與C-Met相關的生物物質的製作方法

2023-06-16 07:52:46 2

與C-Met相關的生物物質的製作方法
【專利摘要】本發明涉及可能與VEGF和/或EGFR組合地與c-Met相關的生物物質，並且更特別地涉及多肽、編碼所述多肽的核酸；涉及用於製備所述多肽的方法；涉及表達或能夠表達所述多肽的宿主細胞；涉及包含所述多肽的組合物，特別是藥物組合物，其用於預防、治療或診斷目的。本發明還描述並提供了用於評估患者對c-Met治療的響應性的方法和試劑盒。
【專利說明】與C-Met相關的生物物質
發明領域
[0001] 本發明涉及與C-Met相關的生物物質，並且更特別地涉及多肽、編碼所述多肽的核酸；涉及用於製備所述多肽的方法；涉及表達或能夠表達所述多肽的宿主細胞；涉及包含所述多肽的組合物，特別是藥物組合物，其用於預防、治療或診斷目的。本發明還描述並提供了用於評估患者對c-Met治療的響應性的方法和試劑盒。
[0002] 發明背景
[0003]受體酪氨酸激酶(RTKs)是重要細胞過程(諸如細胞生長、分化、新血管生成和組織修復)的關鍵調控劑。除了其在正常生理學中的重要性之外，某些RTKs的異常表達已經參與多種類型的癌症的形成和進展。這些RTKs已經成為用於癌症治療的有希望的藥物靶標。
[0004]RTK c-Met是針對肝細胞生長因子((HGF)，也稱為分散因子)的細胞表面受體(Cooper 等，Nature(自然)1984; 311:29-33; Bottaro 等，Science(科學)1991; 251:802 - 4)。HGF是90kD的多結構域糖蛋白，其與纖維蛋白酶原絲氨酸蛋白酶家族的各成員高度相關。其由間充質細胞分泌為單鏈的無活性的多肽，並且由多種蛋白酶裂解為其活性的α/β異源二聚體細胞外形式(Birchmeier等，Nat Rev Mol Cell Biol (自然分子細胞生物學綜述)2003;4:915-25)。α鏈NH2-末端部分包含高親和力c_Met受體結合結構域，但是β鏈是與c-Met受體相互作用用於受體激活所必需的(Matsumoto&Nakamura Cancer Sci(Matsumoto&Nakamura癌症科學)2003; 94:321 - 7)。c_Met受體,與其配體相似,是由細胞外α和β鏈組成的二硫鍵連接的異源二聚體。α鏈異源二聚體化到β鏈的氨基端部分，形成細胞外結構域中的主要配體結合位點。c-Met的羧基端尾部包含酪氨酸Υ1349和Υ1356，其在被磷酸化時作為細胞內銜接蛋白(intracellular adaptor proteins)的停靠位點，引起下遊信號傳導(Ponzetto等，Mol Cell Biol (分子細胞生物學)1993; 13:4600 - 8)。c-Met/HGF途徑是侵襲性生長程序(invasive growth program)的主要驅動者,所述侵襲性生長程序是一系列的事件，包括細胞增殖、分散、遷移、存活和組織侵襲。在正常情況下，侵襲性生長程序對於胚胎發生過程中的正確的器官形成和成年人內穩態是重要的。重要的是，其還參與腫瘤發生、腫瘤血管形成和轉移。
[0005]使用防止配體/受體結合的HGF-或c-Met-特異性抗體，通過抑制增殖並且增強細胞凋亡而導致生長抑制和腫瘤消退。三種單克隆抗體的組合在體外和體內表現出針對HGF的高中和活性，並且表現出針對自分泌HGF-Met-表達性神經膠質瘤異種移植物腫瘤的顯著的腫瘤生長抑制(Cao等，Proc Natl Acad Sci USA (美國國家科學院學報)2001; 98:7443 - 8)。使用單克隆抗體的策略允許針對HGF/c_Met的排他性的特異性，與小分子激酶抑制劑相比相對長的半衰期，以及激發針對腫瘤細胞的宿主免疫應答的潛力(Liu等，Expert Opin Investig Drugs (藥物研究的專家觀點)2008; 17:997 - 1011)。
[0006]AMG102 (Amgen, Inc.)是完全的人IgG2單克隆抗體，其選擇性結合併且中和HGF，由此防止其與c-Met結合以及隨後的活化(Kakkar等，Pharm Res (藥物研究)2007; 24:1910-8 ;Burgess 等，Cancer Res (癌症研究)2006; 66:1721 - 9)。[0007]單臂5D5 (0A5D5, MetMAb; Genentech)是來源於激動性單克隆抗體的人源化的、單價的、拮抗性抗-c-Met抗體(Nguyen等，Cancer Gene Ther (癌症基因治療)2003;10:840 - 9)。MetMAb以高親和力結合c_Met，並且保持在具有c-Met的細胞表面上，防止HGF結合和隨後的c-Met磷酸化以及下遊信號傳導活動和細胞反應。
[0008]不幸的是，使用大的單克隆和/或極大改造的抗體還帶有高的製備成本，並且與其他策略相比，導致不是最理想的腫瘤透過性。
[0009]根據目前的生物醫學理解，耐藥性由負責調節細胞增殖、凋亡、遷移和侵入的複雜的蛋白網絡引起。目前，還沒有關於生長因子受體依賴性信號傳導途徑的系統性描述。事實上，c-Met異常性推動癌症發展的分子途徑是極端複雜的，並且涉及多種相互連接的信號傳導途徑，包括信號傳導分子(如Ras和PI3K)、受體(如EGFR)和生長因子(如VEGF)。
[0010]已經描述了靶向血清白蛋白來延長生物分子(諸如例如免疫球蛋白單可變結構域)的半衰期，例如，在W02008/028977，W004/041865和W008/122787中，和未公布的2011年6月23日提交的US61/500, 464。
[0011]發明概沭
[0012]本領域需要更有效的c-Met (或者本文中還稱為c-MET)拮抗劑，與小分子藥物相t匕，其具有優越的選擇性和特異性，調節半衰期的能力，和/或優越的腫瘤靶向性，即，比常規抗體小，並且具有基於白蛋白的腫瘤靶向策略。此外，本領域還需要診斷、預防和/或治療適用的c-Met拮抗劑，如本文所提供的。
[0013]在研究和治療應用中，免疫球蛋白序列，如抗體和來源於其的抗原結合片段(例如，免疫球蛋白單可變結構域)用於特異性靶向其各自的抗原。免疫球蛋白單可變結構域諸如例如VHHs的產生可能包括免疫實驗動物，如美洲駝(Llama)，從免疫組織構建噬菌體文庫，選擇結合噬菌體展示的抗原的免疫球蛋白單可變結構域並針對需要的特異性篩選所述結構域及其改造的構建體(W094/04678)。備選地，通過直接從首次用於實驗的文庫或合成的文庫中選擇結合噬菌體展示的抗原的免疫球蛋白單可變結構域，並且隨後針對需要的特異性篩選所述結構域及其改造的構建體可以產生相似的免疫球蛋白單可變結構域，諸如例如，dAbs (Ward 等，Nature (自然)，1989，341:544-6; Holt 等，Trends Biotechnol.(生物技術趨勢)，2003，21(11):484-490;以及例如，W006/030220, W006/003388和Domantis Ltd.的其他公布的專利申請)。
[0014]本發明涉及特定的多肽，其也稱為「本發明的多肽」或「本發明的免疫球蛋白單可變結構域」或「本發明的ISVD」，所述多肽包含下述，或者，更優選地，基本上由下述組成:
(i)基本上由一個或多個(優選一個)免疫球蛋白單可變結構域組成的第一結構單元，其中所述免疫球蛋白單可變結構域針對c-Met,特別是針對人c-Met ； (ii)任選地基本上由一個或多個(優選一個)免疫球蛋白單可變結構域組成的第二結構單元，其中所述免疫球蛋白單可變結構域針對血清白蛋白，特別是針對人血清白蛋白(並且甚至更優選地，其中所述免疫球蛋白單可變結構域是Albll或Alb23(如本文定義任選地基本上由一個或多個(優選一個)免疫球蛋白單可變結構域組成的第三和/或第四結構單元，其中所述免疫球蛋白單可變結構域針對EGFR，特別是針對人EGFR，和/或針對VEGF，特別是針對人VEGF。此外，本發明還涉及編碼所述多肽的核酸；涉及用於製備所述多肽的方法；涉及表達或能夠表達所述多肽的宿主細胞；涉及包含所述多肽、核酸和/或宿主細胞的組合物，特別是藥物組合物；並且涉及所述多肽、核酸、宿主細胞和/或組合物用於預防、治療或診斷目的的應用。本發明還描述並提供了用於評估患者對c-Met治療的響應性的方法和試劑盒。本發明的其他方面、實施方案、優點和應用將通過本文的進一步描述而變得清楚。
[0015]如已經提及的，在一些具體的而非限制性的方面中(在本文中更詳細地描述)，本發明提供:針對(如本文定義)c-Met並且能夠抑制或阻斷(完全地或部分地，如本文進一步所述)配體結合，且特別是抑制或阻斷(完全地或部分地，如本文進一步所述)HGF與c-Met的結合(如本文進一步所述)的胺基酸序列。這些胺基酸序列在本文中還稱為「c-Met-阻斷胺基酸序列」或「c-Met-阻斷結構單元」。優選地，這些c-Met-阻斷胺基酸序列為ISVD’s (如本文所述)，在這種情形中，其還稱為「c-Met-阻斷ISVD』 S」。優選地，任意c-Met-阻斷胺基酸序列、c-Met-阻斷結構單元或c-Met-阻斷ISVD’s是這樣的，以使其具有阻斷活性，SP，部分或完全阻斷HGF與c-Met的結合，這可以通過本領域技術人員已知的任何適當的測定來確定，諸如，例如，通過α篩選測定(Alphascreen assay)或通過FACS競爭性測定(如本文所述，例如，實施例2.3.2基於流式細胞術測定的HGF/c-Met競爭性測定)來確定。優選地，阻斷活性通過實施例2.3.2所述的FACS競爭性測定來確定。優選地，所述ISVD在A549細胞中具有IC5tl小於600nM，但是優選為500nM, 400nM, 300nM, 200nM, IOOnM或者甚至更小的阻斷或競爭HGF與c-Met結合的阻斷活性或競爭能力。例如，04E09-樣ISVD在該測定中具有IC50小於ΙΟΟηΜ，更優選地，小於75nM，50nM或者甚至更小，諸如小於20nM或15nM，IOnM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, InM或甚至更優選地小於0.75nM或者甚至小於0.5nM的阻斷活性或競爭能力。
[0016]例如，33H10-樣ISVD在該測定中具有IC50小於ΙΟΟηΜ，更優選地，小於75nM，50nM或者甚至更小，諸如小於20nM或15nM, IOnM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, InM或者甚至更優選地小於0.75nM, 0.5nM, 0.25nM或者甚至小於0.1nM的阻斷活性或競爭能力。在一個具體的而非限制性的方面中，「c-Met-阻斷胺基酸序列」或「c-Met-阻斷結構單元」(中的一些)可以是(並且優選也是)這樣的，以使其能夠抑制或阻斷c-Met信號傳導(例如，參見實施例2.4-2.6和22)，例如，在用於實施例2.4的磷酸化測定，實施例2.5的增殖測定和/或實施例2.6的趨化性測定中。優選地，任意c-Met-阻斷胺基酸序列，c-Met-阻斷結構單元或c-Met-阻斷ISVD』 s是這樣的，以使其具有阻斷活性，即，部分或完全阻斷或抑制HGF介導的c-Met磷酸化,這可以通過本領域技術人員已知的任何適當的測定來確定，諸如，例如，通過任意適當的磷酸化測定，諸如，例如，如本文所述的HGF-誘導的c-Met磷酸化測定。優選地，通過實施例1.6，2.4和22中所述的HGF介導的c-Met磷酸化來確定對磷酸化的阻斷活性或抑制能力。優選地，所述ISVD在A549腫瘤細胞中具有IC5tl小於600nM,但是優選地，500nM，400nM，300nM，200nM, IOOnM或甚至更小的對配體(例如，HGF)誘導的Tyrl349-磷酸化的c-Met的阻斷活性或抑制能力。例如，04E09-樣ISVD在該測定中具有IC50小於IOOnM,更優選地，小於75nM，50nM或甚至更小，諸如小於40nM或30nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM 或 12nM 或甚至更優選地小於 11，10，9，8 或 7nM 的阻斷活性或競爭能力。例如，33H10-樣ISVD在該測定中具有IC50小於IOOnM,更優選地，小於75nM, 50nM 或甚至更小，諸如小於 40nM 或 30nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM 或 12nM 或者甚至更優選地小於11，10，9，8，7，6，5，4或3nM的阻斷活性或競爭能力。
[0017]優選地，通過如實施例2.5和22中所述的HGF-誘導的增殖測定來確定對信號傳導的阻斷活性或抑制能力。優選地，所述ISVD具有IC50小於600nM，但是優選地，500nM, 400nM, 300nM, 200nM, IOOnM或甚至更小的對配體(例如，HGF)誘導的BxPC_3細胞增殖的阻斷活性或抑制能力。例如，04E09-樣ISVD在該測定中具有IC50小於IOOnM,更優選地，小於80nM, 70nM或甚至更小，諸如小於60nM或50nM, 45nM, 40nM, 35nM, 30nM或者甚至更優選地小於20nM，諸如15，12，10，8，7，6，5，4，3，或者甚至小於2nM的阻斷活性或競爭能力。例如，33H10-樣ISVD在該測定中具有IC50小於IOOnM,更優選地，小於80nM，70nM或甚至更小，諸如小於60nM或50nM, 45nM, 40nM, 35nM, 30nM或者甚至更優選地小於20nM,諸如15，12，10，8，7，6，5，4，3，或者甚至小於2nM的的阻斷活性或競爭能力。
[0018]優選地，通過實施例2.6中所述的HGF-依賴性趨化性測定來確定對信號傳導的阻斷活性或抑制能力。優選地，所述ISVD具有IC50小於600nM，但是優選地，500nM, 400nM, 300nM, 200nM, 150nM或甚至更小的對配體(例如，HGF)誘導的A549細胞趨化性的阻斷活性或抑制能力。例如，04E09-樣ISVD在該測定中具有IC50小於150nM，更優選地，小於ΙΟΟηΜ, 90nM, 80nM或甚至更小，諸如小於80nM, 70nM或60nM, 55nM或50nM或甚至更小，諸如小於60nM或50nM, 45nM, 40nM, 35nM, 30nM或者甚至更優選地小於20nM,諸如15，12，10，8，7，6，5，4，3，或者甚至小於2nM的阻斷活性或競爭能力。[0019]附圖簡沭
[0020]圖1顯示本發明的納米抗體抑制HGF-依賴性c-Met磷酸化。標準化的比率(如實施例1中標題1.6所述)針對納米抗體或OT5Fab (三角形)的濃度繪圖。標記的納米抗體04E09-9GS-Albll(SEQ ID NO: 7)作為封閉的圓形繪圖(封閉的圓形)。所述納米抗體與?5Fab —起評估，並且在圖中用實線(SEQ ID NO:7)和虛線(?5Fab)繪製。
[0021]圖2 顯示納米抗體形式04E09-9GS-Albll(SEQ ID NO: 7)和 06C12_9GS_Albll (SEQID NO:9)的激動性活性的分析和與OT5mAb和HGF的比較。標準化的比率(如實施例1中標題1.6所述)針對化合物的濃度繪圖，分析其使c-Met磷酸化的能力。陽性對照HGF用菱形繪製，5D5mAb用封閉的圓形繪製，04E09-9GS-Albll用向上的三角形繪製，並且06C12-9GS-Albll用倒三角性繪製。
[0022]圖3顯示本發明的納米抗體04E09-9GS-Albll (SEQ ID NO: 7)抑制BxPC3細胞的HGF-依賴性的增殖。每個孔的阻抗值用來計算『標準化的細胞指數』(NCI)，其指示細胞增殖。在該圖中，在生長3天後記錄兩種樣品的NCI。所述納米抗體作為封閉的圓形繪製。所述納米抗體與OT5Fab(三角形)一起測定並且在圖中用虛線繪製。
[0023]圖4顯示c-Met阻斷納米抗體04E09_9GS_Albll抑制A549細胞的HGF-依賴性的遷移。測定讀數『相對螢光單位』指示A549細胞穿過膜進入到包含HGF的下層區室中。RFU針對所選用的納米抗體的濃度繪圖。所述納米抗體用封閉的圓形繪製。所述納米抗體與?5Fab(三角形)一起評估並且在圖中用實線(SEQ ID NO:7)和虛線(?5Fab)繪製。
[0024]圖5.在HGF-依賴性U87MG膠質母細胞瘤異種移植物模型中，A00790035納米抗體治療(10mg/kg;3x/周IP)對腫瘤生長的作用。替莫唑胺(Temozolomide)用作陽性對照組中的參比化合物。包括賦形劑組作為陰性對照組。箭頭表示不同的A00790035給藥。腫瘤體積表示為平均腫瘤體積土SE(mm3)。曲線上部的數字表示在不同時間點每組剩餘的小鼠數目。(A00790035 或納米抗體 4E09-9GS-Albll;SEQ ID NO:7)
[0025]圖6.在HGF-依賴性KP4胰腺異種移植物模型中，A00790035納米抗體治療(IOmg/kg; 3x/周IP)對腫瘤生長的作用。吉西他濱(Gemcitabine)用作陽性對照組中的參比化合物。包括賦形劑組作為陰性對照組。箭頭表示不同的A00790035給藥。腫瘤體積表示為平均腫瘤體積土 SE (mm3)。(A00790035 或納米抗體 4E09-9GS-Albll;SEQ ID N0:7)
[0026]圖7.在用劑量範圍系列的A00790171溫育後對ANBL-6HGF自分泌人多發性骨髓瘤細胞增殖的完全抑制。(抗-c-Met納米抗體，A00790171;SEQ ID N0:113;cpm avg,每分鐘計數平均數)
[0027]圖8.在用IOnM A00790171溫育後對INA-6HGF旁分泌人多發性骨髓瘤細胞的HGF-誘導的增殖的完全和特異性的抑制。包括小分子c-Met抑制劑PHA-665752作為陽性對照(40ηΜ) ο (抗-c-Met 納米抗體，A00790171; SEQ ID NO: 113; cpm avg,每分鐘計數平均數；P=顯著性值；N.S.，不顯著)。
[0028]圖9.在用I μ M Α00790171溫育後對INA-6HGF旁分泌人多發性骨髓瘤細胞的HGF-誘導的遷移的完全和特異性的抑制。包括小分子c-Met抑制劑ΡΗΑ-665752作為陽性對照(ΙΟΟηΜ)。包括促遷移性細胞因子SDF-1 α作為誘導遷移的陽性對照。(抗-c-Met納米抗體，A00790171;SEQ ID N0:113;NS,不顯著的)。
[0029]圖10.在KP4異種移植物模型中，可溶性c-Met對納米抗體04E09-9GS-Albll (A00790035, SEQ ID NO: 7)的響應。對於每隻動物顯示可溶性c-MET水平，對於兩個治療組顯示平均值土平均數的標準誤差。與賦形劑(PBS，10ml/kg 1.p.)治療的小鼠(5.348ng/ml)相比，在04E09_9GS_Albll納米抗體(NB)治療的小鼠(0.507ng/ml)中，中值可溶性c-MET水平極大減小。
[0030]圖11.在INA-6細胞中用200ng/ml HGF刺激後，A00790171減少c-Met酪氨酸殘S Tyr1349 (A), Tyrl234/35 (B)和 Tyr1003 (C)的磷酸化。包括 PHA-665752 作為陽性對照(200nM)。細胞用HGF處理5分鐘，然後將其裂解並加工作為總裂解物進行蛋白凝膠電泳。
[0031]圖12.在 INA-6 細胞中用 150ng/ml HGF 刺激後，A00790171 減少 Akt (A)和 MAPK(B)的磷酸化。細胞用HGF處理7分鐘，然後將其裂解並加工作為總裂解物進行蛋白凝膠電泳。
[0032]圖13.A00790171 (IOOnM)阻斷HGF誘導的INA-6細胞與纖連蛋白的粘附。在用BCECF-AM (一種螢光染料)預先溫育後，5X104個細胞用或不用細胞因子HGF (150ng/ml)或SDF-1a (75ng/ml)溫育I小時。線條表示來自代表三次獨立的實驗的一次實驗的四份樣品的平均數(+SD)。
[0033]圖14.A00790171 消除 HGF (100ng/ml)對 hMSCs 的 BMP-2-誘導的 ALP-活性和礦化的抑制作用。hMSCs的ALP活性(A)。通過茜素紅-S (ARS)染色定量(B)或顯現(C)治療21天(5nM A00790171)後的MSCs的礦化。
[0034]發明描述
[0035]定義
[0036]a)除非另外指明或限定，所用的所有術語具有它們在本領域內的通用意思，其對於熟練的技術人員應該是清楚的。例如，參考W008/020079第46頁段落a)中提及的標準手冊。
[0037]b)除非另外指明，術語「免疫球蛋白單可變結構域」或"ISVD"用作一般術語，包括但不限於抗原-結合結構域或片段，分別諸如Vffl結構域或Vh或\結構域。術語抗原結合分子或抗原結合蛋白可互換使用，並且還包括術語納米抗體。所述免疫球蛋白單可變結構域可以是輕鏈可變結構域序列(例如，\-序列)，或重鏈可變結構域序列(例如，Vh-序列)；更具體地，其可以是來源於常規四鏈抗體的重鏈可變結構域序列或來源於重鏈抗體的重鏈可變結構域序列。因此，所述免疫球蛋白單可變結構域可以是結構域抗體，或適於用作結構域抗體的免疫球蛋白序列，單結構域抗體，或適於用作單結構域抗體的免疫球蛋白序列，"dAbs」，或適於用作dAbs的免疫球蛋白序列，或納米抗體，包括但不限於Vhh序列。本發明包括不同來源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驢、人和駱駝科動物(camelid)免疫球蛋白序列。所述免疫球蛋白單可變結構域包括完全人、人源化的、另外序列優化或嵌合的免疫球蛋白序列。可以考慮所述免疫球蛋白單可變結構域和免疫球蛋白單可變結構域的結構——然而，不限於此——包括四個構架區或「FR』 s」，其在本領域和本文中分別稱為「構架區I」或「FR1」 ; 「構架區2」或「FR2」 ; 「構架區3」或「FR3」 ;和「構架區4」或「FR4」;所述構架區由三個互補決定區或「⑶R』 s」中斷，其在本領域中分別稱為「互補決定區I」或「⑶R1」 ； 「互補決定區2」或「⑶R2」 ； 「互補決定區3」或「⑶R3」。應該注意到術語納米抗體(Nanobody或Nanobodies)是埃博靈克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)
的註冊商標，並且因此還可以分別稱為納米抗體? (Nanobody?或Nanobodies?)。
[0038]c)除非另外指明，術語「免疫球蛋白序列」，「序列」，「核苷酸序列」和「核酸」如W008/020079第46頁段落b)中所述。
[0039]d)除非另外指明，所有沒有具體詳細描述的方法、步驟、技術和操作可以以本身已知的方式進行 並且已經進行，這對於熟練的技術人員是清楚的。例如，仍舊參考標準手冊，參考本發明所提及的公知【背景技術】以及其中所引用的其他參考文獻；以及例如參考下述綜述:Presta, Adv.Drug Deliv.Rev.(高級藥物遞送綜述)2006，58 (5-6): 640-56; Levin和 Weiss, Mol.Biosyst.2006, 2 (I):49-57; Irving 等,J.Tmmunol.Methods,(免疫學方法雜誌)2001，248 (1-2)，31-45; Schmitz 等，Placenta, 2000，21 增刊.A, S106-12, Gonzales等，Tumour Biol.(腫瘤生物學)，2005，26 (I)，31-43，其描述了用於蛋白質改造的技術，諸如親和力成熟，和用於提高蛋白如免疫球蛋白的特異性和其他需要的特性的其他技術。
[0040]e)胺基酸殘基按照標準的三字母或一字母的胺基酸密碼顯示。參考埃博靈克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的題目為 「Immunoglobulin single variable domainsdirected against IL—6R and polypeptides comprising the same for the treatmentof diseases and disorders associated with Il-6mediated signalling(針對 IL-6R 的免疫球蛋白單可變結構域和包含其的多肽用於治療與11-6介導的信號傳導相關的疾病和病症)」的國際申請W008/020079第48頁表A-2。
[0041]f)出於比較兩種或更多種核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間的「序列同一性」百分數可以如W008/020079 (通過引用結合在本文中)第49頁段落
e)所述進行計算或確定，諸如通過用[第一核苷酸序列中與第二核苷酸序列中相應位置的核苷酸相同的核苷酸數目]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸總數]並且乘以[100% ]而計算，其中，與第一核苷酸序列相比，在第二核苷酸序列中核苷酸的每一缺失、插入、取代或添加都視作在單一核苷酸(位置)的差異；或者使用適當的計算機算法或技術，同樣如W008/020079 (通過引用結合在本文中)第49頁段落e)所述。[0042]g)出於比較兩種或更多種免疫球蛋白單可變結構域或其他胺基酸序列(諸如例如，本發明的多肽等)的目的，第一胺基酸序列與第二胺基酸序列之間的「序列同一性」百分數(在本文也稱為「胺基酸同一性」)可以如W008/020079 (通過引用結合在本文中)第49和50頁段落f)所述進行計算或確定，諸如通過用[第一胺基酸序列中與第二胺基酸序列中相應位置的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基數目]除以[第一胺基酸序列中的胺基酸殘基總數]並且乘以[100% ]而計算，其中，與第一胺基酸序列相比，第二胺基酸序列中胺基酸殘基的每一個缺失、插入、取代或添加都視作在單一胺基酸殘基(位置)上的差異，即，視作本發明所定義的「胺基酸差異」;或者使用適當的計算機算法或技術，同樣如W008/020079(通過引用結合在本文中)第49和50頁段落f)所述。
[0043]此外，在確定兩種免疫球蛋白單可變結構域之間的序列同一性程度時，技術人員可以考慮所謂的「保守」胺基酸取代，如W008/020079第50頁所述。
[0044]用於本文所述的多肽的任意胺基酸取代也可以是基於Schulz等，Principlesof Protein Structure (蛋白質結構原理)，Springer-Verlag, 1978開發的不同物種的同源蛋白之間的胺基酸變異頻率分析，基於Chou和Fasman, Biochemistry (生物化學)13:211, 1974和Adv.Enzymol.(酶學進展)，47:45-149，1978開發的結構形成潛力分析，並且基於 Eisenberg 等,Proc.Natl.Acad Sc1.USA (美國國家科學院學報)81:140-144，1984;Kyte J Molec.Biol.(分子生物學雜誌)157:105-132，1981，和 Goldman 等，Ann.Rev.Biophys.Chem.( 生物物理和化學年度綜述)15:321-353，1986開發的蛋白質疏水性模式的分析，所有這些通過引用完全結合在本文中。本文的說明書和上文引用的一般【背景技術】中給出了關於納米抗體的一級、二級和三級結構的信息。此外，為了這一目的，例如，Desmyter 等，Nature Structural Biology(自然結構生物學)，卷 3，9，803 (1996) ; Spinelli等，Natural Structural Biology (自然結構生物學)(1996) ; 3，752-757;和 Decanniere等，Structure (結構)，卷7，4，361 (1999)給出了來自美洲馬它的Vhh結構域的晶體結構。關於在常規Vh結構域中形成VH/VL界面的一些胺基酸殘基和潛在的駱駝源化取代的進一步的信息可見於上文引用的現有技術。
[0045]h)如果在它們的全長有100%的序列同一'丨生(如本文所定義),那麼認為免疫球蛋白單可變結構域和核酸序列「完全相同」。
[0046]i)當比較兩個免疫球蛋白單可變結構域時，術語「胺基酸差異」是指與第二序列相t匕，在第一序列位置上的單個胺基酸殘基的插入、缺失或取代；應該理解兩個免疫球蛋白單可變結構域可以包含I個、2個或更多個這樣的胺基酸差異。
[0047]j)當認為核苷酸序列或胺基酸序列分別「包括」另一個核苷酸序列或胺基酸序列，或「基本由」另一個核苷酸序列或胺基酸序列「組成」時，這具有在W008/020079第51-52頁段落i)中給出的意思。
[0048]k)術語「以基本上分離的形式存在」具有W008/020079第52和53頁段落j)中關
於該術語給出的意思。
[0049]I)術語「結構域」和「結合結構域」具有W008/020079第53頁段落k)中關於該術
語給出的意思。
[0050]m)術語「抗原決定簇」和「表位」，在本文中也可以互換使用，具有W008/020079第53頁段落I)中關於該術語給出的意思。[0051]η)如W008/020079第53頁段落m)中進一步所述，對於特定的抗原決定簇、表位、抗原或蛋白(或針對其至少一部分、片段或表位)能夠(特異性)結合、具有親和力和/或具有特異性的胺基酸序列(諸如抗體、本發明的多肽或一般是抗原結合蛋白或多肽或其片段)認為是「針對(against)」或者「針對(directed against)」所述抗原決定簇、表位、抗原或蛋白。
[0052]ο)術語「特異性」具有W008/020079第53-56頁段落η)中關於該術語給出的意思；並且如其中提及的，是指特定的抗原-結合分子或抗原-結合蛋白(諸如本發明的多肽)分子可以結合的許多不同類型的抗原或抗原決定簇的數目。一種抗原-結合蛋白的特異性可以依據親和力和/或抗體親抗原性(avidity)而確定，如在W008/020079第53-56頁中所述(通過引用結合在本文中)，其還描述了用於測量抗原結合分子(諸如本發明的多肽)與相關抗原之間的結合的一些優選的技術。典型地，抗原-結合蛋白(諸如本發明的免疫球蛋白單可變結構域和/或多肽)將以10_5-10_12摩爾/升或更小、並且優選地10_7-10_12摩爾/升或更小並且更優選地10_8-10_12摩爾/升的解離常數(Kd) (BP,以IO5-1O12升/摩爾或以上、並且優選地IO7-1O12升/摩爾或以上、且更優選地IO8-1O12升/摩爾的締合常數(Ka))而結合它們的抗原。任何大於10_4摩爾/升的Kd值(或任何小於IO4升/摩爾的Ka值)通常認為指示非特異性結合。優選地，本發明的單價免疫球蛋白單可變結構域將以小於500nM、優選地小於200nM、更優選地小於IOnM諸如小於500pM的親和力與理想的抗原結合。抗原-結合蛋白與抗原或抗原決定簇的特異性結合可以以本身已知的任何適當的方法確定，其包括，例如，斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或競爭結合測定，諸如放射性免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)和夾心式(sandwich)競爭測定，和本領域本身已知的其不同的變型；以及本文提及的其他技術。技術人員應該清楚，並且如W008/020079第53-56頁所述，解離常數可以是實際的或表觀解離常數。確定解離常數的方法對於熟練的技術人員應該是清楚的，並且例如，包括W008/020079第53-56頁提及的技術。
[0053]P)本發明的胺基酸序列、化合物或多肽的半衰期通常可以如W008/020079第57頁段落O)所述那樣定義，並且如其中提及的，是指所述胺基酸序列、化合物或多肽的血清濃度在體內減少50%所花費的時間，例如，由於所述序列或化合物的降解和/或通過天然機制對所述序列或化合物的清除或螯合(sequestration)。本發明的胺基酸序列、化合物或多肽的體內半衰期可以以本身已知的任何方式確定，諸如通過藥物動力學分析。適當的技術對於本領域熟練的技術人員應該是清楚的，並且，例如，可以通常如W008/020079第57頁段落ο)中所述。還如在W008/020079第57頁段落ο)中所提及的，半衰期可以用參數如tl/2-a，tl/2_i3和曲線下面積(AUC)表示。例如，參考下述實驗部分，以及標準手冊，諸如Kenneth, A等:藥物的化學穩定性:藥劑師手冊(Chemical Stability ofPharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists)和 Peters 等，藥物動力學分子:實踐方法(Pharmacokinete analysis:A Practical Approach) (1996)。還參考〃藥物動力學(Pharmacokinetics) "，M Gibaldi&D Perron, Marcel Dekker 出版，第 2 修訂版(1982)。術語「半衰期增加」或「增加的半衰期」也如W008/020079第57頁段落ο)中所定義，並且特別是指11/2-β的增加，具有或不具有11/2-α和/或AUC或二者的增加。
[0054]q)關於靶標或抗原，術語在所述靶標或抗原上的「相互作用位點」意指在所述靶標或抗原上的位點、表位、抗原決定簇、部分、結構域或胺基酸殘基序列，其是所述靶標或抗原的用於結合配體、受體或其他結合配偶體的位點、催化位點、切割位點、別構相互作用的位點、參與多聚體化(如同源多聚體化或異源多聚體化)的位點；或是在所述靶標或抗原上的參與所述靶標或抗原的生物學作用或機制的任何其他位點、表位、抗原決定簇、部分、結構域或胺基酸殘基序列。更一般地，「相互作用位點」可以是在所述靶標或抗原上的本發明的胺基酸序列或多肽可以與之結合的任何位點、表位、抗原決定簇、部分、結構域或胺基酸殘基序列，以致調節(如本文定義)所述靶標或抗原(和/或其中涉及所述靶標或抗原的任何途徑、相互作用、信號傳導、生物學機制或生物學作用)。
[0055]r)與第二靶標或抗原相比較，當與第一抗原以是所述胺基酸序列或多肽與第二靶標或多肽結合的親和力的至少10倍、如至少100倍、且優選至少1000倍、且多至10000倍或更多的親和力/抗體親抗原性(如上述，且適當表示為Kd值、Ka值、kf速率和/或km速率)結合時，認為這樣的免疫球蛋白單可變結構域或多肽是對第一靶標或抗原「特異性的」。例如，所述第一抗原可以以比所述胺基酸序列或多肽與所述第二靶標或多肽結合的Kd小至少10倍、如小至少100倍、且優選小至少1000倍、如小10000倍或者甚至更小的Kd值結合所述靶標或抗原。優選地，當免疫球蛋白單可變結構域或多肽與第二靶標或抗原相比較對第一靶標或抗原是「特異性的」時，它針對(如本文定義)所述第一靶標或抗原，但是不針對所述第二靶標或抗原。
[0056]s)術語「交叉阻斷(cross-block)」，「被交叉阻斷的(cross-blocked)」和「交叉阻斷(cross-blocking)」在本文可以互換使用，用來意指免疫球蛋白單可變結構域或多肽分別幹擾天然配體HGF與c-Met的結合或幹擾天然配體EGF與EGFR的結合、或幹擾天然配體 VEGF 與 VEGF 受體(如 VEGFR-1R(Flt-1)，VEGFR-2 (KDR/Flk-Ι)和 / 或 VEGFR-3 (Flt-4))的結合的能力。本發明的免疫球蛋白單可變結構域或多肽能夠幹擾另一種化合物諸如天然配體對其靶標(例如，c-Met，VEGF或EGFR)的結合的程度，且因此其能否被認為是本發明所述的交叉阻斷的，可以使用競爭結合測定法確定。一種特別適當的定量交叉阻斷測定法使用基於FACS或基於ELISA的方法或α篩選來測量在本發明的標記的(例如，His標記的或生物素醯化的)免疫球蛋白單可變結構域或多肽與另一種結合劑關於它們與靶標的結合的競爭。實驗部分一般地描述了適當的用於確定結合分子是否交叉阻斷或能夠交叉阻斷本發明的免疫球蛋白單可變結構域或多肽的基於FACS、基於ELISA或基於α篩選-置換的測定。應該理解，所述測定可以與本文所述的免疫球蛋白單可變結構域或其他結合劑中的任一種一起使用。因此，通常，例如，本發明所述的交叉阻斷的胺基酸序列或其他結合劑是一種將在上述交叉阻斷測定法中與靶標結合的，以致在該測定法中且在存在本發明的第二胺基酸序列或其他結合試劑時，所記錄的本發明的免疫球蛋白單可變結構域或多肽的置換是最大理論置換(例如，由需要被交叉阻斷的無活性的(cold)(例如，未標記的)免疫球蛋白單可變結構域或多肽的置換)的60%_100%(例如，在基於ELISA/ α篩選的競爭性測定中)或80%-100%(例如，在基於FACS的競爭性測定中)，所述最大理論置換由以0.01mM以下的量存在的潛在交叉阻斷劑檢測，所述潛在交叉阻斷劑(交叉阻斷劑可以是另一種常規的單克隆抗體，諸如IgG,典型的單價抗體片段(Fab, scFv)和改造的變體(例如，二抗體、三抗體、小抗體(minibodies)、VHHs> dAbs、VHs> VLs))。
[0057]t)如果所述VHHl型免疫球蛋白單可變結構域或VHH型I序列與VHHl共有序列 (SEQ ID NO:99:[0058]QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA)
[0059]具有85%的同一性(使用VHHl共有序列作為查詢序列，使用具有標準設置的blastp算法，即，blosom62評分矩陣(blosom62scoring matrix))並且任選地在位置50具有半胱氨酸，即C50 (使用Kabat編號方式)，則認為胺基酸序列，諸如例如，本發明的免疫球蛋白單可變結構域或多肽，是「VHHl型免疫球蛋白單可變結構域」或「VHH型I序列」。
[0060]u)如果其對這些不同的抗原或抗原決定簇是特異性的(如本文定義)，則認為胺基酸序列，諸如例如，本發明的免疫球蛋白單可變結構域或多肽，針對兩種不同的抗原或抗原決定簇(諸如來自兩種不同的哺乳動物物種的血清白蛋白，諸如人血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白)是「交叉反應性的」。
[0061]V)如W008/020079 (通過引用結合在本文中)第58和59頁段落q)進一步所述，免疫球蛋白單可變結構域的胺基酸殘基按照Kabat等，(「Sequence of proteins ofimmunological interest (免疫感興趣的蛋白的序列)」，US Public Health Services, NIHBethesda, MD, Publication N0.91)提供的用於Vh結構域的一般編號方式進行編號，這在 Riechmann 和 Muyldermans, J.1mmunol.Methods (免疫方法雜誌)2000 年 6 月 23日；240 (1-2):185-195的論文中用於來自駱駝科動物的Vhh結構域(例如，參見該出版物的圖2)，並且因此，免疫球蛋白單可變結構域的FRl包含位置1-30的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的⑶Rl包含位置31-35的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的FR2包含位置36-49的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的⑶R2包含位置50-65的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的FR3包含位置66-94的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的⑶R3包含位置95-102的胺基酸殘基，免疫球蛋白單可變結構域的FR4包含位置103-113的胺基酸殘基。
[0062]w)給出附圖、序列表和實驗部分/實施例只是進一步舉例說明本發明，並且不應該被以任何方式解釋為或者認為限制本發明和/或附上的權利要求的範圍，除非本文中另外明確指明。
[0063]1.本發明的多肽及其應用
[0064]1.1杭-c-Met結構單元
[0065]本發明的多肽通常可以用於調節、特別是抑制和/或防止c-Met、特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)與HGF且特別是人HGF(瑞士蛋白質資料庫(Swiss Protdatabase):P14210)的結合，並且因此調節、且特別是抑制或防止由c_Met、特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)和/或HGF、特別是人HGF(瑞士蛋白質資料庫:P14210)介導的信號傳導，調節其中涉及c-Met、特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)和/或HGF、特別是人HGF的生物途徑，和/或調節與所述信號傳導或這些途徑相關的生物學機制、反應和作用。
[0066]因此，本發明的多肽和組合物可以用於診斷、預防和治療本發明的疾病和病症(本文中也稱為「本發明的疾病和病症」)，並且包括,但不限於，癌症(cancer)，例如，癌(carcinomas),神經膠質瘤(gliomas)，間皮瘤(mesotheliomas)，黑素瘤(melanomas)，淋巴瘤(lymphomas)，白血病(Ieukemias )，腺癌(adenocarcinomas):乳腺癌(breastcancer),卵巢癌(ovarian cancer),宮頸癌(cervical cancer),膠質母細胞瘤(glioblastoma),多發性骨髓瘤(multiple myeloma)(包括意義未明單克隆Y球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance),無症狀的和有症狀的黑素瘤(asymptomatic and symptomatic myeloma)),前列腺癌(prostate cancer),和伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma),頭頸癌(head and neck cancer),結腸癌(coloncancer),結直腸癌(colorectal cancer),非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer),小細胞肺癌(small cell lung cancer),食道癌(cancer of the esophagus),胃癌(stomach cancer),膜腺癌(pancreatic cancer),月幹膽管癌(hepatobiliary cancer),膽囊癌(cancer of the gallbladder),小腸癌(cancer of the small intestine),直腸癌(rectal cancer),腎癌(kidney cancer),膀胱癌(bladder cancer),前列腺癌(prostate cancer),陰莖癌(penile cancer),尿道癌(urethral cancer),睪丸癌(testicular cancer),陰道癌(vaginal cancer),子宮癌(uterine cancer),甲狀腺癌(thyroid cancer),甲狀旁腺癌(parathyroid cancer),腎上腺癌(adrenal cancer),膜腺內分泌癌(pancreatic endocrine cancer),類癌(carcinoid cancer),骨癌(bonecancer),皮膚癌(skin cancer),視網膜母細胞瘤(retinoblastomas)，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin，s lymphoma),非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma),卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma),多中心卡斯爾曼病(multicentric Castleman's disease)或愛滋病相關的原發性滲出性淋巴瘤(AIDS-associated primary effusion lymphoma),神經外胚瘤(neuroectodermal tumors),橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)(例如，關於另外的癌症參見 Cancer, Principles and practice (癌症、原理與實踐)(DeVita, V.T.等編，1997));以及上述任一種癌症的任意轉移病，以及非癌症適應證，如鼻息肉病；以及本文所述的其他病症和疾病。具體地，本發明的多肽和組合物可以用於診斷、預防和治療涉及c-Met介導的轉移、趨化性、細胞粘著、經內皮遷移、細胞增殖和/或存活的疾病，特別是非小細胞肺癌和多發性骨髓瘤。本發明的多肽和組合物還可以用於診斷、預防和/或治療骨轉移癌中的骨骼疾病，包括多發性骨髓瘤。本發明的多肽和組合物還可以用於診斷、預防和/或治療骨轉移癌中的溶骨性損傷，包括多發性骨髓瘤。
[0067]通常，所述「本發明的疾病和病症」可以定義為這樣的疾病和病症，所述疾病和病症可以通過給有此需要( 即，患有所述疾病或病症或具有其至少一種症狀和/或有危險引起或發展所述疾病或病症)的受試者適當地施用本發明的多肽或組合物(並且特別是藥物活性量的)和/或已知的針對c-Met、特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)或者涉及c_Met、特別是人c-Met(SEQ ID NO:1)的生物學途徑或機制有活性的活性成分(並且特別是藥物活性量的)而分別得到診斷、預防和/或治療。
[0068]具體地，本發明的多肽可以用於診斷、預防和治療本發明的疾病和病症，所述疾病和病症特徵在於由c-Met、特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)或涉及c_Met、特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的途徑(例如，HGF/c-Met軸)介導的過量的和/或不需要的HGF信號傳導，特別是人HGF信號傳導。基於本文公開的內容，技術人員也應該清楚本發明的所述疾病和病症的實例。
[0069]因此，不希望限於此，例如，本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽可以用於診斷、預防和/或治療目前用能夠調節c-Met且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)-介導的信號傳導的活性成分進行診斷、預防或治療的所有疾病和病症，諸如疾病和上述現有技術中提及的那些。還考慮到本發明的多肽可以用於診斷、預防和/或治療已經提議或在將來將要提議或研發的目前正開發使用所述活性成分的治療的所有疾病和病症。另外，由於其如本文進一步所述的有利特性，考慮到本發明的多肽可以用於診斷、預防和治療除對其正使用或將要提議或研發這些已知的活性成分的那些疾病和病症之外的其他疾病和病症；和/或本發明的多肽可以提供用於治療本文所述的疾病和病症的新方法和方案。
[0070]因此，本發明涉及本發明的免疫球蛋白單可變結構域和/或多肽，其用於治療。
[0071]通過本文的進一步公開的內容，技術人員應該清楚本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽的其他應用和用途。
[0072]通常，本發明的一個目的是提供可以用於診斷、預防和/或治療本發明的疾病和/或病症的藥物活性試劑，以及包含其的組合物；提供用於診斷、預防和/或治療所述疾病和病症的方法，所述方法包括施用和/或使用所述試劑和組合物。
[0073]特別地，本發明的一個目的是提供所述藥物活性試劑、組合物和/或方法，與目前所用的和/或本領域中已知的試劑、組合物和/或方法相比，所述藥物活性試劑、組合物和/或方法具有某些優點。這些優勢從以下進一步描述中將變得清楚。
[0074]更特別地，本發明的目的是提供可以用作藥物活性試劑的治療性蛋白，以及包含其的組合物，其用於診斷、預防和/或治療本發明的疾病和/或病症以及本文提及的其他疾病和病症；並且提供用於診斷、預防和/或治療所述疾病和病症的方法，所述方法包括施用和/或使用所述治療性蛋白和組合物。
[0075]因此，本發明的一個特定目的是提供針對c-Met、特別是針對來自溫血動物的c-Met、更特別是針對來自哺乳動物(諸如例如，小鼠)、且尤其是針對人c-Met (SEQ IDNO:1)的免疫球蛋白單可變結構域；並且提供包含至少一種所述免疫球蛋白單可變結構域或基本上由其組成的蛋白和多肽。
[0076]特別地，本發明的一個特定目的是提供所述免疫球蛋白單可變結構域和所述蛋白和/或多肽，其適於在溫血動物、特別是哺乳動物、更特別是人中的預防、治療和/或診斷應用。
[0077]更特別地，本發明的一個特定目的是提供所述免疫球蛋白單可變結構域和所述蛋白和/或多肽，其可以用於預防、治療、減輕和/或診斷溫血動物、特別是哺乳動物、更特別是人中的與c-Met相關和/或由c-Met介導的一種或多種疾病、病症或病況(諸如本文提及的疾病、病症和病況)。
[0078]本發明還有一個特定的目的是提供所述免疫球蛋白單可變結構域和所述蛋白和/或多肽，其可以用於製備藥物組合物或獸醫用組合物，所述組合物用於預防和/或治療溫血動物、特別是哺乳動物、更特別是人中的一種或多種與c-Met相關的和/或由c-Met介導的疾病、病症或病況(諸如本文提及的疾病、病症和病況)。
[0079]通常，在本發明中，這些目的通過使用本文所述的免疫球蛋白單可變結構域、蛋白、多肽和組合物而實現。
[0080]通常，本發明提供針對(如本文定義)和/或能夠特異性結合(如本文定義)c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結構域；以及包含至少一種此類胺基酸序列的化合物和構建體，特別是 蛋白和多肽。
[0081]更特別地，本發明提供能夠以如本文定義的親和力(適當地測量的和/或表示為Kd-值(實際的或表觀的)、Ka-值(實際的或表觀的)、kon-速率和/或Iitjff-速率，或備選地作為IC5tl值，如本文進一步所述)結合C-Met、且特別是人C-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結構域和多肽；以及包含至少一種此類胺基酸序列的化合物和構建體，特別是蛋白和多妝。
[0082]特別地，本發明的免疫球蛋白單可變結構域和/或多肽是這樣的，以致:
[0083]-其在α篩選測定(例如，如在實驗部分所述(參見實施例2.3.1))中以1.2ηΜ以下、更優選地500ρΜ以下、甚至更優選地200ρΜ以下、最優選地150ρΜ以下的IC50結合人c-Met (SEQ ID NO:1)，並且其中所述多肽僅包含一個人c-Met結合免疫球蛋白單可變結構域單位，並且其中完全的置換意指約60%-80%且更多、優選95%以上的平均HGF置換(例如，當按照實施例2.3.1中的配體置換測定測量時)；
[0084]和/或是這樣的，以致:
[0085]-其在測定(例如，如在實驗部分(實施例2.3)中所述)中以2.5nM以下的平均IC50值、更優選地2nM以下的平均IC50值、甚至更優選地1.5nM以下的平均IC50值將人HGF完全從人c-Met (SEQ ID NO:1)置換下來，並且其中所述多肽僅包含一個人c-Met結合免疫球蛋白單可變結構域單位，並且其中完全的置換意指約60%-80%且更多、優選95%以上的平均HGF置換(例如，當按照實施例2.3.2中的配體置換測定測量時)；
[0086]通過本文的進一步描述和實施例，本發明的針對c-Met、且特別是針對人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結構域或多肽的結合、置換、遷移或其他體內和/或體外功效的一些優選的技術價值將變得清楚。 [0087]對於與c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的結合，本發明的胺基酸序列通常將在其胺基酸序列內包含一個或多個胺基酸殘基或一個或多個胺基酸殘基片段(即，每個「片段」包含兩個以上彼此相鄰或彼此緊密接近的胺基酸殘基，即，在胺基酸序列的一級或三級結構中),通過其本發明的胺基酸序列能夠結合c-Met、且特別是人c-Met (SEQID NO:1)，因此，所述胺基酸殘基或胺基酸殘基的片段形成用於結合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的「位點」(本文中還稱為「抗原結合位點」)。
[0088]本發明提供的免疫球蛋白單可變結構域優選是以基本上分離的形式(如本文定義)存在，或形成本發明的蛋白或多肽的一部分(如本文定義)，其可以包含一個或多個本發明的免疫球蛋白單可變結構域或基本上由其組成，並且其可以任選地進一步包含一個或多個其他免疫球蛋白單可變結構域(所有任選地通過一個或多個適當的接頭連接)。例如，並且不限於，本發明的優選方面分別提供基本上由下述組成的多肽:通過肽接頭(如本文定義)連接的一個針對人c-Met的免疫球蛋白單可變結構域和針對人血清白蛋白的免疫球蛋白單可變結構域，以提供本發明的雙特異性多肽，和/或也通過肽接頭(如本文定義)連接的針對人EGFR的免疫球蛋白單可變結構域，以提供本發明的另外的雙特異性或三特異性的多肽，均如本文所述。所述蛋白或多肽也可以是基本上分離的形式(如本文定義)。
[0089]因此，本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽優選基本上由不通過二硫鍵與任意其他胺基酸序列或鏈連接的單個胺基酸鏈組成(但是其可以或不可以包含一個或多個分子內二硫鍵。例如，已知本發明的試劑——如本文所述——有時可能包含在⑶R3與⑶Rl或FR2之間的二硫鍵)。然而，應該注意的到，本發明的一個或多個免疫球蛋白單可變結構域可以彼此連接和/或與其他免疫球蛋白單可變結構域連接(例如，通過二硫鍵)，以提供也可以用於本發明的肽構建體(例如，Fab』片段，F(ab』)2片段，ScFv構建體，「二抗體」和其他多特異性構建體)。例如，參考Holliger和Hudson, Nat Biotechnol.(自然生物技術)2005;23:1126-36(通過引用結合)的綜述。
[0090]通常，當意欲將本發明的胺基酸序列(或包含其的化合物、構建體或多肽)用於施用給受試者時(例如，用於本文所述的治療和/或診斷目的)，優選在所述受試者中天然不存在的胺基酸序列；或者，當其確實在所述受試者中天然存在時，其是基本上分離的形式(如本文定義)。
[0091]技術人員還應該清楚，對於製藥用途，本發明的免疫球蛋白單可變結構域(以及包含其的化合物、構建體和多肽)優選是針對人c-Met，特別是針對人c-Met (SEQ ID NO:1);而對於獸醫用目的，本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽優選是針對來自待治療的物種的c-Met，或者至少與來自待治療的物種的c-Met交叉反應。
[0092]此外，本發明的胺基酸序列可以任選地，並且除了至少一個用於針對c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)結合的結合位點之外，包含一個或多個用於針對其他抗原、蛋白或靶標結合的其他結合位點。
[0093]取決於所涉及的具體的疾病或病症，本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽以及包含其的組合物的功效可以使用任何適當的體外測定、基於細胞的測定、體內測定和/或本身已知的動物模型或它們的任意組合來檢測。適當的測定和動物模型應該是技術人員所清楚的，並且，例如，包括配體置換測定(Burgess等，Cancer Res (癌症研究)200666:1721-9)，二聚體化測定(W02009/007427A2, Goetsch, 2009)，信號傳導測定(Burgess等，Mol Cancer Ther (分子癌症治療法)9:400-9),增殖/存活測定(Pacchiana等，J Biol Chem (生物化學雜誌)2010年9月，M110.134031)，細胞粘著測定(Holt 等,Haematologica (血液病學)200590:479-88)和遷移測定(Kong-Beltran等，Cancer Cell (癌細胞)6:75_84),內皮細胞出芽測定(Wang等，J Immunol.(免疫學雜誌)2009; 183:3204-11)，成骨細胞分化測定，ALP測定(Standal等，Blood2007四月一日；109(7):3024-30)，和體內異種移植物模型(Jin等，Cancer Res.(癌症研究)200868:4360-8)，以及在下述實驗部分和在本文引用的現有技術中所用的測定和動物模型。
[0094]此外，按照本發明，針對來自第一溫血動物物種的C-Met的免疫球蛋白單可變結構域和多肽可以或不可以表現出與來自一種或多個其他溫血動物物種的c-Met的交叉反應性。例如，針對人c-Met、且特別是針對人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結構域和多肽可以或不可以表現出與來自一種或多種其他靈長類動物物種(諸如，不限於，來自稱猴屬(Macaca)的猴子(諸如,且特別是食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恆河猴(恆河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)))的c_Met的交叉反應性，和/或與來自通常用在疾病動物模型(例如，小鼠、大鼠、兔、豬或狗)中、且特別是用在與c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)相關的疾病和病症的動物模型中的一種或多種動物物種(諸如，本文提及的物種和動物模型)的c-Met的交叉反應性。在這一方面，技術人員應該清楚，從藥物開發觀點來看，所述交叉反應性，當存在時，可能具有優點，原因在於這允許在所述疾病模型中檢測針對人c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結構域和多肽。
[0095]更一般地，由於允許所述胺基酸序列或多肽跨多個物種使用，所以，本發明與來自多種哺乳動物物種的c-Met交叉反應的免疫球蛋白單可變結構域和多肽通常有利地用在獸醫應用中。因此，本發明的範圍還包括針對來自一個動物物種的c-Met的免疫球蛋白單可變結構域和多肽(諸如針對人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結構域和多肽)可以用於治療另一個動物物種，只要所述免疫球蛋白單可變結構域和/或多肽的應用在待治療的物種中提供需要的作用。
[0096]本發明在其最廣泛的意義上不特別局限於或限制為本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽所針對的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的特定的抗原決定簇、表位、部分、結構域、亞基或構象(confirmation)。例如,所述免疫球蛋白單可變結構域和多肽可以或不可以針對HGF/c-Met相互作用位點、c_Met的細胞內在化位點、c_Met的脫落位點(shedding site)和/或c-Met/c-Met同源二聚體化位點，並且如本文進一步所定義。
[0097]此外，具有針對c-Met和RON、且特別是人c_Met (SEQ ID NO:1)和人RON ((Ming-Hai Wang 等，Acta Pharmacologica Sinica (2010) 31:1181 - 1188)的雙重特異性的免疫球蛋白單可變結構域在本發明的範圍內。
[0098]如本文進一步所述，本發明的多肽可以包含(儘管不優選)兩個以上本發明的針對c-Met且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結構域。通常，與本發明的單個胺基酸序列相比，所述多肽將以增加的抗體親抗原性結合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ IDNO:1)。例如，所述多肽可以包含兩個本發明的針對c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的相同的抗原決定簇、表位、部分、結構域、亞基或構象(當適用時)(其可以或不可以是相互作用位點)的免疫球蛋白單可變結構域；或包含至少一個本發明的針對c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的第一抗原決定簇、表位、部分、結構域、亞基或構象(當適用時)(其可以或不可以是相互作用位點)的「第一」胺基酸序列；和至少一個本發明的針對與第一不同的第二抗原決定簇、表位、部分、結構域、亞基或構象(當適用時)(並且其可以或不可以是相互作用位點)的「第二」胺基酸序列。優選地，在所述本發明的「二互補位」多肽中，至少一個本發明的胺基酸序列是針對相互作用位點(如本文定義)，儘管本發明在其最廣泛意義上不限於此。例如，本發明的多肽可以被格式化(formatted)，例如，以二互補位方式格式化，以組合如實驗部分所表徵的針對不同表位的單價結構單元。
[0099]此外，當靶標是結合對(例如，受體-配體結合對)的一部分時,所述免疫球蛋白單可變結構域和多肽可以是這樣的，以致其與關聯結合配偶體(例如，HGF)競爭與c-Met的結合，和/或是這樣的，以致其(完全或部分地)中和所述結合配偶體與所述靶標的結合。
[0100]還預測到本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽通常將與C-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的所有天然存在的或合成的類似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段結合；或至少與c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的包含與本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽結合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的抗原決定簇或表位基本上相同的一個或多個抗原決定簇或表位的那些類似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段結合。
[0101]同樣，在這樣的情形中，本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽可以以與本發明的免疫球蛋白單可變結構域與(野生型)C-Met結合的親和力和特異性相同的或不同的(即，高於或低於其)的親和力和/或特異性結合所述類似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段。[0102]由於c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)以單體形式和一個或多個多聚體形式存在，例如，以同源二聚體形式存在，因此，下述也在本發明的範圍內:本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽i)僅結合單體形式的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID N0:l),ii)僅結合多聚體/ 二聚體(同源和/或異源二聚體)形式的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ IDN0:1)，或iii)結合單體和多聚體形式二者。在本發明的優選方面中，本發明的多肽防止形成同源二聚體化的人c-Met複合物。在本發明的另一個優選的方面中，本發明的多肽不誘導(甚至在較高的濃度,如IOnM以下，50nM以下，IOOnM以下或500nM以下)同源二聚體化人c-Met複合物的形成。同樣地，在這樣的情形中，本發明的多肽可以以與本發明的免疫球蛋白單可變結構域結合多聚體形式的親和力和特異性相同或不同(即，高於或低於其)的親和力和/或特異性結合單體形式。[0103]此外，當c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)能夠與其他蛋白或多肽締合形成蛋白複合物時(例如，與HGF締合，而且還與其他受體如EGFR，HER3，叢蛋白，整聯蛋白，CD44，RON締合)，下述在本發明的範圍內:本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽結合處於其非締合狀態的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)(並且例如，防止配體結合和/或防止信號傳導)，結合處於其締合狀態的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1),或者結合二者(優選結合非締合狀態)。在所有這些情形中，本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽可以以與本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽結合處於其非締合狀態的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的親和力和/或特異性相同或不同的(即，高於或低於其)親和力和/或特異性結合所述締合的蛋白複合物。
[0104]此外，技術人員應該清楚，包含兩個以上針對c-Met、且特別是人c_Met(SEQ IDNO:1)的免疫球蛋白單可變結構域的蛋白或多肽，例如，本發明的「二互補位」多肽，可以以比相對應的單體胺基酸序列更高的抗體親抗原性結合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ IDNO:1)。例如，不限於，包含兩個以上針對c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的不同表位的免疫球蛋白單可變結構域的蛋白或多肽可以(並且通常)以比不同單體中的每一個更高的抗體親抗原性結合，並且包含兩個以上針對c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結構域的蛋白或多肽可以(並且通常)還以更高的抗體親抗原性結合c-Met的多聚體(例如，同源二聚體)，且特別是結合人c-Met (SEQ ID NO:1)的多聚體(例如，同源二聚體)。
[0105]通常，本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽至少結合與生物學和/或治療觀點最相關的形式的那些形式的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)(包括單聚體、多聚體、締合的和不同的構象形式)，這將是技術人員所清楚的。
[0106]使用本發明的免疫球蛋白單可變結構域和多肽的部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物，和/或使用包含一個或多個所述部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物或基本上由其組成的蛋白或多肽也在本發明的範圍內，只要這些適合用於本文所考慮的應用。所述部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物通常包含用於結合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的功能性抗原-結合位點(的至少一部分)；並且更優選地能夠特異性結合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1),並且甚至更優選地能夠以如本文定義的EC50值、平均K1、IC5tl值(涉及結合、遷移、置換和/或增殖阻斷和/或其他效果測量，如本文進一步所述(例如，在實驗部分))結合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)，並且所述部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物可以更有效、更穩定、更可溶，並且可以具有相同的表位。通過本文的進一步描述，所述部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因、衍生物、蛋白和/或多肽的一些非限制性的實例將變得清楚。本發明的另外的片段或多肽也可以通過適當組合(即，通過連接或遺傳融合)一種或多種如本文所述的(較小的)部分或片段而提供。
[0107]關於免疫球蛋白單可變結構域的一般描述，參考下文的進一步描述，以及參考本文引用的現有技術。然而，在這一方面，應該注意到本說明書和現有技術主要描述所謂的「Vh3種類」的免疫球蛋白單可變結構域(即，與人種系Vh3序列(如DP-47, DP-51或DP-29)具有高度的序列同源性的免疫球蛋白單可變結構域)，這形成本發明的優選方面。然而，應該注意到，本發明在其最廣泛意義上通常涵蓋任意類型的針對c-Met、且特別是人c-Met (SEQID NO:1)的免疫球蛋白單可變結構域，並且例如還涵蓋屬於所謂的「VH4種類」的免疫球蛋白單可變結構域(即，與人種系Vh4種類序列(如DP-78)具有高度的序列同源性的免疫球蛋白單可變結構域)，如例如在W007/118670中所述。
[0108]通常，免疫球蛋白單可變結構域(特別是Vhh序列和序列優化的免疫球蛋白單可變結構域)可以特別地特徵在於在一個或多個構架序列(同樣如本文進一步所述)中存在一個或多個「標誌殘基」(如本文所述)。
[0109]因此，通常，免疫球蛋白單可變結構域可以定義為具有下述(通用)結構的胺基酸序列:
[0110]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0111]其中FR1-FR4分別是指構架區1_4，並且其中⑶Rl-⑶R3分別是指互補性決定區1_3 ο
[0112]在一個優選的方面，本發明提供包含至少一個免疫球蛋白單可變結構域的多肽，所述免疫球蛋白單可變結構域是具有下述(通用)結構的胺基酸序列:
[0113]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0114]其中FR1-FR4分別是指構架區1_4，並且其中⑶Rl-⑶R3分別是指互補性決定區
1-3，並且其中:
[0115]i)在按照 Kabat 編號的位置 11，37，44，45，47，83，84，103，104 和 108 的至少一個
胺基酸殘基選自下表A-1中提及的標誌殘基；並且其中:
[0116]ii)所述胺基酸序列與W02009/138519中所示的(參見W02009/138519的SEQ IDN0:sl-125)至少一種免疫球蛋白單可變結構域具有至少80%、更優選地90%、甚至更優選地95%的胺基酸同一性，其中為了確定胺基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的胺基酸殘基(在所述序列中表不為X);並且其中:
[0117]iii)所述⑶R序列通常如本文進一步所定義(如表(B-2)中提供的組合的⑶R1、⑶R2和⑶R3，注意⑶R定義按照Kabat編號系統考慮)。
[0118]表A-1: VHHs中的標誌殘基
[0119]
【權利要求】
1.能夠將HGF從人C-Met(SEQ ID NO:1)上置換下來的免疫球蛋白單可變結構域，其IC50小於ΙΟηΜ，並且最大HGF置換水平為60%_80%或以上。
2.權利要求1的免疫球蛋白單可變結構域，其中所述免疫球蛋白單可變結構域包含具有式I的胺基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I)； 其中FR1-FR4是指構架區1-4，並且是免疫球蛋白單可變結構域的構架區；並且其中⑶Rl選自由以下組成的組:
a)SEQID NO:51 和 160， b)與SEQID NO:51和160具有至少80%的胺基酸同一性的多肽， c)與SEQID NO:51和160具有3、2或I個胺基酸差異的多肽，並且其中⑶R2選自由以下組成的組:
d)SEQID NO:67 和 170， e)與SEQID NO:67和170具有至少80%的胺基酸同一性的多肽， f)與SEQID NO:67和170具有3、2或I個胺基酸差異的多肽，並且其中⑶R3選自由以下組成的組:
g)SEQID NO:83 和 180， h)與SEQID NO:83和180的免疫球蛋白單可變結構域中的至少一個具有至少80%的胺基酸同一性的多肽， i)與SEQID NO:83和180具有3、2或I個胺基酸差異的多肽。
3.權利要求1-2中任一項的免疫球蛋白單可變結構域，其中所述構架區(FRs)與SEQID NO: 102的FRs具有大於80%的序列同一性。
4.權利要求1的免疫球蛋白單可變結構域，其中所述免疫球蛋白單可變結構域包含具有式I的胺基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I)； 其中FR1-FR4是指構架區1-4，並且是免疫球蛋白單可變結構域的構架區；其中CDRl是 SEQ ID NO: 51 或 160，其中 CDR2 是 SEQ ID NO:67 或 170 ;並且其中 CDR3 是 SEQ ID NO:83或 180。
5.包含權利要求1-4中任一項的免疫球蛋白單可變結構域的多肽。
6.權利要求5的多肽，其中所述多肽選自由以下組成的組:胺基酸序列與SEQIDNO:23-29, 102或187具有大於80%的序列同一性的多肽。
7.權利要求5或6任一項的多肽，其中所述多肽選自由以下組成的組:胺基酸序列與SEQ ID NO:26或187具有大於80%的序列同一性的多肽。
8.權利要求5-7中任一項的多肽，其另外包含與人血清白蛋白結合的免疫球蛋白單可變結構域，諸如例如 Albll (SEQ ID NO: 5)或 Alb23 (SEQ ID NO: 101)。
9.權利要求5-8中任一項的多肽，其中所述多肽選自由以下組成的組:胺基酸序列與SEQ ID NO:7-12, 103-111，113，188 或 142-150 具有大於 80% 的序列同一性的多肽。
10.權利要求5-9中任一 項的多肽，其中所述多肽選自由以下組成的組:胺基酸序列與SEQ ID NO:7, 106，113，188，143，146或147具有大於80%的序列同一性的多肽。
11.權利要求1-4中任一項的免疫球蛋白單可變結構域或權利要求5-10中任一項的多肽，其中在α篩選測定中的IC50為1.2ηΜ以下。
12.權利要求1-4中任一項的免疫球蛋白單可變結構域或權利要求5-10中任一項的多肽，其中在α篩選測定中的IC50為500ρΜ以下。
13.核酸序列，所述核酸序列編碼:i)權利要求1-4，11或12中任一項的免疫球蛋白單可變結構域；或ii)權利要求5-10中任一項的多肽。
14.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含:i)權利要求1-4，11或12中任一項的免疫球蛋白單可變結構域；或ii)權利要求5-10中任一項的多肽；以及任選地藥用賦形劑。
15.權利要求1-4，11或12中任一項的免疫球蛋白單可變結構域；或^)權利要求5-10中任一項的多肽，其用於癌症。
16.用於製備權利要求1-4，11或12中任一項的免疫球蛋白單可變結構域或ii)權利要求5-10中任一項的多肽的方法，所述方法至少包含下述步驟: a)在適當的宿主細胞或宿主生物體中或在另一種適當的表達系統中表達權利要求13的核酸或核苷酸序列； 任選地接著進行: b)分離和/或純化所述免疫球蛋白單可變結構域或所述多肽。
17.用於篩選針對c-Met、且特別是人c-Met(SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結構域的方法，所述方法包括至少下述步驟: a)提供VHHl型免疫球蛋白單可變結構域的組、集合或文庫；和 b)從所述VHHl型免疫球蛋白單可變結構域的組、集合或文庫中篩選能夠結合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)和/或具有針對c_Met、且特別是人c_Met (SEQ ID NO:1)的親和力的免疫球蛋白單可變結構域；和 c)分離能夠結合c-Met、且特別是人c-Met(SEQ ID NO:1)和/或具有針對c_Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的親和力的胺基酸序列。
18.用於評估患有c-Met相關的疾病或病症的患者對治療的響應性的體外方法，所述方法包括下述步驟: a)提供在治療前來自所述患者的第一樣品，並且測量所述第一樣品中的可溶性c-Met的量， b)提供在開始治療後來自所述患者的第二樣品，並且測量所述第二樣品中可溶性c-Met的量， c)將在所述第一樣品中存在的可溶性c-Met的量與在所述第二樣品中存在的可溶性c-Met的量進行比較； 其中，與在所述第一樣品中的可溶性c-Met的量相比，在所述第二樣品中發現的可溶性c-Met的量的減少表示所述患者對所述治療有響應。
19.權利要求18的方法，其中所述樣品是血液樣品，血清樣品，血漿樣品，糞便樣品，尿樣，支氣管肺泡灌洗液，腦脊液或組織樣品。
20.權利要求18的方法，其中可溶性c-Met的量使用免疫測定、化學發光測定或電化學發光測定來測量。
21.權利要求18的方法，其中所述治療包括施用:i)權利要求1-4，11或12中任一項的免疫球蛋白單可變結構域；ii)權利要求5-10中任一項的多肽；或iii)權利要求14的藥物組合物。
22.—種治療至少一種與c-Met相關的疾病或病症的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用權利要求14的藥物組合物。
23.用於評估患有c-Met相關的疾病或病症的患者對治療的響應性的試劑盒，所述試劑盒包含用於按照權利要求18的方法測量患者中可溶性c-Met的量的一種或多種試劑。
24.權利要求23的試劑盒，所述試劑盒還包含:i)權利要求1-4，11或12中任一項的免疫球蛋白單可變結構域；或ii)權利要求5-10中任一項的多肽；或iii)權利要求14的藥物組 合物。
【文檔編號】A61K39/395GK103889451SQ201280047858
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年10月1日 優先權日:2011年9月30日
【發明者】格拉爾德·貝斯特, 蓋伊·赫爾曼斯, 索倫·斯特芬森, 亞歷山大·希羅基, 塞德裡克·約瑟夫·內奧特裡·韋爾韋肯, 延納克·德納耶爾 申請人:埃博靈克斯股份有限公司