克倫特羅快速半定量檢測方法
2023-06-24 14:43:51 1
專利名稱：克倫特羅快速半定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測克倫特羅(clenbuterol，CLB)方法。
背景技術：
克倫特羅又稱鹽酸克倫特羅，或克喘素，俗稱「瘦肉精」，本用於治療哮喘等疾病，在發現它能顯著提高動物的產量和瘦肉率之後，曾一度作為飼料添加劑廣泛用於畜牧業。但是，它毒性大，易在動物組織中殘留，人們常因食入其動物食品而引起中毒。我國雖繼歐美之後，1997年禁止它在飼料中使用，但由於受經濟利益驅使，違法濫用現象仍然存在。據農業部在網上公布的資料，一些不法商販把克倫特羅製成小包裝零售或與飼料搭配銷售，違法銷售轉入地下，更趨隱蔽。因此，在抓緊源頭控制的時，必須加強其安全檢測。
對克倫特羅殘留的檢測目前主要採用高效液相色譜法(HPLC)、氣質聯用法(GC-MS)和酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。GC-MS法和HPLC法靈敏、準確，檢測下限可達0.25ng/mL，但由於這兩種方法需要貴重儀器、樣品前處理繁瑣、分析速度慢，需要幾小時至幾十小時、檢測樣品量少，難以對批量樣品進行檢測，需受過專門訓練的人員才能操作、檢測費用高，幾百上千元/樣，所以應用面窄，僅以一些重要的衛生防疫和質量檢驗監督部門採用為主，通常對初步檢測為陽性的樣品確認時採用。ELISA法是目前研究較多的克倫特羅檢測方法，具有靈敏度高，檢測量大，樣品前處理簡單，比儀器分析時間短、成本低，檢測下限可達0.09ng/mL以下。歐美多家公司已有ELISA試劑盒投放市場，如英國Randox公司的試劑盒銷往全球。但該方法仍需酶標儀等部分設備，分析時間1-3小時，難以在現場採用。
為克服其缺點，使對克倫特羅的檢測更方便、時間更短、成本更低，一些單位開展了膠體金檢測試紙研究，並有「鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條」、「一種免疫層析一步法檢測腎上腺素激動劑類藥物的方法及試紙的製備」的報導，這兩則報導所描述的技術只能定性檢測，不能半定量檢測，且組合線只有2條，而本申請所描述的試紙，為半定量試紙，加有延長部分或增厚部分，組合線數2-4條。另外也有「半定量快速檢測鹽酸克倫特羅的膠體金試紙條及生產和使用方法」的報導，其與本申請不同之處在於第一、其無參考線；第二、在使用方法上，其樣品中鹽酸克倫特羅含量越高，檢測線顯色條數多，而本申請的所描述的試紙，樣品中克倫特羅含量越高，檢測線顏色越淺，檢測線顯色條數越少。以上幾則其他研究者的報導，在膠體金標記部分和檢測反應部分之間都無任何其他材料，而本申請所描述的試紙在膠體金標記部分和檢測反應部分之間加有延長部分，或在膠體金標記部分之下或之上加有增厚部分。因此，本申請克服了上述幾則報導的缺點，研製出了克倫特羅半定量檢測試紙。
發明內容
本設計的目的研製出簡便、靈敏、價格低廉的克倫特羅快速半定量檢測方法。
現結合附圖對發明進行說明附
圖1為本發明的結構示意圖。圖中1為樣液吸收部分、2為膠體金標記部分、3為檢測反應部分、4為檢測線、5為參考線、6為吸水部分。它們按照下列次序粘貼在背襯上樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應部分、吸水部分。膠體金標記部分為玻璃纖維或醋酸纖維或尼龍膜，其上標記的物質為第二種屬動物蛋白與克倫特羅抗體的混合物，或第二種屬動物蛋白與克倫特羅檢測用抗原的混合物。混合物的混合方法第二種屬動物蛋白與克倫特羅抗體或抗原的混合比例以標準的克倫特羅樣品為標準，當陰性樣品檢測時，參考線和檢測線剛好出現肉眼可見的紅色為準。檢測反應部分上麵包被有克倫特羅檢測用抗原1～3條作為檢測線，或包被有克倫特羅抗體1～3條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1～3條作為參考線。檢測線和參考線組合時不能同時多於1條，組合線條數為2～4條，組合方式為1條檢測線和1條參考線、1條檢測線和2條參考線、1條檢測線和3條參考線、2條檢測線和1條參考線、3條檢測線和1條參考線五種形式。根據半定量檢測的準確度要求，組合線數越多，半定量越準確。
當膠體金標記部分標記對象為第二種屬動物蛋白和克倫特羅抗體混合物時，為了提高檢測試紙的靈敏度，在膠體金標記部分和檢測反應部分之間用玻璃纖維紙或濾紙或吸水紙加有延長部分或在膠體金標記部分之上或之下加有增厚部分。
其中檢測用抗原是指克倫特羅與蛋白質類物質或多糖類物質形成的偶合物，所說蛋白質為牛血清白蛋白、匙孔血、藍蛋白、卵清白蛋白。多糖為葡聚糖、殼聚糖、纖維素。在用膠體金標記抗原時此混合物作為標記的對象，或在用膠體金標記抗體時此混合物作為檢測線上的包被物質；第二種屬動物蛋白指非抗體來源屬動物的蛋白。
本發明所描述的試紙的各部分處理與功能如下背襯為一面塗有不乾膠的不吸水的韌性材料，起固定支持試紙其他組成部分的作用。
樣液吸收部分製備將濾紙或玻璃纖維紙浸入pH7.0～8.4的PBS中2min，取出，80℃烘乾或其他方式乾燥，即作為樣液吸收部分，檢測時起吸收樣品溶液的作用，便於樣品溶液向上移動。
膠體金標記部分的製備該部分起固定膠體金標記的抗原或抗體的作用。製備步驟包括膠體金溶膠的製備、膠體金標記克倫特羅抗體或克倫特羅抗原、膠體金標記部分處理。
(1)膠體金溶膠的製備將氯金酸(HAuCL4)用超純水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超純水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加熱至沸騰，加入1～5mL的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續加熱到出現透明的橙紅色為止，即為膠體金溶膠。
(2)膠體金標記克倫特羅抗體將克倫特羅單克隆抗體或多克隆抗體和第二種屬動物蛋白分別用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)溶解稀釋至2～4mg/mL，每100mL膠體金溶膠加入1～3mL 2～4mg/mL的克倫特羅抗體和1～1.5mL 2～4mg/mL第二種屬動物蛋白，震蕩2min，用0.2mol/L的K2CO3調節pH至8.4，振蕩5min，加入11％PEG-10000 2mL，振蕩5min，8000～15000r/min離心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)復溶，以6000～13000r/min離心15min，除去上清，將沉澱用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)稀釋500～2000倍，產物作為金標克倫特羅抗體(GAb)。
(3)膠體金標記克倫特羅抗原將克倫特羅檢測用抗原和第二種屬動物蛋白分別用PBS(0.01mol/L，pH7.0～8.4)溶解稀釋至2～4mg/mL，每100mL膠體金溶膠加入1～3mL 2～4mg/mL的檢測用抗原和1～1.5mL 2～4mg/mL第二種屬動物蛋白，震蕩2min，用0.2mol/L的K2CO3調節pH至8.4，振蕩5min，加入11％PEG-100002mL，振蕩5min，8000~15000r/min離心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)復溶，以6000～13000r/min離心15min，除去上清，將沉澱用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)稀釋500～2000倍，產物作為金標記的克倫特羅抗原(GAg)。
(4)膠體金標記部分處理將GAb或GAg倒入一槽中，將玻璃纖維紙或濾紙浸入1min，取出，室溫乾燥後，即作為膠體金標記部分。
檢測反應部分製備用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亞胺溶液浸泡硝酸纖維膜或醋酸纖維膜或尼龍膜30min，取出，37℃烘乾，上邊包被1～3條不同濃度的克倫特羅檢測用抗原線或克倫特羅抗體線作為檢測線，同時包被1～3條不同濃度的抗第二種屬動物蛋白的IgG線作為參考線。當膠體金標記部分標記對象為第二種屬動物蛋白和克倫特羅抗體混合物時，檢測線則包被克倫特羅檢測用抗原；當膠體金標記部分標記對象為第二種屬動物蛋白和克倫特羅檢測用抗原混合物時，檢測線則包被克倫特羅抗體；檢測線和參考線不能同時多於1條，組合線數2～4條。此即為檢測反應部分，該部分主要作用是將反應結果以肉眼可見的顏色表徵出來。
吸水部分製備將玻璃纖維紙或濾紙或吸水紙室溫乾燥後，即作為吸水部分。該部分主要作用在於將移動上來的多餘的樣品溶液吸收。
延長部分或增厚部分的製備將玻璃纖維紙或濾紙或吸水紙室溫乾燥後，加在膠體金標記部分和檢測反應部分之間，即為延長部分；覆蓋在膠體金部分之上或粘貼在膠體金部分之下背襯之上，即為增厚部分。
試紙組裝在背襯上依次粘貼樣液吸收部分、膠體金標記部分、延長部分、檢測反應部分和吸水部分，即成克倫特羅半定量檢測試紙。當膠體金標記部分標記對象為克倫特羅抗體和第二種屬動物蛋白時，背襯上增加粘貼延長部分或增厚部分。
檢測原理檢測原理因膠體金標記的對象不同，而稍有差異。
當膠體金標記部分的標記物為第二種屬動物蛋白和克倫特羅抗體混合物時，如果樣品中含有克倫特羅，樣品溶液被試紙的樣液吸收部分吸收並通過毛細作用上移到達膠體金標記部分，樣品溶液中的克倫特羅與膠體金標記的克倫特羅抗體反應形成結合物，結合物繼續上移到檢測線，因膠體金標記的克倫特羅抗體只有一個結合位點，樣品溶液中的克倫特羅與之結合後，檢測線上的檢測用抗原就不能再與膠體金標記的克倫特羅抗體結合，於是檢測線無色；當樣品中沒有克倫特羅時，膠體金標記的克倫特羅抗體到達檢測線時被檢測用抗原捕獲，則形成肉眼可見紅色，此即為陰性。無論樣品中是否含有克倫特羅，膠體金標記的第二種屬動物蛋白上移到達參考線時都可被參考線上包被的抗第二種屬動物蛋白的IgG捕獲形成肉眼可見的紅色，此即為參考線。
當膠體金標記部分的標記物為第二種屬動物蛋白和克倫特羅檢測用抗原混合物時，如果樣品中含有克倫特羅，樣品溶液被試紙的樣液吸收部分吸收並通過毛細作用上移，樣品中的游離克倫特羅分子量小移動速度快，先到達檢測線，先與檢測線上包被的克倫特羅抗體結合，因檢測線上包被的克倫特羅抗體只有一個結合位點，而且樣品中游離的克倫特羅結合能力比偶合態的克倫特羅檢測用抗原強，於是膠體金標記的檢測用抗原不能再被檢測線上的克倫特羅抗體捕獲，於是檢測線無色，此即為陽性；如果樣品中無克倫特羅，則膠體金標記的克倫特羅檢測用抗原到達檢測線後就被檢測線上包被的克倫特羅抗體捕獲，形成肉眼可見的紅色，此即為陰性。無論樣品中是否含有克倫特羅，膠體金標記的第二種屬動物蛋白上移到達參考線時都可被參考線上包被的抗第二種屬動物蛋白的IgG捕獲形成肉眼可見的紅色，此即為參考線。
以上兩種方式的試紙，可以通過調節檢測線和參考線包被物濃度，調節顯色深淺，通過設置多條組合線，並將組合線顏色或顯色條數與標準物質濃度對應起來，即可達到半定量檢測目的。
使用方法(1)1條檢測線+1條參考線形式的試紙檢測線包被有濃度為0.1-30μg/mL的克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅檢測用抗原1條，寬1mm；參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG 1條，寬1mm；兩條線之間間隔2-6mm。當檢測線顏色與參考線顏色相同時，則樣品為陰性；當檢測線與參考線顏色相同時，則樣品為陽性，濃度大於Ang/mL，A為設定的檢測限，可以是大於或等於0.1ng/mL的某一濃度。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
(2)2條檢測線+1條參考線形式的試紙2條檢測線包被有0.01-30μg/mL克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅檢測用抗原，第2條檢測線上包被物的濃度小於第1條檢測線參考線包被物濃度；參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG，寬1mm；各條線之間間隔2-6mm。當兩條檢測線都呈現顏色時，則樣品為陰性；當檢測線第1條檢測線呈色，第2條檢測線不呈色時，則樣品中克倫特羅濃度大於Ang/mL，小於Bng/mL；當兩條檢測線都不呈色時，樣品中克倫特羅濃度大於Bng/mL。A、B為設定的檢測限，可以是大於或等於0.1ng/mL的某一濃度。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
(3)3條檢測線+1條參考線形式的試紙3條檢測線包被有0.01-30μg/mL克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅檢測用抗原，三條檢測線上包被物的濃度依次遞減；參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG；各條線之間間隔2-6mm。當3條檢測線都呈現顏色時，則樣品為陰性；當檢測線第1，2條檢測線呈色，第3條檢測線不呈色時，則樣品中克倫特羅濃度大於Ang/mL，小於Bng/mL，當第1條檢測線呈色，第2，3條檢測線都不呈色時，樣品中克倫特羅濃度大於Bng/mL，小於Cng/mL；當3條檢測線都不呈色時，樣瓶中克倫特羅含量大於Cng/mL；A、B、C為設定的檢測限，可以是大於或等於0.1ng/mL的某一濃度，B大於A，C大於B。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
(4)1條檢測線+3條參考線檢測線上包被有0.01-30μg/mL克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅檢測用抗原，檢測線之後包被有3條參考線，參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG，調節參考線包被物濃度和膠體金標記的第2種屬動物蛋白的標記濃度，使3條參考線的顏色分別與標準樣品中克倫特羅含量為C、B、Ang/mL時檢測線的顏色相同，依此確定參考線包被物濃度；各條線之間間隔2-6mm；當檢測線顏色深於第3條參考線顏色時，表明樣品為陰性；當檢測線顏色深於第3條參考線顏色淺於第2條檢測時，表明樣品中克倫特羅濃度大於Ang/mL，小於Bng/mL；當檢測線顏色深於第2條參考線顏色淺於第1條參考線時，表明樣品中克倫特羅濃度大於Bng/mL，小於Cng/mL；當檢測線不呈色時，表明樣品中克倫特羅濃度大於Cng/mL。
(5)1條檢測線+2條參考線檢測線上包被有0.01-30μg/mL克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅檢測用抗原，檢測線之後包被有2條參考線，參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG，調節參考線包被物濃度和膠體標記的第2種屬動物蛋白的標記濃度，使2條參考線的顏色分別與標準樣品中克倫特羅含量為B、Ang/mL時檢測線的顏色相同，依此確定參考線包被物濃度；各條線之間間隔2-6mm；當檢測線顏色深於第2條參考線顏色時，表明樣品為陰性；當檢測線顏色深於第2條參考線顏色淺於第1條檢測時，表明樣品中克倫特羅濃度大於Ang/mL，小於Bng/mL；當檢測線顏色深於第1條參考線顏色淺於第1條參考線時，表明樣品中克倫特羅濃度大於Bng/mL。
本發明優點①特異性強。由於採用了高質量的克倫特羅單克隆抗體，該試紙檢測特異性極強，與腎上腺素、去甲腎上腺素等結構相似物質和土黴素、金黴素、泰樂菌素、有機鉻、磺胺二甲基嘧啶、鹽酸溴己新、氯黴素、乙氧醯胺苯甲酯、萊克多巴胺、北裡黴素、氟苯化考、甲碸黴素等常用獸藥及飼料添加劑無交叉反應，可避免假陽性。
②靈敏度高。本試紙檢測下限可達到0.09ng/mL，也可根據檢測要求在製備試紙時提高檢測下限到0.09ng/mL以上某濃度，避免了假陽性和假陰性，使結果保證可靠。
③準確性好，能夠半定量。用本試紙檢測結果與德國r-Biopharm公司ELISA試劑盒以及儀器分析的檢測結果相關性完全符合要求。根據檢測線顏色與參考線顏色對比或根據檢測線呈色條數達到半定量檢測目的。
④操作特別方便，無須任何儀器設備，適用面寬。本試紙不需任何專業培訓，不需任何儀器設備，普通人員即可操作，只要將試紙插入檢測液中，用肉眼判讀。各種樣品均可方便地進行測定。因此，本試紙適用面寬，衛生檢驗監督部門、動物養殖單位、屠宰場以及消費者個人均可使用。
⑤檢測速度快，顏色穩定時間長。試紙插入樣液中，若為陰性，30s開始顯色，2min以後便可觀察結果，比目前普遍使用的克倫特羅ELISA試劑盒檢測速度快40～160倍以上，並且其顏色可永久保存。
⑥檢測溫度適宜範圍寬。在4～40℃均可使用，結果正常，不需在低溫下進行，不需採取保溫措施，室內野外均可使用。
⑦試紙保質期長。據加速老化試驗結果，試紙保質期可達2年。
⑧成本低廉本試紙法檢測成本大大低於克倫特羅ELISA試劑盒檢測法，隨著規模化生產後，其成本還會大幅度降低。
具體實施例實施例11條檢測線+2條參考線試紙檢測豬尿中的克倫特羅1、克倫特羅偶合抗原合成克倫特羅偶合抗原分為免疫用抗原和檢測用抗原，前者用於免疫動物，後者用於抗體製備中抗體的檢測篩選和試紙製備中的膠體金標記或檢測線包被。
免疫用抗原製備精確稱取克倫特羅22mg，溶解於2mL，pH1.5～2.0的鹽酸溶液中。加入pH2.0的亞硝酸鈉溶液2mL，反應20min。同時稱取100mg牛血清蛋白溶解於5mL pH7.4，0.1mol/L的磷酸緩衝溶液中，將反應好的克倫特羅重氮鹽加入其中，用1mol/L的氫氧化鈉調pH值至7.5，4℃下反應12小時後。將此反應液用pH7.4，0.01mol/L的PBS溶液透析，分裝為免設用抗原。
檢測用抗原製備採用卵清白蛋白替換牛血清白蛋白，其餘步驟同免疫用抗原製備，所得產物即作為檢測用抗原。
2、克倫特羅單克隆抗體製備取健康5周齡雌性二級Balb/c小鼠6隻進行免疫。第一次基礎免疫將0.1mL克倫特羅免疫用抗原與等量完全弗氏佐劑用攪拌器充分混勻乳化，進行腹腔注射，注射量0.2mL/只。四周後開始進行加強免疫，佐劑換為不完全弗氏佐劑，每隔兩周加強免疫一次，末次免疫3d後取脾臟融合。
先將HAT培養液、IMDM不完全培養液、IMDM完全培養液和50％PEG-6000溶液於37℃水浴中預溫，同時將另一盛水的燒杯放入37℃水浴中預溫。將上述製備好的脾細胞和骨髓瘤細胞和脾細胞按1∶5的比例混合，在50mL塑料離心管內用不完全培養液洗1次，1 200r/min離心8min，棄上清，用滴管吸淨殘留液體。置37℃水浴中，將吸管插入管底，在90s內邊攪拌邊加入預熱的1mL、50％PEG-6000。靜置90s後，於37℃水浴中60s內加入10mL預熱的完全培養液。輕輕懸浮一次，以1000r/min離心6min，棄去上清，先用6mL左右完全培養液輕輕懸浮。根據所用96孔培養板的數量，補加HAT培養液到76.8mL，輕輕混勻，將混勻懸液接種於有飼養細胞的96孔板中，每孔0.1mL，一次接種8塊板。將培養板置於37℃、5％CO2培養箱中培養。融合後7d，用HT培養液半量換液1次，在13d後根據增殖情況改用20％NBS的完全培養液。約7d後出現雜交瘤細胞集落，細胞大、圓且透亮。待集落長至孔底1/3時，在培養板的蓋板上畫上克隆生長的標記，此時即可取上清檢測相應的特異性抗體。細胞完全克隆化後，將細胞注入小鼠腹腔，間隔一段時間等腹水足夠多時，取腹水，將腹水用蛋白A免疫親和層析純化後，即得到克倫特羅單克隆抗體。
3、樣液吸收部分處理將濾紙或玻璃纖維紙等浸入0.1mol/L pH7.4的PBS中2min，取出，80℃烘乾或其他方式乾燥，即成樣液吸收部分。
4、膠體金標記部分的製備和處理膠體金標記部分的製備和處理包括膠體金溶膠製備、膠體金標克倫特羅抗體、膠體金標記部分處理。
膠體金溶膠製備將氯金酸(HAuCL4)用超純水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超純水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加熱至沸騰，加入一定量的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續加熱到出現透明的橙紅色為止，即為膠體金溶膠。
膠體金標記克倫特羅單克隆抗體製備將克倫特羅單克隆抗體和豬血清白蛋白分別用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)溶解稀釋至3mg/mL，每100mL膠體金溶膠加入1mL 4mg/mL的克倫特羅單克隆抗體和1mL 2mg/mL豬血清白蛋白，震蕩2min，用0.2mol/L的K2CO3調節pH至8.4，振蕩5min，加入11％PEG-10000 2mL，振蕩5min，15000r/min離心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.4)復溶，以6000～13000r/min離心15min，除去上清，將沉澱用PBS(0.01mol/L，pH7.5)稀釋1000倍，產物作為金標克倫特羅單克隆抗體。
膠體金標記部分處理將金標克倫特羅單克隆抗體倒入一槽中，將玻璃纖維紙或濾紙浸入1min，取出，室溫乾燥或真空冷凍乾燥，即成為膠體金標記部分。
5、檢測反應部分處理用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亞胺溶液浸泡硝酸纖維膜30min，取出，37℃烘乾，上邊用噴塗機噴塗包被1條克倫特羅檢測用抗原線作為檢測線，濃度為3μg/mL；包被2條羊抗豬血清白蛋白的IgG線作為參考線，靠近下端的濃度為2μg/mL，另一條為1μg/mL。此即為檢測反應部分。
6、延長部分的處理將玻璃纖維紙室溫乾燥後，即作為延長部分。
7、吸水部分處理將吸水紙室溫乾燥後，即作為吸水部分。
8、試紙組裝在背襯上依次粘貼樣液吸收部分、膠體金標記部分、延長部分、檢測反應部分和吸水部分，即成克倫特羅半定量檢測試紙。
9、檢測尿樣直接作為檢測液使用。將試紙條直接插入檢測液，2min後，觀察顏色。若2條檢測線都呈現顏色，表明樣品為陰性；若第1條檢測線呈色，第2條不呈色，則表明樣品中克倫特羅含量為1ng/mL；若第1條檢測線與第2條檢測線都不呈色，則表明樣品中克倫特羅含量為5ng/mL。無論樣品中克倫特羅含量如何，參考線應該顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
其他形式的試紙製備以及其他種類的樣品檢測與實施例1類似。
權利要求
1.克倫特羅快速半定量檢測方法，在試紙的背襯上，粘有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應部分及吸水部分，其特徵在於膠體金標記部分標記的物質為第二種屬動物蛋白與克倫特羅抗體的混合物，或第二種屬動物蛋白與克倫特羅檢測用抗原的混合物，檢測反應部分上麵包被有克倫特羅檢測用抗原1-3條作為檢測線、或包被有克倫特羅抗體1-3條作為檢測線，同時包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1-3條作為參考線，檢測線和參考線不能同時多於1條，組合線數為2-4條。
2.根據權利要求1所說的檢測方法，其特徵在於克倫特羅檢測用抗原為克倫特羅與蛋白質類物質或多糖類物質形成的偶合物。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於第二種屬動物蛋白為指非抗體來源屬動物的蛋白。
4.根據權利要求1所說的檢測方法，其特徵在於所說的蛋白質物質為牛血清白蛋白、匙孔血藍蛋白、卵清白蛋白。
5.根據權利要求1所說的檢測方法，其特徵在於所說的多糖類物質為葡聚糖、殼聚糖、纖維素。
6.根據權利要求1所說的檢測方法，其特徵為檢測線和參考線的組合方式為1條檢測線和1條參考線、1條檢測線和2條參考線、1條檢測線和3條參考線、2條檢測線和1條參考線、3條檢測線和1條參考線5種形式。
7.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵是當膠體金標記部分標記對象為克倫特羅抗體和第二種屬動物蛋白時，膠體金標記部分和檢測反應部分之間加有延長部分，或在膠體金標記部分之下或之上加有增厚部分。
全文摘要
本發明涉及一種檢測克倫特羅半定量快速檢測方法。本方法在試紙的背襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應部分及吸水部分。檢測反應部分上包被有克倫特羅抗體1－3條或檢測用抗原1－3條作為檢測線，同時包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG1－3條作為參考線，組合時檢測線和參考線不能同時多於1條，組合線條數為2－4條。該快速檢測試紙條特異性強、靈敏度達到0.09ng/mL、4－40℃都可使用，2min以後便可觀察結果，適合於衛生、質監、海關、肉品加工廠、家畜養殖場等單位或個人對飼料、肉類、尿液、乳品等樣品中的克倫特羅進行快速檢測。
文檔編號G01N33/558GK1547024SQ20031011242
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月3日 優先權日2003年12月3日
發明者孫遠明, 雷紅濤, 潘科, 黃麗, 黃曉鈺, 諶國蓮, 吳青 申請人:華南農業大學