使用表達gm-csf的痘病毒系統性治療轉移性癌和/或全身散布性癌的製作方法

2023-06-16 03:03:11 5

專利名稱：：使用表達gm-csf的痘病毒系統性治療轉移性癌和/或全身散布性癌的製作方法使用表達GM-CSF的痘病毒系統性治療轉移性癌和/或全身散布性癌本申請要求於2005年7月7日申請的序列號為60/714，679的美國臨時專利申請案的優先權，將其通過全文引入作為參考。
背景技術：
：I.發明領域本發明一般普遍涉及腫瘤學和病毒學領域。更特別地，本發明涉及表達GM-CSF的痘苗病毒以及它們在全身施用以治療癌中的用途。II.相關技術的描述正常組織的體內平衡是高度受調控的細胞增殖和細胞死亡的過程。細胞增殖或細胞死亡的失衡可以發展成癌性狀態(Solyanik等，1995;Stokke等，1997;M咖byandWalter,1991;Natoli等，1998;Magi-Galluzzi等，1998)。例如，子宮頸癌、腎癌、肺癌、胰腺癌、結腸直腸癌和腦癌僅僅是可以導致的許多癌中的一些實例。事實上，癌的發生率如此之高以致在美國每年有超過500000人由於癌而死亡。細胞增殖和細胞死亡的維持至少部分受原癌基因和腫瘤抑制基因的調控。原癌基因或腫瘤抑制基因可以編碼誘導細胞增殖的蛋白質(例如，sis、erbB、src、ras和myc)、抑制細胞增殖的蛋白質(例如，Rb、p16、p19、p21、p53、NF1和耵1)或調控程序化細胞死亡的蛋白質(例如bc卜2)(Ochi等，1998;Johnson和Hamdy,1998;Liebermann等，1998)。然而，這些原癌基因和腫瘤抑制基因的基因重排或突變導致原肽。通常，單個點突變足以實現轉化。例如，P53腫瘤抑制基因蛋白中的點突變導致野生型P53功能的完全喪失(Vogelstein和Kinzler，1992)。目前，僅有很少幾個有效選擇用於治療許多普通的癌類型。用於給定個體的療程取決於診斷、疾病已經發展到的階段以及一些因素例如患者的年齡、性別和一般健康狀態。癌症治療的最常規選擇是外科手術、放射療法和化學療法。外科手術在癌的診斷和治療中起核心作用。通常，需要外科手術途徑來用於生物活組織檢查和移除癌性生長。然而，如果癌已經轉移和擴散，外科手術將不可能達到治癒並且必須採取備選的方法。放射療法、化學療法以及免疫療法是癌的外科手術治療的備選方法(Mayer,1998;Ohara，1998;Ho等，1998)。放射療法涉及精確地耙向高能輻射以摧毀癌細胞並且4艮像外科手術，主要在治療非-轉移性、局部化的癌細胞中有效。放射療法的副作用報刊皮膚刺激、吞咽困難、口千、噁心、腹瀉、脫髮和疲乏無力(Curran，1998;Brizel，1998)。用抗癌藥物治療癌的化學療法是另一種模式的癌療法。給定的抗癌藥物療法的功效通常受限於實現藥物遞送貫穿實體瘤的難度(el-Kareh和Secomb，1997)。化學療法策略是基於腫瘤組織的生長，其中將抗癌藥物乾向快速分裂的癌細胞。大多數化療方法包括聯合多於一種的抗癌藥物，這已經證明能增加各種各樣的癌的應答率(美國專利5，824，348;5，633，016和5，798，339，將其通過引入作為參考)。化療藥物的一個主要副作用是它們也影響正常的組織細胞，最可能受影響的細胞是在一些情形中(例如骨髓、胃腸道、生殖系統和毛嚢)快速分裂的那些細胞。化療藥物的其它毒性副作用可以包括口腔潰瘍、吞咽困難、口乾、噁心、腹竭、嘔吐、疲勞、出血、脫髮和感染。免疫療法是癌研究中一個快速m的領域，是治療某些類型的癌的又一個選擇。理論上，可以刺激免疫系統以將腫瘤細胞識別為外來物並靶向它們將其摧毀。不幸地是，響應通常不足以防止大多數腫瘤生長。然而，最i^JC展增強或補足免疫系統的天然防禦機制的方法已經成為免疫療法領域中的一個焦點。目前處於研究或在使用的免疫療法的實例是免疫佐劑(例如，牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、鐮狀瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、二硝基氯苯和芳香化合物)(美國專利5,801,005和5,739,169;Hui和Hashimoto,1998;Christodoulides等，1998)、細胞因子療法(例如，千擾素(IL-1、GM-CSF和TNF)(Bukowski等，1998;Davidson等，1998;Hellstrand等，1998)以及基因療法(例如，TNF、IL-l,IL-2，p53)(Qin等，1998;Austin-Ward和Vi1laseca，1998;美國專利5，830，880和5，846，945)和單克隆抗體(例如，抗神經節戒GM2、抗-HER-2、抗-pl85)(Pietras等，1998;Hanibuchi等，1998;美國專利5,824,311)。這些方法雖然顯示了一些前景，但表現出有限的成果。複製選擇性的溶瘤病毒很有希望用於治療癌(Kirn等，2001)。這些病毒可以通過直接複製依賴性的和/或病毒基因表達依賴性的溶瘤效果引起腫瘤細胞死亡(Kirn等，2001)。而且，病毒能增強宿主體內細胞介導的抗腫瘤免疫的誘導(Todo等，2001;Sinkovics等，2000)。這些病毒也可以經基因工程改造而在肺瘤內表達治療性轉基因而增強抗腫瘤效力。然而，這種治療方法存在大的局限性。儘管可以證明一些病毒物種一定程度的天然的腫瘤選擇性，仍需要新的方法來改造和/或增強溶瘤病毒的胂瘤選擇性以便使安全性最大化。當採用血管內施用時以及在將潛在毒性治療劑加至這些病毒來增強抗腫瘤效能；基因表達將需要嚴格局限於正常組織時，這種選擇性將變得特別重要。而且，通過另外的機制，例如誘導抗腫瘤免疫或靶向腫瘤相關的脈管系統，來增加抗腫瘤效力是十分期望的.因此，需要更有效且更少毒性的用於治療癌的療法。然而，溶瘤病毒和免疫療法的使用代表了可以t艮的領域，然而上面討論的局限性需要克服。因而本發明解決了那些局限性。發明概述因而，根據本發明，提供了殺死受試者中的癌細胞的方法，該方法包括施用有效量的複製性痘苗病毒給受試者，所述的痘苗病毒具有表達區，其啟動子引導編碼粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸的表達，其中施用是血管內施用。特別是考慮核酸編碼人GM-CSF。痘苗病毒可以經靜脈內或經動脈內施用，例如，^f吏用靜脈內滴注或推注，或使用泵。可以將痘苗病毒分散於可藥用製劑中。受試者可以施用大約105、106、107、108至大約109、101。、1012、10"pfu之間的病毒或在大約107至大約10"pfu之間的病毒。受試者可以施用痘苗病毒多次(1、2、3、4、5、6或更多次)，例如，其中第二次處理在第一次處理的1、2、3、4、5、6、7天或數周內進行，或其中第二次處理在第一次處理的2周內進行。可以施用相同的或不同的劑量。癌細胞可以是轉移的癌細胞。受試者可能具有腦癌、頭頸癌、腎癌、卵巢癌、睪丸癌、子宮癌、胃癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、肝細胞癌、血癌、淋巴瘤、骨髓瘤或黑素瘤。痘苗病毒可以在其基因組中具有缺失或在一個或多個基因中具有突變。痘苗病毒的胸苷激酶基因可能已經刪除。痘苗病毒可能在在編碼以下多肽或因子的基因中具有突變(a)痘苗病毒生長因子；(b)功能性幹擾素-調節多肽，其中所述的千擾素-調節多肽直接結合幹擾素；(c)#^調控多肽，其中突變導致病毒缺少至少一種功能性補體調控多肽；(d)TNF-調節多肽，其中突變導致病毒缺少至少一種功能性TNF-調節多肽；(e)絲氨酸蛋白酶抑制劑，其中突變導致病毒缺少至少一種功能性絲氨酸蛋白酶抑制劑；(f)IL-1P調節多肽，其中突變導致病毒缺少至少一種功能性IL-1P調節多肽；(g)功能性A41L，B7R，N1L或vCKBP趨化因子結合多肽或CllREGF-樣多肽，其中突變導致病毒缺少至少一種A41L、B7R、N1L、vCKBP或C11R的功能；或(h)多肽，其中突變導致傳染性EEV型痘苗病毒的增加。而且，痘苗病毒可以在痘苗病毒生長因子中包含突變。痘苗病毒可以是Wyeth或WesternReserve(WR)林。啟動子可以是痘苗病毒啟動子、合成的啟動子、至少在感染早期期間引導轉錄的啟動子或至少在感染晚期期間引導轉錄的啟動子。在另一實施方案中，提供了用於在受試者中治療癌的方法，該方法包括施用有效量的複製性痘苗病毒給受試者，所述的痘苗病毒具有表達區，其啟動子引導編碼粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸的表達，其中施用是血管內施用。在又一個實施方案中，提供了用於在受試者中治療一個或多個轉移灶的方法，該方法包括施用有效量的複製性痘苗病毒給受試者，所述的痘苗病毒具有表達區，其啟動子引導編碼粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸的表達，其中施用是血管內施用。在其它實施方案中，考慮涉及經血管內施用的可複製痘苗病毒的方法可以含有編碼不同於GM-CSF的蛋白質或RNA的核酸。在特別的實施方案中，核酸編碼另一種細胞因子。在某些實施方案中，核酸編碼其它的免疫刺激性細胞因子或化學因子，例如IL-12、IL-2等。在另外的實施方案中，核酸可以編碼胸苷脫氨酶或腫瘤壞死因子(TNF),例如TNF-a。而且，考慮複製性痘苗病毒可以表達多餘一種異源序列。其可以表達，例如，GM-CSF蛋白和其它蛋白質或RNA分子。特別是考慮關於特殊的方法或組合物的任何實施方案可以實現本發明的其它方法和組合物。當在權利要求書和/或說明書中連同術語"包含"使用時，單詞"一"或"一個"的使用可表示"一個"，但是其也與"一個或多個"、"至少一個"和"一個或多於一個"的含義一致。通過下面的詳述，本發明的其它的目的、特徵和優勢將變得顯而易見。然而應該理解，儘管說明了本發明的具體實施方案，但詳述和特定實施例僅是以例證的方式給出，因為根據該詳述在本發明的精神和範圍內的多種改變和修飾對本領域技術人員將變得顯而易見。附圖簡述下面的附圖構成了本說明書的一部分並且包含在內以進一步說明本發明的某些方面。本發明可以通過參考一個或多個這些附圖，結合在此說明的具體實施方案的詳細描述來更好的理解。圖1-JX-594靜脈內(IV)治療自發性大鼠肝細胞癌(HCC)大鼠接受它們飲用中的誘變劑N-亞硝基嗎啡(醒)(175mg/L)，為期8周，並然後接受超聲(US)直到HCC腫瘤已經形成並為300-400mm3(通常是16-20周後)。然後讓動物接受3次靜脈內劑量(每兩周1次，箭頭所示)的PBS(n-17)或lx108PFU的JX-594(n-6)。然後基於來自US成像的腫瘤的測量計算後來的腫瘤體積。圖2A-2B-JX-594靜脈內劑量治療兔中的VX2肝腫瘤，對原發性腫瘤和轉移瘤的效率。將VX2細胞(來自解離的1,3腫瘤)移植進紐西蘭白兔的肝臟中並通過超聲(US)和CT掃描檢測腫瘤生長。一旦腫瘤達到2-4cm3,用單次劑量的PBS(n=7)或用JX-594(lxl09PFU)(n=3/組)經靜脈內或US引導的IT注射。(圖2A)通過CT掃描在7周後測量肝臟中後來的腫瘤體積，(圖2B)在第6周和笫7周通過CT掃描計算肺中可檢測的胂瘤轉移灶的數目。圖3-JX-594和JX-963低劑量靜脈內重複治療兔中的VX2肝腫瘤。如圖2A-2B中描述的移^i腫瘤細胞。在腫瘤達到2-4cn^後用lx108PFU的JX-594、JX-963或wDD(n-6/組)，或PBS(n-18)靜脈內治療動物3次(每兩周一次，箭頭所示)。CT掃描後來的原發性腫瘤體積。圖4-JX-594、wDD和JX-963對負荷VX2肝胂瘤的兔中的肺轉移灶的效果。在治療開始後每隔一周通過CT掃描檢查動物(來自圖3中描述的試驗)的肝臟轉移灶。顯示了每組中的每隻動物的可檢測轉移灶的平均數目。圖5-在IV遞送JX-963後負荷VX2肝腫瘤的兔的存活率。如圖3中描述的用三次劑量的lxl8pFU的JX-9"處理負荷肝腫瘤的動物。顯示了這些動物和對照處理組的卡普蘭-邁耶存活曲線。因為JX-594和wDD組的存活率不顯示顯著的差別，所以不包括JX-"4和wDD組。圖6A-6C-痘苗林的Burstratio、細胞病變效應和系統遞送病毒抹至腫瘤。(圖6A)痘苗林在腫瘤中對在正常細胞中的Burstratio,將不同的痘苗林以1.0個噬斑形成單位噬斑形成單位(PFU)/細胞的感染複數(MOI)用於感染原發性正常細胞(NHBE)和腫瘤細胞系(A2780)。通過噬菌斑測定法滴定48小時後收集的病毒病表示出在胂瘤細胞中相對於在正常細胞中產生的病毒(每個細胞)的比率。(圖6B)由病毒感染產生的細胞病變效應。將WesternReserve、血清5型腺病毒和腺病毒W1520林(ONYX-015)(在一些測定法中)以一系列的MOI(PFU/細胞)加入至細胞系中，並再72小時後用MTS(Promega)測量細胞生存力。畫出了減少細胞生存力至未受處理的對照孔的50%(ED5。)所需的病毒的MOI(PFU/細胞)。(圖6C)系統性遞送病毒林至腫瘤。將lxlO'PFU64或JC腫瘤的免疫活性小^鼠。在48或'72小時後殺死小鼠^對石蠟包埋的腫瘤組織切片上的病毒外殼蛋白進行免疫組織化學分析。圖片顯示了每個腫瘤中的陽性細胞的打分(*=沒有檢測到)。對於每種情況，結果是基於來自3隻小鼠的腫瘤，並且對於每個腫瘤，對隨機選取的10個視場打分。圖7-WR和wDD對一組人腫瘤細胞系的細胞病變效應。在用WR或wDD感染腫瘤細胞系後72小時後測定ECs。值。畫出了減少細胞生存力至未受處理的對照孔的50%(ED5。)所需的病毒的MOI(PFU/細胞)。圖8A-8CH-Ras過度表達對病毒複製的影響、系統性遞送至負荷腫瘤的小鼠後WR和wDD的生物分布以及通過光產生定量的病毒基因表達。(圖8A)H-Ras的過度表達對病毒複製的影響。用不同的痘苗林以1.0PFU/細胞的MOI感染增殖的或者血清飢餓的表達活化H-Ras的NIH3T3細胞和NIH3T3細胞。病毒抹是親本WesternReserve(WR)和在胸苷激酶(TK)基因中含有缺失或插入的WR(vJS6)或在病毒生長因子(VGF)基因中含有缺失或插入的WR(vSC20)或在這兩種基因中含有缺失或插入的WR(wDD)。在48小時後通過噬菌斑測定法滴定感染性病毒。(圖8B)系統性遞送至負荷腫瘤的小鼠後WR和wDD的生物分布。用lxl07PFU的痘苗病毒通過尾靜脈注射處理負荷皮下人HCT116腫瘤的無胸腺CD1nu/nu小鼠(箭頭所示)。在處理後標明的時間，加入底物螢光素後通過在VISI100系統(XenogenCorp，Alameda)中進行生物發光成《綠測表達螢光素酶的病毒林(WR和wDD)和隨後的病毒表達的生物分布。(圖8C)畫出了負荷皮下JC腫瘤(n-5隻小鼠/組)並通it^靜脈注射用1x10'PFU任一種病毒處理的BALB/c小鼠的覆蓋整體(腹部圖像)的重要區域隨時間的病毒基因表達(通過光產生定量)(虛線、空心符號)或僅來自腫瘤的隨時間的病毒基因表達(背視圖)(實線、實心符號)。圖9A-9C-對負荷移植進肝中的VX2腫瘤的兔在胂瘤移植後進行CT成像、對VX2腫瘤細胞進行CTL測定法以及用JX-963預先處理兔。(圖9A)在腫瘤移植後對負荷移植進肝中的VX2腫瘤的兔進行CT成像。在腫瘤移植後第2、3和4周後(箭頭所示)通過耳部小靜脈注射遞送lx109PFU病毒wDD和JX-963，這時腫瘤測量為5cm3。也在這些動物中測量了可檢測的肺轉移灶的數目(顯示了笫8周時原發性肝腫瘤的代表性CT圖像)(對照處理的動物n-8;wDD處理的動物n-6;JX-963處理的動物拿)。(圖9B)目標為VX2腫瘤細胞的CTL測定法。用與12.5x;25x和50x來自負荷VX2腫瘤並用JX-963處理的兔；來自負荷有VX2腫瘤的未經處理的動物；以及來自原來的動物(na口veanimal)的未標記的外周血淋巴細胞混合的預先標記的VX2細胞通過FACS分析進行CTL測定法。通過ACT1測定法(CellTechnology,MountainView)定量細胞死亡。(圖9C)將用JX-963如(A)中處理的四隻兔用lx109PFUJX-M3在移植後第42天(箭頭所示)預處理，然後通過CT掃描隨後的腫瘤體積。圖10A-10B-用WR或Ad5感染的細胞系的病毒產生和由病毒感染產生的細胞病變效應。(圖IOA)用WesternReserve或血清5型以1.0PFU/細胞的MOI感染不同的細胞系。通過噬菌斑測定法滴定48小時後產生的病毒的量(感染單位/細胞)。(圖10B)處死如圖1C中處理的小鼠並對腫瘤切片的病毒外殼蛋白染色。代表性的圖片顯示了在處理後72小時和10天時的切片。圖11-用WR或Ad5感染的細胞系的病毒產生。將增殖或生長至接觸抑制(N.B.胂瘤細胞不變成接觸抑制的)的人腫瘤細胞系(Panc-1和MCF-7)或人永生化但非-轉化細胞系(Beas-2B和MRC-5)用不同的痘苗林以1.0PFU/細胞的MOI處理。使用的病毒林是WesternReserve(WR)和在胸苷激酶(TK)基因中含有缺失的WR(vJS6)或在病毒生長因子(VGF)基因中含有缺失的WR(vSC20)或在這兩種基因中含有缺失的WR(wDD)。在48小時後通過噬菌斑測定法滴定產生的病毒。圖12-系統性遞送wDD的回收。系統性遞送(腹膜內注射lxl(TPFU)至負荷皮下MC38腫瘤的C57B/6小鼠的wDD的回收。在處理(n=8)後第5天或第8天處死小鼠並回收不同的組織並且通過噬菌斑測定法滴定病毒感染單位(PFU/mg組織)(*-低於檢測極限)。圖13A-13B-通過不同途徑遞送進負荷腫瘤的小鼠模型中後wDD的效力。(圖13A)單次靜脈內注射lxl(TPFU的病毒林wDD或攜帶胸苷缺失的痘苗Wyeth株遞送至負荷皮下TIB75腫瘤(50-100mm3)的免疫活性小鼠。通過測徑器測量腫瘤體積(11=8/組)(圖13B)將lx109PFU的wDD經瘤內(IT)或腹膜內(IP)遞送給負荷皮下HT29胂瘤的SCID小鼠或負荷皮下MC38肺瘤的C57B/6小鼠並將隨後的腫瘤體積與未受感染的對照組(n-8/組)進行比較。圖14-用JX-963(1x108PFU)處理負荷VX2腫瘤的兔後中和抗體的形成。將在標明的時間從兔獲得的血漿的稀釋物與已知數目的病毒PFU孵育，並顯示了保持50%的噬菌斑所需的稀釋物。說明性實施方案的描述表達GM-CSF的痘病毒表明了在患有骨髓瘤的動物或患者中經腫瘤內注射後的效力和安全性(Mastrangelo等，1999;2000)。觀察到了局部注射位點和遠距離效果，包括腫瘤退化和穩定(Mastrangelo等，1999)。效力據認為是由於在哺乳動物中誘導了對癌細胞的免疫應答。美國專利6，093,700和6,475,999提出通過在人中進行腫瘤內注射將痘病毒用於遞送GM-CSF至腫瘤以便原位免疫對抗骨髄瘤、頭頸癌、前列腺癌和膀胱癌(Mastrangelo等，2002)。這些癌是因為它們的在表面的性質並可以直接進行腫瘤內注射而選擇。據報導，這些癌也對誘導系統性腫瘤特異性的、細胞毒性T-淋巴細胞的免疫療法敏感。GM-CSF證明是腫瘤特異性的細胞毒性T-淋巴細胞(CTL)的有效誘導劑(Dranoff等，1993)。因為病毒誘導免疫細胞浸潤和致炎細胞因子，病毒可能構成了遞送並在肺瘤體表達GM-CSF的理想方法。然而胂瘤內的注射途徑具有大的局限性。這局限於可以進行安全的腫瘤內注射的腫瘤，通常是淺表腫瘤，例如上面列出的那些。而且，對未注射的腫瘤的效力需要誘導足夠強的腫瘤特異性的細胞毒性T淋巴細胞。這些缺點使這種方法的功用局限於淺表的且能夠系統性地誘導足夠強的腫瘤特異性的細胞毒性T淋巴細胞的腫瘤。這種胂瘤是少見的。適用於這種方法的僅有的一個清楚的實例是轉移性黑素瘤。然而，即^f吏在這種腫瘤類型中，遠距離應答緩慢且局限於淺表皮膚轉移灶。基於器官或內臟的腫瘤不應答。因為這些腫瘤是幾乎所有癌相關的發病和死亡的原因，系統性的細胞毒性T淋巴細胞表現得不足以誘導持續的、系統性的、內臟應答或治癒。因此，絕大部分的人腫瘤不能用這種方法得到成功的效果。血管內施用(即靜脈內、動脈內)遞送至轉移性腫瘤和免疫組織(例如網狀內皮細胞)具有許多理論上的優勢。首先，遞送表達GM-CSF的痘病毒至哺乳動物體內的大部分腫瘤位點或所有腫瘤位點使得能通過局部的腫瘤內的效果(由於受感染腫瘤內局部的痘病毒複製和GM-CSF作用)和腫瘤特異性的、細胞毒性T淋巴細胞誘導兩者，以及隨之在受感染的腫瘤位點和在遠處(不直接用初始劑量感染的腫瘤位點中)兩者的效力系統性地破壞了肺瘤。通過血流遞送病毒至腫瘤也使得更一致、廣泛地感染腫瘤中的癌細胞。因此，本發明現在提出多灶性、散布的、轉移性腫瘤可以有效地通^tj6L管內的表達GM-CSF的疸病毒治療。不適合腫瘤內方法的許多癌類型和/或階段也將潛在地可以用血管內注射方法治療。實例包括，但不限於肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肝細胞癌、血癌、淋巴瘤、骨髓瘤和黑素瘤。然而，技術人員認為安全和有效的使用血管內的表達GM-CSF的痘病毒受潛在問題的負面影響。首先，安全上的考慮是很重要的。在血管內施用後，許多正常的組織將曝露於痘病毒感染。隨後強的致炎細胞因子如GM-CSF的表達據預測將潛在地在許多器官，例如肝、肺、腎、心、腦等中導致顯著的炎症，而且，系統性的曝露於病毒血症可以潛在地誘導膿毒症及其相關的併發症(例如低血壓)。小鼠或人腦中的痘病毒感染例如可以導致臨床上顯著的、甚至是致死的腦炎。GM-CSF表達可以由於增強炎症而潛在顯著地惡化這種併發症。其次，通過GM-CSF表達系統性地誘導腫瘤特異性CTL以前僅通過定位GM-CSF表達來進行，定位GM-CSF表達是通過直接腫瘤注射(例如牛痘-GM-CSF、HSV-GM-CSF)或通過離體感染/轉染自體或同種異體腫瘤細胞來表達GM-CSF(例如GVAX方法)，隨後通過注射GM-CSF細胞進皮膚中。儘管有這些潛在的缺點，本發明現在已經證明，兩種不同的表達GM-CSF的痘病毒是靜脈內耐受良好的並且對散布的腫瘤和轉移灶高度有效。而且，在靜脈內施用後表達GM-CSF的痘苗比其不表達GM-CSF的對照對原發性肺瘤和肺轉移灶兩者具有顯著更好的效力。而且，儘管另外具有其它病毒中不存在的vfg基因中的缺失，這種病毒比相當的病毒(Wyeth疫苗抹)對原發性腫瘤和肺轉移灶具有顯著更好的效力。因而，用靜脈內施用表i^AGM-CSF的痘苗導致比沒有GM-CSF的相同痘苗有顯著更好的效力，並且血管內施用表達GM-CSF的WR林缺失型突變體比表達GM-CSF的標準疫苗林顯著更好。這些病毒在施用給負荷腫瘤的動物(大鼠和兔)和正常動物(兔)耐受良好。受處理的動物沒有降低體重而不接受處理的負荷肺瘤動物體重降低。在靜脈內處理後存活率升高。通過血液檢測或組織病理學沒有發現顯著的器官毒性。唯一可重複的組織病理學發現是處理後可見的多個淋巴樣增生位點(與系統性的免疫刺激一致)。在組織病理學上沒有注意到顯著的毒性。因此，這些表達GM-CSF的痘病毒在高度有效對抗系統性癌的劑量時是耐受良好的。I.痘病毒A.痘苗病毒痘苗病毒對病毒學來說是一個謎。不知道痘苗病毒是否是遺傳重組的產物、其是否是通過長的連續傳代而緣於牛痘病毒或天花病毒的一個種、或其是否是現在滅絕的病毒的生活的代表。痘苗病毒通過接種進前臂皮膚的淺層中用於天花預防接種。然而，天花的消滅，巳經停止了使用痘苗病毒的常規接種。最近的興趣集中在其可能作為用於免疫其它病毒和基因療法的載體的用途上。痘苗病毒是痘病毒科、脊推動物痘病毒亞科、正痘病毒屬的一個成員。該病毒顆粒含有RM聚合酶、早期轉錄因子、聚腺苷酸聚合酶、加帽酶複合體、RNA(核苷_2')甲基轉移酶、三磷酸核苷磷酸水解酶II、缺口連接酶、DNA拓樸異構酶和蛋白激酶。基因組是剛超過180，000鹼基對的雙鏈DNA，其特徵是有10kB的末端反向重複。病毒通過與質膜的pH-不依賴性融合或低pH-依賴性胞內體途徑進入細胞。B.其它痘病毒正痘病毒屬比脊推動物痘病毒亞科的其它成員相對更同源，並且包括ll種不同但是密切相關的種，包括痘苗病毒、開花病毒(天花的病原體)、牛痘病毒、水牛痘病毒、猴痘病毒、鼠痘病毒和馬痘病毒種等(見Moss，1996)如在此描述的，本發明的某些實施方案可以延伸到正痘病毒屬的其它成員以及副痘病毒屬(Parapoxvirus)、禽痘病毒屬(Avipoxvirus)、羊痘病毒屬(Capripoxvirus)、兔痘病毒屬"eporipoxvirus)、豬痘病毒屬(Suipoxvirus)、軟沈痘病毒屬(Molluscipoxvirus)和亞塔痘病毒屬(Yatapoxvirus)。痘病毒科的屬通常通過血清血手段，包括實驗室動物中的中和和交叉反應性來定義。正痘病毒屬的多個成員以及脊稚動物痘病毒亞科(Chordovirinaesubfamily)的其它成員利用免疫調節分子(在此提供了其實例)來中和宿主生物體的免疫應答。因而，在此描述的本發明不限於痘苗病毒，但是可以應用於許多病毒。II.痘病毒的基因工禾呈改造病毒頻繁地由免疫調節分子，例如幹擾素(-oc，-P，-Y)和腫瘤壞死因子-cx(TNF)失活、抑制或清除。宿主組織和炎性/免疫細胞頻繁地分泌這些分子以相應病毒感染。這些分子具有直接的抗病毒效果和/或通過募集和/或激活炎性細胞和淋巴細胞的間接效果。由於這些免疫學清除機制的重要性，病毒已經進化而表達抑制這些細胞因子/趨化因子和幹擾素的誘導和/或功能的基因產物，例如，痘苗病毒(VV;以及一些其它痘病毒)編碼分泌蛋白vCKBP(B29R)，其結合併抑制CC趨化因子(例如RANTES、嗜酸細胞活化趨化因子、MIP-l-oc)(Alcami等，l"8)。一些VV林也表達結合併失活TNF的分泌性病毒蛋白(例如ListerA53R)(Alcami等，1999)。多數痘病毒林具有編碼結合併抑制幹擾素-oc/|3的功能的分泌性蛋白的基因(例如B18R)或編碼結合併抑制幹擾素-Y的功能的分泌性蛋白的基因(B8R)。vC12L是IL-18結合蛋白，其防止il-18誘導ifn—y和nk細胞/細胞毒性t細胞激活。已經在小鼠中進行了大多數的痘病毒毒性研究。許多(但不是全部)這些蛋白質在小鼠中是有活性的(例如，B18R沒有活性)。在其中這些蛋白質對抗小鼠的耙細胞因子的情形中，這些基因的缺失導致使用缺失這些基因或這些基因有功能性突變的VV突變體時毒性減少和安全性增加。而且，與表達抑制性蛋白質的親本病毒林比較，對這些突變體的炎性/免疫應答以及病毒的清除通常增加。例如，Tl/35kDa家族的痘病毒-分泌性蛋白質(趨化因子-結合/-抑制性蛋白)的缺失可以導致白細胞浸潤進病毒感染的組織顯著增加(Graham等，1997)。VV中vC12L基因的缺失導致在鼻內施用給小鼠後低的病毒滴定度/毒性；而且，NK細胞和細胞毒性T-淋巴細胞活性以及IFN-Y誘導增加(Smith等，2000)。粘液瘤病毒T7基因(能夠結合IFN-Y和廣泛的趨化因子)的缺失導致在毒性模型中減少的毒性和顯著增加的組織炎症/浸潤(Upton等，I992;Mossman等，1996)。來自粘液瘤病毒的M-T2基因的缺失也導致兔模型中減少的毒性(Upton等，1991)。81811抗-幹擾素-01/-0基因產物的缺失也導致正常組織中IFN-介導的清除的病毒敏感性增強、毒力減少(Symons等，I"5;Colamonici等，1995;Alcami等，2000)。總之，這些病毒基因產物起著降低抗病毒免疫應答和炎性細胞浸潤進病毒感染組織中的作用。通過缺失/突變而喪失蛋白質功能導致病毒在宿主組織中的毒力降低和/或致炎性質增加。參見PCT/US2003/025141，將其通過引入作為參考。細胞因子和趨/f匕因子可以導致強烈的抗腫瘤效果(Vicari等，2002;Homey等，2002)。這些效果可以直接在腫瘤細胞自己上(例如TNF)或它們可以是間接的，通過作用在非癌性細胞上。後者的實例是TNF，其可以通過引起對腫瘤相關的血管的毒性而具有抗腫瘤效果；這導致喪失血液流至肺瘤，隨後引起壞死。而且，趨化因子可以起作用而募集(以及在一些情形中激活)免疫效應細胞，例如中性白細胞、嗜酸粒細胞、巨噬細胞和/或淋巴細胞。這些免疫效應細胞可以通過許多機制引起腫瘤破壞。這些機制包括抗肺瘤細胞因子(例如，TNF)的表達、fas-配體的表達、穿孔蛋白(perforin)和粒酶的表達、天然殺死細胞的募集等。這些炎性應答可最終導致系統性的腫瘤特異性免疫的誘導。最後，許多這些細胞因子(例如TNF)或趨化因子可以與化學療法或放射療法協同作用來消滅腫瘤。臨床有效的系統性施用重組的這些免疫調節蛋白是不可行的，這是因為(1)系統性施用誘導嚴重的毒性以及(2)需要在腫瘤組織內局部表達來刺激局部的浸潤和抗腫瘤效果。需要有方法來獲得這些分子在腫瘤體內的高的局部濃度，同時使體循環中的水平最低。可以改造病毒來表達細胞因子或趨化因子以試圖增強它們的效力。從複製選擇性載體表達這些基因比從非複製型載體表達具有潛在的優勢。從複製性病毒表達可以導致腫瘤體內更高的局部濃度；而且，複製性病毒可以有助於通過在促炎環境中的腫瘤細胞破壞/癌細胞溶解和釋放腫瘤抗原而誘導抗腫瘤免疫。然而，這種方法有幾個局限性。具有在以高的局部濃度表達時可能會有毒性的基因的有複製能力的病毒(雖然是腫瘤選擇性的)釋放進環境中的可能性引起了嚴重的安全上的顧慮。從它們的基因組表達強效的促炎基因的病毒因而對受治療患者以及對公眾造成了安全上的風險。即使使用表達這些基因的腫瘤靶向的、複製選擇性病毒，基因表達也可能在正常組織中發生，導致毒性。而且，大小的限制防止了多種和/或大基因從病毒(腺病毒)表達；這些分子一起將無疑更有效地作用。最後，使用的許多溶瘤病毒表達抗炎蛋白質並因而這些病毒將抵消受感染腫瘤體內促炎環境的誘導。A.痘苗病毒產物1.幹擾素調節多肽幹擾素-oc/-P通過幾種機制阻斷病毒複製，幹擾素-Y具有較弱的直接病毒抑制效果但是是一種強效的誘導劑，通過幾種機制誘導細胞介導的免疫。病毒已經進化成表達能抵消幹擾素的抗病毒效果的分泌型基因產物。例如，痘苗病毒(以及其它痘病毒)編碼分泌性蛋白BSR和B18R，它們分別結合幹擾素-Y和-aZ-p(Smith等，1997;Symons等，1995;Alcami等，2000)。降低幹擾素誘導的痘苗基因產物的一個另外的實例是細胞凋亡蛋白酶(caspase-l)抑制劑B13R，其抑制幹擾素-y誘導因子IL-8的激活。幹擾素調節多肽包括但不限於B18R(其在其它病毒林，例如痘苗病毒的Copenhagen林中可能稱為B19R)、B8R、B13R、vC12L、A53R、E3L以及具有相似活性或性質的其它病毒多肽。IFN調節多肽可以分為優先調節IFNct和/或P途徑的那些(例如，B18R、B8R、B13R或vC12L)以及調節IFNy途徑的那些(B8R、B13R或vC12L)非排它的類。癌細胞通常對幹擾素的作用有抗性。涉及了許多機制。這些機制包括ras信號轉導途徑激活(例如通過ras突變、上遊生長因子受體過度表達/突變等)，其為癌細胞的一個共同特徵，導致PKR抑制。而且淋巴細胞在腫瘤體中通常受肺瘤細胞通過多種機制，包括IL-10產生和fas-L表達抑制。因為淋巴細胞是幹擾素-Y產生的一個主要來源，淋巴細胞抑制導致腫瘤中幹擾素-Y產生的降低。因而，腫瘤體有點像是逃避幹擾素作用的避難所。而且，幹擾素自身可以具有抗腫瘤效果。例如，IFN-Y可以增加I類MHC相關抗原遞呈；這將使得能進行更有效的CTL-介導的腫瘤細胞殺死。IFN-a/P，例如，可以阻斷腫瘤體中的血管發生並因而阻斷腫瘤生長。2.補體調控多肽用於清除病毒病原體的一個主要機制是通過補體依賴性機制殺死宿主內的受感染細胞或殺死生物體內病毒粒子。當受感染細胞死亡時，其不能繼續產生傳染性病毒。而且，在凋亡過程中，釋放細胞內的酶，其降解DNA。這些酶可以導致病毒DM降解和病毒失活。凋亡可以通過許多機制(包括激活的補體的結合和攻擊膜的補體複合物)誘導。痘病毒例如痘苗病毒已經進化成表達能夠抵銷補體介導的病毒和/或病毒感染的細胞的清除的基因產物。這些基因因此通過補體依賴性機制防止凋亡和抑制病毒清除，因而使得病毒感染能進行並增加病毒毒力。例如，痘苗病毒補體控制蛋白(VCP;例如aiL)在防止補體介導的細胞殺死和/或病毒失活中起作用(Isaacs等，l"2)。VCP還具有抗炎性效果，因為它的表達降低白細胞浸潤進病毒感染的組織中。補體控制多肽包括(但不限於)VCP，其也稱為C3L或C21L癌細胞常常過度表達細胞抗-補體蛋白；這使得癌細胞能倖免於補體攻擊+/-腫瘤特異性抗體(Caragine等，2002;Durrant等，2001;Andoh等，2002)。因而，由於胂瘤細胞內在的對補體介導的殺死的抗性而優先攻擊腫瘤細胞的試劑將在各種各樣的人癌中具有選擇性和強的效力(Durrant等，2001)。而且，癌細胞的其中一個標誌是正常的凋亡機制的喪失(Gross等，1999)。對凋亡的抗性促進了致癌作用以及對抗腫瘤劑，包括免疫劑、化學治療劑和放射治療劑的抗性(Eliopoulos等，1995)。凋亡抑制可以通過喪失促凋亡分子功能、增加抗凋亡分子(例如，bcl_2)的水平/功能以及最終喪失補體敏感性來介導。3.TNF-調節多肽用於清除病毒病原體的多種機制的其中一種是通過誘導凋亡(如上面描述的)殺死宿主內的受感染細胞。凋亡可以通過多種機制，包括TNF和淋巴毒素-oc(LToc)結合至TNF受體上，這引發了細胞內的信號級聯反應。TNF受體的激活起調節免疫和炎性應答以及誘導凋亡性細胞死亡的作用(Wallach等，1999)。痘病毒的多種毒林，包括一些痘苗病毒林，已經進化成表達能夠抵銷TNF-介導的病毒和/或病毒感染的細胞的清除的基因產物。由這些基因編碼的蛋白質通過結合併掩蔽胞外的TNF而阻止了TNF的促炎症反應和凋亡誘導活性，導致病毒清除的抑制。由於病毒沒有清除，使得病毒感染繼續，並因而增加了病毒毒力。痘病毒科的多個成員表達分泌性病毒TNF受體(vTNFR)。例如，幾種痘病毒編碼vTNFR，例如粘液瘤(T2蛋白)、牛痘和痘苗病毒林，例如Lister,可以編碼CrmB、CrmC(AS3R)、CrmD、CrmE、B28R蛋白的一種或多種和/或其等價物，這些vTNFR在防止TNF-介導的細胞殺死和/或病毒失活中起作用(Saraiva和Alcami，2001)。TNF調節多肽包括(但不限於)A53R、B"R(這種蛋白質在痘苗病毒的Copenhagen林中存在，但是可能是無活性的)及其它具有類似活性或性質的多肽。癌細胞的其中一個標誌是異常的基因表達，其可以導致喪失對許多用於生長調節的分子機制的敏感性，例如對TNF的抗癌活性的敏感性。因而，病毒免疫調節機制可能不是病毒在腫瘤微環境內繁殖所需的。4.絲氨酸蛋白酶抑制劑用於病毒病原體清除的一個主要的機制是誘導宿主內的受感細胞中的凋亡。當受感染細胞死亡時，其不能繼續產生傳染性病毒。而且，在凋亡過程中，釋放細胞內的酶，其降解DNA。這些酶可以導致病毒DNA降解和病毒失活。凋亡可以通過許多機制(包括細胞因子的結合(例如腫瘤壞死因子)、由細胞毒性T-淋巴細胞產生粒酶或fas-配體結合)誘導；caspase激活是最終的共有凋亡途徑的一個關鍵部分。病毒已經進化而表達能抵消由包括fas-配體或腫瘤壞死因子(TNF)/TNF-相關分子(例如，腺病毒的E310.4/14.5，14.7基因(Wold等，1994);腺病毒的ElB-19kD蛋白(Boyd等，1994);來自牛痘病毒的crmA;來自痘苗病毒的B13R)誘導的細胞細胞內的信號級聯反應的基因產物(Dobbelstein等，I"6;Kettle等，1997)。這些基因產物防止由凋亡誘導分子引起的凋亡並因而使得病毒複製能進行，儘管存在抗病毒的凋亡誘導細胞因子、fas、粒酶或其它的凋亡刺激物。VVSPI-2/B13R與牛痘CrmA高度同源;SPI-1(VV)與CrmA有弱的同源性(Dobbelstein等，1996)。這些蛋白質是serpin(絲氨酸蛋白酶抑制劑)並且CrmA和SPI-2兩者都在防止多種形式的凋亡方面起作用。白介素-1P-轉化酶(ICE)和粒酶的抑制，例如，可以防止受感染細胞的凋亡。這些基因產物也具有抗炎效果。它們能抑制IL-18的激活，其隨後又將降低IL-18-介導的IFN-y的誘導。IFN-y對細胞介導的免疫的免疫刺激效果因而受到抑制(Kettle等，1997)。SPI包括(但不限於)B13R、B22R和具有類似活性或性質的其它多肽。癌細胞的其中一個標誌是正常的凋亡機制的喪失(Gross等，1999)。對凋亡的抗性促進癌形成以及對抗腫瘤劑(包括免疫劑、化學治療劑和放射治療劑)的抗性(Eliopoulos等，1995)。凋亡抑制可以通過喪失促凋亡分子功能(bax)或增加抗-凋亡分子(bcl-2)的水平/功能來介導。5.IL-1P-調節多肽IL-1P是局部作用以及系統性作用的活性因子。僅描述了IL-1P和IL-loc之間的幾處功能性差別。IL-1P的許多生物活性通過許多不同的縮寫來說明，在這些縮寫下IL-l得以描述。除了人IL-1P夕卜(在豬細胞中是無活性的)，IL-1不顯示種屬特異性。IL-1的一些生物活性通過誘導其它介質，包括ACTH(促腎上腺皮質激素)、PGE2(前列腺素E2)、PF4(血小板因子-4)、CSF(集落刺激因子)、IL-6和IL-8來間接介導。IL-1的合成可以通過其它細胞因子，包括TNF-a、IFN-oc、IFN-P和IFN-Y以及通過細菌內毒素、病毒、促分裂原(mitogen)以及抗原誘導。IL-1的主要生物活性是刺激T-輔助細胞，其經誘導而分泌IL-2以及表達IL-2受體。病毒感染的巨噬細胞產生大量的IL-1抑制劑，其可以支持機會感染和具有T-細胞成熟缺陷的患者中的細胞的轉化。IL-1直接作用於B-細胞，促進它們的增殖和免疫球蛋白的合成。IL-1也作為其中一種引發因子(primingfactor)，使得B-細胞響應IL-5。IL-1刺激NK-細胞和成纖維細胞、胸腺細胞、膠質母細胞瘤細胞的增殖和激活。通過病毒蛋白質阻斷IL-1P的合成被認為是4吏得通過IL-1引發的系統性抗病毒反應能受到抑制或減少的病毒策略。已經發現以與Bl化類似的活性有效地阻斷IL-1的功能的結合蛋白也由牛痘病毒編碼。痘苗病毒也編碼另一種蛋白質，稱為B8R，其具有細胞因子的受體的性質Ulcami和Smith，1992;Spriggs等,1992)。IL-1調節多肽包括(但不限於)B13R、B15R和具有類似活性或性質的其它多肽。癌細胞的其中一個標誌是異常的基因表達，其可以導致喪失對許多用於生長調節的分子機制的敏感性，例如對IL-1的抗癌活性的敏感性.因而，病毒免疫調節機制可能不是病毒在腫瘤微環境中繁殖所需要的。6.EEV型病毒散布至轉移的腫瘤位點，以及甚至是在受感染的實體腫瘤體內散布通常是效率低的(Heise等，1999)。靜脈內施用通常導致抗體(例如腺病毒)(Kay等，1997)和/或補體系統(例如HSV)引起的病毒清除或失活(Dceda等，1999)。除了這些免疫介導的機制，這些病毒的生物分布導致絕大多數的病毒存留在正常的組織內而不是腫瘤體內。靜脈內的腺病毒，例如，首先在肝臟和脾臟中終結；少於O.1%的輸入病毒存留在腫瘤內，甚至是在免疫缺陷的小鼠中(Heise等，1999)。因此，儘管在免疫缺陷的小鼠腫瘤模型中使用非常高的相對劑量可以展示稍微適度的抗腫瘤效力，靜脈內遞送是非常效率低的並且較大地限制了效力。痘苗病毒具有在實體瘤中複製並引起壞死的能力。此外，胸苷激SI^失型突變體可以感染腫瘤體和卵巢組織並優先在小鼠腫瘤模型系統中表達標記基因(Gnant等，1999)。然而，因為這些試驗通常基於在>5天後的標記基因表達來檢測胂瘤靶向，還未清楚該病毒是否優先在腫瘤/卵巢組織中存留、表達基因或複製(Puhlmann等，2000)。不考慮機制，沒有額外轉基因的這種病毒的抗腫瘤效力在統計上是不顯著的(Gnant等，1999)。相反，腫瘤內病毒注射具有顯著的抗腫瘤效力(McCart等，2000)。因而，如果靜脈內遞送至胂瘤得以提高，則靜脈內效力可以提高。痘苗病毒在細胞內複製並產生細胞內病毒(IMV，細胞內成熟病毒；IEV，細胞內有包膜病毒)和細胞外病毒(EEV,細胞外有包膜病毒；CEV，細胞相關的細胞外病毒)(Smith等，1998)。在野生型疸苗病毒株複製後，IMV佔大約99%的病毒產量。這種病毒形式在環境中相對穩定，並因而其主要負責在個體間傳播；相反，由於從細胞釋放的效率低以及對補體和/或抗體中和作用，這種病毒不在受感染的宿主內有效地傳播。相比之下，EEV釋放進細胞外環境並通常僅佔大約W的病毒產量(Smith等，1998)。EEV負責病毒在受感染的宿主內傳播並且在宿主外相對容易退化(degraded)。重要地是，EEV已經發展了幾種機制來抑制其在血流中的中和作用。首先，EBV相對耐受補體(Vanderplasschen等，1998);這個性質是由於將補體的宿主細胞抑制物整合其外面的被膜中以及疽苗病毒補體控制蛋白(VCP)分泌進局部的細胞外環境中。第二，與IMV比較，EEV相對耐受中和性抗體作用(Smith等，1997)。BEV也比IMV(其僅在細胞死亡期間/之後釋放)在感染後更早的時間(例如4-6小時)，並因而EEV形式的擴散更快(Blasco等，1993)。然而，不幸地是，野生型痘苗林僅產生相對十分少量的EEV。而且，迄今為止，用痘苗病毒處理(即病毒的輸入劑量)局限於細胞內病毒形式。標準痘苗病毒(W)生產和純化步驟導致EEV失活(Smith等，1998)，並且非人細胞系常常用於生產病毒；來自非人細胞的EEV形式將不受保護免於補體介導的清除(由EEV從細胞獲得的補體抑制蛋白具有種屬限制性作用)。痘苗病毒效力因而受限於IMV形式對中和作用的相對敏感性以及其在實體腫瘤內低效的擴散；這種擴散通常是從細胞到鄰近的細胞。IMV通過血流或淋巴系統擴散至遠處的腫瘤體也是效率低下的。因而，這種稀少的EEV形式的痘苗病毒具有天然獲得的特性，4吏得其優於目前用於患者的痘苗病毒(IMV);EEV經優化而快速且有效地局部擴散至實體瘤以及擴散至區域性或原處的腫瘤位點。由於EEV相對耐受補體作用，當其在來自相同物種的細胞類型中生長時，這些病毒形式在血管內施用後將比標準的痘苗病毒製備物具有增強的穩定性並且在血液中更久的保持活性。由於EEV耐受抗體介導的中和作用，這種病毒形式在血管內施用後將比標準的痘苗病毒製備物(其幾乎僅含有IMV)保持更夂的活性(Vanderplasschen等，1998)。一旦中和抗體水平已經增加後，這些性質對重複施用將是特別重要的；所有批准的抗癌療法需要重複的施用。因而，EEV形式的牛痘以及其它的痘病毒，將導致良好地遞送治療性病毒以及通過血流良好地遞送它們的遺傳負荷至腫瘤，與標準的痘病毒製備物比較，這將導致增強的系統性效力。最後，轉播至公眾個體的風險應該會顯著減少，因為EEV在體外是相當不穩定的。涉及調節EEV形式的病毒的多肽包括(但不限於)A3狀、BSR以及多種影響EBV形式的痘病毒產生的其它蛋白質，A34R的密碼子151處從賴氨酸突變成天冬氨酸(K151D突變)使得A34R蛋白束縛EEV形式至細胞膜的能力較差。B5R是EEV膜結合多肽，其可以結合補體。A43R的全部缺失可能導致EEV釋放增加，但是顯著地減少了病毒的傳染性，而K151D突變增加了EEV釋放而保持釋放的病毒的傳染性。B5R與VCR(抗-補體)具有序列同源性，但是補體抑制仍然未得到證實。簡單地說，一種用於鑑定強化的EEV形式的方法如下。將EEV稀釋於冰冷的MEM中並與稀釋於冰冷的MEM活性的或熱滅活的(56r,30分鐘，對照)血清混合(血清的最終稀釋度是1/10、1/20或1/30)。7'C下孵育75分鐘後，將樣品在冰上冷卻並將mAb5B4/2F2加至新鮮的EEV樣品以中和任何汙染物(IMV和破裂的EEV)。則在冰上讓病毒粒子結合至RK13細胞1小時，洗掉補體和未結合的病毒粒子，並在兩個小時後計數噬斑的數目。噬斑數目越高，對補體的耐受力就大。Vanderplasschen等，(1998),將其通過引入作為參考。描述分離EEV形式的痘苗病毒的示例性方法可以在Blasco等，(1992)(在此通過引入作為參考)中找到。7.其它多肽其它的病毒免疫調節多肽可以包括結合免疫應答的其它介質和/或調節與免疫應答相關的分子途徑的多肽。例如，趨化因子結合多肽例如B29R(這種在痘苗病毒的Copenhagen林中存在但是可能是失活的)、C23L、vCKBP、A41L以及具有類似活性或性質的多肽。其它痘苗病毒例如痘苗病毒生長因子(例如C11L)，其為一種類似病毒EGF的生長因子，也可以是本發明的一些實施方案中用於改變的靶標。其它可以分類為病毒調節因子的多肽包括(但不限於)B7R、NIL或其活性或性質增加痘病毒毒力的其它多肽。8.痘苗病毒-誘導的細胞融合在本發明的某些實施方案中，編碼A56R或K2L的核睃基因的改變、缺失或突變可以導致由VV感染誘導的細胞融合或合胞體形成。痘苗病毒誘導的細胞融合將通常增加由於腫瘤內的病毒擴散產生的VV的抗腫瘤效力。通過細胞融合的肺瘤內的病毒擴散將通常使得病毒能避免中和抗體和免疫應答。在這些基因的一個或兩個中具有突變的VV中，鄰近的未受感染的細胞的殺死和感染(即"旁觀者"效應)可能更有效，這可能導致提高的局部抗腫瘤效果。B.病毒繁殖痘苗病毒可以用由Earl和Moss(Ausbel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,16.15.1-16.18.10)中描述的方法繁殖，將該文獻通過引入作為參考。III.蛋白質和核酸組分本發明涉及在研究和治療患者中的癌細胞和癌中有優勢的痘病毒。其涉及痘苗病毒，與野生型比較其任選具有一種或多種突變，這樣所述的病毒具有理想的性質以用於對抗癌細胞，而對非癌細胞具有較小毒性或無毒性。這種痘病毒在PCT/US2003/025141中描述，將其引入作為參考。舉例來說，下面描述的教授提供了實現本發明的方法和組合物的多種方案。它們提供了通過使用重組DM技術來產生突變病毒的背景。A.蛋白質組合物在一些實施方案中，本發明涉及產生痘苗病毒(任選缺少一種或多(例如傳染性EBV型)的痘病毒。在其它的實施方案中，本發明涉及痘病毒和它們聯合蛋白質組合物作為部分可藥用製劑的用途。如此處使用的，"蛋白質"或"多肽"指含有至少一個胺基酸殘基的分子。在一些實施方案中，採用了野生型蛋白質或多肽，而在本發明的許多實施方案中，病毒或多肽缺失或受到改變以便使得該病毒更能用於治療患者中的癌細胞或癌。上面描述的術語在此可以交換使用。"經修飾的蛋白質"或"經修飾的多肽"指其化學結構相對於野生型的蛋白質或多肽而受到改變的蛋白質或多肽。在一些實施方案中，受修飾的蛋白質或多肽具有至少一種受修飾的活性或功能(認為蛋白質或多肽可能具有多種活性)。受修飾的活性或功能可以相對於野生型蛋白質或多肽中的活性或功能而受到減少、減輕、消除、增強、提高或以一些其它方式改變(例如特異性)。特別是考慮經修飾的蛋白質或多肽可以關於一種活性或功能受到改變，但仍在其它方面保持野生型活性或功能。備選地，經修飾的蛋白質可以是完全沒有功能的或其相關核酸序列可以已經受到改變以至該多肽根本不再表達、受到截短或由於移碼而表達不同的氨基紗列。在某些實施方案中，突變的蛋白質或多肽的大小包括(但不限於)5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500或更多的氨基分子殘基以及可源於其中的任何範圍。考慮多肽可以通過截短而進行突變，使得它們比它們相應的野生型短。如此處使用的，"氨基分子"指本領域一般技術人員所知的胺基酸、胺基酸衍生物或胺基酸模擬物。在某些實施方案中，蛋白質分子的殘基是連續的，沒有任何非氨基分子打斷氨基分子殘基的序列。在其它實施方案中，序列可以包含一個或多個非氨基分子部分。在特別的實施方案中，蛋白質分子的殘基序列可以為一個或多個非氨基分子部分打斷。因此，術語"蛋白質組合物"包含含有至少一種天然合成的蛋白質中的20種普通胺基酸或至少一種經修飾的或罕見氛基酸的氨基分子序列。蛋白質組合物可以通過本領域技術人員已知的任何技術產生，包括通過標準的分子生物學技術表達蛋白質、多肽或肽、從天然來源分離蛋白質化合物或化學合成蛋白質物質。先前已經公開了多種基因的核苷酸和蛋白質、多肽和肽序列，並且可以在本領域一般技術人員所知的計算機化資料庫中找到。一個這樣的資料庫是NationalCenterforBiotechnologyInformation!/sGenBankandGenPeptdatabases(www.ncbi.nlm.nih.gov)。這些已知基因的編碼區可用在此公開的技術或本領域一般技術人員應該已知的技術擴增和/或表達。1.功能方面當本申請案涉及病毒蛋白質或多肽的功能或活性時，其意在指那種病毒蛋白質或多肽在生理條件下的活性或功能，除非另有說明。例如，幹擾素調節多肽指直接或間接影響至少一種幹擾素及其活性的多肽。該多肽可以直接或間接誘導、增強、提高、增加、減小、減弱、減少、抑制或掩蔽幹擾素的活性。在一些實施方案中，直接影響千擾素的一個實例涉及特異性結合幹擾素的幹擾素調節多肽。檢測哪種分子具有這種活性可以用本領域技術人員熟悉的測定法完成。例如，轉移編碼調節幹擾素的產物的基因或其變體進誘導幹擾素活性的細胞中(與具有這種基因轉移的細胞比較)可以利用不同水平的幹擾素響應而鑑定具有幹擾素調節功能的那些分子。特別是考慮，介質是一種影響涉及靶標分子的途徑的表達蛋白質組合物的分子，例如通過結合編碼幹擾素的轉錄物。測定哪種分子是幹擾素、IL-1P、TNF或其它有治療好處的分子的合適調節劑可以用本領域所熟悉的測定法完成(在此公開了其中一些)並且可以包括例如，天然的和/或重組的病毒蛋白質的使用。2.病毒多肽的變體本發明多肽的胺基酸序列變體可以是取代、插入或缺失變體。與野生型比較，編碼病毒多肽的基因中的突變可以影響該多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多非一連續的或連續的胺基酸。多種由痘苗病毒編碼的多肽可以通過參考Rosel等，(1986)，Goebel等，(1990)和GenBank登記號NC一001559(將它們每個通過引入作為參考)而鑑定。缺失型突變體缺少天然或野生型蛋白質的一個或多個殘基可以刪除獨立的殘基或可以刪除結構域(例如催化或結合結構域)的全部或部分。可以引入(通過取代或插入)終止密碼子進編碼核酸序列以產生截短的蛋白質。插入突變體通常涉及在該多肽的非末端點加入物質。這可以包括插入免疫反應性表位或僅一個或多個殘基。也可以產生末端加入，稱為融合蛋白。取代突變體通常包括在該蛋白質內的一個或多個位點一個胺基酸交換為另一胺基酸，並且可以設計來調節多肽的一種或多種性質，喪失或不喪失其它功能或性質。取代可以使保守性的，即，一個胺基酸用其中一種類似形狀和電荷的胺基酸取代。保守性取代是本領域所熟知的並且包括，例如丙氨酸變成絲氨酸；精氨酸變成賴氨酸；天冬醯胺變成穀氨醯胺或組氨酸；天冬氨酸變成穀氨酸；半光氨酸病床絲氨酸；穀氨醯胺變成天冬醯胺；穀氨酸變成天冬氨酸；甘氨酸變成脯氨酸；組氨酸變成天冬醯胺或穀氨醯胺；異亮氨酸變成亮氨酸或脯氨酸；亮氨酸變成纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸變成精氨酸；曱硫氨酸變成亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸變成酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；絲氨酸變成蘇氨酸；蘇氨酸變成絲氨酸；色氨酸變成酪氨酸；酪氨酸變成色氨酸或苯丙氨酸；以及纈氨酸變成異亮氨酸或亮氨酸。備選地，取代可以是非保守性的，這樣多肽的功能或活性受到影響。非保守性改變通常涉及用化學上不相似的殘基取代該殘基，例如用極性或帶電荷的胺基酸取代非極性或不帶電荷的M酸，反之亦然。術語"功能等價的密碼子"在此用於指編碼相同氣基酸的密碼子，例如用於精氨酸或絲氨酸的6種密碼子，並且還指編碼生物學上等價的胺基酸的密碼子(見下面的表l)。還應該理解，氬基酸和核酸序列可以包括額外的殘基，例如額外的N-或C-末端胺基酸或5'或3'序列，並仍然基本上是如在此公開的其中一個序列中列出的，只要該序列符合上面列出的標準，包括在蛋白質表達涉及的地方保持蛋白質的生物學活性。末端序列的加入特別是應用到可以例如，包括編碼區的5，或3，部分旁側的多種非-編碼序列或可以包括多種內部序列，即內含子(其已知在基因中出現)的核M列。tableseeoriginaldocumentpage30下面是基於改變蛋白質的胺基酸來產生等價的或甚至是改良的、第二代分子的討論。例如，在蛋白質結構中某些胺基酸可以取代為另一胺基酸而沒有明顯喪失與結構例如抗體的抗原結合區或底物分子上的結合位點的相互結合能力。因為是蛋白質的相互作用能力和性質決定了蛋白質的生物功能活性，可以在蛋白質序列中以及在其DNA編碼序列中進行某些胺基酸取代，並仍然產生具有類似性質的蛋白質。因而本發明人考慮可以在基因的DNA序列中作多種改變而不明顯喪失它們的生物學效用或活性，如下面討論的。表l顯示了編碼特定胺基酸的密碼子。在產生這種改變時，可以考慮胺基酸的親水指數(hydropathicindex)。親水性胺基酸指數在賦予蛋白質上的相互作用生物學功能中的重要性通常是本領域所理解的(Kyte和Doolittle，1982)。人們認為胺基酸的相對親水性質有助於得到的蛋白質的二級結構，而二級結構又確定了蛋白質與其它分子，例如酶、底物、受體、DM、抗體、抗原等的相互作用。本領域還認識到，可以基於親水性而有效地進行類似胺基酸的取代。美國專利4，554，101(通過引入作為參考)聲稱由相鄰的胺基酸的親水性決定的蛋白質最大的局部平均親水性與該蛋白質的生物性質相關。如美國專利4,554,101中詳細描述的，將下面的親水性值賦給胺基酸殘基精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);穀氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬醯胺(+0.2);穀氨醯胺(+0.2);甘氨酸(O);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5±1);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-l.0);甲硫氨酸(-l.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。應該理解，一個胺基酸可以置換為另一個具有類似親水性值的^^酸並仍然產生生物學上等價且免疫學上等價的蛋白質。在這樣的改變中，優選置換親水性值為±2的胺基酸，親水性值在±1內的那些M酸是特別優選的，並且親水性值在土0.5內的那些是更特別優選的。如上面概述的，胺基酸置換通常是基於胺基酸側鏈取代基的相對類似性，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。考慮多種前述性質的示例性置換是本領域技術人員所熟知的並且包括精氨酸和賴氨酸；穀氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；穀氨醯胺和天冬醯胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。IV.核酸分子A.編碼天然蛋白質或經^"飾的蛋白質的多核苷酸本發明涉及能表達蛋白質或多肽的全部或部分的可從細胞分離的多核苷酸。在本發明的一些實施方案中，考慮已經經特異性突變的病毒基因組以產生缺少某些功能性病毒多肽的病毒，該多肽可以編碼含有全部或部分病毒胺基酸序列，或者可以改造它們而使得它們不編碼這種病毒多肽或編碼至少一種功能或活性減少、減小或缺少的病毒多肽。重組蛋白質可以從表達細胞純化而產生活性蛋白質。痘苗病毒的基因組以及編碼區的定義可以在Rosel等，(1986)、Goebel等，(1990)和/或GenBank登記號NC-00159找到，將它們每個通過引入作為參考。如此處使用的，術語"DNA片段"指已經分離無特殊物種的總基因組DNA的DNA分子。因而，編碼多肽的DNA片段指含有野生型、多態性或突變的多肽編碼序列包括在術語"DNA片段"內的是一種多肽或多種多肽、比多肽小的DNA片段以及重組載體，包括例如，質粒、粘粒、噬菌體、病毒等。如本申請案中使用的，術語"痘病毒多核苷酸"指已經從總基因組核酸分離的編碼痘病毒多肽的核酸分子。類似地，"痘苗病毒多核苷酸"指已經從總基因組核酸分離的編碼痘苗病毒多肽的核酸分子。"痘病毒基因組"或"痘苗病毒基因組"指可以提供給宿主細胞以在存在或不存在輔助病毒時產生病毒顆粒的核酸分子。與野生型病毒比較，基因組可以或可以不經重組突變。術語"cDNA"意在指用信使RM(mRM)作為模板製備的DM。與使用基因組DNA或從基因組的、不經加工或經部分加工的RNA模板聚合而來的DNA比較，使用cDNA的優勢是cDNA主要含有對應蛋白質的編碼序列。當優選全部或部分基因組序列時，序列可能要加倍，例如其中需要非編碼區用於優化表達或其中非編碼區例如內含子在反義策略中要用來耙向。還考慮來自給定物種的特殊多肽可以由具有稍微不同但是編碼相同的蛋白質(參見上面的表l)的核酸序列的天然變體表達。類似地，含有分離的或純化的野生型或突變的多肽基因的多核苷酸指包含野生型或突變的多肽編碼序列的DNA片段，以及在某些方面，包含調節序列，其基本上與其它天然出現的基因或蛋白質編碼序列分離'在這方面，為簡單起見將術語"基因"用於指功能性蛋白質、多肽或肽編碼單元(包括正常轉錄、轉錄後修飾或定位所需的任意序列)。本領域^L術人員將理解，這個功能性術語(functionalterm)包括基因組序列、cDNA序列以及更小的改造的基因片段，其表達或可以適合於表達蛋白質、多肽、結構域、肽、融合蛋白以及突變體.編碼天然的或經修飾的多肽的全部或部分的核酸可以含有下列長度的編碼這種多肽的一部分的連續核酸序列:10、20、30、40、50、'60、70、,80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、！40、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000或更多核苷酸、核苷或鹼基對。在特殊的實施方案中，本發明涉及分離的DNA片段和整合了DNA序列的重組載體，該DNA片段或重組載體編碼野生型或突變的痘病毒多肽或肽，所述的多肽或肽在其胺基酸序列中包括了根據或基本對應天然多肽的連續氨基i^列。因而，分離的DNA片段或含有DNA片段的載體可以編碼例如，可以抑制或減少TNF活性的TNF調節劑或TNF調節多肽。術語"重組，，可以與多肽或特定多肽的名稱一道使用，並且這通常指從已經在體外進行了操作核酸分子產生的多肽或者從這種經體外操作的分子的複製產物的產生的多肽。在其它實施方案中，本發明涉及分離的DNA片段和整合了DM序列的重組載體，該DM片段或重組載體編碼在其M酸序列中包括了根據或基本對應該多肽的連續M酸序列的多肽或肽。用於本發明中的核酸片段，不管該編碼序列自身的長度，可以與其它核酸序列，例如啟動子、多腺苷酸化信號、額外的限制性內切酶位點、多克隆位點、其它編碼片段等結合，這樣它們的總體長度可以相當不同。因而考慮可以採用幾乎任何長度的核酸片段，總的長度優選通過易於在預期的重組DNA方法中的製備和使用來限制。考慮本發明的核酸構建體可以編碼來自任何來源的全長多肽或編碼截短的所述多肽，例如截短的痘苗病毒多肽，這樣該編碼區的轉錄物代表了該截短型。截短的轉錄物則可以翻譯成截短的蛋白質。備選地，核酸序列可以編碼具有額外的異源編碼序列的全長多肽序列，例如，以允許該多肽的純化、運輸、分泌、翻譯後修飾或用於治療性利益，例如靼向或效力。如上面討論的，可以將標籤或其它異源多肽加至經〗奮飾的多肽編碼序列，其中"異源"指與該經修飾的多肽不同的多肽。在一個非限制性實例中，可以製備一種或多種核酸構建體，其包括與特殊基因，例如B18R基因相同或互補的連續的一段核苷酸。核酸構建體可以是至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6，000、7,000、8,000、9,000、10,000、15,000、20,000、30,000、50,000、100，000、250,000、500,000、750，000至至少1，000，000個核苷酸的長度，以及更大的、高達並且包括染色體大小(包括所有中間長度和中間範圍)的構建體，只要核酸構建體例如酵母人工染色體是本領域技術人員所知的。很容易理解，如此處使用的"中間長度"和"中間範圍"表示包括列出的值或列出的值之間(即包括這些值或這些值之間的所有整數)的任何長度或範圍。用於本發明的DM片段包含生物學功能等價的經修飾的多肽或肽，例如經修飾的gelonin毒素。這種序列可以由於密碼子冗餘和已知在核酸序列以及在因而編碼的蛋白質中天然出現的功能等價性而產生。備選地，功能等價的蛋白質或肽可以通過應用重組DNA:R術產生，在該技術中可以基於考慮要交換的胺基酸的性質而設計蛋白質結構中的改變。由人設計的改變可以通過應用定點誘變技術引入，例如引入對蛋白質抗原性的改良、減少蛋白質對接受該蛋白質的受試者的體內毒性效果或增加涉及該蛋白的任何治療的效力。在某些其它實施方案中，本發明涉及分離的DNA片段和重組載體，該DM片段和重組載體在它們的序列中包含了來自在此鑑定的序列(和/或通過引入作為參考)中顯示的序列的連續核酸序列。然而，可以突變這種序列以產生其活性相對於野生型改變的蛋白質產物。還應該理解，本發明不限於這些鑑定的序列的特殊核酸和氨基,列。重組載體和分離的DNA片段因而可以不同地包括痘病毒編碼區本身、在基本的編碼區中具有選擇的改變或修飾的編碼區，或者它們可以編碼物^功能等價的蛋白質或肽。^"'、'A本發明的DM片段包含在生物學上功能等價的痘苗病毒蛋白質和肽。這種序列可以由於密碼子冗餘和已知在核酸序列以及在因而編碼的蛋白質中天然出現的功能等價性而產生。備選地，功能等價的蛋白質或肽可以通過應用重組DNA技術產生，在該技術中可以基於考慮要交換的胺基酸的性質而設計蛋白質結構中的改變。由人設計的改變可以通過應用定點誘變技術引入，例如引入對蛋白質的抗原性的改良。B.痘苗病毒多核苷酸的誘變在多個實施方案中，可以改變或誘變痘病毒多核苷酸。改變或突變可以包括插入、缺失、點突變、倒位等並且可以導致某些途徑或分子機制的調節、激活和/或失活，以及改變基因產物的功能、定位或表達，特別是是基於產物無功能。在採用時，編碼痘病毒的全部或部分的多核苷酸的誘變可以通過許多標準的誘變方法(Sambrook等，1989)完成。突變是藉此生物體的量或結構發生改變的過程。突變可以涉及單個基因、基因段或整個染色體的核苷酸序列的修飾。單個基因的改變可以通過點突變完成，點突變涉及DNA序列內單個核苷酸威基的除去、加入或置換,或它們可以通過涉及大量核苷酸的插入或缺失的改變完成。突變可以在膝露於化學或物理i秀變劑後i秀導。這種突變-誘導劑包括電離放射、紫外光和一系列化學劑例如烷化劑和多環芳烴，它們都能直接或間接(通常是在一些代謝生物轉化後)與核酸相互作用。由這些因子誘導的DNA損傷可以在受影響的DM複製或修復時導致4^序列的修飾並因而導致突變。突變還可以通過使用特殊的靶向方法進行的定點突變。1.隨機誘變a.插入誘變插入誘變是基於通過插入已知的DM片段使基因失活。由於其涉及插入某種類型的DM片段，產生的突變通常是功能喪失型(loss-of-function)，而不是功能獲得型(gain-of-function)突變。然而，也存在幾個產生了功能獲得型突變的插入的實例插入誘變在細菌和果蠅中已經十分成功(Cooley等，1988)並且最近已經成為玉米(擬南芥；(Marks等，1991;Koncz等，1990);和金魚草(So腿er等，1990)中的一個有力的工具。插入誘變可以用標準的分子生物學技術完成。b.化學誘變化學誘變提供了某些優勢，例如發現各種各樣的具有不同表型嚴重性程度的突變的能力以及執行容易且便宜。大部分化學致癌物在DNA中產生突變。苯並芘、N-乙醯氧基乙醯氛基芴和黃麴黴素B1引起細菌和哺乳動物細胞中的GC至TA的顛換。苯並芘也可以產生鹼基替換，例如AT替換成TA。N-亞硝基化合物產生GCAT的轉換。由曝露於N-亞硝基脲誘導的胸腺嘧啶的04位置的烷基化導致TA轉換為CG。c.輻射i秀變生物分子通過電離輻射而退化。吸收入射能力導致離子和自由基的形成以及一些共價鍵的破壞。對輻射損傷的易感性在分子之間，以及在相同分子的不同晶體形式直接表現出相當的可變性.這取決於總的累積劑量，以及取決於劑量率(因為一M在自由基，它們引起的分子損傷取決於它們的自然擴散速率並因而取決於實際時間)。通過使樣品儘可能冷來減少和控制損傷。電離輻射引起DNA損傷，通常與劑量率成比例。在本發明中，術語"電離輻射"表示包括粒子或光子的輻射，所述粒子或光子具有足夠的能量或可以產生足夠的能量來產生電離(得到或失去電子)。一種示例性的且優選的電離輻射是X-線輻射。給定細胞所需要的或用於特殊分子的電離輻射的量通常取決於那種細胞或分子的性質以及突變乾標的性質。用於確定輻射的有效量的手段是本領域熟知的。d.體外掃描誘變隨機誘變也可以用易錯PCR引入。誘變率可以通過在具有模板稀釋物的多個試管內執行PCR來增加。一種特別有用的誘變技術是丙氨酸掃描突變，在該方法中將許多殘基單獨地用胺基酸丙氨酸置換，這樣可以測定喪失側鏈相互作用的效果，而使構象的大規模幹擾最小化(Cunningham等，1989)。體外掃描飽和誘變提供了一種用於獲得大量結構功能信息的快速方法，該方法包括(i)鑑定調節配體結合特異性的殘基，(ii)基於在給定位置處保持活性的那些胺基酸和消失活性的那些胺基酸來更好地理解配體結合，(iii)評價活性位點或蛋白質亞結構域的整體塑性，(iv)鑑定導致增加結合的胺基酸置換。2.定點誘變結構引導的定點誘變展示了一種用於分解和改造蛋白質-配體相互作用的有利工具(Wells,1996;Braisted等，1996)。該技術提供了序列變體的製備和測試，其通過引入一種或多種核苷^列改變至選擇的DM中。定點誘變使用編碼具有期望突變的DNA序列的特定寡核苷酸序列，以及足夠數目的鄰近的、未經修飾的核苷酸。以這種方式，提供了具有足夠大小和複雜性的引物序列來在被橫過的缺失接頭兩端形成雙鏈。優選大約17-25核苷酸長度的引物，在受改變序列的接頭兩端都具有大約5-10個殘基。該技術通常採用以單鏈和雙鏈兩種形式存在的噬菌體載體.可用於定點誘變的載體包括載體如M13噬菌體。這些噬菌體載體是可商業獲得的，並且它們的用途是本領域技術人員所熟知的.雙鏈質粒也是在定點誘變中常規採用的，其減少了將目標基因從噬菌體轉移至質粒的步驟.通常，人們首先獲得單鏈載體，或使雙鏈載體的兩M解鏈，所述的單鏈在其序列中包含編碼期望蛋白質或遺傳元件的DNA序列。然後將合成製備的攜帶突變序列的寡核苷酸引物與該單鏈DM製備物退火，在選擇雜交條件時考慮錯配度。讓雜交的產物接受DM聚合酶例如大腸桿菌聚合酶I(Klenow片段)的作用以便完成帶有突變的鏈。因而，形成了異源雙鏈，其中一條鏈編碼原來的非突變序列，而第二條鏈攜帶期望的突變。然後將這種異源雙鏈用於轉化合適的宿主細胞，例如大腸桿菌細胞，並選擇包括攜帶突變序列的重組載體。關於功能重要性和蛋白質給定殘基的信息量的綜合信息可最好通過其中總共試驗19個胺基酸置換的飽和突變來獲得。這種方法的缺點是多殘基飽和誘變的邏輯是令人望而生畏(Warren等，1996，Zeng等，1996;BurtonandBarbas，1994;Yelton等，1995;Hilton等，1996)。必須研究成百上千，並且甚至可能是成千上萬個定點突變。然而，改良的技術使得突變的產生和快速篩選更加直接。也參見美國專利5，798，208和5,830,650，其描述了"Look-Through"誘變。其它的定點誘變方法在美國專利5，220，007;5,284，760;5，354，670;5，366，878;5，389，514;5,635，377和5，789，166中公開。C.載體術語"載體"用於指用於引入細胞的可以將外源核酸序列插入其中的載體核酸分子，在細胞中栽體可以複製。核酸序列可以是"外源的"，其意味著其對載體要引入其中的細胞來說是外來的或該序列與細胞中的序列同源，但是在宿主細胞核酸內處於不常發現該序列的位置。載體包括質粒、粘粒、病毒(噬菌體、動物病毒和植物病毒)和人工染色體(YAC)。本領域技術人員將有能力通過標準的重組技術構建載體，這些技術在Sambrook等，(1989)和Ausubel等，(1994)中描述，將這兩篇文獻都通過引入作為參考。除了編碼經修飾的多肽例如經修飾的白樹毒素，載體可以編碼補經修飾的多肽序列，例如標籤或靶向分子。編碼這種融合蛋白的有用載體包括pIN載體(hiouye等，1985)，其為編碼一段組氨酸的載體，和pGEX載體，其用於產生穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)可溶性融合蛋白用於後面的純化和分離或裂解。靶向分子是引導經修飾的多肽至受試者身體的特殊器官、組織、細胞或其它位置的分子。術語"表達載體"指含有編碼至少部分能轉錄的基因產物的核^列的載體。在一些情形中，RNA分子則翻譯成蛋白質、多肽或肽。在其它情形中，這些序列不翻譯，例如在反義分子或核酶的產生中。表達載體可以含有許多"控制序列"，控制序列指在特殊的宿主生物體中有效連接的編碼序列的轉錄以及可能的翻譯所必須的核酸序列。除了，控制轉錄和翻譯的控制序列，栽體和表達栽體還可以含有發揮其它功能的核酸序列並在下文中描述。根據本發明，痘苗病毒本身是表達載體。存在也可以用於改造本發明的痘苗病毒的其它病毒和非病毒載體。在一個實施方案中，這種載體可以經改造而表達GM-CSF。1.啟動子和增強子"啟動子"是一種控制序列，其為核酸序列的一個區域，在該區域轉錄的起始和速率受到控制。其可能含有調節蛋白和分子，例如RNA聚合酶和其它轉錄因子可以結合的遺傳元件。短語"有效定位的"、"有效連接的"、"受到控制的"以及"受到轉錄控制的"表示關於一條核酸序列啟動子處於正確的功能性位置和/或取向以控制該序列的轉錄起始和/或表達。啟動子可以和或可以不和"增強子"協同使用，增強子指涉及核酸序列的轉錄激活的順式作用調控序列。啟動子可以是天然與基因或序列關聯的啟動子，這可以通過分離位於編碼序列和/或外顯子上遊的5，非編碼序列獲得。這種啟動子可以稱為"內源性的"。類似地，增強子可以是天然與核酸序列關聯的，位於該序列的上遊或下遊。備選地，通過使編碼核酸序列定位於重組或異源啟動子的控制下將獲得某些優勢，重組或異源啟動子是指在其天然環境中通常不與核酸序列相關聯的啟動子.重組或異源增強子也指在其天然環境中通常不與核酸序列相關的增強子。這種啟動子或增強子可以包括其它基因的啟動子或增強子，以及從任意其它原核、病毒或真核細胞分離的啟動子或增強子，以及不是"天然出現的"啟動子或增強子，即含有不同轉錄調控區的不同元件和/或改變表達的突變。除了合成產生啟動子和增強子的核酸序列，序列還可以用重組克隆和/或核酸分子擴增技術，包括PCR，連同在此^Hf的組合物(參見美國專利4,683,202、美國專利5,928,906，將每篇通過引入作為參考)來產生。此外，考慮也可以採用控制序列，該控制序列引導序列在非核細胞器例如線粒體、葉綠體等內轉錄和/或表達。自然，釆用有效引導DNA片段在選擇用於表達的細胞類型、細胞器和生物體中表達的啟動子和/或增強子應該是重要的。在本發明的某些實施方案中，啟動子是在痘苗病毒複製周期中激活的痘苗病毒啟動子。特別是，啟動子可以使痘苗病毒晚期啟動子-在晚期啟動子控制下的表達使表達限於複製周期的晚期，導致增強的癌選擇性(由於晚期基因表達在正常組織中應該最少或不存在)。基因表達也可以處於合成的早期-晚期啟動子控制以使基因表達的持續時間和水平最大化。Mastrangelo等，1999，將其通過引入作為參考。分子生物學技術人員通常知道啟動子、增強子和細胞類型組合用於表達的用途，例如，參見Sambrook等，(1989)，將其通過引入作為參考。採用的啟動字可以在引導引入的DNA片段高水平表達的合適M下是組成型的、組織特異性的、可誘導的和/或有用的，例如在重組蛋白和/或肽的大規模生產中是有利的。啟動子可以是異源性的或內源性的。特殊的啟動子是在細胞質中可以是有活性的那些，因為病毒在細胞質內複製。表2列出了可以在本發明的某些實施方案的內容中採用來調控基因表達的幾種元件/啟動子。該名單無意於窮盡所有涉及促i^達的可能元件，而僅僅是舉例說明。表3提供了可誘導元件的實例，其為可以響應特定刺激而激活的核酸序列的區域。tableseeoriginaldocumentpage40tableseeoriginaldocumentpage41tableseeoriginaldocumentpage42tableseeoriginaldocumentpage43組織特異啟動子或元件的鑑定以及用於表徵它們的活性的方法是本領域技術人員所熟知的。這些區域的實例包括人LIMK2基因(Nomoto等，1999)、生長抑素受體2基因(Kraus等，1998)、鼠附睪^L黃酸結合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)、小鼠ct2(XI)型膠原(Tsumaki等，1998)、D1A多巴胺受體基因(Lee等，1997)、胰島素樣生長激素-II(Wu等，1997)、人血小板-內皮細胞粘附分子-1(Almendro等，1996)和SM22ot啟動子。也在本發明中認為有用的是dectin-l和dectin-2啟動子。可以與本發明組合使用的其它病毒啟動子、細胞啟動子/增強子和可誘導啟動子/增強子在表2和3中列出。此外，任何啟動子/增強子組合(按照真核啟動子lt據庫EPDB)也可以用於驅動編碼寡糖加工酶、蛋白質摺疊輔助蛋白、可選標記蛋白或目標異源蛋白的結構基因的表達。備選地，用於癌基因治療(表4)或肺瘤靶向(表5)的組織特異性啟動子可以用於本發明的核酸分子。表4:用於癌基因治療的候選組織特異性啟動子tableseeoriginaldocumentpage44tableseeoriginaldocumentpage45tableseeoriginaldocumentpage462.起始信號和內部核糖體結合位點還需要一種特異性的起始信號來有效翻譯編碼序列。這些信號包括ATG起始密碼子或毗鄰順序。可能需要提供內源性翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。本領域一般技術人員將能夠容易地確定這些並且提供必須的信號。眾所周知，起始密碼子必須是和引導的編碼序列的閱讀框在"框內"以確保整個插入序列的翻譯。外源性翻譯控制信號和起始密碼子可以是天然的或合成的。表達效率可以通過包括合適的轉錄增強子元件來增強。在本發明的某些實施方案中，將內部核糖體^位點(IRES)元件的用途用於產生多基因或多順反子信使RNA。IERS元件能夠繞開5，-甲基化帽依賴性翻譯的核糖體掃描模型並在內部位點開始翻譯(Pelletier和Sonenberg,1988)。已經描述了來自小核糖核酸病毒科的兩個成員(脊髄灰質炎病毒和腦炎心肌炎病毒)的IRBS元件以及來自哺乳動物信使RNA的IRES(Macejak和Sarnow，1991)可以將IRES元件連接至異源開放閱讀框。多個開放閱讀框可以一起轉錄，每個由IRES分來，產生多順反子信使RNA。利用IRES元件，每個開放閱讀框能夠到達核糖體進行有效的翻譯。用單個啟動子/增強子可以有效表達多個基因而轉錄單個信使RM(參見美國專利5，925，565和5，935，819,通過引入作為參考)。3.多克隆位點載體可以包括一個多克隆位點(MCS),其為含有多個限制性內切酶位點的核酸區域，任何一個限制性內切酶位點可以與標準的重組技術協同使用來消化該載體(參見Carbonelli等，1999、Levenson等，1998，和Cocea,1997,將它們通過引入作為參考)。"限制性內切酶消化"指用僅在核酸分子的特定位點作用的酶催化切割核酸分子。許多這些限制性內切酶是可商業獲得的。這些限制性內切的用途是為本領域技術人員所廣泛理解的。通常，載體用在MCS內切割的限制性內切酶進行線性化或片段化以使得外源序列能連接至該載體。"連接"指在可以是或可以不是相互鄰接的兩個核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程。涉及限制性內切酶和連接反應的技術是重組
技術領域：
的技術人員所周知的。4.剪接位點大多數轉錄的真核RNA分子將進行RNA剪接以將內含子從初始轉錄本除去。含有基因組真核序列的載體可能需要供體和/或受體剪接位點來確保轉錄物正確加工來表達蛋白質。(參見Chandler等，1997，將其在此通過引入作為參考。)5.終止信號本發明的載體或構建體將通常包含至少一個終止信號。"終止信號"或"終止子"包括涉及特異性終止由RNA聚合酶進行的RNA轉錄。因而，在某些實施方案中，考慮終止RNA轉錄物產生的終止信號。在體內可能必須終止子來獲得期望的信使RNA水平。在真核系統中，終止子區也可以包含特定的DNA序列，其允許位點特異性切割新的轉錄物以便暴露多腺苷酸化位點。逸傳遞信息給專一的內源性聚合酶來加入一段大約200個腺苷酸殘基(多聚A)至該轉錄物的3，端。用這種多聚A尾的RNA分子表現得更穩定並且得以更有效地轉錄。因而，在涉及真核細胞的其它實施方案中，優選終止子包含RNA切割信號，並且更優選終止子信號促進該信使RNA的多腺苷酸化。終止子和/或多腺苷酸化位點元件可以用於增強信使RNA水平和/或使^達盒連讀到其它序列最小化。考慮用於本發明的終止子包括在此描述的或本領域一般技術人員已知的任何已知的轉錄終止子，包括(但不限於)例如，基因的中止序列，例如牛生長因子終止子或病毒終止序列，例如SV40終止子。在某些實施方案中，終止信號可以是缺少可轉錄或可翻譯序列，例如由於序列平截。6.多腺苷酸信號在表達中，特別是真核表達，通常包括多腺苷酸信號來實現轉錄物的正確多腺苷酸化。多腺苷酸信號的性質並不認為是對成功實踐本發明關鍵，和/或可以採用任意這種序列。優選的實施方案中包括SV40多腺苷酸化信號和/或牛生長激素多腺苷酸化信號，它們是方便的和/或已知在多種把細胞中良好作用。多腺苷酸化可以增加轉錄物的穩定性或可以有助於細胞質轉運。7.複製起點為了在宿主細胞中增殖載體，栽體可以含有一個或多個複製位點的起點(通常稱為"ori")，其為複製在該處起始的特異性核酸序列。備選地，如果宿主細胞是酵母則可以採用自主複製序列URS)。8.可選擇和可篩選標記在本發明的某些實施方案中，含有本發明的核酸構建體的細胞可以通過在該表達載體中包括標記而體外或體內鑑定。這種標記物將賦予細胞可鑑別的變化，使得容易地鑑定含有該表達載體的細胞。通常，可選標記是賦予使得能進行選擇的性質的可選標記。正向可選標記是其中該標記的存在使得能對其選擇的標記，而負向可選標記是其中它的存在防止了對它的選擇的標記。正向可選標記的一個實例是批藥性標記。通常，包含藥物選擇標記有助於轉化物的克隆和鑑定，例如賦予對新黴素、嘌呤黴素、潮霹素、DHFR、GPT、zeocin和histidinol抗性的基因是有用的可選標記。除了賦予使得能基於狀態實現而鑑別轉化體的表型，也考慮其它類型的標記，包括可篩選標記例如GFP,GFP的根據是比色分析。備選地，可以利用可篩選酶例如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯黴素乙醯轉移酶(CAT)。本領域技術人員也將指導如何採用免疫標記，可能與FACS分析協同使用。使用的標記認為是不重要的，只要其能夠與編碼基因產物的核酸同時表達。可選標記和可篩選標記的其它實例是本領域技術人員所熟知的。D.核酸檢測除了它們在引導痘病毒蛋白質、多肽和/或肽的表達中的作用外，在此公開的核酸序列具有許多其它用途。例如，他們具有作為探針或引物用於涉及核酸雜交的實施方案的用途。它們可以用於本發明的診斷或篩選方法。本發明包括編碼痘病毒或痘病毒多肽調節物的核酸的檢測。1.雜交長為13-100個核苷酸之間，優選17-100個核苷酸之間，或在本發明的一些方面多達1-2千鹼基或更長的探針或引物的使用使得能形成既穩定又有選擇性的雙鏈分子。在多於20個鹼基長度的連續序列上具有互補序列的分子通常是優選的，以增加獲得的雜交分子的穩定性和/或選擇性。人們將通常優選設計具有一條或多條20-30個核苷酸，或如果需要甚至是更長的互補序列用於雜交的核酸分子。這種片段可以很容易製備，例如，通過用化學手段直接合成片段或通過將選擇的序列引入用於重組生產的重組載體。因此，可以因為它們與互補的DNA序列和/或MA序列選擇性形成雙鏈或提供引物用於從樣品擴增DNA或RNA的能力而可以使用分子本發明的核酸序列。取決於預想的應用，人們將期望採用各種雜交條件來獲得探針或引物對乾序列的各種程度的選擇性。對於需要高度選擇性的應用，人們通常將期望釆用相對高的嚴^件來形成交鏈。例如，相對低的鹽和/或高的溫度條件，如在大約501C至大約701C的溫度下提供大約0.02M至大約0.10MNaCl。這麼高的嚴格條件容忍極小(如果有的話)的探針或引物與模板或fe鏈之間的錯配並特別適合用於分離特定的基因或用於檢測特定的mRNA轉錄物。通常應該理解，可以通過加入增加量的甲醯胺來獲得更嚴格的條件。對於某些應用，例如，定點誘變，應該理解低嚴格條件是優選的。在這些條件下，即使雜交鏈的序列不是完全互補而是在一個或多個位置處錯配，也可以發生雜交。可以通過增加鹽濃度和/或增加溫度而給條件賦予更少的嚴格性。例如，中等嚴格條件可以由大約37n至大約的溫度下的大約0.1-0.25MNaCl提供，而低嚴格條件可以由大約20匸至大約55'C的溫度範圍下的大約0.15-0.9M的鹽提供。可以根據期望的結果而容易地操縱雜交條件。在其它實施方案中，可以在例如大約20。C-大約37X:之間的溫度、50niMTris-HCl(pH8.3)、75mMKC1、3mMMgCl2、1.0mM二硫蘇糖醇的條件下實現雜交。使用的其它雜交條件可以包括大約10mMTris-HCl(pH8.3)、50mMKC1、1.5mMMgCl2，在大約40。C-大約72"C範圍的溫度下。在某些實施方案中，釆用本發明定義的序列的核酸，結合合適的手段，例如標記用於測定雜交，將是有利的。各種各樣的合適指示手段是本領域已知的，包括螢光、放射性、酶促或其它配基，例如親和素/生物素，它們能夠被檢測。在優選的實施方案中，人們期望採用螢光標記或酶標籤，例如，脲酶、鹼性磷酸酶或過氧化物酶，而不是放射性或其它對環境不不利的試劑。在酶標記的情形中，比色指示底物已知能用於提供檢測手段來鑑定與含有互補序列的樣品的特異性雜交，所述的檢測手段是可通過看得見或通過分光光度計來檢測的。通常，設想在此描述的探針或引物將可在溶液雜交，如在PCR中用試劑，用於檢測對應基因的表達，以及在採用固相的實施方案中用作試劑。在涉及固相的實施方案中，試驗DNA(或RNA)吸附或固定於選擇的基質或表面上。然後讓固定的單鏈核酸與選擇的探針在理想的條件下雜交，選擇的條件將取決於特殊的情況(例如取決於G+C含量、把核酸的類型、核酸來源、雜交探針的大小等)。用於特殊的目標應用的雜交條件的優化是本領域技術人員所熟知的。在洗滌雜交的分子除去非特異性結合的探針分子後，通過測定結合的標記的量檢測和/或定量雜交。代表性的固相雜交方法在美國專利5，843，663、5，900，481和5，919，626中公開。可用於實踐本發明的其它雜交方法在美國專利5，849，481、5,849,486和5,851,772中>^開。在本說明書的該部分中確定的這些或其它參考文獻的相關部分在此通過引入作為參考。2.核酸的擴增用作擴增模板的核酸可以根據標準的方法學(Sambrook等，1989)從細胞、組織或其它樣品分離。在某些實施方案中，分析是在整個細胞或組織勻漿物或生物流體樣品上進行而無需充分純化模板核酸。核酸可以是DNA或分級的或整個細胞RNA。如果使用RNA，可能期望首先將RNA轉換為互補的DNA。如此處使用的，術語"引物"意指包括能在模板依賴性的過程中引發新生核酸的合成的任意核酸。通常，引物是長為10到20和/或30個鹼基對的寡核苷酸，但是可以採用更長的序列。可以提供雙鏈和/或單鏈形式的引物，儘管單鏈形式是優選的。讓引物對與模板核酸在允許選擇性雜交的條件下接觸，所述的引物對是設計用於選擇性雜交至對應在此鑑定的基因序列的核酸。取決於期望的應用，可以選擇將僅使得能雜交至與引物完全互補的序列的高嚴格雜交條件。在其它的實施方案中，雜交可以在降低的嚴格性下進行，以使得核酸的擴增含有與引物序列的一個或多個錯配。一旦雜交，讓模板-可1物複合物與一種或多種促進模板依賴性核酸合成的酶接觸。進行多輪擴增，也稱為"循環"，直至產生了足夠量的擴增產物。可以檢測或定量擴增產物。在某些應用中，可以通過視覺手段來進行檢測。備選地，檢測可以涉及通過整合的放射標記或螢光標記的化學發光、閃爍顯像或甚至是通過使用電和/或熱脈衝信號的系統間接鑑定產物(Bellus，1994),許多模板依賴性過程可以用來擴增給定模板樣品中存在的寡核苷酸序列。最有名的一種擴增方法是聚合酶鏈式反應(稱為PCR)，其在美國專利4，683，195、4，683，202和4，800，159以及在Innis等，1988中詳細描述，將這每篇文獻通過引入作為參考。可以釆用逆轉錄酶PCR擴增方法來定量擴增的mRNA的量。逆轉錄RNA為cDNA的方法是眾所周知的(參見，Sambrook等，1989),用於逆轉錄的備選方法利用熱穩定性DM聚合酶。這種方法在WO90/07641中描迷。聚合酶鏈式反應方法學是本領域所熟知的。RT-PCR的代表性方法在美國專利5,882,864中描述。用於擴增的另一種方法是連接酶鏈式反應("LCR")，其在歐洲申請案No.320308中公開，在此將該參考通過全文引入作為參考。美.國專利4，883，750描述了一種類似LCR的方法用於讓探針對結合至耙序列上。也可以使用一種在美國專利5，912，148中公開的基於PCR和寡核苷酸連接酶測定法(0LA)。可以用於實踐本發明的用於擴增靶核酸序列的備選方法在美國專利5，843，650、5，846，709、5，846，783、5，849，546、5,849，497、5，849，547、5，858，652、5，866，366、5，916，776、5，922，574、5，928，905、5，928，906、5，932，451、5,935,825、5，939，291和5，942，391、GB申請案No.2202328和PCT申請案No.PCT/US89/01025中公開，在此將每篇參考文獻通過全文引入作為參考。在PCT申請案No.PCT/US87/00880中描述的QP複製酶也可以在本發明中用作一種擴增方法。在這種方法中，在存在RM聚合酶時將具有與乾標的區域互補的區域的RNA複製序列加入至樣品中。該聚合酶將複製該複製序列，然後可以檢測該複製序列。等溫擴增技術，其中限制性內切核酸每和連接酶用於實現在限制性位點的一條鏈中含有核苷5'-[ot-硫代-]-三磷酸的靶分子的擴增，也可以用於擴增本發明中的核酸(Walker等，19")。在美國專利5,916,779中公開的鏈置換擴增技術(SDA)是另一種進行核酸的等溫擴增的方法，該方法涉及多輪的鏈置換和合成，即切口平移法。其它的核酸擴增方法包括基於轉錄的擴增系統(TAS)，包括基於核酸序列的擴增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989;PCT申請案W088/10315，在此通過全文引入作文參考).歐洲申請案No.3"8"公開了一種核酸擴增方法，其涉及循環合成單鏈RNA("ssRNA")、ssDM和雙鏈DNA(dsDNA)，其可以用於本發明。PCT申請案W089/06700(在此通過全文引入作文參考)公開了一種核酸序列擴增方案，該方法是基於啟動子區/引物序列與靶標單鏈DNA("ssDM")雜交，隨後轉錄該序列的許多RNA拷貝。這種方案不是循環得，即新模板不是從得到的RM專利物產生。其它的擴增方法包括"RACE"和"單邊PCR，，(Frohman，1990;0hara等,1989)。3.核酸的檢測在任何擴增後，可能期望從模板和/或過剩的引物分離擴增產物。在一個實施方案中，擴增產物用標準的方法通過瓊脂糖、瓊脂糖-丙烯醯胺或拒丙烯醯胺凝膠電泳來分離(Sambrook等，1989)。可以切取出分離的擴增產物並從凝膠中洗出用於進一步操作。使用低熔點瓊脂糖凝膠，可以通過加熱凝膠而將分離的帶移出，隨後提取核酸。也可以通過本領域已知的的色譜技術實現核酸的分離。存在許多類型的可用於實踐本發明的色譜法，包括吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法、羥基磷灰石色譜法、分子篩色譜法、反相色譜法、柱色譜法、紙色鐠法、薄層色鐠法和氣相色譜法以及HPLC。在某些實施方案中，對擴增產物進行顯影。一種典型的顯影方法涉及用溴化乙錠染色凝膠並在UV光下顯影電泳條帶。備選地，如果擴增產物用放射或螢光標記的核苷酸整體標記，則可以將分離的擴增產物曝光於x-光片或在合適的激發光譜下顯影。在一個實施方案中，在分離擴增產物後，讓經標記的核酸探針與擴增的標記序列接觸。探針優選綴合至發色團，但是也可以經放射標記。在另一實施方案中，將探針綴合至結合伴侶(bindingpartner),例如抗體或生物素，或攜帶可檢測部分的另一結合伴侶。在特別的實施方案中，通過與經標記的探針的DM印跡和雜交iM^測。涉及DN印跡的技術是本領域技術人員所熟知的(參見Sambrook等，1989)。前述技術的一個實例描述於美國專利5,279,721(在此將其通過引入作為參考)中，該專利公開了用於自動電泳和核酸轉移的儀器和方法。該儀器使得能進行電泳和印跡而不需外部操作電泳並很理想用於進行根據本發明的方法，可以用於實踐本發明的用於核酸檢測的其它方法在美國專利5，840，873、5，843，640、5，843，651、5，846，708、5，846，717、5，846，7265、846,729、5，849，487、5，853，990、5,853,992、5,853,993、5,856,092、5，861，244、5，863，732、5，863，753、5，866，331、5，905，024、5，910，407、5,912,124、5,912,145、5,919,630、5,925,517、5,928,862、5,928,869、5，929，227、5，932，413和5，935，791中公開，在此將它們每篇通過引入作為參考。4.其它測定法用於遺傳篩選的其它方法可以在本發明的範圍內使用，例如，用於檢測基因組DNA、cDM和/或RNA樣品中的突變。用於檢測點突變的方法包括變性梯度凝膠電泳法("DGGE")、限制性片段長度多態性分析("RPLP")、化學或酶促切割方法、直接測序由PCR擴增的靶區域(見上面)、單鏈構象多態性分析("SSCP")以及本領域熟知的其它方法。用於點突變的其它篩選方法是基於RM/DNA或RNA/RNA異源雙鏈中的>15^對錯配的RM酶切割。如此處使用的，術語"錯配"定義為雙鏈RNA/RM、RM/DM或DNA/DM分子中一個或多個未配對的或錯配的區域。因而該定義包括由於插入/缺失突變以及單個或多個鹼基點突變引起的錯配。美國專利4，946，773描迷了RNA酶A錯配切割測定法，該方法涉及退火單鏈DNA或RNA試驗樣品至RNA探針，並隨後用RM酶A處理該核酸雙鏈。為了檢測錯配，將通過電泳根據大小而分離的RNA酶A處理的單鏈產物與經類似處理的對照雙鏈比較。在含有照雙鏈中不可見的較小片段(切割產物)的樣品記為陽性。其它研究者已經描述的RNA酶I在錯配測定中的使用'來自PromegaBiotech的文獻描述了RNA酶I用於錯配檢測的用途。Promega銷售含有RNA酶的試劑盒，據報導該酶切割4種已知的錯配中的三種。其它人已經描述了使用MutS蛋白或其它DM-修復酶用於檢測單M錯配。可以用於本發明的實踐的用於檢測缺失、插入或置換突變的備選方法在美國專利5,849,483、5，851，770、5，866，337、5,925,525和5，M8，870中公開，將每個這些專利通過全文引入作為參考。E.基因轉移的方法用於核酸遞送以有效表達本發明組合物的合適方法相信實際上包括在此描述的或本領域一般技術人員將知道的、通過其可以將核酸(例如，DNA，包括病毒和非病毒載體)引入進細胞起、細胞、組織或生物體中的任何方法。這種方法包括(但不限於)直接遞送DNA例如通過注射(美國專利5，994，624、5，981，274、5，945，100、5，780，448、5，736，524、5,702,932、5,656,610、5，589，466和5，580，859,在此將它們每個通過引入作為參考)，包括顯微注射(Harlan和Weintraub，1985;美國專利5，789,215，在此通過引入作為參考)；通過電穿孔(美國專利5,384,253，在此通過引入作為參考)；通過磷酸4丐沉澱(Graham和VanDerEb，1973;Chen和0kayama，1987;Rippe等1990);通過使用DEAE-葡聚糖，隨後使用聚乙二醇(Gopal，1985);通過直接sonicloading(Fechheimer等，1987);通過脂類體介導的轉染(Nicolau和Sene，1》82;Fraley等，1979;Nicolau等，1987;Wong等，1980;Kaneda等，1989;Kato等，1991);通過微粒轟擊(PCT申請案No.W094/09699和95/06128;美國專利5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，在此將每個通過引入作為參考)；通過用碳化矽攪動(Kaeppler等,1990;美國專利5，302，523和5，464，765，在此將每個通過引入作為參考)；通過農桿菌介導的轉換(美國專利5，591，616和5，563，055，在此將每個通過引入作為參考)；或通過PEG-介導的原生質體的轉換(Omirulleh等，1993;美國專利4，684，611和4,952，500，在此將每個通過引入作為參考)；通過乾燥/抑制-介導的DM攝取(Potrykus等1985)。通過這些技術的應用，可以穩定或暫時轉化細胞器、細胞、組織或生物體。5.脂類組分和部分在某些實施方案中，本發明涉及含有一種或多種與核酸相關的脂類、胺基酸分子(例如肽)或其它小分子化合物。在此討論的任何實施方案中，所述的分子可以是痘病毒多肽或痘病毒多肽調節基因，例如編碼任一種痘病毒多肽的部分或全部的核酸，或備選地，編碼痘病毒多肽調節物的全部或部分的胺基酸分子。脂類是一種特性上不溶於水並且可以用有機溶劑萃取的物質。本領域技術人員將符合在此具體描述的化合物認為是脂類，並且包含於本發明的組合物和方法中。可以將脂質組分和非脂質組分通過共價或非共價方式相互連接。脂類可以天然出現的或是合成的(即由人設計或生產)。然而，脂類通常是生物物質。生物脂類是本領域所熟知的，並且包括例如，中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、類固醇、萜類、溶脂類(lysolipids)、糖鞘脂類、糖脂、硫脂類、具有醚和酯連接的脂肪酸的脂類和多聚化的脂類以及它們的組合物。可以將與脂質關聯的核酸分子或胺基酸分子(例如肽)分散進含有脂的溶液中、用脂溶解、用脂乳化、與脂混合、與脂組合、共價結合至脂上、作為懸浮物包含於脂中或相反與脂結合。本發明的脂或脂/痘病毒相關組合物不限於任何特殊的結構。例如，它們也可以簡單地散布於溶液中，可能形成大小或形狀不均一的聚集物。在另一實例中，它們可以存在於雙層結構，例如細胞器中，或具有"坍陷"結構。在另一非限制性實例中,也考慮lipofectamine(GibcoBRL)-痘病毒或Superfect(Qiagen)-痘病毒複合物。在某些實施方案中，脂組合物可以包含大約1%、大約2%、大約3%、大約4%about5%、大約6%、大約7%、大約8%、大約9%、大約10%、大約11%、大約12%、大約13%、大約14%、大約15%、大約16%、大約17%、大約18%、大約19%、大約20%、大約21%、大約22%、大約23%、大約24%、大約25%、大約26%、大約27%、大約28%、大約29%、大約30%、大約31%、大約32%、大約33%、大約34%、大約35%、大約36%、大約37%、大約38%、大約39%、大約40%、大約41%、大約42%、大約43%、大約44%、大約45%、大約46°yL大約47%、大約48%、大約49%、大約50%、大約51%、大約52%、大約53%、大約54%、大約55%、大約56%、大約57%、大約58%、大約59%、大約60%、大約61%、大約62%、大約63%、大約64%、大約65%、大約66%、大約67%、大約68%、大約69%、大約70%、大約71%、大約72%、大約73%、大約74%、大約75%、大約76%、大約77%、大約78%、大約79%、大約80%、大約81%、大約82%、大約83%、大約84%、大約85%、大約86%、大約87%、大約88%、大約89%、大約90%、大約91%、大約92%、大約93%、大約94%、大約95%、大約96%、大約97%、大約98%、大約99%、大約100%或可源於此的任何範圍的特殊脂、脂類型或非脂組分如藥物、蛋白質糖、核酸或在此^Hf的或本領域技術人員已知的其它物質。在一個非限制性實例中，脂組分可以包含大約10%-大約20%的中性脂類，和大約33%-大約34%的腦苷脂類以及大約1°/。的膽固醇。在另一非限制性實例中，脂質體可以包含4%-大約12%的闢類，其中大約1%的微膠粒確切地是番茄烯，剩下大約3%-大約11%的脂質體含有其它闢類；和大約10%-35。/的磷脂醯膽鹼，以及大約1%的藥物。因而，考慮本發明的脂組合物可以包含任意組合或百分比範圍的任意脂類、脂類型或其它組分。V.GM-CSF在本發明的一個特殊方面，痘苗病毒將攜帶編碼GM-GSF的基因。GM-CSF是粒-巨噬細胞集落刺激因子，其為一種有助於產生更多白細胞，特別是粒細胞、巨噬細胞和變成血小板的細胞的物質。它是屬於稱為造血(血液形成)劑的藥物家族的細胞因子，並也稱為沙莫司亭GM-CSF由Cantrell等，(1985)首先克隆並測序。人GM-CSF是由單個開放閱讀框編碼的144個胺基酸的糖蛋白，預測的分子量為16，293道爾頓。其表現出與小鼠GM-CSF有69%的核苷酸同源性和54%的^^酸同源性，並且作為單拷貝基因存在。GM-CSF由許多不同的細胞類型(包括激活的T細胞、B細胞、巨噬細胞、肥大細胞、內皮細胞和成纖維細胞)響應細胞因子或免疫和炎性刺激而產生。除了粒細胞-巨噬細胞祖細胞外，GM-CSF還是紅細胞、巨核細胞和嗜酸粒細胞祖細胞的生長因子。對於成熟的造血細胞，GM-CSF是粒細胞、單核細胞/巨噬細胞和嗜酸性細胞的存活因子並激活它們的效應子功能。還據報導GM-CSF對非造血細胞具有功能性作用。其可以誘導人內皮細胞遷移和增殖。GM-CSF是種屬特異性的，人GM-CSF對小鼠細胞不具有功能性作用。GM-CSF通過結合至特定的細胞表面受體而發揮其生物學作用。人GM-CSF信號轉導所需的高親和性受體已經顯示為異二聚體，由一條GM-CSF-特異性ot和一條由IL-3和IL-5的高親和性受體共有的P鏈組成。儘管GM-CSF可以刺激許多種類細胞系(包括骨肉瘤、癌和腺癌細胞系)的增殖，用於患有黑素瘤、白血病、淋巴瘤、成神經細胞瘤、卡波西肉瘤、間皮瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸直腸癌、腦癌、腎癌和子宮頸癌的人的GM-CSF(單獨或與其它免疫療法一起)的臨床試驗正在進行。GM-CSF的普通副作用包括流行性感冒樣症狀(發熱、頭痛、肌肉疼痛)、皮瘮、面部潮紅和骨痛。VI.其它異源基西在一些實施方案中，用於本發明的痘苗病毒含有表達異源序列的核酸序列，該異源序列不編碼GM-CSF，而是編碼其它異源序列。在某些實施方案中，該異源序列編碼細胞因子。備選地或額外地，該痘苗病毒可以含有編碼IL-12、胸苷脫氨基酶、TNFs等。而且，在此討論的任何基因產物可以由包含於痘苗病毒內並用於本發明的方法中的核酸編碼。VII.藥物製劑、遞送和治療方案在本發明的一個實施方案中，考慮通過遞送痘苗病毒來治療過度增殖性疾病，例如癌的方法。考慮治療的癌的實例包括肺癌、頭頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、子宮癌、骨癌、睪丸癌、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、肺部中的瘤前病變、結腸癌、骨髄瘤、膀胱癌和可以治療的任意其它癌或腫瘤。通常，藥物組合物的有效量定義為足以可檢測地且重複地改善、減少、最小化或限制疾病或其症狀的程度。可採用更嚴格的定義，包括疾病的消除、根除或治癒。優選地，患者將具有足夠的骨髄功能(定義為>2,000/mm的外周粒細胞絕對計數和>100，000/mm的血小板計數)、足夠的肝功能(膽紅素<1.5mg/dl)和足夠的腎功能(肌酐4cm的腫瘤，要施用的量是大約4-10ml(優選10ml)，而對於〈4cm的腫瘤，將施用大約l-3ml(優選3ml)的量。作為單次劑量遞送的多次注射劑包含大約0.1-大約0.5ml的量。可以通過施用多次注射劑給胂瘤(間隔大約1cm)來有利地接觸病毒顆粒。在手術介入的情形中，本發明可以在手術前使用，使得不能進行手術的腫瘤能接受切除術。備選地，本發明可以在手術時使用和/或在手術後使用，以治療殘留的或轉移性疾病。例如，可以用含有痘苗病毒多肽或痘苗病毒的製劑注射或灌注切除後的腫瘤床，所述的痘苗病毒含有突變，使得該痘苗病毒有利於用於治療癌或癌細胞。灌注可以在切除後繼續進行，例如，通過保留在手術位點植入的導管來繼續。還考慮定期的手術後治療。還可以在需要的地方，例如，在腫瘤切除的地方，進行持續施用，並且對瘤床進行處理以除去殘留的顯微病灶。優選通過注射器或導管插入術來遞送。這種連續的灌注可以在初次治療後進行大約1-2小時、大約2-6小時、大約6-12小時、大約12-24小時、大約1-2天、大約1-2周或更長。通常，經由連續灌注的施用的治療組合物的劑量等價於通過單次或多次注射給予的劑量，在灌注進行期間過一段時間進行調整。進一步考慮，肢體灌注(limbperfusion)可用於施用本發明的治療性組合物，特別是在黑素瘤和肉瘤的治療中。治療方案也可以變化，並且通常取決於腫瘤類型、腫瘤位置、疾病進展和患者的健康及年齡。顯然，某些類型的肺瘤將需要更強力的治療，而同時，某些患者不能忍受更重的方法。基於治療性製劑已知的效力和毒性(如果有的話)臨床醫生將十分適於做這種決定。在某些實施方案中，要治療的肺瘤可能不能(至少在開始時不能)切除。由於在腫瘤邊緣的收縮或通過除去某些特別有侵潤性的部分，用治療性病毒構建體治療可以增加腫瘤的可切除性。在治療後，有可能進行切除可。切除後額外的治療將用來除去腫瘤位點的肉眼不可見的殘留胂瘤。用於原發性腫瘤或切除後的瘤床的典型療程將涉及多次劑量。典型的原發性腫瘤治療涉及在兩周期間施用6次劑量。該兩周用藥法可以重複l、2、3、4、5、6或更多次。在治療過程中，可以再次評估對完成既定的給藥的需要。治療可以包括多種"單位劑量，，。單位劑量定義為含有預定量的治療性組合物。要施用的量，以及特別的途徑和劑型是在臨床領域的技術人員的能力內。單位劑量不需要以單次注射施用，而是可以包括在設定的時間期限內的持續灌注。本發明的單位劑量可以方便地根據用於病毒構建體的噬斑形成單位(pfu)來描述。單位劑量範圍是103、104、105、106、107、108、109、101。、1011、1012、1013pfu以及更高。備選地，取決於病毒的類型和可達到的滴定度，將遞送1-100、10-50、100-1000或多達lx104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x101。、1x1011、1x1012、1x1013、1x10"或1xIO"更高感染性病毒顆粒(vp)給患者或患者細胞。B.可注射組合物或製劑用於遞送編碼全部或部分痘苗病毒基因組的表達栽體或病毒至本發明的癌或腫瘤細胞的優選方法是通過腫瘤內注射。然而，在此公開的藥物組合物可以備選經腸胃外、靜脈內、皮內、肌內、經皮膚或甚至是經腹膜內施用，如美國專利5,543，158;5，641，515和5，399，363中描述的(在此特別將每篇專利通過全文引入作為參考)。核酸構建體的注射可以通過注射器或用於注射溶液的任何其它方法遞送，只要表達構建體可以通過注射所需的針頭的特殊規格。最近已經描述了(美國專利5,846,233)—種新的無針注射系統，該系統具有的能量裝置。也已經描i了注射器系統在基因治療中的使用，該系:允許精確地在任意深度多次注射預定量的溶液(美國專利5，846,225)。作為游離鹼或可藥用鹽的活性化合物的溶液可以在與表面活性劑例如羥丙纖維素穩定混合的水中製備。g劑也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及在油中製備。在一般的存儲和使用條件下，這些製劑含有防腐劑用以防止微生物的生長。適合注射施用的藥物形式包括無菌含水溶液劑或分散劑以及用於臨時製備無菌注射用溶液劑或分散劑的無菌粉劑(美國專利5，466，468，特別在此通過全文引入作為參考)。在所有情形中,所述的形式必須是無菌的，並且應該是達到容易進行注射程度的流體。其在製造和儲存條件下必須是穩定的，並且必須對抗^t生物如細菌和真菌的汙染作用進行防腐。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和流體聚乙二醇等)及其合適的混合物和/或植物油的溶劑或分散介質。適當的流動性可例如通過用包衣如卵磷脂、在分歉劑的情形中通過保持所需的粒度，以及通過使用表面活化劑來維持。對微生物作用的預防可通過多種抗菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等來實現。在許多情形中，將優選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可注射用組合物的延長吸收可通過在該組合物中使用延緩吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠來實現。對於在含水溶液中的腸胃外施用，例如，如有必要應該適當地緩衝該溶液並用足夠的鹽水或葡萄糖首先賦予該流質稀釋劑等滲性。這些特殊含水溶液特別適合靜脈內、肌內、皮下、瘤內和腹膜內施用.就此而論，根據本公開內容，可使用的無菌含水介質將是本領域那些技術人員已知的。例如，可將一次劑量可溶解於1ml等滲的NaCl溶液中，並加入1000ml皮下輸注流體中或在建議的輸注位點處注入(參見例如，"Remington'sPharmaceuticalSciences"15thEdition,1035-1038和1570-1580頁)。劑量的一些變化必然會取決於受治療的受試者的狀況發生。在任何情況下，負責施用的人將確定用於個體受試者的合適劑量。此外，對於人施用，製劑應該符合如FDAOfficeofBiologiesstandards要求的無菌性、致熱原性、一般安全性(generalsafety)和純度標準。無菌注射用溶液劑通過這樣製備將需要量的活性化合物與上文中列舉的多種其它成分一起合併進合適的溶劑中，根據需要，之後過濾滅菌。通常，*劑通過將多種滅菌的活性成分合併進無菌載體製備，所在用於製備;菌可注射溶液劑的無菌粉劑的情形中，，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥技術，所述技術產生活性物質加上任何來自其事先無菌-過濾的溶液的額外所需成分的粉末。在此公開的組合物可以配製成中性或鹽形式。可藥用鹽，包括酸加成鹽(用蛋白質的游離氨基形成)並且其是與無機酸例如，鹽酸或磷酸，或與有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。用游離羧基形成的鹽也可以源於無枳減，例如，氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵，以及有^U^例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等。一旦配製成製劑，溶液將以與劑型相容的方式並以治療有效的量施用。製劑4艮容易以各種劑型，例如可注射溶液劑、藥物釋放膠嚢劑(drugreleasecapsules)等。如在此使用的，"載體"包括任何以及所有的溶劑、*介質、賦形劑、包衣、稀釋劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和延緩吸收的試劑、緩沖液、載體溶液、混懸液、膠體等。這種介質和試劑用於藥學活性物質的用途在本領域中是熟知的。除了與活性化合物不相容的任何常規介質或製劑外，考慮將它們用於治療性組合物中。輔助的活性成分也可整合進該組合物中。短語"可藥用"或"藥理學可接受的"指在施用給人時不會產生變應性反應或類似的不利反應的分子實體和組合物。含有蛋白質作為活性成分的含水組合物的製備是本領域熟知的。通常，這種組合物可製備成可注射劑，作為流體溶液劑或混懸劑；也可製備成適合在注射前溶解或懸浮於流體中的固體形式。C.聯合治療本發明的化合物和方法可用於包括癌和動脈粥樣硬化的過度增生性疾病/病狀範圍。為了增加用本發明的組合物(例如減毒的痘苗病毒)治療的效力，將這些組合物與在治療那些疾病和病狀中有效的其它製劑組合是理想的。例如，癌的治療可以用本發明的治療性化合物和其它抗癌療法，例如抗癌劑或手術來實施。可以釆用多種組合；例如，減毒多達痘病毒如痘苗病毒是"A"而笫二種抗-癌療法是"B":A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A將本發明的治療性表達構建體施用給患者將按照用於所述特殊的笫二種療法的一般方法，如果有毒性的話，考慮痘病毒治療的毒性。期望應該根據需要重複治療周期。還應考慮，多種標準療法以及外科手術可與上面描述的癌或腫瘤細胞療法結合協同應用。1.抗-癌療法"抗-癌"劑能夠負面地影響受試者中的癌，例如通過殺死癌細胞、誘導癌細胞凋亡、降低癌細胞的生長速度、減少轉移的發生率或數量、減小腫瘤大小、抑制腫瘤生長、減少對腫瘤或癌細胞的血液供給、增強對抗癌細胞或腫瘤的免疫應答、防止或抑制癌m，或延長患有癌的受試者的壽命。抗-癌劑包括生物製劑(生物療法)、化學治療劑和放射治療劑。一般來說，這些其它組合物將以有效殺死或抑制細胞增生的組合量提供。該過程可能涉及將細胞與所述表達構建體和所述藥劑或多種因子同時接觸。這可通過這樣實現將細胞與包含這兩種製劑的單一組合物或藥理學製劑接觸，或通過將細胞在與兩種不同的組合物或製劑同時接觸，其中一種組合物含有表達栽體而另一組合物含有第二種製劑。腫瘤細胞對化療劑和放療劑的耐受是臨床腫瘤學中的一個主要問題。當前癌研究的一個目標是找到通過將化學療法和放射療法與基因療法組合聯合而提高化學療法和放射療法的效力的方法。例如，單純皰滲-胸腺激酶(HS-tK)基因，當通過逆轉錄病毒載體系統遞送至腦腫瘤後，成功地誘導了對抗病毒劑更昔洛韋的易感性。在本發明的內容中，考慮可以類似地將痘病毒療法除了與其它促凋亡劑或細胞周期調控劑聯合使用外，還與化學療法、放射療法、免疫療法或其它生物學介入聯合使用。備選地，基因療法可以在其它製劑治療的數分鐘至數周之前或之後進行。在其中其它製劑和表達構建體分開施用給細胞的實施方案中，通常應該確保有效時段不會在每次遞送時間之間終止，這樣製劑和表達構建體將仍然能夠對細胞發揮有利的聯合作用。在這種情況下，考慮可將細胞與這兩種用藥程式接觸，相互之間在約12-24小時內，更優選相互之間在約6-12小時內。然而，在一些情況中，顯著地延長治療的時間，其中在各次施用之間有數天(2、3、4、5、6或7)至數周(1、2、3、4、5、6、7或8)的時間間隔可能是理想的。a.化學療法癌療法也包括多種用基於化學和放射的治療的聯合療法。聯合化療包括，例如順鉑(CDDP)、卡鉑、甲基苄肼、氮芥、環磷醯胺、喜樹鹼、異環磷醯胺、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulfan)、硝基脲、放線菌素D、柔紅黴素、阿黴素、博來黴素、立可黴素(plicomycin)、絲裂黴素、依託泊苷(VP16)、它莫西芬、雷洛昔芬、雌激素受體結合劑、紫杉醇(taxol)、吉西他濱(gemcitabien)、諾維本(navelbine)、法尼基-蛋白轉移酶抑制劑、反鉑(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、長春新鹼、長春花鹼和甲氨喋呤、氮烯咪胺(Temazolomide，DTIC的含水形式)，或前述藥物的任意類似物或衍生物變體。化學療法與生物療法的組合稱為生化療法。b.放射療法導致DNA損傷並已廣泛利用的其它因素包括通常稱為Y-射線、X-射線的那些，和/或直接遞送放射性同位素至腫瘤細胞。還考慮其它形式的DNA損傷因素，例如微波和紫外線照射。很有可能，所有這些因素實現對DNA、DM前體、DNA的複製和修復，以及染色體的裝配和維持的廣範損傷。X射線的劑量範圍從用於長時間周期(3至4周)的50-200倫琴的日劑量到2000-6000倫琴的單次劑量。放射性同位素的劑量範圍變化很大，並且取決於同位素的半衰期、發射的輻射的強度和類型，以及贅生細胞的吸收。術語"接觸"和"曝露"，在應用於細胞時，在此用於描述將本發明的組合物(例如，低氧的抗腫瘤化合物)或者化學治療劑或放射治療劑遞送至靶細胞或直接與靶細胞並置的方法。為了實現細胞殺死或停滯，可將兩種製劑都以有效用於殺死細胞或防止其分裂的組合劑量遞送給細胞。c.免疫療法通常，免疫治療學依賴於使用免疫效應細胞和分子來靶向和破壞癌細胞。免疫效應物可以是，例如腫瘤細胞表面上的一些標記的特異性抗體。抗體單獨可用作治療的效應物，或者它可以募集其它細胞來實際實現細胞殺死。抗體也可與藥物或毒素(化學治療劑、放射性核素、蓖麻毒素A鏈、霍亂毒素、百曰咳毒素等)綴合併僅用作靶向劑。備選地，效應物可以是攜帶直接或間接與腫瘤細胞靶標相互作用的表面分子的淋巴細胞。多種效應細胞包括細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞。治療方式，即直接的細胞毒活性和某些痘病毒多肽的抑制或減少的組合將在癌治療中提供治療效果。免疫療法還可用作聯合療法的一部分.用於聯合療法的一般方法在下面論述。在免疫治療的一方面，腫瘤細胞必須攜帶一些受靶向作用，即不存於大多數其它細胞上的標記。存在許多腫瘤標記並且任意這些標記在本發明範圍內可適合用於靶向。普通的腫瘤標記包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、泌尿器官腫瘤相關抗原、胎兒抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層粘連蛋白受體、er6B和pl55。免疫療法的一個備選方面是免疫刺激效應的抗癌效應。也存在免疫刺激分子，包括細胞因子例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、y-IFN;趨化因子例如MIP-1、MCP-1、IL-8;以及生長因子例如FLT3配體。將免疫刺激分子作為蛋白質或利用基因送遞與腫瘤抑制基因例如mda-7組合已顯示增強了抗肺瘤效果(Ju等，2000)。如先前論述的，當前正在研究的或使用的免疫療法的實例是免疫佐劑(例:i口，牛分才支軒菌(V/co6acfer/i/邁)、惡小生痴原蟲(/Vfls/zocr/i/邁屍a7c&ar咖)、二硝基氯苯和芳香族化合物)(美國專利5,801,005、美國專利5,739,169、Hui和Hashimoto,1998、Christodoulides等，1998)、細胞因子療法(例如，幹擾素oc、P和Y;IL-1、GM-CSF和TNF)(Bukowski等，1998;Davidson等，1998;Hellstrand等，1998)、基因療法(例如TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin等,1998;Austin-Ward和Villaseca，1998;美國專利5，830，880和美國專利5，846，945)和單克隆抗體(例如抗神經節苷脂GM2、抗-HER-2、抗-pl85)(Pietras等，1998;Hanibuchi等，1998)。赫賽汀(曲妥單抗)是阻斷HER2-neu受體的嵌合(鼠-人)單克隆抗體。它具有抗-腫瘤活性並已經批准用於惡性腫瘤的治療(Dillman，1999)。使用赫賽汀和化學療法的癌的聯合療法已顯示比單獨的療法更有效。因此，考慮可以將一種或多種抗-癌療法與在此描述的痘病毒相關的療法一起使用。被動免疫療法.存在許多不同方法用於癌的被動免疫治療。它們大致可以分為注射抗體自身；注射偶聯至毒素或化學治療劑的抗體；注射偶聯至放射性同位素的抗體；注射抗獨特型抗體；以及清除骨髄中的腫瘤細胞。優選地，在被動免疫療法中採用人單克隆抗體，因為它們在患者中產生極少或不產生副作用。然而，它們的應用多少因它們的缺乏而受到限制，並且目前僅在病變內施用。神經節苷脂抗原的人單克隆抗體已經在病變內施用給患有復發性皮膚黑素瘤的患者(Me和Morton,1986)。在每天或每周病變內注射後，10名患者中有6名觀察到了腫瘤退化。在另一研究中，通過病變內注射兩種人單克隆抗體獲得了較好的成功(Irie等，1989)。使用多於一種針對兩種不同的抗原的單克隆抗體或甚至是具有多抗原特異性的抗體是可能是有利的。治療方法也可以包括施用淋巴因子或如Bajorin等，(1988)描述的其它免疫增強因子。人單克隆抗體的發展在本說明書的其它地方有更詳細的描述。主動免疫療法.在主動免疫療法中，施用通常具有不同的細胞佐劑的抗原肽、多肽或蛋白質或自身或異體腫瘤細胞組合物或"疫苗"(Ravindranath和Morton，1991;Morton等，1992;Mitchell等，1990;Mitchell等，1993)。在黑素瘤免疫療法中，那些引發了高的IgM應答的患者通常比沒有引發或引發了低的IgM抗體的那些患者能更好的存活。IgM抗體通常是暫時抗體(transientantibody)，抗神經節普脂抗體或抗糖類抗體(anti-carbohydrateantibody)看上去例夕卜。過繼免疫療法.在過繼免疫療法中，將患者的循環淋巴細胞或肺瘤侵潤淋巴細胞在體外分離，通過淋巴因子例如IL-2活化或用腫瘤壞死基因轉導，並再次施用(Rosenberg等，1988;1989)。為了實現這些，將給動物或人患者施用免疫學有效量的與如在此描述的整合了佐劑的抗原肽組合物組合的活化的淋巴細胞。活化的淋巴細胞最優選是早先在體外從血液或腫瘤樣品分離並活化(或"擴展的")的患者自身的細胞。這種免疫療法形式已經在幾個案例中引起了黑色瘤和腎癌退化，但是與不響應的那些患者比較，有效者的比例極小。d.基因在另一實施方案中，所述的第二種治療是基因療法，在該療法中，治療性多核苷酸在減毒痘苗病毒施用之前、之後或同時使用。與編碼其中一種以下基因產物的栽體協同使用的痘病毒的遞送將對靶組織具有合併的抗肺瘤效果。備選地，可以將痘病毒基因工程改造為病毒載體以包括治療性多核苷酸。許多蛋白質包含於本發明中，其中一些在下面描述。表7列出了可以為一些與本發明聯合的基因療法所靶向的多種基因。細胞增生誘導物.取決於功能，誘導細胞增生的蛋白質進一步分為多種類型。所有這些蛋白質的共性是它們調節細胞增生的能力。例如，一種形式的PDGF即sis癌基因蛋白，是一種分泌型生長因子。癌基因極少從編碼生長因子的基因產生，並且目前，sis是僅有的已知天然出現的致癌生長因子。在本發明的一個實施方案中，考慮將針對特殊的細胞*增生誘導物的反義mRM用於防治該細胞增生誘導物的表達。蛋白質FMS、ErbA、ErbB和neu是生長因子受體。這些受體的突變導致可調控功能的喪失。例如，影響Neu受體蛋白的跨膜結構域的點突變導致了neu致癌基因。erbA致癌基因是源於甲狀腺激素的細胞內受體。經修飾的致癌ErbA受體被認為是與內源性曱狀腺激素受體竟爭，引起不受控制的生長。最大的一類致癌基因包括信號轉導蛋白(例如，Src、Abl和Ras)。Src蛋白是一種胞質蛋白酪氨酸激酶，在一些情形中其通過527號酪氨酸殘基處的突變實現從原癌基因轉化為致癌基因。相反，在一個實例中，GTP酶蛋白ras從原癌基因轉化為致癌基因是由序列中的12號胺基酸從纈氨酸突變為甘氨酸引起。Jun、Fos和Myc蛋白是作為轉錄因子直接對核4亍使功能的蛋白質。細胞增生的抑制基因.腫瘤抑制致癌基因用於抑制多度的細胞增生。這些基因的失活破壞了它們的抑制活性，導致不受調控的增生。腫瘤抑制基因p53、pl6和C-CAM在下面描述。除了先前已經描述過的p53，另一種細胞增生抑制物是p16。主要的真核細胞周期的轉換由周期蛋白依賴性激酶(或CDK)引發。一種CDK，周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)調控通過d期。這種酶的活性可以在d晚期將使Rb磷酸化。CDK4活性受激活亞基D型細胞周期蛋白以及受抑制亞基控制，pl6IN"已經在生物化學上鑑定為特異性結合併抑制CDK4,並因而調節Rb磷酸化的蛋白質(Serrano等,1993;Serrano等，1995)。由於pW蛋白是CDK4抑制劑(Serrano,1993)，這種基因的缺失可以增加CDK4的活性，導致Rb蛋白的過度磷酸化。p16也已知能調控CDK6的功能。pl6固屬於最新描述的一類CDK-抑制性蛋白，該類蛋白還包括p168、p19、p21麗和p27KIP1。pl6,基因對應於9p21，其為許多腫瘤類型中常常缺失的染色體區域。p16，基因的純合子缺失和突變在人腫瘤細胞系中很頻繁。這種跡象表明pl6""基因是腫瘤抑制基因。然而，這種解釋受到觀察到pl6INK4基因改變頻率在初始的未培養腫瘤比在培養的細胞系中更低這個現象的挑戰(Caldas等，1994;Cheng等，1994;Hussussian等，1994;Kamb等，1994;Kamb等，1994;Mori等，1994;0kamoto等，1994;Nobori等，1994;0rlow等，1994;Arap等,1995)。通過用質粒表達載體轉染恢復野生型pl6^功能見少了一些人胂瘤細胞系的集落形成(0kamoto，1994;Arap，1995)。可以根據本發明釆用的其它基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-1、MEN-II、zacl、p73、VHL、醒AC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/pl6融合基因、p21/p27融合基因、抗凝血(例如，C0X-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、r仏，、腳、ra屍、er6、/7/2s、"i:、r"、^p、A"、aW、E1A、p300、涉及血管發生的基因(例如，VEGF、FGF、血小板反應素、BAI-1、GDAIF或它們的受體)和MCC。程序化細胞死亡調控劑.凋亡或程序化細胞死亡是正常胚胎發育、維持成人組織中的穩態和抑制致癌作用所必需的程序(Kerr等，1972)。Bcl-2家族的蛋白和ICE樣蛋白酶已經證明是其它系統中的凋亡的重要調控劑和效應物。發現與濾泡性淋巴瘤相關的Bcl-2蛋白在控制凋亡和增強細胞響應各種凋亡刺激而存活中起顯著的作用(Bakhshi等，1985;Cleary和Sldar，1985;Cleary等，1986;Tsujimoto等，1985;Tsujimoto和Croce，1986)。現在認識到在進化上保守的Bcl-2蛋白是相關蛋白質的家族的一個成員，該家族的蛋白質可以分為死亡激動劑或死亡拮抗劑。在其發現後，人們發現Bcl-2抑制由多種刺激引發的細胞死亡.而且，現在很清楚存在著Bcl-2細胞死亡調控蛋白家族，該家族的蛋白質具有相同的結構和序列同源性。這些不同的家族成員已經顯示類似於Bcl-2的功能(例如，BCU、Bclw、Bcls、Mcl-l、Al、Bf1-1)或抵消Bcl-2的功能並促進細胞死亡(Bax、Bale、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri),D.手術大約60%有癌症的患者將進行一些類型的手術，包括預防性、診斷性或分期、治癒性和姑息性手術。治癒性手術是一種可與其它療法，例如本發明的治療、化學療法、放射療法、激素療法、基因療法、免疫療法和/或備選療法協同使用的癌症治療。治癒性手術包括其中將癌性組織全部或部分物理移除、切斷和/或破壞的切除術。腫瘤切除術指物理移除至少部分的腫瘤。除了腫瘤切除術，通過手術的治療包括雷射手術、冷凍手術、電外科手術和顯樣史控制手術(莫氏手術)。進一步考慮本發明可以與淺表癌、初期癌或附帶量的正常組織的移除協同使用。切除全部癌性細胞、組織或腫瘤的部分後，可能在身體上形成空洞。治療可以通過用額外的抗癌療法灌注、直接注射、間接注射或局部應用於該區域來完成。這種治療可以例如，每l、2、3、4、5、6或7天，或每l、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月重複一次。這些治療也可以使用不同的劑量。E.其它製劑考慮可以將其它製劑與本發明聯合使用以提高治療的療效。這些額外的製劑包括免疫調節劑、影響細胞表面受體上調和間隙連接的製劑、細胞生長抑制劑和分化劑、細胞粘附抑制劑、增加過度增生細胞對凋亡誘導劑的敏感性的製劑或其它生物製劑。免疫調節劑包括腫瘤壞死因子；幹擾素ot、P和y;IL-2及其它細胞因子；F42K及其它細胞因子類似物；或MIP-1、MIP-1P、MCP-1、RANTES以及其它趨化因子。進一步考慮細胞表面因子或它們的配體，例如Fas/Fas配體、DR4或DR5/TRAIL(Apo-2配體)的上調將通過建立對過度增生細胞的自分泌或旁分泌效果而加強本發明的凋亡誘導能力。通過提高間隙連接的數目增加細胞間的信號傳導將增加對鄰近過度增生細胞群體的抗-過度增生效果。在其它實施方案中，細胞生長抑制或分化劑可以與本發明聯合使用以提高治療的抗過度增生效果。考慮將細胞粘附的抑制劑來提高本發明的效力。細胞粘附抑制劑的實例是勦著斑激酶(FAK)抑制劑和洛伐它丁。進一步考慮可以將增加過度增生細胞對凋亡的敏感性的其它製劑，例如抗體c225與本發明聯合使用來提高治療效力。Apo2配體(Apo2L，也成為TRAIL)是肺瘤壞死因子(TNF)細胞因子家族的一個成員。TRAIL激活許多類型的癌細胞中的快速凋亡，而對正常細胞無毒性。TRAILmRNA在多種組織中出現。大多數正常細胞看上去對TRAIL的細胞毒作用有抗性，暗示存在可以保護免於TRAIL誘導的凋亡的機制。描述的第一種TRAIL抗體(稱為死亡受體4(DR4))含有胞質內的"死亡結構域"；DR4傳導由TRAIL攜帶的凋亡信號。已經鑑定了結合TRAIL的其它受體。一種稱為DR5的受體含有細胞質內的死亡結構域並很像DR4的傳導凋亡信號。DR4和DR5mRNA在許多正常組織和腫瘤細胞系中表達。最近，已經鑑定了誘騙受體例如DcRl和DcR2，其阻止TRAIL通過DR4和DR5i秀導凋亡。這種i秀騙受體因而代表了一種新的用於調控對直接位於細胞表面的促凋亡細胞因子的敏感性的機制。這種抑制性受體在正常組織中的優選表達暗示TRAIL可以用作抗癌劑，在癌細胞中誘導凋亡而在傷害正常細胞。(Marsters等，1999)。在引入細胞毒性化學治療藥物後，癌療法中已經有很多a。然而，化學療法的其中一個後果是耐藥性表型的產生/獲得以及多重耐藥性的產生。耐藥性的產生仍然是這種腫瘤的治療的一個主要障礙並因而，顯然需要備選的方法，例如基因療法。與化學療法、放射療法或生物療法協同使用的其它形式的療法包括高溫治療，高溫治療是一種將患者組織曝露於高溫(高達106。F)的方法。外部或內部加熱器可能涉及給局部的、區域性的或整個身體施加高溫。局部高溫治療涉及對小面積區域，例如腫瘤施加熱。熱可以用來自體外裝置的靶向胂瘤的高頻波在外部產生。內部加熱可能涉及無菌探針，包括細的、加熱的金屬絲或具有溫水的空心管、植入的微波天線或射頻電極。將患者的器官或四肢加熱進行區域性治療，其用產生高能的裝置，例如磁鐵來完成。備選地，可以移出一些患者的血液並加熱，然後灌流進將進行內部加熱的區域。在癌已經擴展至整個身體的情形中，也可以加熱整個身體。溫水毯(Warm-waterblanket)、熱蠟、有感線圏和熱處理室可以用於該目的。激素療法也可以與本發明協同使用或者與先前描述的任意其它癌療法聯合使用。激素的使用可以在某些癌(例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或子宮頸癌)的治療中使用以降低或阻斷某些激素例如睪酮或雌激素的效果。這種治療通常與至少一種其它的癌療法聯合使用作為一種治療選擇或用於降低轉移風險。表6致癌基因complextableseeoriginaldocumentpage74tableseeoriginaldocumentpage75tableseeoriginaldocumentpage76tableseeoriginaldocumentpage77tableseeoriginaldocumentpage78tableseeoriginaldocumentpage79vin.實施例下列實施例包括在內用以說明本發明的優選實施方案。本領域的那些技術人員應該理解，在接下來的實施例中公開的技術顯示，由本發明者發現的技術在本發明實踐中很好的發揮作用，並因此可認為構成了用於其實踐的優選模式。然而，本領域的那些技術人員根據^^開內容應該理解，公開的特殊實施方案可進行許多改變並仍然獲得類似或相似的結果而不會背離本發明的精神和範圍。實施例1:材料和方法病毒和細胞系.一組野生型痘病毒林(Wyeth、WesternReserve(W)、USSR、TianTan、TashKent、Patwadangar、Lister、King、IHD-W、IHD-J和Evans)由GeoffSmith博士,ImperialCollege,London惠贈。人腺病毒血清型5(Ad5)從ATCC獲得。WR的病毒生長因子(VGF)缺失型林(vSC20)由BernieMoss博士，NIH惠贈。WR的胸苷激酶缺失型林(vJS6)和WR的TK-、VGF雙缺失型抹(wDD)在Puhlmann等，(2000)和McCart等，(2001)中描述。表達熒火蟲螢光素酶的WR株由GaryLuker博士(UniMichigan)惠贈。痘苗林JX-963通過將含有大腸桿菌gpt和人GM-CSF基因(分別處於p7.5和pSE/L啟動子的控制下)的pSC65質粒重組進WR的vSC20(VGF缺失型)林的胸苷激酶基因中而構建。在X-Gal中繁殖該病毒後進一步選擇白斑而產生具有無功能lacZ的病泰lacZ從vSC20的VGF內表達)。正確插入TK基因中和lacZ功能的喪失通過測序驗證，而GM-CSF通過ELISA檢驗。表達螢光酶的wDD通過將具有處於p7.5啟動子控制下的螢光酶的pSC65質粒插入vSC20構建。生物發光用IVIS50系統(Xenogen，Alameda)檢驗。人腫瘤細胞系包括A2780(卵巢癌，從ECACC獲得)、A549(肺癌，從ECACC獲得)、HCT116、HT-29和SW620(結腸癌，從ATCC獲得)、HT-1080(纖維肉瘤，從ATCC獲得)、LNCaP(前列腺癌，從ATCC獲得)、PANC-1(胰腺癌，從ATCC獲得)、MCF-7(乳腺癌，從ATCC獲得)。非變異細胞包括MRC-5(肺成纖維細胞，從ATCC獲得)、Beas-2B(支氣管上皮細胞，由TonyReid,UCSD惠贈)以及從Clonetics(Walkersville，MD)獲得的原代正常細胞NHBE(正常人支氣管上皮細胞)和SAEC(小氣道支氣管上皮細胞)。鼠腫瘤細胞系包括CMT64(C57/B6肺癌，從CancerResearchUK獲得)、JC(BALB/c乳腺癌，從ATCC獲得)、MC38(C57/B6結腸癌，從NIH獲得)和TIB-75(BNLIMEA.7R.1)(BALB/c肝癌，從ATCC獲得)。細胞系NIH3T3和過表達H-Ras的NIH3T3細胞系由RichardMarais(ICRLondon)惠贈。先前已經描述了兔腫瘤細胞系VX2(Kidd，1940;Tjernberg1962;Chen等，2004)。體外複製和細胞病變效應測定法.將細胞系以5x106細胞/孔接種進6孔板中並保留過夜。然後將病毒以1.Q個噬斑形成單位(PFU)/細胞的感染複數(M0I)加入並讓其感染2小時。在感染結束時，更換培養基並將板孵育48小時，然後將細胞刮落進培養基中並收集。通過三輪的凍融，然後進行超聲處理溶解細胞，隨後將粗的病毒溶解物的系列稀釋物加至BSC-1細胞以滴定病毒。噬菌斑測定法如先前描述的(Earl等，1998)進行。腺病毒在A549細胞(Earl等，1998)上滴定。試驗通常一式三份進行。為了評估病毒的細胞病變效應(CPE),將細胞以1000個細胞/孔接種於96孔板中並讓其附著過夜。然後將要試驗的病毒的系列稀釋物加至該板中(M0I從100-0.001)，一式三份，並將該板另外孵育72小時。在這之後，用無血清的培養基代替培養基並將MTS(Promega)加至該板中。在孵育2-4小時後，在ELISA酶標儀上讀取450nm下的吸光度。細胞病變效應測定為試驗孔相對於僅含有細胞(100%存活)和無細胞的孔(0%存活)的生存力減少。結果表示為50%的細胞層存活時的MOI(50%有效濃度，EC50)。小鼠同系和異種移植腫瘤模型試驗.免疫活性小鼠用同系腫瘤細胞(1x106個細胞/小鼠)經皮下^，這樣JC和TIB-75細胞移植進BALB/c小鼠中，CMT64細胞移植進C57/B6小鼠中。某些人異種移植模型涉及將1x10HT29個細胞皮下移植進SCID小鼠(所有小鼠為8-10周大，並且性別相配)中。一旦腫瘤達到50-100mm3，按照指示將小鼠重新分組並處理。腫瘤大小通過測徑器測量。用表達螢光酶的病毒處理的小鼠可以用IVIS100系統(Xenogen,Alameda)成像。在成像前，將小鼠腹膜內注射螢光素(30mg/kg)並麻醉(2%異氟烷)。在治療後標明的時間殺死一些小鼠並回收器官用於病毒生物學分布或免疫組織化學試驗。對於病毒的生物學分布，將器官快速冷凍並磨碎，隨後如描述的進行噬菌斑測定法。對於免疫組織化學試驗，在福馬林中固定器官，隨後包埋於石蠟塊中用於切片。切片用蘇木精和伊紅(H&E)以及病毒外殼蛋白抗體(對於腺病毒處理的小鼠，使用多克隆抗-痘苗抗體或多克隆抗殼粒抗體)染色。兔模型.先前已經描述了將VX2腫瘤移植進紐西蘭白兔的肝臟並通過CT和超聲掃描測量腫瘤的發展和轉移至肺部(Paeng等，2003)。細胞毒性T-淋巴細胞(CTL)測定法.這通過將經標記的從按指示進行處理的兔獲得的外周血淋巴細胞(PBL)與VX2肺瘤細胞混合來進行。4小時後，通過碘化丙丁啶染色和流式細胞儀測量細胞凋亡。中和抗體測定法.抗痘苗中和抗體的產生在從處理後的兔獲得的血漿中測量。將血漿稀釋物與1000PFU的痘苗混合過夜，隨後加入含有A2780細胞的96孔板中。在72小時後，通過MTS測定法測量細胞活力。病毒中和作用測量為防止病毒失活所需的血漿稀釋度。統計分析.用廣義Wilcoxin檢驗比較卡普蘭-邁耶曲線。腫瘤響應率(Tumorresponserate)和無轉移率(metastasis-freerate)通常用費歇爾精確檢驗比較。實施例2:大鼠腫瘤模型將大鼠(斯普拉-道來氏大鼠，雄性)曝露於它們飲用水(175mg/L)中的致癌物質(N-亞硝基嗎啉，NNM)8周，在該期間發生了肝硬化，隨後平均在16-20周之間在肝內原位產生了腫瘤(肝細胞癌或膽管癌)(模型先前在Oh等，2002中描述)。腫瘤檢測和評價通過有經驗的超聲檢查操作者利用超聲成4象進行。在治療即將開始前的基線時腫瘤直徑大約為0.75-1.5cm;肺瘤體積在基線時在對照和治療組之間沒有顯著差別(估計平均體積是400-500mm3)。對照動物(n=17)不接受治療，而受治療的動物(n=6)接受靜脈內注射(經由尾靜脈)，注射在合成的早晚期啟動子控制下表iiAGM-CSF(在Mastrangelo等，1999中描述的病毒構建體)的痘病毒(Wyeth林；存在胸苷激酶基因缺失)。病毒以108噬菌斑形成單位(如Earl等，1998中進行滴定)的劑量施用，總體積為0.75ml(病毒懸液與10mMTris混合直到期望體積)，在60秒內通過尾靜脈靜脈內注射。治療每兩周重複一次，總共三次(第1、15和29天)。在開始治療後的十周內，對照種類大小顯著增加直至平均為大約3000mm3(標準誤差為500)(FIG.1)。由於此時腫瘤的發展，為倫理原因需要處死對照動物。所有腫瘤大小已經顯著增加。相反，6個受治療的腫瘤中有5個完全退化(低於超聲檢測極限)。治療組中的平均體積為大約50mm3(標準誤差〈10;相對對照p<0.01)。實施例3:兔VX2腫瘤模型在VX2兔癌模型中進行了一個研究(如Paeng等，2003中描述的)。選取兔是因為先前證明人GM-CSF在兔中具有顯著的生物學活性(與小鼠相反)。讓VX2腫瘤在紐西蘭白兔的肌肉中生長並從l-2mm的腫瘤片段分離細胞，再懸浮於O.1ml生理鹽水中並在肝包膜下注射(21號針頭；注射位點用具有荷包縫合線的手術補片覆蓋)，並且讓其生長14天直至形成原發性腫瘤(平均直徑1.5-2.0cm;估計體積2-4cm3)在標準的burst測定法中，證明VX2細胞離體可以受痘苗病毒感染。腫瘤大小通過CT掃描和超聲實時監控。在後面7周，對照動物(未治療)動物(n=18)在肝臟內發生了腫瘤t艮，估計的平均體積達到大約100cm3(標準誤差大約為20cm3)。而且，發生了許多腫瘤轉移並隨時間過去在肺和肝內變得可以檢測。到第7周，對照動物全部具有可檢測的轉移瘤，肺轉移瘤的平均數是17個(標準誤差2.3)。這些對照動物的生存中值是55天(受治療動物治療開始後)，並且全部在80天內死亡。在第一次試驗中的受治療動物(n-3)接受單次靜脈內注射(經由尾靜脈)，注射在合成的早晚期啟動子控制下表達人GM-CSF(在Mastrangelo等，1999中描述的病毒構建體)的痘病毒(Wyeth抹；存在胸苷激酶基因缺失)。病毒以109噬菌斑形成單位(如Earl等，1998中進行滴定)的劑量施用，總體積為7ml(病毒懸液與10mMTris混合直到期望體積)，在60秒內通it^靜脈靜脈內注射。在第7周，與對照動物相反，受治療的動物沒有可通過CT掃描檢測的肺轉移瘤(FIG.2A_2B)。存活率也顯著增加。到治療開始後110天，生存中值沒有達到，並且大約70%仍舊存活。在第二個試驗中受治療的動物(每組n=6)接受三次每周一次的靜脈內注射(經由尾靜脈)，注射在合成的早晚期啟動子控制下表達人GM-CSF(在Mastrangelo等，1999中描述的病毒構建體，在此將該文獻通過引入作為參考)的痘病4(Wyeth林;存在胸苷激酶基因缺失)JX-594、具有胸苷激酶和痘苗病毒生長因子缺失的痘苗病毒WR林wDD(如McCart等，1999描述的wDD)或具有胸苷激酶和痘苗病毒生長因子缺失並且從合成的早晚期啟動子表i^AGM-CSF的痘苗病毒WR林JX-963。病毒以108個噬菌斑形成單位(如Earl等，1998中進行滴定)的劑量施用，總體積為7ml(病毒懸液與10mMTris混合直到期望體積)，在60秒內通過尾靜脈靜脈內注射。到第7周，與對照動物相反，用JX-963治療的動物沒有可通過CT掃描檢測的肺轉移瘤(相對對照p<0.01)。JX-594治療的動物平均具有8個肺部腫瘤(標準誤差為2;相對對照p<0.05)。wDD治療的動物平均具有5個肺部腫瘤(標準誤差為2;相對對照p<0.05)。值得注意的是，與該劑量的JX-594相反JX-963和wDD對肝臟中的原發性腫瘤生長(圖3)，並且JX-963明顯地增加了這些動物的存活率(圖5)。表達GM-CSF的病毒JX-963比其不表達GM-CSF的對照wDD具有顯著更好的對抗原發性腫瘤和肺部轉移瘤的效力；2)表達GM-CSF的病毒JX-963比表達GM-CSFWyeth林對照(儘管JX-594中不存在另外的vgf基因缺失)具有顯著更好的對抗原發性腫瘤和肺轉移瘤的效力。因而，靜脈內施用表iiAGM-CSF的痘苗導致比沒有GM-CSF的相同痘苗有顯著更好的效力，並且血管內施用表達GM-CSF的WR林缺失型突變體比表達GM-CSF的Wyeth林顯著更好。實施例4:JX-963的系統性癌效力靶向療法很有希望用於治療癌症，但是由於靶分子的突變和/或腫瘤通過冗餘途徑逃逸而頻繁產生耐藥性，仍需要新的藥物。溶瘤病毒是其複製能力固有地或通過基因工程改造而受限於惡性細胞類型的病毒(Thorne等，2005)\選擇性的腫瘤內複製導致病毒增殖，通過獨特且凋亡依賴性機制(溶癌作用)殺死受感染細胞並擴散病毒至其它胂瘤細胞。病毒治療法因而具有有效治療頑固性癌的潛力並且通過局部或區域性施用幾種溶瘤病毒獲得了臨床概念驗證(Parato等，2005)2。然而，要使溶瘤病毒對患者存活率有大的影響，將需要系統性效力和靜脈內遞送。本發明因而釆取了分步的設計和開發策略來產生更有效的系統性藥劑。首先，本發人鑑定了痘病毒(例如痘苗病毒)為已經進化為系統性擴散並且對補體和抗體的清除有抗性的病毒物種(Smith等，1997;Buller和Palumbo，1991)。痘苗病毒具有完全確定的機制來使得能在血液中運輸而不致失活並且可以在組織內快速傳播，人類在天花根除的戰爭中利用痘苗病毒也具有悠久的歷史。在接種程序過程中使用了一組痘苗病毒，並且篩選了一些相關病毒林在正常細胞(NHBE)和腫瘤細胞(A2780)中的複製能力。AU痘苗林在腫瘤細胞系中比在正常細胞中複製達到更高水平(圖6A)，但是治療指數(腫瘤與正常細胞的複製比)在病毒林之間不同。實驗室廣泛使用的病毒抹(例如WesternReserve(WR))比它們的親本痘苗病毒林(Wyeth)傾向於展示更高的固有種類選擇性這是第一次野生型痘苗抹在腫瘤細胞系中相對於在正常細胞中顯示固有的更優的複製。然而，並不是所有病毒都這樣，因為腺病毒血清型5(Ad5)(大多數臨床中的溶瘤病毒的骨架)不顯示這種選擇性(圖10A)。溶瘤劑的另一屬性是快速的腫瘤內擴散(Wein等，2003)。這可以通過短的複製周期和容易從受感染細胞釋放病毒來實現。因而在注射後較早的時間點(72小時)檢驗了痘苜病毒WR^J波壞腫瘤細胞的能力並將其與Ad5和溶瘤腺病毒林W1520(ONYX-015)(Heise等，1997)相比較(圖6B)。相對於Ad5和W1520兩者，WR在該時刻在肺瘤細胞中展示了高達5-logs的增加的殺死潛能，以及比任一種腺病毒林具有更高的肺瘤選擇性。迄今試驗的大多數溶瘤病毒的主要局限性是在系統性遞送後不能有效地感染腫瘤，正如在靜脈內遞送lxl9個噬斑形成單位(PFU)的Ad5至小鼠中的皮下腫瘤;f莫型中時所觀察到的(圖6C和圖10B);這相當於在70kg的人中3.5x1012PFU的劑量，比曾施用給患者的都要高。在肺瘤中病毒複製很少或沒有病毒複製(通過在遞送病毒後48小時和72小時後對病毒衣殼蛋白進行免疫組織化學染色測定)。然而，在這些相同的模型中痘苗林WR可以有效地運送至腫瘤病感染腫瘤，在治療48小時內多達50%的腫瘤細胞染色為陽性。此外，痘苗病毒能夠在胂瘤細胞中繼續存在至少10天(圖IOB)，儘管到該時間應該已經引發了免疫應答。為了使安全性最大化，特別是對於給免疫缺陷的癌患者靜脈內施用，將減毒的且腫瘤靶向的遺傳缺陷引入進病毒中。本發明先前已經描述了在痘苗病毒胸苷激酶(TK)基因中插入序列的病毒基因以及TK和病毒生長因子(VGF)雙缺失型病毒基因的優先在腫瘤中表達(Puhlmann等，1999;McCart等，2001)。儘管這些缺陷型的靶向機制先前沒有闡明，但是基本原理是4吏病毒複製和癌細胞溶解作用局限於具有升高的E2F水平(因為E2F源於細胞的胸苷激酶基因產物(Hengstschlager等，1994))和表皮生長因子(EGF)受體途徑激活(因為VGF激活該途徑是有效的病毒複製所必需的(Andrade等，2004))的癌細胞。這裡顯示TK和VGF雙缺失型病毒(wDD)展示了驚人的破壞多種不同起源的腫瘤細胞的能力(圖7)。還發現TK或VGF基因任一種中的單缺失削弱了痘苗病毒在非-增生性、非-變異性人細胞系中的複製，而雙缺失型病毒(wDD)進一步削弱該能力(圖11)。這些病毒林都沒有削弱它們在人腫瘤細胞中複製的能力。進一步發現VGF"^失型病毒在非-增生性、非-變異性細胞系中複製的能力的阻斷可以在表達激活的H-ras的細胞中克服(圖8A)。發現H-ras激活甚至導致WR的複製增加(p=0.0094)並且發現VGF缺失沒有抑制H-ras激活的細胞中的病毒複製，而TK缺失則產生了抑制(p-0.016)。這表明通過wDD中的基因缺失引入的腫瘤選擇性不僅僅是對增生性細胞的筒單優選，因為如果緩慢增生或甚至非增生性細胞在EGF-R/Ras/MAP激酶信號傳導途徑中含有突變則它們可能被靶向。為了確定雙缺失型痘苗病毒(wDD)是否可能通過乾向正常的增生細胞(例如腸上皮細胞、骨髓或卵巢細胞)而產生毒性，通過非侵入式生物發光成像(圖8B)研究了體內的病毒基因表達並且在殺死後檢查了病毒的生物分布(圖12)。在靜脈內遞送lxlO'PFU表達熒光酶的WR或wDD後進行的生物發光成像顯示，兩種病毒展示了類似的初始感染和病毒基因表iiit式(包括脾、肺、肝和腫瘤)(圖8B)。然而，來自wDD的生物發光信號從大多數器官而不是從腫瘤快速清除，即使是在免疫缺陷型小鼠中，而WR在靶器官中繼續複製並擴散至其它組織，包括骨髓、皮膚和腦(圖8B和8C)。儘管wDD確實在腫瘤外邊產生一些感染點，但這些感染點短暫出現或在後期出現，表明是繼發性擴散而沒有複製(數據沒有顯示)。從用lx109PFU的wDD(WR的致死劑量)進行靜脈內處理的小鼠的組織回收感染性病毒單位揭示，到處理後第8天腫瘤展示出增加的病毒滴定度，每mg組織比任何其它器官多於超過1000倍的病毒拷貝，而所有正常組織低於檢測極限或顯示下降的病毒滴定度(圖l2)。隨後在免疫活性小鼠模型中分析了wDD的抗腫瘤效果。當兩者都經靜脈內遞送時，wDD比WyethTK缺陷型痘苗病毒林(臨床試驗中最常用的痘苗病毒林，通常用作疫苗)具有顯著更好的抗腫瘤效果(圖13)。進一步的研究顯示，在通過系統性注射或腫瘤內注射至攜帶人腫瘤異種移植物的免疫缺陷型小鼠和攜帶同系腫瘤的免疫活性小鼠時，lx109PFU的wDD都能有顯著的抗腫瘤效果(圖13).為了增加wDD的抗肺瘤潛力以及抑制在靜脈內給藥時血管化的顯微腫瘤沉積物(microscopictumordeposit)的過度生長，將細胞因子GM-CSF插入進TK基因的位點內(處於合成的E/L啟動子控制下)；將這種病毒命名為JX-963.由於人GM-CSF在齧齒動物中沒有活性而在家兔中有活性(Cody等，2005)，為了評估對抗大4艮多的可複製轉移的原發性腫瘤的活性，將JX-963用於具有原發性(VX2)肝腫瘤和肺轉移瘤的家兔模型(Kim等，2006)中。正如在小鼠模型中，lx109PFU的靜脈內注射的wDD具有顯著的抗腫瘤效果(圖9A)。wDD也能抑制顯微肺轉移瘤的過度生長。為了評價由於伴隨的GM-CSF表達引起的額外效力，將H-963直接與wDD相比較。JX-963產生了更大的對抗原發性肺瘤的效力，並且完全阻斷了肺轉移瘤的過度生長。通過ELISA在JX-963處理的小鼠的血漿中檢測到了GM-CSF(數據沒有顯示)。除了直接的癌細胞溶解效果，還發現JX-963通過引起對抗VX2腫瘤細胞的CTL應答而交叉保護動物對抗腫瘤(圖9B)。使用痘苗病毒作為抗肺瘤劑的一個關心的問題是，即使系統性遞送至腫瘤最初在未受過處理的個體(na口veindividual)是可能的，但先前曝露於病毒而引起的免疫應答可能抑制隨後的治療的效力。在試驗家兔中，初次感染的3周內產生了強的抗病毒抗體(圖14)。為了研究形成中和抗體後重複給藥的可行性，對4隻已經初次響應治療但是在治療停止4周後具有腫瘤發展的家兔進行了再次治療。初次治療後靜脈內遞送1x10'PFU的JX-963導致4隻經處理的動物中的3隻原發性腫瘤大小降低(圖9C)。因此，通過選擇已經進化成通過造血系統擴散的痘苗病毒，以及篩選腫瘤選擇性複製的病毒林，本發明人能夠發現能系統性腫瘤遞送的具有快速溶癌細胞效果的病毒。為了提高這種病毒的安全性，引入了能增加其治療指數的幾種缺陷型病毒林，描述了它們作用的機制以及在體內檢驗了它們的生物分布。系統性遞送後對抗大的原發性腫瘤的驚人的治療效果得以證明。最後，由於不可能所有胂瘤細胞都受到感染，即使在系統性遞送病毒後，從這種病毒骨架表達GM-CSF。發現GM-CSF的加入增加了這種病毒對抗原發性腫瘤的效力，防止微小轉移灶的過度增生，並且產生抗腫瘤CTL應答。這表明，JX-963這種病毒能夠系統性遞送至腫瘤，在腫瘤中其快速且有效地破壞腫瘤組織，而迴避正常的器官，並且同時在胂瘤中誘導了能識別原位產生的腫瘤抗原的免疫應答。重複給藥進一步顯示通過直接的溶癌作用或通過加強抗腫瘤免疫應答而產生了額外的抗胂瘤效果。因而，JX-963具有治療多種腫瘤的潛力。根據本公開內容，可以產生和執行所有在此公開和要求的組合物和方法而不需要過多的實驗。雖然本發明的組合物和方法是才艮據優選的實施方案來描述，本領域的那些技術人員將理解可以對所述的組合物和/或方法進行改變，以及在在此描述的方法的步驟或步驟的順序中進行改變而不背離本發明的概念、精神和範圍。更特別是，應該理解在化學和生理學兩者上都相關的某些試劑可以替代在此描述的試劑，而將獲得相同或類似的結果。對本領域技術人員明顯的所有類似的取代和修飾被認為是在由附帶的權利要求書定義的本發明的精神、範圍和概念內。IX.參考文獻下面的參考文獻，在它們提供對在此列出的那些的示例性的過程或其它細節的補充的程度上，在此特別通過引入作為參考U.S.Patent4,554,101U.S.Patent4,683,195U.S.Patent4,683,202U.S.Patent4,684,611U.S.Patent4,800,159U.S.Patent4,879,236U.S.Patent4,883,750U.S.Patent4，946，773U.S.Patent4,952,500U.S.Patent5,220,007U.S.Patent5,279,721U.S.Patent5,284,760U.S.Patent5,302,523U.S.Patent5，322，783U.S.Patent5,354,670U.S.Patent5,366,878U.S.Patent5,384,253U.S.Patent5,389,514U.S.Patent5,399,363U.S.Patent5,464,765U.S.Patent5,466,468U.S.Patent5,538,877U.S.Patent5,538,880U.S.Patent5,543,158U.S.Patent5,550,318U.S.Patent5,563,055U.S.Patent5,580,859U.S.Patent5,589,466U.S.Patent5,591,616U.S.Patent5,610,042U.S.Patent5,633,016U.S.Patent5,635,377U.S.Patent5,641,515U.S.Patent5,656,610U.S.Patent5,702,932U.S.Patent5,736,524U.S.Patent5,739,169U.S.Patent5,780,448U.S.Patent5,789,166U.S.Patent5,789,215U.S.Patent5,798,208U.S.Patent5,798,339U.S.Patent5,801,005U.S.Patent5,824,311U.S.Patent5,824,348U.S.Patent5,830,650U.S.Patent5,830,880U.S.Patent5,840,873U.S.Patent5,843,640U.S.Patent5,843,650U.S.Patent5，843，651U.S.Patent5,843,663U.S.Patent5,846,225ILS.Patent5,846,233U.S.Patent5,846,708U.S.Patent5,846,709U.S.Patent5，846，717U.S.Patent5,846,726U.S.Patent5,846,729U.S.Patent5,846,783U.S.Patent5,846,945U.S.Patent5,849,481U.S.Patent5,849,483U.S.Patent5,849,486U.S.Patent5,849,487U.S.Patent5,849,497U.S.Patent5,849,546U.S.Patent5,849,547U.S.Patent5,851,770U.S.Patent5,851,772U.S.Patent5,853,990U.S.Patent5,853,992U.S.Patent5,853,993U.S.Patent5,856,092U.S.Patent5,858,652U.S.Patent5,861,244U.S.Patent5,863,732U.S.Patent5,863,753U.S.Patent5,866,331U.S.Patent5,866,337U.S.Patent5,866,366U.S.Patent5,871,740U.S.Patent5,871,986U.S.Patent5,882,864U.S.Patent5,900,481U.S.Patent5,905,024U.S.Patent5,910,407U.S.Patent5，912，124U.S.Patent5,912,145U.S.Patent5,912,148U.S.Patent5,916,776U.S.Patent5,916,779U.S.Patent5,919,626U.S.Patent5,919,630U.S.Patent5，922，574U.S.Patent5,925,517U.S.Patent5,925,525U.S.Patent5,925,565.u.s.Patent5,928,862u.s.Patent5,928,869u.s.Patent5，928，870u.s.Patent5，928，卯5u.s.Patent5,928,906u,s.Patent5，928，卯6u.s.Patent5,929,227u.s.Patent5,932,413u.s.Patent5,932,451u.s.Patent5,935,791u.s.Patent5,935,819u.s.Patent5,935,825u.s.Patent5,939,291u.s.Patent5,942,391u.s.Patent5,945,100u.s.Patent5,981,274u.s.Patent5,994,624AlcamiandSmith,Cell,71(l):153-67，1992.Alcamietal，Sem.Virol，5:419-427，1998.Alcamietal，Virology,74(23):11230-9，2000.Almendroetal"丄Immunol,157(12):5411-5421，1996.Andohetal，CancerImmunol.Immunother，50(12):663-72，2002.Andradeetal，BiochemJ,381,437-46，2004.Angeletal，Cell,49:729，1987b.Angeletal，MolCellBiol,7:2256，1987.Angeletal，Mol.Cell.Biol，7:2256，1987a.Arapetal"CancerRes.，55(6):1351-1354，1995.AtchisonandPerry,Cell,46:253，1986.AtchisonandPerry,Cell,48:121，1987.Austin-WardandVillaseca,Rev.Merf.Chil.，126(7):838-45，1998.Ausubeletal，In:CurrentProtocolsinMolecularBiology,John,Wiley&Sons,Inc，NewYork,1994.Bajorinetal，J.Clin.Oncol,6(5):786-92，1988.Bakhshietal，Cell,41(3):899隱906，1985.Banerjietal，Cell,27(2Pt1):299掘，1981.Banerjietal，Cell,33(3):729-740，1983.BarkerandBerk，Virology,156，107-21，1987.Bellus，J.MacromolSd.PureApplChem.，A31(l):1355-1376，1994.Berkhoutetal，Cell,59:273-282，1989.Blmavetal，EMBOJ.，8:1139，1989.BlascoandMoss,J.Virology,66(7):4170-4179，1992.Blascoetal"J.Virology,67(6):3319-3325，1993.BodineandLey,EMBOJ"6:2997，1987.Boshartetal"Cell,41:521，1985.Boszeetal，EMBOJ，5(7):1615-1623，1986.Boydetal，Cell,79:341-351，1994.Braddocketal"Cell,58:269，1989.BraistedandWells，Proc.Natl.Acad.ScLUSA,93(12):5688-5692，1996.'Brizel，Semin.Radiat.O腦l，8(4):237-246，1998.Bukowskietal"Clin.CancerRes"4(10):2337-47，1998.BullaandSiddiqui，J.Virol，62:1437，1986.BullerandPal咖bo，MicrobiolRev，55，80-122,1991.Bulleretal，JVirol，62，866-74，1988.BurtonandBarbas,Adv,Immunol,57:191-280，1994*Caldasetal，Nat.Genet,8(1):27誦32，1994.CampbellandVillarreal,MolCell.Biol,8:1993，1988.CampereandTilghman，GenesandDev.,3:537，1989.Campoetal,Nature,303:77，1983.Cantrelletal，Proc.Nat'lAcad.Sd.USA82:6250-6254，1985.Caragineetal，CancerRes.，62(4):1110-5，2002.Carbonellietal，FEMSMicrobiol.Lett.,177(l):75-82，1999.CelanderandHaseltine，J.Virology,61:269，1987.Celanderetal.，J.Virology,62:1314，1988.Chandleretal，Cell,33:489，1983.Chandleretal，Proc.NatlAcad.Sd.USA,94(8):3596-601，1997.Changetal，Mol.CellBiol,9:2153，1989.Chatterjeeetal，ProcNatlAcadSd.U.S.A.,86:9114，1989.ChenandOkayama,MolCellBiol，7(8):2745-2752，1987.Chenetal，LabAnim，38，79-84，2004.Chengetal，CancerRes"54(21):5547-5551，1994.Choietal，Cell,53:519，1988.Christodoulidesetal，Microbiology,144(Pt11):3027-37,1998.ClearyandSklar，Proc.NatlAcad.Sd.USA,(21):7439-7443，1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