使用蛋白質互補在體內實時檢測核酸的製作方法

2023-06-05 06:59:21

專利名稱：：使用蛋白質互補在體內實時檢測核酸的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於體內檢測核酸的組合物和方法。更優選地，組合物和方法能夠在體內靈敏地且實時地衝金測RNA。
背景技術：
：RNA是廣義上被認定為基因表達的多步驟過程的積極參與者，該過程包括RNA在細胞核內的轉錄和加工、由細胞核輸出、經細胞質轉運以及在核糖體內翻譯。此外，非編碼RNA——類日益增多的RNA分子，參與了多種轉錄後和翻譯後事件，這些事件涉及所有的細胞大分子、蛋白質、DNA和RNA:RNA編輯、RNA修飾、DNA曱基化和蛋白修飾(Kiss，2002,Mattick，2004;Huttenhofer等，2005)。為了發揮這樣的多種功能，RNA必須在正確時間處於正確的細胞位置上。換句話說，RNA分子在細胞中的空間和時間定位已經成為目前細胞生物學中的一項重要才幾制。已經認識到RNA的定位不僅調節蛋白質的合成，而且形成了形態發生素梯度，並且決定了細胞系和細胞器的形成(綜述參見Kloc等，2002)。如果RNA沒有適當地發揮作用，其可能造成各種形式的病狀。RNA的動態性和不穩定性及其在多種功能中的重要作用都與它的運動和定位有關，這些都已經引起了興趣和挑戰。目前，體內RNA定位領域中所面臨的困難的一個例子是缺少適當的方法來評估poly(A)+-mRNA在細胞核中的擴散係數。已經報導的數值相差兩個數量級，即0.03-0.6p2/秒和9f/秒(Politz等，1998，Politz等，1999,Molenaar等，2004)。因此，為了更好地了解各種RNA在體內的功能和行為，顯然是迫切需要新的方法來研究它們在活細胞中的定位和運動。為了觀察細胞中的RNA,應該對其進行選擇性標記。有人已經建議並使用了用於體內RNA標記的不同策略(綜述參見Pederson,2001)。它們中的大多數使用了不同的RNA特異性雜交探針，並使用顯微注射或脂轉染法將探針輸送到細胞核或細胞質中。另一種可能是預先標記RNA並將其注射到細胞中。Kool和合作者們成功地〗吏用自連接淬滅探針(Self-ligatingquenchingprobes)在細菌糹田胞中進行RNA雜交(Sando&Kool,2002)。焚光2'-0-曱基-RNA探針已經顯示出比未曱基化的寡核苷酸更加穩定，並且被幾個小組所採用(Carmo-Fonseca等，1999;Molenaar等,2001;Molenaar等，2004)。分子信標和籠鎖螢光素(caged-fluorescein)標記的反義寡核苷酸提供了先進的RNA雜交探針的變體(綜述參見Politz,1999,Pederson，2001)。分子信標和籠鎖探針的優點在於它們只有在分別與靶點雜交或者被照射時才產生信號；這就能獲得較低的背景並因此獲得更好的靈敏度(Sokol等，1998;Perlette&Tan，2001;Matsuo,1998;Tsuji等,2001;Sei-Iida等，2000)。這種雜交策略最大局限性在於雜交靈敏度低，這是由於細胞中RNA的濃度低。在大多數情況下，只有高豐度的RNA種類才能被檢測到(P-肌動蛋白mRNA、c-fosmRNA、石威性成纖維細胞生長因子RNA或者總poly(A)-RNA)。使用寡核苦酸探針在體內進行RNA檢測的另一個障礙是它們會在細胞核中快速積累(Tsuji等，2000;Molenaar等，2001)。研究體內RNA的另一種策略是利用RNA結合蛋白和螢光蛋白之間的融合，在RNA靶點中引入蛋白結合標籤。兩個小組使用了基於MS2外殼蛋白和相應的RNA基序(motif)之間的相互作用的系統(Bertrand等，1998;Beach等.，1999;Beach&Bloom,2001)，另一個小組4吏用了基於U1A剪接蛋白(splicingprotein)的系統(Takizawa&Vale，2000)。這種方法寄希望於能夠對酵母細胞(Bertrand等，1998;Beach等，1999;Corral-Debrinski等,2000;Beach&Bloom,2001)和神經元(Rook等，2000)中的特定RNA的運動進行實時監測。這項技術代表了將螢光蛋白與細胞中的RNA研究相結合的首次嘗試。然而，實質性的限制在於功能完整的螢光蛋白的高背景信號使得實際監測很困難，該螢光蛋白是融合到RNA結合蛋白上的。進一步來說，體內RNA分析主要依賴於螢光檢測方法，其中RNA特異性焚光探針要麼被輸送到細胞中(例如分子信標)，要麼在細胞內合成(例如融合到RNA結合蛋白，例如MS2外殼蛋白上的增強型綠色螢光蛋白，EGFP)[綜述參見(14、15)]。然而，這些方法都有嚴重的缺點和局限性。預先標記的寡核苷酸檢測子探針必須被修飾成抗核酸酶的，而且必須使用侵入性技術將其輸送到細胞中(16)。第二種使用RNA結合蛋白的方法涉及採用串聯形式的多拷貝(高達96個)RNA結合蛋白識別序列來修飾目標RNA,同時將RNA結合蛋白融合到全長螢光蛋白上。結果，融合蛋白的多亞基大複合物就被組裝到目標RNA上(17-20)，這可能損害細胞中RNA的正常運動和遷移。在細菌中也存在由全長螢光蛋白導致的高背景螢光，該螢光蛋白易於聚集，並且聚集體可能與RNA-蛋白複合物相混淆。在真核細胞中，焚光蛋白和RNP複合物分開處在不同區室中在某些情況下這是有利的(21)，但是一般來說全長螢光蛋白所導致的高螢光背景限制了該方法的靈敏度。因此，目前所有的RNA標記方法都受到高非特異性背景和缺少信號放大的困擾；因此它們中的大多數受限制於種類豐富的RNA的檢測。此外，實時檢測RNA的需求也1艮大。發明概述本發明的發明人發現了使用實時蛋白質互補方法在體內才企測核酸分子，如RNA分子的方法。特別地，本發明提供了具有高信號:背景比的體內檢測核酸，例如RNA的方法，由此能夠以高靈敏度來檢測RNA。此外，本發明的方法提供了採用非侵入性方法檢測活細胞中的DNA和RNA的方法和組分(components)。更特別地，本發明的組合物包含檢測子分子(detectormolecule),該檢測子分子包含連接到核酸結合基序上的被裂解成兩個或更多個多肽片段的檢測子蛋白，它們可以獨立或相互配合結合單一位點。檢測子多肽蛋白片段與具有功能活性的檢測子蛋白的重新結合僅僅發生在靶核酸，如RNA或DNA存在的情況下，該靶核酸已經一皮修飾成包含報導子核酸結合序列(例如適配子)，使得核酸結合基序能夠與報導子核酸序列上的其同源結合位點相互作用。這種相互作用聚集了檢測子蛋白片段從而能夠立即檢測信號。檢測子分子多肽特別是檢測子蛋白組分處於活化構型，但其單獨時並不會被活化，而是一旦重組它們就立即形成活性蛋白，從而在靶核酸存在時實時產生信號。在一個實施方案中，靶核酸是RNA。並且，一個實施方案包括了作為檢測子分子的核酸結合基序組分的RNA結合蛋白或肽。如本發明所述，"檢測子構建體"是指編碼包含上述檢測子蛋白(帶螢光的或酶的)的檢測子分子的核酸序列，該檢測子蛋白被裂解成兩個或更多個活化的多肽片段，每個片段都與核酸結合基序接合(conjugated)。經接合的核酸結合基序與耙核酸結合，從而將多肽片段聚集在一起並重構成完全活化的蛋白，就可以被立即檢測。本發明所述的"報導子構建體"是指編碼報導子分子的核酸序列，該報導子分子包含上述核酸，例如編碼目標基因的RNA或DNA，以及靶核酸結合序列，例如適配子。核酸結合序列可以被檢測子構建體的核酸結合基序所識別。核酸結合序列可以是核酸、蛋白、適配子或適配子標籤。在一個實施方案中，檢測子蛋白是螢光分子，例如EGFP。在本發明的一個實施方案中，焚光報導子是被裂解成a片段(大約第1-158位胺基酸)和(3片段(大約第159-239位胺基酸)的EGFP。a片段包含成熟的完全成形的發色團，它單獨並不產生螢光，而是為產生螢光備用的，當其與p片段配對時就立即產生螢光。立即產生螢光就能夠進行體內實時檢測RNA，這是目前的現有技術所無法實現的。重要的是，a和P片段在沒有靶核酸，例如耙RNA的情況下是不會重新結合或者發螢光的。在另一個實施方案中，螢光蛋白是綠色螢光蛋白(GFP)或增強型綠色螢光蛋白(EGFP)。在備選的實施方案中，螢光蛋白是黃色螢光蛋白(YFP)、增強型黃色螢光蛋白(EYFP)、藍色螢光蛋白(BFP)、增強型藍色螢光蛋白(EBFP)、青色螢光蛋白(CFP)、增強型青色螢光蛋白(ECFP)或者紅色螢光蛋白(dsRED)或者上文列舉的螢光蛋白的任何其它天然或基因工程改造的螢光蛋白。在更具體的實施方案中，重構的螢光蛋白可以由上文列舉的螢光蛋白片段的混合物或任意上文列舉的螢光蛋白的組合所組成。備選的檢測子蛋白是能夠放大信號的酶。該酶可以是例如P-半乳糖苷酶、^-內醯胺酶、P-葡萄糖苷酶、P-葡萄糖醛酸酶、氯黴素乙醯轉移酶。在特定實施方案中，；險測子酶是(3-內醯胺酶。在本發明的一個重要實施方案中，組合物和方法提供了能夠在體內實時檢測RNA的報導子分析方法。在一個實施方案中，製備穩定表達檢測子構建體的目標細胞。檢測子構建體表達檢測子分子，在沒有靶RNA的情況下，檢測子分子的檢測子蛋白不產生信號，從而不發螢光或者顯示出活性。細胞也能表達報導子構建體，該構建體編碼包含用於;^測子分子的核酸結合基序的結合位點的報導子分子以及目標基因。這種報導子構建體的表達可以被誘導。當這種報導子分子在細胞中表達時，檢測子分子將結合靶RNA並促進檢測子蛋白的重構以及活性蛋白和信號的產生。這就能夠在體內實時4企測RNA的表達，在圖10-11和18-19以及實施例9至)J11中進行了舉例說明。在備選的實施方案中，目標細胞能夠表達包含報導子分子的雙順反子核酸序列，其中檢測子構建體是以組成型表達的，報導子構建體的表達與目標啟動子可操作地相關聯。在相關的實施方案中，報導子構建體(可操作地連接到目標啟動子上)和檢測子構建體處在分開的核酸序列上。當啟動子在細胞中被某些刺激物活化時，靶核酸序列的結合位點就變得可用了，檢測子分子的核酸結合蛋白的結合促進了檢測子多肽片段的結合以及能夠被立即4全測到的活性檢測子蛋白的形成。該實施方案能夠在體內實時地研究啟動子功能。例如，能夠通過轉染質粒和分析任何初始檢測子構建體的活性來實時研究基因的調節，該質粒表達驅動RNA結合位點的啟動子。在相關實施方案中，i)將細胞與一種或多種化合物相接觸；或者ii)使細胞經受各種可能改變啟動子活性的情況，從而增加、減少或者不改變RNA的轉錄。這種變化通過4企測子構建體立即4全測到。在相似的實施方案中，本發明的方法可以採用"tet-on，，或"tet-off'系統。例如，可以製備穩定表達本發明的檢測子構建體的目標細胞。此外，細胞還可以穩定表達tet-on或tet-off可調節報導子的構建體，使得檢測子分子核酸結合基序的靶結合位點和目標基因的轉錄受到控制。例如，在tet-off系統中，細胞將立即表達目標基因，報導子構建體將被活化並可以立即檢測到。一旦加入tet,報導子構建體(包含目標基因和乾核酸結合位點)的轉錄就停止了，只有已經轉錄的轉錄物能夠被實時分析。在這種tet-off的例子中，我們能夠通過檢測衰減的報導子螢光或活性來在體內實時分析RNA的穩定性，例如它的半衰期。在備選實施方案中，使用，，tet-on"構建體能夠在活細胞中穩定表達目標基因，因此將tet加入到系統中就引發了報導子構建體的轉錄。然後，本發明的檢測子分子能夠結合它的耙RNA並且可以立即糹全測到。在該實施方案中，可以如進行實驗的人員所要求的那樣實時研究RNA定位。在本發明的另一個實施方案中，報導子分析是在生物體內進行的。例如但不限於動物、非人動物、小鼠、斑馬魚、線蟲或蛙，它們可以經處理以表達檢測子構建體和目標基因，而目標基因上帶有將結合到檢測子構建體上的RNA結合位點。兩種構建體在生物中的表達使得能夠通過從第1天的胚胎直到成年期進行取樣從而對整個發育期間的目標轉錄物進行分析。在一個實施方案中，生物是哺乳動物。在一個實施方案中，哺乳動物是小鼠，在另一實施方案中，生物是轉基因生物，例如但不限於轉基因小鼠。可選擇地，本發明的組合物和方法可用於類似於原位雜交的體外實時檢測RNA。在這種實施方案中，將表達包含目標RNA的報導子構建體的細胞進行透性化(permeablized),該目標RNA帶有將結合到^r測子分子的核酸結合基序上的RNA結合序列，並且將本發明的檢測子構建體給予細胞。如果目標RNA被表達，檢測子構建體將結合到RNA結合序列上，就能夠確定RNA的定位和豐度。該系統相對於傳統原位雜交技術的優點在於能夠檢測低豐度的RNA(這是由於釆用酶報導子的檢測子構建體所獲得的信號放大)並且能夠迅速完成分析且沒有放射性。立即進行檢測子構建體檢測是非常值得期待的。目前，進行原位雜交(例如利用放射性)的傳統方法在知道實驗是否成功之前可能耗時數周到數月。此外，傳統原位雜交中使用的RNA探針很難製備，這是由於RNA容易降解以及使用了放射性。本發明的方法無需使用放射性或RNA探針。檢測子構建體很容易例如由細菌來製備，正如本領域技術人員已知的。這種分析方法類似於免疫組織化學或免疫細胞化學技術，其通過使用抗體來體外檢測蛋白。這裡檢測的是RNA。在備選實施方案中，本發明的組合物和方法用於實時;f僉測核酸，特別是體內的RNA和DNA,當在體外的細胞中操作RNA和蛋白構建體時，例如在試管中就涉及到本發明的應用，作為非限制性的例子，檢測離體(exvivo)細胞中的RNA。此外，本發明的組合物和方法可以用於實時體內才全測DNA的實施方案。例如，本發明的4企測子構建體可以包含檢測子蛋白(螢光的或酶的)，它被裂解成至少兩個失活的多肽片段，每個片段都與核酸結合基序結合。當耙核酸，例如適配子的存在使多肽片段聚集在一起時，多肽片段就形成了完全活化的檢測子蛋白，並能夠被立即檢測到。例如，本發明的方法能夠實時檢測基因組中各種位點的複製。與檢測子構建體中的檢測子蛋白相結合的核酸結合基序是特異性針對於RNA或DNA的各個區域的，並且那些位點的複製能夠在體內實時檢測。類似地，我們可以使用本發明的方法和組合物在體內實時檢測染色體。例如，檢測子構建體可以包含與端粒末端轉移酶結合蛋白相結合併在細胞中表達的檢測子蛋白。這樣，在細胞的生命周期中都能夠實時檢測端粒末端轉移酶。本發明記載的組合物和方法的優點在於通過提供端粒末端轉移酶結合蛋白提高了特異性，該端粒末端轉移酶蛋白被切成兩半，每一半都與檢測子蛋白的一半結合。端粒末端轉移酶結合蛋白的兩半協同結合到單一結合位點上確保了在靶向識別之前幾乎不存在檢測子活性。在另一個實施方案中，本發明提供了適用於本發明方法，特別是體內檢測RNA的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒包括4僉測子構建體和可誘導的報導子構建體。在一個實施方案中，報導子構建體和檢測子構建體處在分開的核酸分子上。在另一實施方案中，它們處在雙順反子核酸分子的兩部分上。在另一實施方案中，加入實驗人員感興趣的基因從而對報導子分子進行修飾，在另一實施方案中，報導子分子的表達與tet-on或tet-off啟動子可操作地關聯起來。在另一個變型的實施方案中，實驗人員可以將包含靶核酸序列的報導子構建體修飾成由實驗人員感興趣的啟動子調節。在每個這些實施方案中，試劑盒都包含用於檢測子分子中的檢測子蛋白的裂解多肽的選擇，並且還包含用於檢測來自報導子蛋白的信號的說明書和試劑。在一些實施方案中，試劑盒還包含適用於捕獲和/或檢測樣品中靶核酸的存在或數量的試劑。用於檢測靶核酸的存在和/或數量的試劑可以包括酶活性試劑或者具有針對組裝蛋白的特異性抗體。抗體可以被標記。蛋白互補和酶報導子的組合能夠獲得實質上降低的背景和信號放大。這形成了能夠分析中等豐度的核酸的體內RNA檢測技術。在更具體的實施方案中，本發明提供了包含用於檢測體內RNA的工具的試劑盒。本發明的其它方面在下文中公開。附圖簡述圖1:研究適配子對釀酒酵母中基因表達的影響的轉錄系統(Blake等，2003)。圖2:在標記基因的3，末端插入適配子未影響酵母中的基因表達。將適配子標籤插入EGFP的3'末端(見圖1對質粒的描述)。在0.2%半乳糖和40ng/mlATc存在時，將培養物培養到對數期。數字l-4對應於可i秀導構建體的四種不同染色體整合。通過FACS分析了每種培養物中的50,000個細胞。圖3:用於該項研究的含有EGFP和elF4A片#史的融合蛋白的略圖。將真核起始因子裂解成兩個結構域，並且每個結構域都與EGFP的兩個片段融合以產生EGFP(A)-elF4A(Fl)和EGFP(B)-eIF4A(Fl)。數字表示包括在每個片段中的胺基酸數量範圍。(N,N-末端；C，C-末端)。圖4:在沒有適配子標籤時，細菌細胞中兩種嵌合蛋白的表達不會引起重構而產生螢光。EGFP(A)-eIF4A(Fl)和EGFP(B)-eIF4A(Fl)在BL21(DE3)細胞中共表達。用lmMIPTG在37。C下誘導培養物3小時，通過螢光流式細胞儀監測複合物的形成。將表達全長EGFP的BL21(DE3)細胞用作誘導的陽性對照(bEGFP)，A-F1和B-F1的表達被認為是陰性對照。兩種肽進行的體內蛋白互補的示意圖。裂解的標記蛋白是灰色的，RNA結合肽(探針蛋白)是橙色的。(圖5B)分別通過針對HIVTat蛋白的CQ肽(SEQIDNO:2);HIVrev肽(SEQIDNO:1)和HTLVRex肽(SEQIDNO:3)的體外篩選發現了三種適配子(參見表1的Kd和參考)。這些結構或相似結構可以作為備選設計中的RNA標籤用於在我們的方案中(與裂解蛋白的方法相反)。圖6:蛋白互補分析方法得到了用於體內RNA研究的核酸相互作用的驗證的略圖。將具有酶活性或螢光性質的蛋白裂解成兩個無活性的部分(稱為a亞基和(3亞基)。將這些部分作為與另一蛋白的嵌合體在體內表達，而另一蛋白具有RNA結合域。理想的RNA結合蛋白將包括兩個部分，它們本身是無活性的，但是在一起時是有活性的。在含有可以被RNA結合蛋白所識別的基序的RNA存在時，標記蛋白的活性被恢復。如果蛋白是酶，信號就被放大了。如果蛋白是發螢光的，就沒有信號放大，但也沒有背景，因為螢光完全取決於靶RNA的存在。圖7:體內檢測RNA的示意圖。在體內合成靶RNA或者將靶RNA注射到細胞中。在體內合成兩種蛋白的嵌合體或者將兩種蛋白的嵌合體轉染到細胞中。每種嵌合體含有標記蛋白部分以及特異性結合靶RNA中的特殊二級結構(或基序)的結構域。在攜帶可以由RNA結合蛋白特異性識別的標籤的靶RNA存在時，蛋白標記被組裝起來，依據其活性(螢光或酶活性)進行檢測。圖8:本發明的一個實施方案的示意圖，其中在體內實時分析RNA表達。目標基因和RNA結合位點被編碼在質粒上並轉染到含有穩定整合了本發明的報導子構建體的細胞中。當基因(和RNA結合位點)表達時，報導子構建體就被活化了。圖9:裂解的EGFP的蛋白互補檢測活細菌細胞中的RNA。(a)分別含有裂解的elF4A和裂解的EGFP片段的兩種融合蛋白的表達不產生螢光信號。(b)全長EGFP的表達使五.co"細胞產生均勻的螢光。(c)兩種融合蛋白和帶有適配子的RNA轉錄物的共表達形成了經常定位於細胞極的螢光信號。最上面一排co"中表達的分子構建體。第二排表達互補複合物組分的質粒。第三排由FACS獲得的表達EGFP互補複合物的細胞的螢光分布；黑色，IPTG誘導前；紅色，IPTG誘導後。最下面一排表達互補複合物相應組分的co//細胞的螢光顯微照片。圖10:單個細菌中轉錄的動態。(a)對表達RNA適配子-elF4A互補複合物的五.co//細胞以30分鐘間隔隨時間(Time-lapse)拍攝的螢光顯微照片。實驗期間的相差顯微照片沒有變化。圖11:活細胞中RNA檢測所促成的螢光動態。(b)不同的單個細胞中的螢光變化的動態。(c)視野中的所有細胞的總螢光變化的動態。(d)沿細胞長軸測定的單個細菌細胞中的實時螢光分布的變化。圖12:表達不含適配子序列的RNA的細胞未顯示出高螢光分布，而在lacZ轉錄物存在時，由FACS獲得了表達互補複合物蛋白組分的細胞的高螢光分布。黑色，IPTG誘導前；紅色，IPTG誘導後。為了對比，表達含有適配子序列的RNA和互補蛋白的細胞的螢光分布以藍色顯示。圖13:表達來自較高拷貝載體(~100拷貝)的含適配子的靶RNA細胞顯示出較高螢光。(a)表達融合蛋白和含有適配子序列的RNA轉錄物的質粒的示意圖。(b)由FACS獲得的表達EGFP互補複合物的細胞的螢光分布。黑色，IPTG誘導前；紅色，IPTG誘導後。為了對比，帶有適配子的細胞的螢光分布顯示為藍色，所述適配子是由較低拷貝數(~40)質粒表達的。圖14:表達全長EGFP的細胞的螢光光譜(a)與含有裂解的EGFP的重構核蛋白複合物的螢光光譜(b)是不同的。將細胞懸浮液稀釋到光密度為0.5(OD600=0.5)，使用F-2500螢光計(Hitachi)記錄焚光。具有同樣光密度的未誘導細胞用作散射的對照。圖15:新分裂的細胞不發出螢光。(a)在所示的時間點獲得的相差照片。(b)相應的螢光照片。圖16:基於二元肽-RNA適配子相互作用設計螢光蛋白互補。EGFP的兩個片段cx和(3,與兩個病毒肽HIV-1Rex肽和噬菌體XN肽融合。在帶有兩個相應適配子的RNA轉錄物存在時，兩種肽與同源適配子相互作用並將裂解的EGFP的兩個片段聚集在一起。EGFP的重組裝導致強烈螢光的出現。圖17:基於二元適配子/肽相互作用的裂解EGFP的蛋白互補^f僉測活細菌細胞中的RNA。低濃度IPTG(0.01mM)能夠從背景中區分信號。A,1.00mMIPTG誘導的細胞的萸光分布。B，降低濃度的IPTG誘導的細胞的螢光分布。圖18:具有不同焚光信號定位的E.coli細胞。圖19:單個細菌中RNA定位和濃度變化的動態。(a)表達互補複合物的￡.coZ/細胞以30分鐘間隔的隨時間拍攝的焚光顯微照片。實驗持續期間的相差顯微照片沒有變化。(b)在兩個單個細胞中測定的總焚光變化。(c)沿細胞長軸測定的單個細菌細胞中螢光分布的實時變化。圖20A和20B:由DNA雙鏈形成驗證的功能性EGFP重組裝。20A:實驗略圖。用N-[6-(生物素氨基)己基]-3'-(2'-吡啶二硫)丙醯胺(HPDP-biotin:Pierce)分別對C末端和N末端上帶有Cys殘基的純化EGFP的a和P片段進行生物素化，純化並與等摩爾量的鏈黴親和素孵育。然後將這些複合物分別與等摩爾量的兩種互補的21-nt長的寡核苷酸孵育。通過凝膠轉移(gelshift)分析檢驗每個步驟中複合物的收率，發現接近100%。然後將兩種蛋白-寡核香酸嵌合體以等摩爾濃度混合。IB:天然EGFP(上面)和帶有附加的12bpDNA雙鏈的重組裝EGFP(下面)的焚光發射光謹，在480nm激發。在含有150mMNaCl，1mMEDTA，pH7.4的磷酸鈉緩衝液中測定焚光光譜。圖21:Mg2+離子對天然的和重構的EGFP的萸光的不同影響。圖22A和22B:圖22A:當帶有附加的互補21-nt長的寡核苷酸的EGFP的a和(3片段混合在一起時，螢光快速增加的動態。圖22B:S65T發色團形成的動力學途徑，附帶所有步驟的t1/2(才艮據Zimmer，2002)。圖23A-4B:摺疊的EGFPa片段可以含有預先形成的發色團。圖23A:根據離散分子動力學(DMD)模擬(Dokholyan，未出版)，10種比對的ct片段典型摺疊結構的骨架示意圖。形成發色團的胺基酸以藍色顯示。注意片段的N末端主要部分的緊密堆積，以及由於與分子其餘部分的接觸量少而形成的餘下片段的非常柔性的C末端部分。圖23B:摺疊的a結構域與全長的EGFP的比對。全長EGFP為黃色，a結構域為藍色。形成發色團的殘基(#62-70)顯示為紅色。圖23C:與全長EGFP的胺基酸相比的EGFP的ot片段中每個殘基的平均均方根偏差(RMSD)。RMSD值是根據蛋白摺疊時低溫下的DMD模擬計算的。形成發色團的胺基酸處在陰影區域中，它們的偏差S2A。圖24A-24D:EGFP的a片段含有預先形成的發色團。圖24A:EGFP的吸收光譜，圖24B:EGFP的a和(3片段的吸收光譜，圖24C:EGFP的螢光光語(藍色-激發，粉紅色-發射)，圖24D:a片段的螢光光譜(藍色-激發，粉紅色-發射)。所有蛋白均以等摩爾濃度進行光譜分析。圖25-25B:通過部分蛋白酶解從GFP中分離的含有發色團的肽的吸收光譜(圖25A)以及在酸性/中性pH下化學合成的發色團的吸收光譜(圖25B)(根據Niwa等，1996)。圖26:核酸相互作用的兩種可能排列，它們作為對蛋白互補分析的支持。圖27:作為嵌合體在E.coli中表達的帶有自裂解蛋白內含子(intein)的EGFP(3片段(P-cys)的純化。泳道6中的蛋白是蛋白內含子自裂解後獲得的純EGFPP亞基。圖28:作為嵌合體在E.coli中表達的帶有自裂解蛋白內含子的EGFPa片段的純化。泳道5中的蛋白是純EGFPa亞基。圖29:蛋白與含SH的寡核苷酸的接合幾乎是100%完全的。使用非變性PAGE進行分析。接合之後，蛋白被連接到帶有負電荷的寡核苷酸上。因此，修飾的蛋白比未修飾的蛋白移動更快(對比泳道1和2，以及3和4)。如果寡核苷酸是生物素化的，就能夠形成與鏈黴親和素的複合物。這種複合物也比單獨的鏈黴親和素移動得更快(對比泳道6和7)。根據該數據我們得出結論，寡核苷酸與蛋白的偶聯效率接近100%。圖30:組合的a+A和P+B的螢光顯示了活性EGFP的重構，而沒有寡核苷酸時就沒有活性EGFP。圖31:恢復蛋白的酶學活性的蛋白互補的示意圖。原理與圖6相似。酶的重組裝取決於RNA與RNA結合蛋白的相互作用。活化的重組裝酶分解它的底物，這就產生了顯色產物或螢光產物。由於蛋白的酶活性，因此信號被放大了。發明詳述本發明人已經發現了用於快速檢測活細胞中的RNA的新方法，它能夠以高信號:背景比檢測出RNA，使得檢測靈敏度提高。本發明包括用於在體外和體內實時地、靈敏地檢測核酸，例如RNA和DNA的組合物和方法。特別地，本發明包括使用檢測子分子的方法，其中包括由檢測子蛋白裂解成的至少兩個多肽片段，所述多肽片段結合到核酸結合基序，例如RNA結合基序上，它們可以獨立地或配合地起作用以結合到單一核酸結合位點上。只有在靶核酸分子存在時，作為RNA結合基序與核酸上它們的同源結合位點的相互作用的結果，才會發生檢測子蛋白片段重新結合成功能性的檢測子蛋白的情況。這種相互作用將會把檢測子蛋白的互補多肽片段聚集在一起用來進行信號檢測。本發明基於蛋白互補提供了用於體內觀察核酸如RNA的創新方法，這是指兩個或更多個多肽蛋白片段重新結合成活性蛋白。特別地，裂解的多肽處於活性構型，然而單獨是無活性的，因此它們與互補多肽片段的結合就立即形成活性^r測子蛋白。在這種情況下，互補只有在其它的核酸/蛋白相互作用的支持下才發生。在一個實施方案中，描述了高親和力和高特異性的蛋白/RNA適配子的相互作用。適配子被表達為靶RNA中的識別標籤，同時合成核酸結合基序作為融合到裂解的檢測子蛋白片段上的兩個無活性片段。核酸結合基序片段與適配子的相互作用將檢測子蛋白片段聚集在一起，這形成了細胞內的重組裝檢測子蛋白的酶活性或焚光。在一個實施方案中，本發明描述的方法可以用於核酸的實時檢測。描述了包含編碼檢測子分子的核酸序列的檢測子構建體，檢測子分子包含一種接合了核酸結合基序的檢測子蛋白的多肽片段以及至少一種接合到核酸結合基序上的檢測子蛋白的其它多肽片段。此外，分析方法利用了報導子構建體，它編碼包含目標核苷酸和核酸結合序列的報導子分子。核酸結合序列被檢測子分子的核酸結合基序所識別。這種識別使得檢測子蛋白能夠被重構並且立即地被實時檢測。檢測子蛋白在沒有靶核酸時沒有活性，因此它是相當靈敏的並且顯示出低背景。此外，對檢測子蛋白的裂解進行設計以使得在靶核酸序列存在時，一旦識別活性就可以立即被4全測到。在本發明的一個實施方案中，核酸是RNA。選自mRNA和miRNA的任何RNA都可以被檢測。備選地，核酸是DNA。本發明的分析方法被描述為核酸結合基序。在一個實施方案中，基序可以以一種方式與檢測子蛋白結合，該方式中核酸結合基序被裂解成多肽片段，一個片段與檢測子蛋白的一個片段接合，餘下的核酸多肽片段與檢測子蛋白的一個或更多個其它片段接合。在該實施方案中，基序的結合是協同的，每個片段都必須存在並結合到一種核酸結合序列上。在備選實施方案中，與檢測子蛋白的一個多肽片段結合的核酸結合基序可以是與其它核酸結合基序無關的全長基序，其它核酸結合基序是與檢測子蛋白的一個或更多個其它片段接合的。例如，核酸結合蛋白可以是小的多結構域核酸結合蛋白，因此每個結構域都與檢測子蛋白的一個或更多個片段結合。在該實施方案中，核酸結合基序與報導子分子中它們的同源核酸序列(或天然核酸)的結合是獨立的。細胞中的構建體表達在本發明的一個實施方案中，檢測子和報導子分子在體內細胞中表達。為實現這一點，可以根據本領域技術人員已知的任何適宜的方法，例如轉化或轉染將編碼檢測子和報導子分子的核酸序列插入細胞中。在一個實施方案中，構建體可以例如位於單個核酸序列上。在備選實施方案中，例如，它們可以處在兩個構建體上(一個包含報導子構建體，並且一個包含檢測子構建體)。這樣的構建體可以被共轉化或共轉染到細胞中。不受理論的限制，有人認為共轉化/共轉染的構建體可以在轉化/轉染期間重新結合，結果是兩者被整合到細胞基因組DNA的相同位點上。備選地，檢測子和報導子構建體可以單獨地或者組合地在細胞中穩定表達。產生高水平重組蛋白的穩定克隆是在用編碼所需目標基因和顯性遺傳標記的表達載體轉染細胞後獲得的。穩定整合到各種類型細胞中的方法是本領域技術人員已知的。在一個實施方案中，核酸可以編碼裂解的多肽片段(包括檢測子蛋白和核酸結合基序)，它們重構形成活性檢測子蛋白。在一個這樣的實施方案中，裂解的多肽片段可以，例如由內核糖體進入位點(IRES)連接。IRES能夠由兩個或更多個分離的基因形成單一的轉錄物，由於轉錄物上額外核糖體進入位點的存在，該轉錄物可以被翻譯成相應的分離的產物。在備選實施方案中，裂解的多肽片段和/或檢測子蛋白和/或核酸結合基序可以由一條核酸編碼，在每個核酸序列之間有可裂解的位點以使所需的多肽分離。作為非限制性例子，核酸可以包含編碼活性檢測子蛋白的序列，該檢測子蛋白包含至少兩種核酸結合基序，其中編碼檢測子蛋白的序列包含可裂解的位點從而能夠產生檢測子蛋白的裂解多肽片段，每個片段都包含核酸結合基序。在這樣的實施方案中，通過本領域技術人員已知的任何手段可裂解的位點能夠將裂解的多肽片段分離，例如但不限於酶切、化學裂解；熱裂解、酸裂解、輻射裂解、光裂解等等。此外，檢測子構建體和報導子構建體也可以在單個構建體中編碼，該構建體具有由IRES連接的分離的組分。將核酸序列引入細胞的方法是本領域技術人員已知的，包括例如可以將檢測子和報導子構建體通過多種手段，包括載體、病毒載體和非病毒方法引入到細胞中。非病毒方法包括但不限於融合、電穿孔、基因槍(biolistic)、轉染、脂轉染、原生質體融合、磷酸鈣轉染、顯微注射、壓力進入、棵DNA等等，或者任何本領域技術人員已知的任何其它方法。術語"載體"與"質粒"可交換使用，是指一種核酸分子，其能夠將另一種核酸輸送到與其連接的核酸分子上。載體被可操作地連接到基因和/或核酸序列上，而該載體能夠引導所述基因和/或核酸序列表達，這樣的載體在本發明中被稱為"表達載體"。通常，用於重組DNA技術的表達載體經常是"質粒"形式的，質粒是指環狀的雙鏈DNA環，它們作為載體形式時不與染色體結合。其它的表達載體可以用於本發明的不同實施方案中，例如〗旦不限於質粒、附加體(episome)、噬菌體或病毒載體，這些載體可以整合到宿主基因組中或者在特定細胞中自主複製。也可以使用本領域技術人員已知的具有等價功能的其它形式的表達載體。表達載體包括用於穩定表達或瞬時表達編碼DNA的表達載體。在一個實施方案中，檢測子和報導子構建體可以通過同源重組引入，其中希望將構建體整合到特定位點上。例如，我們可以缺失和/或用本發明的核酸構建體取代相同位點或者其它位點上的內源基因。對於同源重組來說，將核酸克隆到特定載體中，包括但不限於Q或O載體，參見例如Thomas和Capecchi,cell,(1987),51;503-512，Mansour等，nature,(1988)336;348-352;以及Joyner等，nature(1989)338;153-156。包含用於原核或真核表達的有用元件，如細菌或酵母複製起點、可選擇和可擴增的標記、啟動子/增強子元件以及可用於製備核酸構建體的儲備並用於進行轉染的哺乳動物表達控制元件等等的載體都是本領域中公知的，並且許多可以商購。在一些實施方案中，可以使用病毒載體來引入^f企測子構建體和核酸構建體的核酸序列，並驅動它們的表達。病毒載體是指使用病毒或病毒相關的載體作為核酸構建體進入細胞的載體。可以將構建體整合併包裝到不複製的缺陷型病毒基因組中，象腺病毒、腺相關的病毒(Adeno-associatedvims,AAV)或單純皰滲病毒(HSV)或者其它病毒，包括反轉錄病毒和慢病毒(lentiviral)載體，用於感染或轉導到細胞中。載體可以被引入到細胞基因組中，也可以不被引入。如果需要，構建體可以包括用於轉染的病毒序列。備選地，可以將構建體引入到能夠進行附加型複製的載體中，例如EPV和EBV載體。對於具有作為核酸結合部分的多肽的檢測子構建體的裂解多肽片段來說，整個裂解的多肽片段和核酸結合部分分子可以由單個構建體編碼，包括多肽部分、接頭和核酸結合部分多肽。該構建體可以在細胞中表達或者被顯微注射到細胞中。也可以將這些構建體用於體外檢測目標核酸。適配子適配子是相當短的RNA或DNA寡核苷酸，它結合配體，是採用被稱為SELEX(指悽史富集酉己體的系統進4匕，systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)的篩選程序在體外分離到的(Tuerk&Gold,1990;Ellington&Szostak，19卯)。因為篩選程序是由配體結合所驅動的，所以適配子以高親和性結合它們的配體並摺疊成最適於配體結合的二級結構(Herman&Patel,2000)。在這個方面，適配子類似於抗體，都是選擇性結合來自複雜的化學或生物學混合物的相應配體。適配子在本發明的方法中是特別有用的。例如，可以構建檢測子構建體以便核酸結合基序包含適配子結合序列，而報導子構建體包含適配子。相反地，檢測子構建體可以包含適配子，而報導子構建體可以包含適配子結合序列。這樣，在本發明的一個實施方案中，使用編碼包含適配子的RNA寡核苷酸的載體從而能夠表達出不帶有能實質性幹擾適配子功能的側翼序列的適配子，這樣適配子在細胞中表達後就能夠起作用。在一個這樣的實施方案中，這是採用含有兩側是兩種自體裂解核酶的適配子的RNA寡核苷酸來實現的。如美國專利公開文本20050222400所證實的，當寡核苷酸被表達時,一旦自體裂解核酶裂解就會釋放出適配子，釋放的適配子具有短的側翼序列，那是自體裂解核酶的殘留，這不大可能干擾適配子序列的正確摺疊，這與現有技術的方法是相反的。不受限於任何特定機理，我們相信這些短的側翼序列不會實質性幹擾適配子的功能。由於預計RNA寡核苷酸在一些實施方案中是根據DNA模板的轉錄物，因此RNA寡核苦酸可以是能夠通過轉錄形成的任何長度。其它元件如額外的適配子、核酶、編碼區、前導序列等等也可以是RNA寡核苷酸的一部分，只要那些元件不會實質性幹擾適配子或自體裂解核酶的功能。這樣的實施方案中的適配子寡核苷酸可以是現在已知的或者以後開發的任何有用的的適配子。適配子可以以細胞中的靶點作為耙向。這樣的革巴點的一種類型是細胞組分(即天然組分)。然而，在備選實施方案中，適配子以細胞中的工程化組分為靶向。預計能夠被適配子結合有效影響的任何細胞組分都可以作為本發明適配子的潛在耙點。這些細月包組分的非限制性例子包括蛋白，如酶、結構蛋白、離子通道蛋白、電子傳遞蛋白、核酶組分、脂蛋白和轉錄因子；蛋白多糖；糖蛋白；多糖；核酸；脂；以及小分子如甾體。的。、——、、、'、、、適配子-核酸結合蛋白配對。適配子-蛋白配對的任何組合都可以用於本發明。例如，在一個實施方案中，檢測子分子的核酸結合蛋白可以是轉錄因子或者參與RNA剪接的蛋白。檢測子分子的例子是elF4A，它結合到報導子分子的58個核苷酸(nt)的適配子(Oguro等，2003)(參見實施例1-8)。在其它實施方案中，核酸結合蛋白和適配子配對包括二元適配子-肽配對，如表1和實施例11所示。此外，包括在本發明中的適配子和蛋白配對的其它例子，特別是RNA-蛋白夥伴(partner),包括但不限於；(i)MS2外殼蛋白-RNA莖環(Sawata&Taira，2003;Valegard等，1997);(ii)TAR隱TatBIV-1莖環(Roy等，1990;Comolli等，1998);(iii)表現出轉錄活化劑作用的G3/C3莖環的3個重複序列(Jarrell&Ptashne,2003);(iv)適配子的3個重複序列(Yamamoto等，2000);(v)elF4A-87-nt長的適配子，它可一皮^奮飾成58個鹼基，最佳Kd=27nM(Oguro等，2003)。核酸結合基序。核酸結合基序可以是能夠連接到另一分子，如多肽上的任何多肽或蛋白或肽分子，它們能夠以相近的距離結合到靶核酸上。本發明的其它實施方案提供的核酸結合部分是多肽。多肽可以是針對靶核酸具有高親和力的任何多肽。在該實施方案中，靶核酸可以是雙鏈的、三鏈的或者單鏈的DNA或RNA。在一些實施方案中，多肽是小於100個胺基酸的肽或全長的蛋白。多肽對靶核酸的親和力可以處於低至納摩爾、高至皮摩爾的範圍內。多肽可以包括含有鋅指的多肽，要麼是天然的，要麼是通過推理或篩選方法設計的。鋅指的例子包括Zif2g8、Spl、Gfi-l的指5、YY1的指3、CF2II的指4和6以及TTK的指2(PNAS(2000)97:1495-1500;JBiolChem(20010276(21):29466-78;NuclAcidsRes(2001)29(24):4920-9;NuclAcidRes(2001)29(11):2427-36)。其它多肽包括通過體外篩選獲得的多肽，它們結合到特定的核酸序列上。這種適配子的例子包括血小板衍生的生長因子(PDGF)(NatBiotech(2002)20:473-77)和凝血酶(Nature(1992)355:564-6)。其它多肽是體外與DNA三聚體結合的多肽；例子包括異核核糖核酸顆粒(hnRNP)蛋白的成員，如hnRNPK、L、El、A2/B1和I(NuclAcidsRes(2001)29(11):2427-36)。每個裂解的多肽核酸基序多肽的核酸結合部分可以是能夠結合到靶核酸上的任何分子。在一些實施方案中，核酸結合部分包括核酸、核酸類似物和多肽。在一個實施方案中，核酸結合部分是寡核苷酸。活化的裂解多肽片段的特定配對的核酸結合部分可以是相同種類的分子，例如寡核苷酸，或者它們可以是不同的，例如包含活性蛋白的配對中的一種裂解多肽可以含有寡核苷酸核酸結合部分，而配對中的其它成員可以含有多肽核酸結合部分。檢測子蛋白檢測子蛋白(它是檢測子分子的一部分)的裂解多肽片段可以是距離相近時進行結合形成活性蛋白的任何多肽，它可以通過能夠識別組裝的活性蛋白而不是單獨的多肽的任何手段進行檢測。例如，兩個多肽可以重新結合形成具有酶活性的蛋白，形成具有顯色活性或螢光活性蛋白，或者形成由抗體識別的蛋白。此外，對它們進行設計以使它們處於活性狀態並準備(即準備就緒狀態)重構成活性蛋白，從而使體外和體內使用蛋白互補時通常可見的任何滯後時間最小化。在一個實施方案中，檢測子分子的活化裂解多肽片段是螢光蛋白。在這樣的實施方案中，一種裂解的螢光蛋白片段是活性的，因為該片段之一含有成熟的預先形成的發色團，其準備就緒，一旦與它的同源活化的裂解螢光片段發生互補就立即發出螢光。在本發明的優選實施方案中，檢測子蛋白是螢光蛋白，作為非限制性的例子是增強型綠色螢光蛋白(EGFP)。備選地，螢光蛋白可以是黃色螢光蛋白(YFP)、增強型黃色螢光蛋白(EYFP)、藍色螢光蛋白(BFP)、增強型藍色焚光蛋白(EBFP)、青色螢光蛋白(CFP)、增強型青色螢光蛋白(ECFP)或紅色焚光蛋白(dsRED)或者它們的任何其它天然的或基因工程化的片段，其中重構的焚光蛋白的一個片段含有成熟的預先形成的發色團。所有上文提到的螢光蛋白及形成發螢光的螢光蛋白的它們的片段都包括在內用於本發明。那些本領域技術人員已知的焚光蛋白以及它們的片段和基因工程化的蛋白也包括在內。備選地，檢測子蛋白是能夠用於信號放大的酶。酶可以是例如P-內醯胺酶、|3-半乳糖苷酶、P-葡萄糖苷酶、(3-葡萄糖醛酸酶、氯黴素乙醯轉移酶。在特定實施方案中，檢測子酶是(3-內醯胺酶。在本發明的另一個實施方案中，對檢測子蛋白片段進行設計以使得它們在重構時被立即活化。此外，對它們進行設計使得它們準備重構，以便將使用螢光蛋白時通常可見的任何滯後時間最小化。在一些實施方案中，與含有成熟發色團的裂解螢光片段相結合的同源非螢光多肽片段可以包含超過一個的活性非螢光片段。這種活化的非螢光多肽通常是由一種螢光蛋白的編碼核苷酸序列在適當位點上裂解，並且獨立地表達每個核苷酸序列片段而形成的。活化的裂解螢光蛋白片段可以單獨表達或者與一個或更多個蛋白融合夥伴融合表達。在本發明的一個實施方案中，重構的活性蛋白包含活化的裂解EGFP片段，其中第一片段是EGFP的N末端片段，其包含從第l位胺基酸到大約第158位胺基酸的胺基酸連續延伸。可以將C末端半胱氨酸加到該片段上以輔助各種核酸結合基序表達後的接合。另一個活化的裂解EGFP片段是從大約第159位胺基酸到第239位胺基酸的胺基酸連續延伸。也可加入N末端半胱氨酸。第1位胺基酸是指EGFP的第一個胺基酸。第239位胺基酸是指GFP的最後一個胺基酸。所有的殘基都是根據野生型A.victoriaGFP(GenBank登錄號no.M62653;SEQIDNO7)的編號進行編號的，編號也適用於同源序列中相當的位置。這樣，當用截短的GFP(與野生型GFP相比)或者用帶有額外胺基酸的GFP進行研究時，編號必須相應地改變。在備選實施方案中，重組裝的螢光蛋白可以包含來自不同的且光譜學截然不同的螢光蛋白的活化裂解螢光片段。重構的活性螢光蛋白可能具有截然不同的和/或獨特的光譜特性，這取決於用於互補的活化裂解螢光片段。例如，通過將用於多色生物分子螢光互補(多色BiFC)的不同螢光蛋白片段進行重構，已經實現了多色螢光互補(參見Hu等，NatureBiotechnology,2003;21;539-545;Kerppola,2006，7;449-456，Hu等，蛋白隱蛋白相互作用(P.Adams和E.Golemis編輯)，冷泉港實驗室出版社.2005,將其完整引入本發明作為參考)。採用多種螢光蛋白的活化裂解螢光片段以獲得多色實時焚光，這包括在本發明的應用中，其中一個片段含有預先形成的成熟發色團。在一個實施方案中，螢光蛋白可以通過流式細胞儀、焚光板讀數儀、螢光計、顯微鏡、焚光共振能量轉移(FRET)、通過肉眼或通過本領域技術人員已知的其它方法進行檢測。在備選實施方案中，使用焚光活化細胞分選儀(FACS)或隨時間拍攝顯微鏡通過流式細胞術檢測螢光。在另一個例子中，標記是產生顯色產物/螢光產物的酶。在本發明的另一個實施方案中，活化的裂解多肽片段以近距離結合形成組裝的活性酶，這可以使用酶性活分析進行檢測。優選地，通過顯色反應或螢光反應來檢測酶活性。在一個優選實施方案中，酶是二氬葉酸還原酶(DHFR)或(3-內醯胺酶。在另一個實施方案中，酶是二氫葉酸還原酶(DHFR)。例如Michnick等已經開發了包括DHFR的N末端和C末端片段的"蛋白互補分析"，這些片段單獨時沒有任何酶活性，但是距離接近時就形成了功能性酶。參見例如美國專利Nos.6,428,951、6,294,330和6,270,964，它們被引入本發明作為參考。檢測DHFR活性的方法是現有技術中公知的，包括顯色方法和焚光方法。在備選實施方案中，可以使用其它的裂解多肽。例如，催化底物轉變成可檢測的產物的酶。幾種用於重組裝裂解多肽的這樣的系統包括但不限於P-半乳糖苷酶(Rossi等，1997,PNAS，94;8405-8410);二氬葉酸還原酶(DHFR)(Pelletier等，PNAS,1998;95;12141誦12146);TEM-1P-內醯胺酶(LAC)(Galarneauatal，Nat.Biotech.2002;20;619-622)和螢火蟲螢光素酶(Ray等，PNAS,2002,99;3105-3110以及Paulmumgan等，2002;PNAS，99;15608-15613)的重組裝。例如，已經使用裂解的P-內醯胺酶來檢測雙鏈DNA(參見Ooi等，Biochemistry,2006;45;3620-3525)。使用活化的裂解多肽片段用於實時信號檢測包括在本發明的應用中，其中片段具有充分摺疊的成熟構象，從而能夠在互補發生時快速檢測信號。在一個實施方案中，可以使用能夠放大信號的檢測子蛋白，例如帶有細胞可滲透的螢光前體P-內醯胺酶底物，頭孢菌素P-內醯胺(CCF2)的P-內醯胺酶系統(Zlokarnik等，1998;Galarneau等，2002;Wehrman等,2002),它能夠放大信號約100倍(Zlokarnik等，1998;Galarneau等，2002)。在本發明的另一個實施方案中，活化的裂解多肽片段的結合能夠形成含有不連續表位的組裝蛋白，它可以通過使用特異性識別組裝蛋白上的不連續表位，但不識別任一個體多肽上存在的部分表位的抗體來檢測。這樣的不連續表位的一個例子見於HIV的gpl20中。這些以及其它這樣的書亍生物都能夠很容易地由本領域普通技術人員根據公知技術來製備，對不通過自身蛋白片段來識別組裝蛋白的抗體進行篩選。在本發明的另一實施方案中，活化的裂解多肽可以是相互作用形成組裝蛋白的分子。例如，分子可以是蛋白片段，或者二聚體或多聚體的亞基。核酸序列和編碼目標裂解多肽片段的密碼子可以進行優化，例如將密碼子轉換成所需系統中優選使用的密碼子。例如在哺乳動物中。用於在非哺乳動物細胞中蛋白表達的最佳密碼子也是現有技術中已知的，當宿主細胞是非哺乳動物細胞(例如在昆蟲細胞中)時可以使用。本發明的活化裂解多肽可以包含所需的任何額外修飾。例如，在一個實施方案中，活化的裂解多肽也可以包含柔性接頭，它被偶聯到核酸結合部分上。可以通過本領域技術人員已知的任何手段將檢測子蛋白接合到核酸結合基序上。在一個非限制性的例子中，通過基因融合將檢測子蛋白接合到核酸結合基序上。本發明使用的術語"接合"是指將兩個或更多個蛋白連接在一起形成一個整體。可以通過接頭、化學修飾、肽接頭、化學接頭、共價鍵或非共價鍵、或蛋白融合或者通過本領域技術人員已知的任何手段26將蛋白連接在一起。連接可以是永久的或者可逆的。在一些實施方案中，可以包括幾個接頭以便利用接合物中的每個接頭和每個蛋白的所需要的性質。考慮單獨使用或與其它接頭一起使用的柔性接頭以及提高接合物溶解性的接頭都包括在本發明中。可以通過表達編碼接頭的DNA將肽接頭與接合物中的一個或多個蛋白相連接。接頭可以是酸可裂解的、光可裂解的以及熱敏感性接頭。術語"融合蛋白"是指兩個或更多個蛋白的重組蛋白。融合蛋白的產生可以通過例如將編碼一種蛋白的核酸序列連接到編碼另一種蛋白的核酸上，以便它們構成單個開放讀碼框，能夠在細胞中翻譯成包括所有預期蛋白的單個多肽。蛋白排列的順序可以變化。作為非限制性的例子，將編碼裂解檢測子多肽片段的核酸序列按照讀碼框融合到編碼核酸結合基序的核酸的5，或3，末端。這樣，一旦基因表達，裂解的檢測子蛋白就被功能性表達，包含融合到N末端或C末端的核酸結合基序。對檢測子和/或螢光蛋白進行修飾以便檢測子和/或螢光蛋白的功能性實質上不受核酸結合基序與檢測子和/或螢光蛋白的融合的影響。在一個實施方案中，將EGFP的裂解多肽片段按照讀碼框在羧基末端與裂解的elF4A片段或RNA結合肽相融合。術語"接頭"是指通過除了形成融合蛋白之外的手段連接兩個或更多個蛋白的任何手段。接頭可以是共價接頭或者非共價接頭。共價接頭的例子包括共價鍵或者共價連接到一個或多個待連接的蛋白上的接頭部分。接頭也可以是非共價鍵，例如通過金屬中心，如鉑原子形成的有機金屬鍵。對於共價連接來說，可以使用如氨基的各種官能團，包括碳酸衍生物，醚，酯，包括有機酯和無機酯，氨基，尿烷，脲等等。例如，為了進行連接，可以通過氧化、羥基化、取代、還原等等對核酸結合基序和/或螢光蛋白進行修飾以提供偶聯位點。不會明顯削減核酸結合基序和/或檢測子蛋白，例如螢光蛋白的功能的修飾將是所期望的。表達載體為了進行用於本發明的檢測子和報導子構建體的重組表達，可以使用常規技術來完成載體的構建，這些技術對於本領域普通技術人員來說不需要詳細解釋。然而為了回顧一下，普通技術人員可能希望查閱Maniatis等的分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室(NY1982)。簡要地說，編碼檢測子分子和報導子分子的核酸序列的構建採用了標準連接技術。為了分析從而確認產生的核酸構建體中的序列是正確的，可以採用連接混合物來轉染/轉導宿主細胞，並且可以通過適合的抗生素抗性選擇成功地發生遺傳改變的細胞。由轉染/轉導的細胞製備載體，通過限制性進行分析和/或通過例如Messing等(NucleicAcidsRes.,9:309-，1981)的方法、Maxam等(MethodsinEnzymology，65:499,1980)的方法、Sanger的雙脫氧法或者本領域4支術人員已知的其它合適方法進行測序。在轉錄、翻譯或者翻譯後水平上控制基因的表達。轉錄起始是基因表達中的早期事件和關鍵事件。這取決於啟動子和增強子序列，並受到與這些序列相互作用的特定細胞因子的影響。許多原核基因的轉錄單元由啟動子以及某些情況下的增強子或調節元件組成(Banerji等，Cell27:299(1981);Corden等，Science209:l楊(1980);以及Breath跳h和Chambon,Ann.Rev.Biochem.50:349(1981))。對於反轉錄病毒來說，控制元件參與了位於長末端重複序列(LTR)中的反轉錄病毒基因組的複製(Weiss等編輯，腫瘤病毒分子生物學RNA腫瘤病毒，冷泉港實驗室(NY1982))。莫洛尼(Moloney)氏小鼠白血病病毒(MLV)和勞氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)的LTR含有啟動子和增強子序列(Jolly等，NucleicAcidsRes.11:1855(1983);Capecchi等，增強子和真核基因表達，Gulzman和Shenk編輯，第101-102頁，冷泉港實^^室(NY1991))。其它有效的啟動子包括源自巨細胞病毒(CMV)的啟動子和其它野生型病毒啟動子。除非另有指明，本發明的實施採用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常M^支術，它們都在現有技術的範圍內。這些技術在文獻中有詳細說明。參見例如Sambrook，Fritsch和Maniatis編輯的分子克隆實驗指南第二版(冷泉港實驗室出版社1989);DNA克隆，第I巻和第II巻(D.N.Glover編輯，1985);寡核苦酸合成(MJ.Gait編輯，1984);Mulliseral的美國專利No:4,683,195;核酸雜交(B.D.Hames&S丄Higgins編輯，1984);轉錄和翻i,(B.D.Hames&S丄Higgins編輯，1984);動物細胞培養(R.I.Freshley,AlanR.Liss,Inc.,1987);固定化細胞和酶(IRLPress,1986);B.Perbal,分子克隆實用指南(1984);論文，酶學方法(AcademicPress,Inc.,N.Y.);用於哺乳動物細胞的基因轉移載體(J.H.Miller和M.P.Calos編輯，1987，冷泉港實驗室；酶學方法，第154和155巻(Wu等編輯)，細胞中的免疫化學方法和分子生物學(Mayer和Walker編輯，AcademicPress,London,1987);實-驗免疫學手冊，第I-IV巻(D.M.Weir和C.C.Blackwdl編輯，1986);操作小鼠胚胎(冷泉港實驗室出版社冷泉港，N.Y.，1986)。關於這些蛋白接合物或融合蛋白以及調節序列的設計、組裝、引入質粒中以及構建體的轉化方面的其它背景信息和對實驗人員的一般性指導可以在以下公開的國際專利申請中獲得W094/18317;WO95/02684;W095/24419和WO96/41865，其內容引入本發明作為參考。許多非病毒啟動子的啟動子和增強子區域也已經-陂記載(Schmidt等,Nature314:285(1985);Rossi和decrombrugghe,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:55卯-5594(1987))。用於維持和增加休眠細胞中的轉基因表達的方法包括使用包括I型膠原的膠原(1和2XProckop和Kivirikko，N.Eng.J.Med.311:376(1984);Smith和Niles，Biochem.19:1820(1980);deWet等，J.Biol.Chem.，258:143851983))、SV40和LTR啟動子在內的啟動子。根據本發明的一個實施方案，啟動子是選自泛素啟動子(ubiquitinpromoter)、CMV啟動子、JeT啟動子、SV40啟動子、延伸因子la啟動子(EFl-a)、雞(3-肌動蛋白、PGK、MT-1(金屬闢^蛋白)的組成型啟動子。本發明還包括誘導型/抑制型啟動子。這些構建體的非限制性例子是"Tet-On"、"Tet-Off'以及雷帕黴素誘導的啟動子，它們包括在本發明中。除了使用病毒啟動子和非病毒啟動子來驅動轉基因表達之外，還可以使用增強子序列來提高轉基因表達的水平。增強子不但能夠提高其天然基因的轉錄活性，而且能夠提高一些外源基因的轉錄活性(Armelor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:2702(1973))。例如在本發明中，使用帶有膠原啟動子2(I)的膠原增強子序列來增加轉基因表達。此外，也可以使用SV40病毒中發現的增強子元件來增加轉基因表達。該增強子序列由72個鹼基對重複序列組成，如Grass等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:943(1981);Benoist和Chambon，Nature290:304(1981),以及Fromm和Berg，J.Mol.Appl.Genetics,1:457(1982)所述，它們全部引入本發明作為參考。當這個重複序列與各種啟動子串聯存在時，它能夠增加許多不同病毒基因和細胞基因的轉錄(Moreau等，NucleicAcidsRes.9:6047(1981))。使用細胞因子調節啟動子活性也可以增加轉基因表達，從而獲得長期穩定的表達。已經報導過幾種調節膠原2(I)和LTR啟動子的轉基因表達的細胞因子(Chua等，connectiveTissueRes"25:161-170(1，)；Elias等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.,580:233-244(1990);Seliger等，J.Immunol.141:2138-2144(1988)以及Seliger等，J.Virology62:619-621(1988))。例如，轉化生長因子(TOF)、白細胞介素(IL)-I和幹擾素(INF)下調由各種啟動子如LTR驅動的轉基因表達。腫瘤壞死因子(TNF)和TGFl上調這些表達，它們可以被用於控制由啟動子驅動的轉基因表達。證明可因子(EGF)。在一個實施方案中，也可以使用帶有膠原增強子序列(Coll(E))的膠原啟動子來增加轉基因表達，這是通過進一步抑制對載體的任何免疫應答實現的，儘管腦處於免疫保護狀態，所述免疫應答還可能在經處理的腦中產生。在另一個實施方案中，載體可以進一步包含序列，如編碼Cre重組酶蛋白的序列以及LoxP序列。確保檢測子和/或報導子構建體的瞬時表達的另一種方式是通過使用Cre-LoxP系統，該系統造成插入的DNA序列的部分切除，這要麼是在將Cre重組酶給予細胞時(Daewoong等，NatureBiotechnology19:929-933),要麼是通過把編碼重組酶的基因引入病毒構建體中(Pluck,IntJExpPath,77:269-278)時發生。在病毒構建體中引入重組酶基因，以及LoxP位點和結構基因(目前情況下是神經營養因子)經常造成大約為期五天的結構基因表達。轉基因生物在本發明的一個實施方案中，包括了表達用於體內實時檢測核酸的報導子和檢測子構建體的轉基因生物。轉基因生物或動物可以在其所有的細胞中攜帶轉基因，或者是在一些細胞而不是全部細胞中攜帶轉基因，即嵌合體動物。轉基因可以作為單個轉基因進行整合，或者串聯整合，例如頭對頭串聯，或頭對尾串聯，或尾對尾串聯，或者作為多拷貝整合。二體、三體或多體轉基因動物可以優選包含至少兩個或更多個轉基因。在優選實施方案中，動物包含檢測子構建體，該構建體包含可操作地連接到核酸結合基序上的EGFP基因的兩半以及編碼核酸結合序列的轉基因和目標基因。當使用編碼蛋白的一種或多種基因作為轉基因時，希望將基因可操作地連接到適當的調節元件上，這將使得轉基因能夠表達。調節元件，例如啟動子，增強子，(例如誘導型或組成型)，或者多聚腺苷酸信號都是現有技術中公知的。調節序列可以是內源性調節序列，即來自同一種類動物的調節序列，該調節序列作為轉基因被引入所述種類動物中。調節序列也可以是用作轉基因的基因天然調節序列。本發明描述的轉基因構建體可以包括DNA序列下遊的3，非翻譯區。這樣的區域能夠穩定表達系統的RNA轉錄物，從而增加出自表達系統的所需蛋白的產量。在3，非翻譯區中，用於本發明構建體的是提供polyA信號的序列。這些序列可以源自例如SV40小t抗原或者現有技術中公知的其它3'非翻譯序列。3'非翻譯區的長度不是關鍵的，但是它的polyA轉錄物的穩定效應對於穩定表達序列的RNA看來是重要的。轉基因構建體也可以包括啟動子和編碼信號序列的DNA序列之間的5，非翻譯區。這樣的非翻譯區可以來自獲取啟動子的相同控制區或者可以來自不同的基因，例如它們可以源自其它合成的、半合成的或者天然的來源。反義核酸也可以用於本發明的轉基因構建體。例如，可以將反義多核苷酸序列(與DNA編碼鏈互補的)引入到細胞中以減少"正常"基因的表達。該方法利用例如反義核酸、核酶或者三鏈體試劑(triplexagents)來阻斷特定mRNA的轉錄或翻譯，要麼是通過用反義核酸或三鏈體試劑掩蔽mRNA,要麼是通過用核酶將它裂解。備選地，所述方法包括給予模擬基因產物的作用或效應的試劑或者阻斷基因作用的試劑。使用反義方法改變體外基因翻譯是現有技術中公知的(參見例如Marcus-Sekum,172ANAL.BIOCHEM.289-95,1988)。本發明描述的轉基因構建體可以被插入到任何合適的質粒、噬菌體或病毒載體中用於擴增，從而可以使用現有技術中已知的方法進行增殖，如Maniatis等(分子克隆實-驗指南，冷泉港，N.Y.，1989)中描述的方法。可以將構建體製備成較大質粒的一部分，這使得能夠按照現有技術已知的有效方式克隆和篩選構建體。構建體可以位於質粒上適宜的限制性位點之間，以便它們可以從餘下質粒序列上容易地分離，從而被引入到所需哺乳動物中。本發明的方法也涉及轉基因動物或細胞的生產，其中通過使用反轉錄病毒載體將外源DNA引入到卵母細胞中。通過利用病毒感染過程，反轉錄病毒載體可以有效地用於將基因轉移到宿主細胞中(Kim等，4ANIM.BIOTECHNOL.53-69,1993;Kim等，35MOL.REPROD.DEV.105-13,1993;Haskell和Bowen，40MOL.REPROD.DEV.386-90,1995;Chan等，95PROC.NATL.ACAD.SCI.USA14028-33,1998;Krimpenfort等，1991;Bowen等，50BIOL.REPROD.664-68,1994;Tada等，1TRANSGENICS535-40,1995)。應用本發明的方法可以被用於本領域技術人員已知的多種應用。本發明的一個重要的實施方案是用於體內實時檢測RNA的報導子分析方法。在一個這樣的實施方案中，目標細胞穩定地表達檢測子分子，該檢測子分子在沒有靶RNA時不產生來自檢測子蛋白的信號，因而不發出螢光或者顯示出活性。細胞也可表達誘導型報導子分子，該報導子分子包含檢測子分子的核酸結合基序的結合位點以及目標基因，當目標基因在細胞中表達時，檢測子分子將結合耙RNA並促進檢測子蛋白重構以及產生活性蛋白和信號。這樣實現了體內實時檢測RNA表達，在圖10-11和18-19以及實施例9-11中進行了舉例說明。在備選實施方案中，目標細胞可以表達與目標啟動子可操作地連接的報導子構建體。當啟動子在細胞中被某些刺激物活化時，針對靶核酸序列的結合位點就成為可用的了，檢測子分子的核酸結合蛋白的結合有助於檢測子多肽片段的結合，以及能被立即檢測的活性檢測子蛋白的形成。該實施方案能夠在體內實時研究啟動子的功能。例如，可以通過轉染質粒並分析任意的原始檢測子構建體活性來實時研究基因的調節，其中質粒表達驅動RNA結合位點的啟動子。在相關實施方案中，將細胞i)與一種或多種化合物接觸；或者ii)經歷各種可能改變啟動子活性的狀況，從而增加、減少或者不引起RNA轉錄的變化。通過檢測子構建體立即檢測出這種變化。備選地，本發明的方法提供了體內檢測靶核酸存在的方法，即使是在沒有檢測子構建體的情況下。在這樣的實施方案中，例如核酸，例如DNA和/或RNA，包含與檢測子分子的核酸結合基序結合的靶核酸序列。在這樣的實施方案中，根據檢測子分子的核酸組分的設計，能夠在體內檢測天然的或未修飾的核酸。在類似的實施方案中，本發明的方法可以4吏用"tet-on"或"tet-off'系統。例如，可以製備穩定表達本發明的檢測子構建體的目標細胞。此外，細胞也可以穩定表達tet-on或tet-off可調節報導子構建體，而它能夠控制針對檢測子分子核酸結合基序的靶結合位點和目標基因的轉錄。例如，在tet-off系統中，細胞將立即表達目標基因，報導子構建體將被活化並可以被立即檢測到。當加入tet時，報導子構建體(包含目標基因和靶核酸結合位點)的轉錄就停止了，只有已經轉錄的轉錄物才能被實時分析。在該tet-off的例子中，我們能夠通過檢測減弱的報導子螢光或活性從而實時分析體內RNA的穩定性，如它的半衰期。在備選實施方案中，使用"te-on"構建體能夠在活細胞中穩定表達目標基因，這樣將tet加入系統中就啟動了報導子構建體的轉錄。然後，本發明的檢測子分子能夠結合它的耙RNA並且可以被立即檢測到。在該實施方案中，可以按照進行實-瞼的人員所要求的那樣實時研究RNA定位。在本發明的另一個實施方案中，報導子分析是在生物體內進行的。例如但沒有限制，可以製備動物、非人動物、小鼠、斑馬魚、線蟲或蛙來表達檢測子構建體和目標基因，目標基因上帶有將結合到檢測子構建體上的RNA結合位點。兩種構建體在生物體中的表達實現了通過從第1天的胚胎直到成年期進行取樣，從而在整個發育期間分析目標轉錄物。在一個實施方案中，生物為哺乳動物。在一個實施方案中，哺乳動物是小鼠，在另一個實施方案中，生物是轉基因生物，例如但不限於轉基因小鼠。備選地，本發明的組合物和方法用於類似於原位雜交，例如螢光原位雜交(FISH)的體內實時檢測RNA的方法。在這樣的實施方案中，將表達包含目標RNA的才艮道子構建體的細胞進行透化，該目標RNA帶有將結合到檢測子分子的核酸結合基序上的RNA結合序列，將本發明的檢測子構建體給予細胞。如果表達了目標RNA,檢測子構建體將與RNA結合序列結合，就能夠確定RNA的定位和豐度。該系統相對於常規原位雜交技術的優點在於能夠檢測低豐度的RNA(歸因於採用酶報導子的檢測子構建體所得到的信號放大)以及能夠迅速完成分析且沒有放射性。立即進行檢測子構建體的檢測是相當值得期待的。目前，進行原位雜交的常規方法(例如帶有放射性的)在知道實驗是否成功之前可能甚至耗時數周到數月。此外，常規原位雜交中使用的RNA探針很難製備，這是因為RNA容易降解以及要應用放射性。在本發明的方法中，無需放射性或RNA探針。檢測子構建體很容易由例如細菌來製備，這是本領域技術人員已知的。這種分析方法類似於免疫組織化學或免疫細胞化學技術，它們使用抗體來體外檢測蛋白。這裡是4全測RNA。此外，本發明的組合物和方法可以用於體內實時4全測DNA的實施方案。例如，本發明的檢測子構建體可以包含檢測子蛋白(焚光的或酶的)，它被裂解成至少兩個失活的多肽片段，每個片段都與DNA結合基序結合。靶核酸的存在將多肽片段聚集在一起，在這種情況下靶核酸是DNA,多肽片段就形成了具有完全活化的檢測子蛋白，能夠被立即檢測到。例如，本發明的方法能夠實時檢測基因組中各種位點的複製。與檢測子構建體中的檢測子蛋白相結合的DNA結合基序是特異性針對DNA的各個區域的，可以在體內實時檢測那些位點的複製。類似地，我們能夠使用本發明的方法和組合物在體內實時檢測染色體。例如，檢測子構建體可以包含與端粒末端轉移酶結合蛋白相結合的並在細胞中表達的檢測子蛋白。這樣，在細胞的生命期中都能夠實時檢測端粒末端轉移酶。本發明記載的組合物和方法的優點在於通過提供端粒末端轉移酶結合蛋白提高了特異性，該端粒末端轉移酶被平分成兩半，每一半都與檢測子蛋白的一半結合。端粒末端轉移酶結合蛋白的兩半協同結合到單一結合位點上，這就確保了靶向識別之前幾乎沒有檢測子活性。在本發明的另一個實施方案中，公開了實時^r測PCR產物的方法。使用本發明的方法和組合物，PCR反應產物的一企測具有比目前可用的方法更高的特異性並且是實時的。在該實施方案的實施例中，PCR引物的設計使得反應的擴增產物中摻入能夠被檢測子構建體上存在的核酸結合基序特異性識別的適配子。在擴增進行時，能夠實時檢測檢測子蛋白。本發明提供了相對於目前使用的技術，如SYBR綠的優點，這是因為檢測子構建體是特異性針對PCR產物的，將不會檢測模板DNA。使用該實施方案，能夠通過在進行PCR實驗之前將RNA轉變成cDNA來實時檢測RNA。在相關實施方案中，檢測子分子的核酸結合基序組分促進了PCR產物存在時的裂解檢測子分子的重組裝，提供了用於體內免疫PCR的新方法。而且，在另一個實施方案中，檢測子分子的核酸結合組分能夠促進免疫RCA(滾環擴增)方法中核酸存在時裂解檢測子分子的重組裝，從而產生信號，導致了體內的高信號放大。在本發明的另一實施方案中，公開了用於檢測個體中多態性、突變或異常基因表達的方法。例如，本發明的分析方法可以一皮用於檢測個體的DNA和/或RNA以診斷某些疾病、障礙或者易患這些疾病和障礙的體質。因此，如果檢測子構建體能夠設計成帶有核酸結合基序的話，本發明的方法就能夠用於各種疾病和障礙的診斷和預後，其中核酸結合基序是特異性針對於患有疾病或障礙的個體的基因組中可能存在的某些序列的。在相關的實施方案中，本發明能夠用於實時^^測個體中的基因突變、多態性或畸變。作為說明性例子，適配子能夠標記或者暫時結合到特定的突變或多態性位點，這可以通過本發明的裂解多肽分子進行檢測，該多肽分子被設計成便於檢測子分子的核酸結合基序識別所結合的適配子，而該適配子結合到包含我們試圖檢測的特定突變、多態性或畸變的目標基因上。備選地，可以#_用分子庫(pool)，由此可以衝企測多種突變、多態性或畸變。如果核酸結合基序識別所結合的靶核酸，如與基因置換和/或改變相關的適配子，就形成了檢測子蛋白的蛋白互補並能夠用於敏感性檢測，這歸因於立即產生了信號和/或螢光。在一個重要的實施方案中，分子可以被用於實時檢測病原體。在一個實施方案中，本發明的分子可以被用於檢測病原體核酸序列和/或核酸序列中的畸變的存在，該畸變是病原體和/或病原體核酸存在的結果。病原體可以是病毒感染、真菌感染、細菌感染、寄生蟲感染以及其它感染性疾病。病毒可以選自l型單純皰滲病毒、2型單純皰滲病毒、巨細胞病毒、EB病毒、水痘-帶狀皰滲病毒、人皰疹病毒6、人皰滲病毒7、人皰滲病毒8、天花病毒、水泡性口膜炎病毒、曱型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠狀病毒、曱型流感病毒、乙型流感病毒、麻滲病毒、多瘤病毒、人類乳頭狀瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯薩奇病毒、登革熱病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病毒、勞氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus)、黃熱病毒、伊波拉病毒、馬爾堡病毒(Marburgvims)、拉沙熱病毒、東方馬腦炎病毒、日本腦炎病毒、聖路易腦炎病毒(St.LouisEncephalitisvirus)、墨累谷腦炎病毒(MurrayValleyfevervirus)、西尼羅河病毒、裂谷熱病毒(RiftValleyfevervirus)、輪狀病毒A型、輪狀病毒B型、輪狀病毒C型、辛德畢斯病毒(Sindbisvirus)、猴免疫缺陷病毒、人T細胞白血病病毒1型、漢坦病毒、風疹病毒、猴免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒1型以及人免疫缺陷病毒2型。靶核酸也可以用於食品、飲料、水、藥品、個人護理品、乳製品或者環境樣品中細菌和真核生物的檢測。優選的飲料包括汽水、瓶裝水、果汁、哞酒、葡萄酒或者酒類產品。對於製造或貯藏食品、飲料、水、藥品、個人護理品、乳製品或者環境樣品時所使用的原材料、設備、產品或者工藝的分析而言，所開發的分析方法將是特別有用的。在本發明的另一個相關實施方案中，活化的裂解多肽片段經組裝形成含有不連續表位的組裝檢測子蛋白，它可以通過使用特異性識別組裝蛋白上的不連續表位但是不識別任何個體多肽上存在的局部表位的抗體來檢測。一個這樣的不連續表位的例子發現於HIV的gpl20中。這些以及其它這樣的衍生物都能夠很容易地由本領域普通技術人員根據公知技術進行製備，並且對不通過自身的任何蛋白片段來識別組裝蛋白的抗體進行篩選。靶核酸可以是人源的。耙核酸可以是DNA或RNA。耙核酸可以是游離在溶液中的或者固定到固體載體上的。在一個實施方案中，靶核酸是特異性針對遺傳疾病的或者是特異性針對易患遺傳疾病的體質的。所述疾病可以是，例如(3-地中海貧血，鐮狀細胞貧血或者凝血因子VLeiden，遺傳疾病象嚢性纖維化病(CF)，癌症相關靶點如p53和p10,或者乳腺癌易感的BRC-1和BRC-2。在另一個實施方案中，可以研究與親子鑑定、身份確認或者犯罪調查相關的分離的染色體DNA。在另一個實施方案中，本發明提供了適用於本發明的方法，特別是體內檢測RNA的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒包含檢測子構建體和誘導型報導子構建體。在一個實施方案中，報導子構建體和檢測子構建體處在分開的核酸分子上。在另一個實施方案中，它們都由雙順反子核酸分子編碼。在相關的實施方案中，裂解多肽片段由IRES位點分開。在另一個實施方案中，多肽片段被編碼成一種包含可裂解位點的核酸，而且它可以被裂解形成分開的多肽片段，這是通過本領域技術人員已知的手段實現的，例如但不限於酶切；化學裂解、光裂解、酸裂解、熱裂解等等。在另一個實施方案中，可以通過加入實驗人員的目標基因來修飾報導子分子，在另一個實施方案中，報導子分子的表達是與tet-on或tet-off啟動子可操作地相關聯的。在另一個變型的實施方案中，實驗人員可以修飾包含靶核酸序列的報導子構建體以使其被實驗人員的目標啟動子調節。在每個這樣實施方案中，試劑盒都包含用於檢測子分子中的檢測子蛋白的裂解多肽的選項，也包含用於檢測來自檢測子蛋白的信號的說明書和試劑。在一些實施方案中，試劑盒也包含適用於捕獲和/或檢測樣品中靶核酸的存在或數量的試劑。用於檢測靶核酸的存在和/或數量的試劑可以包括酶活性試劑或者特異性針對組裝蛋白的抗體。抗體可被標記。蛋白互補和酶報導子的組合能夠實質性降低背景和放大信號。這形成了能夠分析低豐度、中等豐度和高豐度核酸的體內RNA檢測技術。在另一個實施方案中，本發明提供了適於體內檢測靶核酸存在和/或數量的試劑盒。試劑盒至少包含偶聯到第一分子上的第一探針和偶聯到第二分子上的第二探針，其中探針能夠結合到靶核酸的雜交序列上。優選地，探針是在小瓶中的。試劑盒也包含適用於捕獲和/或檢測樣品中靶核酸存在或數量的試劑。用於檢測靶核酸存在和/或數量的試劑可以包括酶學活性試劑或者特異性針對組裝蛋白的抗體。抗體可以被標記。這樣的試劑盒可以任選地包括進行RCA反應、免疫RCA、免疫PCR所需的試劑，如DNA聚合酶、DNA聚合酶輔助因子以及脫氧核糖核酸-5，-三磷酸。任選地，試劑盒也可以包括各種多核苦酸分子，DNA或RNA連接酶，限制性內切酶，反轉錄酶，末端轉移酶，各種緩衝液和試劑，抗體以及RNase和核酸酶活性的抑制劑。這些組分是在容器如小瓶中的。試劑盒也可以包括進行陽性和陰性對照反應所必需的試劑以及說明書。用於給定反應的試劑的最佳量可以由技術人員在目前公開內容的幫助下很容易地確定。在另一個實施方案中，本發明的方法可以被用於多個核酸靶點同時進行蛋白互補。例如，具有相關的不同核酸結合基序的互補裂解多肽片段的蛋白互補。一種靶核酸的存在將有助於一種活性裂解多肽片段配對的蛋白互補，而另一種靶點的存在將有助於另一對活化的裂解多肽片段的蛋白互補，這產生了不同的活性蛋白和可檢測的信號。在一個這樣的實施方案中，多個靶核酸能夠被同時檢測。在備選實施方案中，可以通過實時蛋白互補來監測靶核酸如RNA和DNA的同時檢測。在相關實施方案中，多個蛋白互補使用來自不同螢光蛋白的裂解螢光蛋白片段。在相關實施方案中，本發明的方法使得能夠實時檢測和鑑別各種其它推定的但並不相同的核酸靶點之中的特定靶核酸(參見Hu等，NatureBiotechnology,2003;21;539-545;Kerppola，2006，7;449-456,Hu等，蛋白-蛋白互補(P.Adams和E.Golemis編輯)，冷泉港實驗室出版社，2005,將它們全部引入本發明作為參考)。定義除非另有說明，本發明使用的下列術語和短語應具有下述含義本發明使用的術語"檢測子構建體"應包括編碼檢測子蛋白和核酸結合基序的核酸序列，其中包含檢測子分子。本發明使用的術語"報導子構建體"應包括目標核酸(例如DNA或RNA)以及耙核酸序列(例如RNA適配子)，其中包含報導子分子。術語"真核生物"或"真核生物"應包括動物、植物和原生生物界中的所有生物，包括原生動物、真菌、酵母、綠藻、單細胞植物、多細胞植物，以及所有動物，脊推動物和無脊推動物。該術語不包括細菌或病毒。"真核細胞"應包括單個的"真核細胞"以及多個"真核細胞"，包含源自真核生物的細月包。術語"脊推動物"應包括單個"脊推動物"以及多個"脊推動物"，包括哺乳動物和鳥類，以及魚、爬蟲類和兩棲動物。術語"哺乳動物"應包括單個"哺乳動物"和多個"哺乳動物"，包括但不限於人類；靈長類如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科動物如狗和狼；貓科動物如貓、獅子和虎；馬科動物如馬、驢和斑馬，食用動物如奶牛、豬和綿羊；有蹄類動物如鹿和長頸鹿；嚙齒類動物如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠；以及熊。優選地，哺乳動物是人類受試者。本發明使用的術語"體內"應包括存在於生物體中的活細胞。當談及生物體外存在的活細胞時，使用典型的術語"離體"。活細胞可以是形成任何生物體的任何細胞，包括多細胞生物體和單細胞生物體，如酵母和細菌。本發明使用的術語"侵入性"就檢測活細胞中的核酸而言，是指使用侵入性方法檢測核酸的方法，例如脂轉染和顯微注射。因此術語"非侵入性"就是指不採用這樣的侵入性方法來檢測活細胞中的核酸的方法。術語"組織培養"或"細胞培養"或"培養(culture)"或培養(culturing)"是指在能夠維持細胞結構、維持細胞功能、進一步分化或者所有這三者的條件下體外維持一直物或動物組織或細胞，或使植物或動物組織或細胞在體外生長。"原代組織細胞"是直接取自組織的細胞，即在生物體內行使同樣功能的相同種類的細胞群。當將組織細胞接種到培養板上時，用蛋白水解酶胰蛋白酶處理這些組織細胞，例如將它們分離形成長成或維持細胞結構的單個原代組織細胞。由組織培養物中的原代細胞增殖產生的細胞培養物被稱為"次代細胞培養物"。大多數次代細胞進行有限次數的分裂，然後死亡。然而少數次代細胞可以度過這個"危機期"，此後它們能夠無限增殖形成連續的"細胞系"。培養細胞的液體培養基在本發明中被稱為"培養基(culturemedium)，，或"培養基(culturemedia)，，。在細胞培養期間，所需要的分子例如免疫球蛋白分子已經分泌到培養基中，在本發明中該培養基被稱為"條件培養基"。細胞也可以不是指特定的受試者細胞，而是指這種細胞因為某些修飾或環境影響，例如分化而形成的後代或者潛在後代，這樣後代可能實際上不同於親本細胞，但是其仍然包括在本發明的範圍中。本發明中使用的細胞可以是例如體外或離體培養的細胞，正如本發明實施例中所顯示的。例如，細胞在培養基中體外培養，並且可以向培養基中加入外界刺激。備選地，對於離體培養的細胞來說，可以從受試者獲取細胞，其中受試者是健康的和/或感染疾病的。作為非限制性的例子，可以通過活組織檢查或本領域技術人員已知的其它外科手術手段獲取細胞。術語"IRES"是指內核糖體進入位點(見Kozak(1991)J.Biol.Chem.266,19867-70)，是編石馬共有衝亥並唐體(consensusribosome)結合4立點的序歹寸，能夠被起始密碼子和/或調節序列的5'端或者其它編碼基因或標記基因的核酸序列的5'端即刻插入，以增強下遊核酸序列的表達。進4亍這種修飾的期望或需要可以根據經驗確定。術語"多核苷酸"是指核酸或構建體中存在的任意一種或多種核酸區段或者核酸分子，例如DNA或RNA片段。"編碼目標基因的多核苷酸"是指包含這種多肽的編碼區的多核苷酸。此外，多核苷酸可以編碼調節序列，如啟動子或轉錄終止子，或者可以編碼多肽或蛋白的特定元件，如分泌信號肽或功能結構域。"核苷酸"是聚合核酸如DNA或RNA中的單體單元，其由三種不同的子部分或部分組成糖、磷酸和鹼基(Blackburn,M.,1996)。當作為雙鏈體的一部分時，核苦酸也被稱為"鹼基"或"鹼基對"。最常見的天然形成的鹼基是腺。票呤(A)、鳥噤呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)，它們具有以序列特異性方式將一種核酸鏈結合到另一核酸鏈上的氫鍵功能。"核苷"是指沒有磷酸基的核苷酸。在DNA和RNA中，核苷單體通過磷酸二酯鍵連接，其中本發明使用的術語"磷酸二酯鍵"是指磷酸二酯鍵，包括其磷酸類似物的鍵，包括結合的反離子，例如IT'、NW、Na'等等。"多核香酸"或"寡核苷酸"是指天然核苷酸單體或其類似物的線性聚合物，包括雙鏈和單鏈的脫氧核糖核酸"DNA"、核糖核酸"RNA"等等。換句話說，"寡核苷酸"是脫氧核糖核酸鏈或核糖核酸鏈，它們分別是包含脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的結構單元。典型的多核苷酸處在幾個單體單元，例如8-40個到幾千個單體單元的長度範圍內。只要DNA多核苷酸由字母序列來表示，例如"ATGCCTG，，，那麼應理解為核苷酸是從左到右為5'一3，方向，"A"表示脫氧腺苷，"C"代表脫氧胞苷，"G"代表脫氧鳥苷，"T"代表胸苷，除非另有說明。"沃森/克裡克鹼基配對"和"沃森/克裡克互補"是指特定核苷酸及其類似物的配對模式，其通過氬鍵結合到一起，例如A與T和U配對，G與C配對。特定鹼基配對的行為是"雜交(hybridization)"或"雜交對就形成了雜種。J^-'-、、、、、、'、-"檢測"是指根據檢測標記的性質來檢測、觀察或測定構建體。術語"修飾的鹼基"是指DNA和RNA中發現的天然形成的鹼基AGC、T、U的配只於》威基書f生物。術語"啟動子"是指足以引導轉錄的最小核苦酸序列。本發明也包括足以提供由細胞類型特異性、組織特異性控制的或者被外部信號或試劑誘導的啟動子依賴的基因表達的那些啟動子元件；這些元件可以位於天然基因的5，或3，區，或者位於內含子中。術語"誘導型啟動子"是指RNA聚合酶結合速率和轉錄起始速率可以被外部刺激物調節的啟動子。術語"組成型啟動子"是指RNA聚合酶結合速率和轉錄起始速率不變且相對獨立於外部刺激物的啟動子。術語"瞬時調節啟動子"是指在發育期間的特定時間調節RNA聚合酶結合速率和轉錄起始速率的啟動子。所有這些啟動子類型都包括在本發明中。本發明使用的"啟動子"或"啟動子區"或"啟動子元件"在本發明中可以互換使用，是指對可操作地連接到其上的核酸序列轉錄進行控制的核酸序列區4爻，典型的是DNA或RNA或其類似物，但不限於此。啟動子區包括足以進行RNA聚合酶識別、結合和轉錄起始的特定序列。啟動子區的這個部分被稱為啟動子。此外，啟動子區包括調節RNA聚合酶的這種識別、結合和轉錄起始活性的序列。這些序列可以是順式作用的，或者可以是響應反式作用因子的。根據調節性質，啟動子可以是組成型或調節型的。術語"組成型活性啟動子"是指在給定細胞中始終表達的基因的啟動子。用於哺乳動物細胞的示例性啟動子包括巨細胞病毒(CMV)啟動子，用於原核細胞的包括噬菌體T7和T3啟動子等等。術語"可操作地連接"或"可操作地結合，，在本發明中可以互換使用，是指核酸序列與核苷酸調節序列，如啟動子、增強子、轉錄和翻譯終止位點以及其它信號序列之間的功能性關係。例如，核酸序列，典型的是DNA,與調節序列或啟動子區可操作的連接是指DNA和調節序列或啟動子之間的物理性和功能性關係，其通過特異性識別、結合和轉錄DNA的RNA聚合酶使得這種DNA的轉錄從調節序列或啟動子開始。為了優化表達和/或體外轉錄，為了在表達核酸或DNA的細胞類型中表達核酸或DNA而修飾調節序列可能是必需的。對這種修飾的預期或需要可以根據經驗確定。術語"接合"是指兩個或更多個蛋白結合在一起形成一個整體的連接。蛋白質可以通過接頭、化學修飾、肽接頭、化學接頭、共價鍵或非共價鍵、或蛋白融合或者通過本領域技術人員已知的任何手段連接在一起。連接可以是永久的或者可逆的。在一些實施方案中，可以包括幾個接頭以便利用接合物中的每個接頭和每個蛋白的所需性質。打算單獨使用或與其它接頭一起使用的柔性接頭和提高接合物溶解性的接頭都被包括在本發明中。可以通過表達編碼接頭的DNA而將肽接頭與接合物中的一個或多個蛋白相連接。接頭可以是酸可裂解的、光可裂解的以及熱敏感性接頭。在一些實施方案中，"接合"或"接合的"也包括共價的、離子的或疏水的相互作用，由此將分子的各個部分結合在一起並保持接近。在本發明中，"適配子，，是指人工設計的來強力地和特異性地與特定靶蛋白相結合的核酸配體。"調節適配子"是指適配子的核心部分經過設計的適配子，這樣其具有低Tm值，並且被分成兩個短的寡核香酸鏈，只有在存在靶蛋白時才結合形成雙鏈。實施例實施例1由核酸相互作用促成的蛋白互補方法。為了表明由核酸相互作用促成的快速蛋白互補的可行性，在體外進行了幾個實驗。圖20a、20b顯示了本發明討論的核酸相互作用是如何進行的。在這些實驗中，選擇增強型綠色螢光蛋白(EGFP)作為標記蛋白是出於許多原因的。首先，根據特徵性螢光的存在很容易確定EGFP的活性。其次，GFP家族的螢光蛋白已經被成功地用作幾種蛋白-蛋白互補研究中的標記蛋白或才全測子蛋白，例如Ozawa等，2000，Ozawa等，2001a，b;Ghosh等，2000;Hu等，2002;Hu&Kerppola,2003;Remy&Michnick,2004;Magliery等，2005，它們都論證了成功裂解EGFP的方案。這些研究顯示，EGFP的第153-161位胺基酸之間的環是用於裂解的便利部位蛋白插入該環中不影響體內蛋白的摺疊和發色團的形成(Ozawa等，2000，Ozawa等，2001a,b;Ghosh等，2000;Hu等，2002;Hu&Kerppola,2003;Remy&Michnick，2004;Magliery等，2005)。而且重要的是，當兩個片段在E.coli中共表達時，沒有顯示出螢光團或發色團的自發性自組裝(Gosh等，2000;Hu等，2002;Magliery等，2005)。這樣，為了證實核酸的相互作用可以引導GFP的兩個裂解多肽片段結合以形成活性螢光蛋白，我們設計了兩個與互補寡核苷酸接合的EGFP多肽片段，以證實偶聯的寡核香酸形成的雙鏈DNA促進了EGFP片段的重新結合，進而形成活性EGFP蛋白並發出強烈螢光。在這些研究中，在第158位將EGFP遺傳裂解成兩個部分，稱為cc片段和(3片段。為了與寡核香酸偶聯，分別在C末端和N末端採用額外的半胱氨酸殘基對a-EGFP片段和P-EGFP片段進行設計。它們在E.coli中表達為帶有蛋白內含子的C末端融合蛋白，應用蛋白內含子自裂解化學(NEBiolabs)進行純化。使用便利的Cys靶向的生物素-HPDP化學(Pierce)將純化的蛋白在體外定量生物素化到接合的寡核苷酸上。首先採用鏈黴親和素標記生物素化的蛋白，接著用5，或3'末端帶有生物素的寡核苷酸標記。這樣，很容易通過四聚鏈黴親和素分子將在不同末端上帶有生物素的互補的21nt長的寡核香酸添加到EGFP的oc片段和P片段上(圖20a)。當這些分子嵌合體以等摩爾量組合時，發出強烈的焚光，表明具有類似於EGFP發射光譜的螢光團的形成(圖20b)。在對照實驗中，將與鏈黴親和素融合但不帶有互補寡核苦酸的生物素化的EGFP的a片段和(3片段混合在一起，沒有檢測到明顯的螢光(圖20b)。螢光恢復隨實驗不同而稍微不同，最大恢復接近完整摺疊EGF的螢光的100%。因此，在大多數情況下，通過可控的蛋白互補能夠恢復100%的GFP螢光。由帶有附加的寡核苷酸的裂解EGFP片段重構獲得的重構EGFP的螢光光譜稍孩t不同於天然EGFP的螢光光譜。首先，與天然EGFP(488/507nm，Zimmer,2002)相比，重構蛋白的發射和激發最大值(490/524)發生了紅移(圖20b)。這可以由重構蛋白P-摺疊結構的構象中存在可能的微小差異來解釋。其次，一旦加入Mg2+離子，重構複合物與EGFP之間的差異就明顯了。一旦加入2mMMg2+,天然蛋白的螢光降低大約30%,而重構EGFP的螢光首先增加了大約30%，然後逐漸降低(圖21)。Mg2十的不同影響可以由附加到重構EGFP上的雙鏈DNA的存在來解釋。實際上，DNA雙鏈象夾鉗(pincergrip)—樣將EGFP的兩個片段結合在一起，因為加入Mg2+離子使得DNA雙鏈更穩定，這可能導致重組裝的EGFP穩定性更高，結果導致初始的螢光增加。相反地，對於天然螢光蛋白來說，已知發色團附近存在二價金屬陽離子會淬滅螢光(Richmond等，2000;Zimmer，2002)。因此，重構EGFP的焚光逐漸降低是兩個過程的結果由Mg2+離子存在使DNA雙鏈穩定性更高導致的複合物穩定化以及螢光淬滅。實施例2檢測用於可控的快速蛋白互補的蛋白。在實施例l中，蛋白互補中的標記蛋白或檢測子蛋白是螢光蛋白，即增強型綠色焚光蛋白(EGFP)，它是水母A叫uoreavictoriaGFP的雙突變體(F64L,S65T)。EGFP和其它相關的焚光蛋白在第154-158位殘基處的裂解已經被成功地用於幾種被設計用來測試體內蛋白/蛋白相互作用的研究中(Ghosh等，2000;Hu&Kerppola,2003;Remy&Michnick2004;Magliery等，2005)。這些研究表明由片段在體內重組裝成活性EGFP並不是自發發生的，而是需要額外的蛋白/蛋白相互作用(Maglieri等，2005)。此外，已經表明EGFP重組裝對相互作用的蛋白的大小具有相當大的耐受性(Ghosh等，2000;Hu&Kerppola，2003;Remy&Michnick2004;Magliery等，2005)。為了將蛋白互補用於RNA定位的研究，特別重要的是片段重組裝的動力學要足夠快。在我們的體外初步研究中，非常迅速的活化裂解EGFP片段的互補引起了螢光增加(圖22A)。這可能是因為EGFP的oc片段含有預先形成的成熟發色團，因而處於活化構象並且一旦與互補的EGFP(3片段結合就能夠立即形成活性螢光蛋白。這種EGFP重組裝的快速動力學的獨特性質使得監測耙RNA在體內的快速運動成為可能。為此，我們由一個質粒表達了互補系統的兩個蛋白組分，並且在2-3小時後i秀導帶有適配子標籤的靶RNA的合成。這樣，我們就能夠監測特定RNA的運動。使用另一種標記蛋白，例如黃色螢光蛋白的變體Venus(F64L，M153T,V163A,S175G)也是可能的，因為它具有比EGFP更快的螢光團成熟速度(Kox=8x10.3s"比1.5X10-4s")並具有更高的量子產率(Nagai等.2002)。此外，該蛋白對光漂白更穩定，它的光譜特性使得能夠更好地與細胞蛋白的自發焚光相區別。在另一個實施例中，標記是產生生色產物/螢光產物的酶。為了開發具有信號放大的蛋白互補系統，我們利用了帶有促螢光的P-內醯胺酶底物，頭孑包菌素P-內醯胺(CCF2)的p-內醯胺酶系統(Zlokarnik等，1998;Galarneau等，2002;Wehrman等，2002)，該底物是細胞可滲透的。據顯示，這種酶系統能夠獲得大約100倍的信號放大(Zlokarnik等，1998;Galarneau等，2002)。定量體內分析顯示，16小時後低至每個Jurkat細胞50個P-內醯胺酶分子能夠在背景之上被檢測到。通過減少暴露於底物的時間，定量測得20,000個P-內醯胺酶分子。這種靈敏度實質上比用螢光蛋白能夠獲得的靈敏度更高，後者的檢測需要105到106個靶分子/細胞在背景自發螢光之上(Zlokarnik等，1998)。因此，具有酶活性的標記蛋白將產生比螢光蛋白更高的信號。然而，在酶學方法中可能要部分損失空間分辯率，這歸因於小分子量顯色反應產物的擴散。因此，根據特定實驗的需要，可以使用這兩種系統(螢光的或酶學的)中的任何一種。為了證明互補核酸相互作用輔助的蛋白互補的可能性，我們選擇增強型綠色螢光蛋白(EGFP)分子作為模型，將其切成兩個片段，1-158和159-234aa。使用含有全長EGFP-1基因的質粒(Clontech，PaloAlto，CA)經PCR獲得相應的基因。將兩個片段設計成在C末端(aCys-片段，1-158)和N末端((3Cys-片段，159-234aa)帶有額外的Cys殘基。在TWIN-1(NewEnglandBiolabs,MA)載體中克隆PCR產物，作為SspDNAB蛋白內含子的C末端融合蛋白。所有構建體的結構經測序驗證。EGFP的a片段包含預先形成的發色團。儘管有一些小的光譜差別，通過基於核酸的蛋白互補還是能夠恢復至高達100%的螢光。以DNA為模板的EGFP重組裝的動力學快得驚人，其t1/2為-100秒(見圖22),接近於EGFP由帶有成熟發色團的變性蛋白復性的動力學(Reid&Flynn,1997,Zimmer，2000)。眾所周知，螢光蛋白中典型的發色團成熟需要數小時(Zimmer,2000，Fig.22b)。根據快速動力學數據，本發明的方法能夠產生含有成熟發色團的EGFPa片段。由於a片段足夠大，其含有從N末端起的158個胺基酸(根據EGFP中的總共239個胺基酸)，因此它具有形成完全發色團的潛能。分子模型印證了EGFP的a片段中存在完全形成的成熟發色團。在圖23a中，oc片段的結構構象的示意圖表明a片段摺疊成了非常緊密的結構(除了它懸出來的C末端部分)，a片段中形成發色團的胺基酸的空間坐標與全長EGFP中的空間坐標是非常接近的(圖23b、c)。這也符合螢光蛋白多肽鏈的特定結構，其在中央螺旋中有劇烈的~800的彎曲，導致了形成發色團的胺基酸T66、Y67和G68很接近(Barondeau等，2003;Donnely等，2001)。儘管完全形成的a片段中的發色團缺乏與C末端P片段中的胺基酸的許多重要的接觸，這些重要接觸存在於全長的EGFP中，而且a片段中的發色團暴露於溶劑中，因此缺乏顯示強烈螢光的能力，這種能力是完整蛋白中的生發團的特徵。為了直接確定ot片段中促螢光發色團的存在，我們單獨分析了p片段的吸收光譜和螢光光語，並將它們與全長EGFP的光譜相比較(圖24)。作為對照，也記錄了EGFP的(3片段和兩種非螢光蛋白(鏈黴親和素和胰凝乳蛋白酶原)的光譜。oc-和P-EGFP片段的吸收光譜顯示在圖24b中。正如我們所見的，它們都沒有490nm下的天然EGFP中可見的特徵性最大值(圖24b)。然而，oc片段的特徵是在300-400nm的區域中具有高的多的吸收值，這是P片段(圖24b，插圖)或者任何非螢光蛋白(未顯示)中所沒有的。a片段的螢光光譜(圖24d)清楚地顯示了特徵性的激發光譜中360nm下的最大值以及弱發射光譜中460nm下的最大值。這些光i普與全長EGFP的光譜(圖24c)是完全不同的，然而它們與合成的發色團的光譜以及通過部分蛋白酶解從GFP中分離的含有發色團的短肽的光譜是一致的(圖25)(Niwa等，1996)。要注意的是，暴露於溶劑的發色團(如同它處在cc片段中)應該吸收300-40nm的光而不是450-500nm的光(如同在全長EGFP中)。在獨立的實驗中，當裂解的EGFP片段在活的E.coli體內表達時，裂解的EGFP片段產生了不同於完全形成的天然結構EGFP的光譜(圖25)。因此以這種方式產生的EGFP的cx和(3片段是活化形式的，儘管單獨的是無螢光的或者失活的，但是它們能夠重新結合以形成活性螢光蛋白。活化的互補EGFP片段的這種重新結合可以是在體外和體內的，核酸相互作用能夠促進EGFP片段的互補。螢光恢復或重構的快速動力學是與處於活化狀態的片段一致的，只有在與相應的互補片段重構時才是有活性的。特別地，EGFP的a片段含有成熟發色團，因而是活化狀態的，然而由於成熟發色團的淬滅，所以單獨的是失活的。含有81個C末端胺基酸的EGFP(3片段的加入導致了緊密的兩部分蛋白結構的形成，將發色團與外界隔離，產生了迅速而強烈的螢光顯色(只要兩個蛋白片段通過結合的DNA-DNA或其它核酸互補相互作用而靠在一起)。這些相當意外的結果對於開發體內快速蛋白互補的方法來說是非常重要的。已經含有成熟發色團的EGFP的a片段以及a片段與P片段的重新結合的使用導致了活性EGFP蛋白的形成，這是在幾秒之內發生的。表達這些裂解的EGFP或裂解的焚光片段，其中含有預先形成的成熟發色團的一個片段可以在RNA組分誘導之前進4亍表達。RNA組分的RNA合成的誘導將促進片段的快速蛋白互補並增加螢光。這應當使得我們能夠從RNA表達早期開始跟蹤特定RNA的命運。結果顯示，帶有互補寡核苷酸的兩個EGFP片段的孵育導致焚光發射光譜(激發最大值490nm)增加，其最大值在524nm處，這是EGFP光譜的特徵。當EGFP片段在沒有與互補核香酸混合在一起時，沒有發現螢光光譜變化。實施例3檢測子蛋白和核酸結合蛋白的接合。在這個實驗中，我們驗證了在沒有相互作用的適配子序列時，兩個切開的蛋白嵌合體的表達將不會產生重構的螢光。這個實驗在E.coli中進行。通過PCR從質粒pEGFP(Clontech)中獲得EGFP基因片段。EGFP基因的裂解發生在與體外實驗相同的位置(1-158,159-239)。採用含有全長elF4A的質粒(pGEX-4Al)。通過PCR獲得elF4A的Fl和F2片段，根據Oguro等的方法進行裂解(見圖3)。將帶有SG接頭的兩個融合蛋白插入到為兩種信^吏共表達而構建的兩個質粒pETDuet1和pACYDuet-l(Novagen)中。這兩個質粒具有不同的複製起點和不同的選擇標記。得到的質粒pMB12和pMB13在E,coli菌林BL21(DE3)(Novagen)中共表達。在pMB12中，通過(Ser-Gly)5肽接頭將被稱為A的EGFP的前158個胺基酸連接到被稱為Fl的真核起始因子蛋白4A(elF-4A)的前215個胺基酸上。類似地，在pMB13中，將被稱為B的含有EGFP的C末端92個胺基酸的肽連接到被稱為F2的elF-4A的另外一半上(圖3)。兩種構建體都在T7啟動子的控制之下，用1mMIPTG進行誘導。通過FACS測定螢光水平，它們比得上未經誘導的培養物的螢光水平(圖4)。作為該實驗中的陽性對照，我們在載體pTWIN(NEB)中表達了全長EGFP,並且作為陰性對照一融合到elF4A的相同Fl片段的EGFP的片段(A-F1，B-F1)(圖4)。在另一實驗中，在被稱為pMP33的相同質粒中表達A-EGFP-Fl-elF-4A和B-EGFP-F2-elF-4A核酸，它們是在E.coli中表達的。PMB33質粒是pACYCDuetl(Novagen)的書f生物，是表達兩種嵌合的裂解EGFP-elF-4A片段蛋白的雙順反子質粒，該蛋白包含標記蛋白(例如EGFP或酶)的片段以及RNA結合蛋白(例如MS2外殼蛋白或elF4a)的片段。表達的嵌合的裂解片段在沒有靶RNA時不會重新組合(圖9a),但是在靶RNA存在時就迅速重新結合形成功能性EGFP標記蛋白(圖9c)。因此，RNA結合蛋白與靶RNA的核酸相互作用能夠促進體外和體內的快速蛋白互補以及來自裂解EGFP片段的螢光以快速動力學恢復。這可以通過所結合的21-bp寡核苦酸或者RNA結合蛋白與核酸的互補結合來促成。實施例4適配子-核酸結合蛋白配對的選擇。在本發明的一個實施方案中，蛋白互補是基於對標記到目標核酸序列例如RNA上的適配子的檢測。適配子可以通過接合到檢測子蛋白上的核酸結合蛋白來檢測。特別地，核酸結合蛋白被分成片段，各個片段接合到檢測子蛋白的多肽片段上。幾個適配子/蛋白的相互作用的參數對於成功地開發基於核酸的蛋白互補來說是重要的。(i)RNA適配子和RNA結合蛋白之間的結合親和力應當足夠高以便為標記蛋白的重組裝提供能量。(ii)適配子的長度不應該太長，否則將適配子引入RNA就可能導致其表達和性能的改變。(iii)RNA結合蛋白應當是單體、小的多肽，優選由兩個結構域組成，它們在分開時是失活的，但是當一起表達時能夠結合適配子。elF4A是真核起始因子，因此是真核翻譯系統中普遍存在的組分。它在酵母中的天然濃度高(50nM)，比得上另一種豐富的細胞蛋白，肌動蛋白的濃度(Duncan等，1987)。它是29kD的小蛋白，其作為ATP依賴性RNA解旋酶在與其它起始因子(4B、4H、4G、4F)(Kapp&Lorsch,2004)的複合物中起作用。elF4A由兩個結構域組成，它的晶體結構類似於啞鈴結構緊密的N末端和C末端結構域由柔性的11aa長的接頭連接(Johnson&McKay,1999;Benz等，1999;Camthers等，2000)。這些結構特徵使得這個蛋白成為切開結構域的方便且有用的工具。此外，最近的研究中已經分離了以納摩爾級親和力結合elF4A的強結合寡核苦酸或適配子(Oguro等，2003)。Oguro等表明強結合的適配子序列可以短至56nt,發現elF4A的切開的結構域不能結合適配子，而全長蛋白能夠以高親和力結合適配子(Oguro等，2003)。由於這些特點，elF4A是用於蛋白互補的良好候選物，並被用於我們的系統以驅動蛋白互補。我們使用的elF4A被裂解成兩個片段，其中每個片段都融合到EGFP4企測子蛋白的片段上。在RNA適配子存在時，elF4A的重組裝就會因此將EGFP蛋白的兩個片段聚集在一起。適配子-elF4A相互作用的親和力與用於監測細胞中RNA的MS2外殼蛋白/MS2RNA相互作用的親和力處在相同範圍內(Bertrand等，1998;Beach等，1999;Beach&Bloom，2001;Rook等，2000)。備選地，互補配對的設計可以包括兩個不同的RNA適配子和附加到標記蛋白片段上的兩個不同蛋白(圖5)。這種情況下的蛋白或肽將從病毒蛋白列表中選擇，為此已經體外分離了具有高結合親和力的適配子(見表1)。表1.具有強結合親和力的RNA適配子/肽配對tableseeoriginaldocumentpage48tableseeoriginaldocumentpage49該備選設計的優點在於兩個不同蛋白或肽將不大可能彼此相互作用，這不同於將一種蛋白裂解成兩個片段。在裂解蛋白的情況下，切開的蛋白片段仍然可能自發地重組裝。選擇適配子/蛋白配對的主要參數是複合物的穩定性(Kd):相互作用越強，標記蛋白互補的概率就越高。我們推斷，相似大小的蛋白(或肽)對於活性互補複合物的形成來說是有利的，這是因為組分的對稱幾何形狀。人工適配子的體外選擇能夠發現高度特異性結合短肽和只結合同源肽的RNA結構。同時，含有那些短肽的更大蛋白與不同適配子交叉反應(Herman&Patel，2000)。例如，已知Rex蛋白與Rev應答元件的一部分結合，能夠從功能上替代Rev(Bogerd等，1991;Rimsky等，1988);然而，體外篩選導致了不與Rev肽相互作用的抗Rex特異性適配子的分離(Baskerville等，1999)。把RNA也可以被設計為含有結合蛋白的結構域。這種靶RNA也將由相應的質粒表達。表1顯示了具有強結合親和力的幾種適配子和肽配對，它們可以用作蛋白互補中的RNA標籤。備選地，可以使用潛在的RNA-蛋白夥伴的另外的例子，它們包括在本發明中，選自包括但不限於以下列表(i)MS2夕卜殼蛋白-RNA莖環(Sawata&Taira,2003;Valegard等,1997)。(ii)TAR畫TatBIV畫l莖環(Roy等，1990;Comolli等，1998)。(iii)經顯示作為轉錄激活物起作用的G3/C3莖環的3個重複序列(Jarrell&Ptashne,2003)。(iv)適配子的3個重複序列(Yamamoto等，2000)。(v)elF4A-87-nt長的適配子，可以被修飾為58個鹼基，最佳Kd=27nM(Oguro等，2003)。實施例5由適配子-核酸結合蛋白相互作用引導的蛋白互補。在本發明的一個實施方案中，實時蛋白互補方法是基於將適配子標籤引入到目標RNA中，它將被蛋白複合物識別，該蛋白複合物由兩個蛋白嵌合體組成，每個嵌合體含有標記蛋白和RNA結合蛋白的片段。為了可靠地使用該系統，適配子標籤的引入應當不幹擾RNA合成和性能。為了顯示使用蛋白互補監測目標RNA，將適配子加到目標基因中。為了顯示適配子不影響真核基因表達，我們在釀酒酵母菌林YPH500(MAToc，um3-52，Iys2-801琥珀色，ade2-101赭石色trpl-A63,his3-A200，Ieu2-Al)中的報導子基因的終止密碼子後面緊接著引入64nt的寡核苷酸(Oguro等，2003)。我們使用可誘導系統，其中報導子基因，例如EGFP受人工Tet-應答的GAL1啟動子(Blake等，2003)的控制。在該系統中，由GAL10啟動子表達TetR基因以便在存在半乳糖時，TetR介導EGFP的阻遏(圖1A)。這種阻遏可以通過加入誘導物脫水四環素(ATc)來解除，它直接結合到TetR上(圖1B)。然後通過流式細胞術分析(FACS),在含有染色體整合的可誘導轉錄系統的細胞中，對半乳糖和ATc存在時的EGFP表達定量。我們沒有觀察到表達未修飾EGFP的細胞與在該基因的3'端插入適配子的細胞之間的焚光差別(圖2)。因此，帶有適配子序列的基因的3，端標記似乎不會影響蛋白水平的基因表達。我們合理地假定RNA水平也不會受到該適配子標籤存在的影響。文獻分析顯示適配子序列可以被引入5，-或3'-端非翻譯RNA區而不幹擾RNA合成(Hanson等，2003;Nickens等，2003),而它能夠影響翻譯效率，特別是如果被引入的適配子與一些翻譯調節物，例如四環素相互作用時(Hanson等，2003)。我們的初步結果證實了這些數據，顯示將針對elF4A的適配子引入3，端-非翻譯區不會影響標記蛋白EGFP在酵母中的表達，這表明EGFPmRNA水平也不會受影響。為了使系統更靈活，我們可以通過測試5，端-非翻譯區是否也能用於適配子引入來擴展這些實驗。例如，使用EGFP作為標記蛋白，根據適配子標籤的位置體內測定其表達。適配子的影響將通過使用螢光細胞分選儀(FACS)測定細胞總螢光以及通過Northern印跡分析來跟蹤，這將直接估計RNA的轉錄水平。適配子標籤的最可能的摻入部位仍是3，端-非翻譯區。引入標籤對RNA運動和定位的影響也是要考慮的。mRNA的3，-UTR含有決定mRNA定位的調節元件(綜述，參見Hesketh,2004)。例如，ASH1mRNA的3'UTR編碼足夠用於mRNA在芽中轉運和錨定的信號。然而在許多情況下，在信使其它部分中的序列對於正確RNA定位來說也是必需的(Chartrand等，1999,Gonzalez等，1999)。例如，使用不去除信使任何部分的最短的可能適配子標籤。在這樣做的時候，維持了所有調節RNA序列以保留所有的RNA/蛋白相互作用，並形成RNA的完整定位。假設焚光蛋白(或P-內醯胺酶)以及與RNA中與適配子相互作用的小肽是小尺寸的，那麼重組裝蛋白複合物在RNA模板上的定位具有相當大耐受性。儘管如此，仍然在對照實驗中通過與特異性針對於給定mRNA的探針原位雜交，直接糹全驗了修飾RNA的正確定位。實施例6用於二嵌合體蛋白等摩爾共表達的系統的開發，每個嵌合蛋白都含有螢光標記蛋白的片段和RNA結合蛋白的片段。為了成功實施本發明的實時蛋白互補方法，協同合成(coordinatedsynthesis)了兩個多肽蛋白片段，包含活化標記蛋白的每個片段都接合到RNA結合蛋白上，它們以等摩爾量形成並準備重組。以前的蛋白互補研究顯示，如果由具有不同拷貝數的質粒合成兩個融合蛋白，就檢測不到GFP的螢光恢復(Magliery等，2005)。因此，我們開發了進行蛋白片段的等摩爾合成的系統以及用於RNA組分獨立合成的可誘導系統。為了等摩爾量表達二嵌合體蛋白，我們使用了能夠使幾個信使共表達的表達載體(pETDuet或pACYCDuet載體，Novagen)。這些質粒具有兩個T7啟動子和兩個多克隆位點，因此每個質粒都能夠支持兩個信使的表達。同時這些質粒中的複製起點是不同的，使它們能夠共表達。我們在一個質粒中放置二嵌合體蛋白，在不同質粒中放置帶標籤的RNA;以便RNA表達能夠被獨立地誘導。將使用獨立誘導RNA表達的pBAD質粒。用抗EGFP抗體(Clontech)經Western印跡分析檢驗嵌合蛋白的表達水平，而RNA合成通過Northern印跡4企驗。這些實驗在E.coli中進行，通過使用FACS測定細胞總螢光來監測蛋白互補。作為對照，在沒有RNA組分時表達二蛋白嵌合物的細胞背景未顯示出螢光(圖9A)，而在存在適配子時它們的表達則產生了螢光(圖9C)，證實了適配子/RNA結合蛋白/肽相互作用的特異性。實施例7(3-內醯胺酶用作裂解多肽檢測子蛋白。兩個獨立小組已經使用了A類(3-內醯胺酶作為蛋白互補分析中的裂解標記蛋白(Wehrman等，2002;Galarneau等，2002),這可能是因為這類酶具有幾個有吸引力的特徵。首先，這些蛋白是相對小的單體酶，它們的晶體結構是公知的(Jelsch等，1993)。|3-內醯胺酶在細菌和真核細胞中都能表達；重要的是真核細胞不具有內源性內醯胺酶活性。採用體內P-內醯胺酶做為有力工具的另一重要因素是可以使用由Tsien小組開發的細月包透性的焚光底物(Zlokarnik等，1997)。上述兩個小組已經表明(3-內醯胺酶可以在196-198位殘基處切開，在附加的相互作用蛋白的存在下，這些片段能夠;f皮此互補(Wehrman等，2002;Galarneau等，2002)。這個位點(第196-198位胺基酸)位於催化中心的相反部位，不顯示周期性二級結構。Blau的小組證明Asp-Gly-Arg三肽摻入到(3-內醯胺酶N末端片段的C末端會增加酶活性高達10,000倍(Wehrman等，2002)。因此，基於(3-內醯胺酶活性的蛋白互補能夠放大信號大約兩個數量級，能夠在蛋白誘導後數分鐘內檢測到信號(Wehrman等，2002)。應當強調的是，基於酶活性重構的蛋白互補就靈敏度而言是有前景的；然而由於信號擴散而可能損失空間分辯率。因此，這種分析形式應當優選應用於空間分辯率不是那麼重要的時候，以及例如低豐度RNA的檢測是重要的場合。在採用(3-內醯胺酶作為原核和真核細胞中的體內RNA檢測分析的檢測子蛋白的方法中，可以將P-內醯胺酶裂解成活化的多肽片段，正如Blau的小組所表明的(Wehrman等，2002)。在E.coli中克隆兩個片段，一個片段由第24到197位胺基酸殘基組成(cc片段，缺少周質分泌信號系統從而將酶保留在細胞內)，第二個片段由第198到240位殘基組成(P片段)。首先從pUC19中PCR擴增a和(3片段，並且經PCR將三肽NGR加到oc片段的C末端。用多肽接頭將編碼oc片段的PCR產物克隆到elF4A的Fl片段的下遊，同時將13-內醯胺酶的P片段克隆到elF4A的F2片段的下遊。對於原核表達來說，將嵌合的裂解P-內醯胺酶-elF4A接合蛋白引入到pCDF-duet載體(Novagen)中，同時由pACYCD質粒表達帶有elF4A結合適配子的RNA靶點。將所得到的質粒在E.coli菌抹BL21(DE3)(Novagen)中共表達。接合到elF4A多肽片段上的P-內醯胺酶在真核細胞中的表達是在釀酒酵母中進行的。用於在酵母中表達含有(3-內醯胺酶和elF4A片段[(3-內醯胺酶(A)-(Fl)和P-內醯胺酶(B)-(F2)]的嵌合蛋白的質粒將是表達載體pDB20(Becker等，1991)的書f生物，它經修飾以表達在其N末端與HA或myc表位標籤融合的蛋白。這將^i且成型蛋白能夠由ADH1強啟動子進行表達並通過Western印跡分析基因的表達。對質粒pRS4Dl(Blake等2003)進行修飾以表達在基因的3'末端帶有64nt長的適配子標籤的靶RNA(代替EGFP)。該質粒在菌林YPH500基因組中的整合將使得一旦將半乳糖和脫水四環素加到培養基中時就能夠調節標記的靶RNA的表達(Blake等2003)。當沒有(3-內醯胺酶活性時，香豆素在409nm的激發將引起FRET,並且將在520nm處出現發射(綠色螢光)。由於適配子與裂解elF4A片段之間的相互作用而產生了P-內醯胺酶活性，它將打開(3-內醯胺環並且焚光素將分裂，在這種情況下將不發生FRET,將觀察到447nm處的發射(藍色螢光)(Zlokamik等1998)。實施例8通過體外和體內快速蛋白互補檢測RNA分子。在下面的實施例中，我們開發了在活細胞中4全測RNA的強效方法，它具有超出目前檢測水平的靈敏度。實時快速動力學蛋白互補與信號放大組合在一起就產生了能夠分析中等豐度核酸的檢測技術，其中蛋白互補採用了活化的裂解焚光片段(見實施例2)，它能夠實質上快速重構活性檢測子蛋白並降低背景，其中信號放大是通過使用酶的步驟而引進的。將具有酶活性或螢光性質的蛋白裂解成兩部分(稱為oc和P亞基)。這些部分作為與核酸結合蛋白的嵌合物在體內表達，該核酸結合蛋白具有適配子結合的結構域。理想的核酸結合蛋白將由兩部分組成，它們單獨時是失活的但是一起時就是有活性的。在含有可以由核酸結合蛋白識別的基序的RNA存在時，檢測子蛋白的活性立即恢復。如果蛋白檢測子是酶，信號就被放大。如果蛋白是發螢光的，就沒有信號放大，但是也沒有背景，因為螢光完全取決於靶RNA的存在。我們製備了用於在￡.co//BL21(DE)3細胞中共表達融合蛋白和含有適配子的RNA轉錄物的構建體(圖9)。我們通過由絲氨酸和甘氨酸殘基組成的柔性多肽接頭，將EGFP片段(第1-158位殘基)的C末端融合到含有第1-215位殘基的elF4A片段的N末端。我們在載體pACYCDuet-l(Novagen)的第一多克隆位點(MCS)上克隆該融合物，該載體是設計用來由兩個T7啟動子表達兩個開放讀碼框的。類似地，我們通過柔性多肽接頭將EGFP片段的C末端(第159-238位殘基)融合到含有第216-406位胺基酸的elF4A片段的N末端。在載體pACYCDuet-l的第二MCS上克隆該融合物以產生能夠以大致等摩爾量表達兩個融合蛋白的構建體。載體pETDuet-l(Novagen)用於表達360nt長的T7轉錄物，它含有串聯的兩個拷貝的與elF4A相互作用的適配子序列。這個小信使含有33nt的前導序列，接著是兩個拷貝的適配子序列以及大約200nt的抗核酸酶的T7終止序列。將表達完整的互補複合物和適宜對照的五.co//細胞在誘導物，異丙基-(3-D-硫代半乳糖苦(IPTG)存在下室溫培養，用於蛋白和RNA的共表達。當培養物的光密度達到大約0.5(OD600=0.5)時，通過螢光活化細胞分選儀(FACS)來分析它們(圖21)。互補融合蛋白與含有適配子的RNA轉錄物的共表達導致平均螢光增加10-20倍(圖9C)。然而，在沒有含有適配子的轉錄物時，帶有互補融合蛋白的五."//細胞未顯示高於背景水平的焚光(圖9A)。更重要的是，當細胞表達互補複合物的蛋白組分與未標記的轉錄物時，我們沒有看見螢光明顯增加(圖12)。當T7轉錄物有或沒有核糖體結合位點時，螢光產量沒有差別。這表明信使的翻譯不幹擾它的檢測。實施例9體內RNA分子的定量。表達完整EGFP的細胞的螢光比帶有互補系統的細胞的螢光高大約30-50倍(圖9B和9C)。這個差別並不令人驚訝，因為與重組裝EGFP相比應該有更大量的全長EGFP，其濃度由RNA濃度決定。已知每個RNA分子都通過核糖體循環幾次，這導致了蛋白與RNA的摩爾比大於1。接著我們利用EGFP標準珠(BDBiosciencesClontech)來評估每個細胞中重組裝EGFP分子的絕對平均數，從而評估我們的檢測系統的效率。我們發現表達來自具有大約40個拷貝數的pET載體的RNA的細胞產生了500-600個重組裝EGFP分子，其相當於1-2piMRNA，如果細胞體積是1.41x1(T15L的話(Lee,等，2005)。該RNA濃度與由具有50-70個拷貝/細胞的載體在五.co/Z中獲得的實驗結果很好地關聯(Lee,等，2005)。期望的結果和實驗結果之間的一致性表明實際上可以通過重組裝蛋白複合物檢測到含有適配子的所有RNA分子。我們通過增加帶有RNA適配子的質粒的拷貝數(40-100個拷貝/細胞)來檢驗這個假設，觀察到細菌細胞顯示了與原始構建體相比更高的螢光(圖13)。該結果支持了我們的結論，即我們的互補系統能夠檢測到幾乎所有RNA分子。然後，我們比較了帶有重組裝EGFP的細胞的螢光光譜與表達全長蛋白的細胞的焚光光譜。我們在這些實驗中發現重組裝複合物的最大激發在470nm處(相對於天然EGFP的490nm)，最大發射在大約520nm處(相對於天然EGFP的508nm)(圖14)。這個差別可以由天然EGFP與重組裝EGFP-RNA複合物之間蛋白構象的可能的變化來解釋。這個結果也支持了細胞中螢光信號歸因於形成了核蛋白複合物的想法，因為在我們的體外實驗中，我們也發現了由附加雙鏈寡核普酸重組裝的裂解EGFP的相似的紅移發射光譜(最大524nm)(Demidov等，2006)。實施例10細菌細胞中螢光在時間和空間上的波動。使用落射焚光顯樣麼鏡(epifluorescencemicroscope)和B&W照相機觀察表達RNA標記系統的細胞(圖9c和11)。同時，記錄孩i分幹涉相差圖像以分析細胞數量和形狀。為了達到足夠用來形成複合物和產生焚光的時間，將細胞室溫培養過夜。因此，當很少或沒有分裂發生時，大多數細胞都處於靜止期。在某些情況下，我們確實觀察到了細胞分裂，在所有情況下新分裂的細胞都不發螢光(圖15)。融合蛋白和含有適配子的RNA轉錄物的共表達產生了帶螢光的細胞，螢光亮點位於細胞的一極或兩極(圖10)。相反，全長EGFP的表達產生了帶強烈螢光的細胞，螢光均勻分布在整個細胞中(圖9b)。同時，在沒有適配子表達時，融合蛋白的表達不會導致明顯的焚光產生(圖9a),這證實了我們前面的流式細胞術結果。時移顯微術(Time-lapsemicroscopy)顯示了帶焚光粒子的幾個顯著特徵以及細胞總螢光的變化。圖IO顯示了在一個典型實驗中以30分鐘間隔拍攝的一系列圖像。同一視野中的細胞顯示了不同振幅的同步波動(圖11c)。每個細胞中的總螢光在前兩個小時內逐漸減少，但是隨後又增加了。同時，細胞總螢光的減少導致了細胞極處出現強螢光粒子。有趣的是，幾個細胞在實驗過程中產生螢光(圖llb，180分鐘以及以後)。這些變化的動力學是隨著不同實驗而變化的，但是螢光隨時間的增加和減少的總體模式始終是一樣的。為了證明細胞焚光的變化實際上顯示了RNA的動力學，我們^J田胞培養物中提取了總RNA，使用實時竟爭性PCR(rcPCR)結合MALDI-TOFMS檢測來確定適配子和mreBRNA的絕對濃度，mreBRNA是用於標準化的管家基因。實時竟爭性PCR利用連續稀釋的DNA竟爭劑作為目標基因在擴增之前的內標。使用MALDI-TOFMS,在l或2nt鹼基的延伸反應中利用了竟爭劑和目標基因之間的單個鹼基差異來對延伸產物的豐度定量。適配子mRNA水平分析顯示了統計學上的明顯波動，而對照基因mreB保持不變(表2)。數據顯示在l小時標記處，適配子轉錄物達到峰值，然後在120到150分鐘處迅速降回到零時間點的基線水平。接著是170分鐘處的另一轉錄峰值，最後是急劇的下降，然後恢復到初始的零時間點的適配子mRNA水平。表2.適配子mRNA轉錄物水平和TITAN(Elvidge等，2006)統計時間(分鐘)等價點(M)mreB適配子倍數P值R202.67E-144.52E-111.00-0.975602.45E-145.49E-111.320.0330.9861202.57E-144.76E-111.090.2600.9卯1502.42E-144.47E-111.090.2430.9691702.54E-145.33E-111,240.0520.9892102.69E-143.73E-110.820.0810.9882402.06E-143.51E-111.010.4960.9872702.48E-144.14E-110.980.4520.984濃度值是針對於從每個細胞培養平板提取的RNA樣品的。倍數值相對於管家對照基因mreB進行了調整，並且是相對於零時間點基線來計算的。bootstrapP值是對其表達不同於基線的基因的置信度測量值。所有被分析樣品的殘值(residualvalue)和失擬值(lack-of-fitvalue)均O.05;是優質分析的象徵。用於實施例9和本實施例的應用技術可以被用於^r測RNA定位和運動。這種新技術的這樣的應用的一個例子是我們能夠研究ASH1mRNA。該RNA編碼抑制HO核酸內切酶轉錄和阻斷子細胞中的交配型互換的細胞命運決定子。通過不同方法都已經證明它定位在出芽酵母細胞的芽尖上。ASH1mRNA被充分研究了；因此它可以被用作模型實驗來驗證活細胞中RNA定位和運動分析的靈敏度和特異性。實施例11利用二元適配子-肽的相互作用體內檢測RNA。在實驗9和10中，我們顯示了體內對RNA的監測，其中組合使用了螢光蛋白互補以及RNA蛋白與RNA-適配子的高親和力相互作用。在這些實驗中，RNA結合蛋白是由啞鈴型結構構成的真核起始因子4A(elF4A)。將elF4A切成兩個片段，並將每個片段融合到增強型綠色螢光蛋白(EGFP)的裂解片段上。兩個互補融合蛋白和含有elF4A特異性適配子的轉錄物的共表達引起了細菌中EGFP螢光的恢復。該方法的主要優點在於螢光信號僅由靶RNA決定，換句話說，沒有RNA就沒有可檢測的信號。此外，相當小的蛋白複合物組裝在靶RNA上，這樣就不會干擾RNA功能和定位。在實驗ll中，我們提供了關於開發用於RNA觀察的備選實施方案的數據，其中適配子結合部分是兩個短肽。在該方法中，將兩個不同的RNA適配子作為標籤加到目標RNA上，並由與裂解EGFP片段融合的兩個病毒短肽來識別(圖16)。進行這些修飾有幾個原因。首先，組裝在靶RNA上的蛋白複合物與含有重組裝elF4A的蛋白複合物相比實質上更小。通常，檢測工具越小，幹擾功能的可能性就越低。第二，elF4A是真核細胞中的翻譯機器的組分，在細菌蛋白中也有其相近的同源物。因此，它的過表達有可能會干擾正常細胞的功能。同時，病毒短肽在細菌或真核細胞中沒有同源蛋白，因此它們在細胞中的表達對於細胞功能來說更可能是中性的。最後，識別複合物的RNA的備選設計給新方法增加了更多靈活性，顯示了它的普適性。用於體內RNA檢測的互補複合物的設計根據是二元適配子-肽的相互作用。根據我們的計劃，為了檢測活細胞中的RNA，提供的RNA應當具有能夠與兩個肽相互作用的兩個適配子序列。每個肽應當在細胞中表達為與裂解的增強型綠色螢光蛋白(EGFP)的兩個片段之一的融合物(圖16)。為了使這種系統運行，要考慮幾個問題；首先，每個所選擇的相互作用的肽/適配子配對的親和力應當高並且兩個配對都要以相當的親和力進4亍結合。第二，兩個適配子/肽配對之間應當沒有交叉反應性，換句話說，每種相互作用的特異性應是足夠高的。第三，肽之間應當沒有相互作用，否則可能將標記蛋白片段聚集在一起從而增加了非特異性背景。其次，肽的長度應當是能夠使互補複合物對稱組裝的相當長度。最後，兩個適配子的位置應當使得它們中的任何一個都能夠與相應的肽獨立地相互作用。這可以使用位於適配子之間的柔性接頭來實現。帶有富含精氨酸基序(ARM)的肽是決定許多RNA結合蛋白與相應RNA靶點相互作用的高親和性和高特異性的片段(22)。這些肽的共同特徵是精氨酸佔優勢，而沒有其它相似性。最近，目的在於了解ARM-肽與相應RNA的相互作用機制的研究得出結論，精氨酸位置的特定模式和肽骨架的柔性是相應RNA配體特異性結合的原因(23)。然而，許多ARM-肽表現出"變色龍樣"行為，並與許多靶RNA結合，儘管親和力較低(24)。記住了這一點，我們從ARM病毒肽(25-27)中選擇RNA結合蛋白，但是在將它們應用到蛋白互補之前，測試了它們與相應RNA的交叉反應性。選擇適配子-肽配對的體外實驗。根據可獲得的數據，我們選擇了三種肽/適配子配對；(i)HIVHex;(ii)噬菌體以及(iii)HTLV-1Rev(見表1)，在體外測試了它們與同源夥伴的結合親和力以及與其它兩種RNA適配子的交叉反應性。在RNA適配子的固定濃度使得隨著ARM-肽濃度增加能夠形成複合物的條件下，我們使用了非放射性凝膠轉移分析。我們對未結合的RNA適配子和轉移的複合物進行定量(表1)。結果顯示XN肽和HIV-1Rex肽顯示出高特異性且不與非匹配RNA適配子交叉反應。同時，HTLV-1Rev肽未顯示出與兩種非匹配RNA適配子的交叉反應性。根據這些結果，我們得出結論XN肽和HTLV-1的Rex肽以及它們相應的適配子提供了用於我們的蛋白互補複合物中的最佳配對(見表3)。tableseeoriginaldocumentpage59表3.三種RNA適配子/肽配對之間的交叉反應利用二元肽/適配子的相互作用^r測細菌活細胞中的RNA轉錄物。克隆融合蛋白和含有適配子的RNA轉錄物，在BL21(DE)3細胞中表達(圖17)。通過由絲氨酸和甘氨酸殘基組成的柔性接頭將EGFP片段(第1-158位殘基)C末端融合到Rex肽(16aa)的N末端。類似地，也通過多肽接頭將第二EGFP片段(第159-238位殘基)的N末端融合到入N肽(22aa)的C末端。通過多步PCR合成編碼兩個融合蛋白的完整DNA插入片段和它們之間的T7啟動子區域，並克隆到載體pACYCDuet-l的Wcol和乂wl1位點之間以產生能夠共表達兩個融合蛋白的構建體。使用載體pETDuet-l(Novagen)來表達230nt長的T7轉錄物，其含有兩個由5或lO個dT殘基連接的適配子序列。該信使包括前導序列，接著是兩個適配子序列，以及大約200nt的抗核酸酶的T7終止序列。在誘導物異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在時，將表達完整互補複合物和合適對照的五.co//細胞室溫培養過夜用於蛋白和RNA的共表達。當培養物的光密度達到大約0.5(OD6Q=0.5)時，通過螢光活化細胞分選儀(FACS)對它們進行分析(圖17)。將表達完整互補複合物的￡.co/z'細胞的螢光與只表達兩個融合蛋白的細胞的焚光以及與表達兩個融合蛋白加上兩個適配子的錯誤組合(由10個dT核苷酸連接的兩個相同Rex肽結合的適配子)的細胞的螢光進行比較。結果顯示在沒有RNA表達時，lmMIPTG的誘導產生了高細胞焚光(圖17A),表達正確適配子序列和錯誤適配子序列的細胞在螢光分布方面也沒有差別(圖17A)。我們認為用lmMIPTG誘導的T7啟動子表達的融合蛋白濃度太高，甚至在沒有RNA靶時就進行重組裝。如果這個意見是正確的，那麼降低IPTG濃度就會導致背景降低。實際上，IPTG濃度降低IO倍就能夠將只表達融合蛋白的細胞與表達帶有兩個正確RNA適配子的蛋白的細胞的焚光分布分開。然而，特異性仍然不高，不足以區別正確適配子序列和錯誤適配子序列。最後，IPTG濃度降低到O.OlmM就能夠將帶有正確和錯誤適配子序列的細胞的螢光分布區分開。在這些優化條件下，表達完整互補複合物的細胞的平均焚光超出背景螢光(沒有RNA成分)10-15倍，帶有正確適配子序列的細胞顯示出比帶有錯誤適配子序列的細胞高4-5倍的螢光。螢光變化動態。使用螢光顯微鏡分析在優化條件下表達完整互補複合物的細菌細胞。觀察到不同類型的螢光分布(圖18)。在大多數細胞中，螢光在細胞極處最高，與由elF4A-適配子相互作用觸發的蛋白互補實驗中獲得的結果相似。一些細胞(大約10%)具有位於細胞中部的螢光粒子，這與Golding和Cox所報導的結果(18)相似。時移成像展示了螢光在時間和空間上的變化，這與基於elF4A的互補系統的結果也是相似的。圖18顯示了在一個代表性實驗中以30分鐘間隔拍攝4小時的一系列圖像。細胞螢光顯示出波動變化，在不同細胞中的波動是同步的(圖19b)。釆用二元適配子-肽相互作用和蛋白互補系統獲得的結果在幾個方面與使用裂解起始因子4A(elF4A)與相應適配子的相互作用的系統所獲得的結果是非常相似的。首先，螢光粒子在絕大多數細胞中都定位在細胞極處，這是兩種方法的特徵。第二，螢光隨時間和細胞空間的動態變化也與基於elF4A的系統相似。最後，在兩個系統中都能夠看到細胞之間螢光的同步變化。這些結果暗示，用於蛋白互補複合物的RNA-蛋白結合蛋白或肽的性質對於系統運行來說是不重要的，其它裂解蛋白或短肽可以用於相似的應用中。有關使用基於MS2外殼蛋白的系統進行活細胞RNA觀察的已發表結果也支持該結論(18,20)。有趣的而同時指出的是，兩種互補設計的比較顯示了螢光信號強度和信號/背景比方面的差異。由於一些我們不完全理解的原因，表達融合到裂解EGFP上的短肽的細胞的焚光要比表達與EGFP融合的elF4A片段的細胞的螢光高的多。我們假定ARM-肽比中性elF4A片段更易於通過第三方分子進行結合，原因在於ARM-肽的正電荷以及它們與帶負電荷蛋白相互作用的能力。這導致了EGFP的重組裝和更高的背景。為了降低背景，我們降低了IPTG濃度，發現了信號/背景比為10-20倍的條件，這是與elF4A系統相同的範圍。此外，在這些條件下也實現了正確和錯誤適配子序列之間的區分。材衝牛和方法。構建體和菌林。pMB33和pMB38是pACYCDuet-l(Novagen)的4汙生物，相互作用的蛋白片段和EGFP的ORF被分別克隆到其中。將elF4A片段1(F1:1-215aa)克隆到pACYCDuet匿l(pMB09)中；片段2(F2:216-406aa)克隆到pETDuet-l(Novagen)(pMBll)中，這是通過PCR擴增質粒pGEX-4AI(由Dr.ChrisProud惠贈)的小鼠elF4A蛋白完成的。類似地，由pEGFP(Clonetech)PCR擴增EGFP片段，a(A:1-158aa)和(3(B:159-238aa)，並分別克隆到pACYCDuet-1(pMB08)和pETDuet-l(pMB10)中。根據Vasl等，2004.(詳情參見補充方法)製備了嵌合基因(pMB12),其中通過10個胺基酸的柔性多肽接頭(Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser)將EGFP片段A的C末端融合到elF4A片段Fl的N末端。使用相似的方案製備融合物B-F2(pMB13)。如上所述，將B-F2克隆到pACYCDuet-1(pMB33)的衍生物pMB12中(Geiser等，2001)。表達含有elF4A相互作用的適配子序列(58nt長)的T7轉錄物的pMB23是pETDuet-l(Novagen)的書亍生物。pMB42是pRSFDuet(Novagen)的書亍生物，也表達elF4A相互作用的適配子序列(詳情參見補充方法)。將五.co//菌抹XL10-Gold(TefA(wed)W3A(mcrC^-fe^SMi-淤〃)773ewd^7swp五44rec^7gy^4P6/acHte[F/ra爿5/"c/qZAM75Tn70(Tetr)AmyCamr])和XL10隱GoIdKanr(TetrA(wed)7S3△(wcrd/wc^Mi-m^T)〃3e』7，柳A"rec"g>r」96,e"7/acHte[F戶J5/ac/qZAM/5TnM(Tetr)Tn5(Kanr)Amy)(Stratagene)用於克隆目的。將BL21(DE)3(cWBFompJ1/w必(rB-mB')ga/義(DE3))(Stratagene)用於融合蛋白和靶RNA的表達。根據Vasi等(Vasi等，2004)描述的方法製備含有EGFP和elF4A片段的融合蛋白。設計並從IntegratedDNATechnology(Coraliville，IA)購買了兩組5，-磷酸化的寡核苷酸1.5'-pCGAAGATCCAGAGGATCCCTGCTTGTCGGCCATGATATAG-3'(SEQIDNO.9)2.5'-10)，3.5'-pCGAAGATCCAGAGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'(SEQIDNO.11),4.5'隱pGGTTCTGGTAGCATTCGGATTCTTGTCAAGAAGGA-3'(SEQIDNO.12)。寡核苷酸中下劃線區域對應於A片^:的3'末端(SEQIDN0.9);Fl片段的起點(SEQIDNO.10);片段B的3'末端(SEQIDNO.ll);以及F2片段的起點(SEQIDN0.12)。餘下的寡核苦酸序列對應於肽接頭GSSGSS(SEQIDNO.9和11)以及GSGS(SEQIDNO.10和12)的編碼序列。用Xho和EcoNl限制性內切酶切割質粒pMB08(攜帶EGFP的片段A)和pMB09(攜帶elF4A的片段Fl);這些限制性位點位於寡核香酸退火位點的5'端。使用ExpandLongTemplateFOR系統(RocheDiagnostics)，利用這些線性化質粒和寡核苷酸1和2進行PCR反應，反應按照如下程序進行94°C、3分鐘；94°C、30秒、30個循環，61°C、30秒以及72°C、10分鐘，72。C下以最終的11分鐘延伸步驟結束。然後用Z》"l酶處理PCR混合物以去除曱基化模板DNA。凝膠純化大約5~5kbp的PCR產物，使用1U的T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs)進行連接。將連接產物轉化到XL-10感受態細胞(Stratagene)中。分離攜帶A-Fl(pMB12)的新嵌合質粒，經測序確認。使用寡核普酸#3和#4按照相似的方案製備載體pETDuet-l(pMBI3)中的嵌合基因B-F2。將兩種嵌合蛋白克隆到pACYCDuet-l的兩個MOS中。為了保持兩種嵌合基因表達的水平相近，接著根據所記載的方案(Geiser等，2001)將B-F2片段整合到已經攜帶A-Fll的pMB12的第二MCS中。簡要地說，由側翼帶有5，和3，載體序列的質粒pMBI3對B-F2進行PCR擴增。側翼序列直接對應於pMB12插入位點上遊和下遊的20bp的DNA。用受體載體和B-F2片段進行PCR反應，B-F2片段將利用20bp側翼同源性退火到未切割的載體上。PCR程序包括95。C下30秒的變性步驟，接著是18個循環，95。C下30秒、55。C下30秒和68。C下8-10分鐘，使用屍/wturboDNA聚合酶。用Z);"/酶處理擴增產物3小時以去除最初的甲基化模板DNA。用一份純化產物轉化XL-10感受態細胞。分離攜帶兩種蛋白片段(A-F1和B-F2)的質粒，經測序確認(pMB33)。還製備構建體A-F1和B-F2作為陰性對照(pMB54)。最後，將全長EGFP克隆到載體pACYC中作為EGFP表達的陽性對照(pMB38)。克隆二元適配子-肽嵌合物。在第158和159位胺基酸殘基之間將EGFP裂解成兩個無螢光片段，分別稱為cc-EGFP和(3-EGFP。通過10-aa的柔性多肽接頭(Gly-Ser-Ser-Gly-Ser陽Ser陽Gly畫Ser-Gly-Ser)將HTLV-1Rex肽融合到cc-EGFP的C末端；通過同樣的10-aa接頭將噬菌體XN肽融合到P-EGFP的N末端(圖18)。進行多步PCR製備編碼兩個融合蛋白加上它們之間的T7啟動子的DNA片段。將DNA構建體插入到載體pACYCDuet-l(Novagen)的限制性位點Wcol和之間，該插入序列位於第一T7啟動子區域之後和T7終止子區域之前(圖17)。這樣，由一個pACYCDuet-l質粒表達了兩個蛋白嵌合物以確保表達等摩爾量的兩種融合物。使用五.co//菌抹XL10-GoldKanr(Tetr△(wctvO7S3△(wcrC^-ZwcKAfi—附rr)773e"^L47sw/五44//n'-7recJ7gy"^^6re/」7/acHte[F/ra^S/ac/qZAAf/5TnlO(Tetr)Tn5(Kanr)Amy](Stratagene)進4亍克隆。所有構建體都經測序驗證。適配子克隆。設計編碼兩種RNA適配子的DNA序列，其中一種結合入N肽，另一種結合HTLV-1Rex肽。通過10個胸腺嘧咬分開適配子，並在末端加入限制性位點力al和力vrll。定製合成相應的DNA模板，PCR擴增，在T7啟動子控制下插入到pETDuet-l載體(Novagen)的和JvrII限制性位點之間。pETDuet-l和pACYCDuet-l載體在共表達中是相容的。作為陰性對照，類似地合成編碼兩種相同RNA適配子序列的DNA序列。使用五.co/z'菌林XL10-Gold進行該克隆。所有構建體都經測序驗證。培養條件和誘導。用pMB33(表達嵌合蛋白)和pMB23(表達靶RNA)共轉化BL21(DE)3細胞。在￡.co//BL21(DE)3(BFdcmompThsdS(rB-mB-)galX(DE3))(Stratagene)中共表達編碼EGFP互補複合物的蛋白和RNA組分的兩個質粒。作為陰性對照，用含有兩種相同適配子的質粒轉化細胞。作為另一個陰性對照，用不含適配子插入片段的pETDuet-l質粒轉化細胞。首先將轉化細胞的單個菌落在37。C下在添加了抗生素的LB培養基中培養3-4小時。37。C孵育之後，將培養物加到含有誘導物異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG;1mM或0.01mM,用於二元適配子-肽相互作用)的新鮮培養基中稀釋300倍，室溫培養過夜。培養物的光密度在檢查之時介於0.4到0.6之間(OD600=0.4到0.6)。在BL21(DE3)pLys感受態細胞(Stratagene,CA)中表達蛋白。用0.35mMIPTG進行誘導，將細胞在37。C下培養4小時。收穫細胞，在含有50mMTris-HCl、pH8.0、25%蔗糖、1mMEDTA、10mMDTT和0.1%疊氮化鈉的緩衝液中清洗並超聲破碎(3次，每次30秒)。用同樣的緩沖液清洗包涵體1次，用含有50mMTris-HCl、pH8.5、100mMNaCl、0.5%tritonX100、lmMEDTA、1mMDTT、0.1%疊氮化鈉的緩衝液清洗3次，然後溶解在含有8M尿素、25mMMES、pH8.5、10mMEDTA和0.1mMDTT的緩衝液中。通過在不含尿素的同樣緩沖液中逐滴稀釋使蛋白再摺疊，加到用緩沖液(50mMtris-HCl、pH8.5、0.15MNaCl、lmMEDTA、0.1%TritonX-100、1mMPMSF)平衡過的幾丁質親和層析樹脂(NewEnglandBiolabs，MA)中。用大量同樣的緩沖液清洗柱子。然後在含有50mMtris-HCl、pH7.0、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMDTT、TritonX-1000.1%、1mMPMSF的緩衝液中平衡柱子，置於40'C下達24-48小時進行蛋白內含子切割。收集洗脫液，通過SDS-PAGE和CoomasiePlusProtein染色(Pierce,IL)分析蛋白濃度和純度(見圖15和16)。所有蛋白都以相似的方式進行純化，除了一種情況在分離EGFP的a亞基的幾丁質層析步驟中，由PBS緩衝液代替Tris-HCl緩沖液。在一些實施例(實施例l和2)中，通過在不含尿素的同樣緩衝液中逐滴稀釋使蛋白重新摺疊，並加到用緩沖液(50mMtris-HCl、pH8.5、0.15MNaCl、lmMEDTA、0.1%TritonX-100、1mMPMSF)平衡過的幾丁質親和層析樹脂(NewEnglandBiolabs,MA)中。用大量同樣的緩衝液清洗柱子。然後在含有50mMtris-HCl、pH7.0、150mMNaCl、lmMEDTA、lmMDTT、TritonX-1000.1°/o、1mMPMSF的緩衝液中平衡柱子，置於4(TC下達24-48小時進行蛋白內含子切割。收集洗脫液，通過SDS-PAGE和CoomasiePlusProtein染色(Pierce,IL)分析蛋白濃度和純度(見圖15和16)。所有蛋白以相似的方式進行純化，除了一種情況在分離EGFP的a亞基的幾丁質層析步驟中，由PBS緩沖液代替Tris-HCl緩沖液。在這些實施例中，從IDTDNATechnologies購買了兩條20nt長的互補寡核苷酸，它們的5，和3'末端帶有SH基團。用含有10mMDTT的緩沖液孵育，去除它們的保護帽，通過G25柱凝膠過濾進行脫鹽，在催化劑3mM硫酸銅和9mM1，10-啡咯啉存在下與等摩爾量的蛋白片段在暗處於370。C下偶聯30分鐘(Lee等，1994)。偶聯效率接近100%(見圖29)。將含有兩半EGFP和互補寡核苷酸的偶聯嵌合物以等摩爾量在透析管中混合，用含有50mMtris-HCl、pH8.5、0.5MNaCl、5mMMgCl2和20PEG(6000MW)的緩衝液進行透析。使用Hitachi螢光分光光度計F-2500獲取4小時中的螢光光譜(圖30)。在有合適抗生素(氯黴素和/或鏈黴素)的LB培養基中培養細胞，用0.2mMIPTG在生色底物頭孢硝基蓬吩(nitrocefm)存在下進行誘導。陰性對照將不表達適配子序列、破壞的適配子序列以及沒有結合適配子所必需的成分之一的融合蛋白。使用NanoDropND-1000分光光度計測定無細胞上清液在4卯nm處的吸光度。流式細胞術。用帶有488nm氬激發雷射器和515-545nm發射濾光片(FL1)的Becton-DickinsonFACS流式細胞儀獲取螢光測定值。在分析之前用lxPBS清洗細胞一次。獲取測定值一直到收集到100，000個細胞。螢光顯微鏡、成像和數據分析。將培養物中的細菌細胞固定在蓋玻片和薄板之間，該薄板由0.8%瓊脂糖的1xPBS溶液製成。用配備了落射螢光系統X-Cite120的NikonEclipse80i倒置顯孩i鏡在室溫下進行顯微鏡檢查。使用帶有由IPLabv.3.7軟體(Scanalytics,Inc)控制的100x放大倍數物鏡的B&W數位相機(12位；20mHz)，以150-300ms的曝光時間拍攝圖像。使用ND4濾光片減少細胞的光損傷。使用ImageJ1.36B軟體(WayneRasband，NIH)進行圖像處理。將通過顯微鏡獲得的螢光照片以JPEG格式讀取到ImageJ中，轉變成8位類型。手動調整每張照片閾值。閾值上限自動設定到最大觀測值，根據經驗設定閾值下限以使作為對象的背景中沒有像素。為獲得細胞總螢光，選擇了選項"分析粒子"。輸出項包括被確定目標的像素麵積，平均、最小和最大灰度級。通過將平均值減去最小值(灰度級/像素)再乘以面積(像素)得到積就獲得了細胞的總螢光。該計算方法減去背景。以相似的方法計算單個細胞中的總螢光變化動態，這次是通過將矩形分割工具(rectangularsegmenttool)應用到目標細胞上。對於沿細胞的螢光分布的定量來說，測定沿細菌細胞長軸的螢光圖i普，在MicrosoftExcell中計算表面積峰值。每個細胞測定3到4次，取結果平均值。類似地，對每個細胞周圍的背景螢光定量，並從細胞螢光圖譜中將其扣除。螢光測定和細胞成像用Becton-Dickinson螢光活化細胞分選儀(FACSCalibur，帶有488nm氬激發雷射器)測定細胞總螢光，使用Excel軟體分析。使用帶有螢光和微分幹涉相差顯微鏡(DIC)之間自動切換的共聚焦顯微鏡系統進行細胞成像。將放大xl50的樣品照片直接發送到冷卻的、'!"曼掃描CCD成l象i殳備(C4880;HamamatsuPhotonics,Bridgewater，NJ)上。設定計算機控制(MetaMorph2.5軟體；UniversalImagingCorp.,WestChester,PA)的顯微鏡執行獲取方案，拍攝1pm軸向步距的螢光照片和相應於中心焚光圖^f象的單個DIC照片。對於EGFP監測來說，將使用帶有488nm激發光線的氬雷射器，發射窗將設定在500-540nm之間。為產生幾個時間點的合成照片，我們將使用Metamorph軟體包(UniversalImagingCorporation)的3D重建特性。通過每1-2分鐘或者如果需要的話可以更短時間拍攝圖像來測定RNA速度，逐點跟蹤萸光RNA點。實時竟爭性PCR設計、擴增和延伸。用0.5嗎隨機六核苷酸和AMV反轉錄酶(Promega)以20)aL總體積在42。C下對細月包培養物中總RNA樣品進4亍反專爭錄。4吏用Sequenom的AssayDesigner壽大^f牛i殳計以及/人IntegratedDNATechnology(Coralville，IA)獲得引物和竟爭劑。使用100nM的PCR引物、不同濃度的竟爭劑、2.75mM的MgCl2、200|uMdNTP和5jiL的0.1UHotStarTaqDNA聚合酶(Qiagen)按照下面的PCR條件進行cDNA擴增95。C熱啟動15分鐘，接著是45個循環，95°C、30秒，56°C、l分鐘、然後是72。C、l分鐘，最後保持在72。C、7分鐘。PCR擴增之後，用O.(MU蝦^威性磷酸酶SAP(S叫uenom)處理產物，將來自擴增循環的未使用dNTP失活，37。C下20分鐘，接著是85。C熱失活5分鐘。對於延伸循環來說，將終濃度為1.2(iM的延伸引物和0.6U的ThermoS叫uenase(Sequenom)加到含有終止混合物的9jiL總反應物中，終止混合物含有每個反應每個石威基50pM的特定二脫氧核苷酸和脫氧核苷酸。延伸條件包括94。C下保持2分鐘，如下的75個循環94°C、5秒，52°C、5秒和72°C、5秒。MALDI-TOFMS和定量分析。在MALDI-TOFMS分析之前，使用SpectroCLEAN樹脂和16^tl水去除反應中的鹽。使用MassARRAY系統(Sequenom)進行ASV分析，其中使用SpectroPOINT納米級分配器(Sequenom)將大約10nL的終產物分配到384平板型MALDI-TOFMSSpectroCHIP上。使用TITAN(Elvidge等，2005)軟體以默認值分析質譜數據。培養基將在YPD(2。/。葡萄糖，1%酵母提取物，2%蛋白腖)中培養野生型酵母細胞。將在選擇性合成缺陷型培養基(dropoutmedia)(0.67%酵母氮源，2%葡萄糖)培養用質粒轉化的細胞，該培養基缺乏色氨酸、尿嘧啶或亮氨酸。用於該研究的菌林是YPH500(MATa，ura3-52,Iys2-801琥珀色，ade2-101赭石色trpl-A63,his3-A200，Ieu2隱Al)(Johnsson&Varshavsky，1994)的書t生物。接合的檢測子-核酸結合蛋白在酵母(真核生物)中的表達。用於在酵母中表達嵌合蛋白EGFP(A)漏elF4A(Fl)和EGFP(B)畫elF4A(F2)的質粒是表達載體pDB20(Becker等，1991)的衍生物，該表達載體經修飾用來表達N末端融合了HA或myc表位標籤的蛋白。這將能夠由ADH1強啟動子進行組成型蛋白表達並能夠通過Westren印跡分析基因表達。修飾質粒pRS4Dl(Blake等2003)以表達完整的ASH1信使(代替EGFP)，它在基因的3'末端處帶有64nt長的適配子標籤(在第4個zip-code之後)。這個質粒整合到菌抹YPH500的基因組中將使得能夠在將半乳糖和脫水四環素加到培養基中時調節被標記的ASH1基因的表達。這樣，我們將跟蹤完整ASH1信使的定位，與帶有ASH1的3'定位序列的報導子轉錄物相反(Bertrand等，1998;Breach和Bloom,2001)。這可能為我們提供有關RNA定位機制的新見解。用消解酶處理酵母細胞，然後在含2(iMCCF2/AM的DMEM存在下以3x1S個細胞/ml的濃度培養1小時。用PBS緩衝液清洗細胞，使用螢光顯微鏡NikonEclipse80i進行觀察，設定為405nm處激發和440-450nm處發射的濾光片。也用焚光活化細胞分選儀(FACSaria，407nm處激發雷射，Becton-Dickinson)測定細月包萸光。體外凝膠轉移分析。為進行體外凝膠轉移分析，我們購買了表l所列的定製合成的肽和RNA適配子。首先在緩沖液(50mMpH8.0Tris-HCl、50mMKC1)中95°C下加熱3分鐘使RNA變性，然後慢慢冷卻到室溫使RNA復性。將復性RNA和肽在普通緩沖液(50mMTris-HClpH8.0、50mMKC1)中在30。C下混合15分鐘。使用15%TBE凝膠進行凝膠電泳，分析肽-RNA適配子複合物。採用溴乙錠對RNA適配子和肽-RNA適配子複合物染色。提出這些實施例是為了向本領域普通技術人員提供關於如何製造和使用本發明的完整的公開內容和說明，並不打算對本發明人所認可的他們的發明範圍進行限制，它們也不會是本發明能夠實施的實驗和實施例的僅有的代表。本領域技術人員將理解的是，根據現在的公開內容，可以在例舉的特定實施方案和實施例中進行許多不脫離發明預期範圍的修改和變化。預期將所有這些修改都包括在所附權利要求的範圍之內，應明白的是，這些方法可以應用於許多系統中進行體內RNA觀察。參考文獻將這裡和整個申請中引用的參考文獻都完整引入這裡作為參考。1.ComolliLR,PeltonJG，TinocoIJr.(1998)Mappingofaprotein-RNAkissinghairpininterface:RomandTar-Tar*.7Vwc/e/c爿cz'(is26(20):4688-95.2.Lee，G.F.，BurrowsG.G.，LebertM.R.，DuttonD.P.&HazelbauerG.L.(1994)/所o/C7ze肌269，29920-29927.3.Og腦A,OhtsuT，SvitkinYV，SonenbergN,NakamuraY.(2003)RNAaptamerstoinitiationfactor4Ahelicasehindercap-dependenttranslationbyblockingATPhydrolysis.RNA.9(4):394-407.4.RoyS,DellingU，ChenCH，RosenCA,SonenbergN.(1990)AbulgestructureinHIV-ITARRNAisrequiredforTatbindingandTat-mediatedtrans-activation.GewesDev.4(.8):1365-73.5.SahaS,A體riAZ,JarrellKA,PtashneM，JarellKA(2003)RNAsequencesthatworkastranscriptionalactivatingregions.TVwc/e/c31(5):1565-70.6.SawataSY,TairaK.(2003)Modifiedpeptideselectioninvitrobyintroductionofaprotein-RNAinteraction./Vo/e/w16(12):1115-24.7.ValegardK,MurrayJB，StonehouseNJ,vandenWormS，StockleyPG，LiljasL.(1997)Thethree-dimensionalstructuresoftwocomplexesbetweenrecombinantMS2capsidsandRNAoperatorfragmentsrevealsequence-specificprotein.JM/說o/.270(5):724-38.8.YamamotoR,KatahiraM,NishikawaS，BabaT，TairaK,KumarPK(2000)AnovelRNAmotifthatbindsefficientlyandspecificallytotheTtatproteinofHIVandinhibitsthetrans-activationbyTatoftranscriptioninvitroandinvivo.G^w^yCW/j.5(5):371-88.9.Le，T.T.,a/.Real-timeRNAprofilingwithinasinglebacterium./Voc淑/jcm^c/固.102,9160-9164(2005).10.Demidov,V.V.da/.FastcomplementationofsplitfluorescentproteintriggeredbyDNAhybridization.iVocTV"//103，2052-2056(2006).11.Elvidge,G.P.,Price,T.S.,Glenny,L.,Ragoussis,J.DevelopmentandevaluationofrealcompetitivePCRforhigh-throughputquantitativeapplications.^a/B/0c/2綴339,231-241，(2005).12.Vasl，J.,Panter，G.，Bencina,M.&Jerala,R.Preparationofchimericgeneswithoutsubcloning.Biotechniques.37，726,728，730(2004).13.Geiser,M.，Cebe，R.,Dreweiio，D.&Schmitz，R.IntegrationofPCRfragmentsatanyspecificsitewithincloningvectorswithouttheuseofrestrictionenzymesandDNAligase.Biotechniques.31,88-90,92(2001).14.Pederson，T.Themolecularcytologyofgeneexpression:fluorescentRNAasbothastainandtracerz.wv/vo.五Mr/77/Woc/2ew.48，57-64(2004).15.SingerRH.RNAlocalization:visualizationinreal-time.CwrAo/.2003，13(17):R673-675.16.Bratu,D.R，Cha,B.J.，Mhlanga，M,M.,Kramer,F.R.&Tyagi，S.VisualizingthedistributionandtransportofmRNAsinlivingcells./VocTVa//Jca"c/f/5^.100,13308-13313(2003).17.Bertrand,E.Wa/.LocalizationofASH1mRNAparticlesinlivingyeast.Mo/CW/.2，437-445(1998).18.Golding，I.&Cox，E.C.RNAdynamicsinliveEscherichiacolicells./VocA^/^^5W6^4.101,11310-11315(2004).19.Golding,I,Paulsson,J.，Zawilski，S.M.&Cox,E.C.Real-timekineticsofgeneactivityinindividualbacteria.Ce〃.123，1025-1036(2005).20.ChubbJR，TrcekT，ShenoySM,SingerRH.(2006)Transcriptionalpulsingofadevelopmentalgene.Cwr5z'o/.16，1018-1025.21.Shav-TalY，DarzacqX,SingerRH.Geneexpressionwithinadynamicnuclearlandscape./2006,25(15):3469-3479.22.SmithCA,ChenL，FrankelAD.UsingpeptidesasmodelsofRNA-proteininteractions.MeAoA五"z戸o/ogy318,423-428，2000.23.BayerTS，BoothLN,KnudsenSM，EllingtonAD.Arginine-richmotifspresentmultipleinterfacesforspecificbindingbyRNA.RNA.2005，11(12):1848-1857.24.SmithCA,CalabroV,FrankelAD.AnRNA-bindingchameleonMo/.CW/，2000，6，1067-1076.25.Baskerville，S,,Zapp,M.,andEllington,A.D.1999.Anti-RexaptamersasmimicsoftheRex-bindingelement./Fra/.73(6):4962-4971.26.Ye，X.，Gorin,A.,Ellington,A.D.,andPatel，DJ.1996.Deeppenetrationofanalpha-helixintoawidenedRNAmajorgrooveintheHIV-1revpeptide-RNAaptamercomplex.胸腸/.3(12):1026-1033.27.Baron-BenhamouJ，GehringNH,KulozikAE，HentzeMW.UsingthelambdaNpeptidetotetherproteinstoRNAs.Me/ZzoAM/所o/,2004,257:135-154.28.Michnick,S.W.Proteinfragmentcomplementationstrategiesforbiochemicalnetworkmapping.Ct^rQp/wS/ofec/wo/.14，610-617，(2003).權利要求1.用於實時檢測核酸的方法，包括a.表達編碼檢測子構建體的核酸序列，其中檢測子構建體包含接合到核酸結合基序上的第一多肽片段，以及至少一種接合到核酸結合基序上的其它多肽片段，其中兩種多肽片段結合形成活化狀態的檢測子蛋白，其中在與活化的野生型蛋白相比時，兩個片段處於活化的且構象正確的形態；以及b.表達編碼報導子構建體的核酸序列，其中報導子構建體包含目標核苷酸和核酸結合序列，其中核酸結合序列由檢測子構建體中的兩種或更多種核酸結合基序識別；以及其中多肽片段的兩種或更多種核酸結合基序與核酸結合序列結合實時重構成活性檢測子蛋白；以及c.用於檢測重構的檢測子蛋白的方法。2.權利要求l的方法，其中所述檢測是在體外或體內進行的。3.權利要求l的方法，其中所述檢測是在體內進行的。4.權利要求l的方法，其中所述核酸是RNA。5.權利要求l的方法，其中所述核酸是DNA。6.權利要求l、3或4的方法，其中與所述檢測子蛋白的第一多肽片段相結合的所述核酸結合基序是全長基序的一部分，該基序的餘下部分與檢測子蛋白的至少一種其它多肽片段相結合。7.權利要求l、3、4或6的方法，其中與所述檢測子蛋白的第一多肽片段相結合的所述核酸結合基序是全長基序，該基序與結合到所述檢測子蛋白的至少一種其它多肽片段的核酸結合基序是無關的。8.權利要求7的方法，其中所述核酸結合基序包含多結構域核酸結合分子的結構域。9.權利要求l、3或4的方法，其中所述檢測子蛋白是螢光蛋白。10.權利要求9的方法，其中所述螢光蛋白選自綠色螢光蛋白(GFP);增強型綠色螢光蛋白(EGFP);綠色螢光蛋白樣蛋白(GFP樣)；黃色螢光蛋白(YFP);增強型黃色螢光蛋白(EYFP);藍色焚光蛋白(BFP);增強型藍色螢光蛋白(EBFP);青色螢光蛋白(CFP);增強型青色螢光蛋白(ECFP);紅色螢光蛋白(dsRED)以及它們的變型和片段。11.權利要求10的方法，其中所述螢光蛋白是EGFP。12.權利要求11的方法，進一步包括位於第一和第二EGFP片段之間的裂解產物。13.權利要求11的方法，其中所述EGFP的第一片段為第l位胺基酸到大約第158位胺基酸，並且其中所述EGFP的第二片段為大約第159位胺基酸到第239位胺基酸。14.權利要求l的方法，其中所述檢測子蛋白是酶。15.權利要求13的方法，其中所述酶選自P-半乳糖苷酶、P-內醯胺酶、(3-葡萄糖苷酶、(3-葡萄糖醛酸酶、氯黴素乙醯轉移酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)。16.權利要求14的方法，其中所述酶是P-內醯胺酶。17.權利要求15的方法，其中所述P-內醯胺酶的第一片段為大約第24位胺基酸到第197位胺基酸，並且其中所述P-內醯胺酶的第二片段為大約第198位胺基酸到第240位胺基酸。18.權利要求1的方法，其中所述核酸結合基序是蛋白質。19.權利要求1、3或4的方法，其中所述核酸結合基序蛋白被分成兩個或更多個片段，其中一個片段接合到所述第一檢測子多肽片段上，並且餘下的片段接合到一種或更多種互補多肽片段上，並且其中的片段是(a)處於活化構象的；(b)非自身活化的；(c)互補的，以便通過結合到報導子構建體中的核酸結合序列上實時重構成活性檢測子蛋白。20.權利要求l、3或4的方法，其中所述核酸結合基序是MS2外殼蛋白且所述核酸結合序列是RNA莖環，或者所述核酸結合基序是TAR且所述核酸結合序列是TatBIV-1莖環，或者所述核酸結合基序是G3/C3莖環的3個重複序列且所述核酸結合序列是轉錄活化劑，或者所述核酸結合基序是特異性針對於elF4A的適配子且所述核酸結合序列是elF4a,或者所述核酸結合基序是特異性針對於報導子構建體中存在的核酸結合序列的適配子，或者所述"^艮道子構建體中存在的核酸結合序列是適配子標籤。21.權利要求l、3或4的方法，其中所述用於檢測報導子蛋白的方法包括定量或定性方法。22.權利要求1的方法，其中所述方法進一步包括(a)檢測生物樣品中檢測子蛋白的基線信號；(b)改變分析條件使得所述報導子構建體的核酸結合序列與接合到所述檢測子蛋白的多肽片段上的核酸結合基序的接觸發生改變，(c)立即檢測生物樣品中活性檢測子蛋白的變化，其中信號的變化顯示了目標核香酸的變化。23.權利要求1的方法，其中所述方法選自焚光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、電子顯微鏡、螢光活化細胞分選儀和肉眼觀察。24.根據權利要求1的方法，其中通過用構建體轉化或轉染細胞而在細胞中表達檢測子構建體和報導子構建體。25.根據權利要求1的方法，其中通過將編碼一全測子蛋白和核酸結合基序的兩種核酸進行符合讀碼框的融合而將檢測子蛋白接合到核酸結合基序上，這樣就產生了融合產物。26.根據權利要求25的方法，其中所述融合產物包括蛋白酶位點或標籤以輔助純化。27.根據權利要求26的方法，其中所述標籤是6-His標籤或者穀胱甘肽-S-轉移酶標籤或者肽表位。28.包含DNA序列的質粒，該DNA序列編碼至少以下一種(i)權利要求1的檢測子構建體；(ii)權利要求1的報導子構建體；或者(iii)(i)中的檢測子構建體和(ii)中的報導子構建體。29.轉基因生物，在其基因組中具有適當整合的至少一種權利要求28的DNA序列。30.轉基因生物，在其基因組中具有適當整合的以下核酸序列的功能性基因組表達a.編碼檢測子構建體的核酸序列，其中檢測子構建體包含接合到核酸結合基序上的第一多肽片段，以及至少一種接合到核酸結合基序上的其它多肽片段，其中兩種多肽片段結合形成活化狀態的檢測子蛋白，其中在與活化的野生型蛋白相比時，兩個片段處於活化的且構象正確的形態；和/或b.編碼報導子構建體的核酸序列，其中報導子構建體包含目標核苷酸和核酸結合序列，其中核酸結合序列由檢測子構建體中的兩種或更多種核酸結合基序識別；以及其中多肽片段的兩種或更多種核酸結合基序與核酸結合序列結合實時重構成活性檢測子蛋白。31.權利要求29或30的轉基因生物，其中所述轉基因生物選自小鼠、斑馬魚、線蟲、酵母、細菌、哺乳動物細胞、原代細胞和次代細胞。32.用於檢測個體中的疾病或障礙的方法，包括a.將來自個體的DNA或RNA與權利要求1所述的4全測子構建體相接觸，其中所述核酸結合基序特異性針對於特定疾病或障礙；以及b.檢測檢測子構建體的信號變化，其中檢測到的檢測子構建體中的信號變化顯示了疾病或障礙的存在。33.權利要求32的方法，其中所述疾病是病原體。34.權利要求33的方法，其中所述病原體選自病毒；流感，細菌，真菌，寄生蟲和酵母。35.權利要求32的方法，其中所述DNA或RNA是傾向於遺傳疾病的。36.權利要求1或3的方法，其中對所述檢測子蛋白片段進行設計使得它們在重構時被立即活化。37.權利要求1的方法，其中在與活化的野生型蛋白相比時，所述檢測子多肽蛋白片段處於活化的且構象正確的形態，其中在靶核酸存在下，互補的檢,測子多肽蛋白片段實時重構成檢測子蛋白和信號表型。38.編碼檢測子構建體和報導子構建體的核酸片段在實時檢測核酸中的用途，其中(i)檢測子構建體包含檢測子蛋白片段，在與活化的野生型蛋白相比時，其處於活化的且構象正確的形態；並且其中它們被接合到核酸結合基序上，且至少一種其它多肽片段被接合到核酸結合基序上；以及(ii)報導子構建體包含目標核苷酸和核酸結合序列，其中核酸結合序列由檢測子構建體中的兩種或更多種核酸結合基序識別；並且其中多肽片段的兩種或更多種核酸結合基序與核酸結合序列結合實時重構成活性的檢測子蛋白。39.權利要求38的核酸片段的用途，其中所述實時4企測核酸是在體內檢測的。40.包含質粒的試劑盒，該質粒包含DNA序列，該DNA序列編碼至少以下一種(i)權利要求1的檢測子構建體；(ii)權利要求1的報導子構建體；或者(iii)(i)中的檢測子構建體和(ii)中的報導子構建體。41.權利要求40的試劑盒，其中所述檢測子構建體包含權利要求9或10的螢光蛋白或者權利要求15的酶。42.權利要求40的試劑盒，其中所述報導子構建體包含權利要求20的適配子。43.權利要求1的方法，其中所述檢測是在選自成纖維細胞、神經細胞、卵母細胞、腫瘤細胞、病毒感染的哺乳動物細胞、表皮細胞、細菌細胞和酵母細胞的細胞中進行的。44.權利要求43的方法，其中所述細胞是經基因修飾的細胞。全文摘要本發明涉及使用實時蛋白互補方法體內檢測核酸分子如RNA分子的方法。本發明進一步涉及高靈敏度實時檢測活細胞中核酸，例如RNA的方法，該方法使用了本發明的新的裂解生物分子接合物。文檔編號C12Q1/68GK101365805SQ200680049801公開日2009年2月11日申請日期2006年10月27日優先權日2005年10月27日發明者C·R·坎託,M·伯頓,N·布勞德,V·V·德米達夫申請人:波士頓大學董事會