待分析物的檢測的製作方法

2023-06-29 17:20:41 2

專利名稱：待分析物的檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及對待分析物的存在或濃度的檢測。更準確地說，本發明涉及使用指示系統來檢測待分析物，所述指示系統在暴露於待分析物中時分子結構會發生改變。結構的改變將影響與指示系統有關的可檢測的性質，由此能夠對待分析物的存在或濃度進行檢測。
背景技術：
美國專利5 503 770(James等人)涉及一種包含硼酸的螢光化合物，當其結合至糖類(包括葡萄糖)上時將發出高強度的螢光。所述螢光化合物的分子結構中包含一螢光基團，至少一個苯基硼酸部分和至少一個供胺氮原子；其中氮原子排列在苯基硼酸部分附近，以便與硼酸發生分子內相互作用。由此，上述相互作用將使化合物在與糖類結合時發射螢光。美國專利5 503 770中描述了適於檢測糖類的化合物。參見T.James等人的J.Am.Chem.Soc.117(35)8982-87(1995)。
NatureBiotechnology16，49-53(1998)涉及利用分子信標，即標記有螢光基團/猝滅劑對的髮夾形低聚核苷酸探針，來進行等位基因鑑別。在結合至目標物上時，探針將經歷結構改組，從而恢復已經內部猝滅的螢光基團的螢光。然而，由於在環境溫度下DNA鹼基配對的強度相對較高，因此，在應用時，分子信標探針必須經歷大的結構改變(通過基本上180°的改變)，所述系統不能容易地用來連續地實時檢測待分析物濃度的波動。
因此，現有技術中對於指示系統還有這樣的需求，即所述系統能夠以更高的靈敏度檢測待分析物的存在或濃度，它還可以使用多種檢測系統，並且還可以用於對濃度會發生波動的待分析物進行實時檢測。
發明概述一方面，本發明涉及一種檢測試樣中多羥基待分析物的存在或濃度的方法，該方法包括a)將試樣暴露於指示系統中，所述系統具有i)能以可逆方式與所述待分析物形成共價鍵的第一識別單元，和能以可逆方式與結合至第一識別單元上的所述待分析物形成共價鍵的第二識別單元(A)，或在沒有所述待分析物時能以可逆方式與第一識別單元相互作用的配位體單元(B)；所述配位體單元還可有可無地包含產生可檢測性的標記，所述可檢測性通過配位體單元與識別單元的相互作用而調控，其中指示系統中包含所述第一識別單元的部分以共價方式或非共價方式連接到包含所述第二識別單元或所述配位體單元的指示系統部分上；和ii)包含下列至少之一的檢測系統(A)產生可檢測特性的供體/受體系統，當所述指示系統暴露至所述待分析物中時，該系統以濃度-依賴的方式發生改變，或(B)所述被標記的配位體單元；和b)測量所述檢測特性的任何改變，由此測定在所述試樣中所述待分析物的存在或濃度。
另一方面，本發明涉及實施上述方法的指示系統。
附圖簡介

圖1示出了實施例1中描述的化合物的標準化螢光發射(在535nm的I/Io)。
圖2示出了實施例2中描述的化合物的標準化螢光發射(在535nm的I/Io)。
圖3示出了實施例3中描述的指示系統的螢光發射(在535nm的I)。
圖4示出了實施例4中描述的指示系統的螢光發射(在535nm的I)。
圖5示出了實施例5中描述的指示系統的螢光發射(在535nm的I)。
圖6示出了實施例6中描述的指示系統的螢光發射(在450nm的I)。
圖7示出了實施例6中描述的指示系統的標準化螢光發射(在430nm的I)。
圖8示出了實施例7中描述的指示系統的吸收光譜。
圖9示出了實施例7中描述的指示系統吸光率之比〔A(565nm)/A(430nm)〕。
圖10示出了實施例7中描述的指示系統在550nm的標準化螢光(I/Io)。
發明詳述一方面，利用在與待分析物相互作用時會發生結構改變的指示系統，本發明提供了一種檢測待分析物的存在或濃度的方法。當所述指示系統經歷結構改變時，它的可檢測特性會發生變化，這可以指示待分析物的存在或濃度變化。
根據本發明可以對許多待分析物進行檢測。合適的待分析物包括分子待分析物(與例如由配位鍵組成的金屬離子或金屬配合物相反，它可以稱為由共價鍵組成的分子)；碳水化合物；多羥基化合物，尤其是具有連位羥基的那些化合物，如游離糖(例如葡萄糖、果糖、乳糖等等)和結合至類脂、蛋白質等上的糖；小分子藥物；激素；氧；二氧化碳；各種離子，如鋅離子、鉀離子、氫離子、碳酸根離子等等。本發明尤其適於檢測小分子量待分析物，特別是小於5000道爾頓的待分析物。
在一實施方案中，本發明可以利用對於被檢測的分析物具有至少兩個識別單元的指示系統來實施，其通過定向能夠在兩個位點上與待分析物發生相互作用，從而使指示系統發生結構改變。另外，所述指示系統還具有與其配合的檢測系統，當指示系統與待分析物相互作用時，檢測系統具有的可檢測特性發生變化。在與待分析物相互作用時，識別單元可以呈現一構型，與沒有待分析物時的構型相比，在新的構型中它們將靠得更近或離得很遠，或者限制其分子運動的自由度，這又會對信號產生影響。構型的改變可以引起可檢測特性的改變。
在另一實施方案中，實施本發明所用的指示系統具有至少一個針對待檢測分析物的識別單元和一個配位體單元。配位體單元與識別單元之間能夠發生可逆的相互作用，並且與待分析物和識別單元的相互作用相競爭。當識別單元和配位體單元在沒有待分析物的情況下相互作用時，檢測系統將具有不同的優選構型或相對取向，而在待分析物與識別單元相互作用時，配位體單元將被從識別單元上置換下來。構型的改變可以引起可檢測特性的改變。在某些實施方案中，配位體單元還可以是檢測系統的一部分。例如，配位體單元也可以是猝滅劑，當待分析物與識別單元相互作用時其作用將被消除。此外，配位體單元還可以包含例如特性(例如光譜分布)隨配位體單元與識別單元之間的相互作用的存在與否而不同的可檢測標記。
對於上面描述的任一實施方案，合適的識別單元包括優選能夠與被檢測分析物可逆地相互作用的分子片斷。應理解的是術語「相互作用」可包括各式各樣的物理的和化學的相互作用，如電荷相互作用、氫鍵合、共價鍵合等等。特別優選的是，在識別單元和待分析物之間的相互作用，以及在配位體單元(如果存在的話)和識別單元之間的相互作用，的形式為以可逆方式形成一個或更多個共價鍵。在此，共價鍵優選指的是兩個原子之間的鍵，其中每一個原子提供一個電子，並且不包括氫鍵合、離子鍵合和由兩原子之一提供兩個電子的配位鍵合或配價鍵合。優選較弱的相互作用，例如離解常數高於約10-6M。已知的合適的識別單元有多種，優選包括硼酸、硼酸根離子、亞砷酸、亞砷酸根離子、碲酸、碲酸根離子、鍺酸、鍺酸根離子等等，已知所述這些可用於識別鄰位二醇如葡萄糖及其他碳水化合物。當待分析物是葡萄糖時，硼酸是最優選的識別單元。
在指示系統包括配位體單元的實施方案中，這樣的單元應當能夠與識別單元相互作用，並且根據目標待分析物的動態範圍進行設計。在上述指導原則下，配位體單元的選擇將取決於待分析物和識別單元。在優選的實施方案中，當待分析物是鄰位二醇如葡萄糖，並且識別單元是硼酸時，配位體單元優選是能夠以可逆方式與識別單元成鍵的分子片斷(如酯鍵)。上述配位體單元包括芳族二醇(例如兒茶酚)、乳酸鹽、α-羥酸、酒石酸、蘋果酸、二乙醇胺、β-氨基醇、葡萄糖、多羥基化合物以及含鄰位羥基的化合物，所述這些物質可以是取代或未取代的。在另一實施方案中，配位體單元還可以是檢測系統的一部分。例如，配位體單元還能夠調控與指示系統締合的螢光基團的螢光。當配位體單元與識別單元相互作用時，它將處於例如可以有效地猝滅螢光基團的構型。當配位體單元被待分析物從識別單元上取代下來時，配位體不再是猝滅螢光基團的構型(參見實施例6)。在另一實施方案中，確實還可以有相反的情況(當與識別單元相互作用時猝滅劑不能與螢光基團相互作用)。
使用中，本發明的指示系統優選處於在此所述結構狀態的動態平衡之中。更優選的是，存在較弱的結合和高速的相互作用，使得在游離的待分析物存在下能夠實現更快的平衡。因此，使用本發明能夠在很寬的條件範圍內對待分析物進行實時檢測，尤其是檢測待分析物的濃度波動。通常，在實施此處所述的方法時，本發明不需要使用大的溫度改變。也就是說，本發明的方法基本上可以在環境溫度下進行，這意味著正常情況下發現待分析物試樣的溫度。很清楚，環境溫度將根據待分析物及其環境而大大地改變。例如，環境溫度可以包括室溫或更冷的；對於許多活體內的應用可以高達約45℃；而對於例如某些發酵應用可以高達約80℃或更高。
本發明的指示系統包括檢測系統，當指示系統暴露於待分析物中時，該檢測系統具有以濃度-依賴的方式改變的可檢測特性。檢測系統優選包含給體/受體系統，它指的是通過相互作用來提供信號的一對不同的基團，其中基團之間距離的改變將改變信號的特性。優選的是，所述信號是電磁或電化學信號(例如，當緊密接近時提供不同電化學勢的電荷轉移對)。
已知的上述性質/系統有許多種，並且可以用於本發明。例如，指示系統可以包括發光的(螢光的或磷光性的)或化學發光的標記，基於吸光率的標記等等，當指示系統經歷結構改變時，所述標記的檢測特性將發生改變。檢測系統可以包含給體部分和受體部分，各自有一定間距，以便在指示系統與待分析物相互作用時有可檢測的改變。
檢測特性可以是可檢測的光譜改變，如螢光衰減時間的改變(通過時域或頻域測量確定)，螢光強度的改變，螢光各向異性或偏振的改變；發射光譜的光譜移動；時間-分辨的各向異性衰減的改變(通過時域或頻域測量確定)，吸收光譜的改變，等等。
檢測系統可以包含螢光基團和能夠猝滅螢光基團的螢光的分子片斷。在該實施方案中，指示系統可以兩種方式構成。首先，它可以這樣構成，以致使在沒有待分析物時，螢光基團和猝滅劑彼此距離很近，結果有效地猝滅了螢光的發射。在與待分析物相互作用時，指示系統的構型發生改變，導致足以使螢光基團去猝滅(dequenching)的螢光基團/猝滅劑的分離。另外，指示系統可以這樣構成，以致使在沒有待分析物時，螢光基團和猝滅劑彼此距離很遠，此時螢光基團能夠發射螢光。在與待分析物相互作用時，指示系統的構型發生改變，並且使螢光基團/猝滅劑足夠接近，從而將螢光基團猝滅。在本發明中使用的螢光基團/猝滅劑對包括如下情形所述螢光基團/猝滅劑對的雙方是相同或不同螢光體，但是當指示系統處於猝滅構型時，如通過接近效應、能量轉移等等，一個螢光基團將影響另一個的螢光。
已知的螢光基團/猝滅劑對有許多，並且是本發明也設計了多個螢光基團/猝滅劑對。例如，已知的是，DABCYL將有效地猝滅許多螢光體，如香豆素、EDANS、螢光素、螢光黃、BODIPYTMEosine、四甲基鹼性蕊香紅、Texas RedTM等等。
應該理解的是從螢光基團發射的螢光可以通過多種機理來猝滅。一種是通過螢光基團和猝滅劑之間光致電子轉移而猝滅(參見Acc.Chem.Res.1994，27，302-308，在此將其引入作為參考)。猝滅還可以通過由重原子作用所引起的系間躍遷或者通過與順磁性金屬離子的相互作用而進行，其中猝滅劑可以包含重原子如碘或順磁性金屬離子如Cu+2(參見例如J.Am.Chem.Soc.1985，107，7783-7784，和J.Chem.Soc.Faraday Trans.，1992，88，2129-2137，兩者均引入作為參考)。
猝滅還可以通過在螢光基團和猝滅劑之間形成基態配合物而發生，如Nature Biotechnology，1998，16，49-53(在此引入作為參考)中所述。另一猝滅機理涉及例如在Meas.Sci.Technol.10(1999)127-136和JACS2000，122，10466-10467(在此引入作為參考)中描述的螢光共振能量傳遞(FRET)。
對本發明的檢測系統有用的另一類分子片斷包括吸收光譜隨分子構型改變而發生改變的那些分子片斷，包括Alizarin Red-S，等等。
適合本發明用的指示系統包括具有下列結構之一的物質的組合物 或
R1-D1-L1-Z-L2-D2-R2或D1-R1-L1-Z-L2-R2-D2式中-R1是針對所述待分析物的一個或多個識別單元；-R2是i)針對所述待分析物的一個或多個識別單元，或ii)可有可無的被標記的配位體單元；-D1和D2一起包含檢測系統，檢測系統包含能量給體/受體系統，當所述指示劑分子與待分析物相互作用時，該檢測系統具有以濃度-依賴方式改變的檢測特性；或者當R2是被標記的配位體單元時，D1和D2可以不存在；-L1和L2相同或不同，並且其所包含的連接基團的長度和結構足以使相互作用和可檢測特性的變化能夠發生；和Z是在L1和L2之間的共價鍵或非-共價鍵。
業已描述了識別單元、配位體單元和檢測系統。連接基團L1和L2具有足以使所述相互作用和改變能夠發生的長度和結構。公認的是，連接基團的準確性質將取決於指示系統其它單元的結構。可以就結構剛度、分子距離、電荷相互作用等對連接劑進行設計，如實施例所示，這可用來使得可逆待分析物檢測系統的相互作用最佳化。本發明指示系統的Z組分優選是在L1和L2之間的共價鍵。指示系統可以呈單分子或大分子的形式。
L1和L2可以採取多種的形式。例如，合適的連接基團包括烷基、芳基、聚醯胺、聚醚、聚氨基、聚酯及其組合，所述這些基團是取代或未取代的。
本發明的指示系統，如果可溶的話，可以根據需要直接在溶液中使用。另一方面，如果需要的話，指示系統可以固定(如通過機械夾帶或共價的或離子的連接)至如玻璃、塑料、聚合材料等不溶表面或基體上或其內部。當指示系統夾帶在例如聚合物內部時，負載材料優選對於待分析物是可充分滲透的，以便在待分析物和指示系統之間提供合適的相互作用。
如果指示系統微溶於水或不溶於水，可是仍希望在水介質中進行檢測的話，可以使指示系統與親水單體共聚合，從而形成如共同待批美國申請09/632,624(2000年8月4日申請)所述的親水大分子，在此將其引入作為參考。
可以理解的是本發明的指示系統在化學上可以採取許多形式。例如，整個指示系統可以是一個尺寸較小的分子。或者，指示系統的個別組分可以是大分子的一部分。在後一情況下，系統的各組分可以摻入相同的聚合物中，或者能夠與單獨交聯的聚合物締合。例如，包含螢光基團/配位體單元加合物和猝滅劑/識別單元加合物的單獨的單體可以共聚合而形成指示系統聚合物(參見實施例5)。另外，可以單獨地使單體聚合形成單獨的聚合物鏈，然後再交聯而形成指示系統。
本發明的指示系統有著許多應用，包括在能源、醫藥和農業方面用作指示劑。例如，指示系統能夠作為指示劑分子用於檢測血液或尿中微量或超微量葡萄糖的檢測，因此，對於診斷或監護如糖尿病和腎上腺機能不全這樣的疾病提供重要情報。具有兩個識別單元的本發明指示系統尤其可用於檢測溶液中的葡萄糖，其中還可以潛在地包含幹擾量的α-羥酸或β-二酮(參見共同待批申請09/754,217(2001年1月5日申請)；60/329,746(2001年10月18日申請)；和60/269,887(2001年2月21日申請)，發明名稱為「對含有α-羥酸或β-二酮的溶液中葡萄糖的檢測」，在此將其引入作為參考)。用於醫療衛生方面的醫用/藥用葡萄糖的生產需要監控。
本發明在農業方面的應用包括檢測待分析物如葡萄糖，在大豆及其他農產品中的含量。對於如歐洲葡萄這樣的高價值產品，在作出收穫決策前，必須對葡萄糖進行仔細地監測。由於葡萄糖是發酵過程中最為昂貴的碳源和原料，因此，在烈性酒生產中，為了使反應器進料速率控制最優化，對葡萄糖的監控是十分重要的。在軟飲料和酒精飲料生產期間，反應劑的混合和葡萄糖濃度的控制對於質量控制也是至關重要的，從全球來看，絕大部分的葡萄糖和可發酵糖(順式-二醇)被用於上述生產。
當將螢光指示劑取代基結合到檢測系統中時，本發明的系統可用於已知的各種檢測技術。例如，本發明的系統可以用於螢光感受設備(例如美國專利5 517 313)或能夠結合至聚合材料上，如用於肉眼檢查的試紙上。後一技術，例如使得葡萄糖的測量類似於用石蕊試紙條測量pH。在此所述的系統還可以作為簡單的試劑與標準的小型(benchtop)分析測試設備如由Shimadzu、Hitachi、Jasco、Beckman等製造的螢光分光計或臨床分析儀一起使用。這些分子還將待分析物特定的化學/光學信號通過轉換提供給如由Ocean Optics(Dunedin，Florida)或OrielOptics製造的基於光學纖維的傳感器和分析螢光計。
在此引入作為參考的美國專利5 517 313描述了可使用本發明的系統的螢光傳感設備，其可用來測定待分析物如液體培養基中的葡萄糖或其他順式-二醇化合物的存在或濃度。該傳感設備包括包含成層排列的螢光指示系統的基體(下面稱之為「螢光基體」)、高通量過濾器和光檢測器。在該裝置中，光源，優選發光二極體(「LED」)，至少部分地位於指示劑材料內，或者指示劑基體下面的波導管中，以便來自光源的入射光使指示系統發螢光。高通量過濾器使發射光能夠到達光檢測器，同時能夠從光源中過濾掉分散的入射光。
使用不均勻存在的待分析物，如葡萄糖或其他順式-二醇化合物，對美國專利5 517 313中描述的裝置中使用的指示劑分子的螢光進行調控，例如減弱或增強。
在美國專利5 517 313中描述的傳感器中，包含指示劑的材料能夠滲透待分析物。因此，待分析物可從周圍的試驗介質擴散入該材料中，由此影響由指示系統發射的螢光。通過對光源、包含指示系統的材料、高通量過濾器和光檢測器的設置，使指示系統發射的至少一部分螢光射向光檢測器，從而產生電信號，該信號就是周圍介質中待分析物(例如葡萄糖)濃度的指示。
根據利用本發明指示系統的其他可能的實施方案，傳感設備還描述於美國專利5 910 661、5 917 605和5 894 351中，在此將其引入作為參考。
本發明的系統還可用於植入裝置中，例如連續地監測體內的待分析物(如血糖量)。合適的裝置描述於例如，共同待批專利申請美國專利09/383 148(1999年8月26日申請)，以及美國專利5 833 603，6 002954，和6 011 984中，在此將其引入作為參考。
利用已知的反應機理和試劑，包括與如下所述常用步驟一致的反應機理，無需過度的試驗，本領域熟練技術人員將能夠製備本發明的系統。
實施例1 nBuF-二甲苯-Q二-硼酸酯nBuF-二甲苯-Q二-硼酸酯nBuF-二甲苯-Q二-硼酸酯N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羥硼基)苄基]-氨基己基]-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-丁基氨基-1，8-萘醯亞胺(nBuF-hexa-Qbis-boronate)。
在葡萄糖研究中使用的游離二硼酸產物是通過將N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨基己基]-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨乙基-4-丁基氨基-1，8-萘醯亞胺溶解於MeOH/PBS緩衝體系中而得到的。
N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-溴-1，8-萘醯亞胺在45℃，將4-溴-1，8-萘二甲酸酐(10.0克，36.1毫摩爾)和氨基乙醛二乙基乙縮醛(4.81克，5.26毫升，36.1毫摩爾，1克當量)在45毫升EtOH中的懸浮液攪拌3天。然後過濾得到的懸浮液，用EtOH進行洗滌，並對殘餘物進行乾燥，得到13.3克(94％)淺棕色固態產物。
TLCMerck矽膠60板，Rf 0.17(98/2 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)觀察。
HPLCHP 1100HPLC色譜儀，水5×100mm NovaPak HR C18柱，注入0.050毫升，0.75毫升/分鐘，1.5毫升注入迴路，檢測波長360nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，10-80％B18分鐘，80-100％B2分鐘，100％B2分鐘，停留時間24.2分鐘。
N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺在45℃下，將N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-溴-1，8-萘醯亞胺(0.797克，2.03毫摩爾)和正丁基氨(1.48克，2.00毫升，20.2毫摩爾，9.96克當量)在8毫升NMP中的溶液加熱66小時。這時，將得到的懸浮液冷卻至25℃，繼之以過濾。用50毫升乙醚溶解殘餘物並利用3×50毫升的水進行萃取。在無水硫酸鈉上對有機萃取物進行乾燥，過濾並濃縮，以便得到粗的黃色粉末。通過矽膠色譜法(25克重力級凝膠，0-1％CH3OH/CH2Cl2)對該原料進行提純，從而得到0.639克(82％)的黃色粉末。
TLCMerck矽膠60板，Rf 0.71(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)觀察。
HPLCHP 1100HPLC色譜儀，水5×100mm NovaPak HR C18柱，注入0.050毫升，0.75毫升/分鐘，1.5毫升注入迴路，檢測波長450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，10-80％B18分鐘，80-100％B2分鐘，100％B2分鐘，停留時間23.5分鐘。
N-(2-氧乙基)-4-丁基溴-1，8-萘醯亞胺在25℃，將N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-丁基溴-1，8萘醯亞胺(0.622克，1.62毫摩爾)和對-甲苯磺酸單水合物(0.010克，0.053毫摩爾，0.032克當量)在25毫升丙酮中的溶液攪拌18小時。這時，對該溶液進行濃縮並通過矽膠色譜法(25克重力級凝膠，0-1％CH3OH/CH2Cl2)對殘餘物進行提純，從而得到0.47克(94％)的橙色固體。
TLCMerck矽膠60板，Rf 0.61(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)觀察。
1H NMR(400MHz，CDCl3)；δ1.03(t，3H，J＝7.3Hz)，1.53(m，2H)，1.78(m，2H)，3.38(t，2H，J＝7.2Hz)，5.02(s，2H)，6.64(d，1H，J＝8.6Hz)，7.52(dd，1H，J＝7.4，8.3Hz)，8.08(dd，1H，J＝1Hz，8.5Hz)，8.38(d，1H，J＝8.3Hz)，8.46(dd，1H，J＝1.0，7.3Hz)，9.75(s，1H).
HPLCHP 1100HPLC色譜儀，水5×100mm NovaPak HR C18柱，注入0.050毫升，0.75毫升/分鐘，1.5毫升注入迴路，檢測波長450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，10-80％B18分鐘，80-100％B2分鐘，100％B2分鐘，停留時間19.6分鐘。
N-(4-二甲氨基苄基)-1，6-二氨基己烷在25℃下，在黑暗中，在氮氣氣氛下，將4-二甲氨基苯甲醛(1.00克，6.70毫摩爾)，硫酸鈉(6.7克，47.2毫摩爾，7.04克當量)和1，6-二氨基己烷(3.89克，33.5毫摩爾，5.00克當量)在20毫升無水EtOH中的懸浮液攪拌18小時。這時，對溶液進行過濾並將NaBH4(1.73克，45.8毫摩爾，6.84克當量)添加至濾液中。在25℃下將懸浮液攪拌5小時。這時，將反應混合物濃縮，並將殘餘物溶解於50毫升水中，再用3×50毫升乙醚進行萃取。用2×50毫升水對混合的有機萃取物進行洗滌。用2×50毫升乙醚對混合的含水提取物進行萃取。在無水硫酸鈉上對混合的有機萃取物進行乾燥，過濾並濃縮，以便得到粘性油(1.35克(81％))。
TLCMerck矽膠60板，Rf0.58(80/15/5 CH2Cl2/CH3OH/iPrNH2)，利用茚三酮著色劑、UV(254/366)觀察。
HPLCHP 1100HPLC色譜儀，水5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分鐘，1.5毫升注入迴路，檢測波長280nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，10-80％B18分鐘，80-100％B2分鐘，100％B2分鐘，停留時間13.3分鐘。
N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)氨己基]氨乙基)-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺。
向N-(2-氧乙基)-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺(0.346克，1.11毫摩爾)在25毫升無水甲醇中的懸浮液中添加N-(4-二甲氨基苄基)1，6-二氨基己烷(0.554克，2.22毫摩爾，2.00克當量)和乙酸(0.067克，1.11毫摩爾，1.0克當量)在20毫升無水甲醇中的溶液。向該混合物中添加NaCNBH3(0.070克，1，1毫摩爾，1.0克當量)在5毫升無水甲醇中的溶液。在25℃將反應混合物攪拌15小時。這時，通過旋轉蒸發除去甲醇，並將殘餘物溶解於30毫升水中。利用1N的HCl將溶液的pH調節至2，然後在25℃攪拌1小時。這時，利用1N的NaOH將溶液的pH調節至12，然後用3×50毫升CH2Cl2進行萃取。用3×50毫升水對混合的有機萃取物進行洗滌，在無水硫酸鈉上進行乾燥，過濾並濃縮，以便得到粗製的棕色油。通過矽膠色譜法(35克閃蒸級凝膠，0-50％CH3OH/CH2Cl2，然後45/50/5CH3OH/CH2Cl2/iPrNH2)對該原料進行提純，從而得到0.190克(32％)二胺產物。
FAB MS對於C33H45N5O2，計算值[M]+554；測量值[M]+554。
TLCMerck矽膠60板，Rf 0.42(80/20CH2Cl2/CH3OH)，利用茚三酮著色劑和UV(254/366)觀察。
HPLCHP 1100HPLC色譜儀，水5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分鐘，1.5毫升注入迴路，檢測波長450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，10-80％B18分鐘，80-100％B2分鐘，100％B2分鐘，停留時間17.6分鐘。
N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨基己基]-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺。
向N-2-[5-(N-4-二甲氨基-苄基)氨己烷]氨乙基)-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺(0.150克，0.276毫摩爾)和DIEA(0.355克，0.478毫升，2.81毫摩爾，10.0克當量)在5毫升三氯甲烷中的溶液中添加(2-溴乙基苯基)硼酸新戊基酯(0.390克，1.38毫摩爾，5.00克當量)在2毫升CHCl3中的溶液。然後，在25℃對該溶液攪拌27小時。這時，對該混合物進行濃縮並通過氧化鋁柱色譜法(100克激活的中性氧化鋁，0-5％CH3OH/CH2Cl2)對殘餘物進行提純，從而得到0.024克(19％)的粘性棕色油。
FAB MS(甘油基體)對於C53H67B2N5O8，計算值為[M]+924(二甘油加合物替代硼酸的二新戊基酯)；測量值為[M]+924
TLCMerck中性氧化鋁板，Rf0.62(80/20CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)觀察。
HPLCHP 1100HPLC色譜儀，水5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分鐘，1.5毫升注入迴路，檢測波長450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，10-80％B18分鐘，80-100％B2分鐘，100％B2分鐘，停留時間20.7分鐘。
nBuF-二甲苯-Q二-硼酸酯 N-2-[4-(N-4-二甲氨基苄基)-[2-(二羥硼基)苄基]氨基-甲基]苄基-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺(nBuF-二甲苯-Q二-硼酸酯)將1-[N-(4-二甲氨基苄基)氨基]甲基-4-氨甲基苯用作二胺偶聯配偶，採用類似於N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羥硼基)苄基]-氨己基]-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺(nBuF-hexa-Q-二硼酸酯)的方式，製備所述化合物。
對比指示劑分子NBuF單-硼酸酯
N-2-(羧甲基)-2-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺(nBuF單-硼酸酯) N-2-(叔丁氧基羰基)氨乙基-4-溴-1，8-萘醯亞胺在45℃，將4-溴-1，8-萘二甲酸酐(1.00克，3.61毫摩爾)和N-(叔-丁氧基羰基)-1，2-二氨基乙烷(0.578克，3.61毫摩爾，1.00克當量)在20毫升EtOH中的懸浮液攪拌2小時。這時，在15分鐘內將溫度升至150℃。隨後，使反應混合物冷卻至25℃並再攪拌15小時。在這時候，將得到的懸浮液過濾，用EtOH進行洗滌，並對殘餘物進行乾燥，得到1.03克(68％)淺棕色固態產物。
TLCMerck矽膠60板，Rf0.63(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)觀察。
N-2-(叔-丁氧基羰基)氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺在45℃下，將N-(叔-丁氧基羰基)氨乙基-4-溴-1，8-萘醯亞胺(0.900克，2.15毫摩爾)和正-丁基氨(0.786克，1.06毫升，10.7毫摩爾，5.01克當量)在5毫升NMP中的溶液加熱17小時。在這時候，添加第二份正-丁胺(0.786克，1.06毫升，10.7毫摩爾，5.01克當量)。在25℃對得到的溶液攪拌23小時。這時，在真空下對混合物進行濃縮。通過矽膠色譜法(50克重力級凝膠，0％，然後4％CH3OH/CH2Cl2分段梯度)對殘餘物進行提純，從而得到0.97克含殘餘NMP的粘性黃色固體。照現在的樣子，對該材料繼續進行試驗。
FAB MS對於C23H29N3O4，計算值為[M]+411；測量值為[M]+411。
TLCMerck矽膠60板，Rf 0.60(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)觀察。
N-2-氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺單三氟乙酸鹽在25℃，將N-2-(叔-丁氧基羰基)氨乙基-4-溴-1，8-萘醯亞胺(0.92克，2.24毫摩爾)在20毫升20％三氟乙酸/CH2Cl2中的溶液攪拌19小時。這時，在氮氣流下對反應混合物進行濃縮。利用醚對殘餘物進行粉碎，並將得到的固體在真空中乾燥，以得到0.772克(81％)橙色粉末。
FAB MS對於C18H21N3O2，計算值為[M]+311；測量值為[M]+312。
HPLCHP 1100HPLC色譜儀，Vydac 201TP 10×250mm柱，0.100毫升注入，2毫升/分鐘，檢測波長450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分鐘，在18分鐘內10-80％B，在2分鐘內80-100％B，100％B2分鐘，停留時間19.5分鐘。
N-2-[(叔-丁氧基羰基)甲基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺在25℃，將N-2-氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺單三氟乙酸鹽(0.99克，0.23毫摩爾)，DIEA(0.167克，0.225毫升，1.29毫摩爾，5.55克當量)和溴乙酸叔-丁酯(0.032克，0.024毫升，0.16毫摩爾，0.70克當量)在2.5毫升CH2Cl2中的溶液攪拌23小時。在這時候，添加25毫升CH2Cl2，用1×25毫升飽和的NaHCO3對該溶液進行洗滌，在無水Na2SO4上對有機萃取物進行乾燥，過濾並濃縮。通過矽膠色譜法(15克重力級凝膠，0％-4％CH3OH/CH2Cl2)對殘餘物進行提純，從而得到0.051克(73％)黃色玻璃狀固體。
TLCMerck矽膠60板，Rf 0.27(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)觀察 N-2-[(叔-丁氧基羰基)甲基]-2-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺在25℃，將N-2-[(叔-丁氧基羰基)甲基]-氨乙基-4-丁氨基-1，8萘醯亞胺(0.051克，0.12毫摩爾)，DIEA(0.78克，0.11毫升，0.60毫摩爾，5.0克當量)和(2-溴甲苯基)硼酸新戊基酯(0.083克，0.29毫摩爾，2.4克當量)在10毫升CH2Cl2中的溶液攪拌72小時。這時，對該混合物進行濃縮並通過矽膠色譜法(10克重力級凝膠，0-1％CH3OH/CH2Cl2)進行提純，從而得到0.035克(47％)玻璃狀的橙色固體。照現在的樣子，對該產物繼續進行試驗。
TLCMerck矽膠60板，Rf 0.39(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)觀察。

N-2-(羧甲基)-2-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺(nBuF單-硼酸酯)在25℃，將N-2-[(叔-丁氧基羰基)-甲基]-2-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺(0.035克，0.056毫摩爾)在5毫升20％TFA/CH2Cl2中的溶液攪拌16小時。在這時候，在氮氣流下對該溶液濃縮，並用乙醚對殘餘物進行粉碎，以便得到橙色固體。通過矽膠色譜法(8克重力級凝膠，0-5％CH3OH/CH2Cl2)對該原料進行提純，從而得到0.011克(39％)的黃色/橙色固體。
FAB MS對於C30H34BN3O7，計算值為[M]+559(單甘油加合物)；測量值為[M]+560。
TLCMerck矽膠60板，Rf 0.26(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)觀察。
螢光的調控確定了葡萄糖對本實施例中製備的三種化合物的螢光的調控。
圖1示出了nBuF-hexa-Q二硼酸酯(「hexa-Q」)指示劑(0.015mM)，nBuF-二甲苯-Q二-硼酸酯(「二甲苯Q」)指示劑(0.049mM)和nBuF單-硼酸酯對比指示劑(0.029mM)在包含0-20mM葡萄糖的70/30MeOH/PBS溶液中的標準化的螢光發射(I/Io，在535nm)。利用Shimadzu RF-5301光譜螢光計記錄光譜，其中激勵在450nm；激勵縫隙1.5nm；發射縫隙1.5nm；環境溫度。誤差線是每個數據點三重值的標準偏差。
數據表明nBuF單-硼酸酯指示劑化合物的螢光不受葡萄糖的存在的影響。NBuF-二甲苯-Q二硼酸酯指示劑化合物的螢光或多或少地受葡萄糖的影響，而nBuF-hexa-Q二-硼酸酯指示劑化合物的螢光在0-5mM的範圍內大大地受葡萄糖的影響。據信，在沒有葡萄糖的情況下，在hexa-Q化合物中相對柔韌的六亞甲基連接使得N-4-二甲氨基苄基猝滅基團能夠充分地接近萘醯亞胺螢光基團，從而有效地猝滅後者的螢光。在有葡萄糖的情況下，兩個硼酸識別單元將參與葡萄糖連接，因此將改變指示劑的分子構型，並使螢光基團和猝滅基團充分地分離，以便使螢光發射去猝滅(dequenched)。對於二甲苯-Q化合物可以看到同樣的作用，但由於二甲苯連接劑不太柔韌，因此其作用程度要小得多，因此，在葡萄糖連接時，螢光基團和猝滅基團之間只允許有較小的分離。
對比化合物包含螢光基團但是沒有猝滅基團。對比化合物在沒有葡萄糖的情況下發射螢光，當添加葡萄糖時其螢光不受影響。
實施例2 氨基乙氧基F-hexa-C二-硼酸酯 氨基乙氧基F-hexa-C二-硼酸酯
N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羥硼基)苄基]-氨基己基]-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙基]氨基-1，8-萘醯亞胺(氨基乙氧基F-hexa-Q二-硼酸酯)藉助下列改進，用類似於N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羥硼基)苄基]-氨基己基]-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-丁基氨基-1，8-萘醯亞胺(nBuF-hexa-Qbis-boronate)的方式製備該化合物。直至二胺中間物的二苄基硼化作用完成之後，才將1，8-萘醯亞胺部分的4-溴位置置換成2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙基)氨基基團。在與合成N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-丁氨基-1，8萘醯亞胺中添加丁胺相同的條件下，通過添加2，2′-(乙二氧基)二(乙胺)而進行該最終步驟。
氨基乙氧基F-hexa-C二-硼酸酯 N-2-[5-苄基-5-[2-(二羥硼基)苄基]氨基己基]-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙基]氨基-1，8-萘醯亞胺(aminoethoxyF-hexa-C bis-boronate)將N-苄基-1，6-二氨基己烷用作二胺偶聯的配偶，用類似於N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羥硼基)苄基]-氨基己基]-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙基]氨基-1，8-萘醯亞胺(氨基乙氧基F-hexa-Qbis-boronate)的方式製備該化合物。
螢光的調控確定了葡萄糖對本實施例中製備的三種化合物的螢光的調控。圖2示出了氨基乙氧基F-hexa-Q二-硼酸酯指示劑(0.197mM)和氨基乙氧基F-hexa-C-二硼酸酯對比指示劑在包含0-20mM葡萄糖的70/30MeOH/PBS溶液中的標準化的螢光發射(I/Io在535nm)。利用ShimadzuRF-5301光譜螢光計記錄光譜，其中激勵在450nm；激勵縫隙1.5nm；發射縫隙1.5nm；環境溫度。誤差線是每個數據點二重值的標準偏差。
數據表明hexa-C指示劑化合物的螢光不受葡萄糖存在的影響，而hexa-Q指示劑化合物的螢光在0-10mM範圍內大大地受葡萄糖的影響。據信，在沒有葡萄糖的情況下，在hexa-Q化合物中相對柔韌的六亞甲基連接使得N-4-二甲氨基苄基猝滅基團能夠充分地接近萘醯亞胺螢光基團，從而有效地猝滅後者的螢光。在有葡萄糖的情況下，兩個硼酸識別單元將參與葡萄糖連接，因此將改變指示劑的分子構型，並使螢光基團和猝滅基團充分地分離，以便使螢光發射去猝滅(dequenched)。
hexa-C化合物與hexa-Q化合物是同等的，但缺少有效猝滅萘醯亞胺螢光基團所需的二甲氨基基團。在沒有葡萄糖的情況下，hexa-C化合物發射螢光，當添加葡萄糖時其螢光不受影響。
下列實施例3-5闡明了葡萄糖檢測方法，其中指示系統包含硼酸識別單元和兒茶酚配位體單元。該方法的一般原理由下式闡明
其中·給體是螢光基團，而受體是螢光基團或猝滅基團；·對給體和受體進行選擇，以便根據分子距離將來自給體的能量傳遞至受體；·L1、L2、L3和L4各自獨立地是具有約3-20個連接原子的化學連接基，並且包含但不限於下列取代或/和非-取代的基團(脂族基團、芳族基團、氨基、醯胺基、磺基、羰基、酮、氨磺醯基等等)；·R是包含一個或兩個苯基硼酸基團的葡萄糖識別單元；·RR是能夠與R的苯基硼酸衍生物形成可逆酯鍵的化學基團，例如，芳族二醇(例如兒茶酚)、乳酸鹽、α-羥酸、酒石酸、蘋果酸、葡萄糖、二乙醇胺、聚羥基鄰位二醇(所有這些物質可以是取代或未取代的)，等等；·L3-6和P1-2是可有可無的基團，並且可以獨立地存在；·如連接基團L1-4所定義的那樣，L5和L6是連接基團，或者是由例如丙烯醯胺、丙烯酸酯、聚乙二醇或其它親水聚合物組成的聚合物鏈；和·P1和P2是親水的或憎水的聚合物。
當R和RR能夠在自由溶液中相互作用時，或者當適當地固定至親水聚合物上時，給體和受體將彼此充分接近，以便能量能夠相對有效地從給體轉移至受體(例如，通過FRET、碰撞能量轉移等等)。當葡萄糖添加至所述溶液中時，它將與RR競爭與R(硼酸酯)的連接，從而使RR-R＝RR+R的平衡向右移動。當游離於溶液中時或利用相對長且柔韌的連接劑固定至聚合物上時，R-給體和RR-受體部分能夠彼此移開，並降低給體和受體之間的能量轉移效率，從而使螢光發射增加。
實施例3在N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸(猝滅劑-硼酸加合物)存在下，葡萄糖對磷酸鹽緩衝鹽水中N-(5-甲氧羰基-5-[3，4-二羥基苯甲醯氨基]戊基)-N′-(5-螢光素基)硫脲(螢光素-兒茶酚加合物)螢光發射的作用。
螢光素-兒茶酚加合物猝滅劑-硼酸加合物 N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-εt-B0C-賴氨酸甲酯將3，4-二羥基苯甲酸(820毫克，5.3毫摩爾)和N-ε-t-BOC-賴氨酸甲酯(1.38克，5.31毫摩爾)溶解於50毫升EtOAc/THF(1/1，無水的)中。將二環己基碳二亞胺(1.24克，6毫摩爾)添加至該溶液中。對反應混合物攪拌24小時，過濾，並蒸發掉溶劑。將獲得的固體溶解於EtOAc(50毫升)中並用磷酸鹽緩衝液(200mM，pH＝6.5)2×50毫升進行萃取。用鹽水對乙酸乙酯溶液進行洗滌，分離，用Na2SO4乾燥，和蒸發，得到1.89克的固體(90％收率)。通過TLC提純該化合物並用於下一步。
N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-賴氨酸甲酯三氟醋酸鹽將N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-t-BOC-賴氨酸甲酯(840毫克，2.12毫摩爾)與10毫升的CH2Cl2，3毫升的三氟乙酸，和1毫升的三異丙基矽烷混合。在室溫攪拌過夜之後，對該溶液進行蒸發，用乙醚對得到的殘餘物進行洗滌，並在真空下進行乾燥，得到808毫克(93％)。
HPLCHP 1100高壓液相色譜儀，水5×100毫米NovaPak HR C18柱，0.100毫升注入，0.75毫升/分鐘，2毫升注入迴路，檢測波長370nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，在18分鐘內10-80％B，在2分鐘內80-100％B，100％B2分鐘，停留時間10.78分鐘。
N-(5-甲氧羰基-5-[3，4-二羥基苯甲醯氨基]戊基)-N』-(5-螢光素基)硫脲將N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-賴氨酸甲酯三氟醋酸鹽(60毫克，0.146毫摩爾)，異硫氰酸螢光素(50毫克，0.128毫摩爾)，和二異丙基乙胺(129毫克，1毫摩爾)與1毫升無水DMF混合。對反應混合物攪拌5小時，然後蒸發掉溶劑。採用二氧化矽(10克)色譜法提純，其中使用CH2Cl2/MeOH(80/20體積)作為洗脫液。分離出產物-68毫克，(77％產率)。
FAB MS對於C35H31N3O10S，計算值為M＝685；測量值為M+1＝686。
HPLCHP 1100高壓液相色譜儀，水5×100毫米NovaPak HR C18柱，0.100毫升注入，0.75毫升/分鐘，2毫升注入迴路，檢測波長370nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，在18分鐘內10-80％B，在2分鐘內80-100％B，100％B2分鐘，停留時間16.59分鐘。
N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基)-N-ε-t-BOC-賴氨酸甲酯將(3-羧基-5-硝基苯基)硼酸(536毫克，2.54毫摩爾)，N-ε-t-BOC-賴氨酸甲酯氫氯化物(776毫克，2.61毫摩爾)，和二苯基磷醯基疊氮化物(718毫克，2.6毫摩爾)與5毫升無水DMF混合。將二異丙基乙胺(1.3毫升，7.5毫摩爾)添加至DMF溶液中。然後，在室溫對該溶液攪拌24小時。在真空下蒸發掉DMF，將殘餘物溶解於50毫升的EtOAc中，並用H2O(3×50毫升)對EtOAc溶液進行萃取。用鹽水萃取之後，分離有機相，用Na2SO4乾燥，並蒸發掉溶劑，得到880毫克的產物(76％收率)。照現在的樣子，對該產物繼續進行試驗。
HPLCHP 1100HPLC色譜儀，水5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分鐘，1.5毫升注入迴路，檢測波長450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，10-80％B18分鐘，80-100％B2分鐘，100％B2分鐘，停留時間17.87分鐘。
N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-賴氨酸甲酯三氟醋酸鹽將N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-t-BOC-賴氨酸甲酯(800毫克，1.76毫摩爾)與10毫升的CH2Cl2，3毫升的三氟乙酸，和1毫升的三異丙基矽烷混合。在室溫下攪拌過夜之後，對該溶液進行蒸發，用乙醚對得到的殘餘物進行洗滌，並在真空下進行乾燥。得到715毫克(87％)。照現在的樣子，對該產物繼續進行試驗。
N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸甲酯。
在黑暗中，25℃下將N-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-賴氨酸甲酯三氟醋酸鹽(0.198克，0.42毫摩爾)，DIEA(0.167克，0.225毫升，1.29毫摩爾，3.05克當量)，4-二甲氨基-3，5-二硝基苯甲酸(0.120克，0.47毫摩爾，1.11克當量)和二苯基磷醯基疊氮化物(0.130克，0.47毫摩爾，1.11克當量)在3毫升DMF中的溶液攪拌23小時。在這時候，添加50毫升EtOAc，並在100mM磷酸鹽緩衝液(pH6.5)(2×20毫升)中洗滌，然後1×25毫升NaCl(飽和水溶液)對該溶液進行洗滌。在無水硫酸鈉上對有機萃取物進行乾燥，過濾並濃縮，以便得到粗的橙色固體。通過矽膠柱色譜法(10克重力級凝膠，0-5％CH3OH/CH2Cl2)對該殘餘物進行提純，從而得到0.0974克(39％)的黃色/橙色固體。照現在的樣子，對該產物繼續進行試驗。
TLCMerck矽膠60板，Rf 0.60(80/20 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)觀察。
HPLCHP 1100HPLC色譜儀，水5×100mmNovaPak HR C18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分鐘，1.5毫升注入迴路，檢測波長450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，10-80％B18分鐘，80-100％B2分鐘，100％B2分鐘，停留時間18.91分鐘。
N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸。
在25℃，對N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸甲酯(0.095克，0.16毫摩爾)在4毫升的1∶1Na2CO3(0.2M水溶液)∶EtOH中的溶液攪拌1小時，然後在45℃攪拌1.5小時。在這時候，在真空下對該混合物進行濃縮，然後添加25毫升5％TFA/CH2Cl2。用2×10毫升水對該混合物進行洗滌，再將25毫升5％的TFA/CH2Cl2添加至有機層。在無水硫酸鈉上對有機萃取物進行乾燥，過濾並濃縮，以便得到0.088克(95％)橙色粉末。
FAB MS甘油基體；對於C25H29BN6O13(單甘油加合物)，[M]+計算值為632；[M+1]+測量值為633。
HPLCHP 1100HPLC色譜儀，水5×100mmNovaPakHRC18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分鐘，1.5毫升注入迴路，檢測波長450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，10-80％B18分鐘，80-100％B2分鐘，100％B2分鐘，停留時間17.66分鐘。
螢光調控圖3示出了2μM的螢光素-兒茶酚加合物在包含30μM猝滅劑-硼酸加合物的PBS溶液中的螢光發射(在518nm處的I)。葡萄糖的濃度在0-160mM之間改變。利用Shimadzu RF-5301光譜螢光計記錄光譜，其中激勵在495nm；激勵縫隙3nm；發射縫隙5nm；低PMT靈敏度，環境溫度。通過添加葡萄糖猝滅能力將降低。
實施例4在N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸(猝滅劑-硼酸加合物)存在下，葡萄糖對磷酸鹽緩衝鹽水中的N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-(5-二甲氨基萘-1-磺醯)賴氨酸(DANSYL-兒茶酚加合物)的螢光發射的作用。
DANSYL-兒茶酚加合物 猝滅劑-硼酸加合物 N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺醯)-賴氨酸甲酯
將N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-賴氨酸甲酯三氟醋酸鹽(205毫克，0.5毫摩爾，參見實施例3的合成)和丹磺醯氯(162毫克，06毫摩爾)與2毫升無水DMF混合。將二異丙基乙胺(224毫克，1.7毫摩爾)添加至DMF溶液中。在室溫下對該溶液攪拌5小時然後，在真空下蒸發掉DMF。使殘餘物經受矽膠色譜法(CH2Cl2/MeOH，98/2體積)。所得到的產物是黃色固體-240毫克(90％產率)。
FAB MS對於C29H31N3O7S，計算值為M＝529；測量值為M+1＝530。
HPLCHP 1100高壓液相色譜儀，水5×100毫米NovaPak HR C18柱，0.100毫升注入，0.75毫升/分鐘，2毫升注入迴路，檢測波長370nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，在18分鐘內10-80％B，在2分鐘內80-100％B，100％B2分鐘，停留時間15.45分鐘。
N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺醯)-賴氨酸將N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺醯)-賴氨酸甲酯(200毫克，0.38毫摩爾)和250毫克的Na2CO3與10毫升的EtOH/H2O(1/1體積)混合。在55℃對混合物攪拌6小時。在真空下蒸發掉溶劑，並添加1毫升的三氟乙酸，以中和過量的鹼，將50毫升的EtOAc添加至混合物中，並用H2O(2×40毫升)對溶液進行萃取。分離有機相，用無水硫酸鈉進行乾燥，蒸發以便得到190毫克固體(產率97％)。
HPLCHP 1100高壓液相色譜儀，水5×100毫米NovaPak HR C18柱，0.100毫升注入，0.75毫升/分鐘，2毫升注入迴路，檢測波長370nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，在18分鐘內10-80％B，在2分鐘內80-100％B，100％B2分鐘，停留時間14.26分鐘。
N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸 參見用於合成的實施例。
螢光調控圖4示出了在包含120μM猝滅劑-硼酸加合物的PBS中丹磺醯-兒茶酚加合物30μM溶液的螢光發射(在545nm處的I)。葡萄糖的濃度在0-120mM之間改變。利用Shimadzu RF-5301光譜螢光計記錄光譜，其中激勵在350nm；激勵縫隙3nm；發射縫隙5nm；高PMT靈敏度，環境溫度。通過添加葡萄糖猝滅能力將降低。
實施例5葡萄糖對包含N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-(5-二甲氨基萘-1-磺醯)-賴氨酸N-3-(甲基丙烯醯氨基)丙基羧醯胺(丹磺醯-兒茶酚單體)和N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸N-3-(甲基丙烯醯氨基)丙基羧醯胺(猝滅劑-硼酸單體)的丙烯醯胺凝膠螢光發射的作用。
丹磺醯-兒茶酚單體 猝滅劑-硼酸單體
N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺醯)-賴氨酸N-3-(甲基丙烯醯氨基)-丙基羧醯胺將N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-(-(5-二甲氨基-萘-1-磺醯)-賴氨酸(75毫克，0.15毫摩爾；關於合成，參見實施例4)，3-氨基丙基甲基丙烯醯胺鹽酸鹽(30毫克，0.17毫摩爾)，二異丙基乙胺(0.1毫升，0.5毫摩爾)，和2毫升無水DMF混合。1-[3-(二甲氨基)-丙基]-3-乙基碳二亞胺氫氯化物(40毫克，0.2毫摩爾)溶解於2毫升的無水CH2Cl2中。混合DMF和CH2Cl2並在室溫下攪拌20小時。在真空下蒸發掉溶劑，並使殘餘物經受二氧化矽(7克)色譜法，從而生產出18毫克的產物(19％收率)。
FAB MS對於C32H41N5O7S，計算值為M＝640；測量值為M+1＝640。
HPLCHP 1100高壓液相色譜儀，水5×100毫米NovaPak HR C18柱，0.100毫升注入，0.75毫升/分鐘，2毫升注入迴路，檢測波長370nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，在18分鐘內10-80％B，在2分鐘內80-100％B，100％B2分鐘，停留時間14.78分鐘。
N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸N-3-(甲基丙烯醯氨基)丙基-羧醯胺。
在25℃，在黑暗中，將3-氨丙基甲基丙烯醯胺鹽酸鹽(0.013克，0.073毫摩爾，1.2克當量)，DIEA(0.025克，0.034毫升，0.19毫摩爾，3.2克當量)，N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸(0.035克，0.061毫摩爾；對於合成參見實施例3)，二苯基磷醯基疊氮化物(0.019克，0.015毫升，0.069毫摩爾，1.1克當量)和約2毫克BHT在1毫升無水DMF中的溶液攪拌23.5小時。在這時候，添加60毫升EtOAc，並用200mM磷酸鹽緩衝液(pH6.5)(2×20毫升)洗滌，然後1×20毫升NaCl(飽和水溶液)對該溶液進行洗滌。在無水硫酸鈉上對有機萃取物進行乾燥，過濾並濃縮，以便得到橙色固體。用醚對該固體進行粉碎並乾燥，以得到0.028克(65％)的橙色粉末。
FAB MS甘油基體；對於C32H41BN8O13(單甘油加合物)，計算值[M]+756；測量值[M+1]+757。
HPLCHP 1100HPLC色譜儀，水5×100mmNovaPakHRC18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分鐘，1.5毫升注入迴路，檢測波長450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，10-80％B18分鐘，80-100％B2分鐘，100％B2分鐘，停留時間17.98分鐘。
包含N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-(5-二甲氨基萘-1-磺醯)-賴氨酸N-3-(甲基丙烯醯氨基)丙基羧醯胺和N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸N-3-(甲基丙烯醯氨基)丙基羧醯胺的丙烯醯胺凝膠的製備製備丙烯醯胺(20％wt.)和N，N′-亞甲基二丙烯醯胺(0.6％wt.)在乙二醇中的溶液。將N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-(5-二甲氨基萘-1-磺醯)-賴氨酸N-3-(甲基丙烯醯氨基)丙基羧醯胺(0.75毫克，1.6×10-6摩爾)，N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸N-3-(甲基丙烯醯氨基)丙基羧醯胺(3.5毫克，5×10-6摩爾)，和30毫升過硫酸銨水溶液(5％wt)與0.5毫升乙二醇單體溶液混合。將得到的溶液置於用氮清潔的乾燥箱中。將N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(30μL，5％wt)添加至單體製劑中，以加速聚合。將得到的製劑倒入由顯微鏡載玻片和100μ的不鏽鋼隔片構成的模具中。在氮氣氛中保持8小時之後，將模具置於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(10mM PBS，pH＝7.4)中，分離顯微鏡載玻片，並將水凝膠取出。用包含1mM月桂烷硫酸酯鈉鹽和1mM EDTA鈉鹽的100毫升PBS，對該水凝膠洗滌3天，溶液每天都發生改變，然後用DMF/PBS(10/90體積，3×100毫升)進行洗滌，最後用PBS(pH＝7.4，3×100毫升)進行洗滌。將得到的水凝膠聚合物存儲於包含0.2％wt疊氮化鈉和1mM EDTA鈉鹽的PBS(10mMPBS，pH＝7.4)中。
螢光調控圖5示出了包含2mM丹磺醯-兒茶酚單體和10mM猝滅劑-硼酸單體的丙烯醯胺凝膠(20％)在PBS中的螢光發射(在532nm處的I)。將凝膠(100μm厚度)塗於PMMA比色環中。葡萄糖的濃度在0-200mM之間改變。利用Shimadzu RF-5301光譜螢光計記錄光譜，其中激勵在350nm；激勵縫隙3nm；發射縫隙10nm；高PMT靈敏度，37℃。通過添加葡萄糖猝滅能力將降低。
實施例6 弱螢光 極弱螢光 強螢光葡萄糖對於在3，4-二羥基苯甲酸存在下蒽二-硼酸衍生物的螢光的作用PBS可溶的蒽二硼酸衍生物的製備 9，10-二[[2-(叔-丁氧基羰基)乙胺基]甲基]-蒽在黑暗中，在23℃，將β-丙氨酸叔-丁基酯鹽酸鹽(3.06克，16.8毫摩爾，5.09克當量)，DIEA(4.27克，5.75毫升，33.0毫摩爾，10.00克當量)和9，10-二(氯甲基)蒽(0.910克，3.31毫摩爾)在75毫升CHCl3中的溶液攪拌93小時。在這時候，對該溶液進行過濾，並用1×40毫升和2×60毫升的NaHCO3(飽和水溶液)進行洗滌。在無水硫酸鈉上對有機萃取物進行乾燥，過濾並濃縮，以便得到粗的黃色固體。通過矽膠柱色譜法(30克重力級凝膠，0-3％CH3OH/CH2Cl2)對該殘餘物進行提純，從而得到1.06克(65％)的粘性黃-橙色物質。照現在的樣子，對該產物繼續進行試驗。
TLCMerck矽膠60板，Rf 0.33(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)觀察。
9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(叔-丁氧基羰基)乙胺基]甲基]蒽在黑暗中，於23℃，將9，10-二[[2-(叔-丁氧基羰基)-乙胺基]甲基]蒽(1.60克，3.25毫摩爾)，DIEA(4.45克，6.00毫升，34.4毫摩爾，10.6克當量)和(2-溴甲基苯基)硼酸新戊基酯(4.80克，17.0毫摩爾，5.22克當量)在30毫升CHCl3中的溶液攪拌4.5小時。在這時候，將45毫升CHCl3添加至混合物中，用2×25毫升的NaHCO3(飽和水溶液)對該混合物進行洗滌。在無水硫酸鈉上對有機萃取物進行乾燥，過濾並濃縮，以便得到粗的帶紅色的油。通過氧化鋁柱色譜法(100克激活的中性氧化鋁，0-3％CH3OH/CH2Cl2)對該殘餘物進行提純，從而得到約3.5克的橙色固體。使該產物溶解，然後形成一白沉澱(DIEA-HBr鹽)。對該溶液進行過濾，濃縮濾液得到2.72克(93％)的橙色固體。照現在的樣子，對產物(＞80％純度，通過RP-HPLC)繼續進行試驗。
TLCMerck鹼性氧化鋁板，Rf 0.66(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)觀察。
HPLC條件HP 1100HPLC色譜儀，Vydac 201TP 10×250mm柱，0.100毫升注入，2毫升/分鐘，檢測波長370nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)梯度10％B2分鐘，在18分鐘內10-80％B，在2分鐘內80-100％B，100％B2分鐘，停留時間23.9分鐘。
9，10-二[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[3-(丙醯基)氨基]-甲基]蒽在黑暗中，在23℃，將9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(叔-丁氧基羰基)乙胺基]-甲基]蒽(0.556克，0.620毫摩爾)於在5毫升20％TFA/CH2Cl2中的溶液攪拌25小時。這時，在氮氣流下對反應混合物進行濃縮。用3×10毫升的乙醚對該殘餘物進行粉碎。在真空中使殘餘的固體乾燥，以得到0.351克(87％)的蓬鬆的黃色粉末。
FAB MS甘油基體；對於C42H46B2N2O10(二甘油加合物)，計算值[M]+760；測量值[M+1]+760。
HPLCHP 1100HPLC色譜儀，水5×100mm NovaPak HR C18柱，0.025毫升注入，0.75毫升/分鐘，1.5毫升注入迴路，檢測波長360nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，10-80％B18分鐘，80-100％B2分鐘，100％B2分鐘，停留時間16.7分鐘。
螢光調控圖6顯示了3，4-二羥基苯甲酸對在該實施例中製備的PBS中的蒽二硼酸衍生物(40μM)螢光強度(450nm)的作用。利用ShimadzuRF-5301光譜螢光計記錄光譜，其中激勵在370nn；激勵縫隙3nm；發射縫隙3nm；高PMT靈敏度，環境溫度。蒽二-硼酸衍生物發射低水平螢光，它將由於3，4-二羥基苯甲酸的存在而有效地猝滅。
圖7顯示了在3，4-二羥基苯甲酸(200μM)存在下，本實施例的蒽二硼酸衍生物(40μM)的標準化的螢光強度(430nm)隨PBS中葡萄糖濃度的變化(菱形點)；以及相同指示劑(40μM)的標準化的螢光強度(430nm)隨PBS中葡萄糖濃度的變化(方形點)。葡萄糖的濃度在0-25mM之間變化。利用Shimadzu RF-5301光譜螢光計記錄光譜，其中激勵在370nm；激勵縫隙3nm；發射縫隙5nm；低PMT靈敏度，環境溫度。在沒有3，4-二羥基苯甲酸猝滅劑的情況下，將葡萄糖添加至蒽二硼酸衍生物中，將使螢光增強。在有3，4-二羥基苯甲酸猝滅劑的情況下，將葡萄糖添加至蒽二硼酸衍生物中，將使螢光顯著增強。據信，該葡萄糖將從硼酸識別單元中替換3，4-二羥基苯甲酸猝滅劑，結果使螢光增加。在該實施例中，3，4-二羥基苯甲酸基不僅起檢測系統猝滅部分的作用，而且還起與識別單元相互作用的配位體單元的作用。
實施例7 A.1，4-二[[4-(叔-丁氧基羰基)氨基丁氨基]甲基]苯
將對苯二甲醛(0.253克，1.89毫摩爾)，N-叔-Boc-丁二胺(0.71克，3.77毫摩爾)和硫酸鈉(5.5克，40毫摩爾)與25毫升的無水甲醇混合。在室溫下，對該混合物攪拌24小時，過濾掉硫酸鈉，並添加NaBH4(1.5克，40毫摩爾)。4小時之後，用100毫升乙醚稀釋混合物並進行過濾。使溶劑蒸發掉之後獲得的殘餘物經矽膠柱色譜純化，其中利用CH2Cl2/MeOH/Et3N(85/15/5體積％)作為洗脫液。所分離出的產物是白色固體(0.77克，86％收率)。在下一步中照現在的樣子利用該材料。
B.1，4-二[N-[2-(頻哪醇)二羥硼基苄基]-N-[[4-(叔-丁氧基羰基)氨基丁氨基]甲基]苯將2-溴甲基苯基硼酸、頻哪醇酯(1.4克，4.7毫摩爾)、1，4-二[[4-(叔-丁氧基羰基)氨基丁氨基]甲基]苯(0.74克，1.56毫摩爾)，和N，N-二異丙基-N-乙胺(1.8毫升，10毫摩爾)溶解於20毫升的CH2Cl2中。在室溫下對該溶液攪拌24小時，蒸發掉溶劑，並用己烷/乙醚(50/50體積，3×10毫升)對殘餘物進行洗滌。再通過柱色譜法(二氧化矽，90/10體積，CH2Cl2/MeOH)對產物進行提純。得產品1.18克(收率83％)。
C.1，4-二[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-氨基丁氨基]甲基]苯二(三氟乙酸)鹽將1，4-二[N-[2-(頻哪醇)二羥硼基苄基]-N-[[4-(叔-丁氧基羰基)氨基丁氨基]甲基]苯(1.1克，1.2毫摩爾)溶解於包含20％體積的TFA和5％體積的三異丙基矽烷的20毫升的CH2Cl2溶液中。對溶液攪拌12小時，並蒸發掉溶劑，在真空下於50℃對殘餘物乾燥24小時。定量的收率。
FAB MS對於C42H64B2N4O4，計算值M+＝710(二頻哪醇酯)，測量值M+2＝712。
HPLCHP 1100高壓液相色譜儀，水5×100毫米NovaPak HR C18柱，0.100毫升注入，0.75毫升/分鐘，2毫升注入迴路，檢測波長280nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，在18分鐘內10-80％B，在2分鐘內80-100％B，100％B2分鐘，停留時間14.6分鐘。

D.3，4-二羥-9，10-二氧代-2-蒽磺醯氯將3，4-二羥基-9，10-二氧代-2-蒽磺酸鈉鹽(1.4克，3.9mM)與30毫升的氯磺酸混合，並在90℃加熱5小時，然後，使該溶液冷卻至0℃，並倒入100克冰中。在用CH2Cl2(3×100毫升)對冰溶融的溶液萃取之後，混合二氯甲烷萃取劑，用Na2SO4進行乾燥並蒸發，以生產出0.87克的固體(收率66％)。
E.1-[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-氨基丁氨基]甲基]-4-[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-[(3，4-二羥-9，10-二氧代-2-蒽)磺醯氨基]丁氨基]甲基]-苯三氟乙酸鹽將3，4-二羥-9，10-二氧代-2-蒽磺醯氯(0.095克，0.28毫摩爾)溶解於3毫升的無水的CH3CN中，並滴加至1，4-二[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-氨基丁氨基]甲基]苯二(三氟乙酸鹽)(1.06克，1.37毫摩爾)和N，N-二異丙基-N-乙胺(1毫升，5.8毫摩爾)在5毫升無水CH3CN中的溶液中。在攪拌4小時之後，蒸發掉溶劑並在真空下對殘餘物進行乾燥。將殘餘物溶解於10毫升的CH3CN/TFA(80/20體積％)中並再次蒸發掉溶劑。將水(10毫升)添加至該殘餘物中，並對燒瓶進行20分鐘的超聲處理，接著過濾包含產物的褐色固體。進一步使用預備的HPLC提純HP 1100高壓液相色譜儀，水25×100毫米NovaPak HR C18柱，1.00毫升注入，5毫升/分鐘流速，2毫升注入迴路，檢測波長470nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分鐘，在18分鐘內10-80％B，在2分鐘內80-100％B，100％B2分鐘，停留時間18.5分鐘。得到產物198毫克(收率79％)。就在MeOH/PBS(1/1，體積比)溶液(pH＝7.4)中，對該化合物與D-葡萄糖的相互作用進行測試，通過對吸收光譜的監測對相互作用進行評估。
F.1-[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-(甲基丙烯醯氨基)丁氨基]甲基]-4-[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-[(3，4-二羥-9，10-二氧代-2-蒽)磺醯氨基]丁氨基]甲基]-苯將1-[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-氨基丁氨基]甲基]-4-[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-[(3，4-二羥基-9，10-二氧代-2-蒽)磺醯氨基]丁氨基]甲基]苯三氟乙酸鹽(30毫克，3.34×10-5摩爾)溶解於1毫升的無水甲醇中。添加根據J.Am.Chem.Soc.(1999，121(15)，3617)製備的甲基丙烯酸NHS酯 (10毫克，5.46×10-5摩爾)，然後添加0.01毫升的Et3N。將該溶液攪拌10小時。在真空下蒸發掉溶劑，並用水對固體進行洗滌。RP-HPLC分析表明在固體中沒有原材料。在真空下對得到的固體進行乾燥，並照現在的樣子聚合成水凝膠薄膜。
G.包含1-[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-(甲基丙烯醯氨基)丁氨基]甲基]-4-[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-[(3，4-二羥基-9，10-二氧代-2-蒽)磺醯氨基]丁氨基]甲基]-苯的N-N-二甲基丙烯醯胺水凝膠薄膜的製備製備N，N-二甲基丙烯醯胺(40％重量)和N，N′-亞甲基二丙烯醯胺(0.8％重量)和D-果糖(200mM)在DMF中的溶液。將1-[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-(甲基丙烯醯氨基)丁氨基]甲基]-4-[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-[(3，4-二羥基-9，10-二氧代-2-蒽)磺醯氨基]丁氨基]甲基]-苯(30毫克)溶解於包含單體和D-果糖的0.5毫升DMF溶液。將含水過硫酸銨(20μL，5％重量)與該配方混合。將得到的溶液置於用氮清洗的手套箱中。將N，N，N′，N′-四甲基乙二胺的水溶液(20μL，5％wt)添加至單體配方中，以加速聚合。將得到的製劑倒入由顯微鏡載玻片和100μM的不鏽鋼隔片構成的模具中。在氮氣氛中保持8小時之後，將模具置於磷酸鹽緩衝鹽水(10mM pi，pH＝7.4)中，分離顯微鏡載玻片，並將水凝膠取出。用包含1mM月桂烷硫酸酯鈉鹽和1mM EDTA鈉鹽的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)100毫升，對該水凝膠洗滌3天，溶液每天都發生改變，然後用DMF/PBS(10/90體積，3×100毫升)進行洗滌，最後用PBS(pH＝7.4，3×100毫升)進行洗滌。將得到的水凝膠聚合物存儲於含有0.2％wt疊氮化鈉和1mM EDTA鈉鹽的PBS(10mM PBS，pH＝7.4)中。
H.D-葡萄糖對包含1-[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-(甲基丙烯醯氨基)丁氨基]甲基]-4-[N-(2-二羥硼基苄基)-N-[4-[(3，4-二羥基-9，10-二氧代-2-蒽)磺醯氨基]丁氨基]甲基]-苯的N-N-二甲基丙烯醯胺凝膠的螢光和吸光率的作用在裝備有可變溫度附件的Shimadzu RF-5301 PC分光螢光計中進行該實驗。將N，N-二甲基丙烯醯胺水凝膠附於一塊以45度角膠合在PMMA螢光池中的玻璃片上。用包含各種濃度D-葡萄糖的PBS(pH＝7.4)溶液填充該池。在對吸光率和螢光強度進行測量之前，將該池在37℃平衡30分鐘。測量螢光強度的激發波長設置在470nm，隙縫寬度是3/3nm，高靈敏度的PMT。利用HP 8453儀器對水凝膠薄膜的吸收光譜進行測量，在每次測量中用690nm處的吸光率進行空白校正。
結果示於圖8-10中。圖8示出了在含有不同葡萄糖濃度的PBS/甲醇中指示劑的吸收光譜。圖9示出了含有不同葡萄糖濃度的指示劑凝膠(A(565nm)/A(430nm))的吸收率。圖10示出了不同濃度葡萄糖在550nm處的標準化螢光(I/Io)。
權利要求
1.一種檢測試樣中多羥基待分析物的存在或濃度的方法，該方法包括a)將試樣暴露給指示系統，所述系統具有i)能以可逆方式與所述待分析物形成共價鍵的第一識別單元，和能以可逆方式與結合至第一識別單元上的所述待分析物形成共價鍵的第二識別單元(A)，或在沒有所述待分析物時能以可逆方式與第一識別單元相互作用的配位體單元(B)；所述配位體單元還可有可無地包含產生可檢測特性的標記，所述可檢測特性通過配位體單元與識別單元的相互作用來調控，其中包含所述第一識別單元的指示系統部分共價地或非-共價地連接至指示系統中包含所述第二識別單元或所述配位體單元的部分上；和ii)包含下列至少之一的檢測系統產生可檢測特性的供體/受體系統(A)，當所述指示系統暴露至所述待分析物中時，該系統以濃度-依賴的方式發生改變，或所述被標記的配位體單元(B)；和b)測量所述可檢測特性的任何改變，由此測定在所述試樣中所述待分析物的存在或濃度。
2.權利要求1的方法，其中指示系統至少有兩個針對待分析物的識別單元。
3.權利要求2的方法，其中待分析物是糖，而每個識別單元獨立地選自硼酸、硼酸根離子、亞砷酸、亞砷酸根離子、碲酸、碲酸根離子、鍺酸、鍺酸根離子及其組合。
4.權利要求3的方法，其中待分析物是葡萄糖，而每個識別單元包含一個或多個硼酸基。
5.權利要求1的方法，其中指示系統具有針對待分析物的識別單元，和配位體單元。
6.權利要求5的方法，其中待分析物是糖，而識別單元包含一個或多個下列物質硼酸、硼酸根離子、亞砷酸、亞砷酸根離子、碲酸、碲酸根離子、鍺酸、或鍺酸根離子。
7.權利要求6的方法，其中待分析物是葡萄糖，而識別單元包含一個或多個硼酸基。
8.權利要求5的方法，其中配位體單元是能與識別單元形成酯鍵的部分。
9.權利要求8的方法，其中配位體單元選自芳族二醇、乳酸鹽、α-羥酸、酒石酸、蘋果酸、二乙醇胺、β-氨基醇、葡萄糖和多羥基化合物以及含鄰位羥基的化合物，所述這些物質可以是取代或未取代的。
10.權利要求1的方法，其中檢測系統包含給體/受體系統。
11.權利要求10的方法，其中檢測系統包含螢光基團和猝滅基團，其中當所述指示系統結合至所述待分析物上時，所述螢光基團被猝滅或被去猝滅。
12.權利要求1的方法，其中檢測系統包含所述被標記的配位體單元。
13.權利要求12的方法，其中所述被標記的配位體單元包含螢光基團，並且所述螢光基團的螢光通過所述指示系統與所述待分析物的結合來進行調控。
14.權利要求10的方法，其中檢測系統包含至少兩個不同的螢光基團，並且其中所述螢光基團的螢光通過所述指示系統與所述待分析物的相互作用來進行調控。
15.權利要求1的方法，其中試樣是生理性液體。
16.權利要求15的方法，其中生理性液體選自血、血漿、血清、間隙流體、腦脊髓液、尿、唾液、眼內的液體、淋巴、眼淚、汗和生理緩衝劑。
17.權利要求1的方法，其中指示系統暴露給溶液中的試樣。
18.權利要求1的方法，其中指示系統固定在固相載體上或固定在其內部。
19.權利要求18的方法，其中固相載體是聚合物基體。
20.權利要求1的方法，其中指示系統與可植入裝置相結合，並且其中步驟(a)在體內進行。
21.權利要求1的方法，其中測量步驟在基本上環境溫度下進行。
22.權利要求21的方法，其中溫度高至約80℃。
23.權利要求1的方法，其中指示系統包含選自如下化合物的殘餘物N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羥硼基)-苄基]氨基己基]-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺；N-2-[4-(N-4-二甲氨基苄基)-[2-(二羥硼基)-苄基]氨甲基]苄基-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺；N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羥硼基)-苄基]氨基己基]-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙基)氨基-1，8-萘醯亞胺；N-(5-甲氧羰基-5-[3，4-二羥基苯甲醯氨基]戊基)-N』-(5-螢光素基)硫脲；N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸；N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺醯)-賴氨酸；N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺醯)-賴氨酸N-3-(甲基丙烯醯氨基)-丙基甲醯胺；和N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸N-3-(甲基丙烯醯氨基)丙基-羧醯胺。
24.一種包含選自如下化合物的殘餘物的指示系統N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羥硼基)-苄基]氨基己基]-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺；N-2-[4-(N-4-二甲氨基苄基)-[2-(二羥硼基)-苄基]氨甲基]苄基-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘醯亞胺；N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羥硼基)-苄基]氨基己基]-[2-(二羥硼基)苄基]氨乙基-4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙基)氨基-1，8-萘醯亞胺；N-(5-甲氧羰基-5-[3，4-二羥基苯甲醯氨基]戊基)-N』-(5-螢光素基)硫脲N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸；N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺醯)-賴氨酸；N-α-(3，4-二羥基苯甲醯基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺醯)-賴氨酸N-3-(甲基丙烯醯氨基)-丙基甲醯胺；和N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲醯基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲醯賴氨酸N-3-(甲基丙烯醯氨基)丙基-羧醯胺。
全文摘要
本發明披露了利用指示系統檢測待分析物(如糖類)的方法，所述指示系統在暴露給待分析物時，其分子結構會發生改變。結構的改變將影響與指示系統有關的可檢測特性，例如螢光特性，由此能夠對待分析物的存在或濃度進行檢測。
文檔編號G01N21/78GK1529815SQ02806007
公開日2004年9月15日 申請日期2002年1月4日 優先權日2001年1月5日
發明者喬治·Y.·丹尼洛夫, 亞里斯多德·G.·卡利夫仁特諾斯, 亞歷山大·V.·尼古拉特奇克, 埃德溫·F.·厄爾曼, F. 厄爾曼, 喬治 Y. 丹尼洛夫, 多德 G. 卡利夫仁特諾斯, 大 V. 尼古拉特奇克 申請人:醫藥及科學傳感器公司