一種大批量生產生物除草劑的方法
2023-06-15 10:56:11 1
專利名稱：一種大批量生產生物除草劑的方法
技術領域：
本發明為一種大批量生產生物除草劑的方法，屬於微生物應用於農業植物保護、防除農作物雜草的技術領域，專用於農田雜草的生物防除。
二、技術背景目前，國內防治草害主要還是依賴於化學農藥產品，而且其使用量和面積還在不斷擴大。隨著全球經濟一體化和貿易國際化，全國農藥行業正面臨著嚴峻的挑戰，新品種化學農藥的高額研製開發成本阻礙了農藥工業的發展和農業生產的需要。另一方面，化學農藥的大量使用，已經和正在造成嚴重的環境汙染問題，直接危害到人畜健康和影響農業的可持續發展。因此，尋求新的防治手段，降低化學農藥的使用，成為一個迫在眉睫的關鍵。發展生物防治技術，特別是以生物農藥替代化學農藥，以在世界範圍內形成共識，引起了大家的關注。生物農藥新品的研製開發，比化學農藥所需投入較少，且周期短，符合國情。生物農藥的開發和利用，正成為農業現代化和農業可持續的標誌性技術。展望未來，生物農藥將作為一種高新技術，在保護環境，保證人類健康，在農林業可持續發展中，發揮愈來愈重要的作用。目前，作為生物農藥的一個主要組成部分，國內尚沒有一種產業化的生物除草劑，而綠色食品和有機食品的生產卻迫切需求無汙染的生物除草劑解決雜草問題。
波斯婆婆納(Veronica persica Poir)、馬唐(Digitaria sanguinalis(L.)Scop.)、紫莖澤蘭(Eupatorium adenophorum Spreng.)和蒼耳(Xanthium occidentale Bertol.)是世界性的惡性雜草，對農田和生態環境造成了極為嚴重的危害。
波斯婆婆納是麥類、油菜等夏熟作物田的惡性雜草，對棉、玉米、大豆等幼苗生長也危害嚴重，蔬菜田、果園、草坪和園藝作物田中也常有發生。波斯婆婆納的分布範圍廣泛，我國長江流域及華北地區均有其發生和危害的報導，另外它也是歐洲、西亞和美洲農田的惡性雜草。該雜草繁殖能力強，生長速度快，生長期長，耐藥性強，人工、機械和化學防除比較困難。
馬唐是玉米、棉花、甘薯、高粱、大豆、花生等秋熟旱作物田的惡性雜草，對棉花、菸草、麻類、甘蔗等幼苗生長危害嚴重，也是蔬菜田、果園、草坪和園藝作物田的優勢雜草。甚至也是南方陸稻田的主要危害性雜草。馬唐的分布範圍廣泛，是世界熱帶和溫帶地區廣布種。該雜草繁殖能力強，生長速度快，生長期長，消耗地力，遮光，耐藥性強。
紫莖澤蘭入侵農田、草地、草原、路邊、宅旁、經濟林地和森林，以其異株克生作用的特性，較快形成優勢種群，已經給農、林、牧業生產及多種經營造成極大的損失。自20世紀40年代傳入我國以來，已經西南地區的雲南、貴州、四川、廣西和重慶廣泛分布和危害，並仍在以每年大約60公裡的速度，隨西南風向東和向北方向傳播擴散。
蒼耳是旱地重要的危害性雜草，其植株高大，對作物生長造成嚴重影響。主要分布發生在東北、華北、華中、華東、華南和西南等地區，主要危害玉米、棉花、大豆、甘薯、蔬菜等旱地作物。
發明人在雜草生物防治的研究過程中發現這四種雜草在自然界存在自然發病的植株，對這四種雜草的寄生真菌進行篩選研究，最終分離到四種菌株，並對這四種菌種的培養條件、大批量生產方法、安全性及致病性均已進行了較為詳細的研究，結果表明，這四種菌株均有潛力發展成為生物除草劑。它們分別為膠胞炭疽菌婆婆納專化型(Colletotrichum gloeosporioides f.sp.weronicae Sheng Qiang et Qing Zeng)、紫莖澤蘭鏈格孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissler)、馬唐雙曲孢黴屬(Nakataea Hara)菌株以及百日草鏈格孢(Alternaria zinniae Pape)菌株。
目前，國內外除針對馬唐的生物真菌在美國有所報導外(與本權力要求書所指馬唐生防菌株不同)，波斯婆婆納和紫莖澤蘭的生物除草劑尚未見報導。而有關這四種生防真菌大批量生產的方法更是鮮見報導。生物除草劑要實現產業化，生產成本是至關重要的因素。從經濟因素方面考慮，要求培養基組分簡單、價格便宜、原料可大量獲得，並且生產過程易於操作，勞動量降到最低。因而，研究生物除草劑的大批量生產工藝和方法，是生物除草劑研究中的核心關鍵內容，一方面，一株優良生防菌株為達到商業化進程，必須能夠有一套較為完整齊全的大批量生產工藝，另一方面，農業生產實踐中，為了保證農產品在價格上有競爭力，要求使用的生物除草劑價格便宜。
現在已經商品化或正在生產上使用的真菌除草劑，多是經發酵技術生產的。固體發酵，生產周期相對較長，因而生物除草劑工業化生產的首選方法是液體發酵，這種方法不需要對現有的工業發酵設備做多少改進就可以直接利用標準的發酵和下遊處理裝置進行。北美四種商業化的生物除草劑中，Collego、Devine和BioMal是通過深層液體發酵生產的。但是生物除草劑的除草活性單元往往是真菌有活力的部分，例如菌絲體、分生孢子、厚垣孢子等無性繁殖體，而通過液體發酵生產的分生孢子等真菌活性部分在發酵液中保藏，活力衰退較快。例如生物除草劑Devine是第一個被作為生物除草劑研製的，它的侵染單元為液體發酵獲得的新鮮的厚垣孢子懸浮劑，必須像新鮮牛奶一樣貯藏，並且只有六個星期的貨架期，致使其商業化進程被延遲，直至上個世紀80年代初才被商業化。此外，為了得到高濃度的生物除草劑，需要經過過濾濃縮、脫水乾燥等一系列步驟，整個工藝流程複雜，需要專用設備，增加了成本。
與同期化學除草劑的發展速度相比較，生物除草劑的發展速度無疑緩慢，經濟高效的大批量生產方法一直是阻礙生物除草劑發展的瓶頸因子。
發明內容
技術問題本發明的目的是一種大批量生產生物除草劑的方法，針對真菌菌株的生物學與產孢特性，通過對培養發酵方法、培養基的種類、pH和水分含量及培養時間、光照、溫度等一系列研究，克服阻礙生物除草劑發展的瓶頸因子，探索最經濟有效的大批量生產生物除草劑的工藝。
技術方案一種大批量生產生物除草劑的方法，其特徵在於，採用液體-固體聯合發酵的方法，其具體工藝流程如下將生物除草劑真菌菌株接種到PDA培養基上培養生長，在15-30℃條件下，培養5-7d，獲得一級種菌後；切取一級種菌培養物小塊，接種到液體培養基中，15-35℃振蕩發酵培養3-10d，振搖速度為20-180轉/min，待菌絲團長滿後，獲得二級液體種菌，即菌體懸浮液；固體培養基由麥麩或米糠和其它一種、兩種或三種農副產品組成，麥麩或米糠乾重∶其它組分乾重＝1∶0.1-9，按比例稱取固體培養基幹料後，加入乾料重的0.3-3.0倍水，拌勻滅菌；在無菌環境下將菌體懸浮液接種到滅過菌的固體培養基上，好氣培養，溫度15-35℃，無菌條件下固體發酵生產3-8d，獲得大批量的生物除草劑。
上述的一種大批量生產生物除草劑的方法，其特徵在於，二級液體種菌最好用粉碎機粉碎獲得菌體懸浮液；固體培養的條件最好增加20W波長365nm黑光燈、日光燈或紫外光燈間隙照射。
上述液體培養基和固體培養基的農副產品原料為工業下腳料的農副基礎產品，包括黃豆粉、麥麩、米糠、釀造酵母(酒釀渣)、亞麻子餅粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、豆渣、豆粕、豆餅粉、玉米澱粉、豆餅粉、甘薯粉、花生粉、棉子餅、花生殼、玉米蛋白及多種魚粉等多種農副產品，以及多種樹木的鋸末屑。
有益效果 本發明與現有技術相比，具有如下優點和積極效果1、比較純固體發酵，本發明方法可誘導生產至少5倍以上的生物除草劑產品，並使固體發酵時間縮短2-7d。發明人在對生物除草劑的大批量生產研製過程中，發現有些生物除草劑能夠通過液體發酵生產，有些能通過固體發酵生產獲得。通過液體發酵生產的生物除草劑保存在發酵液中，活力衰退較快，六個星期後基本喪失。而要將生物除草劑從發酵液中分離出來，技術難度需求較高，需要一系列額外的高值設備，需要另行增加很大的資金。對於生物除草劑這樣一項風險性較大，國內目前尚無一項研製成功先例的研究技術，研製之初，不可能找到足夠的資金支持。這無疑將限制此項技術的深入研究。真菌通過固體發酵生產能夠克服從發酵液中收穫生物除草劑困難的缺點，但是，發酵過程相對較長，並且真菌在其中長勢極不均勻，造成原材料極大的浪費。因此嘗試利用液體-固體發酵相結合的培養方式，即通過液體發酵獲得的液體菌種，能夠均勻接種到固體培養基上，在培養基上長勢均勻，能充分利用原材料物，並使固體發酵時間縮短2-7d。生物除草劑菌種在固體培養基上固態發酵的溫度較寬，在15-35℃的條件下生長，均能獲得大量的生物除草劑；對光照的要求不嚴格，在自然光照、全光照及全黑暗條件下，均能正常生長獲得生物除草劑，並在特殊光源(黑光燈、紫外燈)照射下可誘導生產至少5倍以上的生物除草劑產品。
2、本發明所選用的培養基的營養全面。本發明所用的液體和固體培養基為工業下腳料的農副基礎產品，包括黃豆粉、麥麩、米糠、釀造酵母(酒釀渣)、亞麻子餅粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、豆渣、豆粕、玉米澱粉、豆餅粉、甘油、甘薯粉、花生粉、棉子餅、花生殼、玉米蛋白及多種魚粉等多種農副產品，以及多種樹木的殘屑鋸末。這些發酵培養基價格低廉，來源充足，被轉化為產品的效率高。所選用的培養基的營養全面，含有豐富的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、無氮浸出物、粗灰分以及鈣、磷等元素。在製備發酵培養基時合理配製能夠滿足菌種生長、繁殖。
3、適宜的起始含水量，使得培養基有合適的疏鬆度，顆粒間存在一定空隙，有助於菌體從培養基獲得營養物質和氧的傳遞，從而促進生長繁殖。過高的含水量會導致培養基黏結成團，多孔性降低，影響氧的傳遞；含水量過低，則使培養基膨脹程度降低，水的活度低，從而抑制菌體生長。真菌在適宜的環境下先進行營養生長，然後在條件不適宜時進行生殖生長。因此，在配製培養基時要掌握好水分的加入量，水分加入過少，溼度過小，真菌的營養生長不充分，生殖生長有限。但是培養基溼度過大時，又容易造成培養基通氣差，在發酵過程中受細菌汙染，真菌的營養生長同樣受抑，也不利於生殖生長的進行。而在加水適宜時，真菌的營養生長充分，將不利於細菌生長導致汙染。研究發現，固體發酵培養基按比例稱取乾料並拌勻，再按乾料重量∶水的重量＝1∶0.3-3的比例加水拌勻，能夠得到鬆緊適宜的固體培養基，適合菌種生長。
4、本發明所選用的液體和固體培養基均可大量獲得，價廉、操作方便、產孢效率高，利於生產成本的控制。固態發酵試驗的基質採用麩皮、米糠等農業副產品。麩皮為小麥麵粉加工的副產物，含有豐富的碳水化合物和含氮化合物，並含有多種維生素，質地疏鬆，利於通氣，是微生物生長繁殖的優良基質；且原料來源廣泛，價格低廉。
5、工藝簡單易行。液體-固體聯合發酵方法結合了液體發酵和固體發酵兩種發酵方法的長處，省卻了一系列從液體發酵液中收穫生物除草劑接種體所需的繁複工藝和固態發酵時間較長的缺點，液體發酵種菌均勻接種於固體培養基上，使發酵原料轉化為生物除草劑的比例增高，減少了原料的浪費，縮短了整個發酵的周期。而且，生產出來的分生孢子吸附在乾燥的固體培養基基質中，後處理工藝簡單易行，製劑容易存放。
具體實施例方式
實施例1膠孢炭疽菌婆婆納專化型菌株QZ-97a(專利申請號為00112506.0)，它的除草活性成分為該菌的分生孢子。具體實施方法如下菌株QZ-97a在PDA培養基上培養7d，接種到玉米粉黃豆粉蔗糖液體培養基中培養5-7d，用粉碎機粉碎獲得菌體懸浮液。固體培養基由麥麩、黃豆粉和甘薯粉按乾重比7∶2∶1稱取後，加入乾料重的1.5倍水，拌勻滅菌。在無菌環境下將菌體懸浮液接種到滅過菌的固體培養基上，在自製的培養箱中好氣培養3-7d，房間的溫度用空調控制20℃，每克乾物質生產的孢子量可達到7.8×109個/克以上，過篩後，能獲得孢子量在1010個/克以上的孢子粉。這個數量足以滿足在大田使用的同時，保證產品的生產成本保持低廉。液-固體聯合發酵較純固體發酵產孢量至少多出5倍，且固體發酵時間縮短2-7d。上述實施方法中固體培養基、發酵周期、不同水分含量試驗及結果如下配製10組固體培養基，1.麥麩50克；2.麥麩25克+豆粕25克；3.麥麩25克+米糠25克；4.麥麩35克+玉米粉15克；5.米糠50克；6.米糠15克+豆粕35克；7.麥麩30+鋸末15克+魚粉5克；8.鋸末15克+豆粕35克；9.麥麩35克+豆渣15克；10.麥麩35克+黃豆粉10克+甘薯粉5克。每組培養基中各加入碳酸鈣1.5克、蔗糖1.5克、水40ml混勻滅菌，接種二級液體種菌後進行產孢。固體培養基產孢完畢後，於30℃烘箱中烘乾，取0.1g加入100ml水，用碾缽充分磨碎後，計數孢子數(表1)。
表1固體培養基對菌株QZ-97a產孢的影響產孢量 顯著水平培養基109個/克 Significance levelSolid mediaConidia yields 0.05 0.01麥麩+玉米粉 6.67±0.30 b BC麥麩+鋸末+魚粉 7.41±1.20 a A麥麩 6.99±0.42 b AB麥麩+米糠6.76±0.54 b B麥麩+豆餅粉 6.38±0.45 c BC米糠 5.79±0.53 d D米糠+豆餅粉 7.24±0.79 a A鋸末+豆餅粉 5.46±0.26 d D麥麩+豆渣6.12±0.75 b C麥麩+黃豆粉+甘薯粉 7.80±0.65 a A表1結果表明，膠孢炭疽菌QZ-97a在供試的10種固體培養基上生長都能夠得到大量的分生孢子，最大的產孢量出現在麥麩黃豆粉甘薯粉固體培養基中，發酵結束後每克乾物質孢子量達到7.8×109個。
固體培養基(麥麩35克、黃豆粉10克、甘薯粉5克、碳酸鈣1.5克、蔗糖1.5克)，接種菌絲體懸浮液後，固體分別培養生長2、3、4、5、6、7、8天。產孢完畢後，於30℃烘箱中烘乾，取0.1g加入100ml水，用碾缽充分磨碎後，計數孢子數(表2)。
表2 發酵周期對炭疽菌QZ-97a固體發酵產孢的影響產孢量 顯著水平發酵周期(d)108個/ml 0.050.017 4.35±0.70a A9 4.20±0.19ab A8 4.08±0.35ab A6 3.99±0.32b AB5 3.57±0.44c B4 2.59±0.30d C3 1.18±0.62e D2 0.68±0.25f E表2結果表明，產孢量隨著時間延長，產孢量增大，固體發酵至第7天時產孢量達到最大。延長發酵時間，產孢量之間差異不顯著，因此，在培養時，固體培養7天即可結束培養，這樣至少可以縮短固體培養時間3天。
固體培養基(麥麩35克、黃豆粉10克、甘薯粉5克、碳酸鈣1.5克、蔗糖1.5克)，分別加水5、15、25、35、45、55、65、75、85、95ml，接種菌絲體懸浮液後，生長5天檢測孢子數(表3)。
表3不同水分含量對固體培養基產孢的影響水分含量 顯著水平產孢量109個/克(ml) 0.05 0.0195 5.3±0.70b BC85 7.2±0.63abA75 7.3±0.80a A65 6.4±0.50b AB55 6.3±0.31b AB45 6.1±0.61b AB35 5.5±0.56c BC25 4.7±0.49c BC15 4.3±0.41c C5 3.1±0.51d C培養基含水量是決定固體培養產孢的一個重要因子。表3中，產孢量隨著含水量增加而增大，在加水量為75ml時產孢量達到最大值，加水量繼續增大時，產孢量出現下降的趨勢。因此，在配製固體培養基時，掌握好固體培養基的含水量至關重要，以加入乾料重的1.5倍時最佳。
實施例2 紫莖澤蘭鏈格孢菌利用粗代謝產物控制雜草，具體實施方法如下鏈格孢菌株(專利申請號為00112560.5)在PDA培養基上培養7天，接種到黃豆粉玉米粉蔗糖液體培養基中培養7天，用粉碎機粉碎獲得菌絲體懸浮液。固體培養基由玉米粉豆餅按乾重比1∶1稱取後，加入乾料重的0.33倍水，拌勻滅菌。在無菌環境下將菌體懸浮液接種到滅過菌的固體培養基上，用保鮮袋密封后，適當打孔，控溫25℃培養10天。培養結束後風乾製備粗毒素，稀釋後用針刺法測試生物活性，產毒能力用顯微測微尺測量病斑直徑大小(mm)表示。按此法培養顯著提高產毒量，可使葉片致病病斑直徑達4.63mm以上，固體發酵時間較純固體發酵縮短2-7d。
上述實施方法中固體培養基、發酵周期、不同水分含量試驗及結果如下分別用1∶1質量比的米糠+麥麩、玉米粉+麥麩、米糠+豆餅、玉米粉+豆餅、玉米粉+黃豆粉、豆渣+甘薯粉、花生殼+花生粉、酒釀渣+棉子餅和玉米澱粉+亞麻子餅粉配製固體培養基。接種搖瓶振蕩培養的鏈格孢菌絲體，按實施例於適宜條件下固體生長產毒。固體培養結束後，風乾按流程製備粗毒素，稀釋後用針刺法測試生物活性，重複5次(表4)。
表4固體培養介質對鏈格孢產毒量的影響病斑直徑 顯著水平培養基(mm) 0.05 0.01玉米粉+豆餅 2.49±0.23aA玉米粉+麥麩 1.70±0.14bB米糠+豆餅0.51±0.15dD米糠+麥麩0.55±0.10dD玉米粉+黃豆粉0.88±0.16cC豆渣+甘薯粉 0.65±0.13dD花生殼+花生粉1.63±0.12bB酒釀渣+棉子餅1.32±0.08bB玉米澱粉+亞麻子餅粉 1.25±0.11bB幾種固體培養介質對鏈格孢產毒量的比較表明，多數固體介質可以用來產毒，但鏈格孢在玉米粉和豆餅復配的固體培養基中產毒最高，可使葉片致病病斑直徑達2.49mm。因此，選用玉米粉豆餅作為鏈格孢產毒的最佳培養介質。
配製玉米粉∶豆餅質量比為1∶1的固體培養基，乾物質與水的比例分別為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，按實施例接種培養風乾後製備粗毒素，稀釋針刺測試活性。
表5培養基含水量對鏈格孢產毒的影響病斑直徑 顯著水平乾物質重∶水重 (mm) 0.05 0.014∶12.31±0.19cC3∶14.63±0.24aA2∶13.06±0.25bB1∶11.80±0.23dD培養基含水量決定了鏈格孢在固體培養基上的產毒大小，在乾物質重∶水重＝3∶1時，產毒量達到4.63mm，為最大值。含水量繼續增大，產毒量下降。
按實施例配製質量比1∶1的玉米粉+豆餅固體培養基，接種後於適宜條件下分別培養5、10、15、20天後取樣，風乾後製備粗毒素。稀釋針刺測試活性。
表6培養時間對鏈格孢產毒量的影響顯著水平培養時間(d)病斑直徑0.05 0.015 4.35±0.70bB105.57±0.44aA155.59±0.30aA206.18±0.62aA固體培養10天，產毒量能夠達到最大值，進一步增加培養時間，對毒素的增大效果不顯著，掌握這一點，利於在實踐中把握好固體發酵的時間，省時省力。
實施例3 馬唐雙曲孢黴屬的除草活性成分為該菌的分生孢子。具體實施方法如下菌株QZ-2000(專利申請號為011340020.9)，在PDA培養基上培養5天，接種到玉米粉黃豆粉蔗糖液體培養基中培養5-7天，用粉碎機粉碎獲得菌絲體懸浮液。固體培養基由黃豆粉+棉子餅按乾重比2∶1稱取後，加入乾料重的0.6倍水，拌勻滅菌。在無菌環境下將菌體懸浮液接種到滅過菌的固體培養基上，在自製的培養箱中好氣培養3-8天，置於20W黑光燈(波長365nm)下、日光燈照射1-3天、或紫外光燈間隙照射共計1-10小時，房間的溫度用空調控制在28℃。每克乾物質最大產孢量達到8.6×108個/克，較純固體發酵產孢量至少多出5倍，且固體發酵時間縮短2-7d。
上述實施方法中固體培養基、光照及不同水分含量試驗及結果如下配製質量比2∶1的固體培養基(麥麩單用)，所選擇的鋸末木材有杉樹、楊樹、松樹及櫟樹，按照乾料重量∶水重量＝1∶0.8配製固體培養基。按實施例於適宜條件下固體生長產孢，待菌絲鋪滿培養基，置於黑光燈下照射2天後測量產孢量。
表7固體培養基對菌株QZ-2000產孢的影響(108個/g*)杉樹楊樹 松樹麥 杉鋸+楊鋸+松鋸+ 櫟鋸+培養基鋸末鋸末 鋸末麩 麥麩 麥麩 麥麩 麥麩平均產孢量 2.5c3.4c 3.6c6.0ab 6.6ab6.9a 6.1ab 5.8b花生殼黃豆粉+ 甘薯粉+ 米糠+ 花生粉+ 魚粉+棉 豆渣+玉米粉++玉米培養基棉子餅 花生殼玉米粉 棉子餅 子餅 楊鋸 豆餅粉蛋白平均產孢量 7.1a5.2b 6.1b4.9b4.8b 6.4ab3.6b 2.66c注*數據後跟不同字母的為差異顯著(p＜0.05)。
表7結果表明，多種樹材的鋸末以及多種農副產品都可以用來生產QZ-2000的分生孢子，轉化率較高，其中又以黃豆粉+棉子餅混用產孢量最大，每克乾物質最大產孢量達到7.1×108個/克。
配製質量比為2∶1的黃豆粉+棉子餅固體培養基，加水使得含水量分別是固體培養基幹重的30％、40％、50％、60％和70％，按照實施例接種後待菌絲鋪滿培養基，置於黑光燈下照射2天，檢測孢子量(表8)。
表8不同含水量對固體培養基產孢的影響(108個/g*)含水量 30％ 40％ 50％ 60％ 70％平均產孢量3.19d5.25c7.25b7.64a5.75c注*數據後跟不同字母的為差異顯著(p＜0.05)。
表8結果表明，隨著含水量增加，產孢量增大。含水量60％的固體培養基產孢量最大，產孢量為7.64×108個/g。培養基含水量增大到70％時，產孢量顯著降低。因此，在固體發酵時要掌握好水分的加入量。
配製質量比為2∶1的黃豆粉+棉子餅固體培養基，含水量為固體培養基幹重的60％。按照實施例接種後待菌絲鋪滿培養基時，1.加蓋置於黑光燈、紫外燈、日光燈下連續光照、12h光暗交替；距離25cm；2.去蓋置於以上各條件下；3.連續黑暗條件下處理。以室內自然光照作為對照，室溫為25-28℃，2d後計數孢子產生的數量(表9)。每個處理5個重複。
表9光照對菌株QZ-2000產孢的影響自然 連續光照 12h光暗交替 完全處理光照紫外燈 黑光燈 日光燈 紫外燈 黑光燈 日光燈 黑暗覆蓋0.48*H 8.0B7.3C3.4FG7.9C5.4E2.6G光照0.23H敞開0.53H0 8.6A3.9F 0 6.6D2.8FG光照*表內數據為孢子數量(×108/克)注在行、列中數據後大寫字母的表示有極顯著差異和顯著差異(P＝0.01)表9的試驗結果顯示，固體培養的後期光照可以極大促進產孢，連續光照對產孢的增效大於12h光暗交替，而三種光照方式進行比較，又以黑管燈光照對產孢的促進作用最為明顯。最大產孢量8.6×108個/克出現在固體培養基敞開黑光燈連續光照的小組中。
實施例4 百日草鏈格孢菌株利用真菌分生孢子殺死雜草，生產的具體實施方式
如下百日草鏈格孢菌株(公知公用，強勝、郭愛民、Bruce A.Auld等，大批量生產百日草鏈孢菌孢子的技術，1997.中國生物防治13(4)169-172)在PDA培養基上培養7天，接種到玉米粉黃豆粉蔗糖碳酸鈣液體培養基中培養3～4天，菌體開始沉積黑色色素時，將菌體取出過濾，並用無菌水洗去菌體代謝產物及剩餘營養物，用粉碎機將菌絲體粉碎。固體培養基以麥麩或米糠乾重∶鋸末屑乾重＝1∶7稱取，再按乾料重量∶水的重量＝1∶2.0的比例加水拌勻。將菌絲體懸浮液接種於固體培養基上，隨即置於20W黑光燈(波長365nm)下40cm處進行12小時循環光照，室溫條件下誘導產孢，在自製的培養箱中好氣培養3-8天。每克乾物質生產的孢子量最大值達到3.11×107個/克，較純固體發酵產孢量至少多出5倍，且固體發酵時間縮短2-7d。
上述實施方法中的光照啟始時間以及液體培養基中氮含量對百日草鏈格孢菌產孢量的試驗及結果如下用每升含玉米粉17g、豆粉1g、CaCO33g的液體發酵培養基進行菌絲體發酵所得菌絲體經過濾、洗滌、粉碎等處理後，接種在以麥麩乾重∶鋸末屑乾重＝1∶7，再按乾料重量∶水的重量＝1∶2.0的比例加水拌勻的固體培養基上。分4組，每組的3個平皿，分別經0、3、6、9小時黑暗後用黑光燈誘導產孢。
表10近紫外光照射的啟始時間對百日草鏈格孢菌產孢量(107/g*)的影響啟始時間 0369平均產孢量3.11a2.73b2.43c2.27c注數據後跟不同字母的為差異顯著(p＜0.05)。
表10結果顯示，菌絲體懸浮液接種到固體培養基上後隨即採用20W黑光燈(波長365nm)下40cm處進行12小時循環光照的孢子產量較分別間隔3、6和9個小時再施加光照的孢子產量顯著增加，並且間隔時間越短，產孢量越大。
液體培養基中氮含量對固體培養基百日草鏈格孢菌產孢量的影響在液體培養基中，豆粉所含氮量佔培養基中氮含量的絕大部分，豆粉的含量可近似看作與培養基中氮含量成正比。在保持培養基幹物質總量不變，即玉米粉加豆粉為15g/L，CaCO3含量為3g/L的情況下，分別將豆粉的含量變為0(多加玉米粉3g/L)、3、6、9g/L4種含量。接種按實例配製的固體培養基上產孢，最後比較每克乾物質的產孢量。
表11不同豆粉含量培養基的百日草鏈格孢菌孢子產量(106/g*)培養基中豆粉含量 0g/L 3g/L 6g/L 9g/L平均產孢量22.12±1.034a 17.08±1.560b 16.12±0.225b 5.36±0.149c注*為每克乾物質，數據後跟不同字母的為差異顯著(p＜0.05)。
表11結果表明，液體培養基豆粉含量增大，即氮含量增大，固體培養基的產孢量顯著下降。因此，為增大固體培養基的產孢量，在配製液體培養基時要控制其中的氮含量。
採用本發明上述方法培養其他生物除草劑如利用炭疽菌、鏈格孢等真菌能夠達到同樣的效果，是本領域技術人員所熟悉的。
權利要求
1.一種大批量生產生物除草劑的方法，其特徵在於，採用液體-固體聯合發酵的方法，其具體工藝流程如下將生物除草劑真菌菌株接種到PDA培養基上培養生長，在15-30℃條件下，培養5-7d，獲得一級種菌後；切取一級種菌培養物小塊，接種到液體培養基中，15-35℃振蕩發酵培養3-10d，振搖速度為20-180轉/min，待菌絲團長滿後，獲得二級液體種菌，即菌體懸浮液；固體培養基由麥麩或米糠和其它一種、兩種或三種農副產品組成，麥麩或米糠乾重∶其它組分乾重＝1∶0.1-9，按比例稱取固體培養基幹料後，加入乾料重的0.3-3.0倍水，拌勻滅菌；在無菌環境下將菌體懸浮液接種到滅過菌的固體培養基上，好氣培養，溫度15-35℃，無菌條件下固體發酵生產3-8d，獲得大批量的生物除草劑。
2.根據權利要求1所述的一種大批量生產生物除草劑的方法，其特徵在於，二級液體種菌最好用粉碎機粉碎獲得菌體懸浮液。
3.根據權利要求1或2所述的一種大批量生產生物除草劑的方法，其特徵在於，上述固體培養的條件最好增加20W波長365nm黑光燈、日光燈或紫外光燈間隙照射。
4.根據權利要求1或2所述的一種大批量生產生物除草劑的方法，其特徵在於，上述液體培養基和固體培養基的農副產品原料為工業下腳料的農副基礎產品，包括黃豆粉、麥麩、米糠、釀造酵母(酒釀渣)、亞麻子餅粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、豆渣、豆粕、豆餅粉、玉米澱粉、豆餅粉、甘薯粉、花生粉、棉子餅、花生殼、玉米蛋白及多種魚粉等多種農副產品，以及多種樹木的鋸末屑。
5.根據權利要求3所述的一種大批量生產生物除草劑的方法，其特徵在於，上述液體培養基和固體培養基的農副產品原料為工業下腳料的農副基礎產品，包括黃豆粉、麥麩、米糠、釀造酵母(酒釀渣)、亞麻子餅粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、豆渣、豆粕、豆餅粉、玉米澱粉、豆餅粉、甘薯粉、花生粉、棉子餅、花生殼、玉米蛋白及多種魚粉等多種農副產品，以及多種樹木的鋸末屑。
全文摘要
本發明為一種大批量生產生物除草劑的方法，屬於微生物應用於農業植物保護領域。生物除草劑，真菌菌株膠孢炭疽菌(QZ－97a)、紫莖澤蘭鏈格孢、馬唐雙曲孢黴屬菌株以及百日草鏈格孢等通過液體－固體聯合發酵的方法可以大批量生產獲得。液體發酵及固體發酵的培養基利用的是工業下腳料的農副基礎產品，原料來源廣泛，價格低廉。適宜的起始含水量，有助於菌體從培養基中獲得營養物質和氧的傳遞，轉化率高。固體發酵的溫度範圍較寬，光照條件也很容易滿足。整個培養過程簡單，可操作性強，並不需要特殊的設備，是一種簡便大批量生產生物除草劑的方法。
文檔編號A01N63/00GK1486613SQ0313232
公開日2004年4月7日 申請日期2003年8月14日 優先權日2003年8月14日
發明者強勝, 朱秦, 朱雲枝, 徐春鳳, 安傳福, 宋小玲, 戴寶江, 蔡建國, 強 勝 申請人:南京農業大學, 南通江山農藥化工股份有限公司