免疫學單純皰疹病毒抗原及其使用方法

2023-06-16 11:21:11

專利名稱：免疫學單純皰疹病毒抗原及其使用方法
技術領域：
本發明涉及可用於治療和預防單純皰疹病毒(HSV)感染的分子、組合物和方法。更具體地，本發明鑑定可用於開發刺激或提高HSV特異性免疫的方法、分子和組合物的HSV蛋白表位。
本發明的背景1型和2型HSV的完整已知DNA序列有大約160kb，編碼約85個基因，每個基因編碼至少一種蛋白。這些蛋白中的免疫學表位是未知的，每個表位應長約9-12個胺基酸並能引起對病毒感染的有效T細胞免疫應答。
在人體中需要細胞免疫應答來限制復發性HSV感染的嚴重性。HSV特異性CD4T細胞可對病毒感染細胞具有細胞毒性(M.Yasukawa等，1991，免疫學雜誌(J.Immunol.)，1461341-1347；M.Yasukawa等，1984，免疫學雜誌，1332736-42)。HSV特異性T細胞還可降低HSV感染的HLA匹配細胞中HSV複製的滴度，產生具有抗病毒或免疫調節活性的淋巴因子，或提供特異性B細胞輔助提高抗病毒抗體應答。涉及HSV特異性T細胞的抗原特異性的文獻包括A.G.Langenberg等，1995，Ann.Int.Med.122889-898；A.Mikloska等，1998，J.Gen.Virol.，79353-361；J.W.Torseth等，1987，病毒學雜誌(J.Virol.)，611532-1539；M.Yasukawa等，1985，免疫學雜誌，1342679-2687。
但仍然需要鑑定能夠對HSV感染引起有效免疫應答的特異性表位。這些信息可導致鑑定出對HSV感染的防止和治療有用的更為有效的免疫原性抗原。
本發明概要本發明提供HSV抗原、含有HSV抗原的多肽、編碼這些多肽的多核苷酸、含有這些多核苷酸的載體和重組病毒、呈遞這些多肽的抗原呈遞細胞(APC)、抗HSV的免疫細胞、以及藥物組合物。這些藥物組合物既可用於預防也可用於治療。本發明的抗原可被從皰疹損傷回收的T細胞識別。本發明還提供方法，包括用於防止和治療HSV感染、殺傷HSV感染細胞、抑制病毒複製、增強抗病毒和/或免疫調節性淋巴因子的分泌以及增強HSV特異性抗體產生的方法。用於防止和治療HSV感染、增強抗病毒和/或免疫調節性淋巴因子的分泌、增強HSV特異性抗體產生和廣義地講用於刺激和/或提高HSV特異性免疫的方法，包括給對象施用本發明的多肽、多核苷酸、重組病毒、APC、免疫細胞或組合物。用於殺死HSV感染細胞和抑制病毒複製的方法包括用本發明的免疫細胞接觸HSV感染細胞。本發明的免疫細胞是經本發明的抗原或呈遞本發明抗原的APC刺激的免疫細胞。本發明還提供了產生這些免疫細胞的方法。該方法包括用經修飾呈遞本發明抗原的APC，優選樹突細胞，接觸免疫細胞。在優選實施方案中，該免疫細胞是T細胞如CD4+或CD8+T細胞。
在一個實施方案中，本發明提供含有HSV多肽的組合物。該多肽可包含UL19、UL21、UL49或UL50蛋白或它們的片段，或選自如下序列的多肽UL19的第1078-1319位胺基酸；UL21的第148-181位胺基酸；UL49的第105-190或177-220位胺基酸；UL50的第118-312位胺基酸；糖蛋白E(gE；US8)的第1-273位胺基酸；VP16的第185-197、209-221或430-449位胺基酸；以及上述多肽的替代變體。本發明還提供編碼本發明多肽的分離的多核苷酸和含有該多核苷酸的組合物。此外，本發明提供經遺傳修飾表達本發明多核苷酸的重組病毒和含有該重組病毒的組合物。在優選實施方案中，該病毒是牛痘病毒、金絲雀痘病毒、HSV、慢病毒、逆轉錄病毒或腺病毒。本發明的組合物可是藥物組合物。該組合物可選擇性地含有藥物學上可接受的載體和/或佐劑。
本發明還提供鑑定感染性生物如病毒、細菌或寄生蟲的免疫原性表位的方法。在一個實施方案中，該方法包括製備所述生物基因組的隨機片段的集合。該方法還包括表達由該集合的片段編碼的多肽，並回收表達的多肽。優選地，該多肽表達為不溶性包涵體。在一個實施方案中，該多肽以融合蛋白形式表達，例如採用pUEX載體表達不溶性β-半乳糖苷酶融合蛋白。然後分析表達的多肽引起細胞免疫應答的能力。引起細胞免疫應答的能力指示存在免疫原性表位。
可用基因組片段的亞片段重複以上步驟。該方法可進一步包括基因組片段的測序。在一個實施方案中，所述分析包括進行T細胞增殖測定。該分析可採用來自己暴露於感染性生物的對象的免疫細胞來進行。在優選實施方案中，該細胞來源於主動侵染部位，如皮膚或子宮頸，或來源於感染對象的血液。
本發明還提供通過本發明方法鑑定的免疫原性表位、含有這些表位的多肽、以及編碼這些多肽的多核苷酸。適合的感染性生物包括細菌、寄生蟲和病毒。病毒的例子包括雙鏈和單鏈的DNA和RNA病毒。因為不需要生物的核酸序列信息，所以本發明的方法提供了對抗多種感染性生物包括那些表現出極大變異性的感染性生物的策略。
附圖簡要說明

圖1A是表示0.67-0.73圖距單位區間的HSV基因組結構的示意圖。邊界是近似的。圖中還顯示了HSV-1×HSV-2雜交類型重組病毒(intertypic recombinant viruse，IRV)。HSV-2 DNA用實線表示；HSV-1 DNA用虛線表示，不確定區域用多線條表示。還顯示了用於表達克隆的HSV-2 BamH I w片段。
圖1B是顯示T細胞克隆(TCC)對所標明IRV的增殖應答的柱形圖。數據表示為與單純培養基相比的[3H]胸苷摻入的Δcpm，每種情況中培養基[3H]胸苷摻入的cpm量均少於500cpm。
圖2是免疫印跡圖，其顯示了IRV DX32的UL49基因產物(VP22)的HSV病毒表型的確定。模擬感染細胞和病毒株DX32、HSV-1或HSV-2感染細胞的裂解物經SDS-PAGE分離後，進行印跡，然後用VP22特異性單克隆抗體(mAb)進行探測。蛋白分子量標準(kD)顯示於右側。
圖3A顯示了採用TCC 4.2E1由HSV-2的VP22中的不同肽表位引起的T細胞增殖的柱形圖。抗原呈遞細胞(APC)是自體EBV-LCL。抗原包括10ug/ml的β-半乳糖苷酶和融合蛋白以及3uM的肽。數據表示為與單純培養基相比的[3H]胸苷摻入的Δcpm，每種情況中培養基的[3H]胸苷摻入cpm均少於500cpm。
圖3B顯示了採用TCC 1.L3D5.10.8由HSV-2的VP22中的不同肽表位引起的T細胞增殖的柱形圖。APC是自體PBMC。抗原包括10ug/ml的β-半乳糖苷酶和融合蛋白以及1uM的肽。數據表示為與單純培養基相比的[3H]胸苷摻入的Δcpm，每種情況下培養基的[3H]胸苷摻入的cpm均少於500cpm。
圖3C顯示了採用TCC ESL4.9由HSV-2的VP22中不同的肽表位引起的T細胞增殖的柱形圖。APC是自體PBMC。抗原包括10ug/ml的β-半乳糖苷酶和融合蛋白以及1uM的肽。數據表示為與單純培養基相比的[3H]胸苷摻入的Δcpm，每種情況下培養基的[3H]胸苷摻入的cpm均少於500cpm。
圖4是顯示T細胞克隆BM.17應答HSV-2 VP16的437-449肽的HLA限制成分的線形圖。增殖應答對病毒肽濃度作圖。抗原呈遞細胞是自體的(實心圓)、HLA DQB1*0501純合的(空心三角)、或HLA DQB1*0201純合的(正方形)EBV-LCL。
本發明的詳細描述本發明提供對防止和治療HSV感染有用的HSV抗原。本文公開了經證實可被皰疹損傷來源的T細胞識別的抗原和/或其組成表位。在一些實施方案中，對本發明抗原具有特異性的T細胞顯示出對病毒感染細胞的細胞毒活性。負責T細胞特異性的免疫原性抗原的鑑定有利於開發改善的抗病毒治療和預防策略。含有本發明的抗原或編碼該抗原的多核苷酸的組合物提供了用於防止和治療HSV感染的有效定向疫苗。定義本申請中使用的所有科學和技術術語除非特別規定否則具有本領域通用的意義。當在本申請中使用時，以下詞或詞彙具有規定的意義。
本文中，「多肽」包括從天然原料中分離的、通過重組技術產生的或化學合成的蛋白、蛋白片段、和肽。本發明的多肽典型地含有至少約8個胺基酸。
本文中，「HSV多肽」除非另作說明否則包括HSV-1和HSV-2。對HSV蛋白或多肽的胺基酸的引述基於A.Dolan等(A.Dolan等，1998，病毒學雜誌，72(3)2010-2021)所述的關於HSV-2的基因組序列信息。
本文中，「替代變體」是指在指明的胺基酸序列中有一或多個胺基酸替換或缺失的分子，該分子仍保持了被免疫細胞識別的能力。測定分子是否可被免疫細胞識別的一種方法是增殖分析，其描述於D.M.Koelle等，1994，病毒學雜誌，68(5)2803-2810。
本文中，「載體」是指能向宿主細胞遞送並優選表達一或多個目的基因或序列的結構。載體的例子包括但不限於病毒載體、裸DNA或RNA表達載體、質粒、粘粒或噬菌體載體、與陽離子縮合試劑結合的DNA或RNA表達載體、包在脂質體中的DNA或RNA表達載體，以及某些真核細胞例如生產細胞。
本文中，「表達控制序列」是指指導核酸轉錄的核酸序列。表達控制序列可以是啟動子例如組成型或誘導型啟動子或增強子。該表達控制序列可操作地與待轉錄的核酸序列連接。
術語「核酸」或「多核苷酸」是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚體，並且除非另行限定，包括可以以類似天然存在核苷酸的方式與核酸雜交的天然核苷酸的已知類似物。
本文中，「抗原呈遞細胞」或「APC」是指能處理抗原並將抗原呈遞給淋巴細胞的細胞。APC的例子包括但不限於巨噬細胞、Langerhans樹突細胞、小結樹突細胞、B細胞、單核細胞、纖維原細胞和纖維細胞。樹突細胞是抗原呈遞細胞的優選類型。在許多非淋巴組織中發現樹突細胞，但其可通過輸入淋巴或血流遷移至淋巴器官的T依賴性區域。在非淋巴器官中，樹突細胞包括Langerhans細胞和間質樹突細胞。在淋巴和血液中，它們分別包括輸入淋巴面紗細胞和血液樹突細胞。在淋巴器官中，它們包括淋巴樹突細胞和交錯突細胞。本文中，除非另行說明，這些細胞類型和其祖細胞均被稱作「樹突細胞」。
本文中，「經修飾」以呈遞表位是指通過天然或重組方法操作以呈遞表位的抗原呈遞細胞(APC)。例如，該APC可通過暴露於單獨的或作為攜帶肽的混合物一部分的分離抗原來修飾，或通過遺傳修飾以表達包含一或多個表位的多肽。
本文中，「藥物學上可接受的鹽」是指維持母體化合物所期望的生物活性並且不會賦予任何不期望的毒性效果的鹽。這樣的鹽的例子包括但不限於，(a)與無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成鹽；和與有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、3-羥-2-萘甲酸、褐藻酸、多聚穀氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸形成的鹽；(b)含有多價金屬陽離子如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘等的鹽；或(c)與由N，N』-二-苯甲基乙二胺或乙二胺形成的有機陽離子構成的鹽；或(d)(a)和(b)或(c)的組合，例如單寧酸鋅鹽；等。優選的酸加成鹽是三氟乙酸鹽水和乙酸鹽水。
本文中，「藥物學上可接受載體」包括任何與活性成分結合時可保持該成分的生物活性並且不與對象的免疫系統反應的物質。例子包括但不限於任何標準藥用載體例如磷酸緩衝鹽溶液、水、乳劑如油/水乳劑、和各種類型的潤溼劑。對於氣溶膠或非腸道注射優選的稀釋劑是磷酸緩衝鹽水或生理(0.9％)鹽水。
含有這些載體的組合物的配製可採用熟知的常規方法(見例如Remington製藥科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第43章，第14版，Mack出版公司，Easton PA 18042，美國)。
本文中，「佐劑」包括有利於刺激免疫應答的本領域常用佐劑。佐劑的例子包括但不限於輔助肽；鋁鹽，例如氫氧化鋁膠體(明礬)或磷酸鋁；Freund氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco實驗室，Detroit，MI)；Merck佐劑65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(Smith-Kline Beecham)；QS-21(Aquilla)；MPL或3d-MPL(RibiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT)；LEIF；鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽；醯化酪氨酸的不溶性懸浮液；醯化糖；陽離子或陰離子衍生多糖；聚磷腈；生物可降解微球體；單磷醯脂A和quil A；胞壁醯三肽磷脂醯乙醇胺或免疫刺激複合物，包括細胞因子(例如GM-CSF或白介素-2，-7或-12)以及免疫刺激性DNA序列。在一些實施方案中，例如與多核苷酸疫苗一起使用時，佐劑如輔助肽或細胞因子可通過編碼佐劑的多核苷酸來提供。
本文中，「一」(不定冠詞)除非明確另行指出否則是指至少一個。HSV多肽在一個實施方案中，本發明提供分離的單純皰疹病毒(HSV)多肽，其中該多肽包含UL19(主要衣殼抗原，VP5)、UL21、UL49(VP22)或UL50蛋白或它們的片段。在另一個實施方案中，本發明提供選自如下多肽的分離的HSV多肽UL19的第1078-1319位胺基酸；UL21的第148-181位胺基酸；UL49的第105-190或177-220位胺基酸；UL50的第118-312位胺基酸；糖蛋白E(gE；US8)的第1-273位胺基酸；VP16的第185-197、209-221或430-449位胺基酸；以及以上多肽的替代變體。胺基酸殘基參考A.Dolan等，1998，病毒學雜誌，72(3)2010-2021中所述的HSV-2基因組的蛋白質。
該多肽可是融合蛋白。在一個實施方案中，該融合蛋白是可溶的。本發明的可溶性融合蛋白可適於向對象注射和引起免疫應答。在某些實施方案中，多肽可是含有多個本文所述多肽的融合蛋白，或是含有至少一個本文所述多肽和非相關序列的融合蛋白。例如，融合伴侶可參與提供T輔助表位(免疫學融合伴侶)，優選人識別的T輔助表位，或有助於以高於原來重組蛋白的產量表達蛋白質(表達增強子)。某些優選的融合伴侶既是免疫學融合伴侶又是表達增強性融合伴侶。可選擇其它融合伴侶以增加蛋白的可溶性或使蛋白能導向所期望的細胞內區室。更進一步地，融合伴侶包括有利於蛋白純化的親和標籤。
一般可採用標準技術包括化學偶聯製備融合蛋白。優選地，融合蛋白在表達系統中以重組蛋白的形式表達，以允許產生相對非融合蛋白更高水平的產量。簡單地說，編碼多肽成分的DNA序列可獨立地組裝，然後連入合適的表達載體。編碼一個多肽成分的DNA序列的3』端在有或無肽接頭的情況下與編碼第二個多肽成分的DNA序列的5』端連接，以便這些序列的閱讀框相符合。這就允許翻譯成保留了兩個組成多肽的生物學活性的單一融合蛋白質。
可採用肽接頭序列將第一和第二個多肽成份分開足夠長的距離，以保證每個多肽都摺疊成它的二級和三級結構。這樣的肽接頭序列可採用本領域熟知的標準技術併入融合蛋白。合適的肽接頭序列可根據如下因素選擇(1)能採取柔性伸展構象；(2)不能形成可影響第一和第二多肽的功能性表位的二級結構；以及(3)缺乏可與多肽功能性表位反應的疏水或帶電荷殘基。優選的肽接頭序列含有Gly，Asn和Ser殘基。其它接近中性的胺基酸例如Thr和Ala也可在接頭序列中使用。可有效地用作接頭的胺基酸序列包括那些在如下文獻中公開的序列Maratea等，1985，基因(Gene)4039-46；Murphy等，1986，美國科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)838258-8262；美國專利4,935,233和美國專利4,751,180。該接頭序列一般可長1到約50個胺基酸。當第一個和第二個多肽含有可用來分開功能性結構域和防止立體幹擾的非必需N端胺基酸區域時，則不需要接頭序列。
該連接的DNA序列可操作地連接到適合的轉錄或翻譯調控元件上。負責DNA表達的調控元件位於編碼第一個多肽的DNA序列的5』端。同樣地，終止翻譯所需的終止密碼子和轉錄終止信號存在於編碼第二個多肽的DNA序列的3』端。
本發明還提供含有本發明多肽和非相關免疫原性蛋白的融合蛋白。優選地，該免疫原性蛋白能引起記憶應答。這樣的蛋白例子包括破傷風、結核和肝炎蛋白(見例如Stoute等，1997，New Engl.J.Med.，336869)。
在優選實施方案中，免疫學融合伴侶來源於蛋白D，一種革蘭氏陰性細菌流感嗜血桿菌B(Haemophilus influenza B)的表面蛋白(WO91/18926)。優選地，蛋白D衍生物含有該蛋白的約頭三分之一(例如最初的100-110個N端胺基酸)，而且蛋白D衍生物可以是脂化的。在某些優選實施方案中，在N端包括脂蛋白D融合伴侶的頭109個殘基，以給多肽提供另外的外源性T細胞表位並增加在大腸桿菌中的表達水平(因此其起到表達增強子的作用)。脂類尾保證抗原最好地呈遞給抗原呈遞細胞。其它融合伴侶包括流感病毒的非結構蛋白NS1(血球凝集素)。儘管可採用包括T輔助表位的不同片段，但典型地採用N端的81個胺基酸。
在另一個實施方案中，免疫學融合伴侶是被稱作LYTA的蛋白或其部分(優選C端部分)。LYTA來源於肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，該菌合成稱作醯胺酶LYTA的N-乙醯-L-丙氨酸醯胺酶(由LytA基因編碼；基因43265-292，1986)。LYTA是一種自溶素，其專一降解肽聚糖主鏈中的特定化學鍵。LYTA蛋白的C端結構域可親合膽鹼或一些膽鹼類似物如DEAE。該性質已被用來開發用於表達融合蛋白的大腸桿菌C-LYTA表達質粒。在氨基端含有C-LYTA片段的雜合蛋白的純化已有描述(見生物技術(Biotechnology)10795-798，1992)。在一個優選實施方案中，可將LYTA的重複部分併入融合蛋白。發現在C末端區域從第178個殘基開始有一個重複部位。尤其優選的重複部分包括第188-305位殘基。
在一些實施方案中，可能希望將治療試劑和本發明的多肽連接起來，或將本發明的一個以上多肽連接起來。例如，可將一種以上的試劑或多肽直接與本發明的第一個多肽連接，或者採用提供多個附著位點的接頭。另外可使用載體。一些分子尤其適合用於細胞間的運輸和蛋白的運送，這樣的分子包括但不限於VP22(Elliott和O』Hare，1997，細胞(cell)88223-233；也見Kim等，1997，免疫學雜誌(J.Immunol.)1591666-1668；Rojas等，1998，自然生物技術(NatureBiotechnology)16370；Kato等，1998，FEBS Lett.427(2)203-208；Vives等，1997，生物化學雜誌(J.Bio.Chem.)272(25)16010-7；Nagahara等，1998，Nature Med.4(12)1449-1452)。
載體可以多種方式攜帶試劑或多肽，包括直接共價連接或通過接頭基團進行共價連接。適合的載體包括蛋白質例如白蛋白(例如Kato等的美國專利4,507,234)、肽和多糖例如氨基葡聚糖(例如Shih等的美國專利4,699,784)。載體還可通過非共價結合或包在例如脂質體小泡中來攜帶試劑(例如美國專利4,429,008和4,873,008)。
一般地，本文所述的多肽(包括融合蛋白)和多核苷酸是分離的。「分離的」多肽或多核苷酸是指從其原始環境中分離出來的多肽或多核苷酸。例如，如果一種天然存在的蛋白與天然系統中的一些或全部共存物分離開，則該蛋白是分離的。優選地，該多肽有至少約90％的純度，更優選有至少約95％的純度，最優選有至少約99％的純度。如果例如一個多核苷酸被克隆至非天然環境一部分的載體中，則該多核苷酸被認為是分離的。
該多肽可從其天然存在的形式中分離、通過重組方式產生或化學合成。本文所述DNA序列編碼的重組多肽可採用本領域普通技術人員已知的多種表達載體中的任意一種容易地從DNA序列製備。表達可在任何已轉化或轉染了表達載體的適合宿主細胞中實現，其中該表達載體含有編碼重組多肽的DNA分子。適合的宿主細胞包括原核生物、酵母和高等真核細胞。優選地，所用的宿主細胞是大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞系如COS或CHO。分泌重組蛋白或多肽至培養基的可溶性宿主/載體系統的上清可首先採用商業上可獲得的過濾器進行濃縮。濃縮後，濃縮物可在合適的純化基質例如親和基質或離子交換樹脂上進行純化。最後，可使用一個或多個反相HPLC步驟進一步純化重組多肽。
具有少於約100個胺基酸(一般少於約50個胺基酸)的片段或其它變體也可通過合成方式採用本領域普通技術人員熟知的技術產生。例如，這種多肽可採用任何商業上可獲得的固相技術如Merrifield固相合成法合成，其中胺基酸被順序地添加到生長的胺基酸鏈上(Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.852146-2149)。多肽自動合成儀可從供應商如Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(Foster City，CA)購得，並可按廠家說明進行操作。
根據本發明使用的多肽變體可在指明的胺基酸序列中含有一個或多個胺基酸替換、缺失、添加和/或插入，並使由此獲得的多肽保持對HSV或HSV感染細胞引起免疫應答的能力。一般可通過修飾本文所述的一個多肽序列，然後採用已知的分析方法如本文所述的T細胞分析方法評價該修飾多肽的反應性來識別這種變體。多肽變體與已知多肽間優選有至少約70％的一致性，更優選有約90％的一致性，最優選有約95％的一致性。這些胺基酸替代包括但並不必然限於本領域稱作「保守」的胺基酸替代。
「保守」替代是指一種胺基酸被另一種具有相似性質的胺基酸替代，以致肽化學領域的技術人員可預期該多肽的二級結構和親水性質沒有顯著改變。胺基酸替代一般可根據殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性質、親水性質和/或雙親性質的相似性來進行。例如帶負電荷的胺基酸包括天門冬氨酸和穀氨酸；帶正電荷的胺基酸包括賴氨酸和精氨酸；親水值相似的有不帶電極性頭部基團的胺基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天門冬醯胺和穀氨醯胺；以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。其它可表現出保守改變的胺基酸組合包括(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)cys，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。變體也可或替代性地含有非保守變換。在一個優選實施方案中，變體多肽通過5個或更少胺基酸的替換、缺失或添加而不同於天然序列。變體也可(或作為替代)通過例如缺失或添加對多肽的免疫原性、二級結構和親水性質影響極微的胺基酸來修飾。多核苷酸、載體、宿主細胞和重組病毒本發明提供編碼本發明一個或多個多肽的多核苷酸。該多核苷酸可包含在載體中。該載體還可含有可操作地與本發明多核苷酸連接的表達控制序列。在一些實施方案中，該載體包括一個或多個編碼其它目的分子的多核苷酸。在一個實施方案中，可將本發明的多核苷酸與另外的多核苷酸連接起來以編碼一個融合蛋白。
在某些實施方案中，可配製多核苷酸以允許其進入哺乳動物細胞並在其中表達。正如下文描述的，該製劑對於治療目的尤其有用。本領域普通技術人員將理解有許多方式可實現多核苷酸在靶細胞中的表達，而且可使用任何合適的方法。例如，可將多核苷酸插入病毒載體，所述載體例如但不限於腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒或牛痘或其它痘病毒(如鳥痘病毒)。用於將DNA插入這些載體的技術是本領域普通技術人員所熟知的。逆轉錄病毒還可轉移或包含篩選標記基因(以幫助轉導細胞的鑑定或篩選)和/或使載體靶標特異的靶向成分，例如編碼特定靶細胞受體的配體的基因。靶向還可通過本領域普通技術人員已知的方法採用抗體來實現。
本發明還提供用本發明載體轉化了的宿主細胞。該轉化的宿主細胞可在生產本發明多肽的方法中使用。該方法包括培養宿主細胞並回收所產生的多肽。回收的多肽可從培養物上清中純化。
本發明的載體可用於體內、離體或體外遺傳修飾細胞。遺傳修飾細胞的幾種方法是已知的，其包括直接或通過逆轉錄病毒生產細胞用病毒載體進行轉導或感染、磷酸鈣沉澱、受體細胞與含有DNA的細菌原生質體融合、用含有DNA的脂質體或微球體處理受體細胞、DEAE葡聚糖法、受體介導的內吞、電穿孔、微注射以及許多技術人員已知的其它技術。見例如Sambrook等，分子克隆實驗手冊(Molecular cloning-A Laboratory Manual)(第二版)1-3，1989；和當代分子生物學方法(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等編，Green Publishing Associates公司和John WileySons公司(1994增補)。
病毒載體的例子包括但不限於基於例如HIV、SIV、鼠源逆轉錄病毒、長臂猿的猿白血病病毒的逆轉錄病毒，以及其它病毒例如腺伴隨病毒(AAV)和腺病毒(Miller等，1990，分子細胞生物學(Mol.Cell.Bio.)104239；J.Kolberg 1992，NIH Res.443，和Cornetta等1991，Hum Gene Ther.2215)。廣泛使用的逆轉錄病毒包括基於如下病毒和其組合的病毒鼠源白血病病毒(MuLV)、長臂猿的猿白血病病毒(GaLV)、親嗜性逆轉錄病毒、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)。見例如Buchscher等1992，病毒學雜誌66(5)2731-2739；Johann等1992，病毒學雜誌，66(5)1653-1640；Sommerfelt等1990，病毒學17658-59；Wilson等1989，病毒學雜誌632374-2378；Miller等1991，病毒學雜誌652220-2224；和Rosenberg和Fauci 1993，基礎免疫學(Fundamental Immunology)，第三版，W.E.Paul(編)，Raven Press，Ltd.，New York，及其中的參考文獻；Miller等1990，分子細胞生物學104239；R.Kolberg 1992，J.NIH Res.443；和Cornetta等1991，Hum Gene Ther.2215。
適於擴增序列以便將其亞克隆至表達載體的體外擴增技術是已知的。該體外擴增方法的例子包括聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)、Qβ複製酶擴增以及其它RNA聚合酶介導的技術(如NASBA)，可參見Sambrook等1989，分子克隆實驗手冊(第二版)1-3；以及美國專利4,683,202；PCR手冊方法和應用指南(PCR ProtololsA Guide to Methods and Applications)(Innis等編)Academic Press公司，San Diego，CA 1990。克隆體外擴增核酸的改進方法在美國專利5,426,039中有描述。
本發明還提供經遺傳修飾表達本發明多核苷酸的重組微生物。該重組微生物可用作疫苗，並可採用本領域已知的減毒活疫苗製備技術製備。用作活疫苗的微生物的例子包括但不限於病毒和細菌。在一個優選實施方案中，該重組微生物是病毒。適合的病毒的例子包括但不限於牛痘病毒、金絲雀痘病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、HSV和腺病毒。組合物本發明提供對治療和防止HSV感染有用的組合物。該組合物可用於抑制病毒複製和殺死病毒感染細胞。在一個實施方案中，該組合物是藥物組合物。該組合物可包含治療或預防上有效量的本發明多肽、多核苷酸、重組病毒、APC或免疫細胞。有效量是指足以通過例如激活T細胞引起或提高免疫應答的量。T細胞激活的一種測量方法是增殖分析，其描述於D.M.Koelle等，1994，病毒學雜誌，65(5)2803-2810。在一些實施方案中，該組合物是疫苗。
該組合物可選擇地包括載體，例如藥物學上可接受的載體。藥物學上可接受載體部分地是由施用的特定組合物以及施用該組合物的特定方法決定的。因此，本發明藥物組合物的適合製劑有非常多的種類。適用於非腸道施用例如通過關節內(關節中)、靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內和皮下途徑施用的製劑和載體包括等滲無菌注射水溶液以及水和非水無菌懸液，其中等滲無菌注射水溶液可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和使該製劑與預期接受者的血液等滲的溶質，水和非水無菌懸液可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、防腐劑、脂質體、微球體和乳化劑。
本發明的組合物可進一步含有一種或多種佐劑。佐劑的例子包括但不限於輔助肽、明礬、Freund氏佐劑、胞壁醯三肽磷脂醯乙醇胺或免疫刺激複合物，包括細胞因子。在一些實施方案中，例如和多核苷酸疫苗一起使用時，佐劑如輔助肽或細胞因子可通過編碼該佐劑的多核苷酸來提供。疫苗製備一般可參見例如M.F.Powell和M.J.Newman編「疫苗設計(亞單位和佐劑方法)(Vaccine Design(the subunit andadjuvant approach))」Plenum Press(NY，1995)。屬於本發明範疇的藥物組合物和疫苗還可含有其它成分，這些成分可以是有生物活性的也可是沒有活性的。例如，其它病毒抗原的一個或多個免疫原性部分可通過併入融合肽或作為獨立成分存在於該組合物或疫苗中。
藥物組合物或疫苗可含有編碼一個或多個本發明多肽的DNA，以便該多肽可原位產生。如上所述，該DNA可存在於本領域普通技術人員已知的多種遞送系統的任意一種中，包括核酸表達系統、細菌和病毒表達系統。許多基因遞送技術是本發明領域所熟知的，例如描述於Rolland，1998，Crit. Rev. Therap.Drug Carrier Systems15143-198及其引用的參考文獻中的基因遞送技術。合適的核酸表達系統含有為在患者中表達所必需的DNA序列(例如合適的啟動子和終止信號)。細菌遞送系統涉及施用在其細胞表面表達多肽的免疫原性部分或分泌這種表位的細菌(例如Bacillus-Calmette-Guerrin)。在一個優選實施方案中，該DNA可採用病毒表達系統(例如牛痘或其它痘病毒、逆轉錄病毒、或腺病毒)導入，該病毒表達系統可涉及使用非致病性(缺陷型)可複製病毒。適合的系統公開於例如Fisher-Hoch等，1989，美國科學院院刊86317-321；Flexner等，1989，Ann.My Acad.Sci.56986-103；Flexner等，1990，疫苗(Vaccine)817-21；美國專利4,603,112，4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美國專利4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91102805；Berkner，1988，生物技術(Biotechniques)6616-627；Rosenfeld等，1991，科學(Science)252431-434；Kolls等，1994，美國科學院院刊91215-219；Kass-Eisler等，1993，美國科學院院刊9011498-11502；Guzman等，1993，Circulation 882838-2848；和Guzman等，1993，Cir.Res.731202-1207。將DNA插入這些表達系統的技術是本領域普通技術人員所熟知的。該DNA還可以是「裸露的」，見例如Ulmer等，1993，科學2591745-1749中所述以及Cohen，1993，科學2591691-1692的綜述。裸DNA的攝取可通過將該DNA包被在可有效轉運進入細胞的生物可降解珠上來增加。
儘管在本發明的藥物組合物中可採用任何本領域普通技術人員已知的適合載體，但載體的類型將根據施用方式改變。本發明的組合物可配製成適於任何合適的施用方式，包括例如局部、口服、鼻腔、靜脈內、顱骨內、腹膜內、皮下或肌肉內施用。對於非腸道施用例如皮下注射，載體優選包括水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩衝劑。對於口服施用，可採用以上任意一種載體或固體載體例如甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。也可將生物可降解微球體(例如聚(乳酸-乙醇酸))作為載體用於本發明藥物組合物。適合的生物可降解微球體公開於例如美國專利4,897,268和5,075,109。
這些組合物還可含有緩衝物(例如中性緩衝鹽水或磷酸緩衝鹽水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白質、多肽或胺基酸例如甘氨酸、抗氧化劑、螯合劑例如EDTA或穀胱甘肽、佐劑(例如氫氧化鋁)和/或防腐劑。作為替代，本發明組合物可製備成凍乾物。也可採用熟知的技術將組合物的成分裝入脂質體。
在本發明疫苗中可使用任何各種佐劑。大多數佐劑含有設計用於防止抗原快速代謝的物質例如氫氧化鋁或礦物油，以及免疫應答刺激物例如脂質A、百日咳博德特氏菌(Bortadella pertussis)或結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)來源的蛋白。多種適合的佐劑可通過商業途徑獲得，例如Freund氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco實驗室，Detroit，MI)；Merk佐劑65(Merk and Company，Inc.，Rahway，NJ)；鋁鹽如氫氧化鋁膠體(明礬)或磷酸鋁；鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽；醯化酪氨酸的不溶性懸液；醯化糖；陽離子或陰離子衍生化多糖；聚磷腈生物可降解微球體；單磷醯基脂A和quilA。細胞因子如GM CSF或白介素-2、-7和-12也可用作佐劑。
在本文提供的疫苗中，佐劑組合物優選設計成誘導主要是Th1型的免疫應答。高水平的Th1型細胞因子(例如IFN-γ、IL-2和IL-12)傾向於促進誘導對施用抗原的細胞介導免疫應答。相反，高水平的Th2型細胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和TNF-β)傾向於促進誘導體液免疫應答。在使用本文提供的疫苗後，患者將維持包括Th1-和Th2-型應答的免疫應答。在應答主要是Th1-型應答的一個優選實施方案中，Th1-型細胞因子的水平將比Th-2型細胞因子的水平有更大程度的增加。採用標準實驗可容易地估計這些細胞因子的水平。關於細胞因子家族的綜述參見Mosmann和Coffman，1989，Ann.Rev.Immunol.7145-173。
用於引起主要是Th-1型的應答的優選佐劑包括例如單磷醯脂A(優選3-去-O-醯化單磷醯脂A(3D-MPL))和鋁鹽的組合。MPL佐劑可獲自Ribi ImmunoChem Research公司(Hamilton，MT)(見美國專利4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也可誘導主要是Th1型的應答。這樣的寡核苷酸是人們熟知的，並描述於例如WO 96/02555中。另一種優選佐劑是皂角苷，優選QS21，其可單獨使用或和其它佐劑聯合使用。例如，一種增強系統包含單磷醯脂A和皂角苷衍生物的組合，例如WO 94/00153中所描述的QS21和3D-MPL的組合，或WO 96/33739中所描述的較小反應原性組合物(其中QS21被膽固醇抑制)。其它優選製劑包括水包油乳劑和維生素E。一種尤其有效的佐劑製劑涉及溶於水包油乳劑的QS21、3D-MPL和維生素E，其描述於WO 95/17210。另一種可用佐劑是AS-2(Smith-Kline Beecham)。本文提供的任何疫苗均可採用聯合抗原、免疫應答增強劑與適合載體或賦形劑的熟知技術來製備。
本文所述組合物可作為持續釋放製劑(即可在施用後實現組成成分的緩慢釋放的製劑如膠囊或海綿)的一部分來施用。該製劑一般可採用熟知技術製備，並通過例如口服、直腸或皮下植入，或在需要的靶位置植入的方式施用。持續釋放製劑可含有多肽、多核苷酸或抗體，這些物質分散在載體基質中和/或包含在限速膜包裹的貯藏室中。在這些製劑中使用的載體是生物適合的，並且還可以是生物可降解的；優選地，該製劑提供相對恆定的活性成分釋放水平。包在持續釋放製劑中的活性成分的量取決於植入位點、釋放的速率和期望的持續時間以及待治療或防止的疾病的性質。
在藥用組合物和疫苗中可使用任意各種遞送載體以利於產生靶向HSV感染細胞的抗原特異性免疫應答。遞送載體包括抗原呈遞細胞(APC)如樹突細胞、巨噬細胞、B細胞、單核細胞和其它可改造成有效APC的細胞。這些細胞可以但不必定進行遺傳修飾以增強呈遞抗原的能力，改善T細胞應答的激活和/或維持，使其本身具有抗病毒作用和/或與受者在免疫學上相容(即匹配的HLA單倍體型)。APC一般可分離自多種生物液體和器官，包括腫瘤和腫瘤周圍組織，而且其可以是自體的、同種異體的、同種的或異種的細胞。
本發明的某些優選實施方案採用樹突細胞或其祖細胞作為抗原呈遞細胞。樹突細胞是高效的APC(Banchereau和Steinman，自然(Nature)392245-251，1998)，並且已證明該細胞作為生理學佐劑可有效地引起預防性或治療性免疫(見Timmerman和Levy，Ann.Rev.Med.50507-529，1999)。通常，樹突細胞可根據其典型形狀(在原位置為星性，在體外具有可見的顯著細胞質突起(樹突))和按標準分析確定的B細胞(CD19和CD20)、T細胞(CD3)、單核細胞(CD14)和自然殺傷細胞(CD56)分化標記的缺乏來鑑定。當然，樹突細胞可進行改造以表達通常不出現在體內或離體樹突細胞上的特異性細胞表面受體或配體，而且本發明也包括該修飾的樹突細胞。作為樹突細胞的替代物，可在疫苗中使用攜帶分泌小泡抗原的樹突細胞(稱作外來體)(Zitvogel等，1998，Nature Med.4594-600)。
樹突細胞和祖細胞可獲自外周血、骨髓、腫瘤浸潤細胞、腫瘤周圍組織浸潤細胞、淋巴結、脾、皮膚、臍帶血或任何其它適合的組織或體液。例如，樹突細胞可通過向獲自外周血的單核細胞培養物中加入細胞因子組合例如GM-CSF、IL-4、IL-3和/或TNF-α進行離體分化。此外，可通過向培養基添加GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配體、LPS、flt3配體和/或其它誘導樹突細胞成熟和增殖的化合物的組合來分化獲自外周血、臍帶血或骨髓的CD34陽性細胞。
樹突細胞可方便地劃分為「未成熟」和「成熟」細胞，這樣就允許以一種簡單的方式區分兩種極為特徵化的表型。然而，該命名不應理解為排除了所有可能的中間分化階段。未成熟樹突細胞的特徵是，它是具有高抗原攝取和加工能力的APC，並與Fcγ受體、甘露糖受體和DEC-205標記的高表達相關聯。成熟表型的典型特徵是這些標記表達較低，而負責T細胞激活的細胞表面分子如MHC I類和II類分子、粘連分子(如CD54和CD11)和共刺激分子(如CD40、CD80和CD86)則高表達。一般可用編碼多肽(或其部分或其它變體)的多核苷酸轉染APC，以便該多肽或其免疫原性部分在該細胞表面表達。該轉染可離體進行，然後如本文所述，含有該轉染細胞的組合物和疫苗可用於治療目的。另外，可給患者施用靶向樹突或其它抗原呈遞細胞的基因遞送載體，導致轉染在體內發生。例如，一般可採用本領域已知的任何方法進行樹突細胞的體內和離體轉染，如WO 92/24447中所述的方法或Mahvi等，1997，免疫學和細胞生物學(Immunology and CellBiology)75456-460中所描述的基因槍法。樹突細胞的抗原裝載可通過樹突細胞或祖細胞與腫瘤多肽、DNA(裸露的或在質粒載體中)或RNA；或與表達抗原的重組細菌或病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒、腺病毒或慢病毒載體)一起孵育來實現。在裝載之前，多肽可與提供T細胞輔助的免疫學伴侶(例如載體分子)共價連接。此外，可單獨或在該多肽存在時用非連接的免疫學伴侶刺激樹突細胞。組合物的施用處理包括預防和治療。可通過在一個時間點或多個時間點一次直接注射來實行預防或治療。也可在多個部位幾乎同時施用。
患者或對象包括哺乳動物如人、牛、馬、犬、貓、豬和羊類動物。
典型地，組合物通過如下途徑進行體內施用非腸道途徑(如靜脈內、皮下和肌肉內)或其它傳統直接途徑例如口腔/舌下、直腸、口、鼻、局部(如透皮或眼內)、陰道、肺、動脈內、腹膜內、眼內、或鼻內途徑，或直接進入特定組織。
組合物的施用可採用任何合適的方式，並常常和藥物學上可接受載體一起施用。給患者施用本發明所述細胞的適合方法是現成的，而且儘管有不止一種途徑可用來施用特定的細胞組合物，但通常某個特定途徑會比其它途徑提供更快速和更有效的反應。
根據本發明，施用給患者的劑量應足以在一段時間內為該患者引起有益的治療反應，或抑制感染或感染導致的疾病。因此，給患者施用的該組合物的量應足以引起針對特異抗原的有效免疫應答和/或減輕、降低、治癒或至少部分緩解疾病或感染引起的症狀和/或併發症。足以實現該目的的量定義為「治療有效劑量」。
該劑量將取決於生產的組合物的活性和患者的疾病，以及待治療患者的體重或表面面積。劑量的大小還取決於特定病人中伴隨特定組合物施用的不良副作用的存在與否、性質和程度。在決定疾病如HSV感染的治療和預防中待施用組合物的有效量時，醫師需要評價抗病毒免疫應答的產生、疾病的進程和任何治療相關的毒性。
例如，含有HSV蛋白亞基的疫苗或其它組合物可每劑量包含1-10,000微克HSV蛋白。在一個優選的實施方案中每劑量包含10-1000微克HSV蛋白，在一個更優選的實施方案中每劑量包含10-100微克HSV蛋白。優選地，可這樣選擇劑量一個單獨劑量就足夠，或者是在幾個月療程中施用幾個劑量。對於含有HSV多核苷酸或肽的組合物，每劑施用相似的量。
在一個實施方案中，可在52周內施用1至10個劑量。優選地，按1個月的間隔施用6個劑量，之後可周期性地給予加強疫苗接種。不同的方式可能適合不同的病人。適當劑量是指當按上述方式施用時可提高抗病毒免疫應答並且超過基礎(即未處理)水平至少10-50％的組合物的量。該疫苗還應該能夠引起可導致接種患者比未接種患者有改善的臨床表現的免疫應答。一般地，對於含有一種或多種多肽的藥物組合物和疫苗，每種多肽在劑量中的量的範圍是從每kg宿主體重約100ug到5mg。優選地，該量的範圍是從每劑量約10ug到約1000ug。施用的適當體積將隨患者的身體大小、年齡和免疫狀態的不同而改變，但典型地在約0.1ml到約5ml之間，最通常的是體積小於約1ml。
含有免疫細胞的組合物優選從獲自組合物待施用對象的免疫細胞製備。或者可從HLA相容性供體製備該免疫細胞。採用本領域已知常規技術從對象或供體獲得該免疫細胞，將其暴露於經修飾呈遞本發明表位的APC，離體增殖，然後施用給對象。離體治療的方法描述於Rosenberg等，1990，New England J.Med.9570-578。此外，組合物可含有經修飾呈遞本發明表位的APC。
正如本文所述，免疫細胞一般可通過體外生長獲得足夠用於過繼免疫治療的量。將單個抗原特異性效應細胞擴增至幾十億個細胞並保留其體內抗原識別的培養條件是本領域所熟知的。典型地，這種體外培養條件是採取抗原進行間歇式刺激，通常該刺激在細胞因子(如IL-2)和非分裂飼養細胞存在下進行。如上所述，可使用本文提供的免疫反應性多肽富集和快速擴增抗原特異性T細胞培養物，以便產生足夠量的細胞用於免疫治療。具體地，抗原呈遞細胞如樹突細胞、巨噬細胞、單核細胞、纖維原細胞和/或B細胞可採用本領域的標準技術用免疫反應性多肽刺激(pulse)，或用一種或多種多核苷酸轉染。例如，可用含有適合在重組病毒或其它表達系統中增加表達的啟動子的多核苷酸轉染抗原呈遞細胞。治療中使用的培養效應細胞必須能夠廣泛地生長和分布，並且能夠在體內長期存活。研究顯示通過用添加IL-2的抗原重複刺激可誘導培養效應細胞體內生長並以相當大的數量長期存活(見，例如Cheever等，1997，免疫學評論(Immunological Reviews)157177)。
通過本文所述或其它本領域已知的許多途徑進行的用藥可簡單地採用注射針、導液管或相關裝置在一個單一的時間點或多個時間點通過直接施用來完成。被鑑定抗原的體外測試可使用常規技術來證實鑑定的HSV抗原的體內效力。例如，一種技術使用小鼠攻擊模型。然而，本領域技術人員將明白這些方法均是常規的，而且可使用其它模型。
當待測化合物或組合物製備好後，通過一系列注射免疫小鼠或其它對象。例如，可在幾個月的療程內進行多達10次的注射，典型地劑量間間隔1到4周。在該系列注射的最後一次後，用已建立的通用致死病毒劑量攻擊該對象。對照組接受安慰劑，而實驗組進行主動接種。此外，研究可設計採用亞致死劑量。可選擇包括劑量-應答研究。本研究中待測量的終點包括死亡和經例如脊髓步態(spinal cord gait)證實的嚴重神經學損傷。也可將存活者殺死以進行關鍵器官的定量病毒培養，這些器官包括脊髓、腦和注射位置。可測量碾碎的組織樣品中存在的病毒量。也可在原先感染的動物中測試組合物降低疾病復發的能力以證實其作為治療疫苗的效力。
可通過計算IC50確定效力，該值顯示了為防止50％的對象死亡每千克體重所需要的疫苗微克數。IC50取決於使用的攻擊劑量。此外，可計算LD50，它反映了殺死一半接受了特定劑量疫苗的對象所需要的感染單位數。死亡後病毒滴度的測定證實免疫系統限制了病毒複製。
測試的下一階段可是陰道接種攻擊。對於急性保護研究，可採用小鼠進行。由於豚鼠既可用於急性保護研究又可用於疾病復發防止研究，所以提供了一種用於外推至人的生理學上更為相關的對象。在這種類型的攻擊中，施用非致死劑量，豚鼠對象產生癒合和復發的損傷。測量可包括急性疾病改善和損傷復發。依據希望研究防止還是治療，可在接種前或後用疫苗或其它組合物進行幹涉。方法本發明提供治療和/或防止對象HSV感染的方法。該方法包括給對象施用本發明的組合物。該組合物可用作治療或預防性疫苗。在一個實施方案中，HSV是HSV-2。作為替代，HSV是HSV-1。本發明還提供用於抑制HSV複製、殺傷HSV感染細胞、增加具有抗病毒和/或免疫調節活性的淋巴因子的分泌以及增強皰疹特異性抗體產生的方法。該方法包括用針對本發明抗原的免疫細胞接觸HSV感染細胞，例如按本文給出的實施例中所描述進行。該接觸可在體外或體內進行。在一個優選實施方案中，免疫細胞是T細胞。T細胞包括CD4和CD8 T細胞。本發明的組合物還可用作抗免疫病理疾病例如眼病(如皰疹性角膜炎)的致耐受劑(tolerizing agent)。
此外，本發明提供製備抗HSV的免疫細胞的方法。該方法包括用抗原呈遞細胞接觸免疫細胞，其中該抗原呈遞細胞經修飾呈遞本發明多肽所包含的抗原。優選地，該抗原呈遞細胞是樹突細胞。該細胞可通過例如肽裝載或用編碼該多肽的核酸序列進行的遺傳修飾來修飾。在一個實施方案中，該免疫細胞是T細胞。T細胞包括CD4和CD8 T細胞。此外還提供通過該方法製備的免疫細胞。該免疫細胞可用於體外或體內抑制HSV複製、殺傷HSV感染細胞、增加具有抗病毒和/或免疫調節活性的淋巴因子的分泌、增強皰疹特異性抗體的產生，或用於治療或防止對象的HSV感染。
本發明提供鑑定與感染性生物相關的免疫原性表位的方法。在一個實施方案中，該方法包括製備該生物基因組隨機片段的集合。該製備可包括消化該全基因組，儘管以完整基因組開始並不是必須的。該消化優選包括用一種或多種限制酶接觸該基因組以獲得具有所需長度範圍的隨機片段集合。作為替代方法，可將含有目的基因組的材料超聲破碎、霧化或其它處理，然後從合適大小的凝膠片段中分離。
設計該消化和限制酶的選擇，以獲得比T細胞表位平均長度更長的基因組片段，即長度大於約30個核苷酸。優選地，該片段足夠小以至於遺傳終止位點稀少，例如長約200到約500鹼基對。在目的生物的基因組序列或限制性圖譜已知時，可分析基因組以鑑定限制性位點，如果用合適的限制酶消化，則可獲得期望數目的適當長度片段。還可選擇限制酶以使其位點與所用克隆載體中的位點相容。
然後該隨機片段可用於表達該片段所編碼的多肽。該片段可單個地表達，或優選作為多肽庫單獨或以融合蛋白的形式表達。本領域技術人員將理解可從作為起始物的DNA或RNA表達多肽。例如，可通過首先從RNA片段製備cDNA，然後用此cDNA表達多肽，實現從RNA病毒表達多肽。優選地，多肽表達成不溶性包涵體。以不溶性包涵體形式表達多肽允許多肽以APC容易加工和呈遞的形式大量表達。表達成包涵體的蛋白易於純化，提供了一種表達和加工的高度有效的方法，而且有利於該方法在未測序生物中應用。
可從含有基因組片段的載體表達多肽。在一個優選實施方案中，該載體是質粒例如pUEX載體。本領域技術人員將理解可使用其它能從插入片段表達多肽的載體。優選地，多肽表達為融合蛋白。一個優選的融合蛋白例子是不溶性β-半乳糖苷酶融合蛋白。在一個實施方案中，該表達包括培養轉化了含有基因組片段的載體的宿主細胞。在本方法的優選實施方案中，片段以兩個方向三種不同的閱讀框方式連入表達載體。
該方法還包括回收表達的多肽。例如，可通過收集培養宿主細胞的上清回收培養宿主細胞表達的多肽。回收的多肽可進一步採用標準技術從上清中純化。表達為不溶性包涵體的多肽的回收可採用例如不溶性包涵體的超聲處理、溶菌酶裂解和去汙劑輔助分離，參見Neophytou等，1996，美國科學院院刊，932014-2018。
該方法還包括分析表達多肽引起免疫應答的能力。引起免疫應答的能力反映了多肽中免疫原性表位的存在。在一個實施方案中，該免疫應答是細胞免疫應答。該分析可包括進行測量T細胞刺激或激活的實驗。T細胞的例子包括CD4和CD8 T細胞。
T細胞刺激實驗的一個例子是T細胞增殖實驗，參見例如以下實施例1或D.M.Koelle等，1994，病毒學雜誌68(5)2803-2810。該T細胞增殖實驗可包括例如用抗原呈遞細胞和針對該病毒的T細胞接觸表達多肽，然後測量T細胞的增殖。可通過測量3H-胸苷的摻入或其它增殖標記確定T細胞增殖。與響應對照抗原的T細胞增殖相比，如果在暴露於測試抗原的T細胞中檢測到增殖增加，則該增殖分析反映了T細胞刺激。增殖增加的一個示例性標準是，與對照細胞培養物相比，測試物的沉澱核酸製備物中摻入的3H-胸苷的液體閃爍計數每分鐘計數值(cpm)在統計學上顯著增加。另一個T細胞刺激或激活實驗的例子是細胞溶解實驗。以下的實施例1中提供細胞溶解實驗的一個例子。
可對多肽庫進行該分析以鑑定含有活性成分的庫。然後可進一步分析逐漸縮小的原庫子集以分離目標多肽。可純化含有目標片段的物質如含有病毒插入片段的質粒，並對該病毒片段測序。根據獲得的序列信息，可製備合成多肽用於進一步測試和驗證鑑定的抗原。片段的測序還可導致新基因的識別。
可重複上述方法步驟，其中製備基因組片段的亞片段。可對逐漸縮小的片段進行表達和測試以確定最小表位。
可將本發明方法應用於多種感染性微生物，包括細菌、寄生蟲和病毒。優選的病毒含有無內含子的DNA或大多為編碼序列的DNA。病毒的例子包括雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒、雙鏈RNA病毒和單鏈RNA病毒。雙鏈DNA病毒的例子包括但不限於Epstein-Barr病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)、單純皰疹病毒-1(HSV-1)、HSV-2、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、人皰疹病毒6(HHV-6)、HHV-7、HHV-8、痘病毒和腺病毒。單鏈DNA病毒的例子包括但不限於細小病毒。雙鏈RNA病毒的例子包括但不限於逆轉錄病毒和呼腸弧病毒。單鏈RNA病毒的例子包括但不限於副粘病毒、粘病毒和黃病毒。
因為該方法不需要生物的核酸序列信息，所以它提供了一種對抗表現出極大生物學變異性的感染性生物(如HIV和HCV)的策略。對於顯示出高變異性的病毒，利用特定病人特定部位(如血、皮膚、子宮頸)來源的病毒核酸物質資源，或在特定地理學區域或病人群體中傳播的代表性病毒株是有利的，這些病毒可能與已知核酸序列的原型株不同。
本發明還提供一種診斷方法。該診斷方法可用於鑑定懷疑患有皰疹感染的病人的免疫學反應性，以及預測對象對特定治療過程的反應性。該方法包括將對象的T細胞在存在適當APC的情況下暴露於本發明的抗原，並通過例如測量IFNγ、增殖或細胞毒性來檢測免疫反應性。適當的方法詳見實施例。
實施例以下實施例用於闡述本發明並幫助普通技術人員操作和使用本發明。這些實施例不以任何方式限制本發明的範圍。實施例1HSV-2內膜(tegument)蛋白中病毒表位的鑑定該實施例顯示採用全長病毒DNA的表達克隆鑑定T細胞抗原的方法。本文描述了通過表達克隆發現的可被損傷浸潤T細胞識別的5種HSV表位。還描述了通過表達克隆以外的其它方法發現的VP16中的幾個表位。病毒和細胞在Vero細胞(D.M.Kollele等，1993，J.Clin.Invest.，91961-968)中生長和滴定HSV-1的E115株(S.L.Spruance和F.S.Chow，1980，J.Infect.Dis.，142671-675.)、HSV-2的333株(S.Kit等，1983，Biochim.Biophys.Acta.，741158-170)、雜交型重組病毒RS1G31(M.F.Para等，1983，病毒學雜誌，451223-1227)、DX32(V.G.Preston等，1978，病毒學雜誌，28499-517)和RP-2(D.M.Koelle等，1994，病毒學雜誌，682803-2810)。Epstein-Barr病毒轉化的淋巴細胞傳代細胞系(EBV-LCL)(D.M.Kollele等，1993，見上)包括來源於患生殖器皰疹的供體的自體細胞系、HLA DPB1*0402純合的AMAI、HLA DQB10501純合的HOM2、HLA DQB1*0201純合的MAT以及HLA DPB1*2001純合的ARENT(J.G.Bodmer等，1996，組織抗原(Tissue Antigens)49297-321)。
經Institutional Review Board同意後獲取HSV特異性T細胞。大多數克隆的獲得未經抗原的第二次體外刺激。供體1、2和4的編號同以前所述(D.M.Kollele等，1994，病毒學雜誌，682803-2810)，並分別是損傷來源克隆1.L3D5.10.8、2.3和4.2E1的來源；克隆2.3和4.2E1以前已有描述(D.M.Kollele等，1994，見上)。另外的損傷來源克隆來自供體ES以及供體RH和KM，其中克隆ESL2.20、ESL3.335、ESL4.34和ESL4.9獲自ES供體的第二、第三、第四個損傷樣品(相互之間間隔一年)。克隆2.3、4.2E1、ESL2.20、RH.13、和KM.17直接來源於皰疹小泡液體(D.M.Kollele等，1994，J.Infect.Dis.169956-961)。為了獲得CD4 TCC ESL4.9，進行了復發性生殖器HSV-2損傷的活組織檢查，並按前人所述(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，1011500-09)在存在無環鳥苷時用PHA和IL-2(Schiaperelli Biosystems，Columbia，MD)擴增大量損傷浸潤細胞。16天後，按1細胞/孔的密度克隆細胞(D.M.Kollele等，1994，J.Infect.Dis.169956-961)。以前描述的VP-16特異性克隆1A.B.25、ESL3.334和ESL4.34(D.G.Doherty等，1996，人類免疫學(HumanImmunol.)47149；K.R.Jerome等，1998，病毒學雜誌，72436-441；D.M.Kollele等，1997，人類免疫學，53195-205)同樣來源於粗培養物。
一些克隆採用抗原第二次體外刺激獲得。為從供體1獲得另外的TCC(D.M.Kollele等，1994，病毒學雜誌，682803-2810)，從克隆1A.B.25(見上)取樣時的復發6年後得到的(症狀第5天)4個2mm活檢組織的每一個製備PHS處理的粗培養物。16天後，在2ml T細胞培養基中用10ug/ml HSV-2 VP22 105-190(見下)和等量輻射(3300rad)過的自體PBMC刺激來自一個活檢培養物的1.5×106個粗淋巴細胞(D.M.Kollele等，1994，J.Infect.Dis.169956-961)。從第6天開始加入IL-2(32U/ml)。按前人所述(D.M.Kollele等，1994，見上)在第12天從該細胞系分離TCC 1.L3D5.10.8。為產生PBMC來源的TCCSB.17和BM.17，在25孔板中用4ug/ml杆狀病毒來源的全長VP16，刺激HSV-2血清反應陽性供體SB和BM的1.5×106PBMC 12天；以1細胞/孔克隆應答細胞。最後一次刺激後10-14天使用TCC和細胞系。
除了ARENT外所有的細胞系均是支原體陰性。DNA探針測試(Genprobe，San Diego，CA)顯示ARENT最初為支原體陽性，在使用前用10ug/ml環丙沙星(S.M.Gignac等，1991，Leukemia 5162-165)處理兩周，測試反應轉變為陰性。流式細胞計數鼠mAb與人CD4(克隆SRCI 12T4D11)和CD8(識別人CD8α鏈的克隆SFC 21Thy2D3)(Coulter，Hialeah，FL)結合用於流式細胞計數。免疫印跡按前人所述方法(R.A.Ashley等，1988，臨床微生物學雜誌(J.Clin.Microbiol.26662-667)製備HSV感染的Vero細胞裂解物，10％SDS-PAGE電泳後，轉移至硝酸纖維素膜上。用PBS-0.05％Tween20-1％脫脂幹奶粉封閉印跡。依次與1∶100稀釋的UL49基因產物VP22特異mAb P43(G.D.Elliott等，1992，J.Gen.Viol.，73723-736)、親和純化的羊抗鼠IgM-過氧化物酶偶聯(Sigma，St.Louis.，MO)、以及TMB底物系統(Kirkegaard和Perry，Gaithersberg，MD)一起孵育，並且每步間在PBS-Tween中洗滌(3次×5分鐘)，以檢測抗原。病毒DNA文庫和克隆對於亞基因組DNA，從Bgl II i片段中亞克隆HSV-2的HG-52株的BamH I w片段，並凝膠純化。病毒DNA用Sma I消化，然後用KlenowDNA聚合酶補平BamH I末端，並且通過酚抽提和乙醇沉澱純化DNA片段。對於整個病毒DNA，用HSV-2的HG52株感染匯合成片的Vero細胞。通過蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提和異丙醇沉澱從3個150cm2細胞培養物中製備總核酸。獲得的物質用Range H處理，並重複抽提和沉澱。部分(1ug)HG52的DNA用Sma I或Alu I消化，按如上所述合併和回收80％的消化產物用於創建表達文庫。
採用pUEX載體進行表達克隆(G.M.Bressan等，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，1510056)。用Sma I線形化pUEX-1、-2和-3 DNA，以小牛腸磷酸酶去磷酸化，並凝膠純化。將大約100ng載體與500ng DNA片段連接，取10％的乙醇沉澱的反應混合物在1mm小玻璃管中通過電穿孔(BTX，San Diego，CA)轉化大腸桿菌DH10Electromas株(GIBCO)。在1ml SOC培養基中復甦1小時後，一部分(每個100ul)凍存為甘油儲存物，一部分(250ul)在氨苄青黴素平板上30℃滴定，一部分(250ul)直接用於蛋白誘導產生融合蛋白文庫。每個轉化分離出數千個氨苄青黴素抗性克隆。為擴增基因組文庫，甘油儲存物在2YT-氨苄青黴素中30℃生長過夜，之後重新凍存。
通過分離UL49的262鹼基對Sma I-Stu I片段、UL50的583鹼基對Sma I片段、或UL50的397鹼基對Sma I-Stu I片段，分別進行VP22105-190、UL50 118-312、和UL50 118-250的驗證性亞克隆。將片段克隆入合適的線形化凝膠純化的pUEX載體中，在大腸桿菌DH5I中表達蛋白。通過測序證實構建物。抗原108-109pfu/ml的全病毒製備物用UV失活30分鐘(A.Mikloska和A.L.Cunningham，1998，J.Gen.Virol.，79353-361)，按1∶100的最終稀釋度使用。按已有方法(D.M.Kollele等，1997，人類免疫學，53195-205)合成VP22肽，以2mg/ml儲存在DMSO中。均在杆狀病毒中表達的UL48肽和全長VP16肽獲自Chiron公司(ChironCorporation，Emeryville，CA)，UL48肽長13個胺基酸，並與HSV-2的VP16第1-416位胺基酸有4個胺基酸重疊。
在2YT氨苄青黴素液體培養基中30℃生長至對數期(OD6000.4-0.6)的細胞中，42℃誘導細菌來源的蛋白抗原表達2小時。按已有方法(P.I.Neophytou等，1996，美國科學院院刊，932014-2018)，但省去凝膠純化步驟，進行蛋白純化。50ml細菌培養物(文庫)或5-10ml培養物(庫和克隆)在200-400ul PBS(無Ca無Mg)中產生細顆粒懸液。在1％SDS中60℃溶解蛋白10分鐘後，通過BCA(Pierce，Rockford，IL)測定蛋白濃度。在一些實驗中，用PBS和PBS/10mM EDTA洗滌熱誘導細菌，加熱至56℃ 10分鐘，在用作抗原之前用PBS洗滌。
在鑑定了病毒DNA的活性文庫之後，對於亞基因組病毒DNA片段，抗原鑑定採用了30-60個克隆，而對於全長病毒DNA則使用了2,000-3,000個克隆。對於較不複雜的文庫，將每個克隆的1ml培養物加工成6-8個克隆的庫。活性庫中的每一個克隆以及含有已知病毒DNA片段的驗證性亞克隆均製備成5ml培養物。採用組合方法(P.I.Neophytou等，1996，美國科學院院刊，932014-2018)篩選全病毒DNA的文庫。將轉化細菌的擴增文庫甘油儲存物在氨苄青黴素平板上滴定；在96孔板中加入20-30克隆/孔，於旋轉振蕩器上30℃培養過夜。按1∶100將培養物稀釋至1ml，並按上述方法誘導融合蛋白的合成。按排和列將培養物部分(每份400ul)收集在一起用於蛋白純化並在淋巴增殖實驗中進行評價。如果一排和一列以上的評價結果是陽性，則採用陽性排和一個陽性列交叉的孔從5-10ml培養物中製備蛋白以明確地鑑定陽性孔。用陽性孔的稀釋培養液接種氨苄青黴素平板，獲得細菌的培養物(n＝96個克隆)。按(12個細菌克隆的)庫的形式評價這些克隆，然後評價單個克隆。淋巴細胞功能性分析實驗在96孔U型底平板中進行三個重複增殖分析實驗，實驗孔中加入200ul T細胞培養基，其中含有104個克隆的T細胞、作為抗原呈遞細胞的105個輻射過的(3300rad)PBMC或2.5×104個輻射過的(8000rad)EBV-LCL以及抗原(D.M.Kollele等，1997，人類免疫學，53195-205)。當將加熱殺死的細菌作為抗原時，每孔加入相當於(失活前)105cfu的細菌以及慶大黴素(20ug/ml)。72小時後，每孔加入1uCi[3H]胸苷，18小時後收穫細胞，並通過液體閃爍計數計算胸苷的摻入量。標準偏差小於平均值的10％。結果以平均cpm或Δcpm(Δcpm等於測試抗原的平均cpm減去對照抗原的平均cpm)的形式給出。對於全病毒抗原，對照抗原是模擬感染細胞裂解物，而對於重組蛋白製備物則是pUEX2來源的β-半乳糖苷酶。為測定粗培養的損傷來源T細胞的反應性，融合蛋白或對照β-半乳糖苷酶的使用量是10ug/ml。 HSV-2的糖蛋白B和D以及VP16的使用量是1ug/ml，並且實驗按已有方法(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，1011500-09)進行。為測定HLA限制性座位，按已有方法(D.M.Kollele等，1994，病毒學雜誌，682803-2810)使用HLA DR特異性mAb L243(V.G.Preston等1978，病毒學雜誌，28499-517)、HLA DP特異性mAb B7.21(A.J.Watson等，1983，自然(Nature)，304358-360)、或HLA DQ特異性mAb SpV-L3(H.Spits等，1984，Eur.J.Immunol.，14299-304)。
按已有方法(D.M.Kollele等，1993，J.Clin.Invest.，91961-968)採用4小時51Cr釋放進行三個重複細胞溶解分析。按已有方法(W.W.Kwok等，1996，J.Exp.Med.，1831253-1258)，在洗滌之前將靶EBV-LCL用HSV-3以30的感染複數感染18小時，或用1.0uM肽刺激90分鐘。效應物與靶細胞的比為20∶1。自發釋放少於28％。DNA測序對在細菌中產生活性蛋白的質粒中病毒插入片段進行兩個方向的完全測序(Taq DyeDeoxy FS試劑盒，Perkin-Elmer ABI，Foster City，CA)，起始引物是CATGGCTGAATATCGACGGT(SEQ ID NO1；插入片段的5』末端)和CTAGAGCCGGATCGATCCGGTC(SEQ ID NO2；插入片段的3』末端)，然後按需要設計內部引物。HLA分型按血清學方法或在DNA水平上通過反向點印跡雜交，對II類等位基因進行HLA DR和DQ分型(E.Mickelson等，1993，組織抗原，4186-93)。HLA DP分型通過測序進行(HLA DP試劑盒，Perkin ElmerABI)。結果T細胞表位的精確定位為減少用於表達克隆的文庫複雜性，選擇已用HSV-1×HSV-2雜交型重組病毒(IRV)進行了部分作圖的TCC識別抗原。除VP16之外，0.7圖距單位附近的HSV DNA編碼T細胞抗原。用IRV DX32改善TCC4.2E1和2.3的表位作圖(D.M.Kollele等，1994，病毒學雜誌，682803-2810)(圖1A)。該基於HSV-2的病毒在0.7圖距單位附近含有一個HSV-1 DNA塊(V.G.Preston等，1978，病毒學雜誌，28499-517)。通過與HSV-2型特異的和VP-16特異的(D.M.Kollele等，1994，病毒學雜誌，682803-2810)T細胞克隆1A.B.25反應顯示，UL48基因產物具有HSV-2表型。UL49(圖2)和UL50基因產物(M.V.Williams，1987，病毒學(Virology)，156282-292；F.Wohlrab，1982，病毒學雜誌，43935-942)也具有HSV-2表型。因此，IRV DX32中存在的HSV-2 DNA包括UL48、UL49、UL50，並很可能包括居間的UL49.5。因為TCC 4.2E1和2.3與RS1G31和DX32反應，而不與RP2反應(圖1B)，所以最有可能識別UL49、UL49.5或UL50。通過表達克隆確定T細胞抗原選擇HSV-2的Bamm HI w片段用於表達克隆，因為其含有UL49、UL49.5和大部分UL50的編碼序列(A.Cress和S.J.Triezenberg，1991，基因(Gene)，103235-238；G.D.Elliott和D.M.Meredith，1992，J.Gen.Virol.，73723-736；N.J.Maitland等，1982，Infect.Immun.，38834-842)。70％-90％的隨機克隆含有插入片段；它們均是病毒來源的。篩選對每一種TCC最有效的文庫(pUEX1對TCC 4.2E1，pUEX3對TCC 2.3)(表1)，並通過庫和單個克隆的隨後測試，檢測單個反應性細菌克隆(表2)。克隆1.1.3編碼引起TCC 4.2E1增殖的融合蛋白。該克隆含有UL49的反向80bp Sma I片段，對於β-半乳糖苷酶而言正向並符合閱讀框的預測編碼第105-190位胺基酸的HSV-2 UL49DNA的262bp Sma I片段，以及UL49的246bp Sma I片段(該片段正向但不符合閱讀框，這是由於在262bp Sma I片段與242bp Sma I片段的接頭處有一個C殘基的缺失)。克隆3.19含有編碼UL50的118-312位胺基酸的583 bp Sma I片段，該片段之後是UL49的反向80和96bpSma I片段。
表1.鑑定引起HSV特異的TCC增殖([3H]胸苷摻入的平均cpm)的蛋白文庫。自體EBV-LCL(克隆4.2E1和2.3)或PBMC作為APC，並且文庫來源的融合蛋白抗原按1∶300稀釋。數據為[3H]胸苷摻入的平均cpm。
1文庫名稱列出了表達載體、HSV-2限制性片段的名稱或全長病毒DNA的株系、以及用以消化病毒DNA的限制性酶。2105輻射過的(3300rad)自體PBMC與模擬感染細胞裂解物或UV-處理的HSV-2抗原。
T細胞抗原的鑑定通過定向亞克隆和重疊的肽來證實。將編碼HSV-2 UL49第105-190位胺基酸的262bp Sma I片段亞克隆至pUEX3中，產生質粒49.262.12。該蛋白刺激TCC 4.2E1(表2)。只有HSV-2VP22的肽105-126(GGPVGAGGRSHAPPARTPKMTR；SEQ ID NO3)具有刺激作用(圖3)。將編碼UL50的第118-312和118-250位胺基酸的DNA片段亞克隆至pUEX3中。這些片段表達的融合蛋白是有活性的(表2)。表2.HSV-2反應性TCC的抗原特異性。使用1∶900稀釋的細菌來源的重組融合蛋白抗原。使用自體EBV-LCL(克隆4.2E1)或PBMC作為APC。[實施例352]和[實施例353]
5-{3-氯-4-(甲硫基)苯基}-2，2-二甲基-4-苯基-3(2H)-呋喃酮步驟1製備1-{3-氯-4-(甲硫基)苯基}-2-苯基-乙烷酮
首先0℃下在2-氯硫代茴香醚(3.0g)在120ml二氯甲烷中的攪拌溶液內緩慢添加2.8g的氯化鋁和3.0g的苯基乙醯基氯。在該溫度下攪拌反應混合物12小時。將反應溶液傾倒在冰和鹽酸水溶液上。所得溶情況下，HSV-2 DNA的單個Alu I片段的插入均符合閱讀框並且是正向的。肽作圖說明第187-206位胺基酸(圖3C)刺激TCC ESL4.9。融合蛋白作為粗損傷浸潤T細胞的探針在用於探測損傷浸潤T細胞的粗培養物的HSV抗原組中增加了新發現的T細胞抗原。首先獲得的標本是獲自患者1臀部HSV-2復發第5天(病毒培養物陽性)的一組四個活檢標本(每個2mm)(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，1011500-09；D.M.Kollele等，1994，病毒學雜誌，682803-2810)。所有四個活檢標本顯示了與VP22105-190的反應性，但不與β-半乳糖苷酶、糖蛋白B或D、或VP16反應。用VP22 105-190融合蛋白重複刺激原初粗培養物一個周期後獲得TCC。TCC 1.L3D5.10.8(圖3B)對VP22(105-190)和組成肽的增殖應答說明在VP22中存在第三個T細胞表位，其包含在第125-146位胺基酸中。在內膜蛋白VP16中鑑定另外的T細胞表位VP16中的三個表位(表3)均是HSV-2型特異的，它們以前已獲得了鑑定(K.R.Jerome等，1998，病毒學雜誌，72436-441)，並且從7個患者中的4個(57％)的生殖器HSV-2損傷浸潤淋巴細胞的粗培養物中檢測到對全長VP16的增殖應答(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，1011500-09)。採用了兩個策略在VP16中搜尋其它肽表位。第一個策略涉及篩選與HSV-2的重組VP16反應的從損傷小泡液體回收的克隆組，隨後用肽進行表位作圖。含有第185-197位胺基酸的肽以及含有重疊的209-221和213-225的肽分別對TCC RH.13和KM.7具有刺激作用(表3)。所有其它的VP16肽均是陰性的(＜500cpm)。第二個策略涉及使用PBMC作為起始物和用重組杆狀病毒來源的VP16進行第二次體外刺激。來自於兩個個體的克隆(BM.17和SB.17)識別同一個肽(第437-493位胺基酸)以及β-gal-VP16融合蛋白和全病毒。按序列數據推測，所有這三個新鑑定的VP16表位均是不同類型共有的，HSV-1和HSV-2全病毒製備物均具有該表位(A.Cress和S.J.Triezenberg，1991，基因(Gene)，103235-238)。表3.HSV-2 VP16中損傷或PBMC來源的CD4 TCC識別的表位。數據是與培養基比較獲得的[3H]胸苷摻入的Δcpm，在所有情況中培養基的cpm均少於500cpm。
1VP16 1-492(來自杆狀病毒)的使用量是1ug/ml。β-gal-VP16180-492按1∶1,000稀釋使用。2肽的使用量是1uM。na＝未獲得nd＝未做HLA限制對識別0.7圖距單位附近編碼的抗原的TCC進行HLA限制的詳細測定。VP22 105-126特異的TCC 4.2E1的增殖可被抗DP的mAb抑制84％，而抗DR或抗DQ mAb的抑制少於20％。TCC 4.2E1來自於DPB1*2001/DPB1*0402雜合供體。攜帶DPB1*2001而不是攜帶DPB1*0402的同種異體EBV-LCL呈遞抗原(表4)，說明為DPB1*2001所限制。UL50特異的TCC 2.3的增殖被抗DR的mAb抑制，而不被抗DP或抗DQ的mAb抑制。該克隆來自DRB1*0301/BRB1*0701雜合供體。來自DRB1*0301供體的同種異體PBMC呈遞抗原，這與抗原性肽與該等位基因產物的結合一致。然而，並不能排除通過連鎖的DR基因產物DRw52或DRw53進行的呈遞。其它HLA限制研究總結在表5中。表4.損傷來源的CD4 TCC 4.2E1和2.3的限制性HLA等位基因的確定。抗原是以1∶900稀釋的β-gal融合蛋白(表2)。數據是與培養基比較獲得的[3H]胸苷摻入Δcpm，在所有情況中培養基的cpm均少於500cpm。
1通過mAb的抑制確定的II類HLA座位的HLA型。2與使用相同APC的pUEX2對照蛋白(1∶1000稀釋)比較，該對照蛋白在每種情況中均產生少於500cpm的[3H]胸苷摻入。表5.損傷來源的內膜特異性CD4 TCC的溶細胞活性，及確切特異性和HLA限制的總結。結果是特異釋放百分比，其中效應物與靶之比除ESL4.34(10∶1)外為20∶1。Auto＝自體EBV-LCL作為靶細胞；allo＝同種異體EBV-LCL，其在相關HLA座位(如已知)或HLA DR和DQ不匹配。
auto＝自體allo＝同種異體na＝由於未進行表位作圖和製備合成抗原肽所以未獲得nd＝未做1顯示CTL分析中用於攜帶所選TCC的靶標的肽(1uM)。2HLA限制性座位和/或等位基因的最大程度鑑定。對象RH和KM進行血清學分型；而其它對象在DNA水平上分型。3對於HLA DRB1*0402和DRBl*1301而言對象是雜合的，而且限制性等位基因還未確定。4對於HLA DRB1*0301和DRB1*1102而言對象是雜合的，而且限制性等位基因還未確定。
我們詳細研究了TCC BM.17的HLA限制。TCC BM.17和相似克隆SB.17的增殖被抗DQ的mAb的抑制90％，而僅被抗DR或抗DP的mAb抑制不足25％。供體BM和SB是HLA DQB1*0201/0501雜合的。在高濃度肽存在的情況下，DQB1*0201和DQB1*0501純合的EBV-LCL表現出向TCC BM.17呈遞抗原。然而，DQB1*0501的純合細胞比DQB1*0201的純合細胞呈遞肽的效率要高得多(圖4)。因此，VP16 431-449中的三個不同的但相互重疊的表位由HLA DQB1*0302、DQB1*0201和DQB1*0501呈遞。內膜特異性CD4 T細胞克隆的CTL活性用EBV-LCL靶細胞測試具有新近和以前鑑定的特異性的CD4 TCC的細胞毒活性(表5)。測試的所有克隆表現出對裝載肽的靶細胞的細胞溶解活性。對感染HSV-2的靶細胞的細胞溶解活性表現出較大的變異性。VP22特異的TCC 4.2E1有細胞溶解活性，而來自其它供體的VP22特異TCC則無。在測試的7個VP16特異T細胞克隆中，6個顯示出對HSV-2感染靶細胞的大於10％的細胞毒性。單個UL21和UL50特異的TCC對於病毒感染的靶細胞沒有細胞溶解活性。討論HSV特異性T細胞選擇性地浸潤復發的生殖器HSV-2損傷(D.M.Kollele等，1994，J.Infect.Dis.169956-961)。有CD4和CD8介導的成分參與的局部CTL活性與病毒的清除相關(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，1011500-09)。局部HSV特異性T細胞識別的抗原是多樣的，而且在許多情況中是未知的(D.M.Kollele等，1994，病毒學雜誌，682803-2810)。該實施例闡明了內膜蛋白VP22和UL21以及病毒的dUTPase的識別，並提供了關於內膜蛋白VP16的新信息。
本文描述的表達克隆系統對HSV是有效的。由於HSV基因組中內含子很少，故可直接使用基因組雙鏈DNA。使用同樣的HSV-2株HG52(A.Dolan等，1998，病毒學雜誌，72；2010-2021)篩選候選損傷來源的TCC和製備蛋白文庫。供體中的HSV-2株系和HG52之間相對低程度的株系變異性很少導致體內識別表位的遺漏；自體分離物的使用將利於在具有較高株系變異性的病毒中應用。
值得注意的是，用來自兩個供體的損傷浸潤TCC在兩個獨立的表達克隆實驗中均檢測到與VP22的反應性。在對第一套獲得的損傷浸潤淋巴細胞粗培養物的篩選過程中也檢測到VP22的反應性。來自三個患者的其它10個克隆對於公開的UL49、UL21和UL50片段的反應性是陰性的。
對於損傷浸潤CD4 T細胞，內膜抗原可能是合適的靶標，因為這些抗原很豐富。VP16和VP22大量存在在HSV-1中每個病毒粒體包含大約1.6×103個分子的VP16(Y.Zhang和J.L.C.McKnight，1993，病毒學雜誌，671482-1492)和2.5-2.8×103個分子的VP22(J.Leslie等，1996，病毒學，22060-68)。對於UL21可獲得的信息較少(J.D.Baines等，1994，病毒學雜誌682929-2936；J.A.Blaho等，1994，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)26917401-17410)。病毒dUTPase是報導為HSV特異性CD4 T細胞應答靶標的第一個非病毒顆粒成分。和VP16及VP22一樣，該酶位於HSV-2(而非HSV-1)感染細胞的細胞核(F.Wohlrab等，1982，病毒學雜誌，43935-942)。體內抗原呈遞可在感染細胞中dUTPase的內源合成後或感染細胞碎片的dUTPase抗原清除之後發生。dUTPase特異性TCC 4.2E1對HSV感染細胞的裂解說明至少在體外可發生內源抗原的呈遞。
因為C端與VP22融合表達的多肽可被共轉運進入細胞，所以以VP22融合形式表達蛋白作為佐劑製備物的一種形式可能是有意義的。這可通過VP22中異源表位的表達來測試。正如免疫共沉澱所顯示的那樣，HSV-1的VP16和VP22在感染細胞中以強的非共價形式結合。這些蛋白共定位於細胞的核周區域(G.Elliott等，1995，病毒學雜誌，697932-7941；G.D.Elliott等，1992，J.Gen.Virol.，73723-736)。這種結合可能在刺激CD4 T細胞對VP16的明顯高水平的應答中起作用。
總之，表達克隆允許發現新的HSV T細胞抗原。抗原特異性CD4 T細胞在損傷處的原位富集，允許通過抗原的第二次體外刺激無偏差地研究抗原庫。HSV基因組的有利特點允許直接使用全病毒DNA文庫。內膜蛋白可與膜糖蛋白一起用作人類HSV疫苗候選者。實施例2其它HSV-2病毒表位的鑑定採用以上實施例1所述的表達克隆方法鑑定其它的HSV-2 T細胞抗原。結果揭示了兩個其它抗原。一個位於UL19的第1078-1319位胺基酸。UL19也被稱為主要衣殼抗原或VP5。另一個抗原是US8的第1-273位胺基酸，US8也稱為糖蛋白E。該US8抗原經來源於子宮頸樣品的T細胞鑑定。實施例3全長UL49和UL50的效力該實施例顯示了全長UL49和UL50蛋白可有效刺激T細胞增殖。數據說明了大腸桿菌和Cos-7細胞中表達的全長UL49的抗原性，和Cos-7細胞中表達的全長UL50的抗原性。這些結果證實了上文描述的抗原是準確鑑定的。
為了在原核系統中表達HSV-2的全長UL49蛋白，通過PCR從製備的HSV-2的HG52株DNA克隆該基因，使用的引物是該基因5』端的GGAAGATCTACCTCTCGCCGCTCCGTCA(SEQ ID NO4)和該基因3』端的CCGGAATTCTTGTCTGTCGTCTGAACGCG(SEQ ID NO5)。PCR產物經Bgl II和EcoR I消化後克隆在TA克隆載體pcR2.1-Topo(Invitrogen)的Bgl II和EcoR I位點中。然後將該基因亞克隆至載體pTrcHisB(Invitrogen)，之後亞克隆至pGEX-2T(Pharmacia)。與發表的序列(Dolan 1998)比較，HSV-2 UL49克隆的序列有一個編碼突變第244位胺基酸由絲氨酸突變成脯氨酸。該表達蛋白的預測胺基酸序列還缺失起始甲硫氨酸。UL49含有來源於載體pGEX2T的N端融合域。該質粒命名為pGEX2T-UL49HSV2。
為產生原核表達的全長USV-2 UL49，用pGEX2T-UL49HSV2或對照空質粒轉化大腸桿菌BL21。對數生長期的細菌在LB氨苄青黴素培養基中調節至OD600為0.4。向一些試管加入β-D-硫代吡喃半乳糖異丙苷(IPTG)至0.3mM。細菌在37℃振蕩培養1.5小時。離心收集細菌並用含1mM EDTA的PBS洗滌3次，加熱至65℃10分鐘，再用PBS洗滌兩次以上，然後以大約1×109細菌/ml重懸在T細胞培養基中。使用熱殺死細菌懸液作為測試抗原。
為了在真核系統中表達HSV-2的全長UL49蛋白，採用具有閱讀校對功能的高保真DNA聚合酶通過聚合酶鏈式反應單獨重新擴增該基因。採用相同的引物和模板。該基因直接克隆至pEGFP-C1(Clontech)的Bgl II和EcoR I位點。對整個UL49基因測序，結果與發表的序列一致。表達蛋白的預測胺基酸序列與病毒UL49的預測序列除了第1位胺基酸起始甲硫氨酸缺失外均一致。而且來源於載體pEGFP-C1的N端融合域預測也將表達。該質粒命名為pEGFP-C1-UL49HSV2。
為了製備真核表達的HSV-2的全長UL49，用pEGFP-C1-UL49HSV2質粒DNA或pEGFP-C1載體對照DNA通過脂轉染法轉染Cos-7細胞。48小時後，刮下細胞並超聲破碎，然後分離上清和沉澱相。使用9.4cm2培養皿的細胞產生300微升上清。將由一個9.4cm2培養皿產生的沉澱重懸在300微升培養基中。上清和沉澱製備物用作測試抗原。
為了在真核系統中表達HSV-2的全長UL50蛋白，採用具有閱讀校對功能的高保真熱穩定DNA聚合酶通過PCR從HSV-2的HG52株DNA製備的DNA克隆該基因，所用引物是該基因5』端的TAAGGTACCTATGAGTCAGTGGGGGCCC(SEQ ID NO6)和該基因3』端的AAACTGCAGGAGGCGCGGTCTAGATGC(SEQ ID NO7)。該靶DNA作為BglII i片段的克隆，克隆至pUC9中。該PCR產物經KpnI和PstI消化後，克隆至同樣消化的pcDNA3.1-myc-his-B(Invitrogen)中。對載體和插入片段的接頭處序列進行證實。該質粒命名為pcDNA3.1-myc-his-B-UL50HSV2。該表達蛋白的預測胺基酸序列與病毒UL50的預測序列一致。來源於載體pcDNA3.1-myc-his-B的N端融合域也預測表達。為了將真核表達的HSV-2的全長UL50製備為測試抗原，完全按上述針對UL49的方法使用Cos-7系統。UL50的對照抗原通過pcDNA3.1-myc-his-B轉染Cos-7細胞製備。
將這些測試抗原加入含有200微升T細胞培養基的分析孔(96孔，U型底)中，每孔含有1×105個輻射過的自體外周血單核細胞(PBMC)，以及1×104損傷來源的CD4+T細胞克隆，其中對UL49該T細胞克隆是ESL 4.9，而對UL50是克隆2.3(Kollele等，1994和1998以及最初的專利申請文獻)。進行兩次或三次重複分析。三天後，按實施例1中所述測量3H胸苷摻入量。
結果用刺激指數(測試抗原的3H胸苷摻入平均cpm/培養基對照的3H胸苷摻入平均cpm)以及Δcpm(測試抗原的3H胸苷摻入平均cpm-培養基對照的3H胸苷摻入平均cpm)來表示。按實施例1的描述和標示，進行陽性和陰性對照抗原操作。表6.在大腸桿菌BL21中原核表達的全長HSV-2 UL49的抗原性
表7.在CoS-7細胞中真核表達的全長HSV-2 UL49的抗原性
表8在CoS-7細胞中真核表達的全長HSV-2 UL50的抗原性
這些結果顯示HSV-2蛋白UL49和UL50當以全長蛋白形式表達時保留了它們的免疫原性。在原核和真核系統中均進行了UL49的研究，在真核系統中進行了UL50的研究。實施例4全長UL21的效力為了在真核系統中表達HSV-2的全長UL21蛋白，採用具有閱讀校對功能的高保真熱穩定DNA聚合酶，通過PCR從製備自HSV 2型HG52株DNA的DNA克隆該基因，所用引物在該基因5』端是CTGGGATCCATGGAGCTCAGCTATGCCACC(SEQ ID NO8)，和在該基因3』端是CGCGAATTCTCACACAGACTGGCCGTGCTG(SEQ ID NO9)。該PCR產物經BamHI和EcoRI消化後，克隆至同樣消化的pGEX-5T中。從該質粒，用BamHI和XhoI將其切下，並克隆至同樣消化的pcDNA3.1-myc-his-C(Invitrogen)。對載體和插入片段的接頭處序列進行了證實。該質粒命名為pcDNA3.1-myc-his-C-UL21HSV2。該表達蛋白的預測胺基酸序列與病毒UL21的預測序列一致。預測來源於載體pcDNA3.1-myc-his-B的N端融合域也將表達。為了將真核表達的HSV-2全長UL21製備為測試抗原，完全按針對UL49的所述方法使用Cos-7系統。UL21的對照抗原通過pcDNA3.1-myc-his-B轉染Cos-7細胞製備。
將UL21測試抗原加入含有200微升T細胞培養基的分析孔(96孔，U型底)中，每孔含有1×105個輻射過的自體外周血單核細胞(PBMC)，以及1×104損傷來源的攜帶CD4的T細胞克隆ESL 2.20(Kollele等，1994和1998以及上面的實施例1)。分析進行三次重複。三天後，按實施例1中所述測量3H胸苷摻入量。結果用刺激指數(測試抗原3H胸苷摻入的平均cpm/培養基對照3H胸苷摻入的平均cpm)以及Δcpm(測試抗原3H胸苷摻入的平均cpm-培養基對照3H胸苷摻入的平均cpm)來表示。按所示方法進行陽性和陰性對照抗原操作；細節可參見實施例1。結果陳述於表9。
表9.在Cos-7細胞中真核表達的全長HSV-2 UL21的抗原性
實施例4群體中抗原的普遍性本實施例通過說明群體中對這些抗原應答的普遍性來支持本發明抗原的防止和治療用途的實用性。為達到該目的，調查了7個通過型特異性血清學證明為HSV-2感染的個體。這些個體與HSV-2損傷處回收的指標T細胞克隆的來源個體不同。
對於每個測試對象，分離PBMC並在24孔板中以2×106細胞/孔接種於2ml T細胞培養基中，然後用1∶500稀釋的UV滅活HSV-2 333株體外刺激5天。此時加入40單位/ml重組人IL-2，再作用5至6天，產生短期HSV特異性細胞系，稱作B1細胞系。
按如下方法評價對每種HSV-2蛋白的反應性。在96孔圓型底微量滴定板上進行增殖分析，每種情況重複三次。每孔中加入1×105輻射過(3300 rad)的自體PBMC作為抗原呈遞細胞。每孔還加入1×104B1細胞。然後加入下列對照物質培養基、1∶500稀釋的UV處理模擬病毒製備物、1∶500稀釋的UV處理HSV-2 333株、終濃度達到每ml 4微克的HSV-2糖蛋白B或D或VP16蛋白(純化的)。對UV處理HSV-2的應答預期為陽性，用作細胞變異性和總體特異性的陽性對照。以前顯示糖蛋白B和D以及VP16是HSV特異性T細胞的靶位點(D.M.Kollele等，1994，病毒學雜誌，68(5)2803-2810)。
對於新發現的抗原UL21、UL49、UL50，其全長基因的克隆和在真核Cos-7系統中的表達上面均已描述過，同樣基於空載體的對照抗原的製備上面也已描述過。對於新發現的抗原gE2(US8)，採用具有閱讀校對功能的高保真熱穩定DNA聚合酶，通過PCR從製備自HSV2型HG52株DNA的DNA克隆該全長基因，所用引物在該基因5』端是CGGGGTACCTGCTCGCGGGGCCGGGTTGGTG(SEQ ID NO10)，在3』端是TGCTCTAGAGCCTTACCAGCGGACGGACGG(SEQ ID NO11)。該PCR產物經ACC65I和XhaI消化後，克隆至同樣消化的pcDNA3.1-myc-his-B(Invitrogen)中。該質粒命名為pcDNA3.1-myc-his-B-US8。對載體和插入片段的接頭處序列進行了證實。該表達蛋白的預測胺基酸序列與病毒US8的預測序列一致。預測來源於載體pcDNA3.1-myc-his-B的N端融合域也將表達。為了製備真核表達的全長HSV-2 US8，按以上所述使用Cos-7系統。對於4種新抗原(UL21、UL49、UL50和US8)的每一種以及對照，在三個重複增殖分析中按1∶20的最終稀釋度使用感染的Cos-7細胞超聲破碎後的上清和沉澱。
如果刺激指數(測試抗原3H胸苷摻入的平均cpm/培養基對照3H胸苷摻入的平均cpm)大於或等於4.0，則記為陽性反應。對於UV HSV-2抗原，相關的對照抗原是UV模擬病毒。對於gB2、gD2和VP16，對照是培養基。對於在Cos-7細胞中表達的新抗原，對照抗原是用對照空載體轉染的Cos-7細胞的上清或沉澱。結果顯示於表10。已證明每一種新發現的抗原與至少一個研究對象有反應性。大體上說，觀察到與UL49的反應性具有更高頻率，而且類似於對已知抗原gB2和gD2的反應性。這些數據支持，除了最初在其中描述該T細胞反應性的指標對象外，其他人類個體能夠與這些HSV來源的抗原蛋白發生反應。
表10.在一組7個隨機挑選的HSV-2感染的有免疫能力的成人中已知和新發現的HSV-2抗原的抗原性。
本領域技術人員將理解，在前面的描述中公開的概念和具體的實施方案可以容易地作為修飾或設計其它實施方案以執行本發明相同目的的基礎。本領域技術人員也將理解，這些相當的實施方案並不偏離在所附權利要求中給出的本發明的精神和範圍。
序列表110華盛頓大學(申請人/受讓人)David M.Koelle(僅為發明人)Lawrence Corey(僅為發明人)120免疫學單純皰疹病毒抗原及其使用方法13030967.3 WOU115060/095,7241511998-08-0716011170FastSEQ for Windows Version 3.0210121120212DNA213單純皰疹病毒4001catggctgaa tatcgacggt210221122212DNA213單純皰疹病毒4002ctagagccgg atcgatccgg tc210321122212PRT213單純皰疹病毒4003Gly Gly Pro Val Gly Ala Gly Gly Arg Ser His Ala Pro Pro Ala Arg15 10 15Thr Pro Lys Met Thr Arg20210421128212DNA213單純皰疹病毒4004ggaagatcta cctctcgccg ctccgtca210521129212DNA213單純皰疹病毒4005ccggaattct tgtctgtcgt ctgaacgcg210621128212DNA213單純皰疹病毒4006taaggtacct atgagtcagt gggggccc210721127212DNA213單純皰疹病毒4007aaactgcagg aggcgcggtc tagatgc210821130212DNA213單純皰疹病毒4008ctgggatcca tggagctcag ctatgccacc210921130212DNA213單純皰疹病毒4009cgcgaattct cacacagact ggccgtgctg2101021131212DNA213單純皰疹病毒40010cggggtacct gctcgcgggg ccgggttggt g2101121130212DNA213單純皰疹病毒40011tgctctagag ccttaccagc ggacggacgg
權利要求
1.含有分離的單純皰疹病毒(HSV)多肽和藥物學上可接受載體的藥物組合物，其中所述多肽包含UL19、UL21、UL49、或UL50蛋白或其片段。
2.含有分離的HSV多肽和藥物學上可接受載體的藥物組合物，其中所述多肽含有選自如下序列的胺基酸序列(a) UL19的第1078-1319位胺基酸；(b) UL21的第148-181位胺基酸；(c) UL49的第105-190或177-220位胺基酸；(d) UL50的第118-312位胺基酸；(e) 糖蛋白E(gE)的第1-273位胺基酸；(f) VP16的第185-197、209-221或430-449位胺基酸；和(g) (a)-(f)的替代變體。
3.權利要求1或2的組合物，其中所述多肽是融合蛋白。
4.權利要求3的組合物，其中所述融合蛋白是可溶性的。
5.編碼含有選自下組的胺基酸序列的多肽的多核苷酸(a) UL19的第1078-1319位胺基酸；(b) UL21的第148-181位胺基酸；(c) UL49的第105-190或177-220位胺基酸；(d) UL50的第118-312位胺基酸；(e) 糖蛋白E(gE)的第1-273位胺基酸；(f) VP16的第185-197或209-221位胺基酸；和(g) (a)-(f)的替代變體。
6.含有權利要求5的多核苷酸的載體。
7.用權利要求6的載體轉化的宿主細胞。
8.生產HSV多肽的方法，其包括培養權利要求7的宿主細胞並回收由此產生的多肽。
9.通過權利要求8的方法產生的HSV多肽。
10.含有編碼HSV多肽的多核苷酸和藥物學上可接受載體的藥物組合物，其中所述多肽包含UL19、UL21、UL49、或UL50蛋白或其片段。
11.含有權利要求5的多核苷酸和藥物學上可接受載體的藥物組合物。
12.經遺傳修飾表達UL19、UL21、UL49、或UL50蛋白或其片段的重組病毒。
13.經遺傳修飾表達權利要求5的多肽的重組病毒。
14.權利要求12或13的病毒，其是牛痘病毒、金絲雀痘病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒或腺病毒。
15.含有權利要求14的病毒和藥物學上可接受載體的藥物組合物。
16.權利要求1-4、10-11或15之任一項的藥物組合物，其還包含佐劑。
17.製備抗HSV的免疫細胞的方法，其包括用抗原呈遞細胞接觸免疫細胞，其中所述抗原呈遞細胞經修飾呈遞UL19、UL21、UL49或UL50蛋白或如下多肽中包含的表位(a) UL19的第1078-1319位胺基酸；(b) UL21的第148-181位胺基酸；(c) UL49的第105-190或177-220位胺基酸；(d) UL50的第118-312位胺基酸；(e) 糖蛋白E(gE)的第1-273位胺基酸；(f) VP16的第185-197或209-221位胺基酸；和(g) (a)-(f)的替代變體。
18.權利要求17的方法，其中所述免疫細胞是T細胞。
19.權利要求18的方法，其中所述T細胞是CD4+或CD8+T細胞。
20.通過權利要求17-19之任一項的方法製備的免疫細胞。
21.殺死HSV感染細胞的方法，其包括用權利要求20的免疫細胞接觸HSV感染細胞。
22.抑制HSV複製的方法，其包括用權利要求20的免疫細胞接觸HSV感染細胞。
23.治療對象的HSV感染的方法，其包括給對象施用 1-4、10-11或15-16之任一項的組合物或權利要求20的免疫細胞。
24.防止對象HSV感染的方法，其包括給對象施用權利要求1-4、10-11或15-16之任一項的組合物。
25.增強抗病毒或免疫調節性淋巴因子分泌的方法，其包括用權利要求20的免疫細胞接觸HSV感染細胞。
26.增強HSV特異性抗體產生的方法，其包括用權利要求20的免疫細胞接觸對象的HSV感染細胞。
27.治療或防止對象的HSV感染的方法，其包括給對象施用經修飾呈遞UL19、UL21、UL49或UL50蛋白或如下多肽中包含的表位的抗原呈遞細胞(a) UL19的第1078-1319位胺基酸；(b) UL21的第148-181位胺基酸；(c) UL49的第105-190或177-220位胺基酸；(d) UL50的第118-312位胺基酸；(e) 糖蛋白E(gE)的第1-273位胺基酸；(f) VP16的第185-197或209-221位胺基酸；和(g) (a)-(f)的替代變體。
28.權利要求27的方法，其中所述抗原呈遞細胞用能介導所述表位表達的病毒、肽或微球體修飾。
29.權利要求1-28之任一項的方法，其中所述HSV是HSV-2。
全文摘要
本發明提供對防止和治療HSV感染有用的HSV抗原。本文公開了經證實可被皰疹損傷或子宮頸來源的T細胞識別的抗原和/或其組成表位。對本發明抗原具有特異性的T細胞顯示出對攜帶病毒編碼的肽表位的細胞具有細胞毒活性,在許多情況下,顯示對感染HSV的細胞具有細胞毒活性。負責T細胞特異性的免疫原性抗原的鑑定提供了改善的抗病毒治療和預防策略。含有本發明抗原或編碼本發明抗原的多核苷酸的組合物提供了用於防止和治療HSV感染的有效定向疫苗。
文檔編號C07K19/00GK1348463SQ99810454
公開日2002年5月8日 申請日期1999年8月5日 優先權日1998年8月7日
發明者D·M·科勒, L·克雷 申請人:華盛頓大學