抗cxcl13抗體和抗cxcr5抗體在惡性腫瘤的治療或檢測中的用途

2023-06-09 10:13:51 2

抗cxcl13抗體和抗cxcr5抗體在惡性腫瘤的治療或檢測中的用途
【專利摘要】公開了抗CXCL13和抗CXCR5抗體在個體的治療或檢測中的用途。
【專利說明】抗CXCL13抗體和抗CXCR5抗體在惡性腫瘤的治療或檢測中
的用途
[0001]本申請要求於2011年9月29日提交的美國專利申請號13/248，904的優先權，其為2011年9月15日提交的專利申請號13/233，769的部分繼續申請，而後述申請又為2010年12月14日提交的專利申請12/967,273的部分繼續申請。本申請也要求於2011年12月6日提交的美國專利申請號13/312,343的優先權，其為2010年12月14日提交的專利申請12/967，273的部分繼續申請。
發明領域
[0002]本申請大體涉及惡性腫瘤領域。具體而言，本申請涉及使用抗趨化因子抗體和/或抗趨化因子受體抗體來檢測或治療惡性腫瘤的方法。
[0003]發明背景
[0004]在美國，惡性腫瘤是死亡的首要原因之一。大多惡性腫瘤僅開始於單個的腫瘤細胞。腫瘤細胞增殖從而形成了局部「腫瘤」。腫瘤僅表示膨脹物(swelling);其不一定是惡性的。僅在其位置或起源處生長並且不能向遠處傳播的腫瘤是良性腫瘤，而不是惡性腫瘤。但是，具有傳播能力的腫瘤(無論其是否實際傳播)被稱為惡性腫瘤。惡性腫瘤可以通過血液或淋巴系統傳播至局部淋巴結並通過稱為轉移的過程傳播至遠處位點。轉移的惡性腫瘤更難以治療，因為它已擴散到很多不同的組織和器官中。已證實，在很多類型的惡性腫瘤中(如乳腺癌、結腸癌、卵巢癌和前列腺癌)，早期治療能提高存活率。
[0005]趨化因子是小的細胞因子樣蛋白的超家族，其具有水解抗性、能促進新血管形成或內皮細胞生長抑制、誘導細胞骨架重排、使淋巴細胞活化或失活以及通過與G蛋白偶聯受體的相互作用來介導趨化性。趨化因子可以介導表達其受體的宿主細胞的生長和遷移。
[0006]CXCL13是屬於CXC趨化因子家族的小細胞因子。正如其名稱所示，該趨化因子對同時屬於B-1和B-2亞類的B細胞選擇性地趨化，並通過與趨化因子受體CXCR5的相互作用來發揮其作用。CXCL13和CXCR5控制淋巴組織的囊泡中B細胞的組織結構。CXCR5在人的肝、脾、淋巴結和腸中高表達。CXCR5在B細胞遷移中發揮重要作用。
[0007]在T淋巴細胞中，CXCL13表達可以反映出T細胞的生發中心起源。因此，T細胞淋巴瘤(如血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤)中CXCL13的表達被認為可以反映出腫瘤T細胞的生發中心起源。
[0008]發明概述
[0009]本發明的一個方面涉及治療個體中的黑素瘤、肉瘤、胚細胞瘤、癌、淋巴瘤、骨髓瘤或白血病的方法。在一個實施方式中，所述方法包括以下步驟:對個體給予治療有效量的抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白質、肽或編碼基因)來免疫個體，從而誘導能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:對個體給予能在所述個體中表達抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合的表達載體。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:對個體給予有效量的表達載體，該表達載體表達(I)能夠抑制CXCL13和/或CXCR5的表達的物質，(2)能夠抑制CXCL13和CXCR5之間相互作用的物質，或者(3)能夠抑制CXCL13和/或CXCR5生物活性的物質。
[0010]本申請的另一方面涉及防止或抑制在個體中具有升高表達的CXCL13和/或CXCR5的惡性腫瘤細胞的遷移或轉移的方法。在一個實施方式中，所述方法包括以下步驟:對個體給予治療有效量的抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體或它們的組合。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白質、肽或編碼基因)來免疫個體，從而誘導能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:對個體給予在所述個體中能表達抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合的表達載體。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:對個體給予有效量的表達載體，該表達載體表達(I)能夠抑制CXCL13和/或CXCR5的表達的物質，(2)能夠抑制CXCL13和CXCR5之間相互作用的物質，或者(3)能夠抑制CXCL13和/或CXCR5生物活性的物質。
[0011]本申請的另一方面涉及治療個體中惡性腫瘤的方法。所述方法包括以下步驟:檢測來自所述個體的生物樣本中CXCL13和/或CXCR5的表達水平，並且如果在所述生物樣本中檢測到CXCL13和/或CXCR5的表達水平升高，則對患者給予(I)治療有效量的抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體，或者(2)在所述個體中能表達抗CXCL13抗體，或抗CXCR5抗體，或它們的組合的表達載體。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:檢測來自所述個體的生物樣本中CXCL13和/或CXCR5的表達水平，並且如果在所述生物樣本中檢測到CXCL13和/或CXCR5的表達水平升高，則用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原來免疫個體，從而引發能抑制CXCL13和/或CXCR5生物活性的抗體應答。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:檢測來自所述個體的生物樣本中CXCL13和/或CXCR5的表達水平，並且如果在所述生物樣本中檢測到CXCL13和/或CXCR5的表達水平升高，則對個體給予有效量的表達載體，該表達載體表達(I)能夠抑制CXCL13和/或CXCR5的表達的物質，或者(2)能夠抑制CXCL13和CXCR5之間相互作用的物質，或者(3)能夠抑制CXCL13和/或CXCR5生物活性的物質。
[0012]本申請的另一方面涉及增強化療效果的方法。所述方法包括對進行惡性腫瘤化療的個體給予有效量的抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白質、肽或編碼基因)來免疫進行惡性腫瘤化療的個體，從而誘導能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:對進行惡性腫瘤化療的個體給予能表達抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合的表達載體。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:對個體給予有效量的表達載體，該表達載體表達(I)能夠抑制CXCL13和/或CXCR5的表達的物質，(2)能夠抑制CXCL13和CXCR5之間相互作用的物質，或者(3)能夠抑制CXCL13和/或CXCR5生物活性的物質。
[0013]本申請的另一方面涉及治療個體中惡性腫瘤的方法，所述方法通過用有效量的CXCL13和CXCR5免疫原中的一種或多種和有效量的CXCL16和CXCR6免疫原中的一種或多種來免疫個體，其中所述惡性腫瘤是黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚細胞瘤或癌。
[0014]本申請的另一方面涉及治療個體中惡性腫瘤的方法，所述方法通過用有效量的CXCL16免疫原和/或CXCR6免疫原來免疫個體，從而誘導能抑制CXCL16和/或CXCR6生物活性的抗體，其中所述惡性腫瘤為黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚細胞瘤或癌，其中所述CXCL16免疫原為包括一個或多個選自以下的序列的肽:AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ ID NO: 87), SQASEGASSDIHTPAQ (SEQ IDNO:88), STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:89), SffSVCGGNKDPffVQEL(SEQ ID NO:90)、GPTARTSATVPVLCLL(SEQ ID NO:91)、SGIVAHQKHLLPTSPP(SEQ ID NO:92)、RLRKHL(SEQ IDNO:93)、LQSTQRP(SEQ ID NO:94)、SSDKELTRPNETT(SEQ ID NO:95)、AGENQKQPEKNA(SEQ IDNO:96)、NEGSVT(SEQ ID NO:97)、ISSDSPPSV(SEQ ID NO:98), CGGNKDPff (SEQ ID NO:99),LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:100)、 STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ IDNO: 101), SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA(SEQ ID NO: 102), TGSCYCGKR(SEQ ID NO: 103)、DSPPSVQ(SEQ ID NO: 104), RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSffSVCGG(SEQ ID NO: 105)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ ID NO: 106)、SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ ID NO:107)、RPTLPVGSL(SEQ ID NO: 108)、TAGHSLMG(SEQ ID NO: 109)、GKRISSDSPPSVQ(SEQ ID NO: 110)和 KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ ID NO: 111)，並且其中所述 CXCR6 免疫原為包括一個或多個選自以下的序列的肽:HQDFLQFSKV(SEQ ID NO: 112)、AGIHEffVFGQVMCK(SEQID NO: 113), PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI (SEQ ID NO: 114)和 YYAMTSFHYHMVTEA(SEQ IDNO:115)。
[0015]本申請的另一方面涉及在個體中檢測惡性腫瘤。所述方法包括檢測獲自個體的生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平；以及將生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平與一種或多種惡性腫瘤標誌物的正常表達水平相比較，其中生物樣本中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的高於正常的表達水平表示個體中存在惡性腫瘤，其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的正常表達水平為預定值，或者獲自與所述生物樣本具有相同來源或類型的已知正常非癌性細胞的對照樣本，其中所述惡性腫瘤為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤，並且其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物包括CXCL13、或 CXCR5、或者 CXCL13 和 CXCR5。
[0016]本申請的另一方面涉及評價患惡性腫瘤個體的預後的方法。所述方法包括測定來自個體的生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平，以及將所述生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平與所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的對照表達水平相比較，其中如果所述生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平高於對照水平，則表示所述個體的預後不良，並且如果所述生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平低於或近似於對照水平，則表示所述個體的預後良好，其中預後不良表明惡性腫瘤為攻擊型或侵襲型，其中所述惡性腫瘤為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤，並且其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。
[0017]本申請的另一方面涉及監測個體中惡性腫瘤治療過程的方法。所述方法包括在治療期間或治療後，測定獲自個體的一個或多個生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平，以及將所述一個或多個生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平與所述惡性腫瘤標誌物的對照表達水平相比較，其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的對照水平為個體中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的治療前水平或預設的參考水平，其中如果所述一個或多個生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物近似於或低於對照水平，則認為所述治療是有效的，所述惡性腫瘤為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤，並且其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。
[0018]本申請的另一方面涉及用於檢測惡性腫瘤或監測惡性腫瘤發展的試劑盒。所述試劑盒包括用於測定生物樣本中CXCL13和/或CXCR5表達的試劑；和使用所述試劑的說明，其中所述試劑包括抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體或兩者。
[0019]附圖簡述
[0020]圖1A-B示出了前列腺癌(PCa)細胞系的D0CK2表達。
[0021]圖2示出了 CXCL13-CXCR5相互作用促進LNCaP和PC3細胞侵襲，而不依賴於D0CK2。
[0022]圖3示出了 CXCL13調節Akt和ERK1/2活化。
[0023]圖4示出了 CXCL13通過D0CK2誘導PC3細胞中的JNK活化。
[0024]圖5示出了 CXCL13通過JNK和D0CK2調節PCa細胞增殖。
[0025]圖6示出了 JNK抑制和D0CK2敲低導致並非由於凋亡引起的細胞死亡的PCa細胞增殖降低。
[0026]圖7示出了 CXCL13調節PCa細胞系中的信號轉導級聯。
[0027]圖8A-C示出了前列腺癌細胞系的G蛋白的α亞基同種型的表達。
[0028]圖9Α-Β示出了前列腺癌細胞系的G蛋白β和Y亞基同種型的表達。
[0029]圖10A-D示出了經過或不經過CXCL13處理的前列腺癌細胞系中CXCR5和相關G蛋白的表達。
[0030]圖1lA-B描述了通過免疫沉澱確認Gq/11和Gai2蛋白與CXCR5相關。
[0031]圖12A-C示出了在CXCL13刺激後與Gal3偶聯的CXCR4和CXCR5的鑑定。
[0032]圖13描述了前列腺癌細胞中CXCR5相互作用的假設模型。
[0033]圖14描述了 CXCL13如何調節參與細胞周期的關鍵分子。
[0034]圖15描述了 CXCL13如何調節參與細胞遷移的關鍵分子。
[0035]圖16描述了 CXCL13如何調節參與細胞存活和生長的關鍵分子。
[0036]圖17描述了 PC3細胞中CXCL13調節的最經典途徑。
[0037]圖18示出了 CXCL13介導屬於PI3K/Akt和SAPK/JNK信號通路的蛋白的差異磷酸化。
[0038]圖19是由CXCL13-CXCR5相互作用調節的信號通路的總結圖。
[0039]圖20示出了主要的CXCL13-CXCR5細胞信號轉導級聯的確認。
[0040]圖21示出了 AKT活化所需的CXCL13-CXCR5信號轉導事件。
[0041]圖22A-B描述了 CXCL13介導的CXCR5連接和向胞核的轉移。
[0042]圖23A-B示出了抗CXCL13抗體治療抑制了前列腺癌的發展和骨轉移。
[0043]圖24A-B示出了對CXCL13的阻斷抑制骨中前列腺腫瘤的生長。
[0044]圖25A-B示出了對CXCL13的阻斷消除骨中溶骨性前列腺腫瘤的生長。
[0045]圖26A-B示出了對CXCL13的阻斷抑制了由前列腺癌細胞骨轉移引起的骨礦物質密度(BMD)的損失。
[0046]圖27描述了正常健康對照和肺癌個體的血清中的CXCL13水平。
[0047]圖28示出了非腫瘤性肺和肺癌組織的CXCR5表達。
[0048]圖29示出了非腫瘤性乳房和乳腺癌組織的CXCR5表達。[0049]圖30描述了相對於非腫瘤性對照，結腸癌組織的CXCR5和CXCL13表達。
[0050]圖31描述了相對於非腫瘤性對照，卵巢癌組織的CXCR5和CXCL13表達。
[0051]發明詳述
[0052]以下所示的詳細描述是為了使本領域技術人員能夠實施和使用本發明。出於解釋的目的，對具體術語進行闡述以全面理解本發明。然而，本領域技術人員將明了的是這些具體細節在實踐本發明時不是必需的。對具體應用的描述僅作為代表性實例而提供。本發明並不意圖被局限於所示的實施方式中，而應按照符合本文所公開的原理和特徵的最寬的範圍。
[0053]除非另有定義，本申請中所使用的科學和技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。而且，除非上下文另有要求，單數形式的術語應包括複數形式，而且複數形式的術語應包括單數形式。
[0054]定義
[0055]本文所用的以下術語應當具有以下含義:
[0056]本文所用術語「治療(treat)」、「治療(treating)」或「治療(treatment)」指減輕或消除病症和/或其伴隨的症狀的方法。本文所用術語「預防(prevent)」、「預防(preventing)」或「預防(prevention)」指阻止個體患病症和/或其伴隨的症狀的方法。在某些實施方式中，術語「預防(prevent)」、「預防(preventing)」或「預防(prevention)」是指降低患病症和/或其伴隨的症狀的風險的方法。
[0057]本文所用術語「抗體」指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，包含能特異性結合抗原(與抗原發生免疫反應)的抗原結合位點的分子。術語「抗體」以最寬的含義使用，並具體涵蓋了單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們能表現出所期望的生物活性。「特異性結合」或「發生免疫反應」指抗體與所期望的抗原的一個或多個抗原決定簇反應而不與其他多肽反應(即結合)或與其他多肽結合的親和力非常低。術語「抗體」也包括抗體片段，其包含全長抗體的一部分，通常為全長抗體的抗原結合或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab』、F(ab』)2和Fv片段，雙鏈抗體，線性抗體，單鏈抗體(scFv)分子，和由抗體片段形成的多特異性抗體。在本發明的一些實施方式中，使用抗體片段而非完整的抗體是可取的，例如為了提高腫瘤穿透性。該情況中，使用為提高血清半衰期而通過本領域已知的任何方式修飾的抗體片段是可取的。
[0058]本文所用術語「單克隆抗體」指由基本同質的抗體群體獲得的抗體，S卩，除了可能在少量個體中存在自然發生的突變以外，組成群體的各個抗體是相同的。本文所述單克隆抗體特別包括「嵌合」抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來源於具體物種或屬於具體抗體類或亞類的抗體中的對應序列相同或同源，而重鏈和/或輕鏈的餘下部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類或亞類的抗體中的對應序列相同或同源，並且還包括這樣的抗體的片段，只要它們能表現出所期望的生物學活性(美國專利號4，816，567;和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855(1984))。
[0059]非人抗體的「人源化」形式為包含來源於非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。大多數情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受體抗體)，其中來自接受體抗體的高變區的殘基被來自具有所期望的特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)的高變區的殘基代替，所述非人物種如小鼠、大鼠、兔子或非人類靈長類動物。製造人源化和其他嵌合抗體的方法在本領域中是已知的。
[0060]「雙特異性抗體」是對至少兩種不同的抗原具有結合特異性的抗體。在本發明的情況下，結合特異性之一是針對CXCL16或CXCR6。第二結合靶標是任意其他抗原，並且有利地是細胞表面蛋白或受體或受體亞基。製造雙特異性抗體的方法在本領域中是已知的。
[0061]「異綴合抗體(heteroconjugate antibody)」的使用也在本發明的範圍內。異綴合抗體是由兩種共價結合的抗體組成。例如，這樣的抗體已被提出用於將免疫系統細胞靶向於不希望的細胞(美國專利號4，676，980)。考慮到可以使用蛋白質合成化學中已知的方法在體外製備所述抗體，包括涉及交聯劑的方法。
[0062]「異綴合抗體(heteroconjugate antibody)」的使用也在本發明的範圍內。異綴合抗體是由兩種共價結合的抗體組成。例如，這樣的抗體已被提出用於將免疫系統細胞靶向於不希望的細胞(美國專利號4，676，980)。考慮到可以使用蛋白質合成化學中已知的方法在體外製備所述抗體，包括涉及交聯劑的方法。
[0063]本發明也考慮到使用「免疫綴合物」，其包含與細胞毒性劑(如毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性綴合物))綴合的抗體。可以使用的酶促活性毒素和其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、夕卜毒素A鏈(來自綠膿假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、a-八疊球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(PAP1、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚黴素、依諾黴素和單端孢黴烯。多种放射性核素可用於製備放射綴合抗體。實例包括212B1、1311、131In、90Y和186Re0
[0064]在藥理學方面，本發明上下文中，「治療有效量」的抗體指在抗體能有效治療的病症的預防或治療中的有效量。「病症」是會從抗體治療中獲益的任何疾病狀態，包括癌和化學抗性。其包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳動物偏向於關注的病症的病理狀態。
[0065]本文所用術語「腫瘤」指由異常細胞生長形成的贅生物或實體病變。腫瘤可以是良性的、惡變前的或惡性的。
[0066]「原發性腫瘤」是在個體中最初位點存在的腫瘤，可以與「轉移性腫瘤」相區別，轉移性腫瘤存在於個體中距原發性腫瘤的遠距離部位。
[0067]本文所用術語「惡性腫瘤」是指或描述哺乳動物的生理條件，其典型的特徵在於不受調控的細胞生長。示例性惡性腫瘤包括:癌、黑素瘤肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細胞瘤和胚細胞瘤。惡性腫瘤的更多具體實例包括:鱗狀細胞癌(例如，鱗狀上皮細胞癌)，包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌的肺癌，腹膜癌，肝細胞癌，包括胃腸癌的胃癌，胰腺癌，成膠質細胞瘤，子宮頸癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，尿路癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結腸癌，直腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌(h印atic carcinoma)，肛門癌，陰莖癌，黑素瘤，多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤，腦癌及頭頸癌以及相關轉移灶。
[0068]本文所用術語「癌」指由變異的上皮細胞或具有未知的組織學發生、但具有與上皮細胞有關的特定分子學或組織學特徵(如產生細胞角蛋白或細胞間橋)的變異細胞組成的侵襲性惡性腫瘤。本申請的示例性癌包括卵巢癌、陰道癌、子宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌、胰島瘤、腺癌、腺鱗癌、神經內分泌腫瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、腦癌、成神經管細胞瘤、神經外胚層瘤、膠質瘤、垂體癌和骨癌。
[0069]本文所用術語「淋巴瘤」指免疫系統的淋巴細胞的惡性腫瘤。淋巴瘤通常以實體瘤存在。示例性淋巴瘤包括:小淋巴細胞性淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤、原發性巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、脾邊緣區淋巴瘤、楽;細胞瘤、結外邊緣區B細胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、結內邊緣區B細胞淋巴瘤(NMZL )、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞性淋巴瘤、經典霍奇金淋巴瘤、結節性淋巴細胞為主型霍奇金淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤、結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤、腸病型T細胞淋巴瘤、肝脾T細胞淋巴瘤、母細胞NK細胞淋巴瘤、蕈樣真菌病、賽謝症候群、原發性皮膚CD30陽性T細胞淋巴增生病、原發性皮膚間變性大細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、非特指型外周T細胞淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤。經典霍奇金淋巴瘤的示例性形式包括:結節性硬化型、混合細胞型、淋巴細胞富集型和淋巴細胞消減型或非消減型。
[0070]本文所用術語「肉瘤」為來自由胚胎中胚層發育的多種組織之一中的變異細胞的惡性腫瘤。因此，肉瘤包括骨、軟骨、脂肪、肌肉、血管和造血組織的腫瘤。例如，來自骨的骨肉瘤、來自軟骨的軟骨肉瘤、來自脂肪的脂肪肉瘤和來自平滑肌的平滑肌肉瘤。示例性的肉瘤包括:Askin瘤、葡萄狀肉瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤-PNET、惡性血管內皮瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤。軟組織肉瘤的亞類包括:軟組織腺泡狀肉瘤、血管肉瘤、葉狀囊肉瘤、皮膚纖維肉瘤硬纖維瘤、促纖維化小圓細胞腫瘤、上皮樣肉瘤骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、卡波濟氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、神經纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。
[0071]本文所用術語「白血病」為血液或骨髓的惡性腫瘤，特徵在於白細胞的異常增多。白血病是廣義術語，其涵蓋了一系列疾病。因此，白血病是更廣泛的稱為血液腫瘤的疾病種類的一部分。白血病細分為多個大類；第一種分類是白血病的急性和慢性形式。急性白血病的特徵在於未成熟的血細胞數量的快速增長。由於這些細胞的積聚使得骨髓不能製造健康的血細胞。慢性白血病的特徵在於相對成熟、但仍為異常的白細胞的過度產生。通常通過數月或數年的發展，所述細胞的產生速率大大高於正常細胞，導致血液中有很多的異常白細胞。白血病也可以通過受累的血細胞進行細分。這樣的分界將白血病劃分為成淋巴細胞或淋巴細胞白血病和骨髓性(myeloid)或骨髓性(myelogenous)白血病。在成淋巴細胞或淋巴細胞白血病中，癌變發生在通常繼續形成淋巴細胞的骨髓細胞類型中。在骨髓性(myeloid)或骨髓性(myelogenous)白血病中，癌變發生在通常繼續形成紅細胞、一些其他類型的白細胞和血小板的骨髓細胞類型中。結合這兩種分類提供了總共四種主要類別。在這四種主要分類的每一種中，通常有一些亞類別。還存在分類方案之外的罕見類型。示例性的白血病包括:急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓細胞性白血病(CML)、毛細胞性白血病(HCL)、T細胞幼淋巴細胞性白血病、大顆粒淋巴細胞白血病、幼年型粒-單核細胞白血病、B細胞幼淋巴細胞性白血病、伯基特白血病和成人T細胞性白血病。
[0072]本文所用術語「黑素瘤」是黑素細胞的惡性腫瘤。黑素細胞是產生與皮膚顏色有關的暗色素(黑色素)的細胞。它們主要存在於皮膚，但是也在身體的其他部位存在，包括腸和眼。黑素瘤分為以下分型和亞類:惡性雀斑、惡性雀斑樣黑素瘤、淺表擴展性黑素瘤、肢端著色斑性黑素瘤、黏膜黑素瘤、結節性黑素瘤、息肉樣黑素瘤、結締組織增生性黑素瘤、無黑色素性黑素瘤、軟組織黑素瘤、小痣樣細胞黑素瘤、Spitz痣特徵黑素瘤和葡萄膜黑素瘤。
[0073]本文所用術語「轉移」指惡性腫瘤或癌從一個器官或部分擴展到另一個不相鄰的器官或部分。
[0074]術語「抑制」是相對的術語，如果與給予對照試劑相比，在給予某一試劑後反應或狀態在數量上減少或者如果在給予某一試劑後反應或狀態減弱，則所述試劑能抑制所述反應或狀態。同樣地，術語「防止」並不一定意味著試劑能完全消除反應或狀態，只要能消除反應或狀態的至少一個特徵即可。因此，降低或者防止感染或反應(如病理反應)的組合物能但並不一定完全消除所述感染或反應，只要能檢測到所述感染或反應減少，例如，在未給予所述試劑時或與給予對照試劑相比時，所述感染或反應減少至少約50%,如至少約70%或約80%,或甚至約90% (即，達到10%或更低)。
[0075]術語「CXCL13免疫原」和「CXCR5免疫原」指免疫原性組合物，包括(I)來源於CXCL13或CXCR5的免疫原性肽和/或(2)編碼並能夠表達來源於CXCL13或CXCR5的免疫原性肽的表達載體。所述來源於CXCL13或CXCR5的免疫原性肽可以與另一部分融合以增強其免疫原性。CXCL13免疫原性肽的實例包括但不限於由選自以下的一個或多個序列組成的肽或者包含選自以下的一個或多個序列的肽:RSSSTLPVPVFKRKIP(SEQID NO:45), PRGNGCPRKEIIVffKK (SEQ ID NO:46)、LPRGNGCPRKE11VWK (SEQ IDNO:47), QILPRGNGCPRKEIIV(SEQ ID NO:48)、ILPRGNGCPRKEIIVW(SEQID NO:49),RIQILPRGNGCPRKEI(SEQ ID NO:50), RGNGCPRKE11VffKKN (SEQ ID NO:51),KRSSSTLPVPVFKRKI (SEQ ID NO:52)、IQILPRGNGCPRKEII (SEQ ID NO:53),DRIQILPRGNGCPRKE (SEQ ID NO:54)、RKRSSSTLPVPVFKRK (SEQID NO:55),RCRCVQESSVFIPRRF(SEQ ID NO:56), GNGCPRKEIIVffKKNK(SEQ ID NO:57),CVQESSVFIPRRFIDR(SEQID NO:58)、IDRIQILPRGNGCPRK(SEQ ID NO: 59),LRCRCVQESSVFIPRR (SEQ ID NO:60)、FIDRIQILPRGNGCPR (SEQID NO:61),RCVQESSVFIPRRFID (SEQ ID NO:62)、CRCVQESSVFIPRRFI (SEQ ID NO:63),QESSVFIPRRFIDRIQ (SEQ IDNO:64) , RF IDRIQILPRGNGCP (SEQ ID NO:65),VQESSVFIPRRFIDRI(SEQ ID NO:66)、ESSVFIPRRFIDRIQI(SEQ ID NO:67),SLRCRCVQESSVFIPR(SEQ ID NO:68), NGCPRKEIIVffKKNKS(SEQ ID NO:69),PQAEWIQRMMEVLRKR(SEQ ID NO:70)、RRFIDRIQILPRGNGC(SEQ ID NO:71),LRKRSSSTLPVPVFKR (SEQ ID NO: 72) , VQESSVFIPRR (SEQ ID NO: 73 ,EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK (SEQ ID NO: 74)、KKNK (SEQ ID NO: 75)、RKRSSS (SEQ IDNO:76)、RGNGCP(SEQ ID NO:77)、VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:78),DRIQILP(SEQ IDNO: 79)、RKEIIVW (SEQ ID NO:80)和 KSIVCVDPQ (SEQ ID N0:81)。CXCR5 免疫原性肽的實例包括但不限於由選自以下的一個或多個序列組成的肽或者包含選自以下的一個或多個序列的肽:TSLVENHLCPATE(SEQ ID NO:82), EGSVGffVLGTFLCKT (SEQ ID NO: 83)、LPRCTFS (SEQID NO:84)、LARLKAVDNT(SEQ ID NO:85)和 MASFKAVFVP(SEQ ID NO:86)。
[0076]術語「CXCL16免疫原」和「CXCR6免疫原」指免疫原性組合物，包括(I)來源於CXCL16或CXCR6的免疫原性肽和/或(2)編碼並能夠表達來源於CXCL16或CXCR6的免疫原性肽的表達載體。所述來源於CXCL16或CXCR6的免疫原性肽可以是融合蛋白形式，從而增強其免疫原性。CXCL16免疫原性肽的實例包括但不限於由選自以下的一個或多個序列組成的肽或者包含選自以下的一個或多個序列的肽:AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ ID NO:87)、SQASEGASSDIHTPAQ(SEQ IDNO:88)、STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:89), SffSVCGGNKDPffVQEL(SEQ ID NO:90)、GPTARTSATVPVLCLL (SEQ ID NO: 91)、SGIVAHQKHLLPTSPP (SEQ ID NO: 92)、RLRKHL (SEQ IDNO: 93)、LQSTQRP (SEQ ID NO: 94)、SSDKELTRPNETT (SEQ ID NO: 95)、AGENQKQPEKNA (SEQID NO: 96)、NEGSVT (SEQ ID NO: 97)、ISSDSPPSV (SEQ ID NO:98) , CGGNKDPff (SEQ IDNO: 99)、LLPTSPPISQASEGASSDIHT (SEQ ID NO: 100)、STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT (SEQ ID NO: 101)、SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA (SEQ ID NO: 102)、TGSCYCGKR (SEQ IDNO: 103)、DSPPSVQ (SEQ ID NO: 104), RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSffSVCGG (SEQ ID NO: 105)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ ID NO:106)、 SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ IDNO: 107)、RPTLPVGSL (SEQ ID NO: 108)、TAGHSLAAG (SEQ ID NO: 109)、GKRISSDSPPSVQ (SEQID NO: 110), KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ ID NO: 111)。CXCR6 免疫原性肽的實例包括但不限於由選自以下的一個或多個序列組成的肽或者包含選自以下的一個或多個序列的肽:HQDFLQFSKV(SEQ ID NO: 112)、AGIHEffVFGQVMCK(SEQ ID NO: 113)、PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI (SEQ ID NO: 114)和 YYAMTSFHYTMVTEA(SEQ ID NO: 115)。
[0077]術語「生物樣本」指從哺乳動物個體、優選人類個體獲得的生物材料樣本，包括組織、組織樣本、細胞樣本、腫瘤樣本、糞便樣本和生物流體，如血液、血漿、血清、唾液、尿液、腦液或脊髓液、淋巴液和乳頭抽吸液。生物樣本可以以例如組織活檢的形式獲得，例如抽吸活組織檢查、刷拭活組織檢查、表面活組織檢查、針吸組織檢查、鑽取活組織檢查、切除活組織檢查、切開活組織檢查、切取活組織檢查和內窺鏡活組織檢查。在一個實施方式中，所述生物樣本為血液、血清或血漿樣本。在另一個實施方式中，所述生物樣本為唾液樣本。在又一個實施方式中，所述生物樣本為尿液樣本。
[0078]生物樣本的「分離物」(例如，組織或腫瘤樣本的分離物)指已從樣本分隔、得到、提取、純化或分離的材料或組合物(例如生物材料或組合物)，並優選基本不含有與所述生物樣本有關的不期望的組分和/或雜質或汙染物。
[0079]「組織樣本」包括由個體、優選人類個體的完整組織獲得或移除的組織的部分、片、塊、片段或小份。
[0080]「腫瘤樣本」包括腫瘤的部分、片、塊、片段或小份，所述腫瘤例如由個體、優選人類個體獲得或移除(例如，從個體的組織移除或提取)的腫瘤。腫瘤樣本可以從原發性腫瘤或轉移性腫瘤獲得。
[0081]用於治療目的的術語「哺乳動物」指分類為哺乳動物的任何動物，包括人、非人類靈長類動物、家畜和農畜，以及動物園動物、體育動物或寵物，如狗、馬、貓、牛等。優選地，哺乳動物為人。
[0082]術語「升高的水平」指高於相關領域通常所定義或使用的正常或對照水平的水平。例如，組織中免疫染色的升高的水平是被本領域普通技術人員認為高於對照組織中免疫染色水平的免疫染色水平。[0083]本文中範圍可以表示為從「約」一個具體值和/或至「約」另一個具體值。當表達了這種範圍時，另一實施方式包括從一個具體值和/或至另一具體值。同樣地，當值表示為近似值時，通過使用先行詞「約」，應當理解的是，所述具體值形成了另一實施方式。應當進一步理解的是，每個範圍的端點在與另一端點相關和獨立於另一端點中都是重要的。也可以理解的是，本文公開了很多值，除所述值本身以外，本文中的每個值也公開為「約」該具體值的形式。例如，如果公開了值「10」，則也公開了「約10」。也可以理解的是，當公開了某個值時，也公開了「小於或等於」所述值、「大於或等於」所述值以及值之間的可能範圍，這是技術人員能合適地理解的。例如，如果公開了值「10」，那麼也公開了「小於或等於10」以及「大於或等於10」。
[0084]通過測定CXCL13和/或CXCR5表達或活性來檢測惡性腫瘤的方法
[0085]CXCL13，也稱為B淋巴細胞趨化因子l(BLC)，是CXCR5趨化因子受體的配體。上述趨化因子和受體在惡性腫瘤的轉移和侵襲的調節中表現出作用。與正常組織相比，CXCL13和CXCR5在多種癌組織類型中為局部上調，包括卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨癌和胰腺癌。在這些惡性腫瘤的患者的血清中CXCL13水平也會升高。另外，可溶性CXCL13趨化因子在體內和體外都可以增強惡性腫瘤細胞的增殖和遷移。
[0086]CXCR5(⑶185)，也稱為伯基特淋巴瘤受體I (BLR1)，是G蛋白偶聯受體(GPCR)的趨化因子受體家族的成員，其在惡性腫瘤細胞存活中可能具有多種作用，推測為提供與化療藥物的對抗。CXCR5和CXCL13相互作用活化與DOCK結合蛋白ELMOl(吞噬和細胞運動蛋白I)的D0CK2 (胞質分裂作用因子2，Dedicator of cytokenesis2)，從而允許D0CK2介導的Rac(Rac相關的C3肉毒桿菌毒素底物蛋白，其是GTP酶的Rho家族的亞類的信號轉到G蛋白家族)淋巴細胞中活化。D0CK2與Racl和Rac2同種型結合，並且D0CK2依賴性Rac活化能調節嗜中性粒細胞NADPH氧化酶並且對嗜中性粒細胞的趨化性很重要。在本申請中，術語「CXCR5」包括CXCR5的轉錄變體，如CXCR5a(CXCR5轉錄變體2)和CXCR5b (CXCR5轉錄變體I)。
[0087]本申請的一方面涉及檢測個體中惡性腫瘤存在的方法。在一個實施方式中，所述方法包括檢測來自個體的生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平；以及將生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平與一種或多種惡性腫瘤標誌物的正常表達水平相比較，其中生物樣本中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物高於正常的表達水平表示個體中存在惡性腫瘤，其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的正常表達水平為預定值，或者獲自與所述生物樣本具有相同來源或類型的已知的正常非癌性細胞的對照樣本，其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。
[0088]在另一實施方式中，所述一種或多種惡性腫瘤標誌物包括(I) CXCL13、或CXCR5、或者 CXCL13 和 CXCR5，以及(2) CXCL16、或 CXCR6、或者 CXCL16 和 CXCR6。
[0089]在另一實施方式中，所示一種或多種惡性腫瘤標誌物包括(I) CXCL13、或CXCR5、或者 CXCL13 和 CXCR5，(2)CXCL16、或 CXCR6、或者 CXCL16 和 CXCR6，以及(3)—種或多種其他惡性腫瘤標誌物。
[0090]在本申請的上下文中，術語「檢測」意圖包括預測和可能性分析。本申請的方法意圖在臨床上作出有關治療方式的決策中使用，包括惡性腫瘤的治療幹預、診斷標準(如疾病分期)、疾病監測和監視。根據本申請，可以提供檢查個體疾病狀態的中間結果。這種中間結果可以和其他信息聯合而協助醫生、護士或其他專業人員來診斷個體患有的疾病。可選地，本申請可以用於檢測來源於個體的組織中的惡性腫瘤細胞，並向醫生提供有用信息從而診斷個體患有的疾病。意圖通過本申請的方法進行診斷的個體優選為人，但也可以包括其他哺乳動物，如非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛。
[0091]在一些實施方式中，所述惡性腫瘤為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤。在一些其他實施方式中，所述生物樣本為血漿樣本、唾液樣本或尿液樣本。
[0092]預測患有惡性腫瘤的個體的預後的方法
[0093]本申請的用於診斷惡性腫瘤的方法也可以用於評價患惡性腫瘤個體的預後，其通過比較來源於患者的生物樣本和參考樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平。在一個實施方式中，所述方法包括測定來自患者的生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平，其中如果所述生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平高於對照值(即對照中的水平)，則表示所述個體的預後不良，而如果所述生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平低於或近似於對照中的水平，則表示所述個體的預後良好。預後不良表明惡性腫瘤為攻擊型或侵襲型，可能迅速發展和/或可能轉移，其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。
[0094]在另一實施方式中，所述一種或多種惡性腫瘤標誌物包括包括(I) CXCL13或CXCR5，或者 CXCL13 和 CXCR5，以及(2) CXCL16、或 CXCR6、或者 CXCL16 和 CXCR6。
[0095]在另一實施方式中，所示一種或多種惡性腫瘤標誌物包括(I) CXCL13、或CXCR5、或者 CXCL13 和 CXCR5，(2)CXCL16、或 CXCR6、或者 CXCL16 和 CXCR6，以及(3)—種或多種其他惡性腫瘤標誌物。
[0096]可選地，可以在一系列疾病階段中測量生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的水平從而評價患者的預後。與正常對照水平相比，一種或多種惡性腫瘤標誌物的水平升高表明預後較不樂觀。與正常對照水平相比，一種或多種惡性腫瘤標誌物的水平相似表明患者的預後較為樂觀。
[0097]在一些實施方式中，所述惡性腫瘤為為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤。在一些其他實施方式中，所述生物樣本為血漿樣本、唾液樣本或尿液樣本。
[0098]監測惡性腫瘤治療過程的方法
[0099]在一些實施方式中，一種或多種惡性腫瘤標誌物的水平被用於監測惡性腫瘤的治療過程。該方法中，由進行惡性腫瘤治療的個體提供測試生物樣本。優選地，在治療前、治療中或治療後的不同時間點從個體獲得多個測試生物樣本。然後，可以將治療後的樣本中惡性腫瘤標誌物的表達水平與治療前的樣本中惡性腫瘤標誌物的水平比較，或可選地，與參考樣本(即正常對照水平)比較。例如，如果治療後的標誌物水平低於治療前的標誌物水平，可以推斷治療是有效的。同樣地，如果治療後標誌物水平與正常對照標誌物水平近似或相同，也可以推斷治療是有效的。
[0100]「有效」治療是能使個體中惡性腫瘤標誌物的水平降低或惡性腫瘤的尺寸、發展或轉移可能性降低的治療。當實施預防性處理時，「有效」指所述處理能延緩或預防惡性腫瘤的發生或者減輕惡性腫瘤的臨床症狀。可以使用標準臨床程序來評價惡性腫瘤。而且，可以聯合使用診斷或治療惡性腫瘤的任何已知方法來確定治療的功效。例如，常規通過組織病理學或通過鑑定諸如體重減輕和食欲不振的異常症狀來診斷惡性腫瘤。[0101]在一個實施方式中，將生物樣本中的惡性腫瘤標誌物的水平與參考樣本(如正常的對照樣本)相關的惡性腫瘤標誌物的水平相比較。短語「正常對照水平」指通常在未患有惡性腫瘤群體的生物樣本中發現的惡性腫瘤標誌物水平。所述參考樣本優選與測試樣本有類似的性質。例如，如果測試樣本包括患者血清，參考樣本也應當為血清。可以同時測定來自對照和測試個體的生物樣本中惡性腫瘤標誌物水平，或者可選地，通過分析事先從對照組收集的樣本中惡性腫瘤標誌物的水平，可以通過基於獲得的結果的統計學方法來確定正常對照水平。
[0102]在一些實施方式中，所述惡性腫瘤為為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤。在一些其他實施方式中，所述生物樣本為血漿樣本、唾液樣本或尿液樣本。
[0103]惡性腫瘤標誌物
[0104]本文所用術語「惡性腫瘤標誌物」指或描述了多肽或多核苷酸，其表達水平(單獨或與其他多肽或多核苷酸聯合)與惡性腫瘤或惡性腫瘤預後相關。這種相關可以涉及多肽或多核苷酸的表達升高或降低。例如，多肽或多核苷酸的表達可以指示惡性腫瘤，或者多肽或多核苷酸的表達缺乏可以與惡性腫瘤患者的不良預後有關。
[0105]可以在轉錄水平或者翻譯水平測定術語「惡性腫瘤標誌物的表達水平」，在轉錄水平下，測定多核苷酸的存在和/或量，在翻譯水平下，測定多肽的存在和/或量。可以使用任何合適的方法表徵惡性腫瘤標誌物表達。
[0106]惡性腫瘤標誌物的實例包括CXCL13、CXCR5、其他趨化因子和趨化因子受體，如CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLIO、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CXCLl5, CXCL16、CXCRl、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25—1、CCL25—2、CCL27、CCL28、CCRl、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRlO、CCRl1、XCLl、XCL2、XCRl、CX3CR1、CX3CL1、RNA結合基序3("RBM3")，癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、嗜鉻粒蛋白A、脫氫表雄酮(DHEA)、神經元特異性烯醇酶(NSE)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、促乳素、B7-H3、分離酶多肽(seprase polypeptide)、抗p53、骨橋蛋白、鐵蛋白、溶血磷脂醯膽鹼、驅動蛋白家族成員4A(KIF4A)、神經正五聚蛋白I(NPTXl)和成纖維細胞生長因子受體I癌基因伴侶(FGFR10P)蛋白。
[0107]在一個實施方式中，上述惡性腫瘤標誌物選自黑素瘤標誌物組，其包括CXCL13、CXCR5、CCL25、CCL27、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2, CXCL16、CX3CL1、CCR9、CCR10、CXCRl、CXCR2、CXCR4、CXCR6 和 CX3CR1。黑素瘤組中的標誌物可以用
於檢測黑素瘤或預測患有黑素瘤個體的預後。
[0108]在一個實施方式中，上述惡性腫瘤標誌物選自癌標誌物組，其包括CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2、CXCL16、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR6和CX3CR1。癌組中的標誌物可以用於檢測癌或預測患有癌個體的預後。
[0109]在另一實施方式中，上述惡性腫瘤標誌物選自乳腺癌標誌物組，其包括CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2、CXCL16、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR6、CX3CR1、RNA結合基序3 (〃RBM3〃)和癌胚抗原(CEA)。乳腺癌組中的標誌物可以用於檢測乳腺癌或預測患有乳腺癌個體的預後。[0110]在另一實施方式中，上述惡性腫瘤標誌物選自前列腺癌標誌物組，其包括CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL2 5、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、PSA、CEA、CGA、DHEA, NSE、PAP、促乳素和 B7-H3。乳腺癌組中的標誌物可以用於檢測前列腺癌或預測患有前列腺癌個體的預後。
[0111]在另一實施方式中，上述惡性腫瘤標誌物選自結腸直腸癌標誌物組，其包括CXCLl3, CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCLl、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2,CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、分離酶多肽、抗p53、骨橋蛋白和鐵蛋白。結腸直腸癌組中的標誌物可以用於檢測結腸直腸癌或預測患有結腸直腸癌個體的預後。
[0112]在另一實施方式中，上述惡性腫瘤標誌物選自卵巢癌標誌物組，其包括CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL2 5、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、癌抗原 125 (CA-125)、HE_4、0VX-1 巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和溶血磷脂醯膽鹼。卵巢癌組中的標誌物可以用於檢測卵巢癌或預測患有卵巢癌個體的預後。
[0113]在另一實施方式中，上述惡性腫瘤標誌物選自肺癌標誌物組，其包括CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL2 5、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、驅動蛋白家族成員4A(KIF4A)、神經正五聚蛋白I (NPTXl)、成纖維細胞生長因子受體I癌基因伴侶(FGFR10P)蛋白和CEA。肺癌組中的標誌物可以用於檢測肺癌或預測患有肺癌個體的預後。
[0114]在另一實施方式中，上述惡性腫瘤標誌物選自胰腺癌標誌物組，其包括CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL2 5、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1和CEA。胰腺癌組中的標誌物可以用於檢測胰腺癌或預測患有胰腺癌個體的預後。
[0115]在另一實施方式中，上述惡性腫瘤標誌物選自胃癌標誌物組，其包括CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2、CXCL16、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR6和CX3CR1和CEA。胃癌組中的標誌物可以用於檢測胃癌或預測患有胃癌個體的預後。
[0116]檢測方法
[0117]可以在轉錄水平(即mRNA的量)或翻譯水平(即蛋白的量)測定惡性腫瘤標誌物的表達。在一些實施方式中，通過定量RT-PCR、Northern印跡或本領域技術人員已知的其他方法在mRNA水平測定惡性腫瘤標誌物的表達。在其他實施方式中，通過ELISA、WeStern印跡或使用抗惡性腫瘤標誌物抗體(如抗CXCL13和抗CXCR5抗體)的其他類型免疫檢測方法來測定惡性腫瘤標誌物的表達。
[0118]在一些實施方式中，抗CXCLl 3抗體和/或抗CXCR5抗體包括能特異性結合CXCL13肽或CXCR5肽的抗體。CXCL13肽的實例包括但不限於由選自以下的一個或多個序列組成或者包含選自以下的一個或多個序列的肽:RSSSTLPVPVFKRKIP (SEQID NO:45) , PRGNGCPRKEIIVffKK(SEQ ID NO:46), LPRGNGCPRKEIIVffK(SEQ IDNO: 47) , QILPRGNGCPRKEIIV (SEQ ID NO:48)，ILPRGNGCPRKE11VW(SEQ IDNO:49)，RIQILPRGNGCPRKEI (SEQ ID NO:5 0), RGNGCPRKE11 VffKKN(SEQ IDNO:51) , KRSSSTLPVPVFKRKI (SEQ ID NO:52)，IQILPRGNGCPRKEII (SEQ IDNO: 53)，DRIQILPRGNGCPRKE (SEQ ID NO:54), RKRSSSTLPVPVFKRK (SEQ IDNO:55), RCRCVQESSVFIPRRF (SEQ ID NO: 56) , GNGCPRKEIIVffKKNK (SEQ IDNO:57) , CVQESSVFIPRRFIDR (SEQ ID NO:58)，IDRIQILPRGNGCPRK (SEQ IDNO: 5 9) , LRCRCVQESSVFIPRR (SEQ ID NO:60)，FIDRIQILPRGNGCPR (SEQ IDNO:6 I), RCVQESSVFIPRRFID(SEQ ID NO:62), CRCVQESSVFIPRRFI (SEQ IDNO:63), QESSVFIPRRFIDRIQ (SEQ ID NO:64) , RF IDRIQILPRGNGCP (SEQ IDNO: 65) , VQESSVFIPRRFI DRI(SEQ ID NO:66) , ESSVFIPRRFIDRIQI (SEQ IDNO:67), SLRCRCVQESSVFIPR (SEQ ID NO:68) , NGCPRKEIIVffKKNKS (SEQ IDNO: 69) , PQAEffIQRMMEVLRKR (SEQ ID NO:70)，RRFIDRIQILPRGNGC (SEQ IDNO:71), LRKRSSSTLPVPVFKR(SEQ ID NO:72), VQESSVFIPRR(SEQ ID NO:73, EffIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:74), KKNK(SEQ ID NO:75)，RKRSSS(SEQ ID NO:76)，RGNGCP(SEQ IDNO:77), VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:78)，DRIQILP(SEQ ID NO:79), RKEIIVff(SEQID N0:80)和KSIVCVDPQ(SEQ ID NO:81)。CXCR5肽的實例包括但不限於由選自以下的一個或多個序列組成或者包含選自以下的一個或多個序列的肽:TSLVENHLCPATE(SEQ IDNO:82), EGSVGffVLGTFLCKT(SEQ ID NO:83)，LPRCTFS(SEQ ID NO:84), LARLKAVDNT(SEQ IDNO:85)和 MASFKAVFVP(SEQ ID NO:86)。
[0119]在其他實施方式中，聯合使用抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體與抗CXCL16抗體和/或抗CXCR6抗體。抗CXCL16和/或抗CXCR6抗體包括能特異性結合CXCL16肽或CXCR6肽的抗體。CXCL16肽的實例包括但不限於由選自以下的一個或多個序列組成或者包含選自以下的一個或多個序列的肽:AAGPEAGENQKQPEKN (SEQID NO:87)，SQASEGASSDIHTPAQ(SEQ ID NO:88),STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ IDNO: 8 9), SffSVCGGNKDPffVQEL(SEQ ID NO:9 0),GPTARTSATVPVLCLL(SEQ IDNO:91),SGIVAHQKHLLPTSPP(SEQ ID NO:92), RLRKHL(SEQ ID NO:93)，LQSTQRP(SEQ IDNO:94), SSDKELTRPNETT(SEQ ID NO:95)，AGENQKQPEKNA(SEQ ID NO:96), NEGSVT (SEQ IDNO:97), ISSDSPPSV(SEQ ID NO:98), CGGNKDPff (SEQ ID NO:99)，LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:100), STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT (SEQ ID NO:101)，SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA(SEQ ID NO:102)，TGSCYCGKR(SEQ ID NO:103), DSPPSVQ(SEQ ID NO:104), RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSffSVCGG(SEQ ID NO:105), WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ IDNO:106), SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ ID NO:107), RPTLPVGSL(SEQ ID NO:108), TAGHSLAAG(SEQID NO:109), GKRISSDSPPSVQ(SEQ ID NO:110), KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ IDNO: 111) AXCRe肽的實例包括但不限於由選自以下的一個或多個序列組成或者包括選自以下的一個或多個序列的肽:HQDFLQFSKV(SEQ ID NO: 112), AGIHEffVFGQVMCK (SEQ ID NO: 113),PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI (SEQ ID NO: 114)和 YYAMTSFHYTMVTEA (SEQ ID NO: 115)。
[0120]在一個實施方式中，抗體與固體載體綴合。「固體載體」是指本申請的抗體可以粘附或附著的非水性基質。本文包括的固相的實例包括部分或全部地由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯醯胺、矽酮和塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯醇)形成的固相。
[0121]酶聯免疫吸附測定(ELISA)
[0122]在一些實施方式中，使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)來檢測惡性腫瘤標誌物，通常用包被有抗體的測定板或孔進行ELISA。通常使用的ELISA測定利用了夾心免疫測定或競爭性結合免疫測定。
[0123]簡單地說，夾心免疫測定是使用能結合抗原或配體的不同位點的兩種抗體的方法。對抗原具有高度特異性的一抗附著於固體表面。然後加入所述抗原，然後添加稱為檢測抗體的二抗。所述檢測抗體能結合抗原的不同於一抗結合的表位。因此，所述抗原被「夾」在兩個抗體之間。抗體對抗原的結合親和力通常是免疫測定靈敏性的主要決定因素。隨著抗原濃度增加，檢測抗體的量也增加，導致更高的測量響應。夾心結合測定的標準曲線具有正斜率。為定量結合的程度，可以使用不同的報告物。通常，酶連接於二抗，二抗必須為不同於一抗的物種中產生的(即，如果一抗是兔抗體，二抗則為來自於山羊、雞等而並非兔子的抗兔抗體)。將酶的底物添加至反應中，形成比色讀數作為檢測信號。生成的信號與存在於樣本中的靶抗原成比例。
[0124]用於測定結合事件的連接抗體的報告物決定了檢測方式。分光光度酶標儀可以用於比色檢測。最近開發了幾種類型的報告物，從而提高免疫測定中的靈敏性。例如，已經開發出了化學發光底物，其進一步放大信號並且可以在發光酶標儀上讀出。而且，螢光讀數正變得非常普及，其中測定的酶學步驟被螢光體標記的抗體代替。然後使用螢光酶標儀測量讀數。
[0125]競爭性結合測定是基於標記的和未記的配體競爭結合有限數量的抗體結合位點。競爭性抑制測定經常用於測量小的分析物。當針對分析物的配對抗體不存在時，也使用這些測定。在競爭性結合ELISA中僅使用一種抗體。這是因為如果兩種抗體都試圖與非常小的分子結合時會出現空間位阻。固定量的標記配體(追蹤物)和可變量的未記配體與抗體孵育。根據質量作用定律，標記配體的量為標記和未標記配體的總濃度的函數。隨著未標記配體的濃度增加，更少的標記配體能夠結合抗體並且測量的響應降低。因此，信號越小，樣品中未標記的分析物就越多。競爭性結合測定的標準曲線具有負斜率。
[0126]微珠
[0127]在一些其他實施方式中，使用包被有抗體的微珠檢測惡性腫瘤標誌物。在一些實施方式中，所述微珠為磁珠。在其他實施方式中，所述微珠的內部用螢光染料編碼顏色，並且珠的表面用能夠與測試樣本中的惡性腫瘤標誌物結合的抗惡性腫瘤標誌物抗體(例如抗CXCL13抗體或抗CXCR5抗體)標記。相應地，惡性腫瘤標誌物既可以直接用螢光標籤標記，也可以用與螢光標籤綴合的抗標誌物抗體間接標記。因此，有兩個顏色來源，一個來自於珠而另一個來自於螢光標籤。可選地，可以通過不同的尺寸來內部編碼所述珠。
[0128]通過使用來自兩種染料的不同的螢光強度的混合以及不同尺寸的珠，該測定可以測量多達數百種不同的惡性腫瘤標誌物。在測定期間，將包含顏色/尺寸編碼的珠、螢光標記的抗標誌物抗體和樣本的混合物組合，並上樣到使用精密流控技術而能使珠對準的的儀器中。然後所述珠通過雷射，並基於它們的顏色或尺寸進行分類或測量顏色強度，將其處理為每個反應的定量數據。
[0129]當用螢光團直接標記樣本時，在不移除溶液中未結合的螢光團時，系統僅可以讀出和定量珠上的螢光。可以通過區分不同顏色或尺寸的珠是使該測定多元化使用。當樣本直接需要未標記的樣本時，可實現實時測量。標準的測定步驟包括孵育樣本和包被有抗標誌物抗體的珠，與生物素或螢光團標記的二抗孵育，並檢測螢光信號。螢光信號可以在珠上顯示(對於生物素化的二抗，通過添加抗生蛋白鏈菌素-螢光團偶聯物)並通過珠分析儀讀數。依據固定在珠表面的抗標誌物，基於珠的免疫測定可以是夾心類型或競爭類型的免疫測定。
[0130]測試棒
[0131]在一些其他實施方式中，可以使用測試棒檢測液體生物樣本中的惡性腫瘤標誌物。所述測試棒通常包含液體不可滲透的外殼和具有一種或多種檢測區的液體可滲透的「棒」。在一個實施方式中，每個檢測區包含能與生物樣本中的惡性腫瘤標誌物結合的乾燥結合劑。在另一實施方式中，所述乾燥結合劑是標記的結合劑。在另一實施方式中，所述測試棒可以進一步包括對照區，從而表明測定試驗良好進行(即，試劑存在於測試棒中)，以及在運行試驗時它們是固定的且沿著流動道運輸。所述對照區也表明裝置中的試劑能夠發生免疫化學相互作用，以確認裝置的化學完整性。當考慮到在一定溫度範圍內、乾燥條件下裝置的保存和運輸時，這一點是重要的。所述對照區通常位於檢測區的下遊，並且可以例如包括標記的結合試劑的固定的結合試劑。所述標記的結合試劑可以以可動的形式存在於對照區和檢測區的上遊。標記的結合試劑可以與惡性腫瘤標誌物的標記的結合試劑相同或不同。
[0132]在一個實施方式中，測試棒包括與一個或多個流動通道保持液體連通並位於所述一個或多個流動通道上遊的多孔樣本接收器。多孔樣本接收器可以對所有測定通用。因此施加於裝置的通用樣本施加區的液體樣本能夠沿著一個或多個流通道移動，到達各自的檢測區。多孔樣本接收器可以設置於外殼內部或至少部分伸出所述外殼，並可以用作例如收集體液。多孔樣本接收器也可以用作液體儲存器。多孔樣本接收部件可以由任何能夠迅速吸收液體的吸溼性、多孔或纖維材料製造。材料的多孔性可以是單向的(即，孔或纖維完全或主要平行於所述部件的軸行進)或多向的(全向的，從而使所述部件具有無定形的海綿狀結構)。可以使用多孔塑料材料，如聚丙烯、聚乙烯(優選非常高的分子量)、聚偏二氟乙烯、乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinylacetate)、丙烯腈和聚四氟乙烯。其他合適的材料包括玻璃纖維。
[0133]如果需要，可以在載體材料的遠端設置吸收「池」。吸收池可以包括，例如Whatman3MM色層分析紙，並且應提供足夠的吸收容量,從而允許任何未結合的標記的結合試劑從檢測區洗出。作為這種池的可選方案，具有超出檢測區的一定長度的多孔固相材料就足夠了。
[0134]將結合試劑施加至檢測區後，可以處理多孔固相材料的剩餘部分，從而封閉任何剩餘的結合位點。可以通過例如用蛋白質(例如，牛血清白蛋白或乳蛋白)、或聚乙烯醇或乙醇胺、或者它們的組合來處理而實現封閉。當多孔載體被樣本溼潤時，為了協助標記的結合試劑自由流動，所述多孔載體可以進一步包括如蔗糖或乳糖的糖和/或如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的其他物質。這種材料可以沉積為例如在意圖施加標記的結合試劑的區域中中水溶液。這種材料可以被施加於多孔載體作為第一次施加，接著施加標記；可選地，這種材料可以與標記混合併施加至多孔載體或二者的組合。這種材料可以沉積於標記的結合試劑的上遊或標記的結合試劑處。
[0135]可選地，在製造時可以不封閉多孔載體；而是在所述多孔載體的上遊的材料中包括用於封閉多孔載體的工具。在溼潤測試條時，封閉多孔載體的工具移動，並且封閉工具流入並經過多孔載體，隨著流動過程進行封閉。封閉工具包括如BSA和酪蛋白的蛋白質，以及如PVP、PVA的聚合物，以及糖和如Triton-XlOO的去垢劑。封閉工具可以存在於大孔載體材料中。
[0136]乾燥的結合試劑可以設置於包括檢測區的多孔載體材料的上遊的多孔載體材料上。上遊多孔載體材料可以是大孔的。大孔載體材料應當是蛋白低結合或蛋白不結合，或者應當易於通過如BAS或PVA的試劑封閉，從而減少非特異性結合以及大孔體被液體樣本溼潤後利於標記的試劑的自由移動。可以用表面活性劑或溶劑預處理大孔載體材料，如果必要，使其親水性更強並促進液體樣本的快速吸收。大孔載體的合適材料包括塑料材料，如聚乙烯和聚丙烯，或如紙或玻璃纖維的其他材料。在用可檢測顆粒對標記的結合試劑進行標記的情況中，大孔體可以具有大於顆粒標記的最大顆粒尺寸至少10倍的孔徑。孔徑越大，標記的試劑能越好地釋放。作為大孔材料的可選方案，可以將標記的結合試劑設置於位於檢測區的上遊的無孔基底上，所述無孔基底形成流動通道的一部分。
[0137]在另一實施方式中，測試棒可以進一步包括用於接收液體樣本的樣本接收部件。樣本接收部件可以從所述外殼伸出。
[0138]外殼可以由液體不可滲透的材料構成。外殼也有利地排除環境光線。如果投射至裝置外部的可見光滲透至裝置內部少於10%、優選少於5%、並且最優選少於1%，則認為外殼基本排除了環境光線。不透光合成塑料材料，如包含合適的阻光色素的聚碳酸酯、ABS、聚苯乙烯(polystyrene)、聚苯乙烯(polystyrol )、高密度聚乙烯或聚丙烯,是製造外殼時使用的合適選擇。可以在外殼外部設置孔，所述孔與位於外殼內部空間中的測定相連通。可選地，所述孔可以用來使多孔樣本接收器從外殼延伸至外殼外部的位置。
[0139]微陣列
[0140]在其他實施方式中，通過蛋白質微陣列檢測惡性腫瘤標誌物，所述蛋白質微陣列包含在其表面上的固定的惡性腫瘤標誌物特異性抗體。所述微陣列可以用於「夾心」測定，其中微陣列上的抗體捕獲測試樣本中的惡性腫瘤標誌物並且通過能特異性結合捕獲標誌物的標記的二抗檢測該捕獲標誌物。在優選的實施方式中，二抗是生物素化的或酶標記的。隨後通過與抗生蛋白鏈菌素-螢光團綴合物(用於螢光檢測)或酶底物(用於比色檢測)孵育來實現檢測。
[0141]通常，微陣列測定包括多個孵育步驟，包括與樣本孵育和與多種試劑(例如，一抗、二抗、報告試劑等)孵育。在孵育步驟之間也需要重複的洗滌。在一個實施方式中，以快速測定模式進行微陣列測定，其只需要一或兩次孵育。也可以想到的是，可以在單個孵育步驟中形成可檢測的免疫複合物(例如捕獲的惡性腫瘤標誌物/抗標誌物抗體/標記複合物)，其通過將蛋白質微陣列暴露於樣本和所有必需試劑的混合物而實現。在一個實施方式中，一級和二抗是相同的抗體。
[0142]在另一實施方式中，蛋白質陣列提供了競爭性免疫測定。簡單地說，將包括固定的抗標誌物抗體的微陣列與測試樣本在標記的惡性腫瘤標誌物標準品存在的情況下一起孵育。標記的惡性腫瘤標誌物與測試樣本中未標記的惡性腫瘤標誌物競爭結合固定的抗原特異性抗體。在這樣的競爭環境中，測試樣本中特異性惡性腫瘤標誌物濃度的升高會導致標記的惡性腫瘤標誌物標準品與固定的抗體結合降低，由此來自標記的信號強度降低。
[0143]微陣列可以以手控、半自動或自動化模式運行。手控模式指手動操作所有測定步驟，包括將試劑和樣本遞送至微陣列上，樣本孵育和微陣列洗滌。半自動模式指手動操作將樣本和試劑遞送至微陣列上，而自動運行孵育和洗滌步驟。在自動化模式中，三個步驟(樣本/試劑遞送、孵育和洗滌)可以由計算機或具有鍵盤的集成的電路板單元來控制。例如，可以用 ProteinArray Workstation (PerkinElmer Life Sciences, Boston, Mass.)或Assayl200?.Workstation (Zyomyx, Hayward, Calif.)進行微陣列。利用突光掃描、比色和化學發光的掃描儀可以用於檢測微陣列信號並獲取微陣列圖像。也可以通過其他方式實現基於微陣列的測定的定量，如質譜法和表面等離子體共振。可以通過獨立的圖像分析軟體或用圖像採集和分析軟體包來分析獲取的微陣列圖像。例如，可以用基於PMT的螢光掃描儀 一ScanArray3000 (General Scanning, Watertown, Mass.)或基於 CCD 的比色掃描儀一VisionSpot (Allied Biotech, Ijamsville, Md.)來實現抗原微陣列的定量。通常，圖像分析會包括用各種軟體包進行數據採集和測定報告的準備。為了加速從獲取圖像到生成測定報告的整個測定過程，包括圖像獲取、圖像分析和生成報告的所有分析步驟都可以通過一種軟體包來實現和/或控制。這樣的一體化控制系統會以方便用戶的方式提供圖像分析和測定報告的生成。
[0144]可植入的生物傳感器
[0145]在其他實施方式中，可以使用可植入的生物傳感器來檢測惡性腫瘤標誌物。生物傳感器是能產生作為生物相互作用結果的電子信號的電子裝置。在一個實施方式中，生物傳感器使用抗體、受體、核酸或結合對的其他成員來與惡性腫瘤標誌物結合，所述惡性腫瘤標誌物通常是所述結合對的另一成員。生物傳感器可以和血液樣本一起使用來確定惡性腫瘤標誌物的存在，而無需自動免疫測定系統通常所需的樣本準備和/或分離步驟。
[0146]在一個實施方式中，傳感器為納米級別的裝置。傳感器系統包括連接到納米線的生物識別元件和能夠測定與納米線相關的性質的檢測器。所述生物識別元件是結合對的一個成員(例如，惡性腫瘤標誌物的受體或抗惡性腫瘤標誌物抗體)，其中所測量的惡性腫瘤標誌物是所述結合對的另一成員。優選地，納米線傳感器包括其上形成有外表面的半導體納米線以形成柵電極以及第一末端第二末端，第一末端與導體電接觸以形成源電極，第二末端與導體接觸中以形成漏電極。在一個實施方式中，傳感器為場效應電晶體，包括絕緣材料形成的基底、源電極、漏電極和置於它們之間的半導體納米線，生物識別元件連接到所述納米線的表面。當在生物識別元件和其特異性結合伴侶之間發生結合事件時，會引起場效應電晶體的電流-電壓特性的可檢測的變化。
[0147]在另一實施方式中，傳感器系統包括傳感器陣列。陣列中一個或多個傳感器與保護部件相連，保護部件防止相連的傳感器與周圍環境相互作用。在選定的時間，可以使保護部件失去保護功能，由此使得傳感器開始運行，與周圍的液體或組織相互作用，使生物識別元件可以與其結合對中的另一成員相互作用(如果該結合對成員存在的話)。
[0148]在另一實施方式中，保護部件由傳導性材料形成，所述材料能夠氧化、具有生物相容性和生物可吸收性，並且在施加電勢時可以溶於諸如血液的溶液中。例如，可以在覆蓋有傳導性材料(如生物相容性金屬或可電腐蝕的聚合物)的基底的孔中形成傳感器。在另一實施方式中，使用能在預定的時間段內溶解的材料來形成保護部件。
[0149]質譜法
[0150]在其他實施方式中，使用質譜法(MS)檢測惡性腫瘤標誌物，如MALDI/T0F(飛行時間)、SELDI/TOF、液相色譜-質譜法(LC-MS)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)、高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS)、毛細管電泳-質譜法、核磁共振波譜法或串聯質譜法(例如，MS/MS, MS/MS/MS, ES1-MS/MS 等)。
[0151]質譜法是本領域眾所周知的，並用於定量和/或鑑定諸如蛋白質的生物分子。而且，質譜技術已發展為能允許分離蛋白的至少部分從頭測序。在一些實施方式中，使用氣相離子分光光度計。在其他實施方式中，使用雷射解吸/電離質譜來分析樣本。調製器雷射解吸/電離質譜("LD1-MS")可以以兩種主要變化形式進行:基質輔助雷射解析/電離(〃MALDI〃)質譜和表面增強的雷射解析/電離(〃SELDI〃)。在MALDI中，將分析物與包含基質的溶液混合，並將一滴液體置於基底表面上。然後將基質液與生物分子共結晶。將基底插入質譜儀中。將雷射能量引導至基底表面，在這裡雷射能量解吸和電離生物分子而不顯著將其片段化。在SELDI中，修飾基底表面，從而使其積極地參與到解吸過程中。在一個實施方式中，用能選擇性結合目的蛋白的吸附劑和/或捕獲試劑對表面進行衍生化。在另一實施方式中，用能量吸收分子對表面進行衍生化，當用雷射衝擊所述能量吸收分子時，其不會解吸。在另一實施方式中，用能與目的蛋白結合併且包含施加雷射時能斷開的光分解鍵的分子對表面進行衍生化。每種這些方法中，衍生劑通常是位於基底表面上施加樣本的具體位置。參見，例如美國專利號5，719，060 (Hutchens和Yip)和W098/59361 (Hutchens和Yip)。兩種方法可以聯合，例如通過使用SELDI親和力表面來捕獲分析物並將含有基質的液體加至捕獲的分析物中以提供能量吸收材料。
[0152]檢測惡性腫瘤標誌物的存在通常會涉及信號強度的檢測。該檢測可以反映結合至基底的多肽的量和特性。例如，在一些實施方式中，可以比較來自第一樣本和第二樣本的波譜的峰值的信號強度(例如，肉眼比較，通過計算機分析等)來測定具體生物分子的相對量。如 Biomarker Wizard program (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.)的軟體程序可以用來幫助分析質譜。質譜儀及其技術對本領域技術人員而言是眾所周知的。
[0153]本領域技術人員能理解，質譜的任何組件(例如解吸源、質量分析儀、檢測等)和多種樣本製劑可以與本文所述或本領域所知的其他合適的組件或製劑聯合使用。例如，在一些實施方式中，對照樣本可以包含重原子(例如13C)，因此允許測試樣本與已知對照樣本在同一的質譜運行中混合。
[0154]在一個優選的實施方式中，使用雷射解吸飛行時間(TOF)質譜儀。在雷射解吸質譜中，將具有結合的標誌物的基底引入入口系統。標誌物被來自電離源的雷射解吸並電離為氣相。通過離子光學組件收集產生的離子，然後收集在時間飛行質譜分析儀中，離子通過短的高壓場加速並漂入高真空室。在高真空室的遠端，加速的離子在不同的時間碰撞靈敏的檢測器表面。由於時間飛行是離子質量的函數，所以離子形成和離子檢測器碰撞之間的經歷時間可以用於鑑定是否存在特定質荷比的分子。
[0155]在一些實施方式中，通過用計算機執行算法來部分地測定存在於第一或第二樣本中的一種或多種惡性腫瘤標誌物的相對量。所述算法鑑定第一質譜和第二質譜中的至少一個峰值。然後所述算法將質譜中的第一質譜的峰值信號強度和第二質譜的峰值信號強度相比較。相對的信號強度表示存在於第一和第二樣本中的惡性腫瘤標誌物的量。可以將包含已知量的惡性腫瘤標誌物的標準品作為第二樣本分析，以更好定量存在於第一樣本中的生物分子的量。在一些實施方式中，還可以測定第一和第二樣本中的惡性腫瘤標誌物的同一性。
[0156]標準值、特異性和靈敏性的測定
[0157]在本申請中，可以在統計學上測定惡性腫瘤標誌物的標準表達水平，如CXCL13的血液濃度。例如，可以測量健康個體中CXCL13的血液濃度以在統計學上確定CXCL13的標準血液濃度。當可以獲得統計學上足夠的群體時，距平均值的兩倍或三倍標準偏差(S.D.)的範圍內的值通常用作標準值。因此，對應於平均值+2 XS.D.或平均值+3 XS.D.的值可以用作標準值。所述標準值的設定理論上分別包括90%和99.7%的健康個體。
[0158]可選地，也可以基於惡性腫瘤患者中的實際表達水平(例如，CXCL13的血液濃度)設定標準值。一般來說，這樣設定的標準值能將假陽性的百分比減至最小，並在滿足可以最大限度地提高檢測靈敏性的條件的值的範圍中選擇。此處，假陽性的百分比是指在健康個體中CXCL13的血液濃度被判斷為高於標準值的患者的百分比。相反，在健康個體中，CXCL13的血液濃度被判斷為低於標準值的患者的百分比表明特異性。也就是說，假陽性的百分比和特異性的和始終為I。檢測靈敏性是指在已測定存在惡性腫瘤的個體人群中，所有惡性腫瘤患者中CXCL13的血液濃度被判斷為高於標準值的患者的百分比。
[0159]本文所用術語「測試靈敏性」是篩查測試的鑑定真正疾病的能力，其特徵在於高靈敏性的測試很少發生假陰性，而且測試獨立於疾病的流行性。測試靈敏性計算為真陽性測試/總體受影響的測試患者，表示為百分比。
[0160]術語「測試特異性」是沒有疾病時為正確陰性的篩查測試，其具有高特異性並很少出現假陽性，並且獨立於疾病的流行性。測試特異性計算為真陰性測試/不受影響的測試個體，表示為百分比。
[0161]術語「PPV」(陽性預測值)是陽性測試的患有疾病的患者百分比，並因此評價陽性測試的可靠性。計算:
[0162]1.PPV=(真陽性)/(真陽性+假陽性)。
[0163]術語「NPV」(陰性預測值)指陰性測試的沒有疾病的患者，並因此評價陰性測試的
可靠性。計算:
[0164]2.NPV=(真陰性)/(真陰性和假陰性)。
[0165]如上述關系所示，靈敏性、特異性、陽性預測值和陰性預測值的每個值是評價診斷準確性指標，其根據用於判斷CXCL13的血液濃度水平的標準值而變化。
[0166]通常設定的標準值能使假陽性比例較低並且靈敏性較高。然而，從上述關係也可以很明顯地看出，在假陽性比例和靈敏性之間需要權衡。也就是說，如果標準值降低，檢測靈敏性提高。然而，由於假陽性比例也增加，很難滿足具有「低假陽性比例」的條件。考慮到該情況，例如，給出以下預測結果的值可以選作本申請的優選標準值:(I)假陽性比例為50%以下的標準值(也就是說，特異性不低於50%的標準值)和(2)靈敏性不低於20%的標準值。
[0167]可以使用接收器工作特性(ROC)曲線來設定標準值。ROC曲線是示出垂直軸為檢測靈敏性、水平軸為假陽性比例(也就是說「1-特異性」)的圖。可以通過繪製靈敏性和假陽性比例的變化(在連續改變用來測定惡性腫瘤標誌物(如CXCL13)的血液濃度的高/低程度的標準值之後得到的)來獲得ROC曲線。
[0168]用於獲得ROC曲線的「標準值」是暫時用於統計分析的值。用於獲得ROC曲線的「標準值」通常可以在允許涵蓋所有可選擇的標準值的範圍內連續改變。例如，在被分析群體中，標準值可以在最小和最大的測量的血液CXCL13值之間變化。
[0169]基於所獲得的ROC曲線，本申請中要使用的優選的標準值可以從滿足上述條件的範圍中選擇。可選地，可以基於通過在包括大部分測量的血液CXCL13的範圍改變標準值而生成的ROC曲線來選擇標準值。
[0170]用於檢測惡性腫瘤或監測惡性腫瘤進展的試劑盒
[0171]本申請的另一方面涉及用於檢測惡性腫瘤或監測惡性腫瘤進展的試劑盒。在一個實施方式中，試劑盒包括用於測定生物樣本中CXCL13和/或CXCR5表達的試劑以及使用所述試劑的說明，其中所述試劑包括抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體或兩者。
[0172]使用抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體、抗CXCL16抗體和/或抗CXCR6抗體來治療或預防惡性腫瘤的方法
[0173]本發明的一個方面涉及使用抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體治療或預防惡性腫瘤的方法。所述方法包括對需要這種治療的個體給予治療有效量的抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體或它們的組合。在一個實施方式中，所述惡性腫瘤是黑素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、肉瘤、胚細胞瘤或癌。癌的實例包括但不限於，腺泡細胞癌、囊性腺樣癌、腺癌、腺鱗癌、腎上腺皮質腺瘤、腎上腺皮質癌、未分化癌、阿普多瘤(apudoma)、基底細胞癌、類癌、癌肉瘤、明細胞癌、圓柱瘤、囊腺癌、導管癌、胃泌素瘤、巨細胞癌、神經膠質瘤、胰高血糖素瘤、許特萊氏細胞腺癌、胰島瘤、大細胞癌、小葉癌、成神經管細胞瘤、髓樣癌、粘液腺囊腺瘤、粘液表皮樣癌、神經外胚層瘤、唾液腺嗜酸性粒細胞瘤、乳頭狀汗腺腺瘤、乳頭瘤、多形性癌、肺母細胞瘤、肉瘤樣的瘤、漿液性囊腺瘤、印戒細胞癌、小細胞癌、生長激素抑制素瘤、梭形細胞癌、鱗狀細胞癌、胸腺瘤、疣狀癌、以及來自於內胚層、外胚層或上皮細胞的位於機體的內或外表面排列器官或組織的癌。這些器官或組織包括但不限於:骨、乳房、中樞神經系統、子宮頸、結腸、子宮內膜、食道、法婁皮歐氏管、胃腸道、腎臟、肺、淋巴、乳腺、口腔、卵巢、胰臟、腦下垂體、前列腺、直腸、生殖道、呼吸道、胃、汗腺、胸腺、甲狀腺、子宮、陰道。
[0174]在另一實施方式中，個體被診斷患有導致惡性腫瘤細胞中CXCL13和/或CXCR5的表達升高的惡性腫瘤。這種惡性腫瘤的實例包括但不限於，黑素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、肉瘤、胚細胞瘤和癌。在一個實施方式中，個體被診斷患有腦癌。在另一實施方式中，個體被診斷患有前列腺癌。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白質、肽或編碼基因)來免疫個體，從而誘導能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體。在另一實施方式中，個體被診斷患有骨癌。在另一實施方式中，個體被診斷患有垂體癌。在又一實施方式中，個體被診斷患有卵巢癌。在另一實施方式中，個體被診斷患有肺癌。在另一實施方式中，個體被診斷患有乳腺癌。在另一實施方式中，個體被診斷患有結腸癌。在另一實施方式中，個體被診斷患有淋巴瘤或骨髓瘤。在另一實施方式中，個體被診斷患有白血病。
[0175]在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:用有效量的CXCL16和/或CXCR6免疫原(如蛋白質、肽或編碼基因)來免疫個體，從而誘導能抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的抗體。
[0176]在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:用有效量的CXCL13和CXCR5免疫原中的一種或多種和有效量的CXCL16和CXCR6中的一種或多種免疫原來免疫個體。[0177]本發明的另一方面涉及通過使用抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體治療需要治療的個體來抑制或防止惡性腫瘤轉移的方法。在一個實施方式中，抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體抑制或防止惡性腫瘤對組織的侵襲。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白質、肽或編碼基因)來免疫個體，從而誘導能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體。在一些實施方式中，所述惡性腫瘤為前列腺癌。在其他實施方式中，所述惡性腫瘤為黑素瘤。在一些實施方式中，所述組織為骨。
[0178]本發明的另一方面涉及使用抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體來治療需要治療的個體從而使已有的腫瘤消退的方法。在一些實施方式中，所述方法包括以下步驟:用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白質、肽或編碼基因)來免疫個體，從而誘導能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體。在【具體實施方式】中，已有的腫瘤為晚期腫瘤。在一些實施方式中，已有的腫瘤為轉移性腫瘤。
[0179]本發明的另一方面涉及使用抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體來治療需要治療的個體從而防止或抑制骨中腫瘤溶骨性生長的方法。在一些實施方式中，所述方法包括以下步驟:用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白質、肽或編碼基因)來免疫個體，從而誘導能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體。在一些其他實施方式中，所述腫瘤為黑素瘤、淋巴瘤、肉瘤、胚細胞瘤或癌。在一些實施方式中，所述腫瘤為癌。在【具體實施方式】中，所述腫瘤為前列腺癌。在一些實施方式中，用抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體的治療防止了腫瘤造成的骨質溶解或骨吸收。
[0180]在另一實施方式中，所述方法進一步包括測定來自個體的組織中CXCL13和/或CXCR5的表達水平，並且，如果檢測到CXCL13和/或CXCR5的水平升高，則向個體給予治療有效量的抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體或它們的組合。在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原(如蛋白質、肽或編碼基因)來免疫個體，從而誘導能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體。
[0181]本發明優選的抗體為能結合人CXCL13並且優選(部分或全部)阻斷CXCL13與受體結合能力的抗體，所述受體包括但不限於CXCR5。本發明另一優選的抗體為能結合人CXCR5並且優選(部分或全部)阻斷在其表面表達CXCR5趨化因子受體的細胞(如腫瘤細胞或癌細胞)結合配體能力的抗體，所述配體包括但不限於CXCL13。本發明又一優選的抗體為能結合人CXCR5並優選(部分或全部)阻斷可溶CXCR5趨化因子受體結合配體的能力，所述配體包括但不限於CXCL13。
[0182]在一個實施方式中，抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體為單克隆抗體。在另一實施方式中，抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體為人源化抗體。在另一實施方式中，抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體為人源化抗體片段。
[0183]在本發明的【具體實施方式】中，在用抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體治療個體之前、同時或之後，聯合使用治療有效量的至少一種對另一抗原有特異性的其他抗體治療個體。在一個實施方式中，所述另一抗原為另一種趨化因子或趨化因子受體，如CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLIO、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CXCL15、CXCL16，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCLl1、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25—1、CCL25—2、CCL27、CCL28、CCRl、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRlO、CCRl 1、XCLl、XCL2、XCRl、CX3CR1 或CX3CL1。
[0184]在另一實施方式中，另一抗原為與癌有關的趨化因子或趨化因子受體，並選自:CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CXCL16、CCR2、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR6、CXCR7、CX3CL1 和 CX3CR1。
[0185]在另一實施方式中，另一抗原為與黑素瘤有關的趨化因子或趨化因子受體，並選自:CCL25、CCL27、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2, CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR9、CCR10、CXCRl、CXCR2、CXCR4、CXCR6、CXCR7 和 CX3CR1。
[0186]在另一實施方式中，另一抗原為與淋巴瘤有關的趨化因子或趨化因子受體，並選自 CXCLl2、CXCR4、CXCR7、CCR2。
[0187]在另一實施方式中，另一抗原為與骨髓瘤或白血病有關的趨化因子或趨化因子受體。
[0188]在另一實施方式中，所述另一抗原選自表1和/或表2所示的多肽，以及任意上述多肽的片段。
[0189]其他示例性抗原包括諸如腎素的分子；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；a-l_抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；前胰島素；促卵泡激素；降鈣素；促黃體素；高血糖素；凝血因子，如因子VII1、因子IX、組織因子和血友病 因子(von Willebrands factor);抗凝血因子,如蛋白質C ;心房鈉尿因子；肺表面活性物質；纖溶酶原活化因子，如尿激酶或人尿或或組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA);蛙皮素；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子a和P ;腦啡肽酶；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒管抑制物質(Muellerian-1nhibitingsubstance);鬆弛素A鏈；鬆弛素B鏈；鬆弛素原(prorelaxin);小鼠促性腺素相關肽；微生物蛋白，如P -內醯胺酶；DNA酶；IgE ;細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(CTLA)，如CTLA-4 ;抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF);激素或生長因子受體；蛋白質A或D ;類風溼因子；神經營養因子，如骨來源的神經營養因子(BDNF)、神經營養因子3、4、5或6 (NT_3、NT4、NT-5或NT-6)，或如NGF-P的神經生長因子；血小板來源的生長因子(TOGF);成纖維細胞生長因子，如aFGF和bFGF ;表皮生長因子(EGF) ；ErbB受體家族成員，如EGF受體；轉化生長因子(TGF)，如TGF- a 和 TGF- ^，包括 TGF- ^ 1、TGF- ^ 2、TGF- ^ 3、TGF- P 4 或 TGF- ^ 5 ;胰島素樣生長因子I和IUIGF-1和IGF-1I) ;des (1-3)-1GF-1 (腦IGF-1)、胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白，如⑶3、⑶4、⑶8、⑶19、⑶20和⑶34 ;促紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP);幹擾素，如幹擾素a和Y ;集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和 G-CSF ;白細胞介素(IL)，例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9 和/或IL-10 ;過氧化物歧化酶^細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；運輸蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；a v/ @ 3整聯蛋白，包括其a或b亞基，如⑶I la、⑶I lb、⑶11c、⑶18、ICAM、VLA-4和VCAM ;前列腺特異性抗原(PSA);腫瘤相關抗原，如癌胚抗原(CEA)、CK2、CA125、TA90、HER2、HER3或HER4受體；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體;mpl受體；CTLA-4;蛋白質C ;來自經典、凝集素或旁路補體途徑的任何一種蛋白質；以及任意上述多肽的片段。[0190]可以用已知的方法對個體給予抗體，例如作為彈丸注射或一段時間的連續輸注的靜脈給藥，通過肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口腔、局部或吸入途徑給藥。在一些實施方式中，將抗體直接給藥至腫瘤或惡性腫瘤組織，包括在侵襲期間直接給藥至瘤床。也可以將抗體置於如海綿或紗布的固體載體上，用於給藥抵禦靶趨化因子影響組織。
[0191]本發明的抗體可以在通常所接受的藥學上可接受載體中給藥。可接受的載體包括但不限於，鹽水，緩衝鹽水和葡萄糖鹽水。固體載體、脂質體、納米顆粒、微顆粒、納米球或微球也可以用作抗體給藥的載體。
[0192]抗體的合適劑量(「治療有效量」)取決於例如待治療的疾病狀態，疾病狀態的嚴重程度和過程，抗體給藥是預防還是治療目的，先前的治療，患者的臨床史和對抗體的反應，所用抗體的類型和主治醫師的判斷。抗體適合對患者一次給藥或者在一系列的治療中給藥，並且可以在診斷起的任何時間對患者給藥。抗體可以作為唯一的治療進行給藥或與治療目標疾病狀態中有用的其他藥物或治療聯合給藥。
[0193]作為一般的建議,不論一次或多次給藥,給藥抗體的治療有效量為約lng/kg體重/天至約100mg/kg體重/天。在【具體實施方式】中，抗體的給藥範圍為約lng/kg體重/天至約I P g/kg體重/天、lng/kg體重/天至約100ng/kg體重/天、lng/kg體重/天至約10ng/kg體重/天、10ng/kg體重/天至約I μ g/kg體重/天、10ng/kg體重/天至約IOOng/kg體重/天、100ng/kg體重/天至約I μ g/kg體重/天、100ng/kg體重/天至約10 μ g/kg體重/天、I μ g/kg體重/天至約10 μ g/kg體重/天、I μ g/kg體重/天至約100 μ g/kg體重/天、10 μ g/kg體重/天至約100 μ g/kg體重/天、10 μ g/kg體重/天至約lmg/kg體重/天、100 μ g/kg體重/天至約10mg/kg體重/天、lmg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天和10mg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天。
[0194]在另一實施方式中，抗體的給藥劑量範圍為每次注射Ing至10ng、每次注射IOng至100ng、每次注射IOOng至I μ g、每次注射I μ g至10 μ g、每次注射10 μ g至100 μ g、每次注射100 μ g至lmg、每次注射Img至10mg、每次注射IOmg至IOOmg和每次注射IOOmg至IOOOmg0抗體可以每天注射，或每2、3、4、5、6或7天或每1、2、3或4周注射。
[0195]在另一【具體實施方式】中，抗體的給藥劑量範圍為約lng/kg至約100mg/kg。在又一實施方式中，抗體的給藥範圍為約lng/kg至約10ng/kg、約10ng/kg至約100ng/kg、約100ng/kg 至約 I μ g/kg、約 I μ g/kg 至約 10 μ g/kg、約 10 μ g/kg 至約 100 μ g/kg、約 100 μ g/kg 至約 lmg/kg、約 lmg/kg 至約 10mg/kg、約 10mg/kg 至約 100mg/kg、約 0.5mg/kg 至約 30mg/kg 和約 lmg/kg 至約 15mg/kg。
[0196]在其他實施方式中，抗體的給藥量為0.0006,0.001,0.003,0.006,0.01,0.03、0.06、0.1、0.3、0.6、1、3、6、10、30、60、100、300、600 和 IOOOmg/ 天，或約 0.0006、0.001、0.003,0.006,0.01,0.03,0.06,0.1,0.3,0.6、1、3、6、10、30、60、100、300、600 和 IOOOmg/
天。正如所期望的，劑量會取決於患者的疾病狀態、體型、年齡和疾病狀態。
[0197]視情況或根據指示，可以通過彈丸注射或連續輸注給予單一劑量的抗體，或者可以通過彈丸注射或連續輸注給予多劑量的抗體。可以例如每天多次、每日一次、每2、3、4、5、6或7天、每周、每2、3、4、5或6周或每月給予多劑量。然而，也可以使用其他劑量方案。可以通過常規技術容易地監測治療的過程。[0198]在本發明的【具體實施方式】中，可以將治療有效量的抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體作為唯一的治療劑給予有需要的個體。在一個【具體實施方式】中，治療有效量的抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體殺傷腫瘤或惡性腫瘤細胞或促進腫瘤或癌細胞的凋亡。在另一【具體實施方式】中，治療有效量的抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體抑制或防止腫瘤或癌的生成。在另一【具體實施方式】中，治療有效量的抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體抑制或防止腫瘤或癌細胞從現有的腫瘤或癌遷移或轉移。在又一【具體實施方式】中，治療有效量的抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體抑制或防止腫瘤或癌對非癌性組織的侵入。
[0199]在本發明【具體實施方式】中，可以將治療有效量的抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體與一種或多種另外的治療有效的抗體對有需要的個體聯合給藥。所述一種或多種另外的治療有效量的抗體可靶向CXCL13和/或CXCR5上的其他決定簇、其他趨化因子、其他趨化因子受體、其他可溶性或細胞表面配體或受體(包括但不限於，腫瘤或癌特異性抗原、病毒、細菌或寄生蟲抗原、惡性腫瘤細胞的產物或凋亡的殘餘物)。抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體可以在給予一種或多種另外的治療有效的抗體之前、同時和/或之後進行給藥。
[0200]在【具體實施方式】中，治療有效量的抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體增強一種或多種另外的治療有效的抗體在殺傷腫瘤或癌細胞中的功效。在更具體的實施方式中，治療有效量的抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體減少殺傷腫瘤或癌細胞需要的一種或多種另外的治療有效量的抗體的量。在另一【具體實施方式】中，治療有效量的抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體抑制或防止腫瘤或癌細胞從已有的腫瘤或癌遷移或轉移，從而增強了一種或多種另外的治療有效的抗體在殺傷腫瘤或癌細胞中的局部功效。在又一【具體實施方式】中，治療有效量的抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體抑制或防止腫瘤或癌細胞對非癌性組織的侵入，從而增強了一種或多種另外的治療有效的抗體在殺傷腫瘤或癌細胞中的局部功效。
[0201]在另一實施方式中，抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體是與細胞毒性劑綴合的抗體。在另一實施方式中，抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體與另一種抗惡性腫瘤劑(如化療劑)共同給藥。
[0202]本發明的另一方面涉及抑制趨化因子CXCL13與其受體相互作用的方法，包括使細胞與有效量的能與哺乳動物CXCL13或CXCL13的一部分結合的抗體或其功能片段接觸。
[0203]本發明的另一方面涉及抑制細胞攜帶的CXCR5與其配體相互作用的方法，包括使細胞與有效量的能與哺乳動物CXCR5或CXCR5的一部分結合的抗體或其功能片段接觸。
[0204]在另一實施方式中，治療惡性腫瘤的方法包括對需要這種治療的個體給予有效量的表達載體，所述表達載體能在惡性腫瘤細胞或惡性細胞中表達抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體或它們的組合。在另一實施方式中，治療惡性腫瘤的方法包括下步驟:用有效量的CXCL13和/或CXCR5免疫原來免疫個體，從而誘導宿主產生能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體。
[0205]表達載體可以是能夠將編碼抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體的核苷酸遞送至靶細胞中並在靶細胞中表達抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體的任何載體。在另一實施方式中，表達載體能夠將編碼CXCL13和/或CXCR6的核苷酸遞送至靶細胞中，從而誘導宿主產生抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體。表達載體的實例包括病毒載體和非病毒載體。
[0206]病毒載體包括但不限於，反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體和其他大容量病毒載體，如皰疫病毒和牛痘病毒。也包括共同具有這些病毒的特性的任何病毒家族，所述特性使得它們適合用作表達載體。
[0207]逆轉錄病毒載體
[0208]逆轉錄病毒是屬於逆轉錄病毒科的病毒家族的動物病毒，包括任何類型、亞家族、屬或嗜性。使用反轉錄病毒載體進行基因治療的方法的實例在美國專利號4，868，116和4,980，286 ；PCT 申請 W090/02806 和 W089/07136 ;以及 Mulligan, (Science260:926-932 (1993))中有描述；將其教導的內容通過引用合併於本申請。
[0209]腺病毒載體
[0210]重組腺病毒載體已被證實在直接體內遞送至氣道上皮、肝細胞、血管內皮、CNS實質和許多其他組織位點之後能實現高效的基因轉移。重組腺病毒載體通過以下方式實現基因轉導:結合特定細胞表面，然後，通過受體介導的胞吞作用將病毒內化，這與野生型或複製缺陷型腺病毒的方式相同。
[0211]病毒載體可以是基於腺病毒的載體，其中一個或多個病毒基因被去除，並且這些病毒體在補體細胞系中產生，如人293細胞系。在一個實施方式中，El基因從腺病毒載體中去除。在另一實施方式中，El和E3基因都從腺病毒載體中去除。在另一實施方式中，El和E4基因都從腺病毒載體中去除。在另一實施方式中，所述腺病毒載體為裸腺病毒載體(gutless adenovirus vector)。
[0212]腺相關病毒載體
[0213]另一類病毒載體是基於腺相關病毒載體(AAV)。該缺陷的細小病毒為優選載體,因為它可以感染很多類型的細胞並且對人不致病。AAV型載體可以運輸約4_5kb，已知野生型AAV可穩定地插入染色體19。包含該位點特異性整合性質的載體是優選的。這種類型的載體的特別優選的實施方式為Avigen, San Francisco, CA生產的P4.1C載體,其能夠含有單純皰疹病毒胸苷激酶基因、HSV-tk和/或標記基因，如編碼綠色螢光蛋白GFP的基因。
[0214]在另一類AAV病毒中，AAV包含一對反向末端重複(ITR)，其位於至少一個含有啟動子的盒的側翼，所述啟動子指導細胞特異性表達並可操作地連接於異源基因。在此處，異源指任何對AAV或B19細小病毒而言並非天然的核苷酸序列或基因。
[0215]通常AAV和B19編碼區已被缺失，由此得到安全、無細胞毒性的載體。AAV ITR或其修飾提供感染性和位點特異性整合，但無細胞毒性，並且啟動子指導細胞特異性表達。對於AAV載體的相關材料，將美國專利號6，261，834通過引用合併入本文。
[0216]大的負載病毒載體
[0217]利用大的人皰疹病毒的分子遺傳學實驗提供了在允許皰疹病毒感染細胞中克隆、增殖並建立大的異源DNA片段的手段(Sun等,Nature genetics8:33-41，1994; Cotter andRobertson, Curr Opin Mol Ther5:633-644，1999)。這些大的 DNA病毒(單純皰疹病毒(HSV)和EB病毒(EBV))具有將大於150kb的人異源DNA片段遞送至特定細胞的潛能。EBV重組子可以在感染的B細胞中以游離DNA的方式維持大段DNA。攜帶高達330kb的人類基因組插入物的各個克隆表現出遺傳穩定性。這些游離體的維持需要特定EBV核蛋白EBNAl，其在EBV感染期間組成型表達。另外，這些載體可以用於轉染，可以在體外短暫地生成大量蛋白質。皰疹病毒擴增系統也可以用於包裝大於220kb的DNA片段並感染能夠穩定以游離體形式維持DNA的細胞。其他有用的系統包括例如複製受限的和宿主受限的非複製牛痘病毒載體。
[0218]非病毒載體包括質粒表達載體。質粒載體通常包括環形雙鏈DNA環，另外的DNA片段可以插入其中。
[0219]在病毒和非病毒表達載體中，編碼抗體的多核苷酸通常被置於用於指導mRNA合成的合適的轉錄調控序列(啟動子和任選的一種或多種增強子)附近並且設定方向。也就是說，目的多核苷酸序列可操作地連接於合適的轉錄調控序列。啟動子的實例包括:病毒啟動子，如CMV的立即早期啟動子、LTR或SV40啟動子、杆狀病毒的多面啟動子、大腸桿菌(E.coli)lac或trp啟動子、噬菌體T7和λ PL啟動子，以及其他已知能控制真核細胞或它們的病毒中的基因表達的啟動子。啟動子可以是組織特異性啟動子。
[0220]表達載體通常還包含用於翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄終止子。載體任選地包括用於擴增表達的合適序列。另外，表達載體任選地包括一種或多種選擇標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型形狀，例如，對於真核細胞培養為二氫葉酸還原酶或對新黴素的抗性，或者例如，對於大腸桿菌為對四環素或氨苄青黴素的抗性。
[0221]表達載體也可以包括另外的表達元件，例如，為了提高翻譯效率。這些信號可以包括，例如ATG起始密碼子和相鄰序列。在一些情況中，例如，翻譯起始密碼子和相關序列元件與目的多核苷酸序列(例如天然起始密碼子)被同時插入至合適的表達載體。在這種情況下，不需要另外的翻譯調控信號。然而，在僅插入多肽編碼序列或其一部分的情況下，則要提供外源翻譯調控信號，包括ATG起始密碼子。將起始密碼子置於正確的閱讀框內，以確保目的多核苷酸序列的翻譯。外源轉錄元件和起始密碼子可以是多種來源的，天然的和合成的均可。如果需要，可以通過包含適於使用的細胞系統的增強子來進一步提高表達效率(Scharf 等(1994)Results Probl Cell Differ20:125-62;Bitter 等(1987)Methods inEnzymoII53:516-544)o
[0222]在一個實施方式中，表達載體包含可誘導的或可調節的表達系統。可調節的表達系統的實例簡要描述如下:
[0223]蛻皮激素系統。蛻皮激素系統是基於果蠅中發現的蛻皮誘導系統，但是為了哺乳動物細胞的誘導型表達做了修飾。所述系統使用果蠅類固醇激素蛻皮激素類似物米樂甾酮ACmuristerone A)，通過異源二聚體細胞核受體來激活目的基因的表達。已報導的表達水平超出基礎水平的200倍，並且對哺乳動物細胞生理沒有影響。
[0224]孕酮系統。孕酮受體通常被刺激而與特定DNA序列結合併通過與其激素配體相互作用來激活轉錄。相反地，孕酮拮抗劑米非司酮(RU486)能夠阻斷激素誘導的核轉運和隨後的DNA結合。已經產生了孕酮受體的突變體形式，其可以被刺激而通過與RU486的相互作用進行結合。為了生成特異性的可調節的轉錄因子，孕酮受體的RU486結合結構域已與酵母轉錄因子GAL4的DNA結合結構域和HSV蛋白質VP16的反式激活結構域融合。在缺少RU486時，嵌合因子是無活性的。然而，添加激素誘導嵌合蛋白的構象變化，並且這種變化實現與GAL4結合位點結合併由包含GAL4結合位點的啟動子激活轉錄。
[0225]雷帕黴素系統。如FK506和雷帕黴素的免疫抑制劑通過結合特定細胞蛋白並促進它們的二聚體形成而發揮作用。例如，雷帕黴素與FK506結合蛋白(FKBP)的結合導致了其與另一雷帕黴素結合蛋白FRAP的異二聚體形成(可以通過移除藥物而逆轉)。通過加入藥物使兩種蛋白質合在一起的能力加強了對多種生物過程(包括轉錄)的調節。嵌合的DNA結合結構域已與FKBP融合,這使得融合蛋白能與特定DNA結合序列結合。轉錄激活結構域也已與FRAP融合。當這兩個融合蛋白在相同細胞中共表達時，可以通過添加雷帕黴素、通過異二聚體形成來介導全功能轉錄因子的形成。然後二聚化的嵌合轉錄因子可以結合包含合成的DNA結合序列拷貝的合成啟動子序列。該系統已被成功整合進腺病毒和AAV載體。已在小鼠和狒狒中實現了長期的可調控基因表達。
[0226]利用能抑制CXCL13或CXCR5表達或活性的物質治療或預防惡性腫瘤的方法
[0227]本發明的另一方面涉及通過使用能抑制CXCL13或CXCR5表達或活性的物質來治療或預防惡性腫瘤的方法。在另一實施方式中，所述方法包括對需要這種治療的個體給予有效量的表達載體，該表達載體表達(I)能抑制CXCL13和/或CXCR5的表達的物質，或者(2)能抑制CXCL13和CXCR5之間相互作用的物質，或者(3)能抑制CXCL13和/或CXCR5生物活性的物質。在一個實施方式中，CXCL13和CXCR5的生物活性包括CXCL13和CXCR5之間的相互作用。
[0228]在另一實施方式中，個體被診斷患有導致惡性腫瘤細胞中CXCL13和/或CXCR5表達升高的惡性腫瘤。這種惡性腫瘤的實例包括但不限於黑素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病和癌，如卵巢癌、陰道癌、子宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌、胰島瘤、胰高血糖素瘤、腺癌、腺鱗癌、神經內分泌腫瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、腦癌、成神經管細胞瘤、神經外胚層瘤、膠質瘤、垂體癌和骨癌。
[0229]在另一實施方式中，所述方法進一步包括測定來自個體的組織中CXCL13和/或CXCR5的表達水平，並且，如果在所述組織中檢測到CXCL13和/或CXCR5的水平升高，向個體給予所述物質。
[0230]在一個實施方式中，表達載體為病毒載體。在另一實施方式中，表達載體為非載體載體。在另一實施方式中，表達載體能夠將編碼CXCL13和/或CXCR5的核苷酸遞送至靶細胞，從而誘導宿主產生抗CXCL13和/或CXCR5抗體。
[0231]在另一實施方式中，所述物質為抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體或它們的組合。
[0232]在又一實施方式中，所述物質為功能核酸。功能核酸是具有具體功能的核酸分子，如結合靶分子或催化具體反應。功能核酸分子可以用作靶分子具有的具體活性的抑制劑。功能核酸分子可以與任何的大分子(如DNA、RNA和多肽)相互作用。因此，功能核酸可以與CXCL13或CXCR5的mRNA或基因組DNA相互作用，從而抑制CXCL13或CXCR5蛋白質的表達或CXCL13與CXCR5蛋白質的相互作用，進而抑制活性。通常，功能核酸被設計為能基於靶分子和功能核酸分子之間的序列同源性與其他核酸相互作用。在其他情況下，功能核酸分子和靶分子之間的特異性識別不是基於功能核酸分子和靶分子之間的序列同源性，而是基於允許發生特異性識別的三級結構的形成。功能核酸分子的實例包括SiRNA、反義分子、適體、核酶、三鏈形成分子和外部指導序列。
[0233]SiRNA參與RNA幹擾(RNAi)，其包括兩步機制:起始步驟和效應步驟。在第一步中，輸入的雙鏈(ds)RNA(siRNA)被加工成小片段，如21-23個核苷酸的『指導序列』。RNA擴增在整個動物中發生。然後，通常，指導RNA可以被併入能夠降解RNA的蛋白RNA複合物中，即核酸酶複合物，其被稱為RNA誘導的沉默複合物(RISC)。RISC複合物在第二效應步驟中發揮作用，破壞由指導RNA通過鹼基配對的相互作用識別的mRNA。RNA i涉及通過任何方式將雙鏈RNA引入細胞，觸發引起靶RNA降解的事件。RNA i是轉錄後基因沉默的形式。除本文所公開的SiRNA以外，還公開了在RNAi中發揮作用的RNA髮夾。關於製備和使用RNAi分子的描述，參見例如Hammond等，Nature RevGen2:110-119(2001);Sharp, Genes Devl5:485-490(2001), Waterhouse 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95 (23): 13959-13964 (1998)，通過引用將所有這些文獻全部併入本文，並且至少形成關於遞送和製備RNAi分子的材料。
[0234]RNAi已被證實能在很多類型的細胞中發揮作用，包括哺乳動物細胞。關於在哺乳動物細胞中的作用，優選的是用作RISC複合物中的靶序列的RNA分子較短。例如，長度小於或等於 50 或 40 或 30 或 29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、13、11或10個核苷酸。這些RNA分子也可以在相對於待切割的靶RNA的3』或5』端具有懸突。這些懸突的長度可以至少或小於或等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個核苷酸。
[0235]反義分子被設計為能與靶核酸分子通過典型或非典型鹼基配對而相互作用。反義分子和靶分子的相互作用被設計為能通過例如RNAseH介導的RNA-DNA雜合體降解來促進破壞靶分子的破壞。可選地，反義分子被設計為能中斷通常發生於靶分子的加工過程，如轉錄或複製。可以基於靶分子的序列而設計反義分子。存在很多通過尋找靶分子最易接近的區域來優化反義效率的方法。示例性方法是體外選擇實驗和使用DMS和DEPC的DNA修飾研究。優選地，反義分子結合靶分子的解離常數(kd)小於或等於10-6、10-8、10-10或10-12。幫助設計和使用反義分子的方法和技術的代表性實例可以在以下非限制性美國專利列表中找出:5，135，917,5, 994，320,6, 046，319 和 6，057，437。
[0236]適體是優選以特定方式與靶分子相互作用的分子。通常，適體是長度為15-50個鹼基的小核酸，其摺疊成規定的如莖-環或G-四聯體的二級或三級結構。適體可以結合趨化因子並阻 斷其功能(參見例如，Marro等，Biochem Biophys ResCommun.20060ctl3; 349:270-6)。適體可以與靶分子以小於IO-12M的kds緊密結合。優選地，適體與靶分子結合的^小於10_6、10_8、10_1(1或10_12。適體可以與靶分子以非常高的特異性結合。例如，已分離出能在靶分子和區別僅在於分子上的單個位置的另一分子之間的結合親和力中具有大於10000倍的差異的適體(美國專利5，543，293)。優選地，適體與靶分子的kd至少低於與背景結合分子的kd的10、100、1000、10，000或100，000倍。如何製備和使用適體來結合多種不同的靶分子的代表性實例可以在以下美國專利的非限制性列表中找出:5，476，766,5, 861，254,6, 030，776 和 6，051，698。
[0237]核酶是能夠催化分子內或分子間的化學反應的核酸分子。因此核酶是催化性核酸。優選的是核酶能催化分子間反應。在自然系統中發現很多不同類型的核酶，其催化基於核酶的核酸酶或核酸聚合酶類型的反應，如錘頭狀核酶(參見，例如美國專利:5，334，711和5，861，288、W09858058和W09718312)、髮夾結構核酶(參見，例如美國專利:5，631，115和6，022，962)以及四膜蟲核酶(參見，例如美國專利5，595，873和5，652，107)。也有很多核酶不存在於自然系統中，它們是從頭工程化製備來催化特定反應(參見，例如美國專利:5，580, 967和5，910, 408)。優選的核酶能切割RNA或DNA底物，並且更優選能切割RNA底物。核酶通常通過識別和結合靶底物並隨後切割來切割核酸底物。該識別通常主要基於典型或非典型的鹼基對相互作用。該特性使得核酶能更好地成為核酸的靶向特異性切割的候選，因為靶底物的識別是基於靶底物的序列。如何製備和使用核酶來催化多種不同的反應的代表性實例可以在以下美國專利中找出:5, 646，042,5, 869，253,5, 989，906和6，017，756。[0238]三鏈形成功能核酸分子是可以與雙鏈或單鏈核酸相互作用的分子。當三鏈分子與革巴區域相互作用時，形成稱為三鏈的結構，其中DNA的三條鏈形成了依賴於Watson-Crick和Hoogsteen鹼基配對的複合物。三鏈分子是優選的，因為它們可以以高親和力和特異性結合靶區域。優選的是三鏈形成分子結合靶分子的kd小於10-6、10-8、10-10或10-12。如何製備和使用三鏈形成分子來結合多種不同的靶分子的代表性實例可以在以下美國專利中找出:5，176，996,5, 683，874,5, 874，566 和 5，962，426。
[0239]外部指導序列(EGS)是能結合靶核酸分子而形成複合物的分子，該複合物由能切割靶分子的RNA酶P識別。EGS可以被設計為能特異性地靶向選擇的RNA分子。RNA酶P幫助加工細胞內的RNA轉運(tRNA)。通過使用使靶RNA = EGS複合物模擬天然tRNA底物的EGS,細菌RNA酶P可以被動員來切割幾乎任何RNA序列(參見，例如Yale的W092/03566和Forster and Altman, Science238:407-409(1990))。
[0240]相似地，真核EGS/RNA酶P指導的RNA切割可以用來切割真核細胞內所期望的靶標(Yuan 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:8006-8010(1992);Yale 的 W093/22434;Yale的 W095/24489;Yuan 和 Altman, EMBO J14:159-168 (1995)，和 Carrara 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92:2627-2631 (1995))。如何製備和使用EGS分子來促進切割多種不同的靶分子的代表性實例可以在以下美國專利的非限制性列表中找出:5，168，053、5，624，824、5，683，873,5, 728，521,5, 869，248 和 5，877，162。
[0241]防止或抑制具有升高表達的CXCL13和/或CXCR5的惡性腫瘤細胞的遷移或轉移的方法
[0242]本發明的另一方面涉及防止或抑制個體中具有升高表達的CXCL13和/或CXCR5的惡性腫瘤細胞的遷移或轉移的方法。
[0243]在一個實施方式中,所述方法包括對個體給予治療有效量的抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合。
[0244]在另一實施方式中，所述方法包括以下步驟:對個體給予在所述個體中能表達抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合的表達載體。
[0245]在另一實施方式中，所述方法包括對個體給予表達載體，該表達載體表達能夠抑制CXCL13或CXCR5的表達、或者CXCL13或CXCR5的生物活性、或者CXCL13和CXCR5之間相互作用的物質。在一個實施方式中，所述表達載體能夠將編碼CXCL13和/或CXCR5的核苷酸遞送至靶細胞中，從而誘導宿主產生抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體。
[0246]可以使用本領域已知方法來測定CXCL13和/或CXCR5在惡性腫瘤細胞中的表達，如免疫染色或定量PCR。已知過表達CXCL13和/或CXCR5的惡性腫瘤細胞包括但不限於黑素瘤細胞和癌細胞。癌的實例包括但不限於卵巢癌、陰道癌、子宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌、胰島瘤、腺癌、腺鱗癌、神經內分泌腫瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、腦癌、成神經管細胞瘤、神經外胚層瘤、膠質瘤、垂體癌和骨癌。
[0247]在一個實施方式中，惡性腫瘤細胞是腦癌細胞。在另一實施方式中，惡性腫瘤細胞是骨癌細胞。在另一實施方式中，惡性腫瘤細胞是垂體癌細胞。在又一實施方式中，惡性腫瘤細胞是卵巢癌細胞。
[0248]增強化療效果的方法
[0249]本發明的另一方面涉及增強化療效果的方法。在一個實施方式中，所述方法包括對進行惡性腫瘤化療的個體給予有效量的抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合。
[0250]在另一實施方式中，所述方法包括對進行惡性腫瘤化療的個體給予有效量的表達抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合的表達載體。
[0251]在另一實施方式中，所述方法包括對進行惡性腫瘤化療的個體給予表達載體，該表達載體表達能夠抑制CXCL13或CXCR5的表達、或者CXCL13或CXCR5的生物活性、或者CXCL13和CXCR5之間相互作用的物質。在另一實施方式中，所述表達載體能夠將編碼CXCL13和/或CXCR5的核苷酸遞送至靶細胞中，從而誘導宿主產生抗CXCL13抗體和/或抗CXCR5抗體。
[0252]在一個實施方式中，所述患者進行黑素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病或癌的化療。在另一實施方式中，所述患者進行腦癌的化療。在另一實施方式中，所述患者進行骨癌的化療。在另一實施方式中，所述患者進行垂體癌的化療。在又一實施方式中，所述患者進行卵巢癌的化療。
[0253]用於治療或預防惡性腫瘤的組合物和試劑盒
[0254]本發明的另一方面涉及用於治療或預防惡性腫瘤的組合物和試劑盒。在一個實施方式中，組合物包括(I)抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體或它們的組合，和(2)藥學上可接受載體。在另一實施方式中，組合物包括(I)攜帶抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體或它們的組合的編碼序列的表達載體，和(2)藥學上可接受載體。在另一實施方式中，組合物包括(I)攜帶能抑制CXCL13或CXCR5的表達、或者CXCL13或CXCR5的生物活性、或者CXCL13和CXCR5之間相互作用的物質的編碼序列的表達載體，和(2)藥學上可接受載體。
[0255]本發明的組合物可以包含單一類型的抗體，如單獨的抗CXCL13抗體或抗CXCR5抗體，或者兩種類型的抗體。對於所治療的具體適應症，有必要時，組合物還可以包含治療有效量的上文所述的一種或多種另外的抗原的特異性抗體，優選互補活性不會產生相互不利影響的抗體。例如，當治療中的癌為卵巢癌時，製備包含抗CXCL13和/或抗CXCR5和一種或多種另外的抗癌決定簇抗體(如單一製劑中的抗CEA、抗CA125和/或抗TA90)的治療製劑是可取的。在本發明的一些實施方式中，治療抗體可以與化療劑或細胞毒性劑聯合。在本發明的其他實施方式中，治療抗體可以與抗炎劑或血栓溶解劑聯合。這些試劑適合以對預期目的有效的量進行聯合使用。
[0256]本文所用的語言「藥學上可接受載體」旨在包括與藥學給藥相容的任何和所有溶劑、增溶劑、填充劑、穩定劑、粘合劑、吸收劑、鹼、緩衝劑、潤滑劑、控釋介質、稀釋劑、乳化齊?、潤溼劑、潤滑劑、分散介質、包衣、抗菌或抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。用於藥學活性物質的介質和試劑的使用在本領域是眾所周知的。除非是任何與活性化合物不相容的常規介質或試劑，否則其在組合物中的使用都是要考慮的。補充劑也可以摻入組合物中。在一些實施方式中，藥學可接受載體包括血清白蛋白。
[0257]本發明的藥學組合物被配製為符合其預定的給藥途徑。給藥途徑的實例包括腸胃外，例如鞘內、動脈內、靜脈內、皮內、皮下、口服、經皮(局部的)和跨黏膜給藥。在一些實施方式中，將藥學組合物直接給藥至腫瘤組織。
[0258]腸胃外、皮內或皮下應用的溶液或懸浮液可以包括以下組分:無菌稀釋劑，如注射用水、鹽溶液、固定油、聚`乙二醇、甘油；丙二醇或其他合成試劑；抗菌劑，如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧劑，如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四醋酸；緩衝液，如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及調節張度的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。可以用酸或鹼調節pH，如鹽酸和氫氧化鈉。腸胃外製劑可以封裝在安瓿瓶、一次性注射器或玻璃或塑料製成的多劑
量管中。
[0259]適合於可注射用途的藥學組合物包括無菌水溶液(對於可溶於水的情況)或者用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的分散劑和無菌粉末。對於靜脈內給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL?(BASF, Parsippany, NJ)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況中，可注射組合物應當無菌，並且流動的程度應當易於注射。其在製造和儲存條件下必須是穩定的，並且必須能抵抗如細菌和真菌的微生物的汙染作用。載體可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)和它們合適的混合物的溶劑或分散介質。可以例如通過使用如卵磷脂的包衣，在分散液的情況下通過保持所需的粒徑以及通過使用表面活性劑保持適當的流動性。可以通過多種抗細菌和抗真菌劑來實現防止微生物作用，例如，對羥基苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸和硫柳汞等。在很多情況中，優選的是在組合物中包括等滲劑，例如，糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇和氯化鈉)。通過在組合物中包含延長吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)可以實現可注射組合物的延長吸收。
[0260]可以通過以下方式來製備無菌可注射溶液:將所需量的活性化合物(例如神經調節蛋白)和上面列舉的一種成分或其組合(根據需要)加入至合適的溶劑中，然後過濾滅菌。一般來說，通過將活性化合物加入至包含鹼性分散介質和所需的來自以上列舉的其他成分的無菌介質中來製備分散液。對於用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，其產生活性成分和任何另外的所期望的來自之前無菌過濾的溶液成分的粉末。
[0261]口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可以被封裝在膠囊中或壓縮成片劑。為了口服治療給藥的目的，活性化合物可以與賦形劑一起合併，並以片劑、錠劑或膠囊形式使用。也可以使用液體載體製備用作漱口水的口服組合物，其中液體載體中的化合物口服施用，並發用於漱口和吐出或吞咽。可以包括藥學相容性粘合劑和/或輔助材料作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊和錠劑等可以包含任何以下成分或具有相似性質的化合物:粘合劑，如微晶纖維素、黃芪樹膠或明膠；賦形劑，如澱粉或乳糖；崩解劑，如藻酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂或Stertes ;助流劑,如膠體二氧化娃；甜味劑，如鹿糖或糖精；調味劑，如薄荷、水楊酸甲酯或橙味劑。
[0262]對於吸入給藥，化合物以來自包含合適的推進劑(例如氣體，如二氧化碳)加壓容器或分配器或噴灑器的噴霧劑的形式遞送。
[0263]全身用藥也可以通過跨黏膜或經皮的方式。對於跨黏膜或經皮給藥，對於要滲透的屏障的合適的滲透劑可以用於製劑中。滲透劑在本領域是公知的，並且包括，例如，用於跨黏膜給藥為去垢劑、膽汁鹽和梭黴孢酸衍生物。可以通過使用鼻腔噴霧或栓劑來實現跨黏膜給藥。對於經皮給藥，將藥學組合物配製成本領域公知的軟膏、油膏、凝膠或霜。
[0264]在一些實施方式中，將所述藥學組合物配製成用於活性成分的持續釋放或受控釋放。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯類和聚乳酸。製備這種製劑的方法對本領域技術人而言將是顯而易見的。材料也可以從例如Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc購買獲得。脂質體懸浮液(包括具有針對病毒抗原的單克隆抗體的靶向於感染細胞的脂質體)也可以用作藥學可接受載體。這些可以根據本領域已知方法製備這些製劑，例如，如美國專利號4，522，811所描述的。
[0265]為了給藥的方便性和劑量均勻性，配製單位劑量形式的口服或腸胃外組合物是特別有利的。本文所用單位劑量形式包括適合於待治療的個體的單位劑量的物理上分離的單元；每個單元包含通過計算能產生所需療效的預定量的活性化合物和所需的藥學載體。活性化合物的特性、要實現的具體療效以及化合用於個體治療的活性化合物的領域中固有的局限性影響或決定本發明的單位劑量形式的規格。
[0266]可以通過細胞培養或實驗動物的標準製藥程序來測定化合物的毒性和治療效果，例如測定LD50 (致50%群體死亡的劑量)和ED50 (對50%群體治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比為治療指數，並且可以表示為LD50/ED50。表現出大的治療指數的化合物是優選的。儘管也可以使用表現出毒副作用的化合物，但是應注意設計遞送系統，使這些化合物能靶向於受累組織的位點，從而最小化對未感染的細胞的潛在危害，並由此降低副作用。
[0267]從細胞培養測定和動物研究獲得的數據可以用於制定在人類中使用的劑量範圍。化合物的劑量優選在包括ED50、但具有很小或沒有毒性的循環濃度範圍內。依據使用的劑量形式和利用的給藥途徑，劑量可以在該範圍內變化。對於本發明方法中使用的任何化合物，可以從細胞培養測定中初步估計治療有效的劑量。可以在動物模型中建立劑量來實現包括細胞培養中測定的IC50 (即，實現症狀的半最大抑制的測試化合物的濃度)的循環血漿濃度範圍。這些信息可以用來更準確地確定人類中的有用劑量。在一些實施方式中，單一劑量包含0.01 μ g-50mg的嵌合神經調節蛋白。藥學組合物可以與給藥說明一起包括在容器、包或分配器中。
[0268]通過以下實施例進一步說明本發明，這些實施例不應解釋為限制性的。將整個申請所引用的全部參考文獻、專利和公開的專利申請的內容以及圖和表格通過引用合併入本文。
實施例
[0269]實施例1:惡件腫瘤細朐系中D0CK2的表汰和CXCL13:CXCR5介導惡件腫瘤細朐停襲的體外分析
[0270]通過SDS-PAGE呈現來自RWPE-1、LNCaP和PC3細胞的總細胞裂解物(60 μ g)，並使用針對D0CK2的抗體進行免疫印跡(圖1A)。GAPDH用作內參。圖1B中，按照廠商的說明(Santa Cruz)，通過用2 μ M的D0CK2siRNA雙鏈轉染PC3細胞來優化D0CK2沉默調節，並孵育細胞0、24、48和72小時。通過Western印跡分析來測定D0CK2沉默的效率。
[0271]儘管已知CXCL13-CXCR5相互作用能介導嗜中性粒細胞的D0CK2依賴性趨化作用，但是還發現CXCL13-CXCR5相互作用也能夠促進不依賴於D0CK2的惡性腫瘤細胞轉移和侵襲。在圖 2 中，在 CXCL13 (100ng/ml)、抗人 CXCR5 抗體(I μ g/ml)、D0CK2 或對照 siRNA 的存在下，測試LNCaP和PC3細胞侵入MATRIGEL?基質並通過0.8 μ m的多孔膜遷移的能力。侵入至膜的下表面的細胞被結晶紫染色，並通過顯微鏡在40倍放大倍數下計數。根據廠商的說明(BDBiosciences)計算細胞侵襲的百分比。誤差棒代表3次獨立實驗的平均值的標準誤差。星號(*)表示相對於CXCL13處理的細胞(對照)顯著性差異(p〈0.05)。
[0272] 如圖3，所示CXCL13也調節Akt和ERK1/2的活化。進行FACE測定來測量LNCaP和PC3細胞系中的活性Akt或ERKI/2和總的Akt或ERK1/2。在CXCL13 (100ng/ml)的存在下，用抗人CXCR5抗體、D0CK2siRNA、對照siRNA或JNK抑制劑處理細胞0、5或10分鐘。用三個平行樣品進行實驗，並且結果顯示活性(磷酸化的)與總Akt或ERK1/2的比。誤差棒代表±3次獨立實驗的平均值的標準誤差。星號(*)表示磷酸化顯著性降低(p〈0.05)。
[0273]圖4示出了 CXCL13通過PC3細胞中的D0CK2誘導JNK活化。在存在或不存在CXCL13 (100ng/ml)的情況下，用D0CK2siRNA和相應的對照處理RWPE_l、LNCaP和PC3細胞。在CXCL13刺激後5分鐘收集裂解物，並將樣本在SDS-PAGE上呈現。膜上的印跡是針對磷酸化-JNK (46kDa)。GAPDH用作內參。
[0274]圖5中示出了 CXCL13通過JNK和D0CK2調節PCa細胞增殖。在存在或不存在100ng/ml CXCL13、I u g/ml 抗 CXCR5 抗體、D0CK2siRNA 和 / 或 10 y M JNK 抑制劑的情況下，使RWPE-1、LNCaP和PC3細胞在低血清的條件下生長(2%FBS)。進行3天MTT測定以評價細胞增殖。誤差棒代表±3次獨立實驗的平均值的標準誤差。星號(*)表示相對於CXCL13處理的細胞的顯著改變(P〈0.05)。
[0275]圖6示出了 JNK抑制和D0CK2敲低導致非凋亡引起的PCa細胞增殖降低。在存在或不存在 100ng/ml CXCL13、I u g/ml 抗 CXCR5 抗體、D0CK2siRNA、IOuM JNK 抑制劑或 I U M渥曼青黴素的情況下，使RWPE-1、LNCaP和PC3細胞在低血清條件下生長(2%FBS)。根據廠商的指導，採用CASPASE-GL03/7測定(Promega，Madison，WI)測量半胱天冬酶的活性。星號(*)表不相對於無添加的顯著改變(p〈0.05)。
[0276]圖7示出了 CXCL13調節PCa細胞系中的信號轉導級聯。CXCL13通過其同源受體CXCR5引起Akt和ERKI/2活化。在LNCaP細胞中，CXCL13也調節JNK活化，這可能是通過與CXCR5偶聯得Gaq/11，其介導磷酸酶C (PLC)和蛋白激酶C (PKC)的活化。然而，在PC3細胞中，JNK活化是通過D0CK2介導的。
[0277]圖8A-C示出了前列腺癌細胞系中的G蛋白a亞基同種型的表達。將來自RWPE-1、LNCaP、C4-2B和PC3細胞的等量蛋白(50 u g)通過SDS-Page呈現。通過免疫印跡測定(A)Gail、2、3，Gas;?Gal2，Gal3 和(C) Ga q/11 和 Gal6 的表達。GAPDH 用作內參。
[0278]圖9示出了前列腺癌細胞系中的G蛋白0和Y亞基同種型的表達。將來自RWPE-1、LNCaP、C4-2B和PC3細胞的等量蛋白(50 y g)通過SDS-Page呈現。通過免疫印跡測定G
a 1、2、3、4、5 和 Ga l、2、3、4、5、7、9、10、l3 的表達。GAPDH用作內參。
[0279]圖10A-D示出了用或不用CXCL13處理的前列腺癌細胞系中CXCR5和相關G蛋白的表達。(圖10A)通過RWPE-l、LNCaP、C4-2B、和PC3細胞裂解物(50 u g)的Western印跡分析CXCR5蛋白水平。GAPDH用作內參。用或不用CXCL13處理細胞系並將細胞裂解。對CXCR5進行免疫沉澱(IP)以從總細胞裂解物中拉下相關蛋白。通過SDS-PAGE呈現IP細胞裂解物，並且通過免疫印跡檢測 Gail、Gai2、Gai3、Gas、Gaq/11、Ga12、Gal3(圖 10B)，GM、G02、G03、Ge4(圖 10C)和 Gy5、Gy7、Gy9、Gy1Q(圖 10D)的表達。
[0280]通過免疫沉澱對Gq/11和GY5i2蛋白與CXCR5相關的確認示於圖11中。用或不用CXCL13處理細胞系並將細胞裂解。由總細胞裂解物對(A)Gaq/11和(B)Gai2進行免疫沉澱(IP)。通過SDS-PAGE呈現IP細胞裂解物，並且通過免疫印跡檢測CXCR5表達。[0281]在CXCL13刺激後與Gal3偶聯的CXCR4和CXCR5的鑑定示於圖12A-C。用或不用CXCL13處理細胞系，並將細胞裂解。針對Ga 13的抗體被用於從總細胞裂解物對Ga 13進行免疫沉澱(IP)0通過SDSPAGE呈現IP細胞裂解物，並對CXCR5 (圖12A)和CXCR4 (圖12B)進行免疫印跡。(圖12C)在CXCL13處理之前或之後，還對CXCR5IP裂解物進行CXCR4表達的Western印跡分析。GAPDH用作內參。
[0282]圖13描述了前列腺癌細胞中CXCR5相互作用的假設模型。在缺少CXCR5的特異性配體CXCL13的情況下，CXCR5與CXCR4相聯，並且在雄激素依賴的LNCaP細胞系中與Ga q/11/G03/GY9異三聚體偶聯，或在激素抵抗性C4-2B和PC3細胞系中與Gai2/G03/GY9異三聚體偶聯。在CXCL13刺激時，G蛋白從CXCR5離解以活化效應分子。另外，CXCL13活化的CXCR5引起、結合或隔尚Ga 13蛋白，從而有利於能提聞PCa細胞運動性的/[目號。
[0283]表I示出了前列腺癌細胞的抗CXCL13和/或抗CXCR5處理所影響的不同的網絡，以及前列腺癌細胞中這些網絡的每一個參與的功能。分數表示已知參與各網絡的分子數。關注分子(突出顯示)是各網絡中具有特別作用或重要性的分子。
[0284]表1.參與CXCL13處理的轉移性前列腺癌的最高得分網絡
[0285]
【權利要求】
1.檢測個體中惡性腫瘤的存在的方法，包括: 檢測獲自所述個體的生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平；以及 將所述生物樣本中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平與所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的正常表達水平相比較， 其中所述生物樣本中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的高於正常的表達水平表示所述個體中存在惡性腫瘤， 其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的所述正常表達水平為預定值，或者獲自與所述生物樣本具有相同來源或類型的已知的正常非癌性細胞的對照樣本，以及 其中所述惡性腫瘤為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤，以及 其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物包括CXCL13、或CXCR5、或CXCL13和CXCR5。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括CXCL16、或 CXCR6、或 CXCL16 和 CXCR6。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括選自以下的一種或多種惡性腫瘤標誌物:CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLIO、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CXCL15、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLIO、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL2 2、CCL24、CCL2 5、CCL2 5-1、CCL2 5-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCRl1、XCLl、XCL2、XCRl、CX3CR1、CX3CL1、RNA結合基序3 ("RBM3")、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、嗜鉻粒蛋白A(CGA )、脫氫表雄酮(DHEA)、神經元特異性烯醇酶(NSE)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、促乳素、B7-H3、分離酶多肽、抗p53、骨橋蛋白、鐵蛋白、溶血磷脂醯膽鹼、驅動蛋白家族成員4A(KIF4A)、神經正五聚蛋白I(NPTXl)和成纖維細胞生長因子受體I癌基因伴侶(FGFR10P)蛋白。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述惡性腫瘤為黑素瘤，並且其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括CXCL16、或CXCR6、或者CXCL16和CXCR6。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括選自以下的一種或多種惡性腫瘤標誌物:CCL25、CCL27、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL7、CXCL8、CXCLl2, CX3CL1、CCR9、CCR10、CXCRl、CXCR2、CXCR4 和 CX3CR1。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述惡性腫瘤為癌，並且其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括CXCL16、或CXCR6、或者CXCL16和CXCR6。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括選自以下的一種或多種惡性腫瘤標誌物:CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4 和 CX3CR1。
8.根據權利要求6所述的方法，其中所述癌為乳腺癌，並且其中一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括選自以下的一種或多種惡性腫瘤標誌物:CXCL16、CXCR6、CCLU CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、RNA 結合基序3 ("RBM3")和癌胚抗原(CEA)。
9.根據權利要求6所述的方法，其中所述癌為前列腺癌，並且其中一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括選自以下的一種或多種惡性腫瘤標誌物:CXCL16、CXCR6、CCLU CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、PSA、CEA、CGA, DHEA, NSE, PAP、促乳素和 B7-H3。
10.根據權利要求6所述的方法，其中所述癌為結腸直腸癌，並且其中一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括選自以下的一種或多種惡性腫瘤標誌物:CXCL16、CXCR6、CCLl、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、分離酶多肽、抗P53、骨橋蛋白和鐵蛋白。
11.根據權利要求6所述的方法，其中所述癌為卵巢癌，並且其中一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括選自以下的一種或多種惡性腫瘤標誌物:CXCL16、CXCR6、CCLU CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、癌抗原125 (CA-125)、HE-4、OVX-1巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和溶血磷脂醯膽鹼。
12.根據權利要求6所述的方法，其中所述癌為肺癌，並且其中一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括選自以下的一種或多種惡性腫瘤標誌物:CXCL16、CXCR6、CCLU CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、驅動蛋白家族成員4A(KIF4A)、神經正五聚蛋白I (NPTXl)、成纖維細胞生長因子受體I癌基因伴侶(FGFR10P)蛋白和 CEA。
13.根據權利要求6所述的方法，其中所述癌為胰腺癌或胃癌，並且其中一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括選自以下的一種或多種的惡性腫瘤標誌物:CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL2 5、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CRI 和 CEA。
14.根據權利要求1所述的方法,其中所述生物樣本為血漿樣本、唾液樣本或尿液樣本。
15.評價患惡性腫瘤個體的預後的方法，包括: 測定來自所述個體的生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平，以及將所述生物樣本中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平與所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的對照表達水平相比較， 其中如果所述生物樣本中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平高於所述對照水平，則表示所述個體的預後不良， 其中如果所述生物樣本中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平低於或近似於所述對照水平，則表示所述個體的預後良好， 其中預後不良表明所述惡性腫瘤為攻擊型或侵襲型，其中所述惡性腫瘤為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤，以及 其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括CXCL16、或 CXCR6、或者 CXCL16 和 CXCR6。
17.監測個體中惡性腫瘤治療過程的方法，包括: 在所述治療期間或所述治療之後，測定來自所述個體的一個或多個生物樣本中一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平，以及 將所述一個或多個生物樣本中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的表達水平與所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的對照表達水平相比較， 其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的所述對照水平為所述個體中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物的治療前水平或預定的參考水平， 其中如果所述一個或多個生物樣本中的所述一種或多種惡性腫瘤標誌物接近於或低於所述對照水平，則認為所述治療有效， 其中所述惡性腫瘤為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤，以及 其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物包括CXCL13、或CXCR5、或者CXCL13和CXCR5。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述一種或多種惡性腫瘤標誌物進一步包括CXCL16、或 CXCR6、或者 CXCL16 和 CXCR6。
19.用於檢測惡性腫瘤或監測惡性腫瘤發展的試劑盒，包括: 用於測定生物樣本中CXCL13和/或CXCR5表達的試劑；以及使用所述試劑的說明， 其中所述試劑包括抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體或兩者，並且其中所述惡性腫瘤為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤。
20.根據權利要求19所述的試劑盒，進一步包括: 用於測定生物樣本中CXCL16和/或CXCR6表達的試劑；以及使用所述試劑的說明， 其中所述試劑包括抗CXCL16抗體、抗CXCR6抗體或兩者。
21.治療個體中惡性腫瘤的方法，包括: 給予所述個體治療有效量的抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合， 其中所述惡性腫瘤為黑素瘤、癌、肉瘤、胚細胞瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴瘤，並且其中所述抗CXCL13抗體、或所述抗CXCR5抗體、或抗CXCL13抗體和抗CXCR5抗體的組合的給藥劑量範圍為lng/kg體重/天至約100mg/kg體重/天。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述惡性腫瘤為黑素瘤、淋巴瘤或癌，其中所述癌選自卵巢癌、陰道癌、子宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌、胰島瘤、腺瘤、腺鱗癌、神經內分泌腫瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、腦癌、成神經管細胞瘤、神經外胚層瘤、膠質瘤、垂體癌和骨癌。
23.根據權利要求21所述的方法，其中將所述抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體或它們的組合直接給藥到癌組織中，或與化療劑聯合給藥。
24.根據權利要求21所述的方法，其中所述惡性腫瘤為癌，並且其中所述抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體或它們的組合與一種或多種能特異性結合選自以下的一種或多種趨化因子或趨化因子受體的抗體聯合給藥:CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CXCL16、CCR2、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR6、CX3CL1 和 CX3CR1。
25.根據權利要求21所述的方法，其中所述惡性腫瘤為黑素瘤，並且其中所述抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體或它們的組合與一種或多種能特異性結合選自以下的一種或多種趨化因子或趨化因子受體的抗體聯合給藥:CCL25、CCL27、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2, CXCL16、CX3CL1、CCR9、CCR10、CXCRl、CXCR2、CXCR4、CXCR6、CXCR7 和 CX3CR1。
26.根據權利要求21所述的方法，其中所述惡性腫瘤為淋巴瘤，並且其中所述抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體或它們的組合與一種或多種能特異性結合選自以下的一種或多種趨化因子或趨化因子受體的抗體聯合給藥:CXCL12和CXCR4。
27.根據權利要求21所述的方法，包括: 測定來自所述個體的組織中CXCL13和/或CXCR5的表達水平，以及如果檢測到CXCL13和/或CXCR5的表達水平升高，對所述個體給予治療有效量的所述抗CXCL13抗體、所述抗CXCR5抗體或它們的組合。
28.根據權利要求21所述的方法，其中所述個體被診斷患有導致惡性腫瘤細胞中CXCL13和/或CXCR5表達升高的惡性腫瘤。
29.根據權利要求21所述的方法，其中所述抗CXCL13抗體、或所述抗CXCR5抗體、或所述抗CXCL13抗體和抗CXCR5抗體的組合的給藥劑量範圍為:lng/kg體重/天至約IOOng/kg體重/天、10ng/kg體重/天至約I μ g/kg體重/天、100ng/kg體重/天至約10 μ g/kg體重/天、I μ g/kg體重/天至約100 μ g/kg體重/天、10 μ g/kg體重/天至約lmg/kg體重/天或100 U g/kg體重/天至約10mg/kg體重/天。
30.防止或抑制個體中具有升高表達的CXCL13和/或CXCR5的惡性腫瘤細胞的遷移或轉移的方法，包括: 對所述個體給予治療有效量的抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合， 其中所述抗CXCL13抗體、或所述抗CXCR5抗體、或抗CXCL13抗體和抗CXCR5抗體的組合的給藥劑量範圍為:lng/kg b體重/天至約100mg/kg體重/天,並且其中所述惡性腫瘤細胞為黑素瘤細胞、癌細胞、骨髓瘤細胞、白血病細胞或淋巴瘤細胞。
31.增強化療效果的方法，包括: 對進行惡性腫瘤化療的個體給予有效量的抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合，並且其中所述個體進行黑素瘤、癌、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤的化療。
32.治療個體惡性腫 瘤的方法，包括: 用有效量的CXCL13免疫原和/或CXCR5免疫原免疫個體，從而誘導能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體， 其中所述惡性腫瘤為黑素瘤、癌、肉瘤、胚細胞瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴瘤。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述CXCL13免疫原為包括選自以下的一個或多個序列的肽:RSSSTLPVPVFKRKIP、PRGNGCPRKEIIVWKK、LPRGNGCPRKEIIVWK、QILPRGNGCPRKEIIV,ILPRGNGCPRKEIIVff, RIQILPRGNGCPRKEI, RGNGCPRKEIIVWKKN,KRSSSTLPVPVFKRK1、 IQILPRGNGCPRKEI1、 DRIQILPRGNGCPRKE、 RKRSSSTLPVPVFKRK、RCRCVQESSVFIPRRF、GNGCPRKEIIVWKKNK, CVQESSVFIPRRFIDR、IDRIQILPRGNGCPRK、LRCRCVQESSVFIPRR、 FIDRIQILPRGNGCPR、 RCVQESSVFIPRRFID、 CRCVQESSVFIPRRF1、QESSVFIPRRFIDRIQ, RFIDRIQILPRGNGCP, VQESSVFIPRRFIDRI, ESSVFIPRRFIDRIQI,SLRCRCVQESSVFIPR、NGCPRKEIIVWKKNKS, PQAEWIQRMMEVLRKR、RRFIDRIQILPRGNGC、LRKRSSSTLPVPVFKR、VQESSVFIPRR、EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK, KKNK, RKRSSS, RGNGCP,VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR、DRIQILP、RKEIIVff 和 KSIVCVDPQ，並且其中所述 CXCR5 免疫原為包括選自以下的一個或多個序列的肽:TSLVENHLCPATE、EGSVGffVLGTFLCKT, LPRCTFS、LARLKAVDNT 和 MASFKAVFVP。
34.防止或抑制個體中具有升高表達的CXCL13和/或CXCR5的惡性腫瘤細胞的遷移或轉移的方法，包括: 用有效量的CXCL13免疫原和/或CXCR5免疫原來免疫個體，從而誘導能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體， 其中所述惡性腫瘤為黑素瘤、癌、肉瘤、胚細胞瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴瘤。
35.治療個體惡性腫瘤的方法，包括: 檢測來自所述個體的生物樣本中CXCL13和/或CXCR5的表達水平，以及 如果在所述生物樣本中檢測到CXCL13和/或CXCR5的表達水平升高，則用有效量的CXCL13免疫原和/或CXCR5免疫原來免疫個體，從而誘導能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體。
36.增強化療效果的方法，包括: 對進行惡性腫瘤化療的個體給予有效量的CXCL13免疫原和/或CXCR5免疫原從而誘導能抑制CXCL13和/或CXCR5的生物活性的抗體。
37.治療個體惡性腫瘤的方法，包括: 用有效量的CXCL16免疫原和/或CXCR6免疫原來免疫個體，從而誘導能抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的抗體， 其中所述惡性腫瘤為黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚細胞瘤或癌， 其中所述CXCL16免疫原為包括選自以下的一個或多個的序列的肽:AAGPEAGENQKQPEKN、 SQASEGASSDIHTPAQ、 STLQSTQRPTLPVGSL、 SffSVCGGNKDPffVQEL,GPTARTSATVPVLCLL、SGIVAHQKHLLPTSPP、RLRKHL, LQSTQRP、SSDKELTRPNETT、AGENQKQPEKNA、NEGSVT,ISSDSPPSV、CGGNKDPW、LLPTSPPISQASEGASSDIHT、STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT、SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA、TGSCYCGKR、DSPPSVQ、RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSffSVCGG,WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ, SDIHTPAQMLLSTLQ、RPTLPVGSL、TAGHSLAAG、GKRISSDSPPSVQ、KDPff VQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH,以及 其中所述CXCR6免疫原為包括選自以下的一個或多個的序列的肽:HQDFLQFSKV、AGIHEWVFGQVMCK, PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI 和 YYAMTSFHYTMVTEA。
38.治療個體惡性腫瘤的方法，包括: 用有效量的CXCL13和CXCR5免疫原中的一種或多種和有效量的CXCL16和CXCR6免疫原中的一種或多種來免疫個體， 其中所述惡性腫瘤為黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚細胞瘤或癌。
【文檔編號】G01N33/53GK103608680SQ201180065073
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2011年12月7日 優先權日:2010年12月14日
【發明者】詹姆士·W·裡拉爾德, 施艾賴施·清, 拉傑施·清 申請人:詹姆士·W·裡拉爾德, 施艾賴施·清, 拉傑施·清