一種軟海綿酸毒素分子印跡‑量子點聚合物的製備方法及應用與流程
2023-06-15 16:42:01 1
本發明涉及分析化學、材料科學
技術領域：
，尤其是涉及一種軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物的製備方法及應用。
背景技術：
：軟海綿酸(OkadaicAcid，OA)是一類長鏈脂肪酸，屬於聚醚類毒素。1976年日本發生因食用紫貽貝導致中毒，中毒主要以腹瀉為主，故稱為腹瀉性貝類毒素（DSP），但大田軟海綿酸毒性長效，並且有強烈的致癌性，應當引起足夠重視。目前，美國、加拿大和大多數歐美國家對鮮貝中PSP的最高限量為80μg/100g，加拿大、日本英國等對DSP在貝類食用肉要求不超過20μg/100g。在所有的海洋毒素中，OA的分布範圍最廣，發病率最高，OA毒素能夠導致中毒者出現腹瀉、腹痛、嘔吐等中毒症狀，其作用機制複雜，通過激發消化道細胞中cAMP系統導致水瀉發生。隨著細胞內cAMP的升高，依賴cAMP的蛋白激酶隨之而被激活，蛋白質磷酸化，引起細胞抑制對鈉的正常吸收，而且大量分泌水、氯及碳酸鹽，從而導致腹瀉。另外，OA毒素還具有促腫瘤作用和遺傳毒性，可導致DNA加合物的形成。因此，加強對OA毒素的檢測，可有效保障水產品安全及其對人類健康的威脅。目前，OA毒素的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、液質聯用法（LC-MS/MS）、氣質聯用法（GC-MS/MS）等。其中，氣相色譜法可用於分離和測定OA系列的毒素，而液質聯用技術不需要衍生化和複雜的前處理就能夠對多組分的毒素進行很好的分離，幾乎可以分析所有的貝毒。雖然儀器檢測法通常有較高的靈敏度，但其對前處理要求較高，設備昂貴，且對操作人員要求高。因此，開發新型樣品前處理方法對提高檢測效率具有重要意義。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是提供一種具有靈敏度高、穩定好、選擇性高，方法簡單、操作方便的軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物的製備方法，其解決的另一技術問題為將其作為Spin固相萃取小柱吸附材料，達到簡單、高效實現貝類樣品中軟海綿酸貝類毒素的選擇性分離、純化和富集的目的。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為：一種軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物的製備方法，包括以下步驟：以軟海綿酸為模板分子，加入量子點螢光納米材料，在交聯劑正矽酸乙酯（TEOS）和功能單體3-氨丙基三乙氧基矽烷（APTES）或者甲基丙烯醯氧丙基三(三甲基矽氧烷基)矽烷（MPTES）存在條件下，引發聚合後，採用超聲輔助萃取法除去所得聚合物中模板分子，即獲得可特異識別軟海綿酸毒素的軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物（MIP-QDs）。具體步驟如下：（1）將7.5mL環己烷與1.8mLTritonX-100混合攪拌15min後，量子點螢光納米材料QDs500μg、正矽酸乙酯（TEOS）50μL和氨水100μL，攪拌2h，最後加入濃度為1μg/mL的軟海綿酸毒素溶液156μL，功能單體3-氨丙基三乙氧基矽烷（APTES）或者甲基丙烯醯氧丙基三(三甲基矽氧烷基)矽烷（MPTES）22.8μL，攪拌聚合反應12h；（2）加入10mL丙酮待沉澱後離心棄上清液，加入6mL雙蒸水分散後離心棄上清液，加入5mL乙醇/乙腈溶液，超聲分散均勻靜置40min後離心；（3）重複步驟（2）直到完全除去軟海綿酸毒素為止，即獲得可特異識別軟海綿酸毒素的軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物（MIP-QDs）。所述的乙醇/乙腈溶液中乙醇與乙腈的混合體積比為8：2。所述的量子點螢光納米材料為CdSe/ZnS，粒徑介於2.5nm-6nm之間。上述軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物的應用，利用軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物檢測軟海綿酸的含量，具體步驟如下：（1）稱取0.02-0.05mg軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物溶於0.5-1.0mL乙醇中得到勻漿液，在抽真空狀態下，將勻漿液轉入聚丙烯Spin固相萃取小柱中，將軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物通過上篩板和下篩板壓緊得到軟海綿酸Spin固相萃取小柱；然後將軟海綿酸Spin固相萃取小柱依次用乙醇0.5-1mL、10wt%乙醇水溶液0.5-1mL淋洗活化；（2）精確稱取1.0g貝類樣品，加入2.0mL甲醇，12000rpm勻漿30s，渦旋震蕩5min，於5000r/min，離心5min，取沉澱加入2.0mL甲醇重複勻漿離心一次；合併兩次離心所得上清液，即得到樣品提取液，然後將樣品提取液上樣至步驟（1）活化後的軟海綿酸Spin固相萃取小柱，於1000rpm離心2min，然後依次用去離子水0.5-1.0mL，10wt%乙醇水溶液0.5-1.0mL淋洗，於1000rpm離心5min；最後將1.0mL乙醇加入到軟海綿酸Spin固相萃取小柱，靜止5min後，於1000rpm離心10min，收集洗脫液，過0.22μm濾膜，即可採用LC-MS/MS測定軟海綿酸毒素的含量。與現有技術相比，本發明的優點在於：本發明首次公開了一種軟海綿酸分子印跡-量子點聚合物的製備方法，將量子點納米材料（粒徑小、比表面積大等優點）與分子印跡材料的高選擇性相結合，獲得對軟海綿酸貝類毒素具有高選擇性、高吸附容量的分子印跡-量子點聚合物，並通過篩選建立合適的Spin分子印跡固相萃取小柱上樣、淋洗、洗脫及離心程序，獲得對軟海綿酸貝類毒素具有較高選擇性和靈敏度的萃取體系，可用於貝類樣品中軟海綿酸貝類毒素的分離、純化和富集，具有靈敏度高、穩定好、選擇性高，方法簡單、操作方便的優點。與常規液液萃取、固相萃取等相比，具有富集、淨化效率高、有機溶劑消耗少、成本低、樣品需要量少等優點。附圖說明圖1為實施例一製備的軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物的透射電鏡圖；圖2為軟海綿酸毒素及其結構類似物對MIP-QDs的螢光猝滅結果比較示意圖；圖3為軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物對軟海綿酸的螢光猝滅曲線示意圖。具體實施方式以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。具體實施例一一種軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物的製備方法，包括以下步驟：以軟海綿酸為模板分子，加入量子點螢光納米材料，在交聯劑正矽酸乙酯TEOS和功能單體存在條件下，引發聚合後，採用超聲輔助萃取法除去所得聚合物中模板分子，即獲得可特異識別軟海綿酸毒素的軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物。具體步驟如下：（1）將7.5mL環己烷與1.8mLTritonX-100混合攪拌15min後，加入量子點螢光納米材料QDs500μg、正矽酸乙酯（TEOS）50μL和氨水100μL，攪拌2h，最後加入濃度為1μg/mL的軟海綿酸毒素溶液156μL，功能單體3-氨丙基三乙氧基矽烷（APTES）或者甲基丙烯醯氧丙基三(三甲基矽氧烷基)矽烷（MPTES）22.8μL，攪拌聚合反應12h；（2）加入10mL丙酮待沉澱後離心棄上清液，加入6mL雙蒸水分散後離心棄上清液，加入5mL乙醇/乙腈溶液，超聲分散均勻靜置40min後離心；（3）重複步驟（2）直到完全除去軟海綿酸毒素為止，即獲得可特異識別軟海綿酸毒素的軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物（MIP-QDs）。同時，製備空白印跡-量子點聚合物（NIP-QDs），除不加模板分子外，其製備過程同上述MIP-QDs製備方法。上述量子點螢光納米材料為CdSe/ZnS，粒徑介於2.5nm-6nm之間。上述製備方法獲得的可特異識別軟海綿酸毒素的軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物（MIP-QDs）的透射電鏡圖如圖1所示，表明獲得的MIP-QDs大小均一。具體實施例二利用上述具體實施例一製備的軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物檢測軟海綿酸的含量，具體步驟如下：（1）稱取0.02-0.05mg軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物溶於0.5-1.0mL乙醇中得到勻漿液，在抽真空狀態下，將勻漿液轉入聚丙烯Spin固相萃取小柱中，將軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物通過上篩板和下篩板壓緊得到軟海綿酸Spin固相萃取小柱；然後將軟海綿酸Spin固相萃取小柱依次用乙醇0.5-1mL、10wt%乙醇水溶液0.5-1mL淋洗活化；（2）精確稱取1.0g貝類樣品，加入2.0mL甲醇，12000rpm勻漿30s，渦旋震蕩5min，於5000r/min，離心5min，取沉澱加入2.0mL甲醇重複勻漿離心一次；合併兩次離心所得上清液，即得到樣品提取液，然後將樣品提取液上樣至步驟（1）活化後的軟海綿酸Spin固相萃取小柱，於1000rpm離心2min，然後依次用去離子水0.5-1.0mL，10wt%乙醇水溶液0.5-1.0mL淋洗，於1000rpm離心5min；最後將1.0mL乙醇加入到軟海綿酸Spin固相萃取小柱，靜止5min後，於1000rpm離心10min，收集洗脫液，過0.22μm濾膜，即可採用LC-MS/MS測定軟海綿酸毒素的含量。具體實施例三1、高選擇性（特異性）以軟海綿酸(OA)毒素為模板分子合成的軟海綿酸毒素分子印跡-量子點聚合物，選擇鰭藻毒素1（DTX1）、鰭藻毒素1（DTX2）、原多甲藻酸（AZA1）、石房蛤毒素（STX）作為結構類似物，對獲得的MIP-QDs的特異性進行了分析（螢光猝滅系統用方程式表示，F0/F=1+Ksv[Q]，F0和F分別表示MIP-QDs的初始螢光值和加入氯氰菊酯後的螢光值，Ksv是Stem-Volmer方程中的恆定參數，[Q]為猝滅劑的濃度。（F0-F）表示加入氯氰菊酯前後的螢光猝滅值，（F0-F）/F為MIP-QDs的印跡效率。MIP-QDs和NIP-QDs的Ksv值的比值表示印跡因子（IF），用來評估MIP-QDs的選擇性）。實驗結果如圖2所示，由MIP-QDs的螢光猝滅結果圖可知，獲得的分子印跡-量子點聚合物對OA具有較高選擇性。在對OA和其類似物的實驗中，MIP-QDs的Ksv值（為Stem-Volmer方程中的恆定參數，可以用來表明MIP-QDs的抑制螢光能力）大於NIP-QDs（不加模板的空白印跡-量子點聚合物）的Ksv值，且MIP-QDs和NIP-QDs對OA的Ksv比值遠高於其結構類似物，表明獲得的MIP-QDs具有較好的選擇性。2、靈敏度試驗對上述具體實施例二建立的檢測軟海綿酸含量檢測方法的線性及靈敏度進行分析，結果由圖3可知，在20.0-100.0μg/kg濃度範圍內，OA對MIP-QDs的螢光猝滅增強，由於其猝滅主要依賴於MIP-QDs的特異識別，因此，表明MIP-QDs對OA具有較高的吸附容量。y=0.0017x-0.0069，R²=0.9961，檢測限為通過螢光猝滅三倍空白信號的標準偏差對應的濃度。結果如下表1所示，表1OA的最低檢出限毒素樣品紫貽貝牡蠣文蛤OA檢出限μg/L5.515203、回收率回收率的測定採用提取前基質加標實驗，在樣品中加入OA毒素，使其終濃度為25.0μg/kg，然後經上述具體實施例二中Spin固相萃取小柱分離純化，MIP-QDs體系檢測，測量獲得的濃度，計算回收率。結果如下表2所示，表2回收率比較由上述表2可知，與常規液液萃取、固相萃取等相比，本發明製備的軟海綿酸Spin固相萃取小柱具有富集、淨化效率更高的優勢。上述說明並非對本發明的限制，本發明也並不限於上述舉例。本
技術領域：
的普通技術人員在本發明的實質範圍內，作出的變化、改型、添加或替換，也應屬於本發明的保護範圍，本發明的保護範圍以權利要求書為準。當前第1頁1 2 3