腺病毒組裝方法

2023-06-16 08:55:16

專利名稱：腺病毒組裝方法
腺病毒組裝方法相關申請的交叉引用本申請要求2010年8月16日提交的美國臨時申請61/374，198的權益，為了所有目的，該臨時申請全部併入本文。
背景技術：
有52種人類腺病毒感染不同的人組織，還有上百種腺病毒能夠感染從魚到靈長動物的其他物種。這些病毒是高效的納米級機器，能夠在感染I小時內將它們的遺傳物質有效負載至細胞核內。這些DNA病毒不整合到宿主DNA中，利用成熟的GMP方案可以產生高滴度的病毒，而且它們在為了表達異常基因進行的研究和人類基因治療應用中表現很安全。但是，到目前為止，由於使用幾乎只限於一個變種Ad5或Ad2/5嵌合體以及不能快速和系統地構建和組合多個基因修飾，它們的潛在應用受到了局限。因此，需要將常用的腺病毒載體擴展到Ad2/5以外，並且要建立一個技術平臺來協助由組成部分快速離體地組裝新的腺病毒基因組，以便能夠系統地引入多個修飾和異源元件。這樣的系統可以利用天然的病毒架構在能夠高效運送和表達36個基因(不包括剪接變體)方面的優點。所述系統可以提供有力的診斷劑和治療劑，這些診斷劑和治療劑包含對不同腫瘤樣品中失去調控的途徑活性的多重和定量測量。腺病毒載體在多種應用中的潛力受限於快速和系統地操縱36kb病毒基因組的能力。而且，基礎研究、動物模型、基因治療和溶瘤治療中使用的腺病毒載體只限於腺病毒(Ad)血清型2和5。Ad2和Ad5居於最早發現的腺病毒之列，因此傳統上有大量載體/工具來操縱它們的基因組，特別是El區域。Ad2/5纖維蛋白(Fiber proteins)通過結合受體CAR感染上皮細胞。不幸的是，不是所有類型的細胞都表達CAR，而且CAR在許多轉移病例中被下調。再者，接近80%的人口具有預先存在的抗Ad2/5的中和抗體，這與脫靶肝攝取和炎症一起限制了系統性應用。因此，使用Ad2/5載體進行基因遞送和癌症治療不一定是最佳選擇，而主要是歷史的偶然事件。我們的最終目的是建立強力的癌症病毒療法，所述療法不僅能夠進行腫瘤選擇性裂解複製，還可以在多輪治療中進行系統地給藥、避免對肝臟的毒性、有效地靶向和穿越令人苦惱的腫瘤血管、經由不同的受體感染細胞、在腫瘤內通過前藥活化酶/毒素的局部表達產生腫瘤旁觀者效應並且復甦有益的宿主抗病毒免疫反應。這些主要挑戰因為人類腺病毒不能在小鼠中複製而更加嚴重。這排除了相比異種移植模型有許多優勢的在免疫活性癌症基因工程小鼠模型(GEMMs)中進行人溶瘤病毒評價的可能。52種人類腺病毒的存在表明腺病毒高度專性適應不同宿主組織環境中的感染和複製。這些病毒中的許多可以感染不同組織，並且含有能夠結合除CAR之外的細胞受體的纖維蛋白以及一群不同的『E3』免疫調節基因。由於缺少修飾它們的基因組所需要的工具，對它們的這些獨特屬性還沒有廣泛的研究或利用。類似地，還存在感染其他物種的腺病毒，包括鼠腺病毒(M AV-1)。本文提供了對現有技術中的這些和其他問題的解決方案。發明概述
本發明一方面提供了製備重組腺病毒的方法(文中又稱為「Adsembly」)。所述方法包括由兩個或更多個腺病毒基因模塊組裝核酸，所述模塊選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊或者腺病毒大模塊(maciOmodule)(或者如下文描述的突變體)。本發明另一方面提供了包含複數個腺病毒基因模塊的文庫。本發明另一方面提供了實施本文提供的方法的試劑盒。附圖簡述

圖1.現有腺病毒載體方法和Adsembly的比較列表。Adsembly克服了現有系統中的多個限制。圖2.進一步開發腺病毒作為治療劑所需要克服的挑戰。簡圖表明了該領域需要克服的幾個主要問題。圖3.列舉了四種不同腺病毒屬的系統發生樹。沒有列出所有已知腺病毒。該圖展示了腺病毒家族中的種類多樣性。圖4.52種已知的人腺病毒的受體和向性。受體和向性在血清型和亞型之間有所不同，因此可以利用這一點來重新靶向某些病毒。圖5.腺病毒各屬中保守的「核心」基因組區。頂端的圖是人Ad5基因組(SEQ IDNo: 137)的簡化圖譜，其中的核心區以虛線框強調。正如下端圖中圍繞基因的白框表明的，該核心區在所有腺病毒屬中保守。所有屬都含有該核心區，並且幾乎全部的核心開放讀框都是從IVa2(左端)到pVIII (右端)。基因組的多變性存在於基因組的末端。申請人將我們的模塊名稱劃分為El模塊(文中又稱為El樣模塊)(條帶指示的核心區左側的全部)、核心模塊(條帶指示的)和E·3模塊(文中又稱為E3樣模塊)(條帶指示的核心區右側的全部)，因為模塊內容在不同腺病毒種類之間會有所變化，但它們相對核心區的位置不會變。一些情況中，纖維(fiber)緊挨著核心區,而在其他(人Ads)中位於核心區之外。圖6.多種腺病毒屬的轉錄圖譜，顯示了腺病毒種類之間的保守轉錄單位。顯示了核心基因，以及在一或兩個屬中可以看到的基因。該圖可以看出不同屬之間基因組末端的多樣性。這裡引用的〃Davison, Benko, Harrach〃是指 Be.nk0 M et al., (2005)FamilyAdenoviridae.Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA(eds): VirusTaxonomy.VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.Elsevier,New York pp213_228。圖7A-7C.SEQ ID NO: 32給出的人Ad5聚合酶蛋白中胺基酸966-1103 (底端，緊靠共有序列的上方)與來自非人腺病毒的多個聚合酶蛋白中的相應區域的比對。每個非人Ad序列在與該Ad5聚合酶序列進行分別比較時，該區域內至少45%相同。左側的記號表示GenBank登錄號，從上到下分別對應SEQ ID NO: 1-32 圖7D-7G.SEQ ID NO: 73給出的人Ad5六鄰體蛋白(hexon protein)中胺基酸501-747 (底端，緊靠共有序列的上方)與來自非人腺病毒的多個六鄰體蛋白中的相應區域的比對。每個非人Ad序列在與Ad5六鄰體序列進行分別比較時，該區域內至少45%相同。左側的記號表示GenBank登錄號，從上到下分別對應SEQ ID N0:33_73。圖7H-71.SEQ ID NO: 103給出的人AdOTNA結合蛋白中胺基酸408-475 (底端，緊靠共有序列的上方)與來自非人腺病毒的多個DBPs中的相應區域的比對。每個非人Ad序列在與AdOTBP序列進行分別比較時，該區域內至少35%相同。以黃色標識的殘基在各物種之間是100%保守的。左側的記號表示GenBank登錄號，從上到下分別對應SEQ ID NO: 74-103。圖7J.SEQ ID NO: 135給出的人Ad5pVIII蛋白中胺基酸6-43 (底端，緊靠共有序列的上方)與來自非人腺病毒的多個pVIII蛋白中的相應區域的比對。每個非人Ad序列在與Ad5pVIII序列進行分別比較時，該區域內至少35%相同。左側的記號表示GenBank登錄號，從上到下分別對應SEQ ID NO: 104-135。圖8.腺病毒基因組操作的初始概念一覽。圖9.利用四個DNA片段進行的多位點gateway的簡單示意圖。多位點gateway是我們提議的用於重新組裝基因組的系統。左側是提議的系統。圖10A.詳細說明gateway att重組位點的命名和組織的示意圖。由Gateway克隆得到了四種不同的att重 組位點。四種均含有21bp的中央attB區，這裡是重組真正發生的位置。利用特異的酶混合物(BP)將attP位點與attB位點重組。得到的反應產生了attL和attR位點。用另一種酶混合物(LR)可以使反應逆向進行，這時attL和attR重組形成attP和attB。圖10B.6個不同att位點之間的序列差別。每個位點特異地與它的配對位點重組。attBl位點只與attPl位點重組，attB2隻與attP2,等等。圖11.A)人Ad5基因組(SEQ ID NO: 137)分為重組裝模塊的例子。B)利用多位點gateway技術將提議的模塊重新組裝後，attB位點的插入位置。圖12.人Ad5基因組(SEQ ID NO: 137)中可能的attB插入位點的例子。可以通過將目標區域內的多種腺病毒序列進行比對，選擇非保守序列周圍的位置來確定插入位點。箭頭表示給Ad5選擇的位點。A) El和E2模塊之間的attB4插入。B) E2和L3模塊之間的attB6插入位點。C)L3和E3模塊之間的attB5插入。D)E3和E4模塊之間的attB3插入位點。對於該具體插入，我們決定通過提供雙份的位於纖維polyA/終止子和E4polyA之間的Ad5序列給該重組位點提供一個緩衝區。因此，與attB插入一起，在這兩個元件之間有27bp的重複。圖13.試圖通過PCR獲得5個Ad5模塊時的挑戰和結果。底部的表列出了 PCR獲得的每個片段的測序結果以及與已經發表的Ad5序列的差別。因為所有錯誤的再現性都是100%，這說明我們使用的模板與發表的Ad5序列不同，且該PCR的忠實度很高。圖14.Ad5腺病毒基因模塊可以通過PCR由直接得自純化的病毒的DNA獲得。從純化的病毒中直接分離Ad5基因組DNA，作為Ad5模塊PCRs的模板。所有5個PCRs都成功。左邊小圖:一式四份的E2和L3模塊PCR。右邊小圖:一式兩份的El、E3和E4模塊PCR。紅色箭頭指示所需的PCR產物。右側的箭頭省略了，因為目標產物非常清楚。圖15.Ad5腺病毒基因模塊在gateway BP反應中的效率。El、E2和L3模塊在標準反應中無效，而E3和E4模塊有效。圖16.不依賴序列和連接反應的克隆法(SLIC)的示意圖。左側是單一片段SLIC，而右側是多(9)片段SLIC的例子。圖17.利用SLIC,在不使用gateway克隆酶的情況下製備gateway入門載體。圖18.Ad5El區對細菌有中等毒性。利用SLIC，將Ad5El區或對照(IacZ)插入gateway DONR載體。IacZ對照上的所有菌落均是「正常」大小，對IacZ插入是陽性的。El平板上只出現了兩個「正常」大小的菌落，兩個菌落對El都是陰性。但是，有幾個較小的菌落(箭頭)，全部都是El陽性的。因此，Ad5El區延緩了細菌的生長。這解釋了為什麼我們無法利用gateway重組反應插入El。圖19.由5個模塊入門載體重新組裝Ad5基因組的原始的多位點gateway策略。首先，將5個入門載體中的3個與填充載體合併。然後去除填充載體以便插入反選盒(counterselection cassettes)。然後合併最後的2個入門載體從而形成完整的基因組。該特定策略顯示出與El模塊關聯的毒性，以及E2和L3模塊的大體積。圖20.人Ad5Adsembly雙DEST載體的形成。E2和L3模塊由各自的入門載體通過PCR獲得，並利用SLIC與載體骨架合併。然後，將載體消化後，通過SLIC將gateway反選盒插到模塊旁側，模塊末端帶有獨特的限制酶位點。圖21.人Ad5的Adsembly過程。將核心模塊雙DEST載體與其餘的3個入門載體中的一個在gateway LR反應中合併從而重新組裝完整的病毒基因組。圖22.Adsembly方法中嘗試的多個反選標記物的效率。使用了 PheS+ccdB,對於通過菌落盲選，或者首先利用菌落PCR鑑定到插入然後通過標準的限制酶消化篩選都是有效的。圖23.Adsembly 載體骨架含有適合所述方法的實施方案的兩個獨特屬性。載體骨架使用的是P15A複製原點，降低了質粒的拷貝數，從而減少Ad5El模塊介導的毒性。此外，載體含有哺乳動物1-SceI表達盒，這使得轉染後病毒基因組能夠從載體骨架上自剪切下來。圖24.Adsembly反應的效率。A)Ad5的Adsembly反應使用了 20fmol核心雙DEST載體和各IOfmol的El模塊、E3模塊和E4模塊入門載體進行。反應在室溫下過夜進行，第二天轉化到NEBlO-β細胞中。長出16個克隆，經過處理以備經EcoRV消化進行篩選。16個克隆中的2個顯示出正確的限制酶消化樣式(星號，克隆4和8)。「L」是DNA序列梯(ladder)。「㈠」是陰性對照，即經過消化的核心雙DEST載體。「⑴」是陽性對照，經過消化的完整Ad5基因組。B)提高El入門載體的量增強了 Adsembly的效率。Ad5的Adsembly反應使用了 20fmol核心雙DEST載體、50fmol El模塊入門載體和各IOfmol的E3和E4模塊入門載體。反應在室溫下過夜進行，第二天轉化到NEBlO-β細胞中。長出10個克隆，經過處理以備經EcoRV消化進行篩選。10個克隆中的7個顯示出正確的限制酶消化樣式(紅色星號).「L」是DNA序列梯。是陰性對照，即經過消化的Ad5E2-E4載體。「(+) 」是陽性對照，即經過消化的完整Ad5基因組。圖25.人Ad5的AdSlicR方法。從給Adsembly製備的E2-L3核心模塊開始，載體經SwaI消化被線性化。然後利用SLIC將E3和E4模塊插入載體。後續的載體用PacI線性化，然後通過SLIC插入El模塊形成完整基因組。圖26.人Ad5AdSlicR方法中的效率。菌落PCR作為第一道篩選流程，然後將PCR陽性克隆進行限制酶消化。圖27.Adsembled (經Adsembly製得的)病毒在組織培養中的生長情況。A)通過Adsembly組裝的複製型腺病毒形成的噬菌斑。將Adsembled基因組轉染到293細胞中，到第7天出現肉眼可見的卩遼菌斑。B) AdsembledAd5的傳代和繼續生長。從Adsembled Ad5的轉染收集總病毒，重新在新鮮的293細胞上鋪板。第3天可以看出波及整個平板上的明顯致細胞病變效應。圖28.Adsembled Ad5生長在293細胞中時滴度只有略微下降。293細胞用MOI=IO的野生型Ad5、Adsembled Ad5或AdSLIC Ad5 (不含有attB插入或者分別含有四種attB插入中的一個)轉染。48小時後收集總病毒，經ELISA測定滴度。唯一顯示出缺陷的病毒是Adsembled病毒和只含有attB3插入的AdSLIC病毒。與野生型水平相比,均表現出適度的
2倍下降。這些數據還顯示利用AdSLIC製備的病毒在293細胞中沒有複製缺陷。所有病毒的輸入水平經過滴定，接近le7IU/mL(未顯示)。圖29.圖29A給出了本文描述的Adsembly入門載體文庫中的載體。首先列出了模塊所來源的Ad血清型，之後是對載體進行的改變。如果沒有變化，標記為「野生型」。圖29B給出了用於本文描述的Adsembly和AdSLIC的大模塊載體。首先列出了大模塊Ad所來源的血清型，之後是包含大模塊的模塊，然後是對載體進行的任何改變。如果沒有變化，標記為「野生型」。圖29C給出了利用本文描述的Adsembly或AdSLIC組裝成的腺病毒基因組。首先列出了基因組所基於的Ad血清型，之後是對病毒進行的任何改變。如果沒有變化，標記為「野生型」。圖30.利用SLIC將完整基因組插入質粒。A)所述過程的示意圖，經PCR獲得的質粒載體含有與要插入的病毒基因組末端同源的短片段( 20bp)。然後用T4DNA聚合酶處理基因組和載體，正常用於SLIC。B)完整Ad5基因組插入質粒骨架的例子。篩選到的所有6個克隆都含有完整的基因組。因為基因組可以正向或者反向插入，這裡的情況中四個處於一個方向(克隆1、4、5和6),兩個處於另一個方向(克隆2和3)。圖31-33描述了腺病毒基因組改造的方法。圖34.上方小圖:利用AdSLICr系統，組裝非人腺病毒-小鼠腺病毒I型的基因組(SEQ ID NO: 104)的例子。El、E3-纖維蛋白和E4模塊質粒的設計使得可以用限制性酶對它們進行切割留下突 出 端，所述突出端是將它們經過序列和連接不依賴性克隆(SLIC)到線性化(用SwaI或PmeI)核心載體中所需的。這將減少為了獲得SLIC所需的線性片段而進行PCR的必要，從而消除引入錯誤的可能。設計還保證最終的基因組構建體中不插入外來序列。一般方法包括切割E3-纖維蛋白和E4模塊，並與PmeI線性化的核心載體合併。這生成了 E2-E4大模塊，然後用SwaI對其進行切割，並與切割好的El模塊合併產生完整的基因組。下方小圖:利用以上策略組裝了野生型I型鼠腺病毒，轉染小鼠3T6細胞後獲得能形成噬菌斑的感染性病毒。圖35.為了鑑定會妨礙生長的插入位點，對含有單一 attB重組位點插入的病毒的生長分析。因為利用Adsembly製備的病毒與野生型病毒相比，有略微的生長缺陷(圖28)，所以利用AdSLIC製備病毒,這樣它們只含有利用Adsembly製備的病毒中帶有的attB插入中的一個。293細胞(上方圖形)被以MOI=IO感染。U20S細胞(下方圖形)被以M0I=50感染。48小時後收集總病毒並滴定。模塊[L3]和[E3]之間的attB5插入與野生型病毒相比沒有影響在U20S細胞中的生長，但其他三個接點處的attB插入與野生型細胞相比的確對生長有抑制。圖36.因為位於El和E2-L2模塊之間的初始attB4插入位點造成了生長缺陷(圖35)，設計了替代的位置選項。鹼基對位點參照SEQ ID NO: 137中給出的位點。圖37.由於位於E3和E4模塊之間的初始attB3插入位點造成了生長缺陷(圖35)，設計了替代的位置選項。鹼基對位點參照SEQ ID NO: 137中給出的位點。圖38.用病毒以M0I=50感染U20S細胞，48小時後收集總病毒並滴定。將利用Adsembly生成的三種病毒與野生型病毒進行比較。含有替代attB位點插入的病毒(黑色菱形和三角形)與原來的attB位點安置(黑色X』 s)相比，生長情況改善。所有這些病毒缺少位於L2和L3模塊之間的attB位點，並且含有不影響生長的位於L3和E3模塊之間的attB插入。圖39.Adsembly可以用於生成病毒，所述病毒中從El模塊開始表達轉基因。這種情況中，在El模塊中用GFP表達盒替換Ad5的ElA和ElB基因。利用Adsembly組裝病毒，得到了表達GFP的活病毒。圖40.Adsembly可以用於生成病毒，所述病毒中利用天然的病毒轉錄架構從E3模塊開始表達轉基因。E3模塊經過改造被刪除了 11.6K的蛋白(Ad5核苷酸29491-29772)，代之以mCherry。然後E3轉錄物自然剪接產生mCherry基因，蛋白得以表達。顯示了利用Adsembly進行病毒的製備和U20S細胞的轉導。這是I)從E3模塊開始的轉基因表達，和2)利用天然的病毒轉錄構架表達外來基因的例子。圖41.利用天然的病毒轉錄架構從E4模塊開始表達多重轉基因。將天然E4啟動子替代為CMV啟動子，3個天然E4基因替代為轉基因。然後利用Adsembly生成病毒。鹼基對位點參照SEQ ID NO: 137中給出的位點。圖42.Adsembly可以用於生成病毒，所述病毒中利用天然病毒轉錄架構從E4模塊開始表達多重轉基因。用圖41中製備的 病毒向U20S細胞中轉導24小時，收集總RNA，由RNA通過隨機引發合成cDNA，進行PCR來檢測對mCherry基因的剪接。黑色箭頭指示未剪接的轉錄物，該轉錄物會表達GFP。白色箭頭指示發生剪接的轉錄物,該轉錄物表達mCherry。這顯示了由單一模塊可以表達多重外來基因。泳道I和2分別是未被轉導的細胞或者感染了野生型Ad5的細胞的陰性對照。圖43.利用Adsembly在單個基因組組裝中給多重模塊引入多種類型的變化。示意圖顯示了 Ad5基因組的5個模塊，其中的垂直箭頭指示在完整基因組組裝前給每個模塊做的改變。El模塊被轉化為螢光素酶-GFP融合蛋白的轉基因表達盒。L3模塊中的六鄰體蛋白通過點突變將Glu451改變為Gin。E3模塊中天然Ad5纖維的一部分被來自其他的人腺病毒血清型的多種纖維組分之一所替代。利用Adsembly製備了 6種病毒，每種含有代替的纖維蛋白。給Ad5列出的鹼基對位點參照SEQ ID N0:137中給出的位點。登錄號DQ086466、AJ854486、BK001453、NC_001460 和 AY_737797 分別對應 SEQID NO: 139-143。圖44.利用Adsembly生成的纖維嵌合病毒與正常Ad5纖維相比，在人胚胎幹細胞(hESC)中的轉導能力提高。以不同MOIs將人ESC轉導24或48小時，經顯微鏡測量GFP表達。頂端小圖是不含病毒的陰性對照。第二行小圖是表達處於CMV啟動子調控下的GFP的「Ad5CMV-GFP」。左側標明了所檢驗的病毒纖維嵌合體(即Ad5/3是帶有Ad3纖維球部的Ad5)。所有圖像是在5x放大倍數攝取的。圖45.將腺病毒血清型的核心模塊進行交換產生了有活性的病毒。製備了來自Adll的核心模塊。Ad5El和E3模塊經過改造分別帶有AdllpIX和U外顯子-纖維。利用AdSLIC組裝了整個病毒，病毒在293細胞上重建。「最終病毒」列表中提到的鹼基對位置與SEQ ID N0:137(Ad5)和 SEQ ID NO: 141 (Adll)中給出的一致。
圖46.利用AdSLIC對病毒基因進行突變以便研究基因在病毒感染方面的功能。在El模塊中，E1B-55K基因中的His260位點被突變為Ala。其他所有模塊是野生型的。該病毒是利用AdSLIC組裝的。用複製缺陷型Ad5 (泳道I)、野生型Ad5 (泳道2)或者Ad5H260A (泳道3)以MOI=IO感染人小氣道上皮細胞。感染後36小時收集總蛋白，通過Western印跡進行p53 (頂端小圖)、mdm2、Ad5晚期蛋白和肌動蛋白分析。與野生型Ad5不同，Ad5_H260A病毒不能降解P53，在晚期蛋白的產生方面有缺陷。發明詳述定義「核酸」是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和它們的聚合物，以及它們的互補鏈。該術語涵蓋這樣的核酸，所述核酸含有已知的核苷酸類似物或者骨架帶有修飾的殘基或連接；所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的；所述核酸與參照核酸有類似的結合性能並且與參照核苷酸的代謝方式類似。這種類似物的例子包括，但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNAs)。除非另有說明，特定核酸序列還暗含其保守性修飾的變體(例如簡併密碼子取代)和互補序列，以及明確指出的序列。具體來說，可以通過產生這樣的序列來實現簡併密碼子取代，所述序列中的一或多個選中(或全部)密碼子的第三個位點被混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081(1991) ; Ohtsuka et al., J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes8:91-98 (1994))。術語核酸與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可以互換使用。特定核酸序列還暗含「剪接變體」。類似地，由核酸編碼的特定蛋白暗含由該核酸的剪接變體編碼的所有蛋白。「剪接變體」正如這個名字暗示的是基因替代剪接的產物。轉錄結束後，開始的核酸轉錄物可能發生剪接，使得不同(替代)核酸剪接產物編碼不同的多肽。剪接變體的產生機制可能各不相同，但都包括外顯子的替代剪接。由同一核酸經過通讀轉錄產生的替代的多肽也涵蓋在這個定義中。剪接反應的任何產物，包括重組形式的剪接產物都包括在這個定義中。Leicher, et al., J.Biol.Chem.273 (52): 35095-35101 (1998)中討論了一例鉀離子通道剪接變體。構建含有所需治療基因編碼和調控序列的合適載體可以採用常規的連接和限制性酶切技術，這些技術在本領域已有很好的了解(參見Maniatis et al., in MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1982))。可以將分離的質粒、DNA序列或者合成寡核苷酸切割、修飾並按照需要的形式重新連接。核酸在與另一個核酸序列形成功能性關係時是「可操縱地連接」。例如，編碼前體序列或者分泌前導序列的DNA如果能夠表達為參與多肽分泌的前體蛋白，則所述DNA是可操縱地連接編碼多肽的DNA ;啟動子或增強子如果能夠影響序列的轉錄，則所述啟動子或增強子是可操縱地連接編碼序列；或者核糖體結合位點如果定位方式如果能夠協助翻譯的進行，則所述核糖體結合位點是可操縱地連接編碼序列。通常，「可操縱地連接」意味著被連接在一起的DNA序列距離很近，而且對於分泌前導序列的情 況，是連續的和符合讀框的。但增強子不需要必須連續。連接是通過在方便的限制酶切位點進行相連完成的。如果不存在這樣的位點，可以按照常規做法使用合成寡核苷酸適配子或接頭。
在提及兩個或更多個核酸或多肽序列的語境中，術語「相同的」或「同一性」百分比是指利用BLAST或BLAST2.0序列比較算法，使用以下描述的預設參數，或者通過人工比對和目測進行測量(參見例如NCBI網站等)，所述兩個或更多個序列或子序列是相同的，或者含有特定百分比的胺基酸殘基或核苷酸是相同的(即在比較窗口或者指定區域內按照最大對應性進行比較和對位排列時，特定區域內有大約60%的同一性，優選65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的同一性)。這樣的序列即可被認為是「基本相同的」。這個定義還可以指示或者可以應用於測試序列的互補序列。定義還包括含有缺失和/或添加的序列，以及含有取代的序列。正如以下描述的，優選的算法可以can account for gaps等。優選地,至少大約25個胺基酸或核苷酸長的區域內存在同一性，或者更優選地在50-100個胺基酸或核苷酸的區域內。為進行序列比較，一般將一個序列作為參照序列，將測試序列與它相比。使用序列比較算法時，將測試和參照序列輸入計算機，指定子序列坐標，如果需要還可以指定序列算法的程序參數。優選地，可以使用預設程序參數，或者可以指定替代參數。然後序列比較算法基於程序參數計算測試序列相對參照序列的序列同一性百分比。「比較窗口」用於本文包括兩個序列被最優化對位排列後，選自多個由20-600，優選大約50-大約200，更通常是大約100-大約150個位點組成的連續位點之一的區段，其中所述序列與具有相同數量連續位點的參照序列進行比較。用於將序列對位排列進行比較的方法是本領域已知的。可以如下實施序列比較的最佳對位排列，例如通過Smith &Waterman, Adv.Appl.Math.2:482 (1981)的局部同源性算法；通過 Needleman & ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)的同源比對算法；通過 Pearson&Lipman, Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA85:2444(1988)的尋找相似性的方法；通過這些算法的計算機化實施(WisconsinGenetics Software Package 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA, Genetics ComputerGroup, 575Science Dr.，Madison, WI);或者通過人工比對和目測(參見例如CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.1995supplement))。適用於確定序列同一性百分比和序列相似性的算法的優選例子是BLAST和BLAST2.0 算法，這 兩個算法分別在Altschul et al.，Nuc.Acids Res.25:3389-3402 (1977)和 Altschul et al.，J.Mol.Biol.215:403-410 (1990)中有描述。使用了參數如文中所述的BLAST和BLAST2.0來確定本發明的核酸和蛋白的序列百分比同一性。正如本領域已知的，進行 BLAST 分析的軟體可以通過 National Center for Biotechnology Information公開獲得。該算法涉及首先通過鑑定查詢序列中長度為W的短字節來鑑定高評分序列對(HSPs)，所述HSPs當與資料庫序列中相同長度的字節比對時，或者匹配或者滿足某些正數的閾值打分 T。T 代表相鄰字得分閾值(neighborhood word score threshold) (Altschulet al.,同前)。這些初始的匹配相鄰字作為種子，啟動搜索含有它們的更長的HSPs。將匹配字沿著每個序列，在累加比對得分能夠增加的情況下儘量遠地向兩個方向延伸。對於核苷酸序列，利用參數M(—對匹配殘基的獎勵分；永遠>0)和N(錯配殘基的罰分；永遠〈0)計算累加得分。對於胺基酸序列，利用打分矩陣來計算累加得分。當累加比對得分從它達到的最大值下降數量X時；由於一或多個得負分的殘基比對的累積，累加得分達到零或以下時；或者到達序列的末端時，停止匹配字在每個方向的延伸。BLAST算法參數W、T和X決定算法的靈敏度和速度。BLASTN程序(用於核苷酸序列)使用的預設參數為字長(W)=ll、期望值(E)=10、M=5、N=-4，雙鏈比較。對於胺基酸序列，BLASTP程序使用的預設參數為字長=3、期望值(E) =10、BLOSUM62 打分矩陣(參見 Henikoff&Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915 (1989))比對(B) =50、預期值(E) =10、M=5、N=_4，雙鏈比較。術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在文中可以互換使用來指代胺基酸殘基的聚合物。這些術語適用這樣的胺基酸聚合物，所述胺基酸聚合物中的一或多個胺基酸殘基是相應的天然存在胺基酸的人工化學模擬物；也適用天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。術語「胺基酸」是指天然存在的和合成的胺基酸，以及能夠按照和天然存在的胺基酸相似的方式發揮作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來發生修飾的胺基酸，例如羥脯氨酸、Y -羧基穀氨酸鹽和O-磷酸絲氨酸。胺基酸類似物是指與天然存在的胺基酸有相同的基本化學結構的化合物，即結合在氫原子上的α碳、羧基、氨基和R基團，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。這些類似物帶有被修飾的R基團(例如正亮氨酸)或者被修飾的肽骨架，但保持了和天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指其結構與胺基酸的一般化學結構不同的化合物，但與天然存在的胺基酸的功能方式類似。

胺基酸在文中可以用它們的眾所周知的三字母符號或者IUPAC-1UB BiochemicalNomenclature Commission推薦的單字母符號來表示。類似地,可以用它們的公認單字母代碼來指示核苷酸。「保守性修飾的變體」適用於胺基酸和核酸序列兩者。就特定核酸序列而言，保守性修飾的變體是指那些編碼相同或基本相同胺基酸序列的核酸，或者對於不編碼胺基酸序列的核酸，是指基本相同的序列。由於遺傳密碼的簡併性，有多個功能上相同的核酸編碼任何給定蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙氨酸。因此，在密碼子限定是丙氨酸的每個位點，可以將密碼子改變為上述相應密碼子中的任何一個而不會改變被編碼的多肽。這樣的核酸變異是「沉默變異」，是保守性修飾變體的一種。本文中每個編碼多肽的核酸序列還描述了所述核酸的每個可能的沉默變體。本領域技術人員可以認識到核酸中的每個密碼子(除了 AUG，它通常是唯一的甲硫氨酸的密碼子jPTGG，通常是唯一的色氨酸的密碼子)都可以被修飾而產生功能相同的分子。相應地，就表達產物而言，每個被描述序列中暗含了多肽編碼核酸的每個沉默變體，但對實際的探針序列來說，沒有這種含義。對於胺基酸序列，本領域技術人員可以認識到那些改變、增加或者刪除編碼序列中的單個胺基酸或較小百分比胺基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白序列進行的個別取代、缺失或添加是「保守性修飾變體」，其中所述改變導致胺基酸被化學上相似的胺基酸所取代。給出功能相似胺基酸的保守性取代表格是本領域已知的。這樣的保守性修飾變體是本發明的多態性變體、種間同源物和等位基因額外的，而不是排除它們。以下8個組各自含有相互是保守性取代的胺基酸:1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，穀氨酸(E) ;3)天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K); 5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y),色氨酸(W) ; 7)絲氨酸(S)，蘇氨酸⑴；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如Creighton, Proteins(1984))。提到例如細胞、病毒、核酸、蛋白或載體時使用的術語「重組」表明這些細胞、病毒、核酸、蛋白或載體被引入了異源核酸或蛋白或者天然核酸或蛋白被改變而被修飾，或者細胞來源於被這樣修飾的細胞。因此，重組細胞例如表達天然(非重組的)細胞中沒有的基因；或者表達的是天然基因，但是表達異常、表達下降或者根本沒有表達。術語「嚴緊雜交條件」是指這樣的條件，在所述條件下探針與通常存在於複雜的核酸混合物中它的靶子序列雜交，但不和其他序列雜交。嚴緊條件是序列依賴性的，並且隨著環境的不同而不同。較長的序列在較高溫度下特異雜交。Tijssen, Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicProbes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid aSSayS」(1993)中可以找到關於核酸雜交的全面指南。通常對於限定的離子強度pH，選擇的嚴緊條件比具體序列的融解溫度(Tm)低大約5-10°C。^是(一定離子強度、pH和核苷濃度下)與靶序列互補的探針有50%與靶序列平衡雜交的溫度(靶序列過量的情況下，在Tm，平衡時有50%的探針被佔據)。還可能通過加入去穩定劑，比如甲醯胺來達到嚴緊條件。對於選擇性或特異性雜交，陽性信號是背景的至少兩倍，優選是背景雜交的10倍。示範性的嚴緊雜交條件可以如下:50%甲醯胺、5x SSC和1%SDS，42°C溫育，或者5x SSC、1%SDS、於65°C溫育，並於65°C在0.2x SSC和0.1%SDS中洗滌。嚴緊條件下相互不雜交的核酸如果編碼的多肽基本相同，所述核酸仍然是基本相同的。例如核酸拷貝是利用遺傳密碼所能允許的最大密碼子簡併性形成的，會發生這種情況。在這種情況中，核酸一般在中等嚴緊的雜交條件下發生雜交。示範性的「中等嚴緊雜交條件」包括在37°C下在40%甲醯胺、IM NaCl、l%SDS的緩衝液中雜交和在45°C在IX SSC中洗滌。陽性雜交至少是背景的兩倍。本領域技術人員容易理解可以使用替代的雜交和洗滌條件來提供嚴緊度相似的條件。確定雜交參數的其他指導方針在許多參考文獻和例如Current Protocols in Molecular Biology, ed.Ausubel, et al., John Wiley & Sons 中有提供。對於PCRJ^ 36° C的溫度對於低嚴緊擴增是典型的，雖然根據引物長度，退火溫度可能在約32° C和48° C之間。對於高嚴緊PCR擴增，約62° C的溫度是典型的，雖然根據引物長度和特異性，高嚴緊退火溫度可以處於約50° C到約65° C的範圍。對高和低嚴緊擴增的典型循環條件包括90° C-95° C30秒-2分鐘的變性階段，持續30秒-2分鐘的退火階段，和大約72° Cl-2分鐘的延伸階段。Innis et al.(1990)PCR Protocols, AGuide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.N.Y.)中提供了低和高嚴緊擴增反應的試驗方案和指南。用於本文，術語「癌症」是指在哺乳動物中發現的所有類型的癌症、腫瘤(neoplasm)或惡性腫瘤,包括白血病、癌(carcinomas)和肉瘤(sarcomas)。示範性的癌症包括腦、乳房、宮頸、結腸、頭頸、肝、腎、肺、非小細胞肺、黑素瘤、間皮瘤、卵巢、肉瘤、胃、子宮和髓母細胞瘤的癌症。額外的例子包括何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多症、原發性巨球蛋白血症、原發性腦瘤、癌症、惡性胰島素瘤、惡性類癌、膀胱癌、惡性前皮膚病損、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血症、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌、胰腺內分泌和外分泌的腫瘤以及前列腺癌。術語「白血 病」是泛指造血器官的進展性、惡性疾病，通常特徵在於血液和骨髓中白細胞和它們的前體細胞的異常增殖和發育。白血病的臨床分類通常基於(I)疾病的持續期和特點-急性或慢性；(2)涉及的細胞類型-骨髓的(髓細胞性)、淋巴的(淋巴性)或者單核細胞型；和(3)血液中異常細胞的增加或未增加-白血病或非白血性(亞白血病性)。P388白血病模型是廣泛接受的預測體內抗白血病活性的模型。據信，在P388檢測方法中測試顯示陽性的化合物一般在體內會表現出一定水平的抗白血病活性，無論被治療的白血病類型如何。相應地，本發明包括白血病的治療方法，優選治療下述白血病的方法:急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病、急性粒細胞性白血病、慢性粒細胞性白血病、急性早幼粒細胞白血病、成人T-細胞白血病、非白血性白血病、白細胞不增多性白血病、嗜鹼性白血病、母細胞性白血病、牛白血病、慢性髓細胞性白血病、皮膚白血病、胚胎性白血病、嗜酸粒細胞白血病、葛氏(Gross』)白血病、毛細胞白血病、成血細胞性白血病、血胚細胞性白血病、組織細胞性白血病、幹細胞性白血病、急性單核細胞性白血病、白血病減少性白血病、淋巴性白血病、淋巴細胞性(lymphoblastic)白血病、淋巴細胞性(lymphocytic)白血病、淋巴球性(lymphogenous)白血病、淋巴樣白血病、淋巴肉瘤細胞性白血病、肥大細胞白血病、巨核細胞白血病、小原粒細胞性白血病、單核細胞白血病、髓性(myeloblastic)白血病、髓細胞性(myelocytic)白血病、骨髓粒細胞性白血病、髓單核細胞性白血病、內格利型(Naegeli)白血病、漿細胞白血病、多發性骨髓瘤、漿細胞性白血病、早幼粒細胞性白血病、李德爾氏細胞性(Rie der cell)白血病、希林氏(Schilling’s)白血病、幹細胞性白血病、亞白血性白血病和未分化細胞白血病。術語「肉瘤」通常所指的腫瘤是由胚胎結締組織這樣的物質組成的，一般包含包埋在纖維或均相物質中的緊密堆積的細胞。可以組合使用抗腫瘤的巰基結合線粒體氧化劑和抗癌劑來治療的肉瘤包括軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、艾伯內西氏(Abemethy’s)肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、軟組織腺泡狀肉瘤、成釉細胞肉瘤、葡萄狀肉瘤、綠色肉瘤、絨毛膜癌、胚胎性肉瘤、Wilms』瘤、子宮內膜肉瘤、間質肉瘤、尤文氏(Ewing's)肉瘤、筋膜肉瘤、纖維母細胞肉瘤、巨細胞肉瘤、粒細胞肉瘤、何杰金氏肉瘤、特發性多發性色素沉著出血性肉瘤(idiopathic multiple pigmented hemorrhagic sarcoma)、B細胞的免疫母細胞肉瘤、淋巴瘤、T細胞的免疫母細胞肉瘤、詹森(Jensen’s)肉瘤、卡波西(Kaposi’s)肉瘤、庫柏法細胞(Kupffer cell)肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間葉瘤、骨膜外肉瘤、網狀細胞肉瘤、勞氏肉瘤(Rous sarcoma)、漿液囊性肉瘤、外陰滑膜肉瘤和毛細管擴張性肉瘤。術語「黑素瘤」意味著從皮膚和其他器官的黑色素細胞系統發生的腫瘤。可以組合使用抗腫瘤的巰基結合線粒體氧化劑和抗癌劑來治療的黑素瘤包括例如，肢端雀斑樣痣黑素瘤、無黑素性黑素瘤、良性幼年黑素瘤、克羅德曼(Cloudman』 s)黑素瘤、S91黑素瘤、哈帕二氏(Harding-Passey)黑素瘤、青少年性黑素瘤、雀斑樣痣惡性黑素瘤、惡性黑素瘤、結節性黑素瘤、甲床黑素瘤和淺表擴散性黑素瘤。術語「癌(carcinoma)」是指由上皮細胞構成的惡性新生長物，易於滲透到周圍組織，產生轉移物。可以組合使用抗腫瘤的巰基結合線粒體氧化劑和抗癌劑來治療的示範性癌包括例如腺泡癌、腺泡狀癌、腺囊性癌、腺樣囊性癌、腺癌、腎上腺皮質癌、肺泡上皮癌、肺泡細胞癌、基底細胞癌(basal cell carcinoma)、基底細胞癌(carcinomabasocellulare)、類基底細胞癌、基底鱗狀細胞癌、細支氣管肺泡癌、細支氣管癌、支氣管癌、髓樣癌、膽管癌、絨膜上皮癌、膠樣癌(colloid carcinoma)、粉刺癌、子宮體癌、篩狀癌、銷甲狀癌、癌瘡、柱狀細胞癌(cylindrical carcinoma)、柱狀細胞癌(cylindrical cellcarcinoma)、導管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎癌、腦樣癌、表皮樣癌、腺樣上皮細胞癌、夕卜生性癌、潰瘍性癌、纖維癌、膠樣癌(gelatiniforni carcinoma)、膠狀癌(gelatinouscarcinoma)、巨大細胞癌、巨細胞癌、腺癌、粒層細胞癌、基底細胞癌(hair-matrixcarcinoma)、多血癌、肝細胞癌、許特耳氏細胞(Hurthle cell)癌、膠樣癌(hyalinecarcinoma) > hypemephroid carcinoma、幼稚型胚胎性癌、原位癌(carcinoma in situ)、表皮內癌、上皮內癌、克龍派切爾(Krompecher’s)癌、庫爾契茨基細胞(Kulchitzky-cell)癌、大細胞癌、豆狀癌(lenticular carcinoma、carcinoma lenticulare)、脂瘤樣癌、淋巴上皮性癌、軟癌(carcinoma medullare)、髓樣癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、髓樣癌(carcinoma molle)、粘液癌(mucinous carcinoma、carcinoma muciparum)、粘液細胞癌、粘液表皮樣癌、粘液癌(carcinoma mucosum、mucous carcinoma)、粘液瘤樣癌、鼻咽癌、燕麥細胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans、osteoid carcinoma)、乳頭狀癌、門脈周癌、原位癌(preinvasive carcinoma)、棘細胞癌、腦樣癌、腎臟的腎細胞癌、儲備細胞癌、肉瘤樣癌、施奈德氏(Schneiderian)癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、陰囊癌、印戒細胞癌、單純癌、小細胞癌、馬鈴薯狀癌、球狀細胞癌、梭細胞癌、髓樣癌(carcinomaspongiosum) 、鱗狀癌、鱗狀細胞癌、繩捆癌(string carcinoma)、血管擴張性癌(carcinomatelangiectaticum> carcinoma telangiectodes)、移行細胞癌、結節性皮癌(carcinomatuberosum、tuberous carcinoma)、撫狀癌和絨毛狀癌。「治療有效劑量或量」在本文意味著一個能夠產生它的給藥效應的劑量。確切的劑量和劑型取決於治療目的，由本領域技術人員利用已知技術確定(參見例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols.1-3, 1992) ；Lloyd, The Art, Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding (1999) ；Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor(2003)和 Pickar, DosageCalculations(1999))。術語「可藥用鹽」或「可藥用載體」意味著包括活性化合物的鹽，根據本文描述的化合物帶有的取代基，所述鹽是用相對無毒的酸或鹼製備的。本發明的化合物含有相對酸性的功能團時，可以通過在無溶劑或合適的惰性溶劑中用足夠量的所需鹼與所述化合物的中性形式進行接觸獲得鹼加成鹽。可藥用鹼加成鹽的例子包括鈉、鉀、鈣、鋁、有機胺或鎂鹽或者類似的鹽。當本發明的化合物含有相對鹼性的功能團時，可以通過在無溶劑或合適的惰性溶劑中用足夠量的所需酸與所述化合物的中性形式進行接觸獲得酸加成鹽。可藥用酸加成鹽的例子包括那些由下述無機酸衍生的鹽:鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、重碳酸、磷酸、一氫磷酸、二氫磷酸、硫酸、一氫硫酸、氫碘酸或亞磷酸等等，以及由下述相對無毒的有機酸衍生的鹽:乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥m酸、辛二酸、延胡索酸、乳酸、扁桃酸(mandelic)、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸等等。還包括諸如精氨酸等的胺基酸的鹽，和諸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸的有機酸的鹽(參見例如Berge etal., Journal of Pharmaceutical Science66:1-19 (1977))。本發明的某些特定化合物既含有鹼性功能團也含有酸性功能團，使得化合物能夠轉化為鹼或者酸加成鹽。本領域技術人員已知的其他可藥用載體也適用於本發明。
實施方案詳述1.組裝方法發明一個方面提供了製備重組腺病毒的方法(文中又稱為「Adsembly」)。所述方法包括從選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊或腺病毒大模塊(或者象下文描述的它們的突變體)中的兩個或者更多個腺病毒基因模塊組裝核酸。在一些實施方案中，方法包括從選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊或腺病毒大模塊中的三個、四個或五個腺病毒基因模塊組裝核酸。核酸可以是腺病毒基因組構建體。腺病毒基因組構建體是被表達時(例如被引入哺乳動物細胞中時)能夠形成重組腺病毒的核酸。核酸還可以是部分腺病毒基因組構建體，當被表達時(例如被引入哺乳動物細胞中時)，能夠與其他病毒(例如輔助病毒)一起形成重組腺病毒。這樣形成的腺病毒可以複製並包裝產生子代病毒。因此，本文提供的方法可能包括由兩個或更多個基因組模塊或者異源元件體外組裝腺病毒基因組，所述腺病毒基因組在單獨(轉染感受態細胞系)或者與輔助病毒一起轉染到哺乳動物細胞內時能夠複製並包裝產生子代病毒。基因組模塊的選擇可以基於進化上保守的序列、轉錄或者功能元件。在一些實施方案中，方法包括由選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊的三個或更多個腺病毒基因模塊組裝核酸。這樣得到的核酸(文中又稱為「組裝的核酸」)可以在組裝後被表達(例如發生複製、轉錄、翻譯和包裝)，從而形成重組腺病毒。核酸的表達可以在體外、原位、細胞內(例如通過將核酸轉染到細胞內)或者體內進行。在某些實施方案中，表達在細胞內進行從而導致產生細胞。術語「腺病毒基因模塊」用於本文是指El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊或者它們的大模塊。因此腺病毒基因模塊是核酸(例如DNA)。「個別腺病毒基因模塊」用於本文是指El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊或者E4模塊。在一些實施方案中，可以在組裝核酸之前由更小的子模塊組裝一或多個個別腺病毒基因模塊。腺病毒大模塊是El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊中的兩個、三個或四個的組合。因此大模塊是包含El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3 模塊、E4模塊中的兩個、三個或四個的線性核酸鏈(例如DNA)。術語「腺病毒大模塊」用於本文是指:E1-L2大模塊(即包含合併的El模塊和E2-L2模塊的核酸)；E1-L4大模塊(即包含合併的El模塊、E2-L2模塊和L3-L4模塊的核酸)；E1-E3大模塊(即包含合併的El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊和E3模塊的核酸)；E2-L4大模塊(即包含E2-L2模塊和L3-L4模塊的核酸，文中又稱為「核心大模塊」);E2-E3大模塊(即包含合併的E2-L2模塊、L3-L4模塊和E3模塊的核酸);E2-E4大模塊(即包含合併的E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊的核酸)；L3-E3大模塊(即包含合併的L3-L4模塊和E3模塊的核酸)；L3-E4大模塊(即包含合併的L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊的核酸)；和E3-E4大模塊(即，包含合併的E3模塊和E4模塊的核酸)。在一些實施方案中，腺病毒大模塊是E2-L4大模塊(即核心大模塊)或者E3-E4大模塊。當腺病毒大模塊被作為兩個或更多個選中的腺病毒模塊中的一個來組裝核酸時，其他選中的腺病毒模塊不是所述腺病毒大模塊中的個別腺病毒基因模塊。換句話說，每個個別腺病毒基因模塊在組裝成的核酸中無論是單獨或者位於大模塊內，均只出現一次。例如，當兩個或更多個選中組裝核酸的腺病毒基因模塊中的一個是核心大模塊時，不會選擇E2-L2或L3-L4模塊作為組裝好的核酸中包含的另一個模塊。同樣地，對於選擇了三個或更多個腺病毒基因模塊的情況，腺病毒大模塊不是E1-E3大模塊或E2-E4大模塊。在一些實施方案中，方法包括由選自(i)El模塊，(ii)核心大模塊和(iii)E3模塊、E4模塊或E3-E4大模塊中的三個腺病毒基因模塊組裝核酸。方法還可以包括由選自El模塊、核心大模塊、E3模塊和E4模塊的四個腺病毒基因模塊組裝核酸。在一些實施方案中，可以在組裝核酸之前將一或多個腺病毒基因模塊組合形成大模塊。對於形成大模塊的情況，方法包括由大模塊和所述模塊中不包含的一或多個個別腺病毒基因模塊(即El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和/或E4模塊)組裝核酸。在一些實施方案中，大模塊是核心大模塊。因此，在一些實施方案中，方法包括利用核心大模塊和選自El模塊、E3模塊或E4模塊的一或多個腺病毒基因模塊組裝核酸。腺病毒是一種在細胞核內進行複製的無包膜二十面體病毒。本文提供的腺病毒基因模塊是指腺病毒基因組中的某些位點，象例如Davison et al., Journal of GeneralVirology, (2003)，84 ，28695-2938中描述的。在一些實施方案中，腺病毒基因模塊來源於人腺病毒。圖5是人Ad5的簡圖，顯示了本文提供的腺病毒基因模塊和它們的以kb計量的大概大小。每個模塊可能編碼多重基因產物和替代的基因剪接排列。「E1模塊」用於本文是含有腺病毒反向末端重複(ITR)的核酸。El模塊可能另外包含與組裝成的核酸的蛋白編碼區可操縱連接的啟動子。El模塊一般來源於腺病毒ElA和/或ElB區域。除了 ITR區域，El模塊可以還含有從腺病毒基因組的El末端到病毒聚合酶編碼區的任何病毒基因(在下文中有討論)。例如，El模塊可以另外包含下述的編碼區:主要轉錄激活蛋白ElA (例如編碼pRB家族的失活蛋白)、E1B-19K (例如編碼細胞凋亡阻斷劑)、E1B55K(例如p53結合、mre結合和病毒mRNA輸出蛋白)和/或PIX(例如編碼次要結構蛋白和與病毒衣殼上的六鄰體相互作用的蛋白)。El模塊可能長大約4kb、3kb、2kb或lkb。在一些實施方案中，El模塊與自然界中發現的腺病毒的ElA和ElB區的長度大概相同(例如參見圖5)。「E2-L2」模塊用於本文是含有病毒DNA聚合酶編碼區和六鄰體蛋白編碼區中至少一個的核酸。在一些實施方案中，E2-L2模塊還包含病毒DNA結合蛋白編碼區。E2-L2模塊一般來源於腺病毒E2B的LI和/或L2區。E2-L2模塊可能另外包含下述的編碼區:E2BIVa2(例如編碼晚期轉錄激活蛋白和協助病毒DNA包裝到病毒衣殼中的蛋白)、E2B Pol (例如編碼病毒DNA聚合酶)、E2B pTP (例如編碼附著在病毒基因組末端，是病毒複製或包裝必需的末端蛋白)、L152K(例如編碼病毒DNA包裝到衣殼內所必需的蛋白)、LlIIIa(例如編碼幫助穩定衣殼的次要結構蛋白)、L2III(五鄰體(penton))(例如編碼形成纖維突起處的衣殼頂點的主要結構蛋白)、L2pVII (例如編碼與組蛋白H3有同源性並且與衣殼中的病毒DNA連接的核心結構蛋白)、L2V(例如編碼在DNA和病毒衣殼之間形成連接的核心結構蛋白)和L2pX(例如編碼結合併凝聚病毒基因組的核心結構蛋白)。在一些實施方案中，E2-L2模塊與自然界中發現的腺病毒的E2B、L1和L2區的長度大概相同(例如參見圖5)。「L3-L4」模塊用於本文是含有病毒DNA聚合酶編碼區和六鄰體蛋白編碼區中的至少一個的核酸。在一些實施方案中，L3-L4模塊可能還包含病毒DNA結合蛋白編碼區。在一些實施方案中，當E2-L2模塊含有病毒DNA聚合酶編碼區時，L3-L4不含有病毒DNA編碼區，反之亦然。同樣，當E2-L2模塊含有六鄰體蛋白編碼區時，L3-L4不含有六鄰體蛋白編碼區，反之亦然。同樣，當E2-L2模塊含有病毒DNA結合蛋白編碼區時，L3-L4不含有病毒DNA-結合蛋白編碼區，反之亦然。換句話說，病毒DNA聚合酶編碼區、六鄰體蛋白編碼區和病毒DNA結合蛋白編碼區一般在組裝好的核酸中只出現一次。L3-L4模塊還可能包含下述的編碼區:L3pVI (例如編碼在衣殼和病毒基因組DNA之間於頂點形成連接的次要結構蛋白)、L3II (六鄰體)(例如編碼形成衣殼三角形面的主要結構蛋白)、L323K(例如編碼對病毒蛋白進行加工從而完成衣殼組裝的病毒蛋白酶)、E2A DBP(例如，編碼與病毒DNA結合併協助複製的DNA結合蛋白)、L4100K(例如編碼抑制細胞蛋白的合成並促進病毒晚期蛋白翻譯的蛋白)、L433K(例如編碼促進晚期病毒基因的剪接的蛋白)、一或多個纖維蛋白和L422K (例如編碼促進晚期病毒基因表達並協助病毒DNA包裝的蛋白)。在一些實施方案中，L3-L4模塊與自然界中發現的腺病毒的L3、E2A和L4區的長度大概相同，或者與自然界中發現的腺病毒的L3、E2A、L4和L5區的長度大概相同(例如參見圖5)。「核心大模塊」(文中又稱為「E2-L4大模塊」)用於本文是指含有病毒DNA聚合酶編碼區和六鄰體蛋白編碼區中的至少一個的核酸。在一些實施方案中，核心大模塊還包含病毒DNA結合蛋白編碼區。在一些實施方案中，核心大模塊包含大多數病毒結構蛋白以及DNA複製和包裝所需要的蛋白。在一些實施方案中，模塊包含病毒DNA聚合酶編碼區、六鄰體蛋白編碼區和病毒DNA聚合酶編碼區。在其他實施方案中，核心可能還包含下述的編碼區:L3pVI (例如編碼在衣殼和病毒基因組DNA之間於頂點形成連接的次要結構蛋白)、L3II (六鄰體)(例如編碼形成衣殼三角面的主要結構蛋白)、L323K(例如編碼對病毒蛋白進行加工從而完成衣殼組裝的病毒蛋白酶)、E2ADBP (例如編碼與病毒DNA結合併協助複製的DNA結合蛋白)、L4100K(例如編碼抑制細胞蛋白的合成並促進病毒晚期蛋白翻譯的蛋白)、L433K(例如編碼促進晚期病毒基因的剪接的蛋白)、和L422K(例如編碼促進晚期病毒基因表達並協助病毒DNA包裝的蛋白)、E2B IVa2(例如編碼晚期轉錄激活蛋白和協助病毒DNA包裝到病毒衣殼中的蛋白)、E2B Pol (例如編碼病毒DNA聚合酶)、E2B pTP(例如編碼附著在病毒基因組末端，是病毒複製或包裝所必需的末端蛋白)、L152K(例如編碼將病毒DNA包裝到衣殼內所必需的蛋白)、LlIIIa(例如編碼幫助穩定衣殼的次要結構蛋白)、L2III (五鄰體)(例如編碼形成纖維突起處的衣殼頂點的主要結構蛋白)、L2pVII (例如編碼衣殼中與組蛋白H3有同源性並且與病毒DNA連接的核心結構蛋白)、L2V (例如編碼在DNA和病毒衣殼之間形成連接的核心結構蛋白)、一或多個纖維蛋白以及L2pX (例如編碼結合併凝聚病毒基因組的核心結構蛋白)。在一些實施方案中，L3-L4模塊與自然界中發現的腺病毒的E2B、L1、L2、L3、E2A和L4區的長度大概相同，或者與自然界中發現的腺病毒的E2B、L1、L2、L3、E2A、L4和L5區的長度大概相同(例如參見圖5)。病毒DNA聚合酶基因所編碼的蛋白含有的序列與SEQ ID NO: 32 (圖7A-C)中給出的人AdOTNA聚合酶或者來源於另外一個物種的同源物的胺基酸996-1103中至少50個連續(或者全部)胺基酸有至少45%(例如50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的同一性。六鄰體基因所編碼的蛋白含有的序列與SEQID N0:73(圖7D-G)中給出的人Ad5六鄰體或者來源於另外一個物種的同源物的胺基酸501-747中至少50個連 續(或者全部)胺基酸有至少45%(例如50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%)的同一性。病毒 DNA 結合蛋白基因所編碼的蛋白含有的序列與SEQ ID N0:103(圖7H-1)中給出的人AdOTNA結合蛋白或者來源於另外一個物種的同源物的胺基酸408-475中至少50個連續(或者全部)胺基酸有至少35% (例如 45%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%)的同一I"生。
「E4模塊」用於本文是含有腺病毒反向末端重複(ITR)的核酸。在一些實施方案中，E4另外包含一或多個纖維蛋白的編碼區。E4模塊可能還包含下述的編碼區:E4orf6/7(例如編碼介導病毒轉錄的E2F轉錄激活的蛋白)、E4orf6 (例如編碼促進病毒DNA的合成、穩定和輸出病毒晚期mRNAs，以及促進剪接的蛋白)、E4orf4(例如編碼調節病毒轉錄和剪接並且調製PP2A的蛋白)、E4orf3(例如編碼阻斷p53介導的轉錄、破壞MRNDNA修復複合體和防止環化的蛋白)、E4orf2和E4orfl (例如編碼促進經由PI3激酶進行的信號傳導，從而導致蛋白合成和細胞存活的蛋白)。在一些實施方案中，E4模塊與自然界中發現的腺病毒的E4區的長度大概相同，或者與自然界中發現的腺病毒的E4和L5區的長度大概相同(例如參見圖5)。「E3模塊」用於本文是含有一或多個纖維蛋白編碼區和/或腺病毒反向末端重複(ITR)的核酸。在一些實施方案中，E3模塊包含從pVIII的蛋白編碼區末端到位於基因組右端的ITR的任何已知腺病毒序列(如圖5所示)。pVIII編碼區是任何這樣的基因，所述基因編碼的蛋白含有的序列與SEQ ID:135中給出的人Ad5pVIII中胺基酸6-43(圖7J)中的至少50個連續(或者全部)胺基酸有至少35%(例如50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的同一性。E3模塊可能另外包含下述的編碼區:L4pVIII (例如編碼次要結構蛋白)E312.5K、E3CR1 α (例如編碼阻斷細胞凋亡的蛋白)、E3gpl9K(例如編碼抑制MHC-1抗原呈遞的免疫調節蛋白)、E3ADP (例如編碼具有有效裂解細胞以釋放病毒的功能的蛋白)、E3RID α (例如編碼去除細胞表面的促凋亡FasL和TRAIL的免疫調節蛋白)、E3RID β -(例如編碼去除細胞表面的促凋亡FasL和TRAIL的免疫調節蛋白)、E314.7K(例如編碼阻斷細胞凋亡的蛋白)和L5IV(Fiber)(例如，編碼從五鄰體基座伸出的負責受體結合的主要結構蛋白)。在一些實施方案中，E3模塊與自然界中發現的腺病毒的E3區的長度大概相同，或者與自然界中發現的腺病毒的E3和L5區的長度大概相同(例如參見圖5)。「E3-E4大模塊」用於本文是包含腺病毒反向末端重複(ITR)的核酸。E_3_E4大模塊可能還包含從PVIII的蛋白編碼區末端到位於基因組右端的ITR的任何已知腺病毒序列(如圖5所示)。E3-E4大模塊可能另外包含下述的編碼區:E4orf6/7 (例如編碼介導病毒轉錄的E2F轉錄激活的蛋白)、E4orf6 (例如編碼促進病毒DNA的合成、穩定和輸出病毒晚期mRNAs以及促進剪接的蛋白)、E4orf4(例如編碼調節病毒轉錄和剪接並且調製PP2A的蛋白)、E4orf3 (例如編碼阻斷p53介導的轉錄、破壞MRN DNA修復複合體和防止環化的蛋白)、E40rf2、E40rfI (例如編碼促進經由PI3激酶進行的信號傳導，從而導致蛋白合成和細胞存活的蛋白)、L4pVIII (例如編碼次要結構蛋白)、E312.5K、E3CR1 α (例如編碼阻斷細胞凋亡的蛋白)、E3gpl9K(例如編碼抑制MHC-1抗原呈遞的免疫調節蛋白)、E3ADP(例如編碼具有有效裂解細胞以釋放病毒的功能的蛋白)、E3RIDa (例如編碼去除細胞表面的促凋亡FasL和TRAIL的免疫調節蛋白)、E3RID β -(例如編碼去除細胞表面的促凋亡FasL和TRAIL的免疫調節蛋白)、Ε314.7Κ (例如編碼阻斷細胞凋亡的蛋白)和L5IV (Fiber)(例如，編碼從五鄰體基座伸出的負責受體結合的主要結構蛋白)。在一些實施方案中，一或多個腺病毒基因模塊相對腺病毒基因模塊所來源的天然腺病毒中發現的模塊序列(例如野生型)，包含一或多個突變(例如，核酸的取代、添加或缺失)。例如，本文提供的核酸可能編碼有效數量的腺病毒基因模塊，從而在某些細胞條件下，核酸轉染到細胞中時導致形成有複製能力的腺病毒。一或多個腺病毒基因模塊中的突變可能使得得到的腺病毒在一些細胞(例如，患病細胞，比如癌細胞)中能夠複製，而在其他細胞(例如，未患病細胞，比如健康細胞)中不複製。突變還可能包含一或多個蛋白編碼區的添加(例如添加一或多個外源或異源蛋白編碼區，比如非病毒蛋白編碼區)。一或多個蛋白的添加可能帶來額外的病毒功能、丟失病毒功能(例如複製)、提供病毒檢測方法(例如螢光標記物)、提供病毒純化方法(例如帶有His標籤的衣殼蛋白)或者提供能夠產生目標蛋白的病毒，所述蛋白隨後經分離和/或純化進一步使用。因此，突變可能增加了病毒功能或者減少了病毒功能。因此本文製備的重組腺病毒包括通過引入外源(例如異源)核酸或者改變天然核酸序列而被改造的腺病毒。所述改變可以是如上所述通過一或多個腺病毒基因模塊中的突變進行的，或者是通過將天然腺病毒基因組中存在的一或多個腺病毒基因模塊排除進行的。因此在一些實施方案中，核酸包括發生突變的腺病毒核酸序列。腺病毒核酸序列是在自然界或者天然腺病毒(例如野生型)中發現的序列。發生突變的腺病毒核酸序列可能是如上所述由一或多個腺病毒基因模塊中的突變造成的，或者是通過將天然腺病毒基因組中的一或多個腺病毒基因模塊排除得到的。在某些實施方案中，核酸包括發生缺失的腺病毒核酸序列、異常腺病毒核酸序列或者外源(例如異源)核酸序列(例如編碼非腺病毒基因產物)。發生突變的腺病毒核酸序列可能包括突變的E4-0RF3基因產物(帶來改變的功能)、突變的ElB-55k基因產物、突變的腺病毒纖維基因產物、突變的病毒外殼蛋白、前藥轉化酶、報告蛋白、突變的六鄰體蛋白、與PlX融合的蛋白、對某些細胞有毒性的蛋白、來自獲得核酸的類型以外的腺病毒的完整或部分纖維基因、和/或靶向蛋白(例如腫瘤靶向蛋白或者脈管靶向蛋白)。在一些實施方案中，核酸包含El模塊。核酸還可以包含El模塊和E4模塊。在某些實施方案中，核酸包含El模塊和E2-L2模塊。核酸還可以包含El模塊和L3-L4模塊。核酸還可以包含El模塊、E2-L2模塊和L3-L4模塊。在一些實施方案中，方法包括由選自El模塊、核心模塊、E3模塊和/或它們的衍生物或組分的至少三個腺病毒基因模塊組裝核酸。在相關實施方案中，例如對於人Ad5，方法包括由El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊組裝核酸。在某些實施方案中，形成的核酸至少長 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50kb。在一些實施方案中，形成的核酸至少長10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22kb。在一些實施方案中，形成的核酸至少長10、ll、12、13、14、15kb。在一些實施方案中，形成的核酸至少長10、ll、12kb。在一些實施方案中，形成的核酸至少長12kb。

由本文提供的方法形成的核酸可以是任何能夠表達的核酸。核酸可以被表達從而產生腺病毒。腺病毒可能是感染性的和/或可以自我複製的(例如複製型的)。在一些實施方案中，核酸是質粒。在一些實施方案中，組裝包括將腺病毒基因模塊(或大模塊)組合在一起形成核酸，其中腺病毒模塊或大模塊的方向有助於在導入細胞時形成有複製能力的腺病毒(例如能夠在細胞內表達或形成病毒)。因此，在一些實施方案中，腺病毒基因模塊(例如大模塊)被組裝成特定的取向。可以採用任何適合的克隆技術，包括例如所謂的「gateway」技術和/或不依賴序列和連接反應的克隆技術(「SLIC」)。Gateway技術或者類似的技術採用位點特異性重組將來自一條核酸的核酸(例如DNA)片段交換為另一個。最終結果是將一個核酸序列插入了目標載體或質粒。這些技術和方法在文中一起被稱為「位點特異性重組法」或者「 SSR方法」。在SSR方法的一個這樣的應用中，DNA片段被從入門載體轉移到目標載體中，其結果是目標載體的繁殖(圖9)。入門載體和目標載體一般含有重組位點。在一些實施方案中，入門載體是能夠重組型的。在其他實施方案中，入門載體是能夠雜交的。雜交型入門載體可能含有一或多個腺病毒基因模塊，這些模塊可以通過限制性酶切從入門載體中釋放出來，從而釋放出腺病毒基因模塊。本文提供了吸取了 gateway技術的SSR方法，可以將腺病毒基因模塊插入目標載體從而形成核酸(例如核酸質粒)。使用gateway技術的一般方法在例如 Sone et.al., J Biotechnol.(2008) SeplO; 136 (3-4): 113-2l>Hartley, et al., GenomeRes.(2000)，10，1788 - 1795 和 Sasaki, et al.，J.Biotechnol.(2004)，107，233 - 243 中有描述。例如，使用SSR方法時，組裝包括將重組型目標載體(例如包含重組位點核酸序列`的目標載體)和一或多個腺病毒基因模塊與整合酶(例如λ噬菌體整合酶、λ噬菌體切除酶或細菌宿主的整合因子)接觸，從而形成腺病毒基因模塊載體。所述一或多個腺病毒基因模塊是有重組能力的腺病毒基因模塊(例如包含重組位點核酸序列的腺病毒基因模塊)O在一些實施方案中，一或多個有重組能力的腺病毒基因模塊是通過給腺病毒基因模塊添加重組位點核酸序列，從而形成一或多個重組型腺病毒基因模塊。在其他實施方案中，一或多個有重組能力的腺病毒基因模塊是重組型入門載體的一部分。在一些實施方案中，含有一或多個腺病毒基因模塊的重組型入門載體是通過將一或多個有重組能力的腺病毒基因模塊和重組型供體載體與整合酶接觸形成，從而形成含有一或多個腺病毒基因模塊的重組型入門載體。因此，在一些實施方案中，重組型目標載體和含有一或多個腺病毒基因模塊的一或多個重組型入門載體與整合酶活性接觸，從而形成腺病毒基因模塊載體。圖20-21示意了本文提供的建立人Ad5的方法的實施方案。組裝包括將目標載體和各含有腺病毒基因模塊的一或多個入門載體與一或多個λ曬菌體整合酶、λ曬菌體切除酶或細菌宿主的整合因子組合，從而形成腺病毒基因模塊載體。在一些實施方案中，入門載體是通過給腺病毒基因模塊添加重組位點，然後將供體載體和一或多個λ噬菌體整合酶、λ噬菌體切除酶或細菌宿主的整合因子組合，從而形成腺病毒基因模塊入門載體。目標載體是腺病毒基因模塊與之連接的核酸，比如質粒。所述連接可能是通過含有要包含(插入)到目標載體中的腺病毒基因模塊的一或多個入門載體的交換進行的。在與重組型目標載體和一或多個腺病毒基因模塊與整合酶(例如整合酶、切除酶和/或宿主整合因子)接觸(例如組合)之前，目標載體中可能存在一或多個腺病毒基因模塊。重組位點核酸序列，文中又稱為「att」位點是協助兩個核酸之間進行體外位點特異性重組的核酸序列。在一些實施方案中，重組位點核酸序列大約長21bp。例如，重組位點核酸序列可能是gateway重組信號，比如圖10所示的和/或Sone et.al., J Biotechnol.(2008) SeplO;136(3-4):113-21;Hartley, et al., Genome Res.(2000)，10，1788 - 1795 和Sasaki, et al., J.Biotechnol.(2004), 107, 233 - 243 中給出的(例如 attB 位點、attL 位點、attR位點、attP位點、attBr位點、attPr位點等)。在一些實施方案中，一或多個有重組能力的腺病毒基因模塊形成供體載體的一部分(或者存在於供體載體中)。所述供體載體可以是與gateway技術或者相似類型的克隆技術相容的質粒。在一些實施方案中，DEST載體含有不同反選盒。反選盒是在某些條件下阻止細菌細胞生長的任何DNA片段。圖22描 述了本文提供的方法中使用的各種反選盒的效率。圖19詳細描述了利用多位點gateway策略，重組Ad5腺病毒基因模塊的原始方案。這個具體策略涉及四個入門載體的組合，其中三個是腺病毒基因模塊，第四個是無關的填充模塊。這四個模塊一經組合，即可通過gateway反應除去填充模塊從而形成目標載體。最後，通過gateway反應插入其餘兩個腺病毒基因模塊得到完整的病毒基因組。當gateway反應中使用的是較大的腺病毒基因模塊時，這個原始方案效率不高，並且存在Ad5El模塊帶來的毒性問題。組合方法(例如SLIC和SSR方法)使得更容易由模塊組裝基因組(例如，進行的步驟更少，每個步驟效率更高)。SLIC技術通過依靠兩個核酸(例如DNA片段)中由外切核酸酶生成的單鏈核酸(例如DNA)突出，進行了單鏈同源序列的退火(圖16)。因此，SLIC技術採用依靠在插入核酸(例如DNA)和目標載體中由外切核酸酶生成的單鏈核酸(例如DNA)突出進行的同源重組和單鏈退火(例如雜交)。本文提供的方法採用SLIC技術將腺病毒基因模塊插入到目標載體中從而形成核酸(例如核酸質粒)。這個過程在文中還被稱為AdSlic或AdSlicR。例如 Li et al., Nature Methods (2007)，4，251-256 中描述了使用 SLIC 技術的一般方法。圖25示意了給人Ad5建立的AdSlicR的例子。圖26詳細描述了 AdSlicR方法中反應的效率。例如，使用SLIC技術(或類似的克隆技術)的情況中，組裝包括將(例如每個末端)帶有單鏈核酸(例如DNA)突出的可雜交型目標載體(例如目標載體(例如線性載體))與一或多個腺病毒基因模塊進行雜交(例如退火)，從而形成腺病毒基因模塊載體。所述可雜交型目標載體在文中還可以被稱為SLIC型載體。所述一或多個腺病毒基因模塊可以是可雜交型腺病毒基因模塊(例如，這樣的腺病毒基因模塊(例如，線性腺病毒基因模塊)，所述模塊(在例如每個末端)帶有至少一個單鏈核酸(例如DNA)突出能夠有效地與目標載體上的單鏈核酸(例如DNA)突出互補，從而協助(在例如嚴緊條件下)雜交)。在一些實施方案中，目標載體突出和腺病毒基因模塊突出各種長大約20到25bp。可雜交型目標載體可以利用任何合適的方法形成。例如，在一些實施方案中，當目標載體是環形的(例如質粒)，將目標載體(例如利用內切核酸酶)切割形成線性目標載體。任何將線性目標載體與外切核酸酶(即具有外切核酸酶活性的酶，比如T4DNA聚合酶)接觸，從而形成可雜交型目標載體。類似地，可以通過將腺病毒基因模塊與外切核酸酶接觸(例如處理)而形成可雜交型腺病毒基因模塊。在一些實施方案中，可雜交型目標載體與一或多個腺病毒基因模塊的雜交可能包括將可雜交型目標載體和腺病毒基因模塊與DNA聚合酶合併在一起。在一些實施方案中，當腺病毒基因模塊是環形或者包含在環形質粒中時，在外切核酸酶處理前通過內切核酸酶將腺病毒基因模塊線性化。因此，在一些實施方案中，一或多個可雜交型腺病毒基因模塊是通過將包含一或多個入門載體腺病毒基因模塊的入門載體與內切核酸酶接觸，從而形成一或多個釋放出來的入門載體腺病毒基因模塊。所述一或多個釋放出來的入門載體腺病毒基因模塊可以與外切核酸酶接觸，從而形成一或多個可雜交型腺病毒基因模塊。文中提到的入門載體腺病毒基因模塊是作為入門載體的一部分的腺病毒基因模塊。文中提到的釋放出來的入門載體腺病毒基因模塊是由例如限制性內切酶從入門載體上釋放出來的腺病毒基因模塊。在一些實施方案中，腺病毒基因模塊不是環形的(例如通過PCR或基因合成獲得的)，不需要在外切核酸酶處理前進行線性化。在一些實施方案中，將SLIC型載體與一或多個腺病毒基因模塊進行退火可能包括將SLIC型載體和腺病毒基因模塊與DNA聚合酶組合。在一些實施方案中，SLIC型載體在與SLIC型腺病毒基因模塊退火前，含有一或多個腺病毒基因模塊。因此在一些實施方案中，可以順序進行多重SLIC反應來插入多重腺病毒基因模塊。在一些實施方案中，為了獲得處於質粒中的腺病毒基因組以便作為產生腺病毒基因模塊的模板，可以利用SLIC將整個腺病毒基因組插入質粒骨架。在一些實施方案中，SLIC型腺病毒基因組是從純化的病毒保藏物中獲得的。圖30示意了這一過程的一個實施方案，並提供了人Ad5的例子。腺病毒基因模塊載體是含有至少一個腺病毒基因模塊的核酸。利用合適的克隆技術，給目標載體添加所需數量的 腺病毒基因模塊，從而形成腺病毒基因模塊載體。例如，一旦形成後，可以利用合適的克隆技術(例如gateway克隆技術和/或SLIC克隆技術)進一步改造腺病毒基因模塊(例如腺病毒基因模塊載體)，以便加入更多腺病毒基因模塊，從而形成核酸，後者即可(在例如細胞內)被表達形成腺病毒(例如可以複製的腺病毒)。因此，在一些實施方案中，可以利用合適的克隆技術將第一個腺病毒基因模塊進一步改造形成第二個、第三個和/或第四個腺病毒模塊，其中分別向載體添加了第二、第三和/或第四腺病毒基因模塊，從而形成了核酸，核酸經表達形成腺病毒(例如可複製的腺病毒)。因此在一些實施方案中，核酸是腺病毒基因模塊載體。的確，可以使用不同的克隆技術來組裝核酸或腺病毒基因模塊載體。在一些實施方案中，組裝包括將可雜交型目標載體與第一腺病毒基因模塊雜交(例如退火)從而形成第一腺病毒基因模塊載體。第一腺病毒基因模塊可能是可雜交型腺病毒基因模塊。第一腺病毒基因模塊載體可以和第二腺病毒基因模塊入門載體與整合酶(例如整合酶、切除酶或者宿主整合因子)進行接觸(例如合併)，從而形成第二腺病毒基因模塊載體。第二腺病毒基因模塊載體可能是可重組型第二腺病毒基因模塊載體(例如目標載體)，第二腺病毒基因模塊可能是可重組型第二腺病毒基因模塊。在一些實施方案中，第一腺病毒基因模塊是E2-L2模塊、L3-L4模塊或者E2-L4大模塊。第二腺病毒基因模塊可以是El模塊、E3模塊或者E4模塊。圖20-21提供了聯合使用克隆方法來組裝腺病毒基因模塊的例子，其中聯用了 SLIC和 gateway。在其他實施方案中，組裝包括將可重組型目標載體和第一腺病毒基因模塊與(在有)整合酶(例如，整合酶、切除酶或者宿主整合因子)進行接觸(例如合併)，從而形成第一腺病毒基因模塊載體。第一腺病毒基因模塊是可重組型第一腺病毒基因模塊(例如入門載體)。第一腺病毒基因模塊載體與第二腺病毒基因模塊雜交，從而形成第二腺病毒基因模塊載體。第一腺病毒基因模塊載體是可雜交型腺病毒基因模塊載體(例如目標載體)。第二腺病毒基因模塊是可雜交型腺病毒基因模塊(例如入門載體)。在一些實施方案中，第二腺病毒基因模塊是E2-L2模塊、L3-L4模塊或者E2-L4大模塊。第一腺病毒基因模塊可以是El模塊、E3模塊或者E4模塊。在一些實施方案中(例如人Ad5的例子中)，E2-L2模塊和L3-L4模塊分別大約14kb和10kb。文中提供的一個發現是E2-L2和L3-L4模塊的大小太大，在一些實施方案中利用標準或者gateway (例如多位點gateway)克隆技術不能有效地組裝為核酸。圖15中提供了例子。因此在一些實施方案中，SLIC克隆技術(或類似的克隆技術)被用來將這些模塊插入到目標載體(例如入門載體)中。利用例如gateway克隆技術添加其他腺病毒基因模塊。因此在一些實施方案中，當E2-L2模塊和L3-L4模塊被組裝為核酸時，優選聯用SLIC和gateway (例如多位點gateway)克隆策略來組裝核酸。圖20-21中給出了 SLIC和gateway (例如多位點gateway)克隆策略聯用的特定實施方案。本文提供的方法的某些實施方案實現了快速有效的腺病毒基因組構建體的組裝。一些情況中，腺病毒基因組構建體在不到10、9、8、7、6、5、4、3、2或者I個小時內即可組裝好。本文提供的方法還使得可以進行腺病毒片段到載體的插入、在個別載體內進行的簡單獨立突變、和/或多位點特異性體外組裝。如下文所述，在一些實施方案中，一個或全部腺病毒基因模塊可能選自重組腺病毒基因模塊庫。因此，Adsembly過程的某些實施方案能夠快速有效地構建多種重組腺病毒，從而可以根據腺病毒基因模塊的最佳組合快速優化定製腺病毒的功能性。因此方法提供了通過將來自各種腺病毒血清型的部分進行混合和匹配以製備新的腺病毒血清型嵌合體的能力。這使得不僅能將每個血清型的獨特屬性結合在一起，而且能夠利用到血清型的不同向性以及避開對流行血清型已有的免疫能力的可能性。本文提 供的方法的某些實施方案避免了對有限的限制酶位點克隆技術的依賴性。方法還可以避開對腺病毒血清型5的單一依賴性。確實在人Ad5的例子中，當採用了 El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊所有5種模塊時，相對以前的已知方法突變體選擇顯著增加。在某些實施方案中，本文提供的方法能夠在基因組中同時形成複合的變化。所述方法還可能避開以前的單一依賴在專門化細菌菌株或哺乳動物細胞培養物(例如MAGIC)中經常需要幾個月進行低效同源重組的已知基因組組裝方式。而且，本文提供的方法的某些實施方案給出了簡單的試驗方案，只需常見試劑而無需使用專門的細菌(例如ccdB抗性)。本文提供的方法和文庫的用途包括例如:(I)為了基因功能分析而進行的腺病毒基因的突變，(2)獲得腺病毒突變體，其中腺病毒基因功能的丟失使它們不能在正常細胞內複製，但在能夠補充其功能的腫瘤細胞中可以選擇性地發生裂解性複製。(3)靶向基因表達，作為複製缺陷型載體或者可複製型病毒。(4)方法可以提供用於基因表達的新的複製缺陷型腺病毒。可以將利用文中所述方法組裝的腺病毒為了這個目的進行優化。在人Ad5的情況中，El模塊文庫可能包括例如多個ElA或ElB缺失的模塊和/或每個含有不同的哺乳動物啟動子從而允許使用者能夠選擇最佳啟動子來表達目的基因。(5)利用已有的腺病毒基因組轉錄構架進行多基因表達。在El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊中每一種都運用了的實施方案中，只有E4模塊中不存在突變。可以利用任何適宜的方法(例如PCR技術或者基因合成)，從任何合適的腺病毒獲得El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊以及它們的大模塊。例如，可以用從純化病毒獲得的病毒基因組DNA進行PCR(圖14)。圖13詳細描述了人Ad5腺病毒基因模塊的PCR效率。在一些實施方案中，El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊和E4模塊的組合構成了或者它們的大模塊構成了完整的或者基本完整的腺病毒基因組。利用文中提供的教導，本領域技術人員可以確定模塊之間中斷處的確切位置。例如，可以利用生物信息學手段確定重組位點核酸序列(例如，gateway重組信號或者gateway重組位點)的最佳插入位點。可以將多個腺病毒血清型進行比對，並在腺病毒基因模塊之間進行基因組區域的保守性分析。在一些實施方案中，避開了血清型之間的核苷酸保守區，而簡併區域是可以接受的插入位點。例如，圖12、圖35、圖36、圖37和圖38中箭頭指示了人Ad5中某些適宜的重組位點核酸序列的插入位點。在一些實施方案中，腺病毒基因模塊之間的序列可能較短，因此需要序列的重複。圖12提供了一個例子，其中由於Ad5纖維蛋白polyA和E4polyA之間的序列短,與attB位點插入一起插入了一個27bp的Ad5序列重複。在一些實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含一或多個重組位點核酸序列。圖35-39中公開了一些例子，但這些例子不是意圖限制重組位點核酸序列在重組腺病毒中的核酸序列位置如何影響重組腺病毒的生長速率。因此在一些實施方案中，包含一或多個重組位點核酸序列(例如att位點)的重組腺病毒可能比沒有一或多個重組位點核酸序列的重組腺病毒生長地慢。在其他實施方案中，包含一或多個重組位點核酸序列(例如att位點)的重組腺病毒可能與沒有一或多個重組位點核酸序列的重組腺病毒生長地至少一樣快。在其他實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含位於E3模塊和E4模塊之間的重組位點核酸序列。在一些實施方案中，E3模塊和E4模塊之間的重組位點核酸序列是attB3重組位點核酸序列。在一些實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含位於如SEQ ID NO: 137中給出的核苷酸32904之後的或者位於所述序列同源物中的等同核苷酸之後的重組位點核酸序列。在其他實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含位於El模塊和E2-L2模塊之間的重組位點核酸序列。在其他實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含位於如SEQ ID NO: 137中給出的核苷酸4035之後的或者位於所述序列同源物中的等同核苷酸之後的重組位點核酸序列。在其他實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含位於如SEQ ID NO: 137中給出的核苷酸3608之後的或者位於所述序列同源物中的等同核苷酸之後的重組位點核酸序列。在一些實施方案中，核酸(例如腺病毒基因模塊載體)包含位於L3-L4模塊和E3模塊之間的重組位點核酸序列。在一些實施方案中，L3-L4模塊和E3模塊之間的重組位點核酸序列是attB5重組位點核酸序列。在其他實施方案中，核酸(例如腺病毒 基因模塊載體)包含位於El模塊和E2模塊之間的第一重組位點核酸序列、L3-L4模塊和E3模塊之間的第二重組位點核酸序列、E3模塊和E4模塊之間的第三重組位點核酸序列。在其他實施方案中，第一重組位點核酸序列包含在核酸中如SEQ ID NO: 137中給出的核苷酸4035之後或者所述序列的同源物中等同核苷酸之後，第三重組位點核酸序列包含在核酸中如SEQ ID NO: 137給出的核苷酸32904之後或者所述序列同源物中等同核苷酸之後。以下列出的插入策略的例子顯示了 Ad5基因組(SEQ ID NO: 137)中的四個插入。數字表示已公開的Ad5基因組序列中重組位點核酸序列插入所位於的核苷酸位點。在以下例子中，attB序列(即重組位點核酸序列)帶有下劃線，最後一個插入的Ad5序列重複顯示為粗體。本領域技術人員很容易識別相似情景中或者同源病毒序列中合適的和/或等同的插入位點。4075 和 4076 之間的:CAACTTTTCTATACAAAGTTGTA17959 和 17960 之間的:CAACTTTTTAATACAAAGTTG27173 和 27174 之間的:TCAACTTTGTATACAAAAGTTGTG32815 和 32816 之間的:ACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTGAATCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTG圖21中的組裝策略被使用17次來產生感染性人Ad5病毒。圖24詳細描述了本文提供的方法的效率。在四·個獨立情景中，野生型Adsembled腺病毒被轉染至細胞內，產生了病毒。此外，該實驗方案生成了 13個突變體腺病毒，全部能夠產生感染性病毒。圖27提供了由轉染重組裝得到的表現為單個噬菌斑並且在293細胞上進行了傳代的野生型Ad5的圖像。由圖20-21和圖25中的策略產生的病毒在293細胞中測試了複製效率，如圖28所
/Jn ο另一方面，提供了通過本文公開的方法製備的腺病毒。在一些實施方案中，腺病毒是可複製型的。在另一個實施方案中，腺病毒不是可複製型的。I1.腺病毒基因模塊和大模塊文庫另一方面，提供了包含複數個腺病毒基因模塊(例如大模塊)的文庫。在一些實施方案中，文庫包含複數個不同El模塊。在其他實施方案中，文庫包含複數個不同E2-L2模塊。在其他實施方案中，文庫包含複數個不同L3-L4模塊。在其他實施方案中，文庫包含複數個不同E3模塊。在其他實施方案中，文庫包含複數個不同E4模塊。在其他實施方案中，文庫包含複數個不同核心大模塊。在一些實施方案中，根據以上描述的方法製備了腺病毒基因組文庫。在其他實施方案中，文庫包含複數個不同El模塊、複數個不同E2-L2模塊、複數個不同L3-L4模塊、複數個不同E3模塊、複數個不同E4模塊和/或複數個不同核心大模塊。在一些實施方案中，文庫包含複數個不同大模塊，其中所述大模塊包含複數個不同E1-L2大模塊、複數個不同E2-L4大模塊(即核心大模塊)和/或複數個不同E3-E4大模塊。在一些實施方案中，複數個不同腺病毒基因模塊和/或大模塊區別在於它們來源於不同的腺病毒類型(例如不同種或者不同血清型)。例如，在一些實施方案中，複數個不同El模塊、複數個不同E2-L2模塊、複數個不同L3-L4模塊、複數個不同E3模塊、複數個不同E4模塊和/或複數個不同大模塊(例如核心大模塊)包含來自複數個腺病毒類型(例如一個以上人腺病毒血清型)的腺病毒基因模塊。在一些實施方案中，複數個不同腺病毒基因模塊和/或大模塊區別在於它們編碼不同的突變體模塊或大模塊(例如缺失的腺病毒核酸序列、取代的腺病毒核酸序列、異常的腺病毒核酸序列或者編碼非腺病毒基因產物的核酸序列)。例如，文庫可能包含複數個不同的El模塊、複數個不同的E2-L2模塊、複數個不同的L3-L4模塊、複數個不同的E3模塊、複數個不同的E4模塊或者複數個不同的大模塊(例如核心大模塊)，所述模塊包含缺失的腺病毒核酸序列、突變的腺病毒核酸序列、異常腺病毒核酸序列或者編碼非腺病毒基因產物的核酸序列。在一些實施方案中，複數個不同的腺病毒基因模塊和/或大模塊是可重組型的(例如，包含在入門載體中)。例如，文庫可以包含可重組型的複數個不同的El模塊、複數個不同的E2-L2模塊、複數個不同的L3-L4模塊、複數個不同的E3模塊、複數個不同的E4模塊和/或複數個不同的E2-L4大模塊。在一些實施方案中，複數個不同的腺病毒基因模塊和/或大模塊是可雜交型的(例如比如線性化後是SLIC型的)。例如，在一些實施方案中，文庫包含可雜交型的複數個不同的El模塊、複數個不同的E2-L2模塊、複數個不同的L3-L4模塊、複數個不同的E3模塊、複數個不同的E4模塊和/或複數個不同的E2-L4大模塊。

本文提供的文庫的部分可以由不同使用者製備，在不同使用者之間共享。可以將各種腺病毒基因模塊混合和匹配構建具有所需功能或者沒有某功能的新的腺病毒構建體。因此本文的方法和文庫提供了通過將來自各種腺病毒血清型的部分進行混合和匹配以製備新的腺病毒血清型嵌合體的能力。腺病毒基因模塊文庫給使用者提供了構建理想腺病毒載體的多項選擇。在一些實施方案中，腺病毒基因模塊可能對細菌是有毒的。例如，圖18顯示了人Ad5El模塊的毒性。在一些實施方案中,可能需要將腺病毒基因模塊包含在以低拷貝數維持的質粒中(例如P15A複製原點)。在一些實施方案中，腺病毒基因模塊毒性、大小或者其他因素可能會妨礙它們在SSR方法(例如gateway反應)中的用途。例如，圖15詳細描述了 5個人Ad5腺病毒基因模塊的標準gateway BP反應效率。在一些實施方案中，使用SSR方法(例如gateway反應)效率低的腺病毒基因模塊可以通過替代的克隆方法(例如SLIC)來操作。圖17示意了用SLIC代替SSR方法(例如利用gateway克隆酶)來製備入門載體的策略。II1.試劑盒另一方面，提供了供本文描述的方法和文庫使用的試劑盒，所述試劑盒包含含有選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊或者腺病毒大模塊(或者如下所述的它們的突變體)的兩個或更多個腺病毒基因模塊的核酸。試劑盒的合適成分包括以上I和/或II部分中討論過的組合物和成分。例如在一些實施方案中，試劑盒可能包含核酸，所述核酸含有選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、E4模塊或者腺病毒大模塊中的3、4或5個腺病毒基因模塊。正如上文討論過的,核酸可能構成載體(例如質粒)(例如目標載體或供體載體)的一部分。在一些方面中，本文提供的試劑盒可能包含帶有或者沒有腺病毒基因模塊的載體。可用於試劑盒的載體可能包含一或多個重組位點核酸序列和/或單鏈核酸突出(或者在與合適的酶接觸時能夠形成單鏈核酸突出的核酸序列)。在一些實施方案中，載體是如上所述的可雜交型的目標載體、SLIC型載體或者供體載體。載體可以包含一或多個腺病毒基因模塊。在一些實施方案中，載體中包含反選盒。參考本文對Adsembly方法和文庫的描述，用於實施本文提供的方法的試劑盒的其他成分是顯而易見的(例如外切核酸酶、整合酶、啟動子序列等)。IV.實施例以下實施例僅供闡釋而非限制要求保護的發明。A.病毒組裝方法1.「組合」化學和「重組」病毒基因組以開發新一代病毒載體和複製裂解性癌症療法我們開發了由組成部分快速離體組裝病毒基因組的新的重組策略，從而能夠對多重修飾和異源元件進行系統地組合。腺病毒載體的多種應用潛能受限於快速和系統地改造和組合多重基因修飾的能力。當前使用的方法主要依賴於基因組中在合適位置上存在的獨特的合適限制酶位點，一般來說不適合系統地使用或者不能在快速的單一步驟中生成準確的複合修飾。大基因組DNA片段的操作和缺乏獨特的限制位點使這種方法有技術上的難度和受到限制。另一種方法需要生成帶有要改造基因組區域的小「穿梭」載體，和帶有病毒基因組的「骨架」載體。對這些載體來說主要限速步驟是重組，所述重組或者是在哺乳動物細胞內通過同源重組發生的(概率非常小的事件，發生在隨機位點，需要進行多輪噬菌斑純化來分離所需的重組體)，或者是在特殊的細菌菌株中通過同源重組發生的。這些方法有它們的局限性。

為了克服目前技術的局限性，我們開發了新的腺病毒基因組組裝策略，使得能夠快速和系統地過夜生成複合病毒突變體。這樣可以省略在哺乳動物細胞內進行的低效不準確重組、對BACs或穿梭載體的需要、費時費力的噬菌斑純化。這個策略提供了由組成部分快速體外組裝新的病毒基因組的能力，包括:1)對病毒基因的多重突變/修飾；2)來自其他病毒亞型的基因(例如結合不同受體的病毒外殼蛋白)，和改變血清型；3)異常基因，例如前藥轉化酶以便誘發強力的腫瘤旁觀者效應；4)添加螢光報告物或標籤用於體內造影和診斷，以及5)定向體外病毒進化。此外，這項技術利用了天然的病毒轉錄構架，對於人Ad5它編碼了 36個基因(不包括剪接變體)，因此多蛋白複合體和整個途徑可以經由腺病毒感染來組裝、遞送和共表達。為了克服Ad2/5和目前的方法學的局限，我們開發了 Adsembly方法，使得能夠體外由基因組組成部分和異源元件快速離體組裝腺病毒基因組。利用生物信息學手段，我們根據進化保守序列、轉錄和功能模塊，將不同腺病毒基因組(36-38kb)分為5個單位。這5個單位的每一個包含基因組構成成分文庫的相容部分，通過突變或異源元件的加入可以改變它們的功能和多樣性，並且這些功能和多樣性可以通過添加來自完全不同的腺病毒血清型、突變體和種的等同單位進一步擴展。為了製備具有獨特性能的新腺病毒，從文庫中選擇每個單位各一個，利用Adsembly (例如Ad-SlicR)快速體外重新組裝成完整基因組。可以利用Adsembly通過多位點特異性重組來組裝新的基因組，所述基因組在轉染後，即從質粒骨架上自我剪接並複製產生新的病毒。可以利用Ad-SlicR策略除去插入的重組序列以便實現更強力的病毒複製(如果需要)和臨床應用。本文公開的策略可以使用基因組構成元件文庫，所述文庫是由具有不同Ad2/5向性和其他所需特性的人和/或動物腺病毒製備的或者已經經過基因改造被賦予了改變的功能性。為了實現這一目的，我們利用了經過修飾，特異性和效率得以提高的噬菌體位點特異性重組系統，又被稱為Gateway 。被命名為attB、attP、attL和attR的四類重組位點經由不同噬菌體酶進行重組。最近鑑定到了新的att位點特異性，可以允許多個DNA片段以一定的順序和方向進行同時重組。本文公開的是該系統的新應用，即由基因組組成部分離體組裝整個病毒基因組。令人驚訝的是這項技術革新了腺病毒載體的建立和潛在應用。使用引入了獨特attB位點(編號1-6)對的引物組來擴增與之匹配的相鄰病毒基因組。Ad5腺病毒基因組長36kb，暫時劃分為「早期」(E)和「晚期」(L)轉錄單位，它們共同編碼36-40個基因。野生型Ad5/2、Ad5/2的突變體和完全不同的腺病毒亞型或動物病毒被用做DNA模板。將PCR片段重組到「入門」載體中生成含有腺病毒基因組組成元件的文庫。LR重組到目標載體中使得個體元件多種排列組裝成新的病毒基因組(圖1B)。通過對目標載體的抗生素抗性進行的陽性選擇和對大腸桿菌中未反應目標載體進行的陰性選擇(毒性基因ccdB提供的(Hartley et al.，2000))來協助這一過程。對於片段的數量或大小限制了重組效率的情況，製備了中間目標載體，其中的第二 BP/LR反應中發生modular replacement或者完全組裝。該快速病毒DNA操作新方法通過利用DNA重組的固有化學屬性改變了新病毒的工程化過程。還引入 了其他組合，例如，腺病毒34纖維蛋白，該蛋白與CD46細胞受體結合，能夠規避針對Ad2/5病毒產生的中和抗體。2.材料與方法採用以上指導方針，用以下參照成分製備了經過改造的腺病毒。使用了 GatewayDONR載體。在人Ad5的例子中，經PCR獲得El模塊並利用SLIC插入載體pDONR P1P4。利用PCR擴增包含attLl和attL4重組位點的pDONR P1P4載體骨架，並通過SLIC與Ad5El模塊組合。為了製備替代的反選盒，對載體pDONR P1P4進行了改造。包含attPl和attP4重組位點的該載體骨架利用PCR擴增，並與PheSA294(:突變和四環素抗性盒(來自pENTR L3-pLac-Tet-L2的pLac-Tet盒)組合形成新的DONR載體。然後經PCR擴增新DONR 載體中的 attRl-PheSA294G-Tet (r) _attR4 片段，並插入到 Adsembly DEST 載體中。參見「MultiSite Gateway Pro Plus」，Cat#12537-100 和 Sone, T.et al.J Biotechnol.2008S印10;136(3-4):113—21。在人Ad5的例子中，E3模塊經gateway BP反應插入pDONR P5P3r載體。E4模塊經gateway BP 反應插入 pDONR P3P2 載體。來自 pDONR P5P2 載體的 attR5-ccdB_Cm(r) _attR2片段經 PCR 擴增，插入 Adsembly DEST 載體中。參見 「MultiSite Gateway ProPlus」，Cat#12537-100;and Sone,T.et al.JBiotechnol.2008S印10;136 (3-4):113-21。用於Adsembly DEST載體的載體骨架是由來自三個不同來源的部分構成的。Amp (r)盒和IacZ基因是從質粒pUC19擴增的。將它們與pl5A複製原點組合，所述複製原點來自質粒 pSB3K5_I52002 (BioBricksiGEM2007partsdistribution 的一部分)。使質粒保持在較低(10-12)拷貝數的pl5A ori是減少El毒性所需要的。最後，為了產生能夠自身切除的病毒，從pAdZ5-CV5-E3+質粒PCR 1-SceI酶的哺乳動物表達盒。將該盒克隆到載體骨架中形成被稱為P15A-Scel的載體。這是啟動基因組組裝所使用的載體。在Ad5的例子中，基因模塊全部得自由野生型Ad5病毒純化的DNA或者質粒pAd/CMV/V5/DEST (Invitrogen)。對於人Ad5例子中的DEST載體，將E2和L3模塊通過3片段SLIC插入質粒pl5A_SceI。旁側帶有attR5和attR2位點的表達ccdB的反選標記物和Chlor (r)通過PCR從質粒pDONR P5P2獲得。第二反選標記物(PheS-Tet)是經PCR從載體pDONRPlP4PheSA294G-Tet (見上文)獲得。將這兩個反選標記物用加在E2和L4模塊末端的獨特限制酶切割後，通過SLIC插入pl5A-SceI E2-L4的右側(ccdB/Cm)和左側(PheS/Tet)從而形成DEST載體。對於人Ad5的例子中含有腺病毒基因模塊的多位點gateway入門載體，將El模塊通過SLIC插入pDONR P1P4。E3模塊通過gateway BP反應插入pDONR P5P3R。E4模塊經gateway BP 反應插入 pDONR P3P2。

對於Amp (r)盒:質粒 pUC19、pl5A or1:質粒 pSB3K5_I52002 是 BioBricksiGEM2007parts distribution的一部分。腺病毒基因模塊或者是來自由Ad5毒粒純化的DNA 或者是質粒 pAd/CMV/V5/DEST (Invitrogen)。DONR 載體 pDONR P1P4、P5P2、P5P3R、P3P2來自Jon Chesnut (Invitrogen)。PheS基因來源於DH5alpha細菌基因組DNA,隨後通過Quickchange 形成 PheSA294G 突變體。對於 Tet (r)基因，質粒 pENTR L3-pLac_Tet_L2 來自JonChesnut(Invitrogen)。對於Adsembly方法的實施方案，將20fmol雙DEST載體(一般含有旁側帶有兩個反選盒的核心模塊)與其餘含有基因模塊的入門載體各IOfmol組合。在Ad5的例子中，這包括將20fmol E2-L3雙DEST載體與各IOfmol的El模塊入門載體、E3模塊入門載體和E4模塊入門載體組合。在一些情況中，增加一或多個入門載體的量可能提高效率(例如，給Ad5使用50fmolEl模塊入門載體)。將這些載體與2 μ I LR Clonase II (Invitrogen)在終體積10 μ I中組合。反應於25° C過夜(12-16小時)溫育。加入I μ I蛋白酶K(Invitrogen)並在37° C溫育10分鐘來終止反應。然後取5 μ I反應轉化至對ccdB基因產物敏感的高感受態細菌(>le9cfu/μ g)，並鋪在 YEG-Cl 瓊脂板(如 Kast，P.Gene, 138 (1994) 109-114 中所描述的使用PheSA294(:反選時)或者其他對於載體使用的反選來說合適的培養基上。對於PCRs，所有PCR均使用Phusion酶(NEB)進行。由Ad5獲得腺病毒基因模塊的PCR用Ix HF緩衝液、dNTP各200 μ Μ、引物各0.5 μ M和IOng模板進行。對於E2-L2模塊，還添加了 3%DMS0。模板是質粒 pAd/PL-DEST (Invitrogen;對於 E2-L2、L3-L4 和 E4 模塊)或者Ad5基因組DNA(對於El和E3模塊)。PCR條件如下。對於E2-L2和L3_L4:98。C30秒-98。ClO秒、65° C30秒(每2個循環降低1° C) ,72° C7分鐘，10個循環-98° ClO秒、60° C30秒、72° C8分鐘，29個循環-72° ClO分鐘-保持在4° C。對於E3:98° C30秒-98° ClO秒、70° C30秒(每個循環降低0.5° C)、72° C2分30秒，10個循環-98° ClO秒、68° C30秒、72° C2分30秒，25個循環-72° ClO分鐘-保持在4° C。對於E4:98° C30秒-98° ClO秒、63° C30秒(每個循環降低0.5° C)、72° C2分鐘，6個循環-98° ClO秒、60° C30秒、72° C2分鐘，29個循環-72° C5分鐘-保持在4° C。對於由純化的病毒獲得病毒基因組DNA，將最多100 μ I純化病毒加入300 μ I含有IOmM Tris pH8、5mM EDTA、200mM NaCl和0.2%SDS的裂解緩衝液。混合液於60。C溫育5分鐘，之後加入5 μ I蛋白酶K儲液( 20mg/mL)，在60° C繼續溫育I小時。然後將樣品置於冰上5分鐘，隨後於15K X g轉15分鐘。取上清液加入等體積的異丙醇、混合均勻，15K X g於4° C旋轉15分鐘。沉澱用70%乙醇洗滌，再次4° C旋轉15分鐘。將沉澱乾燥，重懸待用。對於SLIC，線性片段用外切核酸酶於室溫下在如下20μ I反應中處理20分鐘:50mM Tris pH8、10mM MgCl2、50 μ g/mL BSA、200mM 脲、5mM DTT 和 0.5μ1 T4DNA 聚合酶。加入I μ 10.5Μ EDTA並在75° C溫育20分鐘來終止反應。然後將等量的Τ4處理的DNA在新試管中混合至20 μ I。對於組合兩個片段的SLIC，每個反應各使用10 μ I。對於組合三個片段的SLIC，每個反應各使用7 μ I。通過加熱至65° ClO分鐘，然後每5秒降低0.5° C緩慢冷卻至25° C使片段退火。退火後，取5μ I反應進行轉化並篩選克隆。對於用於例如Ad5的AdSlicR，使用IOOng T4處理的pl5A_SceI (經PCR線性化)和各300ng的E2和L3模塊(由它們各自的入門載體經PCR獲得)進行3片段SLIC反應。這產生了載體 pl5A-SceI E2-L4。5μ g pl5A_SceI E2-L4 用 SwaI 切割並使用 QiagenQiaexII凝膠純化。E3和E4模塊由它們各自的入門載體經PCR獲得。將各個被線性化的載體(450ng)和PCR產物(200ng)用T4DNA聚合酶處理，用150_200ng載體和 IOOng各模塊PCR正常進行SLIC。分離陽性克隆，取5μ g新載體用PacI切割並凝膠純化，然後與ElPCR產物(IOOng T4處理過的)在新的SLIC反應中組合。基因組組裝至此完成，質粒可用於轉染來重建病毒。B.經過改造的腺病毒腺病毒常用於基因轉移的用途。例如，它們被用於將轉基因遞送給培養物中的細胞、體內動物組織或者對於基因治療遞送遞送給體內人類細胞。這種方式使用腺病毒的一個限制因素是基因表達只是暫時的。腺病毒是非整合型病毒，因此一旦發生細胞分裂就會丟失轉基因的表達。其他能夠發生整合的病毒系統，比如逆轉錄病毒和慢病毒，被用於同樣的基因轉移目的。但是，這些天然具有整合能力的病毒較小，因此限制了可以表達的轉基因的量，很難生長到高滴度，難以由它們表達多個轉基因，而且它們會整合到基因組中的隨機位置。已有試驗表明PhiC31整合酶可以介導含有 280bp attB序列的外來環形DNA整合到宿主細胞染色體中的特定位置，被稱為假性attP位點。已經使用環形質粒DNA展示了這個過程，但還沒有在諸如腺病毒的病毒中證明，可能是因為腺病毒基因組是線性的，因此或者不發生整合或者整合導致染色體斷裂。這裡我們提供了可以這樣形成重組腺病毒基因組的系統，所述系統在轉導後，基因組的一部分經由ere介導的1xP位點重組變成環形，從而使得可以通過PhiC31整合酶/attB進行定向整合。對於這項技術，以多種方式將腺病毒基因組進行了改造(參見圖31-33)。首先，刪除了 El和E3區以便表達多個轉基因。E4區被表達ere重組酶和PhiC31整合酶的盒代替。利用tet-反應性啟動子或其他類似的可調控元件來調節這些酶的表達。基因組中安置了兩個1xP位點，一個在El區的左端表達轉基因的地方，第二個位於纖維蛋白和E4區之間。因此位於兩個1xP位點之間的全部都被插入到細胞染色體中。最後，在E3區內安置PhiC31attB位點，雖然可以將 這個短序列安排在其他位置只要是位於1xP位點之間(雖然本實施例中ere重組酶和PhiC31整合酶是由含有1xP位點和轉基因的同一個腺病毒表達的，也可以由分開的病毒表達這些酶)。在腺病毒被轉導到細胞中時，ere重組酶和PhiC31整合酶被誘導。Cre協助腺病毒基因組中的1xP位點的重組。這導致位於1xP位點之間的DNA發生環化。然後這使得整合酶利用片段中的attB位點將環形片段重組到細胞染色體中(參見圖33)。最終的結果是腺病毒基因組中選定的一部分被穩定(非回復性)整合到宿主細胞染色體中有限的幾個位置之一。從這個整合片段穩定地表達轉基因。沒有腺病毒複製或復活的風險，因為1)E1區被刪除和2)在這個過程中病毒基因組的末端被刪除。這兩個區域是病毒轉錄和複製所必需的。該系統與現有逆轉錄病毒和慢病毒系統相比的優勢包括I)在基因組內數量有限的位置發生整合，而不是隨機整合，2)提高了轉基因表達允許的大小，3)通過纖維蛋白修飾(圖39-42)或者使用其他腺病毒血清型和種(圖45)將腺病毒重新導靶到特異細胞或組織的能力，4)使用Adsembly系統操作的簡易性，5)生產高滴度病毒的簡易性和6)由單一載體進行多基因表達的簡易性。該系統通過利用病毒介導的DNA遞送推進了目前的PhiC31整合技術(由LifeTechnologies以「 Jump-1n」產品線銷售)。現有技術只是基於質粒的，因此局限於可以被有效地轉染或電穿孔的細胞。而且不能體內使用除非生成特定的轉基因小鼠。腺病毒被常規用於體內遞送轉基因，因此極大地擴展了現有技術的能力。一個體現是利用多基因表達盒通過將改造過的腺病毒可滴定地和定向地遞送到特異組織中來產生小鼠模型。另一個體現是含有att位點以便進行靶向敲入的小鼠系。再一個體現是iPS。C.利用ADSEMBLY製備完整的近乎野生型腺病毒5型利用以下策略,使用Adsembly構建了 Ad5的近乎野生型版本。將側翼帶有gateway反選盒的野生型核心序列與野生型Ad5El模塊、野生型Ad5E3模塊和野生型Ad5E4模塊混合(圖21)。分離到含有完全組 裝好的基因組的克隆並轉染到293細胞中。7天後可以看到噬菌斑，收集病毒並在更多293細胞上擴增。生長分析顯示該近乎野生型的病毒(與真正的野生型病毒相比，它含有3個attB插入)達到的滴度只比真正的野生型病毒略低(圖28)。D.複製缺陷型突變體AD5的製備，所述突變體表達GFP，含有來自另外的血清型的纖維蛋白我們利用Adsembly製備了突變體Ad5。Ad5El模塊經過改變，其中的ElA和ElB區被缺失，因此使得任何用這個新載體製備的病毒都是複製缺陷型的。除去ElA和ElB後，插入了含有CMV IE啟動子和GFP基因的哺乳動物表達盒。Ad5E3模塊的改變是用來自Ad34的纖維蛋白基因代替Ad5纖維蛋白基因。將這些突變體El和E3-纖維蛋白模塊與側翼帶有gateway反選盒的野生型Ad5E4模塊和野生型Ad5核心模塊在標準Adsembly反應中組合(圖21)。分離到含有完全組裝好的基因組的克隆並轉染至293細胞中。7天後可以看到噬菌斑，收集病毒並在更多293細胞上擴增。該病毒的生長情況表明這一策略可以用於I)轉基因表達，2)螢光基因表達，3)複製缺陷型病毒構建體，4)製備嵌合腺病毒，和5)在Ad5背景中的替代的纖維蛋白表達。 E.利用ADSLICR製備可複製型AD5
利用AdSlicR由腺病毒基因模塊構建野生型Ad5。野生型E3和E4模塊從它們的腺病毒基因模塊載體經PCR獲得。將它們與SwaI切割的野生型Ad5核心模塊在標準SLIC反應中組合(圖25)。分離到成功含有核心模塊和E3和E4模塊的克隆並用PacI進行切害I]。然後將其與通過PCR從腺病毒基因模塊載體獲得的野生型Ad5El模塊在第二個SLIC反應中組合。分離到含有完全組裝好的基因組的克隆並轉染到293細胞中。到第7天有可見的噬菌斑。將得到的病毒在更多293細胞上進行擴增。對該病毒進行的生長分析顯示它與野生型Ad5可以生長到同樣的滴度(圖28)。V.表格表1-9公開了利用本文提供的方法製備的腺病毒基因模塊載體、目標載體和入門
載體的例子。
權利要求
1.製備重組腺病毒的方法，所述方法包括由選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、和E4模塊的三個或更多個腺病毒基因模塊組裝核酸。
2.如權利要求I所述的方法，其中所述核酸包含El模塊。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述核酸還包含E4模塊。
4.如權利要求2所述的方法，其中所述核酸還包含E2-L2模塊、L3-L4模塊，或者既有E2-L2模塊也有L3-L4模塊。
5.如權利要求I所述的方法，其中在組裝所述核酸之前，通過將三個或更多個腺病毒基因模塊中的兩個組合而形成大模塊。
6.如權利要求5所述的方法，其中大模塊是E2-L4大模塊。
7.如權利要求6所述的方法，其中該方法包括由所述E2-L4大模塊和選自El模塊、E3模塊、或E4模塊的一或多個腺病毒基因模塊組裝所述核酸。
8.如權利要求I所述的方法，其中該方法包括由選自El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E 3模塊、和E4模塊的至少四個腺病毒基因模塊組裝所述核酸。
9.如權利要求8所述的方法，該方法包括由El模塊、E2-L2模塊、L3-L4模塊、E3模塊、和E4模塊組裝所述核酸。
10.如權利要求8所述的方法，其中所述核酸至少12kb。
11.如權利要求I所述的方法，其中所述核酸包含缺失的腺病毒核酸序列、突變的腺病毒核酸序列、異常腺病毒核酸序列或者編碼非腺病毒基因產物的核酸序列。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述突變的腺病毒核酸序列編碼突變的E4-ORF3基因產物。
13.如權利要求11所述的方法，其中所述突變的腺病毒核酸序列編碼突變的ElB-55k基因產物。
14.如權利要求11所述的方法，其中所述突變的腺病毒核酸序列編碼突變的腺病毒纖維蛋白基因產物。
15.如權利要求11所述的方法，其中所述突變的腺病毒核酸序列編碼突變的病毒外殼蛋白。
16.如權利要求11所述的方法，其中所述異常腺病毒核酸序列編碼前藥轉化酶。
17.如權利要求11所述的方法，其中所述非腺病毒基因產物是報告蛋白。
18.如權利要求11所述的方法，其中所述非腺病毒基因產物是靶向蛋白。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述靶向蛋白是腫瘤靶向蛋白或者脈管系統靶向蛋白。
20.如權利要求I所述的方法，還包括轉錄所述核酸，從而形成重組腺病毒。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述重組腺病毒是可複製型的。
22.如權利要求20所述的方法，其中所述重組腺病毒是複製缺陷型的。
23.如權利要求I所述的方法，其中所述方法是在體外實施的。
24.如權利要求I所述的方法，其中所述組裝包括將可雜交型目標載體與一或多個可雜交型腺病毒基因模塊雜交，從而形成腺病毒基因模塊載體。
25.如權利要求24所述的方法，其中所述可雜交型目標載體的形成是通過 (i)切割目標載體從而形成線性目標載體，和(ii)將所述線性目標載體與外切核酸酶進行接觸從而形成可雜交型的目標載體。
26.如權利要求24所述的方法，其中所述一或多個可雜交型腺病毒基因模塊的形成是通過 (i)將包含一或多個入門載體腺病毒基因模塊的入門載體與外切核酸酶進行接觸，從而形成一或多個釋放出的入門載體腺病毒基因模塊，和 (ii)將一或多個釋放的入門載體腺病毒基因模塊與外切核酸酶進行接觸，從而形成一或多個可雜交型腺病毒基因模塊。
27.如權利要求I所述的方法，其中組裝包括將可重組型的目標載體和一或多個含有一或多個所述腺病毒基因模塊的可重組型入門載體與整合酶進行接觸，從而形成腺病毒基因模塊載體。
28.如權利要求27所述的方法，其中含有一或多個所述腺病毒基因模塊的所述可重組型入門載體的形成，是通過將一或多個可重組型腺病毒基因模塊和可重組型供體載體與整合酶進行接觸，從而形成含有一或多個所述腺病毒基因模塊的所述可重組型入門載體。
29.如權利要求I所述的方法，其中組裝包括 (i)將可雜交型目標載體與可雜交型第一腺病毒基因模塊雜交，從而形成第一腺病毒基因模塊載體；和 (ii)將所述第一腺病毒基因模塊載體和可重組型第二腺病毒基因模塊入門載體與整合酶進行接觸，從而形成第二腺病毒基因模塊載體。
30.如權利要求29所述的方法，其中所述第一腺病毒基因模塊是E2-L2模塊、L3-L4模塊、或E2-L4大模塊；第二腺病毒基因模塊是El模塊、E3模塊或E4模塊。
31.文庫，所述文庫包含複數個不同El模塊、複數個不同E2-L2模塊、複數個不同L3-L4模塊、複數個不同E3模塊、複數個不同E4模塊或者複數個不同E2-L4大模塊。
32.如權利要求31所述的文庫，其中所述複數個不同El模塊、所述複數個不同E2-L2模塊、所述複數個不同L3-L4模塊、所述複數個不同E3模塊、所述複數個不同E4模塊、或所述複數個不同E2-L4大模塊包含來自複數個腺病毒種的腺病毒基因模塊。
33.如權利要求32所述的文庫，其中所述複數個不同El模塊、所述複數個不同E2-L2模塊、所述複數個不同L3-L4模塊、所述複數個不同E3模塊、所述複數個不同E4模塊或所述複數個不同E2-L4大模塊包含來自一個以上人腺病毒血清型的腺病毒基因模塊。
34.如權利要求31所述的文庫，其中所述複數個不同El模塊、所述複數個不同E2-L2模塊、所述複數個不同L3-L4模塊、所述複數個不同E3模塊、所述複數個不同E4模塊或所述複數個不同E2-L4大模塊包含缺失的腺病毒核酸序列、取代的腺病毒核酸序列、異常腺病毒核酸序列、或者編碼非腺病毒基因產物的核酸序列。
35.如權利要求31所述的文庫，其中所述複數個不同El模塊、所述複數個不同E2-L2模塊、所述複數個不同L3-L4模塊、所述複數個不同E3模塊、所述複數個不同E4模塊或所述複數個不同E2-L4大模塊是可重組型的。
36.如權利要求31所述的文庫，其中所述複數個不同El模塊、所述複數個不同E2-L2模塊、所述複數個不同L3-L4模塊、所述複數個不同E3模塊、所述複數個不同E4模塊或所述複數個不同E2-L4大模塊是可雜交型的。
37.根據權利要求1-20中任一項所述方法製備的腺病毒基因組文庫。
全文摘要
本文提供了組裝改良腺病毒的方法、腺病毒基因模塊文庫和它們的組合物。
文檔編號C12N7/01GK103237889SQ201180050029
公開日2013年8月7日 申請日期2011年8月16日 優先權日2010年8月16日
發明者C.奧謝, C.鮑爾斯 申請人:薩克生物研究學院