中和血管內皮生長因子受體的人單克隆抗體及其用途的製作方法

2023-06-09 16:40:16 2

專利名稱：：中和血管內皮生長因子受體的人單克隆抗體及其用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及中和血管內皮生長因子受體的人單克隆抗體及其用途，尤其涉及中和血管內皮生長因子受體的人ScFv分子、以及含有該人ScFv分子的抑制血管生成的組合物和治療癌症的組合物。
背景技術：
：血管生成是指通過內皮細胞的生長、分化和移動由先存在的血管形成新血管，這不發生在健康成人中，除非因為某些特殊的原因，包括傷口癒合，月經等。然而，已經報導了在疾病(如腫瘤生長和轉移、老年性黃斑退化、風溼性關節炎、糖尿病視網膜病變、銀屑病和慢性炎症)中過度形成新血管(CamelietandJain,Nature，407249，2000)。因此，在採用血管生成抑制劑治療疾病尤其是腫瘤上進行了許多努力。參與血管生長的因子包括血管內皮生長因子(VEGF)、上皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子-b(TGFb)、成纖維細胞生長因子(FGF)等。其中，血管內皮生長因子是直接參與內皮細胞生長、分化和移動的內皮細胞特異性因子，存在四種不同亞型(VEGF165、VEGF121、VEGF189和VEGF206)。四種亞型之中，VEGF165是除了胎盤外所有人組織中最豐富的亞型(Tisheretal.，J.Biol.Chem.，266=11947,1991)血管內皮生長因子(VEGF)調控由內皮前體(成血管細胞)原位分化而引起的新血管形成，VEGF在傷口癒合期間在胚胎組織(Breieretal.，Development(Camb),114521，1992)、巨噬細胞以及增生的上皮角蛋白細胞中表達(Brownetal.，J.Exp.Med.，1761375，1992)，並且VEGF可能是形成炎症相關的組織水腫的原因(Ferraraetal.,Endocr.Rev.,13:18，1992)。原位雜交研究已證實，包括多形性成膠質細胞瘤、成血管細胞瘤、中樞神經系統腫瘤和AIDS相關的卡波希肉瘤在內的大量人腫瘤系中存在VEGF的高表達(Plateetal.,Nature,359845,1992；Plateetal.,CancerRes.,53:5822,1993；Berkmanetal.,J.Clin.Invest.,91:153,1993；Nakamuraetal.，AIDSWeekly，13(1)，1992)。在缺氧誘導的血管生成中也觀察到高水平的VEGF(Shweikietal.，Nature,359:843，192)。VEGF的生物功能是通過高親和力的VEGF受體介導的，所述VEGF受體在胚胎形成(Millaueretal.,Cell,72=835,1993)和腫瘤形成期間在內皮細胞中進行選擇性表達。VEGF受體(VEGFR)通常是III級受體型酪氨酸激酶，其特徵在於在受體的氨基末端細胞外配體結合域具有幾個(通常是5或7個)免疫球蛋白樣環(Kaipainenetal.,J.Exp.Med.，178:2027，1993)。其他兩個區域包括一個跨膜區和一個通過插入可變長度的親水性內激酶序列而阻斷的羧基末端細胞內催化域，該羧基末端細胞內催化域稱為激酶插入域(Termanetal.，Oncogene,6:1677，1991)。VEGF受體包括fms-樣酪氨酸激酶受體(Flt-1),或VEGFR-1(Shibuyaetal.,Oncogene,5519,1990；W092/14248；Termanetal.，Oncogene，6:1677，1991)，含激酶插入域的受體/胎兒肝激酶(KDR/Flk-1)，或VEGFR-2(Matthewsetal.，PNAS,889026,1991)，儘管其他受體如神經纖毛蛋白(neuropilin)-l和神經纖毛蛋白_2也可結合VEGF。其他酪氨酸激酶受體VEGFR-3(Flt_4)結合VEGF同系物VEGF-C和VEGF-D，且在淋巴管的生長中是很重要的。滲入神經膠質瘤的內皮細胞表達高水平的Flk-1(Plateetal.,Nature,359845，1992)。由人成膠質細胞瘤產生的VEGF特異性地正調節Flk-1水平(Plateetal.,CancerRes.，53:5822，1993)。與內皮細胞相關的成膠質細胞瘤(GAEC)中高水平的Flk-1表達表明了在腫瘤形成期間可能誘導受體活性，因為在正常腦內皮細胞中幾乎檢測不到Flk-1轉錄物。這種正調節限於最接近腫瘤的血管內皮細胞。在裸鼠中封閉VEGF活性和中和抗VEGF單克隆抗體(mAbs)可抑制人腫瘤異種移植物的生長(Kim,K.etal.，Nature,362:841_844，1993)，這表明了VEGF在腫瘤相關的血管生成中的直接作用。儘管在腫瘤細胞中VEGF配體被正調節，並且其受體在腫瘤滲入血管內皮細胞中被正調節，但在與血管生成無關的正常細胞中VEGF配體和其受體的表達水平是很低的。因此，這種正常細胞會封閉VEGF和其受體之間的相互作用以抑制血管生成，從而抑制腫瘤生長。由滲入神經膠質瘤的內皮細胞表達高水平VEGFR-2，並由人成神經膠質瘤產生的VEGF對其進行特異性正調節(Plateetal.,Nature,359:845，1992；Plateetal.,CancerRes.,53=5822,1993)。在成神經膠質瘤相關的內皮細胞(GAEC)中VEGR-2的高水平表達表明了在腫瘤形成期間誘導了受體活性，因為在正常腦內皮細胞中幾乎檢測不到VEGFR-2轉錄物。因此，正積極地開展研究，關注於抑制在腫瘤生長位點表達的VEGF的活性，以抑制血管生成，從而抑制腫瘤生長。通常地，已經發展了抑制癌細胞膜上的VEGF受體以阻止VEGF進入細胞的方法。產生VEGFR抗體的細胞系實例包括產生大鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體的雜交瘤細胞系(DC101；ATCCHB11534)、產生小鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體mAb25的雜交瘤細胞系(M25,18A1；ATCCHB12152)、和產生小鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體mAb73的雜交瘤細胞系[(M73，24;ATCCHB12153)、KM1730(FERMBP-5697;W098/22616；WO99/59636)、KM1731(FERMBP-5718)、KM1732(FERMBP-5698)、KM1748(FERMBP-5699)、KM1750(FERMBP-5700)]。已持續研發了針對VEGF受體的人源化抗體。迄今為止，這些針對VEGF受體的人源化抗體在體外表現出與VEGF的高度競爭性，但存在一個問題即它們中和細胞中VEGF受體的能力下降了且抗體在小鼠或大鼠中未表現出交叉反應性，以致未能進行動物試驗。因此，本發明人構建了非免疫完全人抗體文庫，篩選了針對VEGF受體(KDR)的單鏈可變區片段(ScFv)抗體，並發現了抗體不僅在體外，而且在細胞內和體內也顯示出優異的KDR中和效應，甚至在小鼠和大鼠中表現出交叉反應性，因此完成了本發明。
發明內容本發明的一個目的是提供完全的人單鏈可變區片段(singlechainvariablefragment,ScFv)抗體6A6_ScFv和6A6_IgG，其具有優異的在細胞和體內中和VEGF受體的能力。本發明的另一目的是提供完全的人單鏈可變區片段(ScFv)，其是6A6的輕鏈變體，該輕鏈變體相對於6A6-ScFv表現出更為優異的中和VEGF受體的能力。本發明的另一目的是提供抑制血管生成的組合物，其含有具有中和VEGF受體能力的完全人ScFv或IgG。本發明的另一目的是提供治療癌症的組合物，其含有具有中和VEGF受體能力的完全人ScFv或IgG。為實現上述目的，在一方面，本發明提供了一種單鏈可變區片段(ScFv)分子，其含有由SEQIDN0S:1-19的任一胺基酸序列所表示的輕鏈可變區並具有中和血管內皮生長因子受體的功能。在本發明中，ScFv(單鏈可變區片段)分子和其構建體優選具有由SEQIDNO20的胺基酸序列所表示的重鏈可變區。在另一方面，本發明提供了編碼所述ScFv(單鏈可變區片段)分子的DNA，含有所述DNA的載體，和轉化有所述載體的重組細胞。在本發明中，所述細胞優選是細菌或動物細胞。在另一方面，本發明提供了抑制血管生成的組合物，其含有所述ScFv分子，並且本發明提供了治療癌症的組合物，其含有所述ScFv分子。在另一方面，本發明提供了IgG，其含有由SEQIDN0S:1_19的任一胺基酸序列所表示的輕鏈可變區並具有中和血管內皮生長因子受體的功能。在本發明中，所述IgG優選具有由SEQIDNO20的胺基酸序列所表示的重鏈可變區。在另一方面，本發明提供了抑制血管生成的組合物，其含有所述IgG，並且本發明提供了治療癌症的組合物，其含有所述IgG。將由以下具體描述和所附權利要求闡明本發明的其他特點和方面。圖1顯示了插入p⑶NA3-KDRD123tFcm載體的基因的胺基酸序列和功能。圖2顯示了本發明中用於表位定位(印Hopemapping)的KDR(ECD1_2)和KDR(ECD2-3)-Fc的示意圖。圖3顯示了本發明中純化的KDR(ECDl-3)-Fc的SDS-PAGE結果。圖4顯示了本發明中抗KDR噬菌體和抗KDR-SvFc的VEGF競爭試驗結果。圖5顯示了本發明中6A6ScFv噬菌體的核酸序列、胺基酸序列和⑶R序列。圖6顯示了純化的6A6ScFv的SDS-PAGE結果。圖7顯示了採用抗KDR-SvFc的VEGF競爭試驗結果。圖8顯示了本發明中抗KDR-SvFc的表位定位結果。圖9顯示了含有非可變區和6A6IgG重鏈區的載體pIGHD_6A6Hvy的酶切圖。圖10顯示了含有恆定區和IgG輕鏈區的載體pIgGLD_6A6Lgt的酶切圖。圖11顯示了純化的6A6IgG的SDS-PAGE結果。圖12顯示了採用抗KDR6A6IgG的VEGF競爭試驗結果。圖13顯示了抗KDR6A6IgG和VEGF族的競爭試驗結果。圖14顯示了本發明抗KDRIgG抗體與HUVEC細胞的結合親和力的FACS分析結果。圖15顯示了在HUVEC細胞中本發明抗KDRIgG抗體與VEGF165的競爭的FACS分析結果。圖16顯示了在K562細胞系(ATCCCCL-243)中KDR表達的蛋白印跡分析結果。圖17顯示了本發明抗KDRIgG抗體與K562細胞系的結合親和力。圖18顯示了在K562細胞系中本發明抗KDRIgG抗體與VEGF的競爭的FACS試驗結果。圖19顯示了本發明抗KDR抗體與Gleevec抗性細胞系的結合親和力的FACS分析結果。圖20顯示了本發明的抗KDRIgG抗體抑制細胞增殖的分析結果。圖21顯示了本發明抗KDR抗體對由VEGF誘導的KDR磷酸化和ERK磷酸化的抑制能力的蛋白印跡分析結果。圖22顯示了IgG型KDR抗體抑制VEGF移動內皮細胞的能力。圖23顯示了IgG型KDR抗體抑制由VEGF誘導的內皮細胞血管形成的能力。圖24顯示了通過IgG型KDR抗體和細胞表面KDR之間的結合抑制VEGF-KDR內化。圖25顯示了IgG型KDR抗體對由VEGF誘導的大鼠主動脈環化的抑制效應。圖26顯示了IgG型KDR抗體對由VEGF誘導的血管生成的抑制效應分析結果。圖27顯示了在結腸癌小鼠異種移植物模型中6A6抗體對HCT116細胞系中腫瘤生長的抑制效應分析結果。圖28顯示了在結腸癌小鼠異種移植物模型中以6A6抗體治療後的腫瘤切片圖像。圖29顯示了在肺癌小鼠異種移植物模型中6A6抗體對A549細胞系中腫瘤生長的抑制效應分析結果。圖30顯示了以碘放射性同位素對IgG型6A6抗體的標記結果。圖31顯示了在慢性髓性白血病小鼠腫瘤模型中以碘123標記的IgG型6A6抗體的彩圖。圖32是顯示輕鏈改組(lightchainshuffling)製備的示意圖。圖33顯示了通過輕鏈改組獲得的抗KDR抗體的VEGF競爭試驗結果。圖34顯示了通過輕鏈改組獲得的抗KDR抗體的VEGF競爭試驗結果。圖35顯示了通過輕鏈改組獲得的抗KDR抗體的VEGF競爭試驗結果。具體實施例方式在一方面，本發明涉及完全人ScFv(單鏈可變區片段)抗體A6A(TTAC-0001)-ScFv，其中和血管內皮生長因子。按以下方式篩選6A6_ScFv。首先，構建完全人抗體文庫，並構建表達融合到Fc上的由KDR(VEGFR-2)胞外域1_3中的每個組成的融合蛋白的細胞系。採用純化的重組KDRD1-D3-FC融合蛋白從細胞系中的完全人抗體文庫中篩選中和KDR的抗KDR-ScFv抗體。以V5標籤在細菌中表達並純化經篩選的ScFv抗體，並在ScFv噬菌體顆粒狀態中進行人KDRD1-D3-FC結合試驗和VEGF競爭試驗。此外，進行BIAcore分析以測量ScFv抗體親和力，並獲得具有恆定維持親和力的6A6-ScFv且將其轉化成IgG形式。而且，在本發明中通過蛋白印跡法確認了在初級培養的HUVEC細胞中6A6_ScFv抑制了血管生成信號因子ERK的磷酸化且這種抑制依賴於6A6-ScFv的濃度。在另一方面，本發明涉及中和血管內皮生長因子受體的完全人抗體6A6_IgG。FACS分析揭示了與商業可供的IMC-1C11IgG嵌合抗體(Imclone,USA)相比，6A6-IgG牢固地結合到由活體HUVEC細胞(ATCC，USA)在表面表達的內源人KDR上，甚至還在以競爭性結合人VEGF165處理細胞的時候，與商業可供的IMC-1C11IgG嵌合抗體相比，6A6-IgG能更有效地中和HUVEC細胞表面表達的KDR。這表明了ELISA中的VEGF競爭試驗結果不同於在相似水平下6A6_IgG和IMC-1C11IgG嵌合抗體中和KDR獲得的結果。即，體外試驗結果和體內試驗結果會互有區別，且根據體外試驗結果篩選高度有效的抗體是有局限性的。此外，在本發明中，可以觀察到與IMC-1C11IgG相比，6A6_IgG抗體更牢固地結合到由人急性粒細胞白血病細胞系K562(ATCC，USA)表達的KDR上。而且，在本發明中，通過蛋白印跡法確認了在初級培養的HUVEC細胞中6A6_IgG抑制了血管生成信號因子ERK的磷酸化且這種抑制以6A6-IgG濃度依賴方式而增強。此外，在本發明中，可以觀察到本發明的6A6_IgG抑制了HUVEC細胞的趨化性向存在VEGF的環境的移動且6A6-IgG也抑制了HUVEC細胞的微管形成，其直接作用於血管生成。而且，在本發明中，為了確認6A6_IgG對HUVEC細胞VEGF的抑制效應是因為6A6-IgG阻斷了VEGF受體進入HUVEC細胞，在採用以FITC標記的KDR抗體的試驗中以共焦顯微鏡進行觀察。結果觀察到當以6A6-IgG處理細胞時VEGF受體(KDR)不能進入細胞中。此外，通過在體外大鼠主動脈環試驗，發現了以6A6_IgG處理大鼠主動脈環，不會出現血管萌生。而且，通過將基質膠皮下注射到小鼠中的基質膠塞入試驗分析了血管生成。結果在以VEGF處理的組中，在塞入物中觀察到血管生成，但在以VEGF和6A6_IgG處理的組中，未觀察到血管形成，這表明了6A6-IgG在體內具有血管生成抑制效應。在另一方面，本發明涉及通過輕鏈改組以突變6A6_ScFv輕鏈序列而獲得的變體。通過輕鏈改組，獲得了18個6A6_ScFv輕鏈變體，且輕鏈改組通過以下方式進行。(1)為了防止在生物淘篩期間6A6被再次選中，以在6A6的⑶R3上具有識別位點的限制性酶Spel處理6A6輕鏈改組文庫中的DNA。在DNA被轉染到ETB細胞中之後，構建亞文庫，以ELISA進行KDR親和力和VEGF競爭試驗以選擇具有優異KDR中和能力的克隆子。(2)在生物淘篩的洗滌步驟中，使抗體克隆子與可溶性KDR競爭以選擇具有優異KDR中和能力的克隆子。(3)在生物淘篩的使噬菌體結合到抗原KDR上的步驟中，還加入IMC-1121BIgG(ImClone,USA)以選擇KDR中和能力強於或類似於1121BIgG的克隆子。在另一方面，本發明涉及抑制血管生成的組合物和治療癌症的組合物，其含有所述的ScFv或IgG。本文所用的術語「血管生成」包括腫瘤生長和轉移、老年性黃斑退化、風溼性關節炎、糖尿病視網膜病變、銀屑病和慢性炎症中涉及的血管形成，但本發明的範圍不限於此。在本發明中，所述癌症包括但不限於結腸癌，胰腺癌，直腸癌，結直腸癌，前列腺癌，腎癌，黑色素瘤，轉移至骨骼的前列腺癌，卵巢癌和血癌。本發明的組合物可通過任何適宜特定分子的途徑給藥。本發明組合物可通過任何適宜方式直接地(例如，局部地，如通過注射、皮下注射或局部給藥至組織部位)或全身地(例如，胃腸外或口服)提供給包括人在內的動物。若通過胃腸外提供本發明組合物，例如通過靜脈內、皮下、眼、腹膜內、肌肉內、口腔內、直腸、陰道、眼眶內、大腦內、顱內、脊柱內、心室內、腱鞘內、腦池內、囊內、鼻內給藥或通過氣溶膠給藥，組合物優選含有部分水性或生理相容流體懸浮液或溶液。從而，載體或輔料是生理可接受的以便除將所需藥劑遞送給受試者之外，溶液不會另外負面影響受試者的電解質和/或容積平衡。用於藥劑的水性介質可包括常規生理鹽水。為了治療，可將本發明的ScFv或IgG蛋白以足以預防、抑制或減緩腫瘤發展(例如腫瘤的生長、侵入、轉移和/或復發)的量給藥至癌症患者。足以實現該效果的量被定義為「藥效治療劑量」。能有效發揮該用途的量將取決於疾病的嚴重性和患者自身免疫系統的概況。本發明所述蛋白的劑量優選為0.01-100mg/kg，更優選為0.1-lOmg/m2。然而，最佳劑量將取決於要治療的疾病和副作用的存在，其可通過常規實驗進行測定。抗體的給藥可通過周期的彈丸注射，或通過從外部源(例如從靜脈內袋)或內部源(例如從生物可降解的植入物)持續靜脈內或腹膜內給藥。而且，本發明的抗體蛋白也可與許多不同生物活性分子一起給藥至預期接受者。然而，可通過本領域技術人員熟知的常規實驗確定融合蛋白和其他分子的最佳組合，給藥模式，劑量。本發明所述的組合物可和其他與相關疾病有關的治療劑組合使用。當以VEGF受體抗體與放療、化療、其他受體拮抗劑或其組合結合來治療包括人腫瘤在內的腫瘤時，存在協同作用。換言之，在與化療劑、放療、或附加受體拮抗劑或其組合結合時通過VEGF受體拮抗劑抑制腫瘤生長可被增強至超過預期。例如相對於以VEGF受體拮抗劑和化療劑、放療或附加受體拮抗劑治療所預期的累加效應，通過組合治療能更強地抑制腫瘤生長，從而體現出協同作用。優選地，通過癌症的消除證實協同作用，其中該消除是不能由VEGF受體拮抗劑和化療劑、放療或附加受體拮抗劑的組合治療所預期的。在開始化療或放射治療的之前、期間或之後給藥VEGF受體拮抗劑以及它們的任意組合，即開始化療和/或放射治療的之前和期間，之前和之後，期間和之後，或之前、期間和之後。例如，當VEGF受體拮抗劑是抗體時，該抗體通常在開始放射治療和/或化療之前的1-30天之間，優選3-20天之間，更優選5-12天之間被給藥。VEGF受體抗體在一個實施方式中，VEGF受體抗體特異性地結合到VEGF受體的胞外域的表位上。VEGF受體的胞外域是配體結合域。該配體結合域可在受體的任一端發現，但通常在氨基末端發現。VEGF受體的一些實例包括蛋白酪氨酸激酶受體，其在文獻中被稱為Flt-1(VEGFR-1)、KDR和Flk_l(VEGFR-2)。除非本文另外指出或另有明確說明，本說明書將遵循VEGF受體的常規文獻命名法。KDR將被稱為分子量MW為180kD的人形式VEGF受體(Termanetal.，Oncogene,6:1677，1991)。Flk-1(VEGFR-2)將被稱為KDR的鼠同系物(Matthewsetal.，PNAS，88:9026，1991)。Flt-1(VEGFR-1)被稱為與KDR/Flk-1受體不同但相關的一種形式的VEGF受體(Shibuyaetal.，Oncogene,5:519，1990)。其他VEGF受體包括可與標記VEGF交聯的VEGF受體，或可與KDR共免疫沉澱的VEGF受體。這些VEGF受體的一些已知形式具有大約170kD、150kD、130_135kD、120_125kD和85kD的分子重量(Quinnetal.，PNAS,90:7533，1993；Scheretal.，J.Biol.Chem.，2715761,1996)。VEGF受體通常與細胞結合，例如內皮細胞。VEGF受體也可與非內皮細胞結合，例如腫瘤細胞。可選地，VEGF受體可游離於細胞，優選以可溶形式。本發明的拮抗劑中和VEGF受體。在本說明書中，中和(neutralizing)受體是指鈍化受體固有的激酶活性以轉導信號。VEGF受體中和的可信試驗是受體磷酸化的抑制。本發明不受VEGF受體中和的任何特定機制限制。由一種拮抗劑引發的機制不一定與另一拮抗劑引發的相同。一些可能的機制包括防止VEGF配體與VEGF受體胞外結合域的結合，和防止受體的二聚化或低聚化。但不排除其他機制。在本發明的上下文中，VEGF受體(或VEGFR)抗體抑制受體VEGFR亞族的活化。抑制受體VEGFR亞族的活化是指VEGFR活化的任何下降。即，防止活化不需要完全終止VEGFR的活化。而且，在本發明中定義的VEGFR活化的抑制是指通過VEGFR抗體和VEGFR的相互作用抑制VEGFR。聯合(association)是指VEGFR和能抑制受體酪氨酸激酶活性的VEGFR抗體之間的充分物理或化學作用。本領域技術人員會識別這種化學作用的實例，本領域已知的包括聯合或結合，且包括共價結合、離子結合、氫鍵結合等。因此，本發明的VEGFR拮抗劑抑制受體的酪氨酸激酶活性，其防止受體的自磷酸化和參與VEGFR信號途徑的多種其他蛋白的磷酸化。參與調控脈管形成和血管生成的這種途徑包括以下任一者磷脂酶Cy(PLCy)途徑、或磷脂醯3』激酶(PI3-K)/Akt和分裂素活化蛋白激酶(MAPK)途徑(Larriveeetal.，Int.JMed.，5447,2000)。受體的VEGFR亞族的特徵在於在胞外域中存在七個免疫球蛋白樣環，單個跨膜域，以及在胞內區中的裂解酪氨酸激酶結構域(III級受體酪氨酸激酶)。存在幾種已知的受體VEGFR亞族成員，其實例包括VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。通常認為KDR(VEGFR_2)是引起內皮細胞增殖、移動、分化，引起脈管形成，增加血管滲透性，和保持血管完整性的主要VEGF信號轉導蛋白。VEGFR-1擁有弱得多的激酶活性，且在受到VEGF刺激時不能發生有絲分裂反應，儘管其與VEGF的結合的親和力比KDR(VEGFR-2)高大約10倍。VEGFR-1也參與VEGF和胎盤生長因子(P1GF)誘導的單核細胞和巨噬細胞移動以及組織因子的產生。如上述的VEGFR的情況，增加的VEGFR活化可能起因於更高水平的配體、VEGFR基因擴增、引起正調節受體信號的受體或突變體的轉錄增加。在本發明的一個實施方式中，VEGFR抗體抑制VEGFR與其配體的結合。配體與VEGH外部胞外域的結合刺激受體的二聚化、VEGFR的自磷酸化、受體內部細胞質酪氨酸激酶結構域的活化、和參與調控脈管形成和血管生成的多信號轉導途徑的啟動。VEGFR的配體包括VEGF及其同系物P1GF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E。例如，P1GF是一種二聚化分泌因子且僅與VEGFR-1結合，其由絨毛細胞滋養層、合體細胞滋養層和絨毛外滋養層大量產生並且與VEGF具有密切的胺基酸同源性。在人類中存在三種亞型P1GF-1、P1GF_2和P1GF-3。對缺乏P1GF的小鼠的研究證實該生長因子本身不參與血管生成，而是在病理狀態下特異性地調控VEGF的血管生成和通透性效應。此外，由於存在未在其他VEGF族成員中發現的N和C端延長，VEGF-D與VEGF-C密切相關。在成人組織中，VEGF-DmRNA在心、肺、骨骼肌、結腸和小腸中最豐富。分析VEGF-D受體特異性揭示了VEGF-D是VEGFR-2(Flkl)和VEGFR-3(Flt4)的配體並能活化這些受體；但是，VEGF-D不能結合到VEGFR-1。此外，VEGF-D是內皮細胞的促分裂劑。9在本發明的另一實施方式中，VEGFR抗體特異性地結合VEGFR。應該認識的是，VEGFR抗體可在外部結合到VEGFR的胞外部分，其可以或不可以抑制配體的結合，或進入酪氨酸激酶的結構域。優選地，本發明的VEGFR拮抗劑是VEGFR特異性的抗體或其功能等效物，在以下將更為詳細地描述其細節。在一個優選實施方式中，VEGF受體抗體與KDR特異性結合。尤其優選的是抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白結合到KDR胞外域並通過其配體VEGF和P1GF中的一個或兩個阻斷結合、和/或中和VEGF誘導或P1GF誘導的KDR活化。也存在多種產生VEGFR-2抗體的雜交瘤。例如，產生大鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體(DC101)的雜交瘤細胞系保藏為ATCCHB11534；產生小鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體mAb25的雜交瘤細胞系(M25.18A1)保藏為ATCCHB12152；產生小鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體mAb73的雜交瘤細胞系(M73.24)保藏為ATCCHB12153。此外，存在多種產生抗VEGFR-1抗體的雜交瘤，包括但不限於在W098/22616、W099/59636、AU5066698B2和CA2328893中公開的雜交瘤KM1730(保藏為FERMBP-5697)、KM1731(保藏為FERMBP-5718)，KM1732(保藏為FERMBP-5698)、KM1748(保藏為FERMBP-5699)、KM1750(保藏為FERMBP-5700)。本領域中已知多種其他VEGFR拮抗劑。VEGFR拮抗劑的一些實例如US5，185,438、5，621，090、5，283，354、5，270，458、5，367，057、5，548，065、5，747，651、5，912，133、6，677，434,6，960，446,5，840，301,5，861，499,6，365，157,5，955，311,6，365，157,6，811，779、以及W02001/66063所述。US5，861，301、Termanetal.，Oncogene，6:1677，199UW094/10202和WO95/21865公開了VEGFR拮抗劑，特別是抗VEGFR-2抗體。此外，抗VEGFR-2抗體如US.6，177，401和5，712，395所公開的。US5，981，569公開了為有機分子的VEGFR拮抗劑。此外，已知針對KDR(VEGFR-2)和VEGFR-1的雙特異性抗體(BsAbs)，其具有兩種不同抗原結合特異性或位點。而且，Hennequinetal.，J.Med.Chem.,42=5369,1999公開了特定的喹唑啉、喹啉和噌啉可作為有效的VEGF受體拮抗劑(Annieetal.,J.Acqu.ImmuneDefic.Syn.andHum.Retrovirol.,17:A41,1998)。而且，本領域已知檢測VEGFR抗體的試驗。本發明的VEGFR抗體抑制VEGFR的酪氨酸激酶活性，其通常涉及磷酸化作用。因此，磷酸化試驗可用於檢測本發明的VEGFR抗{本o^Paneketal.,J.Pharmacol.Exp.Thera.,2831433,1997andBatleyetal.,LifeSci.,62=143,1998中描述了一些酪氨酸激酶活性的試驗。此外，可利用特異性檢測VEGFR表達的方法。抗體可通過本領域已知的方法(Kohler和Milstein，Nature,256:495，1975；Campbell,MonoclonalAntibodyTechnology,TheProductionandCharacterizationofRodentandHumanHybridomas；Burdonetal.,Eds.,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,Vol.13,ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,1985；Huseetal.，Science，246:1275，1989)製備本發明的抗體。本發明的抗體可以是單克隆或多克隆抗體或任何其他適宜形式的抗體，例如抗體的片段或衍生物、單鏈可變區片段(ScFv)或抗體的合成同系物，條件是所述抗體具有與完整抗體相同的結合特性或具有與完整抗體相當的結合特徵。除非文中另有指示或明確指出，本文所用的抗體結構域、區域和片段遵循本領域熟知的標準定義(Abbasetal.,CellularandMolecularlmmunology,ff.B.SaundersCompany,Philadelphia,PA,1991)。優選地,本發明的抗體是單克隆抗體。抗體片段可通過裂解完整抗體或通過表達編碼片段的DNA而製備。抗體片段可通過公開文獻中描述的方法製備(Lamoyietal.,J.Immunol.Methods,56=235,1983；Parham，J.Immunol.，131:2895，1983)。這種片段可包含Fab片段和F(ab')2片段中的一個或兩個。這種片段也可包含單鏈可變區片段抗體(即ScFv)、雙抗體或其他抗體片段。在W093/21319，EP239,400,W089/09622，EP338，745和EP332，424中公開了製備這些功能等效物的方法。單鏈可變區片段(scFv)是與輕鏈可變區(一種短肽連接物)連接的抗體重鏈可變區組成的多肽。從而，scFv包含整個抗體結合位點。可在細菌或在真核細胞中製備這些鏈。本發明的單鏈抗體的典型實例是6A6-ScFv(TTAC-0001)。6A6_ScFv表現為阻斷VEGF-KDR(VEGF-VEGFR-2)相互作用並抑制VEGF刺激的受體磷酸化。這種6A6_ScFv可與HUVEC細胞和K562細胞中的可溶性KDR(VEGFR_2)和細胞表面表達的KDR(VEGFR_2)結合。6A6-ScFv具有SEQIDNO35的輕鏈序列和SEQIDNO36的重鏈序列。6A6_ScFv抗體是完全的人抗體並可由Fab',F(ab')2、二價ScFv、二價重組ScFv或人IgG抗體構成。優選地，儘管抗體片段含有整個抗體的所有六個互補決定區(⑶Rs)，但是包含比所有這些區域更少的如三，四或五個⑶Rs的片段也具有功能。如果抗體片段太短而不具備免疫原性，可將其與載體分子偶聯。一些適宜的載體分子包括匙孔血藍蛋白和牛血清白蛋白。可通過本領域已知的方法進行偶聯。本發明的抗體也包括通過直接突變、親和力成熟的方法、噬菌體展示或鏈改組而改善其結合特性的抗體。通過突變CDRs和篩選具有所需特性的抗原結合位點，可修飾或改善親和力和特異性(Yangetal.，J.Mol.Biol.，254:392，1995)。以多種方式突變CDRs。一種方法是任意排布單個殘基或殘基組合以使在一組同一抗原結合位點中在特定位點發現所有二十種胺基酸。可選地，通過錯配PCR方法在CDR殘基範圍內誘導突變(Hawkinsetal.,J.Mol.Biol.,226=889,1992)0含有重鏈和輕鏈可變區基因的噬菌體展示載體在E.coli突變株中繁殖(Lowetal.，J.Mol.Biol.，250:359，1996)。這些產生突變的方法是本領域技術人員已知的許多方法的例示。抗體特別是單克隆抗體可由本領域已知的方法製備。製備抗體的實例包括但不限於在雜交瘤中產生和用編碼受體拮抗劑的DNA轉化哺乳動物細胞。在許多公開文獻中描述了這些方法(KohlerandMilstein,Nature,256:495，1975；Campbellin"MonoclonalAntibodyTechnology,TheProductionandChracterizationofRodentandHumanHybridomas"inBurdonetal,Eds.，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,Vol.13,ElservierSciencePublishers,Amsterdam,1985；Huseetal.，Science,246:1275，1989)。抗體等效物也可通過本領域已知的方法製備。例如，可由完整抗體酶促製備抗體片段。優選地，抗體等效物是由編碼這些等效物的DNA製備的。編碼抗體片段的DNA可以通過刪除除了所需的編碼抗體全長的DNA部分之外的所有部分而製備。編碼嵌合抗體的DNA可通過重組基本上或專門地來自於相應的人抗體區域的編碼人恆定區域的DNA和基本上或專門地來自於除人之外的哺乳動物的可變區序列的編碼可變區的DNA而製備。編碼人源化抗體的DNA可通過重組基本上或專門地來自於相應的人抗體區域的編碼除了互補決定區(CDRs)之外的恆定區和可變區的DNA和基本上或專門地來自於除人之外哺乳動物的編碼⑶Rs的DNA而製備。編碼抗體片段的DNA分子的適宜來源包括表達全長抗體的細胞，例如雜交細胞瘤。片段可作為抗體等效物而使用，或可如上述重組到等效物之中。在本節描述的DNA刪除和重組可通過已知方法進行，例如在本節名為「FunctionalEquivalentsofAntibodies」的公開專利申請中描述的那些和/或例如以下描述的標準重組DNA技術。優選的轉化載體和表達本發明抗體的宿主細胞是哺乳動物細胞，例如C0S-7細胞、中國倉鼠卵巢(CH0)細胞和淋巴源的細胞系(例如淋巴瘤、骨髓瘤或雜交瘤細胞)。可選擇利用其他真核宿主例如酵母。例如，小鼠胎兒肝基質細胞系2018結合APtag-Flk1和APtag-Flk-2的融合蛋白，即含有VEGFR-2和Flk_2(ATCC,Manassas,VA,CRL10907)的配體，人胎兒脾細胞系Fsp62891含有Flk-2配體(ATCCCRL10935)，人基質胎兒胸腺細胞系F.thy62891含有VEGFR-2配體(ATCCCRL10936)。本文所用的術語「載體」是指任何含有將被引入宿主細胞並且將被重組和整合到宿主細胞組中的合適核酸序列、或含有作為附加體自主複製的合適核酸序列的核酸。這種載體包括線性核酸，質粒，噬菌體，粘粒，RNA載體，病毒載體等等。病毒載體的實例包括但不限於逆轉錄病毒、腺病毒和腺病毒相關病毒。本文所用的術語「基因表達」或「靶蛋白表達」應理解成表示DNA序列的轉錄、mRNA轉錄物的翻譯和Fc融合蛋白產物的分泌。在本發明中，適宜的宿主細胞可以被DNA轉化或轉染並可用於表達和/或分泌靶蛋白。優選用於本發明的宿主細胞包括永生雜交瘤細胞、NS/0骨髓瘤細胞、293細胞、中國倉鼠卵巢(CH0)細胞、HELA細胞和COS細胞。通過本領域已知的方法在含有可同化碳源(碳水化合物例如葡萄糖或乳糖)、氮源(胺基酸、肽、蛋白或其降解產物，例如酮、銨鹽等)和無機鹽(鈉、鉀、鎂和鈣的硫酸鹽、磷酸鹽和/或碳酸鹽)的液體培養基中培養轉化的細胞。培養基額外含有例如促生長物質，例如微量元素，如鐵、鋅、錳等。若希望在酵母中表達基因構建體，適宜用於酵母的選擇基因是存在於酵母質粒YRp7±的trpl(Stinchcombetal.，Nature,28239,1979；Kingsmanetal.，Gene,7:141，1979)。trpl基因為缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變株提供了選擇標記，例如ATCC44076或PEP4-1(Jones，Genetics，8512，1977)。trpl在酵母宿主細胞基因組中存在損壞然後提供了在缺乏色氨酸下通過生長來檢測轉化的有效環境。類似地，通過已知帶有Leu2基因的質粒補充Leu2缺陷酵母株。可選地，編碼受體拮抗劑的DNA可被克隆到來自病毒(例如腺病毒，腺病毒伴隨病毒，皰疹病毒，逆轉錄病毒或慢病毒)的載體中。基因表達通過可誘導或不可誘導調控序列來控制。簡言之，選擇了含有表達所需DNA(例如抗體，抗體等效物或VEGF受體的核酸分子)的細胞的適宜來源。通過標準程序由適宜來源製備總RNA。總RNA直接用於cDNA合成。在例如以上所述的那些分子生物學的標準手冊中提供了分離RNA和合成cDNA的標準方法。可通過已知方法擴增cDNA。例如，cDNA可作為聚合酶鏈式反應(PCR)的擴增模版(Saikietal.，Science,239:487，1988；US4，683，195)。用於PCR擴增的低聚核苷酸引物來源於要擴增的已知序列。通過本領域已知的方法合成所述低聚核苷酸(Caruthers，Science,230:281，1985)。將上遊和下遊低聚核苷酸的混合物用於PCR擴增中。根據標準程序優化每個特定引物對的條件。例如通過電泳具有正確大小的cDNA並對照引物之間的序列來分析PCR產物。可選地，編碼區域可擴增兩個或多個重疊片段。該重疊片段被設計成包含允許由這些片段裝配成完整cDNA的限制性酶切位點。為了分離完整的VEGF受體蛋白編碼區域，例如上遊PCR低聚單克隆抗體與5』端的序列是互補的，並優選地包含ATG啟動密碼子和至少5-10個核苷酸的啟動密碼子上遊。下遊PCR低聚核苷酸引物與所需DNA序列的3』端序列是互補的。所需DNA序列優選編碼VEGF受體的完整的胞外部分，並且任選地編碼所有或部分跨膜區域和/或所有或部分細胞內區域，包括終止密碼子。要擴增的NDA(例如編碼抗體、抗體等效物或VEGF受體的DNA)也可以在多種克隆載體中在多種宿主細胞中進行複製。宿主細胞可以是原核的或真核的。拼接了DNA的載體可含有染色體、非染色體和合成DNA序列片段。一些適宜的原核克隆載體包括來自於E.coli的質粒，例如colEl、pCRI、pBR322、pMB9、pKSM和RP4。原核載體也包括噬菌體DNA的衍生物例如M13和其他絲狀單鏈DNA噬菌體。優選用於克隆編碼VEGF受體的核酸的載體是杆狀病毒載體。含有要表達DNA的載體被轉染到適宜的宿主細胞中。宿主細胞被保持在適宜的培養基中，並置於細胞和載體複製的條件下。可從細胞回收載體。可從載體中回收要表達的DNA。要表達的DNA(如編碼抗體、抗體等效物或受體的DNA)可被插入到適宜的表達載體中並在適宜的原核或真核宿主細胞中進行表達。例如，插入宿主細胞的DNA可編碼VEGF受體的整個胞外部分，或VEGF受體的胞外部分的可溶性片段。由DNA編碼的VEGF受體的胞外部分可任選地在5』和/或3』端添加上附加胺基酸序列。附加胺基酸序列可添加在VEGF受體胞外區(例如前導序列)、VEGF受體的跨膜區和/或胞內區。附加胺基酸序列也可以是天然VEGF受體所未添加的序列。優選的，這種附加胺基酸序列發揮特定作用，以改善表達水平、分泌、可溶性或免疫原性。用於在細菌特別是E.coli中表達蛋白的載體是已知的(DieckmarmandTzagoloff,J.Biol.Chem.，2601513，1985)。這些載體含有編碼鄰氨基苯甲酸合成酶(TrpE)的DNA序列且之後在其羧基端有聚合接頭。其他的表達載體系統是基於β_半乳糖苷酶(ρΕΧ)、λPL、麥芽糖結合蛋白(pMAL)和穀胱甘肽S-轉移酶(pGST)(Gene,67:31，1988；PeptideResearch,3:167，1990)。用於在哺乳動物細胞中表達的適宜載體也是已知的。這種載體包括公知的SV-40衍生物、腺病毒、逆轉錄病毒衍生DNA序列和來自於功能性哺乳動物載體組合的改組載體，例如以上描述的那些，以及功能性質粒和噬菌體DNA。用於真核細胞表達的附加載體是本領域已知的(Southern，P.J.andBerg,P.，J.Mol.App1.Genet.，1327,1982；Subramanietal,Mol.Cell.Biol.，1854,1981；KaufinannandSharp,J.Mol.Biol.,159601,1982；KaufinannandSharp,Mol.Cell.Biol.，1982；Scahilletal.，PNAS，80:4654，1983；UrlaubandChasin,PNAS，77:4216，1980)。本發明可用的表達載體包含至少一個被操作連接到要表達的DNA序列或片段上的表達控制序列。控制序列被插入載體中以控制和調控克隆DNA序列的表達。可用的表達控制序列實例包括=Iac體系，trp體系，tac體系，trc體系，噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區，和fd包被蛋白的控制區，酵母的糖酵解啟動子(例如3-膦酸甘油酸酯激酶的啟動子)，酵母酸性磷酸酶的啟動子(例如Pho5)，酵母α配對因子的啟動子，來自於多瘤、腺病毒、逆轉錄病毒和猿猴病毒的啟動子(例如SV40的早期和晚期啟動子)，以及已知控制原核或真細胞及其病毒的基因表達的其他序列。含有控制信號和要表達的DNA(例如編碼抗體、抗體等效物或VEGF受體的DNA)的載體被插入到用於表達的宿主細胞中。一些可用的表達宿主細胞包括公知的原核和真核細胞。一些適宜的原核宿主包括例如E.coli，例如，E.coliSG-936、Ε.coliHB101、E.coliW3110、E.coliX1776、Ε.coliX2282、Ε.coliDHI、和E.coliMRCI；假單胞菌(Pseudomonas)；桿菌(Bacillus),如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；禾口鏈黴菌(Str印tomyces)。適宜的真核細胞包括酵母和其他真菌、昆蟲、動物細胞(例如COS細胞和CHO細胞)、以及組織培養的人類細胞和植物細胞。然後維持在適宜培養基的宿主細胞中進行表達，要表達的多肽或肽(例如抗體、抗體等效物或VEGF受體)可通過本領域已知的方法從培養基中分離和純化。如果多肽或肽未被分泌到培養基中，可在分離純化之前裂解宿主細胞。此外，本發明的抗體可通過以可溶性受體免疫哺乳動物而製備。可溶性受體本身可作為免疫原，或被附加到載體蛋白或其他目標如微球即瓊脂糖微球上。在哺乳動物產生抗體之後，分離產生抗體的細胞的混合物例如脾細胞。通過從混合物中分離單個產生抗體的細胞並將這些細胞與腫瘤細胞例如骨髓瘤細胞融合使其永生來製備單克隆抗體。製得的雜交瘤被保存在培養液中，並表達單克隆抗體，單克隆抗體可從培養基中收集獲得。還可由結合到表達特定感興趣受體的細胞的表面的受體製備抗體。受體結合的細胞可以是天然表達受體的細胞，例如VEGF的血管內皮細胞。可選地，受體結合的細胞可以是被編碼受體的DNA所轉染的細胞，例如3T3細胞，其被VEGFR所轉染。受體可用作免疫原以產生本發明的抗體。受體肽可從天然來源獲取，例如從表達受體的細胞中獲取。例如，VEGF受體肽可從血管內皮細胞中獲取。可選地，採用商業可供機械可製備合成的受體肽。在一個實施方式中，VEGF受體胺基酸序列可由公開文獻提供(Shibuyaetal.,Oncogene,5:519,1990；PCT/US92/01300；Termanetal.,Oncogene,61677，1991；Matthewsetal.，PNAS，889026,1991)。可選地，將編碼受體的DNA例如cDNA或其片段進行克隆和表達，並回收製得的多肽從而以其作為免疫原以產生本發明的抗體。例如，為了製備抗體所針對的VEGF受體，可採用例如以下所述的那些標準重組DNA技術將編碼本發明VEGF受體或其部分特別是其胞外部分的核酸分子插入到用於在宿主細胞表達的已知載體中。這些核酸分子的適宜來源包括表達VEGF受體的細胞，即血管內皮細胞。可在任意哺乳動物中製備抗體；除人之外的適宜哺乳動物包括例如兔，大鼠，小鼠，馬，山羊或靈長類。小鼠被頻繁用於製備單克隆抗體。抗體可以是以下免疫球蛋白類別中的一種成員IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及它們的亞型，並優選是IgGl抗體。本發明的抗體和其功能等效物可以是免疫球蛋白類別的任意成員或其組合。VEGF受體的VEGF活化的中和可在體外或體內在內皮或非內皮細胞的樣品例如腫瘤細胞中實施VEGF受體活化的中和。在表達VEGF受體的細胞樣品中VEGF受體的VEGF活的化中和包括以本發明的抗體接觸細胞。在細胞樣品中添加VEGF之前同時或之後，細胞在體外接觸抗體。在體內，通過給藥至哺乳動物將本發明的抗體與VEGF受體接觸。給藥至哺乳動物的方法包括例如口服，靜脈內，腹膜內，皮下，或肌肉內給藥。這種體內中和方法可用於抑制已知哺乳動物的血管生成。血管生成抑制是一種有效的治療方法，例如用於防止或抑制與病理狀態如腫瘤生長相關的血管生成。因此，本發明的抗體是抗血管生成和抗腫瘤的免疫治療劑。本發明所用的術語「哺乳動物」是指任意哺乳動物。哺乳動物的一些實例包括寵物動物，例如狗和貓；農場動物，例如豬、牛、綿羊和山羊；實驗室動物，例如小鼠和大鼠；靈長類，例如猴、猿和黑猩猩；和人。在一些非內皮細胞例如腫瘤細胞中發現VEGF受體，這表明在這些細胞中存在非預期的自分泌和/或旁分泌環。本發明的拮抗劑例如抗體可用於中和這些細胞中的VEGF受體活性，從而阻斷自分泌和/或旁分泌環，並抑制腫瘤生長。抑制血管生成和抑制病理狀態例如在哺乳動物中的腫瘤生長的方法包括給藥有效量的任意本發明拮抗劑(例如抗體，包括任意的功能等效物)至哺乳動物全身或直接至哺乳動物內的腫瘤。所述哺乳動物優選為人。這種方法可有效地治療患有實體腫瘤(優選高度脈管腫瘤)和非實體腫瘤的受試者。抑制或減少腫瘤生長包括防止或抑制腫瘤的發展，包括癌性和非癌性腫瘤。腫瘤的發展包括侵入，轉移，復發和腫瘤大小的增長。抑制或減少腫瘤生長也包括腫瘤的破除。通過本發明的方法可治療所有類型的腫瘤。腫瘤可以是實體或非實體的。可通過本發明拮抗劑治療的實體腫瘤的一些實例包括癌，肉瘤，胚細胞瘤或神經膠質瘤。這些腫瘤的一些實例包括表皮樣腫瘤，鱗片狀腫瘤(例如頭頸腫瘤)，結直腸腫瘤，前列腺腫瘤，乳腺腫瘤，肺腫瘤(包括小細胞和非小細胞肺腫瘤)，胰腺腫瘤，甲狀腺腫瘤，卵巢腫瘤，和肝腫瘤。其他實例包括=Kapos肉瘤、CNS瘤、成神經細胞瘤、毛細血管成血管細胞瘤、腦膜瘤和腦轉移瘤、黑色素瘤、胃腸道和腎的癌和肉瘤、橫紋肌肉瘤、成膠質細胞瘤(優選多形性成膠質細胞瘤)和平滑肌細胞瘤。本發明的拮抗劑有效的血管化皮膚癌的實例包括鱗片狀細胞癌、基底細胞癌和可通過壓制惡性角蛋白形成細胞例如人惡性角蛋白形成細胞生長而治療的皮膚癌。非實體腫瘤的一些實例包括白血病、多發性骨髓瘤和淋巴瘤。白血病的一些實例包括急性粒細胞白血病(AML)，慢性粒細胞白血病(CML)，急性淋巴白血病(ALL)，慢性淋巴白血病(CLL)，紅細胞白血病或單核細胞性白血病。淋巴瘤的一些實例包括與霍奇金病和非霍奇金病相關的淋巴瘤。防止或抑制血管生成也可用於治療特徵為過度血管生成的病症，例如新生血管性青光眼，包括增生性糖尿病視網膜病變在內的增殖性視網膜病，關節炎，黃斑變性，血管瘤，面部血管纖維瘤，和銀屑病。採用本發明的抗體以分離和純化VEGF受體採用常規方法例如親和層析法(Deanetal.，AffinityChromatographyAPracticalApproach,IRLPress，Arlington，VA，1985)，可利用本發明的拮抗劑分離和純化VEGF受體。本領域公知的其他方法包括以塗有抗體的磁珠進行的磁性分離，以附著在固體基質上的抗體進行的「淘篩」，和流式細胞計數法(FACS)。VEGF受體的來源通常是表達VEGF受體的脈管細胞，特別是脈管內皮細胞。脈管內皮細胞的適宜來源是血管，例如臍帶血細胞，特別是人臍帶血管內皮細胞(HUVEC)。VEGF受體可用作製備其他物質的起始物質，例如用於製備能識別並結合到VEGF受體上或VEGF表達細胞表面的其他抗原上的附加單克隆和多克隆抗體的抗原。採用本發明的抗體以分離和純化KDR陽性腫瘤細胞採用常規方法例如親和層析法(Deanetal.，AffinityChromatographyAPracticalApproach,IRLPress，Arlington，VA，1985)，可利用本發明的抗體分離和純化Flk-IKDR(VEGFR-2)陽性腫瘤細胞，即表達KDR的腫瘤細胞。本領域公知的其他方法包括以塗有抗體的磁珠進行的磁性分離，偶聯在抗體上的細胞毒素劑(例如互補物)，以附著在固體基質上的抗體進行的「淘篩」，和流式細胞計數法(FACS)。監測體外或體內VEGF和VEGF受體水平採用本領域已知的標準試驗和方法，利用本發明的抗體可在生物樣品中監測體外或體內VEGF或VEGF受體的水平。生物樣品的一些實例包括體液，例如血液。標準試驗包括例如標記抗體和實施標準免疫試驗，例如本領域公知的放射免疫試驗。執行本發明的標準重組DNA技術如文獻所述(Sambrooketal.，『『MolecularCloning,「第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1987；Ausubeletal,(Eds)"CurrentProtocolsinMolecularBiology,"GreenPublishingAssociates/ffiley-Interscience,NewYork,1990)。給藥為了治療，可將本發明受體抗體以足以防止、抑制或減緩腫瘤發展(例如腫瘤的生長、侵入、轉移和/或復發)的劑量給藥至患有腫瘤的患者。足以實現該目的的劑量被定義為有效治療劑量。能有效發揮該用途的量將取決於疾病的嚴重性和患者自身免疫系統的概況。也會依據疾病狀態和患者體質改變給藥方案，通常從單次丸劑劑量或持續輸注至每天多次給藥(例如每4-6小時)，或如治療醫生和患者狀態所指示的。然而應該注意的是本發明不限於任何特定劑量。本發明可用於治療任何適宜腫瘤，包括例如乳腺，心，肺，小腸，結腸，脾，腎，膀胱，頭頸，卵巢，前列腺，腦，胰腺，皮膚，骨骼，骨髓，血液，胸腺，子宮，睪丸，宮頸或肝的腫瘤。優選地，在腫瘤是結腸腫瘤或腫瘤是非小細胞肺癌(NSCLC)時採用本發明方法。而且，本發明的腫瘤優選具有VEGFR的異常表達或信號。在許多不同人類癌症中觀察到增強的VEGFR信號。由滲入神經膠質瘤的內皮細胞表達高水平VEGFR-2(Plateetal.，Nature,359:845，1992)。由人成神經膠質瘤產生的VEGF特異性地正調節VEGFR-2水平(Plateetal.，CancerRes.,53:5822，1993)。與內皮細胞相關的成膠質細胞瘤(GAEC)中高水平的VEGFR-2表達表明了在腫瘤形成期間可能誘導受體活性，因為在正常腦內皮細胞中幾乎檢測不到VEGFR-2轉錄物。這種正調節限於最接近腫瘤的血管內皮細胞。本發明可用於抑制或減緩腫瘤生長。抑制或減緩腫瘤生長表示防止、抑制或減緩腫瘤的發展，例如腫瘤的生長、侵入、轉移和/或復發。此外，本發明也可用於治療血管生成病狀，例如動脈粥樣硬化、關節炎、黃斑變性和銀屑病。鑑別具有本發明對症的病症的患者完全在本領域技術人員的能力和知識範圍之內。本發明中，任何適宜方法或途徑可用於給藥VEGFR抗體，例如口服、靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內給藥。拮抗劑的給藥劑量取決於許多因素，包括例如抗體類型、要治療腫瘤的類型和嚴重性、以及抗體給藥途徑。然而應該強調的是本發明不限於任何特定的給藥方法或途徑。在一個可選實施方式中，VEGFR拮抗劑可與一種或多種抗腫瘤藥組合給藥(US6，217，866)。可採用任何適宜的抗腫瘤藥例如化療劑或放療。化療劑的實例包括但不限於順鉬，鏈黴菌(doxorubicin)，紫杉醇，伊立替康(CPT-Il)，託波替康或其組合。當抗腫瘤藥是放療時，放射源可以是在待治療患者的體外(外放射治療-EBRT)或體內(近距離放射治療-BT)。抗腫瘤藥的給藥劑量取決於許多因素，包括例如藥劑類型、要治療腫瘤的類型和嚴重性、以及藥劑的給藥途徑。然而應該強調的是本發明不限於任何特定劑量。在一個附加的可選實施方式中，本發明的VEGFR抗體可與一種或多種適宜的佐劑例如細胞因子(例如IL-10和IL-13)或其他免疫刺激劑組合給藥。參見例如Larriveeetal.,supra.,然而應該認識到以有效治療方式僅給藥VEGFR拮抗劑就足以防止、抑制或減緩腫瘤的發展。此外，VEGFR抗體可作為配體偶聯物給藥，其特異性地結合到受體上並遞送毒性致命的有效載荷，之後配體_毒素被內化。為了開發過表達EGFR或VEGFR的腫瘤細胞的特異性毒劑並最小化非特異性毒性，設計了毒素和受體之間的偶聯物。例如，由EGF和假單胞菌內毒素(PE)組成的偶聯物在體外表現出對表達EGFR的HeLa細胞的毒性。包括硫利噠嗪和腺病毒在內的多種藥劑可增強細胞對偶聯物的吸收，以及增加偶聯物的細胞毒性。應理解的是，為預防和治療目的用在哺乳動物中的本發明的VEGFR抗體可以以額外含有藥物可接受載體的組合物形式給藥。適宜的藥物可接受載體包括例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽溶液、右旋糖、甘油、乙醇等以及它們的組合中的一種或多種。藥物可接受載體還可含有少量的輔助物質例如潤溼或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其增加了儲存期或結合蛋白的有效性。如本領域公知，可製劑化成用來注射的組合物以便提供在給藥至哺乳動物之後有效成分的快速、持續或延遲釋放。本發明的VEGFR抗體可以是多種形式。包括例如固體、半固體和液體劑型，例如片齊、丸劑、粉末、液態溶液、分散液或懸浮液、脂質體、栓劑、可注射溶液和可注入的溶液。優選形式取決於預期的給藥模式和治療用途。可按藥物領域公知的方式製備這種抗體。在組合物製備中，活性成分將通常與載體混合、或被載體稀釋和/或被吸附在載體內，其可以是例如膠囊、囊劑、紙或其他容器的形式。當載體作為稀釋劑時，其可以是固體、半固體或液態物質，其充當有效成分的媒介、賦形劑或介質。從而，組合物的形式可以是片劑，錠劑，囊劑，扁囊劑，酏劑，懸浮液，氣霧劑(作為固體或液體介質)，含有例如高達10%重量的活性化合物的軟膏，軟膠囊和硬膠囊，栓劑，注射液，懸浮液，無菌包裝粉末，以及局部貼劑。放射與VEGF受體拮抗劑組合使用的放射源可以在待治療患者的體外或體內。當放射源在患者體外，該治療被稱為外放射治療(EBRT)。當放射源在患者體內時，該治療稱為近距離放射治療(BT)。採用為此製造的標準設備例如AECL遠距離鈷治療機(Theratron)和瓦裡安醫用直線加速器(VarianClinac)，按照公知標準技術給藥射線。射線的劑量取決於本領域公知的許多因素。這些因素包括要治療的器官、在射線途徑中可能無意間受到負面影響的健康器官、患者對放射治療的耐受性、以及需要治療的機體面積。劑量通常在I-IOOGy之間，更具體在2-80Gy之間。已報導的一些劑量包括對脊髓的35Gy，對腎的15Gy，對肝的20Gy，和對前列腺的65-80Gy。然後應該強調的是本發明不限於任何特定劑量。由治療醫生根據給定情況下的特定因素包括以上提及的因素確定劑量。體外射線源和進入患者的點之間的距離可以是表示殺死靶細胞和最小化副作用之間達到的可接受平衡的任何距離。通常地，體外射線源至進入患者的點之間為70cm-100cmo近距離放射治療通常將射線源置入患者內。通常地，射線源置於離待治療組織大約0-3cm。已知的技術包括間質、腔內和表面近距離放射治療。放射性粒源(radioactiveseed)可被永久地或暫時地植入。已用於永久植入的一些典型放射性原子包括碘-125和氡。已用於暫時植入的一些典型放射性原子包括鐳、銫-137和銥-192。已用於近距離放射治療的一些其他放射性原子包括鋂-241和金-198。近距離放射治療中的射線劑量可同於以上所述外放射治療的。除了以上述提及的決定外放射治療劑量的因素之外，還要考慮所用放射性原子的特性以確定近距離放射治療的劑量。化療化療劑包括所有能有效抑制腫瘤生長的化合物。可通過多種方式完成化療劑的給藥，包括通過腸胃外和腸內途徑的全身給藥。在一個實施方式中，VEGF受體拮抗劑和化療劑以單獨分子被給藥。在另一實施方式中，例如通過偶聯將VEGF受體拮抗劑附加到化療劑上。化療劑的實例包括烷基化劑，例如氮芥、乙烯亞胺化合物和烷基磺酸鹽；抗代謝物，例如葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑，例如長春花生物鹼和鬼白毒素衍生物；細胞毒性抗生素；破壞或幹擾DNA表達的化合物。此外，化療劑包括本文所述的抗體、生物分子和小分子。化療劑或化療的特定實例包括順鉬、達卡巴嗪(DTIC)、更生黴素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、鏈脲菌素、環磷醯胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNE)、多柔比星(阿黴素)、柔紅黴素(daunorubicin)、丙卡巴胼(procarbazine)、絲裂黴素、阿糖胞苷(cytarabine)、依託泊苷(etoposide)、甲氨ifΠφ(methotrexate)>5-M^BtPS(5-fluorouraci1)>(vinblastine)>-lx#ifM(vincristine)、博來黴素(bleomycin)、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(泰素帝)、阿地白介%(aldesleukin)、^#酉先月安_(asparaginase)、白消安(busulfan)、+白(carboplatin)、克拉屈濱(cladribine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、氟脲苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、羥基脲、異環磷醯胺(ifosfamide)、幹擾素α、亮丙瑞林(Ieuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法侖(melphalan)、巰嘌呤(mercaptopurine)、普利黴素(plicamycin)、米託坦(mitotane)、培門冬酶(pegaspargase)、噴司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普利黴素(plicamycin)、鏈脲菌素、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、高內酯(testolactone)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)、長春瑞濱(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、泰素(taxol)、以及它們的組合。本發明還包括用於抑制腫瘤生長的試劑盒，該試劑盒含有有效治療劑量的EGFR拮抗劑和有效治療劑量的VEGFR拮抗劑。本發明的試劑盒的EGFR或VEGFR拮抗劑可以是任何適宜的拮抗劑，其實例如上所述。優選地，試劑盒的EGFR拮抗劑含有EGFR特異性的抗體或其功能等效物。可選地，且優選地，試劑盒的EGFR拮抗劑含有EGFR特異性的小分子。試劑盒的VEGFR拮抗劑含有VEGFR特異性的抗體或其功能等效物。可選地，試劑盒的VEGFR拮抗劑優選含有VEGFR特異性的小分子。此外，本發明的試劑盒還可含有抗腫瘤藥。本文描述了本發明的合適抗腫瘤藥的實例。本發明的試劑盒還可含有佐劑，其實例已如上所述。因此，本發明的受體抗體可在體內和體外用於研究、診斷、預防或治療方法中，其是本領域公知的。當然，可以理解和預期的是本領域技術人員可對本文公開的發明原理進行改變，這種修改應被包括在本發明範圍之內。實施例下文中將更具體地描述本發明。然而，應該理解的是這些實施例的目的僅在於示例性而不應解釋成限制本發明的範圍。實施例1分泌KDR-Fc的細胞系的構建從人胎盤cDNA文庫(Clonetech，USA)中擴增與KDR基因(GenBank的登錄號AF063658)的胞外域(ECDs)1_3對應的基因。採用分別具有BamHI和NheI消化位點的引物KDRIF(SEQIDNO21)和KDR3R(SEQIDNO22)進行擴增。SEQIDNO215'-CGCGGATCCATGGAGAGCAA-3『SEQIDNO225'-CCGCTAGCTTTTTCATGGACCCTGACA-3『為製備KDR(ECD1-3)-Fc嵌合蛋白，以BamHI和NheI消化由將BACE-Fc蛋白基因插入pcDNA3載體(Invitrogen，USA)中而構成的pcDNA3-BACE_Fc載體(韓國專利公開文本10-2005-0032177)，然後連接到以相同限制性內切酶消化的PCR片段上。採用引物ThFc-F(SEQIDNO23)和MycFc-R(SEQIDNO:24)通過PCR擴增Fc結構域以使其具有凝血酶消化位點和myc標籤，採用NheI和XhoI位點將擴增片段與載體連接，從而構建pcDNA3-KDRD123tFcm。SEQIDNO235'-CCGCTAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCGACAAAACTCAC-3『SEQIDNO245'-GGCTCGAGTCACAGGTCTTCCTCAGAGATCAGCTTCTGCTCTTACCCGGAGAC-3『pcDNA3-KDRD123tFcm由編碼含有人KDR的分泌信號序列和胞外域的胺基酸殘基1-327的鹼基序列、編碼凝血酶識別位點(SSGLVPRGS)的鹼基序列、編碼對應人免疫球蛋白G(hlgG)的Fc結構域的227個胺基酸的鹼基序列和編碼myc標籤的鹼基序列(EQKLISEEDL)構成(圖1)。為了抗體的表位定位，製備了KDR(ECDl-2)_Fc(胺基酸殘基1-222)和KDR(ECD2-3)-Fc(胺基酸殘基1-327(Δ24-116))。為了克隆KDR(ECD1-2)，採用弓|物KDRIF(5，-CGCGGATCCATGGAGAGCAA,SEQIDNO25)和引物KDR12R(5，_CTAGCTAGCCCTATACCCTACAACGACA_3，，SEQIDNO26)通過PCR對製得的序列進行擴增，然後將PCR擴增片段插入到以BamHI和NheI消化的pcDNA3_KDRD123tFcm中，從而製得pcDNA3_KDRD12tFcm。為克隆KDR(ECD2-3)，通過重疊PCR來擴增引物KDRIF和引物KDR23SR(SEQIDNO26)的PCR片段以及引物KDR23SF(SEQIDNO27)和引物KDR23R(SEQIDNO28)的PCR片段。採用BamHI和NheI位點將製得的PCR片段插入pcDNA3_KDRD123tFcm中，從而製得pcDNA3-KDRD23tFcm(圖2)。SEQIDNO265'-ACATAACCCACAGAGGCGGCCCGGGTCTCCA-3『SEQIDNO:27:5'-GACCCGGGCCGCCTCTGTGGGTTATGTTCAAGATTACAGA-3'SEQIDNO285'-CTAGCTAGCTTTTTCATGGACCCTGACA-3『為製備KDR(ECD)-Fc嵌合蛋白，將以上製得的pcDNA3_KDRD123tFcm載體轉染到CH0-DG44細胞中(Aprogen，Korea)，在含有10%dFBS(Gibco,USA)和500μg/mlG418(Geneticin；Sigma,USA)的α-MEM(GibCo，USA)中培養該細胞。為優化KDR(ECD)-Fc嵌合蛋白的表達，在存在MTX(甲氨蝶呤，Sigma)的CH0-SFM2培養基(Gibco)中培養該細胞，同時增加MTX的濃度。結果，確定蛋白在700nMMTX中有最佳表達。採用蛋白A親和層析(蛋白A-瓊脂糖，GEHealthcare)和體積排阻色譜(HiloadSuperdex200，GEHealthcare)對製備的蛋白進行純化並將其儲存在含有150mMNaCl的IOmM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)。圖3顯示了按照上述方法純化的KDR(E⑶1_3)-Fc的SDS-PAGE結果。^MM2MirMm^(魏)單鏈抗體(ScFv)卩策If體展示採用TRI試劑(Sigma)從五個健康骨髓供者身上獲取總RNA，基於總RNA，採用mRNA純化試劑盒(OligotexmRNA製備試劑盒，Qiagen，USA)純化mRNA。採用RT-PCR體系(ThermoScriptRT-PCR體系，Gibco_BRL，USA)處理mRNA以獲取cDNA。為獲得VH基因，採用表1所示的引物擴增V基因片段和DJ片段，採用在5』端和3』端具有SfiI限制性酶切位點的引物(SEQIDNOS29-61)通過二次PCR對每個擴增DNA片段進行擴增。表1用於擴增VH和DJ基因片段的引物序列tableseeoriginaldocumentpage21其中，R表示A或G;S表示C或G為獲得VL基因，採用每個用於\基因擴增的引物(表2)和用於K基因擴增的引物(表3)進行一次PCR，並採用在5』端和3』端具有BstXI消化位點的引物(入:SEQIDNOS.76-81；和k:SEQIDNOS.106-108)將每個擴增片段進行二次PCR。表2擴增入基因片段的引物序列tableseeoriginaldocumentpage22其中，K表示G或T;R表示A或G;Y表示T或C;W表示A或T表3擴增k基因片段的引物序列tableseeoriginaldocumentpage23其中，H表示A、C或T表示A或T為將VH基因片段和VL基因片段導入噬菌粒載體中，採用pAKlOO載體(Krebber，A.etal.，J.Immunol.Method.，201:35，1997)。為導入VL基因片段，採用快變位點特異性突變試劑盒(Stratagene，USA)突變pAKlOO載體的lac阻遏基因(lacl)中存在的三個BstXI結構域(236、365和488)。採用修飾的pAKlOO載體，為製備用於構建ScFv文庫的骨幹載體，將採用H05引物(SEQIDN029)和H230引物(SEQIDNO49)擴增的重鏈V基因和採用CDR3-3引物(SEQIDNO54)和JH-U1引物(SEQIDNO57)擴增的DJ基因片段，以H48SfiI(SEQIDNO58)/H47Sfil(SEQIDNO61)進行二次PCR，並以Sfil消化製得的重鏈可變區且將其連接到以相同酶消化的修飾PAK100載體中。為導入輕鏈和連接體，採用引物(正向:SEQIDNO109；和反向:SEQIDNO110)擴增重鏈區，採用每個引物(正向SEQIDNO111；和反向:SEQIDNO112)擴增人4-1BB抗體(LB506)(韓國專利公開文本2000-0034847)。採用Xbal/EcoRI將擴增片段插入具有導入的重鏈可變域的修飾pAKlOO載體，從而製得抗體文庫骨幹載體。SEQIDNO1095'-CGAATTTCTAGATAACGA-3『SEQIDNO1105『-CCTCCGCCACTACCTCCTCCTCCGAGGCCCCCGAGGCCTGA-3『SEQIDNO1115'-GGTAGTGGCGGAGGAGGCTCCGGTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCGATATTGTG-3『SEQIDNO1125』-CTCGAATTCCCACGAGGCTGGCTCCTCCACGTTTGATTTC-3』為導入輕鏈可變區，以BstXI消化每個擴增的輕鏈(k，入)可變區並將其插入抗體文庫骨幹載體中。以Sfil限制性內切酶消化製得的質粒並將其連接到之前以Sfil消化的重鏈可變區擴增PCR片段上。連接質粒被轉染到ElectroTen-Blue感受態細胞中(Stratagene,USA)。結果，從集落中收集了具有約1011多樣性的ScFv噬菌體文庫。實施例3牛物淘篩將實施例2中構建的文庫原液培養至對數生長期並以M13K07輔助噬菌體(GEhealthcare,USA)進行復壯。在2xYT培養基中(2xYT/C/K；含有34ug/ml氯黴素和70ug/ml卡那黴素並添加了ImMIPTG)30°C下將製得的文庫擴增過夜。以20%PEG6000/2.5MNaCl沉澱噬菌體原液並重懸在PBS中。將重懸的噬菌體原液在含有500yg/ml人Fc蛋白的2%脫脂乳/PBS溶液中37°C溫育1小時以去除表現出抗人Fc的噬菌體。作為抗原的KDR(人VEGFR-2)是含有KDR胞外域的IgG_樣結構域1、2和3的KDR(ECDl-3)-Fc。培養實施例1製備的KDR(ECD1_3)-Fc穩定細胞系，並從培養細胞系中純化KDR(ECDl-3)-Fc。首先以2%脫脂乳/PBS將塗有KDR(ECDl-3)_Fc(10iig/ml)的Maxisorp星號離心管(NuncDenmark)在室溫下封閉2小時，然後以5.4X1012pfu的噬菌體原液在室溫下孵育1小時。以PBST(含0.1%Tween20的PBS)將離心管洗滌10次，再以PBS洗滌10次。在室溫下以1ml的100mM新鮮三乙胺溶液將結合噬菌體洗脫10分鐘。將洗脫好的噬菌體與10ml對數中期XL1-藍細胞保留在一起，然後振蕩培養30分鐘。然後，將感染的XL1-藍細胞在含有葡萄糖的2xYT/C平板上30°C培養過夜。在一次淘篩之後，通過將KDR(ECDl-3)-Fc塗在96孔板(Nunc，USA)以替代Maxisorp離心管進行二次和三次淘篩程序。實施三次淘篩之後，通過VEGF競爭試驗分析獲得的噬菌體的KDR中和能力。對於VEGF競爭試驗，將以200ng的VEGF165(R&Dsystem)塗覆過夜的微板與2%脫脂乳/PBS在37°C反應2小時。以PBS洗滌微板，然後將由10ngKDR(ECD1_3)-Fc與不同量噬菌體在室溫下反應1小時獲得的混合物置於板的每個孔中並使其在室溫下反應2小時。以PBS清洗反應溶液，使其與兔抗KDR抗體(Reliatech，Germany)在37°C反應1小時，與HRP(辣根過氧化物酶)偶聯的羊抗兔抗體(Abcam，UK)在37°C反應1小時。反應完成之後，以TMB溶液(Sigma)顯色每個孔，然後測量在450nm處的吸光值(圖4)。結果，觀察到6A6、6H1、6G1和6C1都能抑制VEGF和KDR的結合，其中，6A6和6H1顯示出最高的中和VEGF能力。此外，6A6和6H1表現出具有類似於實施例4獲得的改造1C11(下文稱為1C11)噬菌體的結合親和力。6A6(TTAC-0001)ScFv的DNA序列、胺基酸序列和⑶R序列如圖5所示。此外，6A6(TTAC_0001)ScFv的鹼基序列和胺基酸序列表示為重鏈CDR1(SEQIDN0:113*SEQIDNO:114)、重鏈CDR2(SEQIDNO:115和SEQIDNO:116)、重鏈CDR3(SEQIDNO:117禾口SEQIDNO:118)、輕鏈CDR1(SEQIDNO:119禾口SEQIDNO:120)、輕鏈CDR2(SEQIDN0:121禾口SEQIDNO:122)、輕鏈CDR3(SEQIDN0:123禾口SEQIDN0:124)，重鏈可變區(SEQIDNO125和SEQIDNO20)、輕鏈可變區(SEQIDNO126和SEQIDNOl)、IgG重鏈區(SEQIDNO:127禾口SEQIDNO:128)、和IgG輕鏈區(SEQIDNO:129禾口SEQIDNO130)。實施例4改造IMC-1121(rIMC~1121)和IMC-1C11(rlMC-lCll)噬菌體載體的構建為獲得可用作陽性對照組的IMC-1C11ScFv(PCT/US2001/10504)和IMC-1121ScFv(PCT/US2002/006762)噬菌體顆粒(Imclone)，將每個抗體的ScFv區克隆到pAK載體中。對於IMC-1C11，採用從小鼠naAve抗體文庫(LGLifeSciences)中獲取的pTA-d9_07克隆(LGLifeSciences)作為模板克隆輕鏈可變基因。採用表4所示的LR和LF引物擴增克隆，以BstXI消化擴增的輕鏈可變基因並將其連接到以BstXI預處理的文庫骨幹載體上。採用表4所示的引物以pTA-A5N2-10克隆(LGLifeSciences)作為模板通過PCR擴增重鏈可變基因。採用每個引物對HF1-RI(A)、HF2-HR2(B)、HF3-HR3(C)和HF4-HR4(D)進行每個PCR反應之後，採用A_B(HF1-HR2引物組)和C_D(HF3-HR4引物對)通過重疊PCR擴增每個擴增片段，然後採用A-B-C-D(HF1-HR4引物對)通過重疊PCR進行擴增。然後以Sfil處理每個擴增片段並將其連接到以Sfil處理的含有1C11輕鏈基因的文庫骨幹載體上。表4顯示了噬菌體載體(pAK-rlcll)的PelB信號序列和琥珀(TGA)密碼子的DNA序列。表4:LR和LF引物tableseeoriginaldocumentpage26tableseeoriginaldocumentpage27tableseeoriginaldocumentpage28為獲得IMC-1121，以6G1作為模板克隆輕鏈可變區。採用引物對LF-KRl(A)、LF1-LR2(B)、LF2-LR3(C)和LF3-LR4(D)通過PCR擴增6G1模板，採用A-B(LF-LR2引物組)和C-D(LF2-LR引物對)通過重疊PCR進行擴增，然後採用A_B_C_D(LF-LR引物對)通過重疊PCR進行擴增。以BstXI處理獲得的PCR片段並將其插入文庫骨幹載體中(改造IMC-1121；下文稱為IMC-1121)。此處所用引物如表5所示。對於重鏈可變區，將從人naAvescFv文庫(實施例2)中獲得的克隆序列中具有最接近IMC-1121的序列的YGKL-136克隆作為模板。採用每個引物對HF-HRl(A)、HF1-HR2(B)和HF2-HR(C)通過PCR擴增YGKL-136克隆，然後進行A+B和C重疊PCR(HF_HR引物對)。以SfiI處理製備的PCR片段並將其連接到含輕鏈的文庫骨幹載體中。表5用於克隆輕鏈可變區的LF和HF引物formulaseeoriginaldocumentpage29GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCYGKL-136CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT144重鏈(模板)CACCTTCAGTAGCTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATACACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCACAGATGCTTTTGATATCTGGGGCCCCGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA6G1輕鏈GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAATTTGCAAACAGGGGTCCCGCCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATC145(模板)tableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30tableseeoriginaldocumentpage31實施例5可溶件ScFv的製備和純化為製備可溶性6A6ScFv,以EcoRI和XbaI消化具有pelB序列和ScFv序列的PAK-6A6以獲得具有pelB序列和ScFv序列的片段。採用相同的限制性內切酶將片段插入pET21b載體中(NoVagen，USA)。為了給插入具有pelB序列和ScFv序列的片段的載體添加myc標籤，採用引物(mycFor，SEQIDNO160；和mycRev，SEQIDNO161)通過PCR擴增作為模板的插入了PelB序列和ScFv序列的pET21b載體，並採用EcoRJ和XboI將該PCR片段連接到具有pelB序列和ScFv序列的載體中，從而構建pET21b-KDR6A6。SEQIDNO1605'-GAGCCAGCCTCGTGGAATTCGAACAAAAA-3『SEQIDNO:1615'-TGCTCGAGATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTGAATTCCACGAGGCT-3'對於動力學測量，按以下方式在myc標籤下遊的XboI位點插入V5標籤序列(GKPIPNPLLGLDST)。採用引物(V5-正向，SEQIDNO:162；和V5-反向，SEQIDNO163)通過PCR擴增製得的序列，所述引物擴增pET21b-KDR6A6的EcoRI和含V5標籤序列的XboI消化位點，以EcoRI和XboI消化擴增的片段並將其連接在以相同限制性內切酶消化的pET21b-KDR6A6,從而構建pETV-KDR6A6。將構建的pETV-KDR6A6轉化到E.coliBL21(DE3)中。SEQIDNO1625'-CCAGCCTCGTGGAATTCGAAC-3『SEQIDNO:163:5'-CCGCTCGAGGGTGGAGTCCAGACCTAATAGAGGGTTTGGGATCGGCTTTCCATTCAGATCCTCTTCTGA-3'培養被pETV-KDR6A6轉化的E.coliBL21(DE3)細胞以表達可溶性ScFv蛋白並離心，採用含有20%蔗糖和200iig/ml溶菌酶和蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Swiss)的50mMTris(pH8.0)溶液從細胞中收集胞質部分。採用Ni_NTI親和層析(Hispr印，GEHealthcare,USA)和離子交換色譜(Q-瓊脂糖，SP-瓊脂糖，GEHealthcare,USA)純化獲得的部分，從而獲得ScFv蛋白。對於6A6，採用含有20mM咪唑、0.4MNaCl和lxPBS的溶液平衡Hispr印柱，在柱內裝填胞質部分並以300mM含咪唑的溶液(300mM咪唑，0.4MNaCl/lxPBS)洗脫。將洗脫的蛋白在50mM咪唑(pH6.7)溶液進行透析，然後以陽離子交換色譜洗脫同時將NaCl的濃度增至0.5M。濃縮洗脫的蛋白(Centripr印YM10，Milipore，USA)，然後透析並儲存在PBS溶液中。圖6顯示了純化的6A6ScFv的SDS-PAGE結果。實施例6以VEGF的VEGF競爭試騎為了檢測分離的ScFv能否抑制KDR和VEGF的結合，實施了競爭試驗。為此，將20ng的VEGF165塗在96孔微孔板室溫過夜，然後使其與2%脫脂乳/PBS在37V反應2小時。反應完成之後，以PBS洗滌板，然後將由lOOng的Fc消化KDR(ECDl-3)與不同量ScFv在室溫下反應1小時獲得的混合物置於微孔板中並在室溫下反應2小時。反應完成之後，以PBS洗滌板，然後往其中添加抗KDR小鼠抗體(5ug/ml,Reliatech，Germany)並在37°C反應1小時。然後，往其中添加15000稀釋的HRP偶聯羊抗小鼠抗體(Abcam，UK)並反應1小時，然後添加TMB溶液進行反應。接著，測量每個板孔中細胞在450nm和650nm處的吸光值。圖7顯示了以實施例5中純化的抗KDR-ScFv的VEGF競爭試驗結果。如圖7所示，可以看出僅6A6-ScFv表現出中和KDR的有效能力。實施例7抗KDRScFv抗體的表位定位為了檢測哪些抗KDRScFv抗體結合到KJDR胞外域1_3中的哪個結構域中，將按照實施例1方法製備的3ug/ml每種KDR(ECDl-2)、KDR(ECD2_3)和KDR(ECD1-3)-Fc塗在96孔板上並在37°C反應2小時。反應完成之後，以PBS洗滌板，然後將未塗KDR蛋白的板部分以2%脫脂乳/PBS封閉。接著，再以PBS洗滌板，然後往其中添加330nM抗KDRScFv抗體並在37°C下反應1小時30分鐘。反應完成之後，再以PBS洗滌板，然後往其中添加1500稀釋的HRP偶聯兔抗6x組氨酸抗體(Abcam，UK)並在37°C下反應1小時。然後，以TMB溶液將每個孔中的細胞顯色並測定450nm處的吸光值。結果，可以觀察到6A6以與IMC-1121相同的方式結合到KDR的胞外域3上(圖8)。但是，6G1和6C1更牢固地結合到結構域1上，儘管吸光值很低。實施例8:IrG的表達和純化為表達完整形式的IgG，製備了各含有完整恆定區的重鏈和輕鍊表達載體。對於重鍊表達載體，以Sfil處理具有人4-lbb的重鏈骨幹的plgGHD載體(Aprogen，Korea)，然後將其與以Sfil處理pAK-ScFv重鏈可變區所獲得的片段連接，從而構建表達載體pIgGHD-6A6Hvy，其含有完整的恆定區和重鏈區(圖9)。對於輕鍊表達載體，以BstXI處理具有人4-lbb的輕鏈骨幹的plgGLD載體(Aprogen，Korea)，然後將其與以BstXI處理pAK-ScFv輕鏈可變區所獲得的片段連接，從而構建表達載體pIgGLD-6A6Lgt，其含有完整的恆定區和輕鏈區(圖10)。對於IMC-1C11和1121，按如上所述的相同方式構建IgG表達載體。對於IgG的表達，將相同量的重鍊表達載體(6A6克隆的pIgGHD-6A6Hvy)和輕鍊表達載體(6A6克隆的pIgGLD-6A6Lgt)共轉染至CHODG44細胞(Aprogen，Korea)。在含有10%dFBS和500iig/mlG418的a-MEM培養基中培養共轉染的細胞，然後選擇具有最高蛋白表達水平的克隆，同時往其中添加10nM-700nM濃度範圍的MTX。對於抗體的表達，在含有700nMMTX的CH0-SF2培養基中37°C培養細胞，並收集培養物。按照供應商的方案採用蛋白A柱(GEHealthcare,USA)通過親和層析從組合上清液中純化6A6-IgG。將上清液倒入以含有20mM磷酸鈉(pH7.0)和100mMNaCl的溶液平衡的蛋白A柱中並以含有20mM磷酸(pH7.0)UmMEDTA和500mMNaCl的溶液清洗。然後，以含有lOOmMNaCl的0.1M甘氨酸-HC1(pH3.3)溶液洗脫蛋白。以1MTris中和洗脫的蛋白。按11比例將洗脫蛋白與5mM磷酸鈉緩衝液(pH6.0)混合，然後倒入以含有50mMNaCl的5mM磷酸鈉(pH6.0)平衡的預裝SP-瓊脂糖柱(GEHealthcare)中。以含有50mMNaCl的磷酸鈉緩衝液(pH7.0)洗脫結合到柱上的蛋白並將其倒入以洗脫緩衝液平衡的預裝Q-瓊脂糖柱(GEHealthcare)中，收集未結合的蛋白。以30KdVivaspin20(Sartorius)濃縮收集的蛋白並以PBS透析。圖11顯示了按上述方法純化的6A6IgG蛋白的SDS-PAGE結果。實施例9以不同VEGFs的抗KDRIgG競爭試騎按採用VEGF165的實施例6進行的KDRScFv的VEGF競爭試驗相同的方式進行以VEGF的抗KDRIgG競爭試驗。結果，在抗IgGs之中，6A6IgG表現出最高的中和KDR的能力，類似於以ScFv進行的競爭試驗結果，這表明了KDR中和能力類似於在胺基酸序列基礎上改造的IMC-1121抗KDRIgG(圖12)。此外，為了檢測6A6IgG與同型和除VEGF165之外的VEGF族的結合和競爭，將各200ng的VEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E塗在96孔板，然後按與實施例6相同的方法進行競爭試驗。結果，6A6IgG通過與屬於VEGF-A的VEGF121、VEGF165和VEGF-E的結合顯示了VEGF中和能力，且它不與VEGF-C和VEGF-D結合(圖13)。實施例10抗KDRScFv和I甙結合親和力的分析以BIAcore(GEHealthcare)測量了抗體與KDR(VEGFR-2)的結合親和力。對於ScFv，按照供應商的手冊將KDR(ECDl-3)-Fc固定到CM5晶片(GEHealthcare，Sweden)上，對於V5-標籤ScFv，將V5抗體(Abchem，UK)固定到晶片上。將V5-標籤ScFv結合到固定有V5抗體的CM5晶片上，然後使無Fc的KDR(E⑶1-3)作用於晶片表面，從而獲得感應圖。對於IgG，如在沒有V5的ScFv情況下，將KDR(ECDl-3)-Fc固定到CM5晶片上，然後以不同量的抗體作用於晶片表面，從而獲得感應圖。根據每個濃度獲得的感應圖，測定動力學常數kon和k。ff，從動力學常數k。ff/k。n的比值計算Kd(表6)。結果，證實在不同ScFvs中，對KDR具有高親和結合力的ScFv是6A6。此外，當6A6被轉化成IgG的形式時，其Kd值大約比IMC-1121的低2倍。這表明了相對於IMC-1121，6A6IgG更牢固地結合到KDR上。表6抗KDRScFv的Kd(M)值，IgGtableseeoriginaldocumentpage34*N/A(不適用)實施例11利用FACS分析在HUVEC細胞中分析抗KDR_IgG的KDR中和能力將原始培養的HUVEC細胞在無血清的培養基中過夜培養以誘導KDR的過度表達，然後收集細胞，以PBS洗滌三次。將洗滌的細胞與6A6或IMC-lCllIgG(10iig/ml)在4°C反應1小時，然後與FITC標記的兔抗人IgG抗體(Abchem，UK)反應60分鐘。反應完成之後，洗滌細胞並以流式細胞計數儀(FACS；型號EPICS9，CoulterCorp.，USA)進行分析。結果，如圖14所示，IMC-1C11和6A6在相同水平識別HUVEC細胞的KDR。此外，為了檢測對VEGF的競爭抑制能力，將HUVEC細胞在無血清狀態下過夜培養以誘導KDR的表達，然後收集細胞並以PBS洗滌三次。將清洗的細胞與20ng/ml的VEGF在室溫下反應30分鐘。反應完成之後，將細胞與6A6-IgG和IMC-1C11IgG在4°C反應1小時，然後與FITC標記的兔抗人IgG抗體在4V反應30分鐘。結果如圖15所示，觀察到兩種抗體都表現出與VEGF165結合的信號，這表明6A6-IgG競爭性結合VEGF。此外，在VEGF競爭試驗中，6A6-IgG和IMC-1C11IgG表現出相同水平的KDR中和能力，但是在實際的活體細胞中6A6-IgG的KDR中和能力大約是IMC-1C11IgG的2倍。實施例12在K562細胞中抗KDR_IgG的KDR中和能力的分析為了在除了HUVEC細胞之外的KDR表達細胞系中檢測抗體的KDR結合親和力，在白血病細胞系K562(ATCCCCL-243)中分析了KDR的表達。圖16顯示了在K562(ATCCCCL-243)細胞中KDR表達的蛋白印跡分析結果。如圖16所示，不管是否存在血清，K562和HUVEC細胞都表達KDR。因此，按與實施例11對HUVEC細胞相同方式處理K562細胞(ATCCCCL-243)並通過FACS進行分析以檢測KDR-IgG是否能與K562細胞結合。結果，如圖17所示，不同於HUVEC細胞，6A6_IgG僅在顯著水平能與K562細胞結合。通過VEGF競爭的FACS試驗結果如圖18所示。如圖18所示，不同於HUVEC細胞，K562細胞在陽性細胞比率上未表現出大變化。儘管不清楚原因，但是考慮是因為6A6抗體牢固地結合在K562細胞表面表達的KDR上或利用VEGF/KDR(VEGFR-2)的自分泌環機制來調控細胞的生長，因而如果外部處理VEGF，可誘導K562細胞中的KDR表達，使得相對於外部處理VEGF之前在細胞表面表達增加量的KDR蛋白，且6A6-IgG信號增強。此外，如圖19所示，可看出6A6_IgG能結合到Gleevec-抗性的K562細胞(TheCatholicUniversityofKorea)的KDR上。實施例13:6A6抗體抑制HUVEC細胞增殖的分析採用WST-1試劑(Roche，Swiss)分析抗KDR-IgG對HUVEC細胞增殖的抑制。將HUVEC細胞按2xl04細胞/孔的濃度分散在塗有明膠的24孔培養板的孔中並培養18小時。然後，將細胞在無血清M199培養基(Sigma-aldrich，USA)中進一步培養4小時，然後往其中添加20ng/mlVEGF和不同濃度6A6。然後，按照供應商手冊將WST-1試劑加入其中，1小時和4小時之後，測量細胞在450nm和690nm處的吸光值(圖20)。結果，當以VEGF處理HUVEC細胞時，其增殖增加了三倍，而當將6A6抗體添加到HUVEC細胞中時，細胞的增殖以濃度依賴方式被降低。實施例14:6A6抗體對KDR抑制和ERK磷酸化的影響的分析將充分生長的HUVEC細胞在含1%FBS的M199培養基培養6小時，然後以不同濃度的VEGF和6A6、IMC-1121和6C1抗體處理10分鐘。然後，以1ml裂解緩衝液(20mMTris-HCl,pH8.0,2mMEDTA,137mMNaCl,ImMNa3V04,ImMPMSF，10%甘油，1%TritonX-100)裂解細胞並離心，且以1Pg/ml抗KDR/Flk-1抗體(SantacruzBiotechnology,USA)4°C處理上清液3小時。處理的上清液與蛋白A瓊脂糖微粒(Sigma-aldrich，USA)溫育1小時，將免疫沉澱的蛋白在SDS-PAGE上進行電泳，然後以蛋白印跡進行分析(圖21的A)。結果，觀察到當以VEGF處理細胞時，KDR的磷酸化如預期地增加，但以6A6或IMC-1121處理細胞時，由VEGF引起的KDR的磷酸化被抑制。此外，6C1抗體對VEGF的中和沒有影響。根據如上所述的方法，進行了試驗以檢測已知接收KDR信號的激酶ERK的磷酸化是否被抑制。結果，確認6A6和IMC-1121會抑制ERK磷酸化，但如預期地6C1基本不抑制ERK的磷酸化(圖21的B)。實施例15抗KDR-6A6IrG對由VEGF誘導的內皮細胞趨化性的抑制效應的分析為了檢測6A6-IgG對由VEGF誘導的HUVEC細胞遷移的抑制效應，採用了具有6.5mm直徑的聚碳酸酯過濾器(8yM孔徑)的培養小室(transwell)(Corningcostar,USA)。以10yg的明膠塗覆過濾器的下層表面，並將新鮮的M199培養基(含1%FBS)和VEGF置於過濾器的下層孔中。按lxl06/ml的濃度以M199培養基(含FBS)稀釋HUVEC細胞，並往其中添加不同濃度的抗KDR抗體且在室溫下反應30分鐘。將100yl的反應液置於上層孔中並在37°C反應4小時。然後，將細胞以蘇木精和伊紅染色。以棉球去除未遷移的細胞，而以顯微鏡觀察遷移至下層孔的細胞以測量遷移細胞的數量。結果，觀察到由VEGF誘導的HUVEC細胞的遷移被6A6抑制。實施例16抗KDR-6A6IrG對由VEGF誘導的微管形成的抑制效應的分析為了檢測6A6抗體是否抑制由VEGF誘導的HUVEC微管形成，將250u1生長因子減少的基質膠(CollaborativeBiomedicalProducts,USA)置於16mm直徑的組織培養板的孔中並在37°C聚合30分鐘。將HUVEC細胞懸浮在M199培養液中(含1%FBS)，並混合不同量的抗體使其與細胞反應。30分鐘之後，將細胞以2xl05細胞/孔的濃度塗在基質膠上，並往其中加入lOng/ml的VEGF，將細胞培養20小時。以顯微鏡觀察培養的細胞，以Image-Proplus(Mediacybernetics,USA)進行顯象。結果，觀察到6A6IgG抑制了由VEGF誘導的HUVEC微管形成(圖23)。實施例17由6A6與細胞表面KDR的結合抑制VEGF-KDR的內化將2xl04細胞/孔濃度的HUVEC細胞置於塗有明膠的蓋玻片上，24小時之後，將細胞以M199培養基洗滌兩次並在M199培養基(含FBS)中培育6小時。將HUVEC細胞與不同濃度的抗體反應30分鐘並與lOng/mlVEGF反應10分鐘。反應完成之後，以甲醇或20%甲醛將細胞固定和滲透10分鐘並以PBS洗滌。然後以0.TritonX-100和2%BSA/PBS將細胞封閉30分鐘，並將細胞與小鼠KDR抗體反應1小時，然後與FITC標記的抗小鼠抗體在室溫下反應45分鐘。以SloFade(MolecularProbe)包埋蓋玻片並以共焦顯微鏡(Zeiss，Germany)在488nm(激發波長)下進行觀察。結果，圖24顯示，觀察到6A6抗體抑制了KDR向細胞的滲透，而6G1基本不抑制KDR向細胞的滲透。實施例18杭KDR-IgG對血管牛成的抑制效應的離體分析為了檢測6A6-IgG是否抑制由VEGF誘導的主動脈環血管萌發，進行了主動脈環試驗。首先，從6周齡的大鼠(SpragueDawley)中分離動脈，然後切成約0.5mm的大小。將切好的動脈置於塗有120u1基質膠的48孔板中並以50u1基質膠覆蓋。將VEGF(10ng/ml)和6A6-IgG、6Cl-IgG和1121-IgG與人內皮無血清培養基(Invitrogen)各混合至終體積200iil，將混合物置於板孔中。6天之後，固定細胞並以Diff_Quick(BaxterDiagnostics)染色。按0(最低陽性)至5(最高陽性)的分數對數據進行評級，且進行了6次獨立試驗。圖25的A顯示了血管萌發的圖像，而圖25的B顯示了血管萌發分數的統計結果。6A6抗體抑制了由VEGF誘導的血管萌發，但6C1抗體未顯示出抑制能力。除了6A6抑制由VEGF誘導的血管生成的簡單事實之外，上述的離體大鼠主動脈環試驗結果具有非常重要的意義。即，結果揭示了6A6可與Flk-1結合以中和大鼠中表達的人KDR同系物Flk-1，儘管其是為中和人KDR的目的而製備。換言之，可以看出6A6抗體在人和大鼠之間具有交叉反應性。實施例19:6A6對抑制體內由VEGF誘導的血管生成的影響(體內小鼠基質膠塞入試驗)大鼠主動脈環試驗之後，進行了小鼠基質膠塞入試驗以檢測人KDR中和抗體6A6能否抑制小鼠體內由VEGF誘導的血管生成。為此，將0.6ml含有200iig抗體、lOOngVEGF和10單位肝磷脂的基質膠皮下注射到6-8周齡的小鼠中。7天之後，通過手術將基質膠塞入物取出，並對其進行照相(圖26的A)。然後，在OCT(最佳切割溫度)化合物的存在下在液氮中將塞入物快速冷凍並切成8-12um的厚度。以4%中性緩衝多聚甲醛將切好的塞入物固定，以抗CD31抗體測量微血管的密度(圖26的B)。觀察到6A6抗體可在小鼠體內抑制由VEGF誘導的血管形成。類同於大鼠離體實驗，再次證實6A6抗體可中和小鼠KDR同系物Flk-1並在人和小鼠之間具有交叉反應性。在治療抗體中，未公開過在人和小鼠之間具有交叉反應性的KDR抗體。若採用種交叉反應性的6A6抗體，可採用小鼠或大鼠確認抗體的體內作用。20=6A6抗體在結腸癌中言云力4勿It型中的抗痛效應採用已知相對於N0D/SCID小鼠具有更容易接受人癌細胞的優勢的刪除了T細胞、B細胞和NK細胞的N0D/SCIDIL-2R裸鼠(雌性，11周齡，重25g，TheJacksonLaboratories,USA)分析了6A6抗體在結腸癌異種移植動物模型中的抗癌效應。對於人癌細胞，採用了稱為HCT116(ATCC，USA)的人結腸癌細胞，在第0天按2xl05細胞(無血清DMEM)/10y1的濃度將細胞皮下注射到小鼠左側來實現腫瘤細胞的注射。從第1天(在注射腫瘤細胞的第0天起24小時)，每周三次將6A6抗體靜脈注射到小鼠中。將小鼠分成三組，每組由5個動物組成。組1是注射PBS組(對照組)，組2是注射100μg/ea(=4mg/kg)6A6抗體，而組3是注射200μg/ea(=8mg/kg)6A6抗體。以26天的間隔根據以下等式測量小鼠中出現的腫瘤大小腫瘤體積=l/2x(長χ面積χ高)在第30天，將小鼠處死，並測量腫瘤重量。結果觀察到相對於注射PBS的對照組，在以6A6抗體給藥的組內腫瘤大小依據劑量減小(圖27和圖28)。實施徹丨21:6A6杭體在肺癌異種移棺雲M勿1草型中的杭癌效應以7xl07細胞的濃度將人肺癌A549細胞(ATCC，USA)皮下注射到裸鼠中(JapanSL,Japan)以形成腫瘤。注射癌細胞10天之後，肉眼已經可觀察到腫瘤，然後每周三次將6A6抗體腹膜內注射到小鼠中。將小鼠分成三組，每組由5個動物組成。組1是注射PBS組(對照組)，組2注射lmg/kg6A6抗體，而組3注射lmg/kgof阿伐他汀(Genentech，USA)。結果如圖29所看到的，相對於注射PBS的對照組，在注射6A6抗體的組和注射阿伐他汀的陽性對照組中腫瘤的生長被抑制了。實施例22放射件碘標記的6A6抗體在體內的腫瘤靶向採用抗體和CML(慢性髓性白血病)K562細胞的結合親和力分析了6Α6抗體的腫瘤靶向作用。採用碘珠方法以放射性碘-125標記抗體，以用碘標記超過90%的抗體(圖30的Α)，製備了純度超過98%的以放射性碘標記的抗KDR(6Α6)抗體(圖30的B)。將Κ562細胞皮下注射到Balb/c裸鼠中以製備CML腫瘤模型，在注射K562細胞之後的21-28天當腫瘤大小達到Icm時，將碘-125標記的抗體(100μg)注射到K562腫瘤模型裸鼠的尾靜脈中。注射抗體2小時和24小時之後，獲得了體內形成腫瘤的動物的γ造影圖像。觀察到在2小時和24小時抗體導入腫瘤表現出相似的模式，24小時之後本底放射能下降。觀察到抗體定位於腫瘤，這表明了K562腫瘤表達了KDR。從而，由於抗體本身通過定位的治療效應，以及由於放射性同位素輻射的β射線引起的治療效應，該抗體可能用作一种放射免疫治療劑(圖31)。實施例23採用輕鏈改組的6Α6-Ι戒的親和力成熟為了鑑別親和力高於6Α6的抗體，按實施例2的操作，採用限制性內切酶SfiI從完整人抗體文庫DNA中移除重鏈。在移除重鏈的位點插入以SfiI限制性內切酶處理的ΡΑΚ-6Α6的重鏈。將製得的DNA轉化到ETB(ElectroTenblue)細胞中(Stratagene，USA)，並將細胞在SOB培養基上培養1小時。然後，將細胞塗布在2xYT(Cm)平板上，第二天收集菌落並儲存在_70°C。結果，構建了具有4xl06多樣性的6A6輕鏈改組文庫(圖32)。為了檢測是否成功構建輕鏈改組文庫，隨機挑選48個克隆，分析其輕鏈序列。結果，在48個克隆的輕鏈序列中不存在重疊。按與實施例3相同的方式通過噬菌體展示的生物淘篩程序從文庫中篩選具有高於6A6的結合親和力的克隆。通過以下程序最終獲得了18個候選者。(1)為了防止在生物淘篩程序中再選到6A6，以在6A6的⑶R3上具有識別位點的限制性內切酶SpeI處理6A6輕鏈改組文庫的DNA。DNA被轉化到ETB細胞之後，基於培養細胞構建子文庫，在ELISA中分析了子文庫的KDR親和力。在由第四輪淘篩獲得的候選者之中，按與實施例5相同的方式選擇了94個候選者並進行KDR結合試驗。在表現出陽性反應的候選者之中，隨機挑選四個候選者，測定其DNA序列。此外，採用各自的噬菌體對候選者進行VEGF競爭(圖33)。結果，選擇了具有類似等於陽性對照組6A6的KDR中和能力的4SD5、4SC3和4SC5。(2)在生物淘篩的清洗步驟中，通過與可溶性KDR的競爭選擇了KE3、KE6、2KG8、3KE11、3KF11、3KG3和K3F1。此處所採用的生物淘篩程序如下。以4mlKDR(5yg/ml)塗覆Maxisorp星號離心管(Nunc,Denmark)並以2%脫月旨乳/PBS在37°C封閉2小時。然後，將500μ1懸浮在2%脫脂乳中的6Α6輕鏈改組文庫噬菌體與KDR結合，然後在0.PBS-T(Tween20)中反應1小時。然後，以0.1%PBST將離心管洗滌10次並以PBS緩衝液洗滌10次。然後，添加4ml可溶性KDR(25μg/ml/PBS)並使其結合30分鐘，以IOOmM三乙胺處理離心管以洗脫噬菌體。洗脫的噬菌體以500μIlMTris-Cl(ρΗ7.5)中和並將其轉化到Ε.coliXLl-Blue細胞50分鐘，然後培養細胞。將在三個淘篩步驟中選擇的抗體在ScFv-噬菌體顆粒狀態下進行VEGF競爭試驗。在第一次淘篩中獲得的四個候選抗體之中，選擇了相對於其他候選抗體具有高VEGF競爭力的KE3和KE6，排除了KC7和KQll(圖34的A)。在第二次淘篩中獲得的三個候選抗體之中，排除了VEGE競爭力低的2KE5，而選擇了具有類似於6A6的VEGF競爭力的剩餘2KG4和2KG8。2KG4表現出與後面選擇的抗體3KG3相同的序列，從而其被3KG3所取代(圖34的B)。在第三次淘篩中獲得的五個候選抗體之中，排除了具有低競爭力的3KG2和3KF7，僅選擇了3KE11、3KF11和3KG3(圖34的C)。類似地，選擇了通過第三次淘篩獲得的K3F1，K3F1相對於6A6K3F1表現出相當高的VEGF競爭力(圖34的D)。(3)在生物淘篩程序的噬菌體和抗原KDR結合的步驟中，也添加了實施例8中獲得的IMC-1121IgG，結果，選擇了IE4、3IG11、3IG12、3IE1、3IH2、I2F2、I3A12和I3F2克隆。此處所採用的生物淘篩程序如下。以4mlKDR(5yg/ml)塗覆Maxisorp星號離心管(Nunc,Denmark)並以2%脫月旨乳/PBS在37°C封閉2小時。然後，將500μ1懸浮在含21μg/mlIMC_1121IgG(0.14μΜ)的2%脫脂乳中的6Α6輕鏈改組文庫噬菌體在其中結合1小時，然後在0.PBST中反應1小時。然後，以0.1%PBST將離心管洗滌10次並以PBS緩衝液洗滌10次。然後，在離心管中添加4ml可溶性KDR(25μg/ml/PBS)並使其結合30分鐘，以IOOmM三乙胺進行處理以洗脫噬菌體。洗脫的噬菌體以500μ1IMTris-Cl(ρΗ7.5)中和，然後將其轉化到Ε.coliXLl-Blue細胞50分鐘，然後培養細胞。將在三個淘篩步驟中選擇的抗體在ScFv-噬菌體顆粒狀態下進行VEGF競爭試驗。在第一次淘篩中獲得的三個候選抗體之中，僅選擇了具有類似於6A6的VEGF競爭力的IE4(圖35的A)。分析了IE4的DNA序列，結果，在IE4有28個胺基酸不同於6A6。此外，6A6具有108個輕鏈胺基酸，而IE4具有107個胺基酸，這表明了在6A6的CDR3中被刪除了一個胺基酸。圖35的B顯示了通過第三次淘篩獲得的三個候選抗體的VEGF競爭試驗結果。在DNA測序中，3IG8具有完全不同於6A6的輕鏈序列，在FACS結果中，3IG8不與活體細胞結合，表明了其不轉化成IgG的形式。選擇了3IG11、3IG12、3IE1和3IH2，並排除了3IA7，因為其在輕鏈序列中有一個終止密碼子。圖35的C顯示了通過第二次淘篩和第三次淘篩獲得的候選抗體的VEGF競爭試驗結果。選擇了全部的3IA12、I3F2和I2F2。18個被選克隆的輕鏈DNA序列如SEQIDNO164至SEQIDNO181所示，由DNA序列推斷的胺基酸序列如SEQIDNO:2至SEQIDNO19所示。表7顯示了相對於6A6輕鏈胺基酸(TTAC-0001)被取代的區域。此外，克隆被重命名為「TTAC-0002至TTAC-0019」(表8)。表7:18個被選克隆的突變位點tableseeoriginaldocumentpage39tableseeoriginaldocumentpage40表8開發的抗體的新名稱tableseeoriginaldocumentpage40開發的抗體的名稱新名稱開發的抗體的名稱新名稱SD5TTAC-0005I2F2TTAC-OO152KG8TTAC-0006I3A12TTAC-OO163KE11TTAC-0007I3F2TTAC-OO173KF11TTAC-00084SC3TTAC-OO183KG3TTAC-00094SC5TTAC-OO193IG11TTAC-OO10產業應用性如上具體所述的，本發明提供了完全人抗體，其具有優異的中和體內細胞中VEGF受體的能力，並且提供了含有所述抗體的抑制血管生成的組合物和治療癌症的組合物。相對於商業可供的針對血管內皮生長因子受體的抗體，本發明的6A6抗體在活體細胞中表現出優異的中和能力，並不僅在人而且在小鼠和大鼠中也表現出中和血管內皮生長因子受體的能力。因而，6A6抗體可用於抗癌研究並在癌症治療中高度有效。儘管參照特定特徵具體描述了本發明，但本領域技術人員顯然會認識到這樣的說明僅是優選的實施方式而不會限定本發明的範圍。從而本發明的實際範圍將由所附的權利要求和其等效物所確定。權利要求一種單鏈可變區片段分子，該單鏈可變區片段分子含有由SEQIDNOS1-19的任一胺基酸序列所表示的輕鏈可變區，並且具有中和血管內皮生長因子受體的功能。2.根據權利要求1所述的單鏈可變區片段分子，該單鏈可變區片段分子具有由SEQIDNO20的胺基酸序列所表示的重鏈可變區。3.一種編碼權利要求1或2所述的單鏈可變區片段分子的DNA。4.一種含有權利要求3所述的DNA的載體。5.重組細胞，該重組細胞轉化有權利要求4所述的載體。6.根據權利要求5所述的重組細胞，其中該細胞是細菌或動物細胞。7.一種抑制血管生成的組合物，該組合物含有權利要求1或2所述的單鏈可變區片段分子。8.一種治療癌症的組合物，該組合物含有權利要求1或2所述的單鏈可變區片段分子。9.一種IgG，該IgG含有由SEQIDN0S1-19的任一胺基酸序列所表示的輕鏈可變區，並且具有中和血管內皮生長因子受體的功能。10.根據權利要求9所述的IgG，該IgG具有由SEQIDNO20的胺基酸序列所表示的重鏈可變區。11.一種抑制血管生成的組合物，該組合物含有權利要求9或10所述的IgG。12.—種治療癌症的組合物，該組合物含有權利要求9或10所述的IgG。全文摘要本發明涉及中和血管內皮生長因子受體的人單克隆抗體及其用途。具體而言，本發明涉及中和血管內皮生長因子受體的人ScFv分子、以及含有該人ScFv分子的抑制血管生成的組合物和治療癌症的組合物。相對於商業可供的針對血管內皮生長因子受體的抗體，所公開的中和血管內皮生長因子受體的單克隆抗體在活體細胞中表現出優異的中和能力，並不僅在人而且在小鼠和大鼠中也表現出中和血管內皮生長因子受體的能力。因而，單克隆抗體可用於抗癌研究並在癌症治療中高度有效。文檔編號C07K16/00GK101802003SQ200780053244公開日2010年8月11日申請日期2007年6月26日優先權日2007年6月13日發明者全在元,姜貞恩,尹採玉,張賢淑,樸美熙,樸英宇,權英根,李東憲,李東燮,李俊哲,李元燮,柳珍山,柳賢美,沈相烈,片寶貞,羅根配,薛衫淑,趙頭賢,金世美,金聖祐,金渡倫,金藍珠,金貴和,高尚錫申請人:韓國生命工學研究院