變體，所述野生型CocE具有SEQIDNO1的胺基酸序列。90.權利要求89的用途，其中CocE具有SEQIDNO:1的胺基酸序列，除了取代T172R，S159A,N197K,L169K,F189K,G173Q,或T172R/G173Q之外。91.權利要求89的用途，其中CocE具有SEQIDNO:1的胺基酸序列，除了取代L169K/G173Q之外。92.權利要求86-91中任意一項的用途，其中所述化合物是93.權利要求92的用途，其中所述化合物是94.權利要求92的用途，其中所述化合物是95.權利要求92的用途，其中所述化合物是96.權利要求92的用途，其中所述組合物包括所述化合物中的不止一種。97.權利要求16的組合物用於治療古柯鹼誘導狀況的用途。98.權利要求97的用途，其中所述古柯鹼誘導狀況是服用古柯鹼過量，古柯鹼毒性，古柯鹼成癮，或古柯鹼依賴。99.權利要求97的用途，其中所述古柯鹼誘導狀況是服用古柯鹼過量。100.權利要求97-99中任意一項的用途，其中CocE是野生型CocE的熱穩定突變體，所述野生型CocE具有SEQIDNO1的胺基酸序列。101.權利要求100的用途，其中CocE具有SEQIDNO1的胺基酸序列，除了取代T172R,S159A,Ν197Κ,L169K,F189K,G173Q,或T172R/G173Q之外。102.權利要求100的用途，其中CocE具有SEQIDNO1的胺基酸序列，除了取代L169K/G173Q之外。103.權利要求97-102中任意一項的用途，其中所述化合物是104.權利要求100的用途，其中所述化合物是105.權利要求100的用途，其中所述化合物是或106.權利要求94的用途，其中所述化合物是107.權利要求99的用途，其中所述化合物中的不止一種位於組合物中。108.—種編碼CocE多肽的分離的核酸，所述CocE多肽包括與SEQIDNO:1的多肽具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，其中所述編碼的CocE多肽具有(a)取代L169K和G173Q，和(b)與野生型CocE相比在37°C熱穩定性增加的酯酶活性。109.權利要求108的分離的核酸，其中所述胺基酸序列與SEQIDNO:1的多肽具有至少90%的序列同一性。110.權利要求108的分離的核酸，其中所述胺基酸序列與SEQIDNO:1的多肽具有至少95%的序列同一性。111.權利要求108的分離的核酸，其中所述胺基酸序列與SEQIDNO:1的多肽具有至少99%的序列同一性。112.權利要求108的分離核酸，其編碼除了取代L169K和G173Q之外具有SEQIDNO1的序列的CocE多肽。113.由權利要求108-112中任意一項的核酸編碼的CocE多肽。114.一種包括權利要求113的CocE多肽的組合物，其位於藥學上可接受的載體中。115.一種治療患有古柯鹼誘導狀況的哺乳動物的方法，所述方法包括以足以降低所述古柯鹼誘導狀況對哺乳動物影響的方式給所述哺乳動物施用權利要求114的組合物。116.權利要求114的組合物在製備用於治療古柯鹼誘導狀況的藥物中的用途。117.權利要求114的組合物用於治療古柯鹼誘導狀況的用途。全文摘要本發明提供包括古柯鹼酯酶(CocE)和熱穩定化CocE的化合物的組合物。還提供熱穩定化古柯鹼酯酶的方法。此外還提供治療患有古柯鹼誘導狀況的哺乳動物的方法。還提供確定化合物是否是蛋白熱穩定劑的方法。另外提供上述組合物用於治療古柯鹼誘導狀況的用途。還提供編碼具有取代L169K和G173Q的CocE多肽的分離的核酸，和由該核酸編碼的CocE多肽，及其藥物組合物。還提供該組合物在製備用於治療古柯鹼誘導狀況的藥物和治療古柯鹼誘導狀況中的用途。文檔編號A61K38/46GK101903038SQ200880106098公開日2010年12月1日申請日期2008年7月10日優先權日2007年7月10日發明者D·蘭德裡,D·納拉辛罕,J·H·伍德,J·J·G·特斯默,J·麥唐納,M·N·斯託亞諾維克,R·K·蘇納哈拉,R·L·布賴姆申請人:紐約市哥倫比亞大學信託人;密執安大學評議會