減少核酸雜交中C_ot-1DNA畸變的發生的製作方法

2023-06-24 20:55:36

專利名稱：：減少核酸雜交中Cot-1DNA畸變的發生的製作方法減少核酸雜交中Cot-lDNA畸變的發生相關申請的交叉參考本申請要求之前於2005年11月18日提交的待批臨時申請系列號60/737，986的權益，其內容納入本文作參考。序列表本申請還附紙件形式的序列表，也納入本文作為參考，同時以計算機可讀的ASCII文件形式在U.S.P.T.O電子提交系統中遞交相同內容。發明背景1.發明領域本發明涉及抑制耙基因組或轉錄基因組中存在的重複元件與核酸探針中對應的重複元件之間非特異性交叉雜交，同時避免探針中單拷貝序列與抑制性DNA中外來單拷貝序列之間偶然雜交的材料和方法。更具體說，本發明涉及開發和應用基本上缺乏重複序列的探針，和開發和應用合成的基本上沒有單拷貝元件的抑制性重複DNA。甚至更具體說，這類重複DNA包含的重複序列對應於毗鄰一外或多個代表性基因組區域中的單拷貝元件的中至高拷貝重複元件。2.現有技術描述微陣列和陣列為基礎的比較基因組雜交研究已促進了對基因表達和基因座拷貝數的廣泛基因組研究。不同實驗室交互驗證研究提出了關於這些技術重複性的持續討論"5。減少複製研究所得結果差異的策略集中於關注如何使技術因素，如陣列產品、RNA合成、標記、雜交、掃描、和數據分析的標準化6—8。Zakharkin等s提出樣品之間的生物學差異是這種差異的最大來源，其它因素的作用程度較弱。當用雜交探針分析DNA時，必須先封閉耙DNA中的重複序列，然後才使探針與靶DNA雜交，以心避免探針中的重複元件與靶DNA中的同源重複元件之間雜交產生高背景噪音。單倍體基因組中常有多個拷貝的重複序列。拷貝數範圍從二個到數十萬個，其中DNA的A1U家族是後者數目變化的典型例子。多個拷貝的重複序列可聚集成簇或間插在整個基因組中。重複序列可在基因組中一處或多處聚集成簇，例如重複序列可位於各染色體的著絲點處和有各種數目的串聯重複序列(VNTR)Nakamura等，Science,235;1616(1987);或重複序列可分布在一個染色體上，如Bardoni等，Cytogenet.CellGenet，46:575(1987)報導只在X染色體裁上發現有重複序列；或重複序列可分布在所有的染色體上，如重複序列的Alu家族。基因中可發現複雜性低的簡單重複序列，但在基因組的非編碼序列中更常見。這種重複元件由一個、二個、三個、四個、或五個核苷酸核心序列元件組成，排列成串聯單元。不同個體基因組中相同位置處包含這些重複序列的串聯單元數目常不同。搜尋基因組序列中的核心序列元件的保守性連綴可發現這些重複元件。競爭雜交，也稱為抑制雜交提供了封閉可能的壓倒性DNA信號的方法。未標記的競爭DNA或抑制DNA含有能結合耙DNA中同源重複元件的高數量重複元件，因此能阻止標記探針的重複部分與靶核酸中這種重複元件結合，從而提高探針主要與非重複性靶序列雜交的機率。大多數微陣列雜交研究共同需要利用富含重複序列(C。t-l)的DNA來抑制或封閉探針中的重複朝花夕拾與基因組(或轉錄基因組)中其它部位之間的非特異性交叉雜交。現有技術通常在FISH之前山性DNA勸C。t-1與耙DNA的雜交以避免發生背景雜交，即非特異性雜交。在人類中，這種C。t-l組分高度集中於含有間插重複元件，如短和長間插重複元件SINE和LINE^'"的家族中。商品化產生C。t-1DNA製品的方法反覆說明基因組DNA的變性和重連接，這可通過Alu元件(三重摺疊大大超過正常基因組的相應水平)和Ll元件(四重摺疊大大超過正常基因組的相應水平)的豐富程度來監測。目前的質控方法不能測定C。t-1DNA的精確組成或序列。雖然C。t-l組分看來能抑制探針的重複元件與耙DNA的對應或同源重複元件之間的非特異性雜交，但也增加了實驗的嗓音12(圖1)。因此，研究了C。t-l組成中的差異是否可能是基因組雜交研究結果差異的主要來源。採用序列明確的基因組單拷貝(SC)探針"和由毗鄰的SC及重複性基因組序列構成的探針，進行定量微球體雜交試驗(QMHf'"闡明了C。t-1在基因組雜交中的作用。確定C。t-1能促進包含毗鄰的共生同源重複序列(通常與該探針無關)的穩定雙鏈體(探針中的一拷貝序列與C。t-lDNA中的一拷貝序列雜交)的形成，從而阻止了對一拷貝序列雜交的精確量化。C。t-1中的一拷貝元件與探針中一拷貝的同源元件雜交扭曲了(假擴增)探針信號。圖1說明C。t-1105與基因組DNA靶100雜交抑制或阻斷了靶100中重複元件115不能被利用與探針110中的共生同源重複元件120雜交。顯示重複元件115與C。t-1DNA105中的抑制性重複元件117平行(進化)相關，從而表明元件115與117能雜交。作為現有技術的一種典型，探針110包含一個拷貝元件135及外來的重複元件120，選擇和合成一拷貝元件135使之與靶100中的一個同源拷貝元件140選擇性雜交。如上所述，將探針110偶聯於微球145用於探針的檢測和定量。如該研究所預計的那樣，顯示探針110能與靶110雜交。除與靶115中的重複元件雜交外，C。t-1105中的一拷貝元件130也與探針125中的同源單拷貝元件135雜交，從而提高了該探針的信號3倍。2006年8月16日提交的題為"微球懸液雜交的量化及其應用(QuantificationofMicrosphereSuspensionHybridizationandUsesThereof)"的專禾U申請PCT/US2006/032693採用低或單個拷貝的基因組雜交探針的微球懸液雜交試驗，能用流式細胞計數法直接分析整個基因組DNA(或RNA)，此專利內容納入本文作參考。因此，本領域需要抑制核酸探針與C。t-1DNA中元件雜交時產生信號畸變的方法；抑制探針與耙DNA非特異性雜交的方法；抑制抑制性或競爭性DNA與耙部分以及探針中單個拷貝序列雜交的方法；鑑定和合成抑制性DNA，合成的重複性DNA產物有效作為抑制性DNA的方法；和利用這種合成的抑制性DNA與基本上沒有重複元件的單個拷貝探針聯合的核酸雜交系統。發明概述本發明通過用合成的富含重複元件但基本上沒有單個拷貝元件或很低的9抑制性核酸替代C。t-l，克服了上述問題並提供了抑制C。t-1DNA所致畸變作用的新方法和產品。概括地說，本發明方法包括製備合成的抑制性DNA和使此抑制性DNA與耙基因組DNA雜交以封閉靶部分中重複序列，然後使探針與靶部分雜交的步驟。優選，所述針沒有或基本上沒有重複元件，所述抑制性DNA沒有或基本上沒有單或低拷貝的DNA延伸段。在某些優選形式中，所述方法包括的步驟為通過偶聯光譜編碼(spectrally-encoded)的聚苯乙烯微球與選擇的低拷貝合成的DNA序列製備雜交探針；使靶基因組DNA與本發明的合成的抑制性或封閉性DNA預雜交；再使所述探針與靶基因組DNA雜交；和用流式細胞計數法檢測雜交產物。雜交試驗中出現的C。t-1所導致的信號畸變通過靶部分與合成的重複元件預雜交抑制了交叉雜交而減少，所述的重複元件沒有或基本上沒有單個拷貝序列，優選沒有或基本上沒有低拷貝序列。與目前的雜交試驗不同，本發明的雜交試驗用開發的包含選擇的重複元件但不包含競爭性單(或低)拷貝元件的DNA替代C。t-1抑制性DNA。所選的本發明的合成DNA優選是由於其與側接有單(或低)拷貝感興趣序列的靶DNA的重複區域同源，所述感興趣序列對應於所述單(或低)拷貝雜交探針的序列或與之同源，所述雜交探針設計用來與所述感興趣單(或低)拷貝序列雜交。本發明的方法和產物能有效減少(l)抑制性DNA與探針中同源元件之間，(2)探針中單或低拷貝元件與抑制性DNA中的同源單(或低)拷貝元件之間，和(3)探針中重複元件與靶基因組序列中同源元件之間的額外交叉雜交。本發明的單或低拷貝探針優選基本上，甚至更優選完全沒有重複元件，合成的抑制性DNA基本上，甚至更優選完全沒有單或低拷貝元件。圖2說明合成的抑制性DNA205與基因組DNA靶200雜交能抑制或封閉此耙DNA中的重複元件215。如圖所示，合成的抑制性DNA205不提供額外的能與探針210中單或低拷貝元件235，或耙200中單或低拷貝元件240雜交的單或低拷貝元件，從而明顯減少了此試驗中單或低拷貝元件的交叉雜交。合成的探針210優選包含一個或多個單拷貝或低拷貝元件，但沒有可能與抑制性DNA205或靶200中同源重複序列雜交的重複元件。圖2中，探針信號與靶200中所含的單拷貝或低拷貝元件240的直接(信號)對比為1:1。因此，本發明一方面提供抑制核酸探針中存在的重複序列與靶核酸基因組中同源重複序列之間非特異性交叉雜交的方法。一般來說，該方法包括鑑定代表性基因組區域中的重複序列，合成衍生自所鑑定的重複序列的抑制性核酸，和使所述抑制性核酸與靶核酸反應。所述抑制性核酸宜含有一個或多個選自短散布元件、長散布元件、長末端重複序列、Alu元件、L1元件和DNA轉座子的序列明確的PCR產物。此反應導致所述抑制性核酸中的重複序列與靶核酸中的同源重複序列雜交，從而基本上封閉了靶核酸中的重複序列使其不能與後續的反應性核酸探針中的同源重複序列雜交，結果抑制了探針中重複序列與靶核酸中同源重複序列之間的非特異性交叉雜交。這種抑制作用因所述抑制性核酸基本上由所鑑定的重複序列組成又基本上沒有低拷貝序列而大大增強。合成的所述抑制性核酸優選完全沒有低拷貝序列。在優選形式中，靶核酸包含低拷貝序列。合成的所述抑制性核酸優選包含選出的與一個或多個代表性基因組區域中的毗鄰低拷貝序列的重複序列相對應的多個重複序列。在某些優選形式中，本發明方法還包括使靶核酸與含有與所述靶核酸中的低拷貝序列同源的低拷貝序列的一外或多個探針雜交的步驟。在優選形式中，所述探針基本上，甚至更優選完全沒有重複序列。在其它優選形式，本發明方法包括使所述探針與光譜編碼的聚苯乙烯微球偶聯。此種探針優選用可檢測部分標記以提高其可利用性。一些優選的可檢測部分包括螢光團、酶偶聯物、螢光團標籤核苷酸、與攜帶抗原的核苷酸結合的螢光標記抗體、生物素-dUTP、地高辛(digoxygenin)-dUTP和它們的組合。此法以及本文中其它地方所述的方法可用於任何程序，這些程序中Cot-lDNA已用於或可能用於選自微陣列雜交試驗、螢光原位雜交試驗和微球體雜交試驗等試驗。另一方面提供合成抑制性核酸的方法。此方法一般包括鑑定代表性基因組區域中的重複序列；和通過合成能與所鑑定的重複序列雜交但不與所述代表性基因組區域附近或其中的低拷貝序列雜交的核酸序列來合成所述抑制性核酸的步驟。此合成的抑制性核酸優選基本上沒有低拷貝序列。在某些優選形式中，本發明方法也包括根據它們與感興趣低拷貝序列的相鄰性(proximity)選擇某些經鑑定的重複序列來合成所述抑制核酸。這些經鑑定的重複序列是最靠近感興趣低拷貝序列的那些序列。此種合成的抑制核酸優選不含有能與該感興趣低拷貝序列雜交的序列。當然，本發明的合成的抑制性核酸可用於雜交試驗，特別是可用於Cot-l或封閉DNA的雜交試驗。一些優選的雜交試驗包括螢光原位雜交試驗，微陣列試驗和微球體雜交試驗。本發明另一方面提供提高低拷貝數核酸探針與靶核酸中同源區域之間雜交特異性的新型方法。此方法通常包括使靶核酸中的重複元件與抑制性核酸中的同源重複元件雜交的步驟，其中，合成或選擇的抑制性核酸包含多個重複元件，且基本上，更優選，完全不含有低拷貝數元件，和使靶核酸中的低拷貝數元件與一個或多個核酸探針中的同源低拷貝數元件雜交。在優選形式中，選出的所述抑制性核酸中的重複元件與一個或多個代表性基因組區域中低拷貝元件側翼的重複元件基本同源。甚至更優選，此側翼重複元件是中到高拷貝數，而所述低拷貝元件包括單拷貝元件。還要更優選，所述探針基本上沒有重複元件。本發明另一方面提供精確量化核酸序列拷貝數的方法。這種方法通常包括的步驟有製備具有第一光譜地址的第一光譜編碼螢光微球，和具有第二光譜地址的第二光譜編碼螢光微球，通過確認懷疑含有感興趣序列的靶核酸序列的核苷酸-核苷酸序列鑑定靶基因組核酸探針的序列，合成由鑑定的耙基因組核酸探針序列衍生的低拷貝靶探針，此靶探針含有至少一個低拷貝元件且基本上沒有重複元件，將此耙探針與第一微球偶聯，合成所選的與該耙核酸序列的參比核酸序列雜交的參比探針，將所述參比探針與具有第二光譜地址的微球偶聯，鑑定代表性基因組區域中的重複序列，合成抑制性核酸，所述抑制性核酸包含與所述鑑定的重複序列雜交的充分同源性序列，所述抑制性核酸基本上含有重複元件且基本上沒有低拷貝元件，使抑制性核酸與染色體靶核酸反應，從而導致抑制性核酸中的重複元件與染色體靶序列中的同源重複元件雜交，使靶探針與染色體靶序列反應從而導致靶探針中低拷貝元件與染色體靶序列中的同源低拷貝元件雜交，使抑制性核酸與含有染色體靶序列染色體參比序列反應從而導致抑制性核酸中的重複元件與染色體參比序列中的同源重複元件雜交，使參比探針與染色體參比序列反應從而導致參比探針與參比染色體雜交，通過第一光譜地址檢測雜交的靶探針，通過第二光譜地址檢測雜交的參比探針，和比較檢測到的雜交耙探針的反應與檢測到的雜交參比探針的反應來量化檢測到的靶探針。在優選形式中，所述抑制性DNA包含的重複元件與耙中低拷貝元件相毗鄰的基因組重複元件相對應的重複元件。本發明另一方面，提供抑制核酸探針中存在的重複元件與靶核酸中的同源重複元件之間非特異性交叉雜交的方法。此方法通常包括使抑制性核酸與含有一個或多個低拷貝元件的靶核酸中同源重複元件雜交的步驟。優選地，合成或選擇的抑制性核酸含有選出的與含有毗鄰中至高拷貝數重複元件的單拷貝區域的一個或多個代表性基因組區域相對應的多個重複元件且基本上不含低拷貝元件。然後，再使所述靶核酸與含有與所述靶中的低拷貝元件同源的低拷貝元件的一個或多個探針雜交，所述探針基本上不含重複序列。本發明另一方面，提供抑制抑制性核酸中存在的低拷貝元件與靶核酸中的同源低拷貝元件之間的非特異性交叉雜交的方法。該方法通常包括鑑定靶核酸中和附近的重複性和低拷貝元件，通過從所述靶核酸中選擇重複序列將其包含在所述制性核酸中同時在所述合成中基本上避免包含低拷貝序列來合成抑制性核酸序列，和使合成的抑制性核酸與耙核酸反應，而使各同源性抑制核酸與靶核酸元件互相雜交。本發明也提供利用抑制或封閉DNA(如Cot-lDNA)來提高試驗精確度和重複性的方法，包括選擇或合成含有多個重複元件但基本上沒有低拷貝序列的抑制性核酸，和釆用所選擇的或合成的抑制性核酸替代Cot-lDNA的步驟。本發明另一方面，提供抑制基因組靶核酸與核酸探針額外雜交的方法。此方法通常包括選擇基因組中對應於感興趣序列的一條或多條序列來製備用於雜交的基因組靶核酸；鑑定感興趣靶序列中的低拷貝序列；合成與所鑑定到的低拷貝耙序列同源的低拷貝探針，所述低拷貝探針基本上沒有重複序列；鑑定毗鄰於靶低拷貝序列的重複序列；合成與靶重複序列同源的抑制性DNA，該抑制性DNA基本上含有重複元件；使耙核酸與該抑制性DNA反應從而該抑制性DNA中的重複元件與靶核酸中的同源重複元件雜交；使靶核酸與所述低拷貝探針反應而使所述探針中的低拷貝元件與所述耙核酸中的同源低拷貝元件雜交；和檢測該低拷貝探針以量化探針與靶的雜交，從而確定靶核酸中替代的低拷貝元件。定義除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域普通技術人員共同理解的相同含意。所有專利申請、公開的專利申請和其它公開的專利及本文參考的GenBank與其它資料庫的序列它們的內容都納入本文作參考。如果此節所述的定義與所述專利申請、公開的專利申請和其它公開的專利及納入本文作參考的GenBank與其它資料庫的序列內容相反或不一致，將取此節中所述及的定義而不取納入本文的參考文獻中的定義。如本文所用，"一個"或"一種"指"至少一個"或"一個或多個"。如本文所用，"核酸"指任何形式的脫氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)，包括單鏈、雙鏈體、三鏈體、線性和環形。如本文所用，"序列"指核酸序列。如本文所用，術語"參比探針"指對基因組中某基因座的特異性探針，所述基因座優選常染色體序列中可造成嚴重損傷和優選致死性的具有拷貝數除2以外的基因座。參比探針可衍生自任何低拷貝或單拷貝染色體基因座，只要它在病人樣品中具有正常的染色體組分。在為診斷體質疾病而測定基因組拷貝數時，參比探針通常是常染色體來源的正常發育中需要由二個等位基因表達的一個或多個基因(的探針)。對診斷癌症疾病而測定基因組拷貝數，從含有少量致癌基因的染色體區域選擇參比探針，其應含有染色體的正常成分。如本文所用，"標記物"批號具有可檢測物理性能的化學基團或部分，或任何能導致化學基團或部分顯示楞檢測性能的化合物，如能催化底物轉變為可檢測產物的酶。術語"標記物"也包括能抑制特定物理性能表達的化合物。"標記物"可以是結合對的一成員化合物，另一成員具有可檢測的物理性能。示範性標記物包括質量基團、螢光基團、冷光基團、化學發光基團、光學基團、帶電基團、極性基團、色素、半抗原、蛋白質結合配體、核苷酸序列、放射基團、酶、特定顆粒和它們的組合。如本文所用，"樣品"指可能含有待分析靶核酸的材料。樣品可以是生物樣品，如生物體液或生物組織。生物體液的例子包括尿液、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰液、腦脊液、眼淚、粘液、羊水等。生物組織是聚集的細胞，常由特定類型細胞與它們的胞間成分一起形成人的結構，動物、植物、細菌、真菌或病毒的結構，包括結締、上皮、皮膚、肌肉和神經組織。生物組織的例子還包括器官、腫瘤、淋巴結、動脈和單細胞集合，例如，分離自血漿、血液或尿液或用膠原酶處理的固體組織。如本文所用，"擴增"指線性倍增樣品中的靶核酸分析物以提高試驗的靈敏度。如本文所述，本領域已知有許多不同方法可擴增核酸。如本文所用，"微球組"指含有相同的光譜地址與一個lc探針或一組lc探針偶聯的微球組。如本文所用，"低拷貝"或"lc"指能與基因組中靶核酸或區域的10個或較少個間隔序列雜交的序列。優選拷貝數為IO或更少，更優選7個或更少，還要優選5個或更少，最優選3個或更少。如本文所用，"單拷貝"或"sc"指能與基因組中靶核酸或區域的3個或較少個間隔序列雜交的核酸序列。因此，此術語包括極嚴格獨特性的序列(即與相應基因組中的一個而且只有一個序列相互補的序列)，及其二鏈體和三鏈體。術語"單拷貝元件"和"單拷貝序列"也可用於指這類核酸序列。如本文所用，"高重複性的"指存在1000個以上的拷貝。如本文所用，"序列相同性"指二條或多條多核苷酸序列，即參比序列和與該參比序列作比較的某給定序列之間的關係。可通過將給定序列和參比序列作最佳排列後產生最高程度序列相似性，測定序列串之間的匹配進行序列的比較來測定二序列的相同性。比對時，根據鹼基的位置對位置確定序列相同性，如具體位置的核苷酸相同則序列相同。然後將位置相同的總數除以參比序列的核苷酸或殘基總數產生序列相同性百分比。用已知方法，包括但不限於《計算機分子生物學》(ComputationalMolecularBiology),Lesk，AN主編，牛津大學出版社，紐約(1988);《生物計算信息學和基因組計劃》(Biocomputing:informaticsandGenomeProjects),Smith,DW，主編，學術出版社，紐約(1993);《序歹ll數據的計算機分析》(Computeranaysisofsequencedata),Griffm，AM禾口Griffm，HG主編，人類出版社(HumanaPress),新澤西(1994);《分子生物學中的序歹ll分析》(SequenceAnalysisinMolecularBiology),vonHeinge，G，學術出版社(1987);《序列分析引物》(S叫uenceAnalysisPrimer),geibskov，M和Devereux，J主編，M,斯圖克頓出版社(StocktonPress),紐約(1991);Carillo，H和Lipman，D，SIAMJAppliedMath，48:1073(1988)。設計了測定序列相同性的優選方法給出了所測試序列之間的最大匹配。可利用公眾可獲得的計算機15程序編輯測定序列相同性的方法確定給定序列之間的相同性。這類程序的例子包括但不限於GCG程序包(Devereux，J等，NucleicAcidResearch,12(1):387(1984)、BLASTP、BLASTN禾tlFASTA(Altschul，SF等，JMolBiol，215:403410(1990)。這些程序採用缺口對序列作最佳比對可產生給定序列與參比序列之間最高水平的序列相同性。例如說，某多核苷酸的核苷酸序列與參比核苷酸序列具有至少例如95%的"序列相同性"，這意味該給定的多核苷酸的核苷酸序列與參比序列相同，除了該多核苷酸序列每IOO個核苷酸可包含最多5個與參比核苷酸不同。換言之，在含有與參比核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸中，該參比序列中最多5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代，或參比序列中總核苷酸的最多5%可插入到參比序列中。二序列之一中的轉化可用這些電腦程式根據參比序列與同源性測試序列的反義鏈相似性檢測。參比序列的這些變異可發生在參比核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之間單個散布在參比序列核苷酸中的任何處，或參比序列中一個或多個毗鄰基團中。如本文所用，"重複序列"是在基因組中作為靶DNA—部分的反覆出現的序列，此重複序列之間的序列相同性至少約60%，更優選至少約80%，這是可能導致幹擾探針與靶DNA所需特異性雜交的足夠長度，即此時探針可能與多個拷貝重複序列雜交。一般而言，基因組中出現的重複序列至少為10倍，重複序列的大小範圍從1個核苷酸至數百個核苷酸，重複單元的長度至少為10個核苷酸到數千個核苷酸。重複序列可以是任何形式，如串聯、散布、回文或尖角重複序列(在靶區域中有一些拷貝，在基因組中那處有一些拷貝)，可出現在染色體的著絲點附近，分布在一條染色體全長上，或某些或所有的染色體上。正常時但有少數例外，重複序列不表達物理學上有用的蛋白南。"重複序列"也可稱為"重複性序列"或"重複性元件"。如本文所用，"短散布元件"本文也稱為SINE，指由RNA聚合酶III轉錄產生的含75bp-500bp長度重複單元的高度重複性散布性可轉座元件。SIME元件中最豐富的一類是Alu家族。Alu序列度約300bp在人基因組中存在約500,000個拷貝。如本文所用，"長散布元件"本文也稱為LIME，指由RNA聚合酶I轉錄產生的含高達7000bp重複單元的高度重複性散布性可轉座元件。如本文所用，"長末端重複序列"本文也稱為LTR，指含有通常長200-500bp的末端直接重複序列的一大類可轉座元件。如本文所用，"MIR"重複序列指哺乳動物的含有長至少260bp重複單元在人基因組中有約105個拷貝的散布性重複元件。如本文所用，"MER"重複序列指起源未知在人基因組中拷貝數為100-1000個的中等散布性重複元件。如本文所用，中等(散布性)DNA指均勻分布在人基因組中存在10-1000個拷貝長度150-300bp的重複序列。一個例子是Alu家族。如本文所用，高度重複性DNA指在人基因組中存在1S拷貝的長5-300bp的短重複序列。一個衛星DNA。如本文所用，術語"DNA轉座子"或"轉座子"指基因組中可從一處位置移動到另一處的DNA序列。這些序列也稱為"可移動基因元件"。轉座子移動通常稱為轉座。附圖簡述圖1是說明探針與C。t-1DNA中單拷貝元件雜交的示意圖。圖2是說明抑制DNA與耙核酸中重複序列雜交的示意圖。圖3是說明在C。t-1DNA中的QMH雜交產生潛在結構的示意圖。圖4是說明所用的合成重複產品和探針抑制與基因組模板交叉雜交的示意圖。優選實施方式的詳細描述以下實施例提供了本發明的優選實施方式。這些實施方式顯示了，單(或低)拷貝探針能與先前已與含有重複元件但無單拷貝或低拷貝元件的合成的DNA雜交的基因組靶核酸雜交。然而這些實施例目的只說明和公開本文的內容，不應構成對本發明範圍的限制。實施例材料和方法定微絲飾,微扁泉合成將,微可檢測到以標記的核酸片段形式或標記的核酸片段集合形式與靶序列雜交的探針。標記的探針可用於含有與該探針中序列同源的序列的任何靶核酸。這些靶核酸可包括但不限於含有單拷貝序列作為轉錄物整合組分的染色體或純化的核酸DNA、異核RNA或mRNA。為確保詳細解譯，上述DNA靶序列和DNA探針為常用例子，然而本領域技術人員知道以上所述可等同(所知差異全歸於靶序列和探針的性質)應用於其它種類的核酸。本發明優選探針的一個重要特徵是它們由"低拷貝"或"單拷貝"或"獨特"的DNA序列構成，此種序列均與靶DNA區域的至少感興趣部分互補而且基本上沒有與構成基因組靶區域一部分的重複序列互補的序列。因此，優選由單拷貝或獨特序列構成的探針與相應基因組中的三個或多個序列互補，優選只與一個序列互補。低拷貝或混合的低拷貝和重複序列探針的設計或參見以前的報導"'15'16'2G。在優選形式中，本發明採用專門設計的能與單倍體基因組序列中獨特基因座高特異性雜交的低拷貝或單拷貝雜交探針。探針選擇和合成的方法可參見美國專利6，828,097和7,014，997，它們的內容納入本文作參考。這些最初的步驟要求了解靶核酸和基因組重複序列二者的序列，其逐漸增多的可利用信息可向人類基因組計劃(HumanGenomeProject)和相關生物信息研究(單位)査詢。為了開發本發明的探針，必須知道靶DNA區域的序列。靶區域可以是重排已經過鑑定的整個染色體或只是其一部分。知道了這種序列，目標是確定靶區域中單拷貝或獨特序列的邊界。優選通過參比耙區域中重複序列位置而實現這點。通常將耙區域的序列與相應基因組的已知重複序列作比較，可利用已有的計算機軟體。一旦鑑定好耙區域中的重複序列，推導的該間插序列即是低或單拷貝序列(即舭鄰重複序列之間的序列)。可利用Smith等，Adv.Appl.Math.，2:482(1981)的局部同源性算法，或Needleman等，J.Mol.Biol.，48:443(1970)的同源性比對算法，最佳排列對比靶序列與重複序列進行比較。宜選擇和合成至少二種不同的探針。應選擇和合成至少一組能識別特定核酸序列中異常變化(如果存在)的探針(測試探針)，和選擇和合成另一組識別參18比序列的探針(參比探針)。探針宜長60-1000鹼基對，更優選80-500鹼基對，最優選90-110鹼基對。發現微球與約100鹼基對的低拷貝探針偶聯後能產生特性明確的平均螢光分布值和一致的較高次級平均螢光強度值，因而更精確地反映了真正的拷貝數。較短的偶聯探針也更穩定，偶聯後適當保存，優選在黑暗處4"C保存在雜交反應中可用二個月以上。這可減少標記的貯存微球的批間差異，從而減少偶聯、定性和定量偶聯探針的微球所需的工作量。其使用期長於偶聯後二周內即顯示雜交效率降低的偶聯探針。此實施例中使用的探針包括含有sc間插物的探針(i)ABLla(2004-5，chr9:130623551-130625854)，其含有多樣性的AluJo/Sx/L2重複序列，(ii)ABLlb(chr9:130627353-130628735)，其含有先前設計和經驗證的ABL1中的多樣性AluJo重複序列13'14,(iii)1823bp染色體9探針，其含有Alu/MER1重複序列，ABLlAluMERl(chr9:130621702-130623525)，(iv)TEKT3內含子的98bpsc區段(chrl7:15149108-15149206)和(v)PMP22內含子的101bpSC區段(chrl7:15073475-15073576)，(vi)H0XB1內含子的93bpsc區段(chrl7:43964237-43964330)。基因組重建實驗的探針包括(vii)HOXBlb(chrl7:43963396國43965681)和(viii)C1QTNF7(chr4:15141452-15141500)。探針中所見重複序列定義為多樣性，根據(在網際網路girinst.org)與家族成員共有序列的差異百分比(>12%)，缺失百分(>4°/。)，和/或插入百分比(>4%)。微與錄,錄凝如前所述合成探針並與微球偶聯13'2Q。合成期間根據具體的偶聯反應，給探針加上氨基尾以便與不同的微球偶聯。優選通過改進的碳二亞胺反應使探針與微球偶聯。將各有特定的光譜地址(命名為Ll-L9;加州派羅阿託杜克科技公司(DukeScientific,PaloAlto，CA))和約2000,000個碳大小包衣的螢光微球分別與不同的lc探針偶聯。將純化的氨基修飾的lc探針通過改進的碳二亞胺交連程序與羧基化微球產(Dunbar等，2003;Fulton等，1997)。先加熱變性各探針，然後在冰上快速冷卻。將具有相同光譜特性的約3.125x105個微球滴入1.5ml微離心管(佛羅裡達州奧卡拉的美國科技公司(USAScientific,Ocala，Florida))中，10000g離心2分鐘，吸棄上清液。將150微升0.1MMES緩衝液(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)pH4.5加入各管簡單旋渦振蕩微球然後lO,OOOg離心2分鐘。除去上清液用80微升0.1MMES振蕩重懸微球。各管加入單一lc探針(0.5nM)振蕩混合。加入1.25微升體積10mg/ml的新制l-乙基-3-3-二甲氨基丙基碳二亞胺鹽酸(EDC)，簡單振蕩反應液，避光培育30分鐘偶而攪拌。重複攪拌和培育EDC二次，每次用新配製的1.25微升EDC溶液。加入500微升0.02%吐溫(Tween)20停止反應，振蕩和10，000g離心2分鐘。除去上清液後每管加入250微升0.1%SDS，振蕩，然後10，000g離心2分鐘。小心除去上清液，加入25微升0.1MMESpH4.5，振蕩試管後4"C避光保存。將1微升各微球加入到100微升1xPBS中，在FACSCalibur流式細胞計數儀(加州桑澤斯的BD公司(BectonDickinson,SanJose，Califomia))上採用以下給出的條件進行分析，量化微球濃度。已開發了與上述方法等同的核酸與微球偶聯的其它方法。DNA與微球偶聯的另一常用方法是使鏈黴親和素包被珠與含有5'-末端用生物素修飾的核苷酸的探針結合。美國專利6,361,944已將金米顆粒與巰基修飾的核酸偶聯。美國專利6，468，546;6,838，243;6,833,246;6，828,146和6,828,142已將蛋白-核酸與珠偶聯。已通過親電子連接試劑，即N-氯乙醯氨二已基氨基磷酸酯試劑(Guzaev等，BioorgMedChemLett1988-1215;8(24):3671-6)實現了寡核苷酸與微球的偶聯。也已將DNA與半導體納米晶體顆粒偶聯(Taylor，J.R.，Fang，M.M.和Nie，S.M."用生物學方法偶聯的螢光納米顆粒檢測DNA單部分上的特異性序歹ll"(ProbingspecificsequencesonsingleDNAmoleculeswithbioconjugatedfluorescentnanoparticle)Anal.Chem.，72，1979-1986;2000;W，Z，Guo.，J.J.Li，Y.A.Wang,X.G.Peng."通過樹枝狀橋製備半導體盒式納米晶體的偶聯化學方法及生物應用"(Conjugationchemistryandbioapplicationsofsemiconductorboxnanocrystalspreparedviadendrimerbridging)Chem.Mater.15，3125-3133(2003)，和美國專利6，630，307)。在一優選的實施方式中，微球本身被染色，將具有不同光譜地址的螢光聚苯乙烯微球與低拷貝探針偶聯，得到低拷貝探針-偶聯珠的各種組合，其中參比探針按不同的光譜地址命名。流式細胞計數儀能識別不同的光譜地址，允許與結合在不同組微球上的各種低拷貝探針發生多重反應。20麟鄉微吝如前所述13'2G，利用甲醇-乙酸固定的來源於骨髓樣品的細胞遺傳學製品中的沉澱細胞，製備了基因組模板(靶核酸序列)。不同於其它方法，此靶序列不作預先選擇或擴增。因此，在本發明中可雜交基因組(或轉錄基因組)的整個拷貝作分析。根據樣品的來源和狀況，抽提細胞DNA(或RNA)，如需要可用常規方法體外複製。宜用GenomiPhi試劑盒(加州瓦倫西亞恰根公司(Qiagen，Valencia,CA))體外複製所述核酸，此試劑盒只需用不到1納克的樣品核酸，需要的操作時間不到20分鐘。然後用常規方法標記此DNA，優選在體外複製中直接標記，或採用由標記物與對此標記物具有親和性的報告分子組成的間接標記系統。用可鑑定的標記物如螢光團、酶偶聯物、或選自親和素、鏈黴親和素或特異性抗體可識別的生物素或部分來標記靶核酸。有幾種類型的可鑑定的非同位素標記物。一類是能化學結合靶核酸可作為直接鑑定工具的標記物。此類的一個例子是螢光染料部分，當用適當波長的射線照射時，此部分被激發至高能態而發射螢光。本領域已知有直接標記螢光的核苷酸如Cy3-dUTP是標記用於本發明耙DNA的合適形式。直接DNA的其它方法可能也適合(例如用於Ulysses方法的市售氨基-烯丙基標記物(荷蘭克裡太克(Kreatech，Netherlands)),然而此法必須使基因組DNA片段(通過超聲、DNA酶、剪切或用其它酶消化)化為適合雜交的大小，然後將標記的靶DNA加入到偶聯探針的微球中。在一優選的實施方式中，核酸在體外複製期間用生物素-dUTP或地高辛-dUTP直接標記，超聲處理得到的標記樣品產生長約300bp-lkbp的片段。也可用切口平移法，利用修飾的、或直接標記的核苷酸來標記靶核酸(Rigby等，J.Mol.Biol.，113:237-251，1977),在常規方法中利用含有可鑑定的選擇性標記物的反應試劑(但不限於此)使其偶聯於核苷酸如dUTP或dATP。或用含螢光團標籤的核苷酸直接標記這些片段，或通過使標記的雙鏈體與能識別如下所述己摻入到這種片段中的核苷酸的螢光標記抗體結合而間接標記這些片段。切口平移(100微升)要用無內切核酸酶的DNA聚合酶I(羅氏分子生物化學公司(RocheMolecularBiochemicals))和DNA酶I(沃生頓化學品公司(WorthingtonChemical))。將各片段與DNA聚合酶1(4單位/mgDNA)、DNA酶(0.01-3mg/100n1反應液)、標記的核苷酸(0.05mM終濃度)和切口平移緩衝液混合。15。C反應60分鐘，產生不同量的標記的探針片段，其核苷酸含量不同在約300-1000bp範圍。或者，可在體外複製期間摻入生物素-dUTP或地高辛-dUTP，再用DNA酶I處理或用其它一些方法剪切得到的標記樣品，產生長約300bp-lkbp的片段。常用的標記和檢測核酸的其它方法可應用於檢測本發明方法(製備的)低拷貝DNA偶聯微球。這些物質包括螢光染料標記物和螢光組合物，如能量轉移基團、偶聯蛋白質、抗體或抗原。更具體說，切口平移時將1微克基因組DNA和pUC19DNA用生物素-16dUTP標記分別獲得長100bp-350bp和50bp-300bp的產物17。將1微克各C。t-1DNA(得自製造商I和R)經切口平移用地高辛-lldUTP標記獲得50bp-300bp產物。雜效座,敘潘冊箭用含10,000探針偶聯微球的40微升1.5xTMAC雜交緩衝液(3-mol/L氯化四甲銨、50mmol/LTris-HCI，pH8.0lg/L肌氨醯(Sarkosyl))稀釋標記的DNA(50ng)。反應配製的組分列於表1中。表1微球雜交的量化(平均螢光強度)tableseeoriginaldocumentpage23*每次反應用生物素-16dUTP進行切口平移並用50ngFL2進行SPE檢測。按前人描述進行雜交反應和檢測13'，雜交反應的條件取決於具體的核苷酸組成和每條低拷貝探針的長度，這些本領域技術人員不難確定。對於雜交，用含有低拷貝探針偶聯微球的雜交緩衝液稀釋樣品序列。探針偶聯微球的用量取決於測試樣品的量。每次雜交反應分析優選約5pg對1tig樣品，更優選對約25-100ng樣品，還要優選對約30-70ng樣品，還更優選對約40-60ng樣品，最優選對約50ng樣品。因此，要雜交的每組緩衝液宜含有約2,000-10,000個探針偶聯微球，更優選2,000-6，000個探針偶聯微球，還要優選約4,500-5,500個探針偶聯微球，最優選約5,000個探針偶聯微球。稀釋後宜在約95'C加熱變性雜交反應物，然後在合適的雜交溫度下雜交過夜，溫度宜約45-51°C，取決於探針核酸的組成和長度。然後洗滌雜交的微球，離心去除未雜交的靶序列。除去上清液，染色雜交樣品，或用一定量的修飾的報告分子或其它合適的標記物，優選可作為次級螢光染料的標記物標記，以檢測標記的樣品與低拷貝探針偶聯微球的雜交。優選的報告分子是藻紅素標記的鏈黴親和素，或抗-地高辛螢光抗體，分別檢測和結合優選的靶序列標記、生物素和地高辛。在雜交反應所用的相同溫度下培育雜交的和標記的/染色的樣品足夠時間使報告分子檢測和結合標記的靶序列。然後洗滌樣品除去殘餘染料。離心樣品除去上清液，用一定量的雜交緩衝液重懸著色的雜交微球。流式細胞計數分析前，可按流式細胞計數儀操作說明書稀釋雜交樣品。每次反應每組優選分析約2，000-6，000個微球，更優選約4,500-5,500個微球，最優選每次反應每組分析約5,000個微球。然而，分析的樣品量取決於用於的具體流式細胞計數儀。該領域技術人員無須過多實驗即可修改確定最佳的流式細胞計數儀校正和操作設置範圍，從而測定具體的雜交試驗。螢光珠標準品已廣泛使用，可用其校正流式細胞計數儀不同螢光檢測通道的強度。也可用參比螢光標準品依據分子的等價可溶性螢光染料(MESF)單位校正的表面標記校正此儀器。優選優化光電倍增管(PMT)的電壓設置和前向掃描、側向掃描、流速、和各檢測通道的域值以最大程度減少二種不同探針與一份基因型正常病人樣品雜交所產生的螢光強度差異。易出現非優化的電壓參數導致寬大的螢光峰或非線性數據，而優化的參數當以側向掃描圖觀察時偏嚮導致具有不同光譜地址的微球緊密聚集。這些設置優選依據螢光測定的數學平均值、幾何平均值、中位數和峰頻道而確定。反應物經5(TC變性3分鐘和雜交過夜。洗滌雜交微球用報告分子鏈黴親和素藻紅素(SPE;分子探針公司(MolecularProbes))和/或抗-地高辛-抗體異硫氰酸螢光黃(FITC，分子探針公司)染色。用流式細胞儀(FACSCalibur，加州桑澤斯的BD公司)分析雜交樣品，採用雙雷射檢測，用細胞計數儀共同測定微球的光譜地址和與樣品序列結合產生的次級螢光染料以鑑定和定量雜交的探針。通過量化結合樣品產生的次級螢光染料的螢光強度，測定每種樣品序列與其互補的探針偶聯微球雜交產生的信號。選擇相容的微球光譜地址以最大程度減少與未結合的次級螢光染料(報告分子)的發射波長相重疊。這可通過與用相同的未偶聯和未雜交的微球獲得的結果作比較而得到證實。也可採用保留在含有除樣品核酸外所有成分的反應管中的陰性對照，測定檢測通道次級螢光染料的背景螢光。優選在運作之間用蒸餾水衝洗此系統去除殘留的微球。每次反應分析約5,000個微球。用SPE和/或FITC平均螢光強度(分別在通道FL2和/或FL1中檢測)定量雜交，此強度對應於探針所結合的基因組靶DNA(FL2)和C。t-1DNA(FL1)的量。用偶聯探針和含有相同序列的標記靶DNA進行的校正研究證明，平均螢光強度的變化與雜交的靶DNA量呈線性相關。每次雜交實驗用含有除耙DNA以外的所有反應組分的陰性對照分別測定FL1和FL2通道的背景螢光。如前所述設置優化的PMT電壓；用廠商提供的CellQuest軟體13'2收集數據進行分析。通過選擇能最大程度減少二種不同探針與一份基因型正常病人樣品雜交所產生的螢光強度差異的光電倍增管電壓設置，確定最優的光電倍增管電壓設置。這些設置依據說明書(CellQuest;BD公司)的螢光測定的數學平均值、幾何平均值、中位數和峰頻道而確定。FACSCalibur儀的典型光電倍增管電壓設置是FSC(前向掃描)二EOO(無信號放大)、SSC(側向掃描"344V、FL1=727V、FL2=640V和FL4=500V。設置的FSC、FL1、FL2和FL3的域值是默認值52V。選擇此FSC域值作為主要參數的52V值，設置的SSC次級參數為125V值。對所用的下部護套管液體設置的流速是FACsFlow(BD公司)。在運作之間用2-5ml蒸餾水衝洗此系統去除殘留的微球。用CellQuest軟體收集數據和分析。也用WinMDI2.8流式細胞儀軟體包(WinMDI;J.Trotter.加州索克儀器公司(SalkInstitute,LaJolla，California》進行數據分析。^微伊效遊"A^#虔用250ul0.1XSSC1%SDS洗滌等份(35ul)與ABLla(表1:反應9和20)雜交的基因組DNA，離心(13,000xg)沉澱，重複二次。95°。加熱變性雜交的基因組序列5分鐘，然後4"C離心3分鐘快速冷卻。回收的序列用作QPCR和與微球偶聯的ABLlAluMERl(表1:反應21和22)雜交的靶序列。全慮復絲"A^從根據重複性序列家族選擇的基因組區域合成製備了重複性DNA，因為這些重複序列各自在C。t-1製備過程中均富含。然而，可採用包含毗鄰中拷貝至高拷貝數重複元件的sc區的代表性基因組區。為了證明基因組探針中的這種重複元件可能在超過所需目標區段的部位受到抑制，製備了包含位於染色體4p中ClQTNF7基因上遊二個400bpsc區(chr4:15139704-15141581)之間中央的l.lkbLTR元件的探針(圖4A)。然後合成了用於封閉此重複元件的位於ABLla探針中的重複序列；染色體9的ABLla含有280bp的AluJo重複序列、300bp的AluSx重複序列和830bp的L2元件區段(圖4C)。也採用染色體17q上位於HOXB15'端含有306bpAluSx重複序列和154bpLl截短序列(chrl7:43963396-3965681)的2286bp區段作為探針9圖4B)。開發了PCR擴增各重複序列和靶產物(表2:HOXBlb和ClQTNF7)的引物，擴增了直接側接這些重複元件(表2:HOXBlAluLl和C1QTNF7LTR)的獨特序列。用Pfx(因維曲根公司(Invitrogen》擴增基因組DNA(帕瑪咖公司(Promega))。然後電泳擴增產物用微離心柱離心抽提。如前人所述通過改進的碳二亞胺反應使探針偶聯於微球13'2。在存在和缺乏C。t-lDNA時，此雜交反應(表l:反應23-33)均提高了合成的重複性PCR產物與同源性PCE產物和/或基因組DNA雜交的效力。使反應物雜交，洗滌，用SPE染色，然後用流式細胞計數分析。用Chromo4定量PCR系統(加州赫爾克裡斯的BR實驗室公司(Bio-RadLaboratories,Hercules,California))進行QPCR和數據分析。引物和擴增區段用BLAT"(見英特網genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlast)和BLAST(表2)驗證獨特的基因組表示。BLAT是一種計算機軟體工具，包含序列比對算法，和鑑定人26基因組中可能與査詢序列同源的區域的脊椎動物序列索引。BLAT是與BLAST類似的比對工具，只是結構上有所不同，因為BLAT工作時能將整個基因組的索引保存在存貯器中，而BLAST的靶資料庫包括GenBank收集的序歹ij。每50微升反應液含有各引物0.5PM、50ngC。t-1模板或陽性對照人基因組DNA(帕瑪咖公司)、25n12xQTSybrG主混合物(恰根公司)。用DNA酶在基因組DNA上形成缺口以產生50bp-300bp的片段，陰性對照含有除DNA以外的所有反應組分。熱循環條件是95°C15分鐘後，45輪擴增(94'C15秒、61°C30秒(獲取數據)、72°C30秒)然後72r5秒，溫度遞降每秒20'C產生解鏈曲線。利用校正曲線測定採用不同量的正常基因組模板(lng、2ng、4ng、lOng和20ng)回收的基因組模板中輸入的靶序列量，和測定各反應的Ct値。用QPCR測定從ABLla雜交產物(lul;表1:反應21和22)回收的序列組成。引物組採用幾個從ABL1區擴增的不一定與此探針同源的序列，包括ABLla和ABLlc(chr9:130709665-130711469)、ABLld(chr9:130699324-130700596)以及其它未連接的基因組區如DNJA3Alu(chrl6:4421138-4421200)的特異性引物，它含有位於DA^/基因5'端的Alu重複序列、7^《73和T/OiB7(表2)。如上所述進行反應。每組引物運作陽性對照(人基因組DNA)以提供原先加入QMH反應中的基因組DNA的初始量(50ng)。在存在和缺乏C。t-1DNA時從測試樣品中初始模板量確定從QMH回收的靶序列摩爾比(從針對標準校正曲線的交互參考Ct信內推)。表2.此項研究所用的探針和引物tableseeoriginaldocumentpage27tableseeoriginaldocumentpage0原位螢光雜交(FISH)本發明方法也可用於原位螢光雜交(FISH)實驗。FISH探針的靶區域可以是整條染色體或其一部分。探針合成後進行標記15'16，FISH雜交探針可與合成的重複性DNA—起培育代替Cot-lDNA進行重複抑制，然後與固定在載玻片上的染色體雜交。採用Cot-lDNA的比較性實驗用或不用探針預雜交常呈現不同的探針雜交信號14。與不用Cot-lDNA預雜交的FISH實驗相比，不用Cot-lDNA探針的FISH預雜交顯示染色體上探針信號微弱14。此微弱信號來源於探針中的單拷貝序列與Cot-lDNA中的單拷貝序列雜交。這樣就減少了與染色體中靶序列雜交所需的探針用量因此信號較弱。然而作為結果，不用Cot-lDNA預雜交的實驗雖然探針信號強度明亮，但通常呈現更多的假陽性探針雜交，而導致背景螢光水平較高使分析更加費力。通過探針與不包含店拷貝序列的合成的純重複性DNA組分預雜交，能有效抑制探針中的任何重複序列，留下的單拷貝序列可用於與染色體雜交。因此不會損傷染色體上的探針信號強度並且有效地最大程度地減少了背景(假陽性雜交信號)。結果與C。"ZW4遊定量徵承效使FISH-驗證的混合的sc和重複序列的探針、包含多樣性AluJo/Sx/L2重複序列(chr9:130623551-130625854)的ABLl基因IVSlb5，端的ABLla與生物素標記的基因組DNA雜交13'2、雖然在複製ABLla與生物素標記的基因組DNA雜交中，預計購得的C。t-1DNA能抑制重複序列的雜交，但當C。t-1用複製ABLla與切口平移的基因組DNA雜交時，標記的基因組耙部分的平均螢光強度一致地和顯著地增強了2.2倍(表1:反應1和2)。衍生自染色體17基因的sc探針PMP22(Chrl7:15073475-15073576)和TEKT3(Chr17:15149108-15149206)在存在C。t-lDNA時顯示較小但可重複的1.08禾P1.14倍增長(表l:反應l-6)。這些實驗提示C。t-l的效力與圍繞這些sc間區的重複序列組成相關。來自HOXB1的sc探針(Chrl7:43964237-43964330)—致性顯示了加入C。t-lDNA導致雜交強度的小降低(表1:反應7-12)，測試的基因組樣品雜交強度降低了0.84-0.92倍。HOXB1間區特點是無重複序列(UCSC基因組瀏覽器(UCSCGenomeBrowser),2004-5)。環繞ABLla的區域含有豐富的高密度保守和散布的SINE(AluJo，AluSx)和LINE(L2)元件。TEKT3和PMP22間區含有較短較不豐富和更多樣性種類的重複元件(MIR、MER和L2)。通過比較生物素標記的耙DNA(在FL2通道中用鏈黴親和素藻紅素[SPE]檢測)、生物素標記的陰性靶對照(Puc19質粒)各與地高辛標記的C。t-1DNA(在FL1通道中用FITC-偶聯的抗-地高辛抗體)雜交來測定加入C。t-1DNA改變靶DNA與ABLla探針雜交的程度。存在C。t-1導致ABLla與生物素標記的同源基因組耙序列雜交產生的螢光平均強度提高了2倍，然而，結合的標記C。t-1序列量大大超過抑制ABLla中重複序列所需，與其中刪除了C。t-1序列的反應相比，強度提高了50倍(表1:反應13和14)。C。t-1結合看來有特異性，因為不論C。t-1是否存在ABLla與pUC19雜交顯示有背景信號水平(〈101)(表1:反應15)。這些發現提示C。t-l中的同源序列直接與ABLla探針結合。因為推測ABLla序列只代表了C。t-1靶部分的一小部分，它單獨不能解釋所見的雜交強度提高。為確定信號提高是否與C。t-1DNA的量有關，在固定量(50ng)的生物素標記的基因組耙DNA中加入不同量的地高辛標記的C。t-1DNA與ABLlb雜交，ABLlb是混合的sc和重複性探針，含有二種多樣性的AluJo重複序列(chr9:130627353-130628735)。將反應中的C。t-1量從50ng倍增到100ng探針與C。t-1的雜交提高了1.8倍，與同源序列的雜交提高了1.3(表1:反應16和17)。類似地，150ng標記的C。t-1DNA與ABLla雜交比50ngC。t-l提高了3倍，與靶DNA雜交提高了1.5倍(表1:反應17和18)。雖然加入C。t-1DNA稀釋了同源的生物素化靶DNA,但仍提高了2-4倍，對應的雜交強度出乎意料地提高了1.5倍。C。t-1濃度與雜交強度的相關性提示此反應成分促進了含有除探針和所需的基因組耙DNA以外的其它序列的雙鏈體形成。為測定結合探針的C。t-1衍生序列的組成，變性這些產物，與ABLla偶聯微球雜交後回收(表l:反應19和20)。將這些產物用作耙序列，隨後與非重疊sc和重複性微球偶聯探針ABLlAluMERl雜交，ABLlAluMERl含Alu元件(AluJb、AluSq、Charlie1禾口AluSx)和位於距ABLla2.3kb著絲點的MER1序列。鑑於ABLlAluMERl在基因組中的此位置，預計它不存在於切口平移回收的基因組產物中。然而，發現標記的C。t-1組分是回收ABLlAluMERl序列的來源，依據是FL1通道中平均螢光強度提高了11倍(表1:反應21和22).C。t-1中毗鄰雜交的ABLla的重複序列看來通過形成重複和單拷貝序列元件的網絡而聚集在一起與基因組序列雜交(圖3:分圖1和2)。通過定量PCR(QPCR)分析回收的雜交產物中存在的序列評價了這種可能性。微量屍C及藩效柳用QPCR測定了C。t-1中與我們探針同源的sc序列成分。表2鑑定了此項研究所用的探針和引物。表3顯示了此項分析的結果。表3.回收的雜交耙DNA量化tableseeoriginaldocumentpage31擴增C。t-1DNA和對照基因組DNA的500ng樣品中ABLla的100bpsc區段(表2)。根據它們各自的Ct信，廠商I和R的C。t-1組分顯示與正常基因組成相比，雜交的ABLla量分別提高了14和2倍(或提高了2.5和1.7摩爾)(表1:反應l-3)。雜交後回收ABLla序列測定與此探針雜交的基因組和C。t-1衍生序列的組成(表1:反應21和22)。在含耙和C。t-1DNA二者的雜交樣品中ABLla序列提高了128倍(表3:反應13和14)。從雜交液回收的與ABLlAluMERl相同序列包含的C。t-1比缺乏C。t-1的一式二份反應中的高139倍(表3:反應15和16)。在回收的雜交產物中還檢測到與ABLlAluMERl密切相關的重複序列。在雜交反應物中測到的具有92%相似性的Alu元件DNJA3Alu(5，連接於DNJA3基因；chrl6:4421138-4421200)含有C。t-1，但在缺乏C。t-1的反應物中沒有，表明C。t-1是此汙染序列的來源(表3:反應17和18)。與ABLla探針雜交的回收產物中沒檢測到其它sc基因組區段(即來自CMTlA、H0XB1和其它ABL1區域(ABLlc和ABLld))。與連接ABL1的RRP4-1.6a序列雜交的C。t-1衍生序列(表2)含有同源sc和重複序列，儘管此單拷貝探針已經FISH驗證14。基因組中中等和高度豐富的MIR、L2和Ll重複元件圍繞此序列。QPCR證明相對於從sc間區內衍生的短RRP4-1.6a產物，從上遊(5，)和下遊(3，)擴增子回收的重複序列濃度較高(表3:反應4-12)。Cr值的比較表明，拓寬基因組重複序列(RRP4-1.6a5'和RRP4-1.6a3，)的廠商R的sc序列是基因組DNA中唯一比C。t-1組分豐富6.8倍的序列(廠商I的也類似)。如預計的那樣，基因組中內部scRRP4-1.6a序列比C。t-1豐富得多(24倍)，但在C。t-l中仍可檢測到(表3:反應7-9)。C。t-1製品中SINE和LINE豐富導致雜交時連接lc或sc序列加速，有可能與標記的基因組DNA中的偶聯探針或真正的sc耙序列退火相連。微始成艦復腦在基因組的三個不同基因座通過替代專門從與sc序列毗鄰的重複元件製備的過量純化的DNA，逆轉了C。t-lDNA的雜交效果(圖4)。合成的1.9kb擴增產物含有LTR-樣重複元件和染色體4中C1QTNF7上遊的單拷貝序列。除純化的合成的LTR-樣元件外，C1QTNF7LTR對此產品自身與偶聯微球的雜交沒有作用，而加入C。t-lDNA提高了平均螢光強度1.2倍(表l:反應23-25)。在存在和缺乏C。t-1DNA時用C1QTNF7LTR阻斷重複序列與切口平移的基因組DNA雜交獲得了類似結果(表1:反應26-28)。用含有這些序列的合成的PCR產物HOXBlAluLl抑制了AluSx與染色體17的H0XB1基因座(HOXBlb)上遊約2.3kb區域中的Ll重複序列雜交。在存在HOXBlAluLl時HOXBlb的PCR產物與對應的微球偶聯探針雜交有效封閉了擴增靶DNA中的重複序列，降低了雜交產生的螢光強度0.3倍，推測是由於靶DNA長度減少(表1:反應32和33)。在比較基因組與偶聯ABLla探針的微球雜交中，在此靶區域中加入合成的Alu和L2元件，也有效地抑制了重複序列的雜交(表l:反應29-31)。C。"微厚麟妙遊縛在已發表的雜交研究中對於抑制重複序列的雜交幾乎都包括c。t-i，提出的問題是此試劑如何影響表達和/或基因組拷貝數的定量測定？在採用C。t-l的研究中，評價了一組複製的靶樣品與克隆探針陣列的雜交的雙標記雜交螢光強度的變異(數據來源於GEO資料庫http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo)。分析用於微球雜交試驗的基因的cDNA探針試驗結果(包括ABLla、HOXB1和TEKT3)，然後通過它們的重複序列組成，鑑別位於基因組環境中的幾個基因序列的雜交模式，即重複序列群集的密度(表4下部)或稀疏度(表4上部)。表4不同基因複製微陣列研究中的變異tableseeoriginaldocumentpage0與衍生自含有較少但多態性更大重複序列的因組區域的探針相比，重複序列緻密的基因組間區中的序列複製Cy3/Cy5的強度比率變異更顯著。例如，發現採用相同的測試樣品在不同的複製實驗中ABL1顯示了提高和降低的表達(如資料庫記錄GDS751/20213顯示樣品方差為0.3，p=0.18;表4)，與我們用偶聯-ABLla的微球在雜交中觀察到的扭曲相似。相反，採用相同的測試樣品在複製表達陣列研究中H0XB1的螢光強度對數比率顯示幾乎沒有差異(GDS223/31555，樣品方差=0.001，pO.OOOl)，與此基因座我們的結果相符。這提示，C。t-1中的單拷貝序列與探針雜交，使形成的混合sc與重複序列網絡聚集而捕獲靶cDNA中的標記的重複序列。在微陣列研究中，C。t-1就如此以類似於QMH中所見方式通過形成複雜的雜交網絡而扭曲了富集的克隆探針與散布的重複序列的雜交。討論上述分析證明，C。t-1DNA中存在的非重複序列能顯著改變用同源探針檢測雜交反應時標記的基因組靶DNA的量。C。t-1並非抑制交叉雜交，而是使與含重複序列探針的雜交提高了3倍多。此結果提示，未標記的C。t-1DNA序列能橋連序列特異性探針中的lc和重複序列與互補的耙序列。重複序列與C。t-1組分中的同源lc序列連接可能使基因組靶DNA中標記的重複序列隨後雜交而聚集。將C。t-1DNA加入到與標記的基因組模板雜交的探針中可催化形成與該探針和基因組某處同源的異質雙鏈體網絡(圖3，實施例2)。將C。t-lDNA通過標記的lc基因組靶DNA加到連接的重複元件上(圖3,實施例4)促進了含有lc和重複序列(圖3，實施例3)的"偏愛(partial)"雙鏈體的形成。標記的重複序列與lc基因組靶DNA連接也可能改變雜交強度，但程度與C。t-1不同，這是由於C。t-l同時富含lc和散布的重複序列。隨著微陣列技術的進展，許多研究人員關註上述實驗的可重複性4—5。也許，交叉雜交有關差異的最大來源來自重複序列7。然而，許多學者認為解決此差異的方法是用C。t-lDNA封閉重複元件，然後使cDNA與陣列雜交6—7。Dong等人19發現"某些無重複序列的區域與能與人C。t-1DNA組分雜交的重複序列充分同源"，提出是它們歪曲了微陣列結果的雜交信號強度。C。t-1通過促進探針與無關的標記基因組耙DNA之間重複性序列橋連的形成，影響了雜交試驗的重複性，C。t-1所含的1C和SC序列能與標記的靶DNA競爭探針(結合)位點。有理由進行更廣泛的大基因組分析以鑑定更可能對此種系統誤差來源敏感的其它基因組區域。C。t-1DNA中的重複組分根據合理的動力學而非序列的組成製備。由於lc序列中不含重複序列，這種序列明確的合成的DNA能更有效阻斷探針中重複序列與共生同源基因組耙重複DNA的雜交。合成的基因座特異性試劑的另一優點是在C。t-lDNA中不能充分提呈重複(序列)家族，或由於重複序列的多態性而不能提呈，可合成這些序列提供更精確更綜合性的無sc序列的基因組重複序列庫。然而，基於此產品本身的成本和邏輯挑戰，應防止C。t-1被合成的廣泛代表了整個基因組中所有已知重複元件的重複性DNA試劑取代。可進一步加工C。t-1以限制其所含的sc序列的量。將含有C。t-l中大部分雙鏈DNA的重複序列重新退火連接於本身含單拷貝無重疊重複組分的單鏈序列。用專性持續推進的核酸外切酶如綠豆核酸酶，或A核酸內切酶處理這些混合的雙鏈體和單鏈結構，將修剪從雙鏈體DNA上凸出的單鏈序列。這些酶應不會在錯配核苷酸處切割，錯配核苷酸常見於同一重複序列家族的相關成員，其中單鏈缺口間隔序列被配對的鹼基序列間隔開或位於雙鏈體的切口處。此方法將消化單鏈重複序列和單拷貝間區。這將特別影響到通常顯示基因組5'(或3')端截斷的例如在Ll逆轉座子[11]中所見的重複元件的提呈。可加入相應的合成的DNA試劑來緩解這些序列的丟失。應注意C。t-1DNA的這種處理不能完全消除所有的sc序列，因為sc序列可能重退火連接，然而形成這類雙鏈體是反應動力學不喜愛的。鑑於以上所述，用部分或完全合成的由明確的重複序列組成的阻斷試劑替代C。t-1DNA應能改善微陣列和基因組雜交比較陣列表達的可重複性。這應最終導致這些應用廣泛的方法實驗條件的標準化。參考文獻l.Oostlander.A.，Mcijer.G.和Ylstra，B{2004)"基於微陣列的比較性基因組雜交及其在人類遺傳學中的應用，，(Microarray-basedcomparativegenomichybridizationanditsapplicationsinhumangenetics)Clin.Genet.，66:488-95.2.Hijum，SV.等(2005)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貝元件雜交；使所述抑制性核酸與含有所述染色體靶序列的染色體參比序列反應從而導致所述抑制性核酸中的重複元件與所述染色體參比序列中的同源重複元件雜交；使所述參比探針與所述染色體參比序列反應從而導致所述參比探針與所述染色體參比序列雜交；通過所述第一光譜地址檢測雜交的靶探針；通過所述第二光譜地址檢測雜交的參比探針；和比較檢測到的雜交靶探針的反應與檢測到的雜交參比探針的反應來量化檢測到的耙探針。26.如權利要求25所述的方法，其特徵在於，所述抑制性DNA包含重複元件，所述重複元件與所述靶中低拷貝元件相毗鄰的基因組重複元件相對應。27.—種抑制核酸探針中存在的重複元件與靶核酸中的同源重複元件之間的非特異性交叉雜交的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟使抑制性核酸與含有一個或多個低拷貝元件的靶核酸中的同源重複元件雜交，合成的所述抑制性核酸含有選出的與含有毗鄰中至高拷貝數重複元件的單拷貝區域的一個或多個代表性基因組區域相對應的多個重複元件且基本上不含低拷貝元件，再使所述靶核酸與含有與所述靶中的低拷貝元件同源的低拷貝元件的一個或多個探針雜交，所述探針基本上不含重複序列。28.—種抑制抑制性核酸中存在的低拷貝元件與核酸探針中或靶核酸中的同源低拷貝元件之間的非特異性交叉雜交的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟鑑定所述靶核酸中和附近的重複性和低拷貝元件，通過從所述靶核酸中選擇重複序列將其包含在所述制性核酸中同時在所述合成中基本上避免包含低拷貝序列來合成抑制性核酸序列，和使所述合成的抑制性核酸與所述靶核酸反應，而使各同源性抑制核酸與耙核酸元件互相雜交。29.—種利用Cot-lDNA來提高試驗精確度和重複性的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟選擇或合成含有多個重複元件但基本上沒有低拷貝序列的抑制性核酸，和用所述選擇的或合成的抑制性核酸替代Cot-lDNA。30.—種抑制基因組靶核酸與核酸探針額外雜交的方法，其^P徵在於，所述方法包括以下步驟選擇基因組中對應於感興趣序列的一條或多條序列來製備用於雜交的基因組靶核酸；鑑定所述感興趣靶序列中的低拷貝序列；合成與所述鑑定到的低拷貝靶序列同源的低拷貝探針，所述低拷貝探針基本上沒有重複序列；鑑定毗鄰於所述靶低拷貝序列的重複序列；合成與所述耙重複序列同源的抑制性DNA，該抑制性DNA基本上含有重複元件；使所述靶核酸與所述抑制性DNA反應從而該抑制性DNA中的所述重複元件與靶核酸中的同源重複元件雜交；使靶核酸與所述低拷貝探針反應而使所述探針中的低拷貝元件與所述靶核酸中的同源低拷貝元件雜交；和檢測所述低拷貝探針以量化探針與靶的雜交，從而確定所述靶核酸中替代的低拷貝元件。全文摘要本發明提供了抑制核酸探針中存在的重複元件與靶核酸中對應的重複元件之間非特異性交叉雜交的新型方法，該方法所用合成的DNA含有多個重複元件，同時能避免產生低拷貝的單拷貝序列。文檔編號C12Q1/68GK101405407SQ200680049039公開日2009年4月8日申請日期2006年11月17日優先權日2005年11月18日發明者H·L·紐科克申請人:兒童慈善醫院