硝酸甘油治療急性心絞痛療效檢測方法和試劑盒的製作方法

2023-06-01 08:43:56 4

專利名稱：硝酸甘油治療急性心絞痛療效檢測方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域。更具體地涉及乙醛脫氫酶2基因(acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)的單核苷酸多態性(singlenucleotide polymorphism，SNP)及其與硝酸甘油治療急性心絞痛的療效之間相關性。本發明還涉及檢測這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術：
從1876年的第一次臨床應用起，硝酸甘油(Nitroglycerin，NTG)就被廣泛的用來治療急性心絞痛。硝酸甘油的舌下腺給藥治療已經成為了急性心絞痛的標準治療方法。一般硝酸甘油的舌下腺給藥治療可以使急性心絞痛的症狀在5到10分鐘內得到緩解。硝酸甘油的生理學治療原理主要被解釋為，它具有釋放具有藥理活性的氮氧化合物(NO or NO congener)的能力，從而激活和推動下遊環鳥苷酸(cGMP)途徑，達到舒緩血管平滑肌的作用。
急性心絞痛是一種極為危險的疾病，如果不能及時救治將有生命危險。雖然目前已經廣泛使用硝酸甘油治療急性心絞痛，但是臨床上仍發現有一些急性心絞痛病人在舌下腺給予硝酸甘油治療時的效果不明顯。這提示，這些人可能由於種種原因而對硝酸甘油治療不敏感。
人們嘗試提出了可能導致硝酸甘油治療失效的多種原因，包括環境差異、個體差異、飲食習慣等。
乙醛脫氫酶2基因屬於一個依賴NAD(P)的醛脫氫酶基因家族中的一員。這個基因家族主要的作用是在生理環境下的氧化醛類。除了具有脫氫酶的活性外，乙醛脫氫酶2基因還具有相當強的酯酶的活性。它可以促使硝酸甘油水解成1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)。
2002年，Chen.ZQ等人發現無論在體內實驗還是體外實驗，依賴cGMP的硝酸甘油對血管的擴張作用，都可以被乙醛脫氫酶2基因(ALDH2)蛋白的抑制劑所阻斷。這提示，乙醛脫氫酶2基因參與了依賴cGMP的硝酸甘油擴張血管的生理作用，並且扮演了重要的角色。
然而，迄今為止，可能導致硝酸甘油治療失效的真正原因尚沒有被證實。
綜上所述，人們對於影響硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的原因還了解甚少。為了針對性地使用硝酸甘油，本領域迫切需要開發預測硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的方法和試劑盒。

發明內容
本發明的目的就是提供一種預先判斷硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的方法及試劑盒。
在本發明的第一方面，提供了一種體外檢測樣品是否存在乙醛脫氫酶2基因ALDH2的單核苷酸多態性的方法，包括步驟(a)用ALDH2基因特異性引物擴增樣品的ALDH2基因，得到擴增產物；和(b)檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態性1951位G→A；其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
在另一優選例中，所述的基因特異性引物具有SEQ ID NO3和4的序列。
在另一優選例中，所述的擴增產物的長度為50-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第1951位。
在本發明的第二方面，提供了一種預測硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的試劑盒，它包括特異性擴增ALDH2基因或轉錄本的引物，所述的引物擴增出長度為50-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第1951位的擴增產物。
在另一優選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與SEQ ID NO1中第1951位的突變結合的探針；(b)識別SEQ ID NO1中第1951位的突變限制性內切酶。
在另一優選例中，所述的突變是以下的單核苷酸多態性1951位G→A；其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
在另一優選例中，所述的引物具有SEQ ID NO3和4的序列。
在本發明的第三方面，提供了一種對硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性進行預測的方法，它包括步驟檢測待檢個體的ALDH2基因、轉錄本和/或蛋白，並與正常的ALDH2基因、轉錄本和/或蛋白相比較，
存在差異就表明對該個體而言硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性低於普通的急性心絞痛人群。
在另一優選例中，檢測的是ALDH2的基因或轉錄本，並與正常ALDH2核苷酸序列比較差異。
在另一優選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態性1951位G→A；其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
在本發明的第四方面，提供了一種藥物組合物，它含有0.01-99wt％的1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)以及藥學上可接受的載體。或者，該組合物含有(a)安全有效量(0.01-99wt％)的硝酸甘油、(b)有效量的使硝酸甘油水解成1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)的野生型乙醛脫氫酶2(通常，乙醛脫氫酶2與硝酸甘油的摩爾比為1∶10,000至1∶1,000,000)，以及藥學上可接受的載體。
具體實施例方式
本發明人經過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析。首次發現和證明了ALDH2基因的部分SNP與硝酸甘油治療急性心絞痛的療效密切相關，ALDH2的改變將導致硝酸甘油治療急性心絞痛的療效下降，其中關聯研究結果顯示，在ALDH2第1951位的SNP(1951位G→A)在病例和對照組中的分布存在顯著性差異(P＜0.01)，因此可作為預測硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的特異性SNP。在此基礎上完成了本發明。
ALDH2基因乙醛脫氫酶2基因(acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)的詳細序列可參見登錄號為NT_009775的核苷酸序列(可參見網址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，如SEQ ID NO1所示。其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO2所示。
乙醛脫氫酶2基因屬於一個依賴NAD(P)的醛脫氫酶基因家族中的一員。這個基因家族主要的作用是在生理環境下的氧化醛類。除了具有脫氫酶的活性外，乙醛脫氫酶2基因還具有相當強的酯酶的活性。它可以促使硝酸甘油水解成1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)。
本發明的研究表明，當乙醛脫氫酶2發生突變導致活性下降時，將使硝酸甘油對血管的擴張作用受到影響，甚至被阻斷，從而導致硝酸甘油療效下降。
如本文所用，「ALDH2基因」指編碼乙醛脫氫酶2的多核苷酸分子，包括DNA和RNA。
如本文所用，「ALDH2蛋白」指乙醛脫氫酶2蛋白。
如本文所用，把乙醛脫氫酶2基因分為兩種類型的等位基因，即多態性位點為G的乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)和多態性位點為A的乙醛脫氫酶2基因2型(ALDH2*2)。
本發明人對大量候選基因的SNP進行了測定和分析，其中對ALDH2基因中的幾乎整個區域進行了測序，發現了許多SNP，其中大部分SNP與硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性並不相關，然而關聯研究表明，1951位G→A卻是與硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性關聯性非常高的SNP。該SNP使讀碼框從GAA變為AAA，從而引起了504位胺基酸從Glu到Lys的改變，進而導致影響ALDH2的活性，並最終導致攜帶者的硝酸甘油治療急性心絞痛的療效明顯低於普通的急性心絞痛人群。
基於本發明的新發現，ALDH2蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限於)輔助治療急性心絞痛，例如與硝酸甘油一起用於聯合治療急性心絞痛。
另一方面，本發明還包括對人ALDH2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人ALDH2基因產物或片段。較佳地，指那些能與人ALDH2基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制人ALDH2蛋白的分子，也包括那些並不影響人ALDH2蛋白功能的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人ALDH2基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人ALDH2蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。本發明的抗體包括能阻斷人ALDH2蛋白功能的抗體以及不影響人ALDH2蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人AIDH2基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與人ALDH2基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗人ALDH2蛋白的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人ALDH2蛋白的多少和/或突變與否。一種優選的抗ALDH2抗體是不識別正常ALDH2但識別突變ALDH2的抗體，或者識別正常ALDH2(即野生型)但不識別突變型ALDH2的抗體。利用這些抗體，可以方便地在蛋白質水平進行硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的預測。
利用本發明ALDH2蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與ALDH2蛋白發生相互作用的物質，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明ALDH2蛋白及其激動劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)舌下、肌內、靜脈內、或皮下給藥。
正常的ALDH2可直接用於疾病治療，例如，用於硝酸甘油治療急性心絞痛的療效治療。在使用本發明ALDH2蛋白抑制劑時，還可同時使用其他治療硝酸甘油治療急性心絞痛的療效的藥劑。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明ALDH2蛋白和硝酸甘油、以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的ALDH2蛋白或其激動劑施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
本發明還涉及定量和定位檢測人ALDH2蛋白水平的試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括ELISA等。
一種檢測樣品中是否存在ALDH2蛋白的方法是利用ALDH2蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與ALDH2蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在ALDH2蛋白。
ALDH2蛋白的多聚核苷酸可用於預先判斷硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性。如ALDH2 DNA序列可用於對活檢標本的雜交以判斷ALDH2蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析和基因檢測。用ALDH2蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測ALDH2蛋白的轉錄產物。
檢測ALDH2基因的突變也可用於預先判斷硝酸甘油治療急性心絞痛的療效。檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。ALDH2蛋白突變的形式包括與正常野生型ALDH2 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
最方便的檢測本發明SNP的方法，是通過用ALDH2基因特異性引物擴增樣品的ALDH2基因，得到擴增產物；然後檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態性1951位G→A，其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
應理解，在本發明首次揭示了ALDH2基因的SNP與硝酸甘油治療急性心絞痛的療效的相關性之後，本領域技術人員可以方便地設計出可特異性擴增出含該SNP位置的擴增產物，然後通過測序等方法確定是否存在1951位G→A。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補是優選的，但是本領域技術人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(尤其是引物的5′端)的情況下，也能夠特異性地擴增(即僅擴增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發明範圍之內，只要該引物擴增出的擴增產物含有本發明SNP的對應位置。一種優選的引物對具有SEQ ID NO3和4的序列。
雖然擴增產物的長度沒有特別限制，但是通常擴增產物的長度為50-3000bp，較佳地為150-2000bp，更佳地為200-1000bp。這些擴增產物都應含有SEQ ID NO1中第1951位。
由於本發明的SNP與硝酸甘油治療急性心絞痛的療效具有非常高的關聯性，因此不僅可用於早期較準確地預先判斷硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性，而且可以未雨綢繆地使攜帶者在未發病前或發病時就採取合理的預防措施(如使用其他有效藥物如1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)，或在使用硝酸甘油的同時使用乙醛脫氫酶2)，從而顯著提高對急性心絞痛患者的救治效果，因此具有極其重大的應用價值和社會效益。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例11.1研究對象選取了80名中國漢族，並且明確診斷冠心病的病人。他們均以含服硝酸甘油作為心絞痛發作時用藥。根據舌下硝酸甘油給藥的效果，可以將這些病人分為十分鐘內顯效的有效組，和十分鐘內未顯效的無效組。有效組共有59個病人，其中男性47人，女性12人。無效組共21個病人，其中男性13人，女性8人。這些病人，從性別關係上看，給藥的效果與患者的性別無顯著相關(p＝0.107)。
1.2實驗方法和結果1.2.1DNA提取用常規酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul後，用於常規PCR擴增。
1.2.2PCR及測序引物的設計根據GenBank中ALDH2基因的序列，設計和合成以下引物。具體引物如下表1所示。
表1引物序列表

1.2.3ALDH2基因的PCR擴增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR儀上以Touchdown程序進行PCR擴增。反應條件為94℃預變性2分鐘，94℃變性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10個循環，每個循環退火溫度遞減0.5℃；以後94℃變性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30個循環；最後72℃延伸7分鐘。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證。
結果，獲得358bp的擴增產物。
1.2.4SNP的發現和檢測PCR產物經Resin樹脂純化後，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀(美國應用生物系統公司appliedbiosystems(ABI))進行螢光標記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟體(美國華盛頓大學http//droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)進行序列的判讀和SNP確認。
結果，發現存在以下SNP1951位G→A。
1.2.5SNP基因分型和分析將這80個病人，針對乙醛脫氫酶2基因中的1951G/A位點，利用如上的PCR以及測序的結果，進行了基因分型。
結果發現在有效組中，乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)純合子個體(即1951位為G/G)數為40個；而在無效組中，乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)純合子個體數為7個。乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)純合子的個數，在兩個不同的組中，具有顯著性差異(x2＝7.59，p＝0.006)。結果說明，舌下硝酸甘油給藥治療急性心絞痛的效果，對乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)純合子的個體，明顯比對乙醛脫氫酶2基因2型(ALDH2*2)純合子(即1951位為A/A)，或乙醛脫氫酶2基因1型、2型的雜合子的個體(即1951位為G/A)要更有效，並且兩者具有顯著性差異。
實施例2野生型和突變型乙醛脫氫酶2的活性測定從乙醛脫氫酶2基因型雜合的個體中，利用逆轉錄的方法得到了野生型和1951位G→A突變型的兩種不同基因型的逆轉錄DNA(cDNA)，並通過測序對所得序列進行了驗證。隨後，使用嵌套式PCR(nest-PCR)的方法對目標序列進行了擴增，並引入了酶切位點。然後，擴增後的序列被重組進質粒中(recombinantplasmid)，並將質粒轉染進了昆蟲細胞sf9(購自Invitrogen公司)中。重組進質粒的序列也通過測序進行了驗證，分別為SEQ ID NO5(野生型，第1510位為G)和SEQ ID NO6(突變型，第1510位為A)。使用常規免疫吸染(immunoblotting)的方法，驗證了傳染進細胞中的質粒的乙醛脫氫酶2基因的表達。
重組表達的乙醛脫氫酶2基因蛋白，經過親合層析提純，可以通過12％的丙烯醯胺凝膠電泳，利用託馬斯亮藍(Coomassie blue)染色，看到大約54kDa的蛋白。
將重組表達的兩種不同基因型的乙醛脫氫酶2基因蛋白，以及直接從乙醛脫氫酶2基因1型純合個體和乙醛脫氫酶2基因1型、2型雜合個體取得的純化後的乙醛脫氫酶2基因蛋白，通過放射化學的方法，檢測這四種樣本轉化硝酸甘油的能力。
結果見下表兩種等位基因型蛋白的動力學特性

結果發現乙醛脫氫酶2基因1型(即野生型)的蛋白，明顯比乙醛脫氫酶2基因2型的蛋白，在轉化硝酸甘油方面，具有更低的Km，以及更高的Vmax。而乙醛脫氫酶2基因1型的蛋白純合子的蛋白，也比1型、2型雜合子蛋白具有更低的Km，更高的Vmax。
由此可見，乙醛脫氫酶2基因1型的蛋白具有更高的轉化硝酸甘油的生理活性。而乙醛脫氫酶2基因2型的蛋白，由於1951G→A的突變，改變了蛋白的胺基酸序列，影響了蛋白的功能和活性。乙醛脫氫酶2基因2型的蛋白無法有效的轉化硝酸甘油，也就影響了硝酸甘油對下遊cGMP途徑的作用，無法達到有效舒張血管平滑肌的效果，從而降低了硝酸甘油對急性心絞痛的療效。
實施例3硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性有效性預測試劑盒如實施例1所述，SEQ ID NO1中1951位G→A的突變與硝酸甘油治療急性心絞痛的療效密切相關。因此，可基於這個突變設計ALDH2基因特異性引物在以待測個體的DNA為模板進行擴增進行預測。
製備一試劑盒(100人次)，它含有

抽取待測男性病人的血液3ml，使用常規方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將硝酸甘油治療急性心絞痛的療效預測試劑盒中的PCR引物稀釋到1ìmol/ìl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進行PCR反應。PCR產物純化後，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀進行螢光標記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟體進行序列的判讀和SNP確認。
或者，將擴增產物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進行色譜分析，也可檢測出1951位G→A。
結果表明，含1951位G→A的測試對象的硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性(以十分鐘顯效為標準)低於普通的急性心絞痛人群。
實施例4其他乙醛脫氫酶2的SNP與硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的相關性除了1951位G→A之外，還用實施例1中所述的方法檢測到了ALDH2基因中以下9個SNP

用實施例1中相同方法，對這些SNP進行了SNP基因分型和分析。結果表明，這些SNP與硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性在統計學上沒有相關性。
討論乙醛脫氫酶2基因屬於一個依賴NAD(P)的醛脫氫酶基因家族中的一員。這個基因家族主要的作用是在生理環境下的氧化醛類。除了具有脫氫酶的活性外，乙醛脫氫酶2基因還具有相當強的酯酶的活性。它可以促使硝酸甘油水解成1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)。
在乙醛脫氫酶2基因(ALDH2)的第十二號外顯子中，有一個單核苷酸多態性位點(SNP)，即SEQ ID NO1中第1951位的鳥苷酸和腺苷酸(G/A)的多態。這個SNP位點把乙醛脫氫酶2蛋白的第504號胺基酸從穀氨酸(Glu)改變成了賴氨酸(Lys)(見SEQ ID NO2)。由這個SNP，把乙醛脫氫酶2基因分為兩種類型的等位基因，即多態性位點為G的乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)和多態性位點為A的乙醛脫氫酶2基因2型(ALDH2*2)。
這個SNP在包括中國人在內的亞洲人群中，具有比較高的頻率，約為30％左右。由於它改變了乙醛脫氫酶2基因蛋白的胺基酸序列，導致了這個SNP具有功能上的作用。乙醛脫氫酶2基因1型具有正常的酶活性，而乙醛脫氫酶2基因2型產出的是具有活性缺陷的酶。乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)生成的有正常活性的酶，可以促發下遊反應，使硝酸甘油發揮舒張血管的作用。而乙醛脫氫酶2基因2型(ALDH2*2)所生成的沒有正常活性的酶，無法正常促發下遊反應，使得硝酸甘油的舒張血管作用減弱，甚至消失。
本發明提示，可以將乙醛脫氫酶2基因1型與硝酸甘油聯合給藥，或者對於具有1951位G→A突變的急性心絞痛患者，可以在硝酸甘油之外使用1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)等藥物。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110上海人類基因組研究中心復旦大學上海第二醫科大學附屬瑞金醫院120硝酸甘油治療急性心絞痛療效檢測方法和試劑盒1300459371606170PatentIn version 3.121012112445212DNA213智人(Homo sapiens)4001acctcgttca tctccttcac ctccgaaatg atctcgcttt tgggtttacg gccggtctct 60tcacctggag catcagccgg gaaggtcagg gtcgccctgg ctcgggcctg ttcacattgg120ggtcaaaggc acacattggg ggctcaacca aggcgagctg cgttcgcggg gccgggtctt180tccgcacagg cggagggcgg tggcgggcgc ggaggcgtcg cgcgagccag ggggcagcca240cgggccgggg gtacctagcg ccacccgctt cgcttgcatc agctgcgcgc cccatcccga300ggaatggtag aggcagcccc gcccccggcc cgcccccgcc tttccattgg ctgccgcgcg360gggcggggag cggggtcggc tcagtggccc tgagacccta gctctgctct cggtccgctc420gctgtccgct agcccgctgc gatgttgcgc gctgccgccc gcttcgggcc ccgcctgggc480cgccgcctct tgtcagccgc cgccacccag gccgtgcctg cccccaacca gcagcccgag540gtcttctgca accagatttt cataaacaat gaatggcacg atgccgtcag caggaaaaca600ttccccaccg tcaatccgtc cactggagag gtcatctgtc aggtagctga aggggacaag660gaagatgtgg acaaggcagt gaaggccgcc cgggccgcct tccagctggg ctcaccttgg720cgccgcatgg acgcatcaca caggggccgg ctgctgaacc gcctggccga tctgatcgag780cgggaccgga cctacctggc ggccttggag accctggaca atggcaagcc ctatgtcatc840tcctacctgg tggatttgga catggtcctc aaatgtctcc ggtattatgc cggctgggct900gataagtacc acgggaaaac catccccatt gacggagact tcttcagcta cacacgccat960gaacctgtgg gggtgtgcgg gcagatcatt ccgtggaatt tcccgctcct gatgcaagca 1020tggaagctgg gcccagcctt ggcaactgga aacgtggttg tgatgaaggt agctgagcag 1080acacccctca ccgccctcta tgtggccaac ctgatcaagg aggctggctt tccccctggt 1140gtggtcaaca ttgtgcctgg atttggcccc acggctgggg ccgccattgc ctcccatgag 1200gatgtggaca aagtggcatt cacaggctcc actgagattg gccgcgtaat ccaggttgct 1260gctgggagca gcaacctcaa gagagtgacc ttggagctgg gggggaagag ccccaacatc 1320atcatgtcag atgccgatat ggattgggcc gtggaacagg cccacttcgc cctgttcttc 1380aaccagggcc agtgctgctg tgccggctcc cggaccttcg tgcaggagga catctatgat 1440gagtttgtgg agcggagcgt tgcccgggcc aagtctcggg tggtcgggaa cccctttgat 1500agcaagaccg agcaggggcc gcaggtggat gaaactcagt ttaagaagat cctcggctac 1560atcaacacgg ggaagcaaga gggggcgaag ctgctgtgtg gtgggggcat tgctgctgac 1620cgtggttact tcatccagcc cactgtgttt ggagatgtgc aggatggcat gaccatcgcc 1680aaggaggaga tcttcgggcc agtgatgcag atcctgaagt tcaagaccat agaggaggtt 1740
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1.一種體外檢測樣品是否存在乙醛脫氫酶2基因ALDH2的單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，包括步驟(a)用ALDH2基因特異性引物擴增樣品的ALDH2基因，得到擴增產物；和(b)檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態性1951位G→A；其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的基因特異性引物具有SEQID NO3和4的序列。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的擴增產物的長度為50-3000bp，且含有SEQ ID N01中第1951位。
4.一種預測硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的試劑盒，其特徵在於，它包括特異性擴增ALDH2基因或轉錄本的引物，所述的引物擴增出長度為50-3000bp，且含有SEQID NO1中第1951位的擴增產物。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於，它還含有選自下組的試劑(a)與SEQ ID NO1中第1951位的突變結合的探針；(b)識別SEQ ID NO1中第1951位的突變限制性內切酶。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述的突變是以下的單核苷酸多態性1951位G→A；其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
7.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於，所述的引物具有SEQ ID NO3和4的序列。
8.一種對硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性進行預測的方法，其特徵在於，它包括步驟檢測待檢個體的ALDH2基因、轉錄本和/或蛋白，並與正常的ALDH2基因、轉錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明對該個體而言硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性低於普通的急性心絞痛人群。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，檢測的是ALDH2的基因或轉錄本，並與正常ALDH2核苷酸序列比較差異。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述的差異是以下的單核苷酸多態性1951位G→A；其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
全文摘要
本發明公開了一種預測硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性有效性的方法，它包括檢測個體的乙醛脫氫酶2基因ALDH2、轉錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明對該個體而言用硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性低於普通的急性心絞痛人群。本發明還公開了相應的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1749415SQ20041006637
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月15日 優先權日2004年9月15日
發明者黃薇, 金力, 李一峰, 金瑋 申請人:上海人類基因組研究中心, 復旦大學, 上海第二醫科大學附屬瑞金醫院