C型肝炎病毒包膜抗原elisa試劑盒及檢測方法

2023-06-05 10:36:11 2

專利名稱：C型肝炎病毒包膜抗原elisa試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬於C型肝炎檢測技術領域。更具體涉及一種C型肝炎病毒包膜抗 原檢測ELISA試劑盒，同時，本發明還涉及一種C型肝炎病毒包膜抗原試劑盒檢 測C型肝炎病毒包膜抗原和病毒的方法，利用標記的多肽和E2抗體在作為檢測 C型肝炎病毒表面包膜抗原的酶聯免疫吸附檢測(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, EUSA)，可廣泛應用於醫學和生物學等相關領域。
背景技術：
丙型病毒性肝炎(簡稱C型肝炎)是由C型肝炎病毒(HepatitisC Virus, HCV) 引起的肝臟炎症性疾病。HCV感染呈全球性分布，主要通過血液傳播。據世界 衛生組織統計，全球HCV感染率約為3%，估計有l. 7億人感染HCV，每年新發 C型肝炎病例約3.5萬。我國血清流行病學調查資料顯示， 一般人群抗HCV陽性 率為3.2%,各地區感染率有一定差異。急性HCV感染者約80。/。發展為慢性丙型 肝炎(CHC)，在20年間約20%可發展為肝硬化，每年約有1% 4%肝硬化患者發 展為肝癌。CHC己成為不可忽視的重要疾病，及早發現和治療CHC患者已受 到重視。CHC治療目的包括根除或長期抑制病毒複製，減輕肝內炎症和纖維化， 最終阻止進展為肝硬化、肝癌和肝功能衰竭，並提高患者的生活質量。
HCV病毒顆粒直徑30 60nm，含類脂外膜，屬於黃病毒科，是一種單股正 鏈RNA病毒，全長約9500bp， HCV整個基因組只有一個可讀框(ORF)，位於基因 組中央。在基因組的5'和3'末端各有一段非編碼序列。5'末端有一個長度和序列 非常穩定的非編碼區(URT)，可以說是整個基因組最為保守的區域，長度是341 個核苷酸。3'末端非編碼區由三部分組成，從編碼病毒前體蛋白的可讀框的第一 個終止密碼之後是30 40個核苷酸的非編碼變異序列，然後是polyU (或polyA) 結構，最後面有98個核苷酸的高保守序列。中間是幾乎跨越了整個基因組的大的ORF，由9 033個核苷酸組成，能編碼約3 010 3 033aa的病毒前體多聚肽，經過 蛋白酶切割修飾後，前體多肽產生2種結構蛋白，即核心蛋白(C區)和膜蛋白(E 區)，5種非結構區蛋白NSt 、 NS2 、 NS3 、 NS4和NSs。 HCV的複製是利用RNA 指導的RNA多聚酶，又稱RDRP，並無閱讀保護酶來修正複製中的錯誤，因而HCV 的變異較大，尤其在結構基因的E區的3'末端和非結構基因的NS1區的5'末端之 間是一個高度可變區，在結構基因的C區和非結構基因的NS3、 NS4和NS5區則保 守性較高。
目前，臨床上檢測HCV感染的方法大致包括(1) ELISA法檢測抗-HCV抗 體，包括重組免疫印跡(RIBA); (2) PCR檢湖ijHCV的RNA，包括螢光PCR、免疫 PCR法(PCR -ELISA)、及用於定量的bDNA和NASBA技術；(3)基因型晶片檢 測技術。酶聯免疫吸附法檢測抗HCV的特異性好，靈敏度高，操作簡便，目前 己成為採供血機構檢測抗-HCV的常規方法。然而抗-HCV樣本的濃度介於試劑盒 臨界範圍時，由於受到各種不確定因素如試劑盒的敏感度、操作人員技術熟練程 度及其責任心、實驗室溫度、加樣器等影響，很可能造成假陽性或假陰性的結果。 文獻曾報導用ELISA法檢測抗-HCV灰帶區血樣經重複檢測有12.6 %(11/87)的 假陰性率。對落在灰區範圍內的隨機抽樣樣本進行的PCR檢測中，HCVRNA的 陽性率為18%(3/17)，表明灰區內樣本確實存在著病毒複製。如果沒有設置灰區， 一年之內就可能有5份抗-HCV陽性的樣本輸入到無辜的患者體內。為提高抗 -HCV的檢出率，最大限度地防止漏檢，提高輸血的安全性，筆者認為灰區的設 置有著重要的意義。至於灰區的範圍應該多大才合適，還須做進一步的研究。對 於落在灰區內的樣本應進行重複檢驗。有條件的單位應予行PCR檢測，以提高 檢驗的準確性。PCR檢測HCV的RNA，特別是支鏈DNA(bDNA)技術的最大特 點是不經過呈指數增長的擴增過程，放大倍數確定，不利因素少，因此穩定性、 重複性高，用於HCV RNA的動態水平研究結果準確。但bDNA技術的局限性也 顯而易見，即放大倍數少、敏感性低、檢測範圍窄、不適用於HCVRNA的低水 平檢測。基因晶片技術適用於研究HCV的流行病學、變異趨勢、傳播途徑，對 C型肝炎患者判斷病情、指導治療、預測療效及預後有重要意義，但其成本高， 易出現假陽性。
由於現有的臨床檢測HCV感染的方法的各種局限性，臨床工作者迫切希望
4出現一種新型的臨床檢測HCV的方法，該方法應具有特異性高，成本低廉，操 作簡便，診斷迅速的特點。

發明內容
本發明的目的是在於提供一種C型肝炎病毒包膜抗原ELISA試劑盒，能快 速、靈敏、準確的檢測C型肝炎病毒。
本發明另一個目的是在於提供了一種C型肝炎病毒包膜抗原ELISA試劑盒 的檢測方法，該方法特異性高，成本低廉，檢測速度快，操作方便，省時效率高。
本發明的C型肝炎病毒包膜抗原試劑盒在快速檢測HCV感染中可廣泛應用。
為了實現上述目的，本發明採用以下技術措施
一種快速檢測C型肝炎病毒包膜抗原ELISA的試劑盒，該試劑盒包括
a. 生物素等標記的能與HCVE2蛋白特異性結合的12肽；
b. 多肽為SEQIDNO:l、 SEQIDNO:2、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:4所示的序
列；
c. 兔抗E2的的多克隆抗體；
d. 辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素；
e. 辣根過氧化物酶底物；
f. 酶標板(CellStar@,購自武漢大風生物科技有限公司)；
g. E2蛋白作為標準陽性對照；
h、酶聯免疫檢測儀(購自南京華東電子集團醫療裝備有限公司。
核糖體文庫篩選技術是將編碼隨機肽的DNA文庫在體外轉錄、翻譯，轉錄 產物mRNA由於缺乏終止子，不能從核糖體上釋放，而與新生多肽、核糖體以 共價鍵結合，形成mRNA—核糖體一蛋白質三聚體結構，此三聚體形式將蛋白 和mRNA信息連接在一起，使基因型和表型得到統一。利用固相化抗原或受體 的特異性的單克隆抗體親和篩選核糖體表面的隨機多肽，分離特異性結合的 mRNA—核糖體一多肽複合物，通過降低Mg^濃度，核糖體解離，釋放mRNA， 回收核糖體富集庫中的mRNA，逆轉錄成cDNA,PCR擴增，其產物可作為下一輪體外合成的模板，經過幾輪篩選，能找到與抗體特異性結合的多肽。近年來， 應用核糖體展示技術已進行了許多研究，如篩選配體或受體，篩選抗體或確定抗 原表位，開發新的蛋白酶抑制物和新的藥物。
一種抑制C肝病毒與人肝細胞結合的多肽具體製備步驟如下
一、製備E2-GST融合蛋白的步驟如下
A. 挑取含有pGEX-KG-E2(見參考文獻Li， et al.， Engineering of 7V-glycosylation of Hepatitis C Virus Envelope Protein E2 Enhances T cell responses for DNA immunization, f^cc'we. 2007. 25:1544-1551.)的大
腸桿菌BL21DE3 (購自美國invitrogen公司)接種於3 ml含有氨節青 黴素(5p(ig/ml)的LB培養基中，對照組別接種含有pGEX-KG(GST蛋 白的原核表達載體，購自Amersham Biosciences公司)的大腸桿菌 BL21DE3, 37。C培養12~16小時。
B. 將小試管中的菌液分別轉移到200ml含有氨苄青黴素(50pg/ml)的LB 液體培養基(LB液體培養基為lOg胰蛋白腖，5g酵母提取物，10 g氯 化鈉，溶解至1000ml雙蒸水)中，37 'C培養到OD600為1 2。
C. 加入100mM異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其終濃度為0.1 mM, 3(TC誘導4 5小時。
D. 將誘導以後的菌液分裝到250ml的離心管中，4'C,7700 g,5min離心， 棄上清。
E. 沉澱物用磷酸鹽緩衝液PBS (140mM氯化鈉，2.7 mM氯化鉀，10 mM 磷酸氫二鈉，1.8 mM磷酸二氫鉀)洗滌1次，4°C ， 7700 g, 5 min離心，
棄上清。
F. 將沉澱重懸於8 ml含1 mM苯甲基磺醯氟(PMSF: 17.42 mg PMSF溶 於lml異丙醇中，-20 'C保存)的PBS中。
G. 將菌液放置冰中，超聲碎菌，加入20。/。曲通X-100 (Triton X-100: 1ml TritonX-100溶於4 ml無菌雙蒸水中)，使其終濃度1%, 4°C,輕混30分鐘。
H. 每EP管中加入lml超聲降解的菌液，4 °C, 12000 g, 10 min離心，取上清。
6I. 4 °C, 12000 g，離心10min，再取上清。
J.各EP管加入20 pi瓊脂糖凝膠4B (Sepharose 4B:購自Amersham
Biosciences公司，美國)，混勻，室溫20 25 °C孵育30 min。 4°C ， 5000 rpm，
5min,離心，棄上清。 K.每個EP管中各加入100 pi 0.01M PBS洗滌，離心洗滌後將含有
Separose 4B的懸濁液收集於一管，4°C, 5000 rpm， 5 min，離心，棄上清，
共洗滌3次。
L.加入與Sepharose 4B等量的谷光苷肽洗脫緩衝液(Glutathione Elution Buffer: 0.0154 g谷光苷肽溶解於0.25 ml pH 8.0的1M過濾除菌，分裝， 4'C保存)，室溫20 25。C輕輕混勻10 min， 4°C, 5000 rpm， 5 min，取上清。
M.重複步驟L兩次。收集的上清則為E2-GST融合蛋白。
二、 製備兔抗E2蛋白抗體的步驟如下
A. 將表達純化的E2-GST融合蛋白用PBS稀釋至1 mg/ ml，加入完全弗氏 佐劑(CFA)，注射至紐西蘭家兔(購自武漢大學醫學院實驗動物中心) 脊椎兩側6點皮下及腹股溝淋巴結，每點O. l 0.2ml,每隻兔子抗原免 疫劑量為1 mg。
B. 兩周後，用同樣抗原量再次免疫家兔，以不完全弗氏佐劑(IFA)為佐劑。 免疫位點及數量選擇同基礎免疫。
C. 共免疫4次，間隔時間為2周，後兩次免疫劑量為第一次劑量的1.5倍。 末次免疫後第10天心臟採血，室溫靜置凝固後，轉入4'C冰箱靜置過夜， 分離血清，血清即為E2-GST融合蛋白的抗體，置於-80。C冰箱保存備用。
三、 製備隨機DNA文庫的步驟如下
A.寡核昔酸為3 ，-CCT CTATATAGGTAC CGA TCG (NNM)12 AGG CCG G TAGTA GTA GTA GTA GTA CCZ4GG CCA-5'(90bp)(劃線部分分別為 SD序列、啟始密碼子、HisTag、斜體部分為5aw/fl酶切位點)(N代表 A， C, T或G, M代表A或C)
7B.第一輪PCR的上遊引物Ul為5'-G CTC GTA TAA TGT GTG GCC ACA ACG GAT ATA TCC ATG -3' (43 bp)(劃線部分為5'端莖環和
斜體部分為核糖體結合位點:RBS)，下遊引物Dl為3'-GTA GTA ￡￡I
G-5，(52 bp)(劃線部分分別為5awHI酶切位點、Gly-Ser序列和3，端莖環)
C. 第二輪PCR的上遊引物U2為5'-GCG CTG CAG TTG ACA ATT AAT CAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG-3' (42 bp),(劃線部分分別為Pwl酶切 位點和Tac啟動子)。下遊引物為D1。隨機ssDNA文庫和引物由上海博 亞生物有限公司合成。隨機DNA文庫的構建示意圖見圖1。
D. 以寡核普酸為模板，用引物U1和D1進行第一輪PCR，反應體系為
10 X Tag DNA Polymerase buffer (含Mg2+)5pl
dNTP mix(10mM;) 1 pi
引物Ul (20 (aM) 1 |Lll
引物Dl (20 (iM)1. W
寡核苷酸(0.05ng7pl)"I
雙蒸水40 (al
Tag DNA聚合酶1. W
總體積50 |al
反應程序
a. 95°C， 2分鐘
b. 95°C， 36秒；63°C， 36秒；72°C， 84秒；共25個循環。
c. 72°C， 5分鐘
E. PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠(0.4 g瓊脂糖粉末溶解於20 mil X TAE溶 液)電泳，然後用回收試劑盒(QIAEX II gel Extraction Kit,美國promega
公司)回收。
F. 經步驟E回收所得的PCR產物作為模板，進行第二輪PCR擴增，反應 體系為
10 X Tag DNA Polymerase buffer (含Mg2+) 5 (al
dNTP mix (10 mM) .1(^1引物U1 (20|aM)
引物D1 (20pM) 化l
第一輪PCR產物 4^1
雙蒸水 37|al
TagDNA聚合酶 "1
總體積 50pl
反應程序
a. 95 °C, 2分鐘
b. 95°C， 36秒；62°C， 36秒；72°C, 84秒；共25個循環。
c. 72°C， 5分鐘
G.步驟F所得得PCR產物經2。/。的瓊脂糖凝膠電泳，然後用回收試劑盒回 收，回收所得片段即可用於體外轉錄翻譯
四、製備核糖體文庫的步驟如下
A.核糖體文庫的製備(見參考文獻Wu, et al.,戶e;^W^ 2005， 26(11): 2057-2063.),構建及篩選流程如圖2所示:將編碼1014個隨機12肽的DNA 庫在體外進行偶聯的轉錄/翻譯，轉錄產物mRNA由於缺乏終止子，不 能從核糖體上釋放，從而形成一個穩定的mRNA-核糖體-新生多肽複合 體結構。利用連接有Sepharose 4B (sigma公司)的E2-GST融合蛋白 (E2-GST-Sepharose4B)親和篩選核糖體表面的隨機多肽，分離特異性 結合的mRNA—核糖體一多肽複合物，通過降低Mg^濃度，核糖體解離， 釋放mRNA，回收核糖體富集庫中的mRNA,逆轉錄成cDNA. PCR擴 增，其產物可作為下一輪體外合成的模板，經過六輪篩選，能找到與E2
蛋白特異性結合的多肽。 B.反應體系
DNA模板(0.3mg/ml) 10^1
S30 Premix without Amino Acids 20 (il
胺基酸混合液(無甲硫氨酸) 2.5 pi
胺基酸混合液(無亮氨酸) 2.5^1
S30 Extract 15^1
9總體積 50 pi
輕輕混勻EP管中各混合物，5000rpm，離心30秒，讓混合物沉積於EP 管底部。
C. 30'C孵育2.5小時。
D. EP管冰上放置5分鐘中止反應，EP管中物質即為核糖體展示文庫。
五、核糖體展示文庫篩選與C肝病毒E2糖蛋白結合的多肽的歩驟如下
A. 在100 pi體外轉錄翻譯混合物中加入6單位的無RNA酶的DNase (Promega公司，美國)，lOXDNase I緩衝液(Promega公司，美國)6 |il， 37。C溫育30 min。然後加中止緩衝液，65°C， 10 min滅活DNase。
B. 取60 pl E2-GST陽Sepharose 4B, 4 。C， 5000 rpm， 5 min離心，棄上清。
C. 沉澱用500 pl洗脫緩衝液(washing buffer : 50 mM pH 7.5的Tris-醋 酸，150 mM氯化鈉NaCl， 0.1 %Tween-20, 50 mM醋酸鎂)洗滌3次。
D. 將100 pi體外轉錄/翻譯混合物加入到洗滌過的E2-GST-Sepharose 4B 中，4'C搖動1小時。
E. 4 。C， 5000 rpm， 5min離心，棄上清，沉澱用washing buffer洗滌3次。
F. 沉澱中加入100 nl elution buffer, 4"C搖動10 min使mRNA與核糖體解 離，4°C， 5000rpm， 5min離心，取上清。
G. 用RNaidKit (購自biol01公司，美國)回收mRNA,具體方法如下
a. 上清中加入3倍體積的RNA Binding Salt (RNaid Kit成份)混勻。
b. 再加入1 RNA MATRIX (RNaid Kit成份)，室溫放置5 min。
c. 13000 rpm， lmin離心，棄上清。
d. 用RNA wash (RNaid Kit成份)洗滌2次，(RNA wash:乙醇4:l)。
e. 加入無RNase的H20， 45 55。C溫育5 min。
f. 13000 rpm， 2 min離心，取上清，上清即是RNA模板，可用於RT-PCR。
H. RT-PCR，其反應體系為
AMV/Tfl 5 X Reaction buffer 10 pi
dNTP mix混合物 1 1^1
引物U 1(20 pM) 1 pi
10引物D 1(20 (iM) 1 pi
MgS04(25 mM) 2 pi AMV Reverse Transcription 1 Tfl DNA Polymerase 1 (il
RNA模板 1 |al
無酶水 29 ^
總體積 50 ^
反應程序為48°C， 45分鐘；94°C， 2分鐘；94°C， 30秒；63°C， l分
鍾，72°C， 2分鐘；共31個循環；72°C， 7分鐘 I. 2%瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳。 J.回收分子量大小為155 bp的RTPCR產物。
K.以回收產物為模板，再行第二輪PCR擴增，回收分子量大小為181 bp 的PCR產物。
L.將回收的第二輪PCR產物連接至載體pUC19 (購自美國Invitrogen公 司)上，具體步驟為-
a.將PCR產物及載體pUC19酶切，反應體系為
lOXY+Buffer 2 |Ld
5畫HI 1 pi
屍WI 1 nl
ddH20 17 pi
總體積 20 ^ 37'C水浴2小時
M.分別回收分子量大小為128 bp的DNA片段以及分子量大小為2.668 kb 的pUC 19目的片斷，然後用回收試劑盒(QIAEX II gel Extraction Kit,美 國promega公司)回收。
a.用DNA連接酶將步驟b所的DNA和載體pUC19連接，反應體系為 DNA 4 |il
pUC 19 2 pi
10 X Buffer 2 |alT4連接酶 2 ^
雙蒸水 10 pl
總體積 20 |al 16'C孵育20小時
b. 將步驟c所得的連接產物分別轉化至大腸桿菌DH5 a 。取連接產物 10 ^，加入100plDH5a感受肽細胞，冰浴30分鐘，42°C 90秒，再冰 浴5分鐘，加入800pl LB液體培養基(LB液體培養基為10 g胰蛋白 腖，5g酵母提取物，10 g氯化鈉，溶解至1000ml雙蒸水)，37°C， 225 rpm振搖40 50分鐘。取200W菌液均勻塗在有氨苄青黴素(Ampf)抗 性的LB固體培養基(LB固體培養基為10g胰蛋白腖，5g酵母提取 物，10 g氯化鈉，15g瓊脂粉溶解至1000 ml雙蒸水)上(氨苄青黴素 濃度為50嗎/ml)， 37'C培養過夜。
c. 挑取單個克隆菌落，置於3 ml LB液體培養基(含氨苄青黴50 pg/ml) 培養過夜。
d. 提取步驟e獲得的菌液的質粒DNA。
e. PCR鑑定步驟f所得的DNA，反應體系為
10 X Taq DNA polymerase buffer 5 |il
dNTP mix混合物(10 mM) 1
引物U2(20mM) 1 pi
引物D 1(20 mM) 1 (il
質粒DNA 1 |_U
雙蒸水 40 nl
Taq DNA Polymerase 1 |al
總體積 50 ^
反應程序為95°C， 2分鐘；95°C， 30秒；62°C， 1分鐘，72°C, l分 鍾24秒；共25個循環；72°C， 5分鐘
f.將步驟g所得產物經5amM和屍Wl鑑定，正確的克隆送至上海華諾 公司測序。
根據測序結果，請西安美聯公司合成的，得到了4條一種分離的多肽，其氨
12基酸序列分別為:
PE2A (SEQIDNO:l)
GFGRYRRHGSPW
PE2B (SEQIDNO:2)
MAIGPYPACGSG
PE2C (SEQIDNO:3)
LSVLVISMFNAV
PE2D (SEQIDNO:4)
MARHRNWPLVMV
六、利用C型肝炎病毒包膜抗原試劑盒檢測C肝病人血清裡的C肝病毒的歩驟
如下
A. 96孔板裡每孔加入100 pl用碳酸氫鈉緩衝液(0.05M pH9.6)稀釋的抗 E2-GST抗體(稀釋度為1:300 1:500)，或加入100 pl用碳酸氫鈉緩衝液
(0.05MpH9.6)稀釋的多肽(30 50ug/孔)，37'C孵育1小時。
B. 洗滌液(0.P/。Tween-20的PBS磷酸鹽緩衝液)洗滌五次
C. 封被每孔加入10(^1封閉液(1。/。BSA的PBS磷酸鹽緩衝液)，4°C孵 育過夜。
D. 洗滌液(0.1。/。Tween-20的PBS磷酸鹽緩衝液)洗滌五次
E. 每孔加入100 plC肝病人血清或健康人血清，室溫(26°C)孵育1小時。
F. 重複B步驟一次。
G. 每孔加入100 pl 10 mg/L的生物素標記的多肽(bio-ZD, bio-ZA等，北
京華大基因公司合成)室溫(26°C)孵育1小時。
H. 重複B步驟一次。
I. 每孔加入IOO辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素(稀釋度為1: 1000)， 室溫(26°C)孵育30分鐘。
加入鄰苯二氨顯色，酶標儀OD450nm下讀取OD值。結果顯示分離得到的多 肽能特異性結合C肝病毒E2糖蛋白，並能與C肝病人血清裡的病毒直接結合， 其OD值大於與正常人血清結合的OD值的2 3倍以上。可達到直接檢測病人血樣 裡病毒含量的效果。
七、利用C型肝炎病毒包膜抗原試劑盒檢測C肝病毒顆粒的步驟如下
A. 96孔板裡每孔加入l&LlC肝病毒顆粒(3xlS個病毒)和162|^1碳酸氫 鈉緩衝液(0.05MpH9.6)，混合，4'C孵育7小時。B. 洗滌液(0.1。/。Tween-20的PBS磷酸鹽緩衝液)洗滌五次。
C. 每孔加入lOOpl封閉液(1。/。BSA的PBS磷酸鹽緩衝液)，4°C孵育過夜。
D. 洗滌液洗滌五次次後，分別加入^g ^g的生物素標記的多肽到96孔 板中，每孔體積為lOOpl， 37°C孵育lh。
E. 洗滌五次後，加入IO(VI稀釋度為1:1000的辣根過養化物酶標記的鏈黴 親和素(HRP-advin，購自晶美公司)。
F. 加入鄰苯二氨顯色，酶標儀OD450nm下讀取OD值。顯示生物素標記 的多肽能與C肝病毒顆粒直接結合。
該實驗證明分離得到的多肽能特異性結合C肝病毒顆粒(HCVcc)的E2糖 蛋白，結合能力呈劑量依賴性。
本發明的優點
本實驗首次應用核糖體文庫篩選了與C肝病毒E2糖蛋白結合的多肽。篩選 到的三種多肽(ZD,ZA,ZB)與C肝病毒表面包膜E2糖蛋白蛋白具有高親和力，本 實驗首次用抗E2的多克隆抗體和生物素標記的多肽，ELISA法檢測C肝病人血清 中的C肝病毒表面抗原，本發明所提供的針對C肝病毒E2糖蛋白的小分子多肽 (12肽)分子量小，易於合成，抗E2的的多克隆抗體製備簡單，靈敏度高於傳統檢 測HCV抗體方法，接近傳統HCVRNA檢測方法，成本較傳統檢測HCVRNA檢測 方法低，不需要PCR儀。


圖l.隨機DNA文庫的構建流程圖。
RBS表示核糖體結合位點，N代表A, C, T或G, M代表A或C 圖2.核糖體展示文庫篩選與C肝病毒E2糖蛋白結合的多肽的構建流程圖。 圖3. SPR檢測多肽PE2A、多肽PE2B、多肽PE2C、多肽PE2D與E2蛋白的親
和力，它們結合的親合力大小是多肽PE2D〉多肽PE2B〉多肽PE2A〉多肽
PE2C。
圖4A多肽抑制HCVE2蛋白與人肝細胞Huh7.5細胞結合 圖4B多肽抑制HCVE2蛋白與DC-SIGN+靶細胞結合(A)流式細胞儀檢測多 肽A、多肽B、多肽D分別抑制HCVE2蛋白結合人肝癌細胞Huh7.5的能力(圖4A);多肽分別抑串ijHCVE2蛋白結合人肝癌細胞Huh7.5的能力的劑量依賴性(圖4A)。(B) 流式細胞儀檢測多肽A、多肽B、多肽0分別抑制￡2蛋白結合00810!^+-皿113丁3 細胞的能力(圖4B);多肽分別抑制E2蛋白結合人肝癌細胞DC-SIGN+-NIH3T3的 能力的劑量依賴性(圖4B)。
圖5.多肽PE2D能競爭性抑制E2與HCV的受體CD81,肝素的結合。 圖6.多肽PE2D能特異性抑制C肝假病毒(HCVpp)感染靶細胞，且多肽PE2D 抑制能力呈劑量的依賴性。圖4A是假病毒的構建步驟，圖4B是假病毒在293細胞 裡表達E1、 E2蛋白，圖4C是PE2D (SEQIDNO:4)阻止假病毒感染Huh7.5細胞， 並呈劑量依賴性。
圖7.不同濃度PE2D與HCV病毒顆粒(HCVcc)結合的能力呈劑量依賴性。 圖8. ELISA檢測不同濃度的PE2D能抑制HCVcc與Huh7.5結合的能力不同， 劑量越大，抑制能力越強。
圖9. HCV表面包膜ELISA試劑盒檢測方法包被E2抗體，加樣品，再加生物 素表記的多肽，以及辣根過養化物酶標記的鏈黴親和素檢測HCV抗體陽性或 HCVRNA檢測陽性的C肝病人血清中的病毒。正常人血清作為對照。
具體實施例方式
實施例1
C型肝炎病毒包膜抗原試劑盒的配置
a. 生物素等標記的能與HCVE2蛋白特異性結合的12肽；
b. 多肽為SEQIDNO:l、 SEQIDNO:2、 SEQIDNO:4所示的序列；
c. 兔抗E2的的多克隆抗體；
d. 辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素；
e. 辣根過氧化物酶底物；
f. 酶標板(CellStar@,購自武漢大風生物科技有限公司)，酶標儀；
g. E2蛋白作為標準陽性孔；
h、酶聯免疫檢測儀(購自南京華東電子集團醫療裝備有限公司)。
一種多肽PF2A、 PE2B、 PE2C、 PE2D的步驟如下一、製備E2-GST融合蛋白的步驟如下
A. 挑取含有pGEX-KG-E2(見參考文獻Li, et al.， Engineering of N-glycosylation of Hepatitis C Virus Envelope Protein E2 Enhances T cell responses for DNA immunization, Vaccine. 2007. 25:1544-155l.)的大腸杆 菌BL21DE3(購自美國irwitrogen公司)培養於3 ml含有氨苄青黴素(50
g/ ml)的LB培養基中，對照組別接種含有pGEX-KG (GST蛋白的原 核表達載體，購自Amersham Biosciences公司)，37。C培養12~16小時。
B. 將小試管中的菌液分別轉移到200 ml含有氨苄青黴素(50g/ ml)的 LB液體培養基(LB液體培養基為lOg胰蛋白腖，5g酵母提取物， 10 g氯化鈉，溶解至1000 ml雙蒸水)中，37 。C培養到OD600為1 2。
C. 加入100 mM異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG),使其終濃度為0.1 mM， 3(TC誘導4 5小時。
D. 將誘導以後的菌液分裝到250ml的離心管中，4'C,7700 g，5min離心， 棄上清。
E. 沉澱用磷酸鹽緩衝液PBS(140mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10mM磷 酸氫二鈉，1.8mM磷酸二氫鉀)洗滌1次，4'C， 7700g,5min離心，棄上清。
F. 將沉澱重懸於8 ml含1 mM苯甲基磺醯氟(PMSF: 17.42 mg PMSF溶 於lml異丙醇中，-20 X:保存)的PBS中。
G. 將菌液放置冰中，超聲碎菌後加入20。/。曲通X-100 (20%TritonX-100:
1 ml TritonX-100溶於4 ml無菌雙蒸水中)，使其終濃度1%, 4°C,輕混 30分鐘。
H. 每EP管中加入1 ml超聲降解的菌液，4 °C， 12000 g, 10 min離心，取上清。
I. 上清再次離心，4 °C, 12000 g, 10 min，再取上清。
J.各EP管加入20 pi瓊脂糖凝膠4B (Sepharose 4B:購自Amersham Biosciences公司)，室溫(20-25°C，以下相同)輕混30min。 4°C， 5000 rpm， 5min，離心，棄上清。
K.每個EP管各加入1000.01M PBS洗滌，離心洗滌後將含有Separose 4B的懸濁液收集於一管，4'C， 5000 rpm, 5 min，離心，棄上清，共洗滌3次。
L.加入與Sepharose 4B等量的Glutathione Elution Buffer (0.0154 g谷光 苷肽溶解於0.25 mlpH8.0的1MPBS過濾除菌，分裝，4。C保存)，室 溫輕混10min， 4。C,5000rpm, 5min，取上清。
M.重複步驟L兩次。收集的上清則為所需E2-GST融合蛋白。
二、 製備兔抗E2蛋白抗體的步驟如下
A. 將表達純化的E2-GST融合蛋白用PBS稀釋至1 m/ml，加入完全弗氏佐 劑(CFA)，注射至紐西蘭家兔脊椎兩側6點皮下及腹股溝淋巴結，每 點0. l 0.2ml,每隻兔子抗原免疫劑量為1 mg。
B. 兩周後，用同樣抗原量再次免疫家兔，以不完全弗氏佐劑(IFA)為佐劑。 免疫位點及數量選擇同基礎免疫。
C. 共免疫4次，間隔時間為2周，後兩次免疫劑量為第一次劑量的1.5倍。 末次免疫後第10天心臟採血，室溫靜置凝固後，轉入4t:冰箱靜置過夜， 分離血清，血清即E2-GST融合蛋白抗體，置於-80。C冰箱保存備用。
三、 製備隨機DNA文庫的步驟如下(見圖1):
A. 寡核昔酸為3'-CCT CTATATAGGTAC CGA TCG (NNM)12 AGG CCG G TAGTA GTA GTA GTA GTA CCT4( G CCA-5'(卯bp)(劃線部分分別為 SD序列、啟始密碼子、HisTag、斜體部分為S"m/ZI酶切位點)(N代表 A, C， T或G, M代表A或C)
B. 第一輪PCR的上遊引物Ul為5'-G CTC GTA TAA TGT GTG GCC ACA ACG G" GGL4 GAT ATA TCC ATG -3' (43 bp)(劃線部分為5'端莖環和 斜體部分為核糖體結合位點:RBS)，下遊引物Dl為3'-GTA GTA ￡￡J
Q-5，(52 bp)(劃線部分分別為ftraHI酶切位點、Gly-Ser序列和3，端莖環) C.第二輪PCR的上遊引物U2為5'-GCG CTG CAG TTG ACA ATT AAT CAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG-3' (42 bp),(劃線部分分別為PWl酶切位點和Tac啟動子)。下遊引物為Dl。隨機DNA文庫的構建示意圖見圖
D. 以寡核普酸為模板，用引物U1和D1進行第一輪PCR，反應體系為
10 X Tag DNA Polymerase buffer (含Mg2+) 5 pi
dNTPmix(10mM) "1 引物Ul (20 pM) "1 引物Dl (20 (aM) Jfil 寡核苷酸(0.05嗎/pl) 化l 雙蒸水
TagDNA聚合酶 Jpl 總體積 50pl 反應程序
a. 95°C， 2分鐘
b. 95°C， 36秒；63°C， 36秒；72°C， 84秒；共25個循環。
c. 72°C， 5分鐘
E. PCR產物經2。/。的瓊脂糖凝膠(0.4g瓊脂糖粉末溶解於20mllXTAE溶 液)電泳，然後用回收試劑盒(QIAEX II gel Extraction Kit,美國promega
公司)回收。
F. 經步驟E回收所得的PCR產物作為模板，進行第二輪PCR擴增，反應 體系為
10 X Tag DNA Polymerase buffer (含Mg2+) 5 (al
dNTPmix(10mM) 引物Ul (20 nM) 引物Dl (20|aM)
第一輪PCR產物 4^1 雙蒸水 37pl TagDNA聚合酶 ^1 總體積 50|al 反應程序a. 95°C， 2分鐘
b. 95°C， 36秒；62°C， 36秒；72°C， 84秒；共25個循環。
c. 72°C, 5分鐘
G.步驟F所得得PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳，然後用回收試劑盒回 收，回收所得片段即可用於體外轉錄翻譯DNA模板。
四、製備核糖體展示文庫的步驟如下
A.核糖體文庫製備及篩選流程(見參考文獻Wu, et al., Pep^fes 2005， 26(11): 2057-2063.)，構建及篩選流程如圖2所示:將編碼1014個隨機12肽的DNA 庫在體外進行偶聯的轉錄/翻譯，轉錄產物mRNA由於缺乏終止子，不 能從核糖體上釋放，而與新生多肽、核糖體以共價鍵結合，形成一個穩 定的複合體結構。利用連接有Sepharose 4B的E2-GST蛋白(E2-GST— Sepharose 4B)親和篩選核糖體表面的隨機多肽，分離特異性結合的 mRNA—核糖體一多肽複合物，通過降低Mg^濃度，核糖體解離，釋放 mRNA，回收核糖體富集庫中的mRNA，逆轉錄成cDNA. PCR擴增， 其產物可作為下一輪體外合成的模板，經連接有Sepharose 4B的GST蛋 白(GST—Sepharose 4B)反篩以去除非特異性結合的多肽，E2-GST— Sepharose4B正篩，經過六輪篩選，篩選到與E2蛋白特異性結合的多肽。
B.反應體系
DNA模板(0.3mg/ml) 10 pl
S30 Premix without Amino Acids 20 jxl
胺基酸混合液(無甲硫氨酸) 2.5 )il
胺基酸混合液(無亮氨酸) 2.5 pi
S30 Extract,linear 15 pi
總體積 50 pi
輕輕混勻步驟B中各混合物，5000rpm，離心30秒，讓混合物沉積於 EP管底部。
C. 30'C孵育2.5小時。
D. EP管冰上放置5分鐘中止反應。即得到核糖體展示文庫。四、核糖體展示文庫篩選與C肝病毒E2糖蛋白結合的多肽的步驟如下(見圖2)A．在100「1體外轉錄翻譯混合物中加入6單位的無RNA酶的DNase(Promega公司，美國)，10 X DNase I緩衝液(Promega公司，美國)6 gl，37℃溫育30 min。然後加§¨l中止緩衝液，65~C，10 rain滅活DNase。B．取60「1 E2一GST-Sepharose 4B，4℃，5000 rpm，5 min離心，棄上清。C．沉澱用500 gl washing buffer(50 mM pH 7．5的Tris一醋酸，1 50 mM NaCl，0．1％Tween．20．50 mM醋酸鎂)洗滌3次。D．將100 ul體外轉錄／翻譯混合物加入到洗滌過的E2-GST-Sepharose 4B中，4℃搖動I小時。E 4℃，5000 rpm，5 min離心，棄上清，沉澱用洗脫緩衝液洗滌3次。F．沉澱中加入100¨l elution buffer，4℃搖動10 rain使mRNA與核糖體解離，4"C，5000 rpm，5 rain離心，取上清。G．用RNaid K「(購自biol01公司，美國)回收mRNA，具體方法如下g．上清中加入3倍體積的RNABinding Salt(RNaid Kit成份)混勻。h．再加入lOgl RNA MATRIX(RNaid Kit成份)，室溫放置5 min。i．13000 rpm，1 rain離心，棄上清。i．用RNAwash(RNaid Kit成份)洗滌2次，(RNAwash~gg。11)。k．加入1．Ogl無RNase的H20， 55口C溫育5 min。1． 13000 rpm，2 min離心，取上清，上清即是RNA模板，可用於RT-PCR。H．RT-PCR，其反應體系為AMV／Tfl 5×Reaction buffer10「ldNTP mix混合物1「1引物U 1(20 raM)l pl引物D l(20 mM)1肛1硫酸鎂(25 mM)2 plAMV Reverse Transcription1 LLlYfl DNA聚合酶1「lRNA模板1 pl無酶水 29 總體積 50 ^
反應程序為48°C， 45分鐘；94°C， 2分鐘；94°C， 30秒63°C， 1分 鍾，72°C， 2分鐘；共31個循環；72°C, 7分鐘 I. 2%瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳。 J.回收分子量大小為155 bp的RTPCR產物。
K.以回收產物為模板，再行第二輪PCR擴增，回收分子量大小為181 bp 的PCR產物。
L.將回收的第二輪PCR產物連接至載體pUC19 (購自美國invitrogen公 司)上，具體步驟為
a.將PCR產物及載體pUC19酶切，反應體系為
lOXY+Buffer 2^1
M 1 pi
ddH20 17pl
總體積 20 pi 37'C水浴2小時
b. 分別回收分子量大小為128 bp的DNA片段以及分子量大小為2.668 kb的pUC 19目的片斷(回收方法同上)。
c. 用DNA連接酶將步驟b所的DNA和載體pUC19連接，反應體系為
DNA 4 pil
pUC19 2^1
10 X Buffer 2 (il
T4連接酶 2 pi
雙蒸水 10 pi
總體積 20 pi 16'C孵育20小時
d.將步驟c所得的連接產物分別轉化至大腸桿菌DH5 a 。取連接產物 10 pl，加入100nlDH5a感受肽細胞，冰浴30分鐘，42°C 90秒，再冰浴5分鐘，加入800pl LB液體培養基(LB液體培養基為10 g 胰蛋白腖，5g酵母提取物，10g氯化鈉，溶解至1000ml雙蒸水)， 37°c， 225 rpm振搖40 50分鐘。取200pl菌液均勻塗在有氨苄青 黴素(Ampf)抗性的LB固體培養基(LB固體培養基為10g胰蛋 白腖，5g酵母提取物，10g氯化鈉，15g瓊脂粉溶解至1000ml雙 蒸水)上(氨苄青黴素濃度為50嗎/ml)， 37。C培養過夜。
e. 挑取單個克隆菌落，置於3 ml LB液體培養基(含氨節青黴50 pg/ml) 培養過夜。
f. 提取步驟e獲得的菌液的質粒DNA。
g. PCR鑑定步驟f所得的DNA，反應體系為
10 X Taq DNA polymerase buffer 5 (j1
dNTP mix混合物(l 0 mM) 1
引物u2(20 nM) 1 pi
引物D 1(20 ^M) 1 pi
質粒DNA 1 |ul
雙蒸水 40 ^
Taq DNA Polymerase 1 jil
總體積 50 pi
反應程序為95°c， 2分鐘；95°c， 30秒；62°c， 1分鐘，72°c， l分 鍾24秒；共25個循環；72°c， 5分鐘
h.將步驟g所得產物經^wzM和PWl鑑定，正確的克隆送至上海華諾 公司測序。
M.根據測序結果，請西安美聯公司合成12肽，見表1。 表l篩選出的與e2蛋白結合的多肽序列
分離的肽胺基酸序列
PE2AGFGRYRRHGSPWSEQIDNO:l
PE2BMAIGPYPACGSGSEQIDNO:2
PE2CLSVLVISMFNAVSEQIDNO:3
PE2DMARHR麗PLVMVSEQ謂0:4實施例2
表面等離子共振技術(SPR)檢測多肽與E2蛋白的親和力的步驟如下
A. 讓測試儀器Biocore(美國)通過一段HBS緩衝液直至基線穩定。
B. 注射40 pl氨基偶聯試劑(含0.02 M的l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亞胺(EDC)禾n 0.05 M的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS))，活化CM5傳
感片上的羧基。
C. 用pH值為5.0的醋酸緩衝液將E2蛋白稀釋至5 mg/ml，注射該溶液40
D. 上機檢測，流速為20nl/min。
E. 將多肽PE2A、 PE2B、 PE2C、 PE2D稀釋為不同濃度，以2 nl/min上機 與CM5傳感片上的E2蛋白作用7分鐘。
F. 以2 pl/min的流速注射10 pl的HC1再生液使基線恢復，實時採集響應 信號。
G. 用BIACORE的專用軟體進行數據分析，我們發現分析PE2D與E2蛋白 的親和力最高，結果見圖3，其親和力有關參數見表2。
表2多肽與E2蛋白相互結合作用的動力學數據
多肽 ka/M"s.1 (x104) kd/s.1 (xl(T3) kA/M"(x107)
PE2A3.22 1.39 2.32
PE2B2.56 1.22 2.10
PE2C I no ; no no
PE2D7.51 1.45 5.18
實施例3
流式細胞儀檢測多肽與靶分子細胞結合的步驟如下
A.培養人肝癌細胞Huh7.5(見參考文獻Zhong, et al.， Robust hepatitis C virus infection in vitro， 2005， PNAS, 102: 9294-9299)和DC-SIGN+陽NIH3T3 (表 面有DC-Sign分子的小鼠的成纖維細胞)細胞(見參考文獻Wu, et al.， Functional evaluation of DC-SIGN monoclonal antibodies reveals DC-SIGNinteractions with ICAM-3 do not promote human immunodeficiency virus type I transmission. J. virol. 2002, 76: 5905-5914)。培養條件均為10%胎牛 血清的DMEM培養基(Gibco公司購買)，培養於37°C，含5%二氧化 碳的培養箱中。
B. 將多肽PE2A、 PE2B、 PE2D分別與E2-GST蛋白混合(對照管加入GST蛋 白)，總體積為50pl，其中多肽的濃度均為500 pM, E2-GST蛋白和GST 蛋白的濃度均為20嗎/ml， 37。C孵育30分鐘。
C. 將步驟B所得的多肽與蛋白的混合物分別與收穫的Huh7.5和DC-SIGN+ -NIH3T3細胞混合，總體積為100Ml，其中細胞個數為2X 106個。37°C 孵育30分鐘。
D. 每管加入1 mlPBS洗滌，1000 rpm， 5 min，棄上清，用80 pl重懸細胞。
E. 加入201: 500的E2-GST抗體，37'C孵育30分鐘。
F. 重複步驟D。
G. 加入1 |al PE標記的羊抗兔的二抗，37'C孵育30分鐘。
H. 每管加入1 mlPBS洗滌，1000 rpm, 5 min，棄上清，用500 |al重懸細胞。
I. 經上機檢測，申請人發現PE2A,安PE2B， PE2D分別與E2-GST蛋白作用 後，能顯著抑制￡2蛋白結合到他117.5細胞(圖4)及0(:-810^^1113丁3細胞
(圖5)，且成劑量依賴關係，多肽劑量愈大，其與E2的親合力愈強，抑 制HCVE2侵襲靶細胞能力愈強(圖4A和圖4B)。
實施例4
多肽D能部分競爭性抑制E2與HCV的受體CD81,和肝素的結合(圖5)。 實施例5
PE2D能抑制HCVppv假病毒(圖6A,6B)侵襲人靶細胞(圖6C). HCVppv 假病毒的構建見6A,6B， PE2D抑制HCVppv假病毒侵襲人靶細胞的能 力呈劑量依賴性，多肽D濃度愈大,其抑制能力愈強(圖6C)。
實施例6檢測多肽PE2D與C肝病毒顆粒(HCVCC)結合的步驟如下
A. 96孔板裡每孔加入WWC肝病毒顆粒(3"05個病毒)和162 Ml碳酸氫 鈉緩衝液(0.05MpH9.6)，混合，4°C孵育7小時。
B. 洗滌液(0.1。/。Tween-20的PBS磷酸鹽緩衝液)洗滌五次。
C. 每孔加入100(xl封閉液(1%BSA的PBS磷酸鹽緩衝液)，4°C孵育過夜。
D. 洗滌液洗滌五次次後，分別加入Ofig， >g，化g， 的bio-PE2D到 96孔板中，每孔體積為IOOW， 37°C孵育lh。
E. 洗滌五次後，加入lOppl稀釋度為1:1000的辣根過養化物酶標記的鏈黴 親和素(HRP-advin，購自晶美公司)。
F. 加入鄰苯二氨顯色，酶標儀OD492 nm下讀取OD值。顯示ZD能與丙 肝病毒顆粒直接結合。
該實驗證明分離得到的多肽能特異性結合C肝病毒顆粒(HCVcc)，結合能力呈 劑量依賴性(圖7)。
實施例7
檢測多肽PE2D抑制C肝病毒顆粒(HCVcc)感染人肝細胞Huh7.5細胞的 步驟如下
A. 培養人肝癌細胞Huh7.5於24孔板中，置於37'C，含5%二氧化碳的培 養箱中，培養條件為10%胎牛血清的DMEM培養基，。
B. 每孔加入PE2D和3><105個C肝病毒顆粒，PE2D的濃度分為200(aM， 卿nM。
C. 37'C孵育5小時，洗滌細胞後，加入培養基培養3天。
D. 加入螢光標記的HCV-E2抗體(購自上海巴斯德研究所)與細胞孵育30 分鐘
E. 螢光顯微鏡下計數每孔紅色螢光點數(ffu/we11， 58nm)。 該實驗證明分離得到的多肽PE2D能特異性抑制C肝病毒顆粒(HCVcc
感染人肝細胞，且劑量越大，抑制能力越強，呈劑量依賴性(圖8)。
實施例8利用C型肝炎病毒包膜抗原試劑盒檢測150例C型肝炎病人血清裡的C肝 病毒(該病毒是從湖北.武漢有關醫院收集到C型肝炎病毒人血清裡的C肝病毒)， 150例正常人血清作為對照(體檢收集到正常人血清為參考物)，步驟如下
A. 96孔酶標板裡每孔加入100nl用碳酸氫鈉緩衝液(0.05MpH9.6)稀釋 的抗E2抗體(稀釋度為l: 400)， 37°C孵育l-2小時(或fC過夜)。
B. 洗滌液(0.1。/。Tween-20的PBS磷酸鹽緩衝液)洗滌五次。
C. 封被每孔加入100nl封閉液(P/。BSA的PBS磷酸鹽緩衝液)，4°C孵 育過夜。
D. 重複B步驟一次。
E. 每孔加入100 ^tlC肝病人血清或健康人血清，26。C-37。C孵育1~2小時。
F. 重複B步驟一次。
G. 每孔加入IO(VI 10mg/L的生物素標記的多肽(北京華大基因公司合成) 26'C-37'C孵育1~2小時。
H. 重複B步驟一次。
I. 每孔加入100 pl 1辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素(稀釋度為1: 1000)， 26。C-37。C孵育30分鐘。
J.加入鄰苯二氨顯色，酶標儀OD492nm下讀取OD值(見圖9)。結果顯 示生物素標記的多肽能特異性與C肝病人血清裡的病毒直接結合，其 OD值大於與正常人血清結合的OD值的2 3倍以上。可達到直接檢測 病人血樣裡病毒含量的效果。
SEQUENCE LISTING
武漢大學
C型肝炎病毒包膜抗原ELISA試劑盒及檢測方法 C型肝炎病毒包膜抗原ELISA試劑盒及檢測方法 4
Patentln version 3.1
1 12 PRT 人工合成
1
Gly Phe Gly Arg Tyr Arg Arg His Gly Ser Pro Trp 1 5 10
<210〉 2
12
PRT 人工合成
2
Met Ala lie Gly Pro Tyr Pro Ala Cys Gly Ser Gly 1 5 10
3
12
PRT 人工合成
<400〉 3
Leu Ser Val Leu Val He Ser Met Phe Asn Ala Val 1 5 10
4
<211〉 12
PRT 人工合成
<400〉 4
Met Ala Arg His Arg Asn Trp Pro Leu Val Met Val 1 5 10
權利要求
1、一種C型肝炎病毒包膜抗原ELISA試劑盒，其特徵是該試劑盒包括a. 生物素等標記的能與HCV E2蛋白特異性結合的12肽；b. 多肽為SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4所示的序列；c. 兔抗E2的的多克隆抗體；d. 辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素；e. 辣根過氧化物酶底物；f. 酶標板，酶標儀；g. E2蛋白作為標準陽性孔。
2、 利用權利要求l所述的一種試劑盒在製備檢測C型肝炎病毒包膜抗原ELISA試劑盒的方法，該檢測方法包括下列步驟A、 在96孔酶標板裡每孔加入100 pi用碳酸氫鈉緩衝液稀釋的兔抗E2抗體，稀釋度為l: 400， 37°C孵育l-2小時或4。C過夜，PBS洗滌3遍，甩幹，碳酸氫鈉緩衝液為0.05M， pH9.6;B、 洗滌液洗滌五次，洗滌液為0.1。/。Tween-20的PBS磷酸鹽緩衝液；C、 封被每孔加入100 ^封閉液，4°C孵育過夜，封閉液為1%BSA的PBS磷酸鹽緩衝液；D、 重複B步驟一次；E、 每孔加入100 C肝病人血清或健康人血清，26'C-37。C孵育1 2小時；F、 重複B步驟一次；G、 每孔加入100 10 mg/L的生物素標記的多肽室溫26'C-37'C孵育1~2小時；H、 重複B步驟一次；I、 每孔加入100pl辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素，稀釋度為1: 1000，26'C-37"C孵育30分鐘，加入辣根過氧化物酶底物鄰苯二氨顯色，酶標儀OD492nm下讀取OD值。
全文摘要
本發明公開了一種C型肝炎病毒包膜抗原ELISA試劑盒及檢測方法，包括酶標板，生物素標記的能與HCV E2蛋白特異性結合的三種多肽(12肽ZA，12肽ZB，12肽ZD)，兔抗E2的多克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素。一種檢測C型肝炎病毒包膜抗原試劑盒的方法，首先包被兔抗E2的多克隆抗體，再加入待測病人血清，第三是加入生物素標記的多肽，第四是加入辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素，第五是加入鄰苯二氨顯色，酶標儀OD450nm下讀取OD值。這些多肽及其標記物作為檢測C型肝炎病毒包膜抗原的試劑盒中的應用，這些多肽同時還可作為製備或治療預防C型肝炎病毒感染的藥物，可廣泛應用於醫學等相關領域。
文檔編號G01N33/576GK101458256SQ20071016889
公開日2009年6月17日 申請日期2007年12月14日 優先權日2007年12月14日
發明者晶 俞, 李冬青, 章曉聯 申請人:武漢大學