基於ercc1表達確定化療方案的方法

2023-09-20 15:09:10 2

專利名稱：基於ercc1表達確定化療方案的方法
技術領域：
本發明涉及有效用於醫學，特別是癌症化療中的預測方法。更特別是，本發明涉及評估患者中的腫瘤細胞的基因表達。通過檢測人類中參與DNA修復的基因表達的mRNA，測定用靶定於DNA的化療劑，特別是以鉑製劑的方式破壞DNA的試劑治療的患者的存活。
背景技術：
當正常細胞經歷致癌性轉化並成為惡性細胞時癌症發生。轉化的(惡性)細胞逃離可規定細胞表型並抑制細胞增殖的正常生理控制。個體機體中的轉化細胞因此增殖，形成腫瘤。當發現腫瘤時，臨床目標是選擇性地破壞惡性細胞，同時減輕在個體進行治療過程中對正常細胞的任何損害。
化療方案是以對癌細胞具有選擇毒性(細胞毒性)的藥物的使用為基礎的。人們已經研製出了很多類化療藥物，包括幹擾核酸合成，蛋白合成，及其它重要代謝過程的藥物。這些通常被稱作抗代謝藥物。其它類的化療藥物是損害細胞的DNA。這些類藥物通常被稱作是基因毒性的。然而，個體腫瘤對預期化療藥物或藥物聯合的敏感性常常只能在治療的試驗期之後才能準確地測定。在不成功試驗期投入的時間會在臨床處理侵入性惡性腫瘤時造成重大的危險。
對細胞DNA損傷的修復是由細胞的酶促DNA修復機制進行的一種重要生物過程。細胞基因組中的未修復病變可以阻礙DNA複製，損害新合成DNA的複製保真性和/或阻礙細胞存活所需基因的表達。因此，一般認為基因毒性藥物對涉及DNA合成的活躍分裂的細胞比對靜止、不分裂的細胞毒性更強。然而，許多機體組織的正常細胞更靜止，並且不經常重新進入細胞周期和分裂。細胞分裂的各輪之間的時間更長，因此提供給由化療基因毒性導致的正常細胞中DNA破壞的修復。因此，殺滅癌細胞達到了一定的選擇性。許多治療方案中嘗試通過屬於兩種或更多這些類的化療藥的共同給藥而改進選擇性。
因為對實體瘤進行有效的化療通常需要聯合給藥，而對每種單一藥物的敏感性或抗性決定因素的鑑定和測量成為設計個體聯合化療的重要工具。
已經發現損害細胞DNA的廣泛使用的兩種基因毒性抗癌是順鉑(DDP)和卡鉑。目前順鉑和/或卡鉑用於治療選定的、各種上皮和間質來源的腫瘤，包括呼吸道、胃腸道和生殖道、中樞神經系統的癌和肉瘤，以及頭和頸的鱗狀細胞癌。順鉑和其它試劑的聯合目前優選用於睪丸癌的控制，在許多情況下產生持續的緩解(Loehrer等，1984，100 Ann.Int.Med.704)。順鉑(DDP)通過形成鏈內加合物而破壞DNA結構。DDP等鉑製劑的抗性是由於對鉑加合物的耐受、藥物積聚減少、或DNA修復增加。儘管對DDP的抗性是多因素的，DNA修復機制的的改變可能起了重要作用。大的DNA加合物，如鉑製劑形成的加合物的切除修復似乎由參與DNA破壞識別和切除的基因介導。Cleaver等，Carcinogenesis 11875-882(1990)；Hoeijmaker s等，CancerCells 2311-320(1990)；Shivji等，Cell 69367-374(1992)。實際上，在酶促DNA修復機制的一個或多個元件中具有遺傳缺陷的細胞對順鉑極為敏感。Fraval等(1978)，51 Mutat.Res.121，Beck和Brubaker(1973)，116 J.Bacteriol 1247。
切除修復交叉互補(ERCC1)基因在DNA加合物的修復中是關鍵的。已經克隆了人ERCC1。Westerveld等，Nature(London)310425-428(1984)；Tanka等，Nature 34873-76(1990)；(編號XM-009432，在此引入作為參考，SEO ID NO10)。一些研究使用了該基因缺陷的突變人和倉鼠細胞系，並且人腫瘤組織的研究表明，由ERCC1編碼的產物參與鉑-DNA加合物的切除修復。Dabholkar等，J.Natl.Cancer Inst.841512-1517(1992)；Dijt等，Cancer Res.486058-6062(1998)；Hansson等，Nucleic Acids Res.1835-40(1990)。
當轉染到DNA修復缺陷的CHO細胞中時，ERCC1通過其修復鉑-DNA加合物的能力賦予了對基於鉑的化療的細胞抗性。Hansson等，Nucleic Acids Res1835-40(1990)。目前接受的切除修復模型表明，破壞識別/切除是切除修復過程的限速步驟。
已經檢測了接受基於鉑的化療的癌症患者的惡性細胞中ERCC1等切除修復基因表達的相對水平。Dabholkar等，J.Natl.Cancer Inst.841512-1517(1992)。已經報導，用順鉑(DDP)/氟尿嘧啶化療方案治療時，胃癌患者中ERCC1的過量表達對腫瘤反應和最終存活率具有負影響(Metzger等，J Clin Oncl 16309，1998)。最近的證據表明，吉西他濱(Gem)可以調節ERCC 1核苷酸切除修復(NER)活性。因此，ERCC1表達的腫瘤內水平可以是確定DDP和GEM是否可以有效治療癌症的主要預後因素。
絕大多數患者的病理樣品都是按常規固定且用石蠟包埋的(FPE)，然後用於組織學分析及隨後的存檔。因此，絕大多數活檢組織樣品都不能用於基因表達的分析，這是因為這種研究需要高度完整的RNA，才能進行基因表達的準確測量。目前，基因表達水平只能通過免疫組織化學染色在這種固定且包埋的樣品中定量監測，從而監測蛋白表達水平。
迄今為止，包括ERCC1和TS表達的定量基因表達研究都限於來自於新鮮和冷凍組織的RNA的逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增。Reed等的美國專利5,705336公開了定量卵巢腫瘤組織中的ERCC1mRNA並確定該組織是否對基於鉑的化療敏感的方法。如Leichman等，Reed等的文章中所描述，定量冷凍腫瘤活檢物的mRNA。
由健康護理專業人員使用冷凍組織具有相當大的不便。在設計任何一種基於RNA的定量遺傳標記測定法時，迅速遞送活檢樣品，以避免組織及後來的mRNA降解是首先要考慮的。進行活檢的健康護理專業人員必須把組織樣品迅速遞送到所裝備的設備上，從而在收到組織樣品後立即進行RNA提取。如果沒有這種設備，臨床醫師必須迅速將樣品冷凍，從而防止mRNA降解。為了在組織和RNA降解之前使用診斷設備進行有效的RNA提取，組織樣品必須保持冷凍，直到它到達診斷設備，但可以位於較遠處。在轉移過程中，可使用帶有液氮和乾冰的專用設備維持冷凍組織的完整性，但花費較高。
常規的活檢樣品通常含有基質和腫瘤組織的不均一混合物。與新鮮或冷凍組織不同，FPE活檢組織樣品可很容易地被顯微解剖，分成基質和腫瘤組織，因此優於使用新鮮或冷凍組織。而RNA從固定組織，特別是固定且石蠟包埋組織中的分離會產生高度降解的RNA，這通常被認為不適於基因表達的研究。
現在有很多從生物樣品中純化RNA的技術，但還沒有一種可靠的從FPE樣品中分離RNA的方法。例如，Chomczynski(美國專利US5,346,994)描述了一種從組織中純化RNA的方法，它是以液相分離為基礎，使用苯酚和異硫氰酸胍進行的。在苯酚和異硫氰酸胍的水溶液中勻化生物樣品，然後將勻漿與氯仿混合。離心後，勻漿分成有機相，中間相和水相。蛋白螯合在有機相中，DNA在中間相中，RNA在水相中。RNA可從水相中沉澱出來。不幸的是，該方法不適於固定且石蠟包埋的(FPE)組織樣品。
分離RNA的其它已知技術通常是利用胍鹽或苯酚提取，如Sambrook，J.等，(1989)pp.7.3-7.24，和Ausubel，F.M.等，(1994)pp.4.0.3-4.4.7中實施例所述。同樣，在從石蠟包埋的組織樣品中分離RNA方面，還沒有一種已知方法能夠提供可再現的測量結果。
因此，特別需要一種從石蠟包埋組織中分離RNA的技術，從而研究腫瘤組織中的基因表達，然後將某些受體或酶的表達水平用於測定特定療法成功的可能性或適合性。
需要一種定量石蠟包埋的組織中ERCC1 mRNA的方法，以便提供基因毒性癌症治療的早期預後。因此，本領域中還沒有成功獲得在固定和石蠟包埋(FPE)組織中定量ERCC1表達的方法。因此，本發明的目的是提供一種通過檢測患者腫瘤細胞中的ERCC1 mRNA量並且將其與預定的域表達水平進行比較，從而評估固定並且石蠟包埋(FPE)組織中ERCC1水平，並且預測患者腫瘤對DNA破壞試劑的治療的可能抗性，確立由DNA鉑製劑引起的DNA損傷類型的方法。
發明概述本發明一方面提供一種評估固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤細胞中ERCC1 mRNA表達水平的方法。
本發明另一方面提供一種測量固定且石蠟包埋(FPE)的組織樣品中相對於內部對照的ERCC1 mRNA表達量的方法。該方法包括分離所述樣品的總mRNA，並測定相對於內部對照基因的mRNA量的ERCC1 mRNA的量。
在本發明這方面的其中一個實施方案中，提供具有ERCC1-504F(SEQ ID NO1)或ERCC1-574R(SEQ ID NO2)序列和具有基本上與其相同序列的寡核苷酸引物。本發明還提供這樣一種寡核苷酸引物，其序列在嚴格條件下可與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或它們的互補序列雜交。
本發明另一方面提供一種確定患者的化療方案的方法，包括從固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中分離RNA；測定樣品中ERCC1的基因表達水平；把ERCC1基因表達水平與ERCC1基因的預定閾水平進行比較；根據ERCC1基因表達水平和預定閾水平的比較結果確定化療方案。
本發明還涉及一種標準化組織樣品中相對於內部對照基因的ERCC1的未校正基因表達(UGE)的方法，其中所述組織樣品是使用TaqMan技術分析的，所述方法是通過利用pre-TaqMan技術，相對於樣品的內部對照，對已知的ERCC1表達水平進行分析而進行的。


圖1表示接受順鉑/Gem治療的患者的總體存活與NSCLC中校正的相對ERCC1表達。校正的相對ERCC1表達水平低於域值6.7×10-3的患者具有顯著更優的存活。而校正的相對ERCC1表達水平高於域值6.7×10-3的患者具有顯著更差的存活(P＝0.009，對數秩檢驗)。
圖2是舉例說明如何計算相對於內部對照基因的ERCC1表達的圖表。所述圖表包括用兩種試驗樣品獲得的數據，(未知1和2)，並舉例說明如何測定未校正基因的表達數據(UGE)。該圖表還舉例說明了如何利用通過pre-TaqMan技術測定的已知相對ERCC1值，標準化TaqMan儀器所產生的UGE。這是通過用UGE乘以校正因子KERCC1完成的。圖中的內部對照基因是β-肌動蛋白，校準RNA是人肝總RNA(Stratagene，目錄號735017)。
圖3是表示研究中的56名患者的腫瘤分期和細胞類型的人群統計詳細內容。接受的治療周期的中值數為3(範圍1-6)。14名患者(25％)以前接受過化療，大多數(9名)採用單獨的紫杉烷治療或與DDP或卡鉑聯合。56名患者中的3名接受放療，5名患者進行原發腫瘤的外科切除。
圖4表示校正的ERCC1表達水平低於域值的患者與校正的ERCC1表達水平高於域值的患者的20.4周(95％C.I.6.9，33.9周)相比，具有顯著更長的中值存活，即61.6周(95％ C.I.42.4，80.7周)。對腫瘤周期進行校正後，低或高ERCC1表達和總體存活之間的關聯的對數秩統計量為3.97，P值為0.046。圖中顯示了未校正的對數秩結果。也顯示了在使用Kaplan Meier生存曲線和對數秩檢驗進行的單變量分析中與總體存活顯著相關的因素。這些因素是預治療體重減輕的存在和ECOG狀態。患者年齡(P＝0.18)、性別(P＝0.87)、腫瘤分期(P＝0.99)、腫瘤細胞類型(P＝0.63)和胸膜滲出的存在(P＝0.71)不是總體存活的顯著預後因素。校正的相對ERCC1表達水平、ECOG表現狀態和體重減輕在Cox危險比回歸模型多變量分析中仍然是存活的顯著預後因素。對腫瘤分析進行分層的Cox回歸模型的P值是0.038，體重減輕為0.017，ECOG表現狀態為0.02(PS 0與1或2)。
發明詳述本發明部分依賴於腫瘤中ERCC1 mRNA的量與用DNA鉑製劑治療的患者的存活相關的發現。表達高水平ERCC1 mRNA的腫瘤被認為可能對基於鉑的化療具有抗性，具有更低的存活水平。相反，表達低水平ERCC1mRNA的那些腫瘤可能對基於鉑的化療敏感並具有更高水平的存活。患者腫瘤的ERCC1 mRNA相對表達是通過把它與預定的閾表達水平進行比較而確定的。
本發明提供一種測量固定且石蠟包埋(FPE)的組織中，ERCC1 mRNA相對於內部對照基因表達的表達量的方法。本發明人已經開發了可準確評估固定且包埋組織中的ERCC1表達的寡核苷酸引物。本發明的寡核苷酸引物，ERCC1-504F(SEQ ID NO1)，ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或基本上與其相同的寡核苷酸引物，優選與從固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中提取出來的RNA一起使用。然後可將ERCC1基因表達的這種測量值用於預測基於鉑的化療。
本發明的該實施方案包括，第一，一種確實可靠的，從FPE樣品中提取RNA的方法，第二，通過使用一對寡核苷酸引物，使用逆轉錄酶聚合酶鏈式反應測定樣品中ERCC1 mRNA含量的方法，其中優選寡核苷酸引物對ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或基本上與其相同的寡核苷酸。RNA是通過1999年12月20日提交的美國專利申請09/469,338中描述的任意mRNA分離的方法從FPE細胞中提取的，該專利申請在此引用作為參考。
本發明的方法適用於患者的任意組織類型。對於檢驗腫瘤組織的抗性，優選檢驗腫瘤組織。在優選實施方案中，檢驗得到腫瘤組織的患者的一部分正常組織。然後可以用更高量的化療組合物治療那些預計正常組織對基於鉑的化療化合物具有抗性，即表現出高水平ERCC1基因表達，但預計腫瘤組織對所述化合物敏感，即表現出低水平ERCC1基因表達的患者。
可以用更高量的化療組合物治療ERCC1基因表達水平低於域水平的患者，因為預計他們比腫瘤表達高於域水平的ERCC1基因的患者具有更好的存活。或者，醫生可以確定，腫瘤表達高於域水平的ERCC1基因的患者可能不會從化療中得到任何顯著優點，因為他們的預計存活很低。
本發明的方法適用於各種腫瘤類型。它可製備個體「腫瘤表達分布」，由此在個體患者的樣品中測定ERCC1的表達水平，並預測對各種化療的反應。優選，本發明的方法適用於實體瘤，最優選非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤。對於將本發明的一些實施方案用於特定的腫瘤類型，優選證明ERCC1基因表達水平與存活力之間的關係，這是通過編輯在特定ERCC1表達和對基於鉑的化療的臨床抗性之間建立聯繫的數據組而進行的。
此處定義的ERCC1表達的「預定閾水平」是一種校正的ERCC1腫瘤表達相對水平，當高於此水平時，腫瘤可能對基於鉑的化療方案有抗性。表達水平低於該域值的腫瘤可能對基於鉑的化療方案敏感。表示為ERCC1β-肌動蛋白之比的相對ERCC1表達在反應於基於鉑的化療方案的腫瘤中的範圍為低於約6.7×10-3。不反應於基於鉑的化療方案的腫瘤中表示為ERCC1β-肌動蛋白之比的相對ERCC1表達範圍為高於約6.7×10-3。見實施例4。
「預定閾水平」進一步定義為腫瘤的校正的相對ERCC1表達水平，當高於此水平時，接受基於鉑的化療方案的患者可能存活率低。當接受基於鉑的化療方案的患者中腫瘤的校正的相對ERCC1表達水平低於此域水平時，與高患者存活率相關。表示為ERCC1β-肌動蛋白之比的域校正相對ERCC1表達為約6.7×10-3。圖1，見實施例4。然而，本發明不限於用β-肌動蛋白作為內部對照。
在進行本發明該實施方案的方法時，優選分離患者的腫瘤細胞。實體或淋巴瘤或其一部分是通過手術從患者切除下來的，或通過常規的活檢獲得。從冷凍或新鮮腫瘤樣品中分離出來的RNA是通過本領域任何一種典型的方法從細胞中提取出來的，例如Sambrook，Fischer和Maniatis，MolecularCloning，alaboratorymanual，(2nded.)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，(1989)。優選在提取過程中，注意避免RNA降解。
然而，患者的組織在活檢後常常被固定，例如，通常用福馬林(甲醛)或gluteraldehyde固定，或用醇浸漬。通常是使固定的生物樣品脫水，並將其包埋在石蠟或本領域那些技術人員已知的其它固體支持物中。見Plenat等，AnnPathol2001Jan；21(1)29-47。沒有包埋的固定組織及固定且包埋的組織都可用於本發明的方法中。將包埋固定組織的固體支持物設計為可用有機溶劑除去，隨後使保存的組織再水合。
RNA是通過1999年12月20日提交的美國專利申請US09/469,338中描述的任何一種方法從FPE細胞中提取出來的，所述專利申請全部引入此處作為參考。此處所述固定且石蠟包埋(FPE)的組織是指可儲存或存檔的組織樣品。RNA可從存檔的病理樣品或活檢樣品中分離出來，其首先脫石蠟。代表性的脫石蠟方法包括用有機溶劑，如二甲苯洗滌石蠟包埋的樣品。脫石蠟樣品還可用低級醇的水溶液再水合。適宜的低級醇包括，例如甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。脫石蠟樣品可用逐漸降低濃度的低級醇溶液連續洗滌而再水合。可選擇地，樣品可同時脫石蠟和再水合。然後提取樣品中的RNA。
為了提取RNA，可利用機械，聲波或其它勻化工具勻化固定或固定且脫石蠟的樣品。再水合的樣品可在含有離液劑，如硫氰酸胍(也可作為異硫氰酸胍銷售)的溶液中勻化。將離液溶液中的勻化樣品加熱至約50-約100℃，所述離液溶液含有有效量的離液劑，如胍化合物。優選的離液劑是硫氰酸胍。
「有效濃度的離液劑」的選擇是指從石蠟包埋的樣品中純化的RNA量比沒有離液劑情況下分離出來的RNA量高大約10倍。離液劑包括，如，胍化合物，脲，甲醯胺，碘化鉀，硫氰酸鉀及類似的化合物。本發明方法的優選離液劑是胍化合物，如異硫氰酸胍(也作為硫氰酸胍銷售)和鹽酸胍。很多陰平衡離子都是有用的，本領域的技術人員可用這種適宜的陰離子製備多種胍鹽。本發明所用胍溶液的有效濃度通常約為1-5M，優選約4M。如果RNA已存在於溶液中，那麼胍溶液的濃度可以更高，這樣，樣品中獲得的最終濃度約為1-5M。優選用適當的生化緩衝液，如Tris-HCl把胍溶液緩衝至pH約3-6，更優選約4。離液溶液還可含有還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)和β-巰基乙醇(BME)。離液溶液還可含有RNA酶抑制劑。
將離液溶液中的勻化樣品加熱至約50-約100℃，所述離液溶液含有有效量的離液劑，如胍化合物。優選的離液劑是硫氰酸胍。
然後通過苯酚-氯仿萃取，離子交換色譜或大小排阻色譜回收離液溶液中的RNA。然後，利用提取，電泳，層析，沉澱技術或其它適宜技術進一步純化RNA。
ERCC1 mRNA的定量優選使用本領域常用的逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)進行，其中所述ERCC1 mRNA來源於新鮮，冷凍，或固定組織的純化總mRNA。定量ERCC1 mRNA的其它方法包括，例如，使用多重PCR中所用的分子指標和其它標記探針。此外，本發明還利用沒有PCR的系統測量ERCC1的mRNA，其中沒有PCR的系統使用的是與Invader測定(ThirdWave Technologies，Inc.)中使用的探針相似的螢光標記探針。最優選，ERCC1cDNA及內部對照或管家基因(例如，β-肌動蛋白)的定量是利用基於螢光的實時檢測法(ABIPRISM7700或7900 Sequence Detection System[TaqMan]，AppliedBiosystems，FosterCity，CA.)或與Heid等(Genome Res 1996；6986-994)和Gibson等(Genome Res 1996；6995-1001)所述相似的系統進行的。ABI7700(TaqManInstrument)的輸出量是以Ct’s或「循環閾」表示的。使用TaqMan系統，樣品中具有較高數量靶分子的高水平表達基因產生一種信號，並且PCR循環(較低的Ct)比具有較少靶分子(較高的Ct)的低水平相對表達的基因要少。
此處所用「管家」基因或「內部對照」是任何一種組成型或全局型表達基因，它的存在可評估ERCC1 mRNA的水平。這種評估包括測定基因轉錄的總體組成型水平和RNA回收中變異的對照。「管家」基因或「內部對照」包括，但不限制於親環蛋白基因，β-肌動蛋白基因，轉鐵蛋白受體基因，GAPDH基因等。最優選內部對照基因是β-肌動蛋白基因，如Eads等，Cancer Research 1999；592302-2306所述。
RNA回收中變異的對照需要使用「校準RNA」。「校準RNA」可以是任何一種可得到的精確預定量的對照RNA。優選使用人肝總RNA(Stratagene，目錄號735017)。
此處所用「未校正基因表達(UGE)」是指由TaqMan儀器產生的相對於內部對照基因的ERCC1表達的數字輸出。用於確定UGE的公式在實施例3中表示，並用圖2樣品計算結果舉例說明。
本發明另一方面提供一種校準化未校正基因表達(UGE)值的方法，所述未校正基因表達(UGE)值是利用源於非-TaqMan技術的「已知相對基因表達」值，從TaqMan儀器獲得的。優選，已知源於非-TaqMan的相對ERCC1β-肌動蛋白表達值是用源於TaqMan的組織樣品ERCC1 UGE值標準化的。
此處所用「校正的相對ERCC1表達」是指標準化的ERCC1表達，UGE乘以ERCC1特異性校正因子(KERCC1)得到一個值，該值可與ERCC1相對於內部對照基因的已知表達水平範圍相比較。實施例3和圖2詳細說明了這些計算結果。這些數值可確定特定樣品的「校正相對ERCC1表達」是高於還是低於「預定閾」水平。相對於β-肌動蛋白水平的校正的相對ERCC1表達的預定域水平為約6.7×10-3。ERCC1，內部對照β-肌動蛋白和校準人肝總RNA(Stratagene，目錄號735017)的特異性KERCC1為1.54×10-3。
「已知的相對基因表達」值源於先前分析的組織樣品，且它是以靶基因的RT-PCR信號與組成型表達的內部對照基因(例如，β-肌動蛋白，GAPDH等)的比值為基礎的。優選這種組織樣品是用福馬林固定並用石蠟包埋(FPE)的樣品，RNA是按照實施例1描述的方案從它們之中提取出來的。為了測量相對於內部對照的基因表達，使用了本領域已知的標準定量RT-PCR技術。Pre-TaqMan技術PCR反應進行固定的循環數(即，30次)，並報告每份樣品的終點值。然後按照ERCC1表達與β-肌動蛋白表達的比值報導這些值。見Reed等的美國專利5,705,336。
除了β-肌動蛋白和/或不同於人肝總RNA(Stratagene，目錄號735017)的校準RNA之外，還可測定其它內部對照基因的KERCC1。為此，人們必須校準內部對照基因和校準RNA，其中已經測定了相對於特定內部對照基因ERCC1的表達水平(即，「已知的相對基因表達」)。優選這種組織樣品是福馬林固定且石蠟包埋的(FPE)樣品，RNA是按照實施例1和1999年12月20日提交的美國專利申請09/469,338描述的方案從它們之中提取出來的，該專利申請在此全文引入作為參考。這種測定可使用本領域熟知的標準pre-TaqMan定量RT-PCR技術進行。根據這種測定，這種樣品具有ERCC1的「已知相對基因表達」水平，可用於測定對實施例3所述的新內部對照和/或校準RNA特異的新KERCC1。
本發明的方法可適於各種組織和腫瘤類型，可用於評估患者的臨床治療，並作為各種癌症，包括乳腺癌，頭頸癌，肺癌，食管癌，結腸直腸癌等的診斷或預後工具。在優選實施方案中，本發明的方法適於非小細胞肺癌(NSCLC)的預後。
化療前治療腫瘤活檢樣品通常只對固定且石蠟包埋(FPE)的組織有效，這些組織通常只含有非常少量的不均一組織。這種FPE樣品可很容易經過顯微解剖，這樣就可測定沒有汙染非惡性基質組織的腫瘤組織中的ERCC1基因表達。此外，比較還可在活檢組織樣品內的非惡性基質組織和腫瘤組織間進行，因為這種樣品常常含有兩種類型的組織。
通常，與ERCC1基因的一個區側面連接的任何寡核苷酸對都可用於進行本發明的方法。在嚴格條件下與ERCC1基因的一個區雜交，用於本發明的引物可擴增20-1000個鹼基對，優選50-100個鹼基對，最優選少於100個鹼基對的產物。
本發明提供特異性的寡核苷酸引物對和與其基本上相同的寡核苷酸引物，可利用FPE組織精確評估ERCC1表達。優選寡核苷酸引物，ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1(SEQ ID NO2)，(此處也稱為寡核苷酸引物對ERCC1)和基本上與其相同的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1(SEQ ID NO2)顯示出對測量ERCC1 mRNA的水平特別有效，所述測量是使用通過任何一種mRNA分離方法從FPE細胞中提取出來的RNA進行的，如實施例1和1999年12月20日提交的美國專利申請09/469,338所述，該專利申請在此引入作為參考。
「基本上相同」的核酸是指在嚴格條件下與靶雜交的核酸，及適當比對時，與具有適當核苷酸插入和缺失的核酸相比較時，至少約60％，優選至少約70％，更優選至少約80％，優選至少約90％，更優選至少約95-98％的核苷酸相同的核酸片段，或它們的互補鏈。當選擇性高於特異性時，存在選擇性雜交。見，Kanehisa，NucleicAcidsRes.，12203-213(1984)。
本發明包括基本上相同的寡核苷酸，其在嚴格條件下(如此處所定義的)與ERCC1-504F(SEQ ID NO1)，其互補序列，或ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或其互補序列的核苷酸引物序列的全部或一部分雜交。
在嚴格的雜交條件下，只有高度互補的，即，與此處所定義的基本上相似的核酸序列才能進行雜交。優選，這種條件會阻礙20個連續核苷酸中有4個或更多錯配，更優選20個連續核苷酸中有2個或更多錯配，最優選20個相連核苷酸中有1個或更多錯配的核酸進行雜交。
核酸的雜交部分通常至少約為10個(例如，15個)核苷酸長。核酸進行雜交的部分與寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1)，其互補序列，或ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或其互補序列的全部或一部分序列至少約80％，優選至少約95％，或最優選至少約98％相同。
寡核苷酸引物與核酸樣品在嚴格條件下的雜交在下面規定。核酸雙鏈體或雜交體的穩定性是以解鏈溫度(Tm)表示的，它是探針從靶DNA解離下來的溫度。解鏈溫度可用於限定所需的嚴格條件。如果所要鑑定的序列與探針基本上相同，而不是相同，那麼它可首先用於確定最低溫度，在最低溫度時，只有使用特殊濃度的鹽(例如，SSC或SSPE)才能進行同源雜交。然後，假定1％錯配導致Tm降低1℃，那麼雜交反應的最終洗滌溫度因此降低(例如，如果找到與探針的同一性＞95％的序列，那麼最終的洗滌溫度降低5℃)。實際上，Tm在0.5℃-1.5℃/1％錯配之間變化。
嚴格條件包括約68℃時，在5xSSC/5xDenhart’s溶液/1.0％SDS中雜交，室溫時，在0.2xSSC/0.1％SDS中洗滌。中度的嚴格條件包括約42℃時，在3xSSC中洗滌。改變鹽濃度和溫度參數，可在引物和靶核酸之間獲得最佳的同一性水平。有關這種條件的其它指導可在本領域中很容易地得到，例如，Sambrook，Fischer和Maniatis，MolecularCloning，a laboratory manual，(2nded.)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NewYork，(1989)和F.M.Ausubel等編輯，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons(1994)。
此處公開的寡核苷酸引物能夠精確評估固定或固定且石蠟包埋的組織，及冷凍或新鮮組織中的ERCC1基因表達。FPE樣品的RNA比新鮮或冷凍組織的RNA更破碎。因此，本發明的方法適用於測定所有組織中的ERCC1基因表達，而先前不存在利用固定組織測定ERCC1基因表達的方法。
根據在腫瘤中表達的ERCC1 mRNA量的測量結果，本領域技術人員可以進行關於腫瘤對特定基因毒素的臨床抗性或接受特定基因毒素的患者的存活率的預後。基於鉑的化療或誘導相似類型的DNA破壞的化療優選是基因毒素。
基於鉑的化療導致DNA的「大加合物」，其中主要的作用是扭曲雙螺旋的三維構象。所述化合物可以單獨給藥，或與吉西他濱(Gem)或5-氟尿嘧啶(5-FU)聯合給藥。
基於鉑的基因毒性化療包括形成共價DNA加合物的重金屬配位化合物。一般地，這些重金屬與DNA共價結合，在恰當的部分形成順-1，2-鏈內二核苷酸加合物。一般地，這一類的代表有順-二氨合二氯鉑(II)(順鉑)，並且包括順-二氨合-(1，1-環丁烷二羧基)鉑(II)(卡鉑)，順-二氨合-(1，2-環己基)二氯鉑(II)，以及順-(1，2-乙二胺)二氯鉑(II)。鉑製劑包括前述代表性化合物的類似物或衍生物。
目前可以用鉑配位化合物控制的腫瘤包括睪丸、子宮內膜、宮頸、胃、鱗狀細胞、腎上腺皮質和小細胞肺癌，以及成髓細胞瘤和成神經細胞瘤。
反-二氨合二氯鉑(II)(反-DDP)在臨床上是無用的，這是因為認為它的DNA加合物迅速修復。用反-DDP作為化療劑可能將在未選擇的細胞中提供低毒性，在選擇的細胞中提供高相對毒性。在優選實施方案中，鉑化合物是順鉑。
許多化合物通常與基於鉑的化療劑一起給藥。例如，BEP(博萊黴素、依託泊苷產出、順鉑)用於睪丸癌，MVAC(氨甲喋呤、長春鹼、阿黴素、順鉑)用於膀胱癌，MVP(絲裂黴素C、長春鹼、順鉑)用於非小細胞肺癌治療。許多研究記錄了含有鉑的製劑之間的相互作用。例如，報導了可能包含在基於鉑的化療中的許多藥物的治療藥物協同性。對於該內容的最近的參考文獻的很少的一些例子如下Okamoto等，Urology 2001；57188-192；Tanaka等，Anticancer Research2001；21313-315；Slamon等，Seminars in Oncology2001；2813-19；Lidor等，Journal of Clinical Investigation1993；922440-2447；Leopold等，NCI Monographs 1987；99-104；Ohta等，Cancer Letters 2001；16239-48；van Moorsel等，BritishJornal of Cancer 1999；80981-990。
其它基因毒性劑是形成持續基因組損傷的那些，優選用於癌症的臨床控制中的化療劑。基因毒素誘導的DNA破壞的細胞修復速度，以及通過細胞分裂周期進行的細胞生長影響了基因毒素治療的結果。細胞基因組中未修復的損傷可以妨礙DNA複製，妨礙新合成的DNA的複製保真性或阻礙細胞存活所需基因的表達。因此，基因毒性劑的細胞毒性(導致細胞死亡的傾向)的一個決定因素是由其形成的基因組損傷對細胞修復的抗性。形成持續的基因組損傷，如保持在基因組中至少到細胞進行細胞周期的損傷的基因毒性劑，相對於形成瞬時的、容易修復的基因組損傷的試劑一般是更有效的細胞毒素。
一大類用於治療許多癌症並且受ERCC1表達水平影響的基因毒性化合物是DNA烷基化試劑以及DNA嵌入劑。補骨脂素是已知用於皮膚病如牛皮癬、白癜風、真菌感染的光化療中的基因毒性化合物。Harrison’s Principles of Internal Medicine，Part 2 CardinalManifestations of Disease，Ch.60(12thed.1991)。另一大類基因毒性化合物，包括合成和天然來源的抗生素，其成員可以烷基化或嵌入DNA。此處特別關注的是抗腫瘤性抗生素，包括但不限於由以下化合物代表的各類化合物安沙可林；放線菌素A，C，D(也稱作更生黴素)或F(或KS4)；氮絲氨酸；博萊黴素；卡美諾黴素(洋紅黴素)；柔紅黴素(紅比黴素)或14-羥基柔紅黴素(阿黴素或羥基紅比黴素)；絲裂黴素A，B或C；米託恩醌；plicamycin(光輝黴素)等。
另一大類常用的基因毒性劑是烷基化DNA的試劑，包括滷代乙基亞硝基脲，特別是氯乙基亞硝基脲。該大類的代表性成員包括卡氮芥、氯脲菌素、福替目丁、羅氮芥、尼氮芥、雷尼氮芥和鏈脲黴素。滷代乙基亞硝基脲試劑也可以是上述任意代表性化合物的類似物或衍生物。
另一大類基因毒性劑包括硫和氮芥，其成員烷基化DNA。這些化合物主要通過在鳥嘌呤的N7氮形成共價加合物而破壞DNA。該大類的代表性成員包括Chlorambucil，環磷醯胺，異環磷醯胺，美法蘭，methloroethamine，新氮芥，氯乙環磷醯胺等。如果需要選擇一個或多個預定的基因組靶作為基因組損傷的位點，也可以使用與選定細胞的基因組中的特定序列共價或非共價相互作用的寡核苷酸或其類似物作為基因毒性劑。
另一類試劑包括氮丙啶和甲基蜜胺類，其成員烷基化DNA。這些類包括，例如六甲基蜜胺，三亞乙基磷醯胺(TEPA)，三乙基硫代磷醯胺(硫代TEPA)。
其它類的DNA烷基化試劑包括磺酸烷基酯，代表為白消安；azinidines，代表為苄替哌；以及其它，代表為，例如丙米腙，米託恩醌和甲基苄肼。這些類都包括代表性化合物的類似物和衍生物。
上面描述了本發明，本發明的實際操作是通過下面給出的實驗性實施例舉例說明的。技術人員應認識到說明實施例中使用的材料和方法可以各種方式進行改進。這種改進也被認為落在本發明的範圍之內。
實施例實施例1從FPE組織中分離RNARNA是通過下列一般過程從石蠟包埋組織中提取出來的。
A.切片的脫石蠟和水合(1)把約10μM的切片的一部分放在1.5mL塑料離心管中。
(2)加入600μL二甲苯，室溫(約20-25℃)用力振搖混合物約10分鐘。
(3)室溫時，以臺式離心機的最大速度(約10-20,000xg)將樣品離心約7分鐘。
(4)重複步驟2和3，直到絕大部分石蠟溶解。根據原始樣品部分所含的石蠟量，通常需要重複2次或更多次。
(5)用低級醇，優選用100％乙醇(約600μL)用力振搖約3分鐘，除去二甲苯溶液。
(6)按照步驟(3)將試管離心約7分鐘。傾出並棄去上清液。顆粒狀物變為白色。
(7)用更稀釋的乙醇溶液首先用約95％乙醇，然後用約80％乙醇，最後用約70％乙醇連續重複步驟5和6。
(8)按照步驟(3)，室溫將樣品離心7分鐘。棄去上清液，室溫乾燥顆粒狀物約5分鐘。
B.用苯酚-氯仿分離RNA(1)加入400μL含0.5％肌氨酸的異硫氰酸胍溶液和8μL二硫蘇糖醇。
(2)然後用組織勻漿器(Ultra-Turrax，IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)勻化樣品約2-3分鐘，速度從低速(速度1)到高速(速度5)逐漸升高。
(3)然後將樣品在大約95℃時加熱約5-20分鐘。優選在加熱到95℃之前，用細針刺入含樣品的試管的管帽。可選擇地，管帽可用塑料夾子或實驗用薄膜固定。
(4)然後用pH4.0的50μL 2M醋酸鈉和600μL苯酚/氯仿/異戊醇(10∶1.93∶0.036)萃取樣品，其中苯酚/氯仿/異戊醇(10∶1.93∶0.036)是用18mL苯酚和3.6mL 1∶49的異戊醇∶氯仿溶液新製備的。用力振搖溶液約10秒，然後在冰上冷卻約15分鐘。
(5)以最大速度將溶液離心約7分鐘。將上層的(水)相轉移到一個新的試管中。
(6)-20℃時，用約10μL糖原和400μL異丙醇沉澱RNA30分鐘。
(7)通過在臺式離心機中以最大速度離心約7分鐘，而使RNA成為顆粒狀物；傾出並棄去上清液；用大約500μL約70-75％的乙醇洗滌顆粒狀物。
(8)以最大速度將樣品再次離心7分鐘。棄去上清液，並將顆粒狀物風乾。然後將顆粒狀物溶解在適宜的緩衝液中，用於進一步的實驗(例如，50pL 5mM Tris氯化物，pH8.0)。
實施例2mRNA的逆轉錄和PCR
逆轉錄如實施例1中舉例說明和1999年12月20日提交的美國專利申請US09/469,338中的描述(全文引入此處作為參考)，RNA是從顯微解剖或非-顯微解剖的福馬林固定的石蠟包埋(FPE)組織中分離出來的。用乙醇沉澱並離心後，將RNA顆粒狀物溶解在50μL pH8.0的5mM Tris/Cl中。M-MLV逆轉錄酶可延伸一種寡核苷酸引物，其在脫氧核苷酸存在的情況下與單鏈RNA或DNA模板雜交，產生互補鏈。所得RNA是用來源於Life Technologies的M-MLV逆轉錄酶和隨機的六聚體逆轉錄的。逆轉錄是通過把25μLRNA溶液與25.5μL「逆轉錄混合物」混合進行的(見下面)。將反應物放在熱循環儀中，26℃時8分鐘(用於使隨機的六聚體與RNA結合)，42℃時45分鐘(用於M-MLV逆轉錄酶促反應)，95℃時5分鐘(用於DNA酶的熱滅活)。
「逆轉錄混合物」由以下成分組成10μl 5X緩衝液(250mMTris-HCl，pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，0.5μl隨機的六聚體(50O.D.溶解在550μl，pH7.5的10mM Tris-HCl中)，5μl 10mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)，5μl 0.1M DTT，1.25μl BSA(在pH7.5的10mM Tris-HCL中為3mg/ml)，1.25μl RNAGuard24，800U/ml(RNA酶抑制劑)(目錄號27-0816，AmershamPharmacia)和2.5μl MMLV 200U/μl(Life Tech目錄號28025-02)。
反應組分的最終濃度是50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mMMgCl2，1.0mM dNTP，1.0mM DTT，0.00375mg/ml BSA，0.62U/μl RNAGuard和10U/μl MMLV。
mRNA表達的PCR定量。ERCC1 cDNA和內部對照或管家基因(例如β-肌動蛋白)cDNA的定量是使用Heid等，(Genome Res1996；6986-994)；Gibson等，(Genome Res1996；6995-1001)所述的基於螢光的實時檢測法(ABI PRISM 7700或7900序列檢測系統[TaqMan]，Applied Biosystems，FosterCity，CA.)進行的。簡言之，該方法使用一種雙重標記的產螢光TaqMan寡核苷酸探針，(ERCC1-530Tc(SEQ ID NO3)，Tm＝70℃)，其特異性地在正向和反向引物內退火。含反應混合物的加蓋孔內的雷射刺激引起3』猝滅劑染料(TAMRA)發射，直到探針在PCR延伸過程中被DNA聚合酶的5』-3』核酸酶活性裂解，引起5』報導染料(6FAM)的釋放。因此，擴增子的產生引起螢光信號的發射，這是通過TaqMan’sCCD(電荷耦合器件)檢測照相機檢測的，PCR反應純指數相內，閾循環所產生的信號量可反映目標序列的起始拷貝數。目標序列起始拷貝數與內部對照基因起始拷貝數的比較可提供相對基因表達水平。TaqMan分析了產率的水平，它是以兩個絕對測量值間的比值(目標基因/內部對照基因)表示的。
PCR反應混合物由以下成分組成0.5μl含有如上製備的cDNA的逆轉錄反應物，600nM各寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1，Tm＝59℃)和ERCC1-574R(SEQ ID NO2，Tm＝58℃)，200nM TaqMan探針(SEQ ID NO3)，5U AmpliTaq Gold聚合酶，200μM各dATP，dCTP，dGTP，400μM dTTP，5.5mMMgCl2，和含有參考染料的1xTaqman緩衝液A，最終的體積小於或等於25μl(所有試劑，AppliedBiosystems，FosterCity，CA)。循環條件是，95℃10分鐘，然後是95℃15秒和60℃1分鐘循環45次。用於定量內部對照基因β-肌動蛋白的寡核苷酸是β-肌動蛋白TaqMan探針(SEQ ID NO4)，β-肌動蛋白-592F(SEQ ID NO5)和β-肌動蛋白-651R(SEQ IDNO6)。
用於上述反應的寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1-574R(SEQ ID NO2)將擴增71bp的產物。
實施例3測定ERCC1的未校正基因表達(UGE)進行兩對平行反應。「試驗」反應和「校準」反應。圖7。ERCC1擴增反應和β-肌動蛋白內部對照擴增反應是試驗反應。單獨的ERCC1和β-肌動蛋白擴增反應是在校準RNA模板上進行的，被稱作校準反應。TaqMan儀器產生4個不同的循環閾(Ct)值試驗反應的CtERCC1和Ctβ-肌動蛋白，和校準反應的CtERCC1和Ctβ-肌動蛋白。兩種反應的Ct差值是根據下列公式確定的ΔCt試驗＝CtERCC1-Ctβ-肌動蛋白(「試驗」反應)ΔCt校準＝CtERCC1-Ctβ-肌動蛋白(「校準」反應)下一步是按照下列公式計算2的負ΔCt次方。
2-ΔCt試驗(「試驗」反應)2-ΔCt校準(「校準」反應)
為了從TaqMan儀器獲得ERCC1的未校正基因表達，進行了下列計算ERCC1的未校基因表達(UGE)＝2-ΔCt試驗/2-ΔCt校準用已知的相對ERCC1表達水平標準化UGE標準化的計算需要將UGE乘以對ERCC1和特定校準RNA特異的校正因子(KERCC1)。還可測定任何一種內部對照基因和任何一種精確預定量的校準RNA的校正因子KERCC1。優選，使用內部對照基因β-肌動蛋白和精確預定量的校準RNA，人肝總RNA(Stratagene，目錄號735017)。已知這些試劑的校正因子KERCC1等於1.54×10-3。
標準化是使用ΔCt方法的改進法進行的，所述ΔCt方法由Applied Biosystems，TaqMan製造商，在UserBulletin#2中和上文描述。為了進行該過程，使用上述TaqMan方法，分析了6個不同FPE試驗組織的UGE的ERCC1表達。使用內部對照基因β-肌動蛋白和校準RNA，人肝總RNA(Stratagene，目錄號735017)。
用各樣品AG221，AG222，AG252，成人肺，PC3，AdCol的已知相對ERCC1表達水平除以其相應的源於TaqMan的UGE，得到不平均的校正因子K。
K不平均的＝已知的值/UGE接下來，求全部K值的平均值，從而確定對ERCC1，校準RNA即Stratagene人肝總RNA(Stratagene，目錄號735017)和β-肌動蛋白特異的單一KERCC1校正因子。
因此，為了成規模地測定與pre-TaqManERCC1表達研究一致的，未知組織樣品中的校正相對ERCC1表達，人們只需用源於TaqMan儀器的未校正基因表達數據(UGE)乘以KERCC1特異性校正因子，前提是使用相同的內部對照基因和校準RNA。
校正的相對ERCC1表達＝UGE×KERCC1KERCC1可使用任何一種精確預定量的校準RNA或內部對照基因測定。未來來源的精確預定量RNA可按照上述方法，相對於樣品用已知的相對ERCC1表達校準或可相對於先前已經校準過的校準RNA，如上述人肝總RNA(Stratagene，目錄號735017)校準。
例如，如果隨後測定不同的內部對照基因和/或不同的校準RNA的KERCC1，則人們必須相對於組織樣品校準內部對照基因和校準RNA，其中已經測定了相對於特定內部對照基因的ERCC1表達水平。這種測定可使用本領域熟知的標準pre-TaqMan，定量RT-PCR技術進行。用這些樣品的已知表達水平除以它們相應的UGE水平，可確定樣品的K值。然後根據已知樣品數，求K值的平均值，從而測定對不同內部對照基因和/或校準RNA特異的新KERCC1。
實施例4所有患者參與前瞻性多中心三方案隨機試驗(GEPC/98-02，西班牙肺癌組III期順鉑/吉西他濱(CG)與順鉑/吉西他濱/長春瑞濱(CGV)與序貫雙重吉西他濱/長春瑞濱，然後是異環磷醯胺/長春瑞濱(GV/IV)，在晚期NSCLC中進行)中的順鉑/吉西他濱方案。所有患者每3周的第1、8天接受Gem 1250mg/m2，第1天加CDDP 100mg/m2。GECP/98-02的入選標準是可測量的IV期(如果無症狀，腦轉移者可入選)或IIIB期(惡性胸膜和/或心包滲出和/或鎖骨上腺體病變)NSCLC以及東方合作組(ECOG)表現評分0-2。所有患者在進入該研究前進行胸部X線檢查和胸部及上腹部計算機體層攝影(CT)掃描，並且至少6周進行一次重複評估。根據WHO標準將腫瘤反應評估為完全反應、部分反應、穩定疾病和進展性疾病。用同樣的成像方法建立基線腫瘤測量值。
總mRNA是從顯微解剖的FPE預處理腫瘤樣品中分離的，如實施例2和3的描述用定量RT-PCR測量校正的相對ERCC1表達。從樣品分離mRNA的方法描述於實施例1中和1999年12月20日提交的美國專利申請US09/469,338中的描述，在此全文引入此處作為參考。
統計學分析用Mann-Whitney U檢驗評估連續檢驗變量，校正的相對ERCC1表達和二分變量(患者性別、高於中值年齡和低於中值年齡的年齡、體重減輕的存在、胸膜滲出的存在、腫瘤分期)之間的顯著關聯。用Kruskal-Wailis檢驗方法檢驗多組內校正的相對ERCC1表達的顯著差異(ECOG表現狀態、組織病理學)。用Fisher精確檢驗分析分類的臨床病理值，包括反應和二分的校正的相對ERCC1表達值。
所有患者進行第一研究治療，直到死亡或直到檢查數據。Kaplan-Meier存活曲線和對數秩檢驗用於分析存活和無疾病存活的單變量分布。Miller和Sigmund(Miller等，Biometrics 381011-1016，1982)的最大卡方方法適於確定最有利於將患者二分成預後差和預後好(是否可能存活)的亞組的表達值，對數秩檢驗作為用於測量分組強度的統計方法。為了測定P值，其中所述P值被解釋為以最大卡方分析為基礎的相關強度的測量值，用1000引導指令樣刺激用於評估假設無關情況下的最大卡方統計量分布。(Biometrics 381017-1023，1982)。進行單變量分析中顯著的因素的Cox危險比模型分析，用於鑑定哪些因素可能對存活具有顯著影響。用SPSS 10.0.5版軟體(SPSSInc.Chicago I11.)進行所有的統計分析。所有P值都是雙側的。
校正的相對ERCC1表達水平ERCC1 mRNA表達在所有56個分析的樣品中都是可檢測的。相對於內部對照管家基因β-肌動蛋白的中值校正相對ERCC1表達為6.7×10-3(範圍0.8×10-3-24.6×10-3)。校正的相對ERCC1表達水平和以下任意因素年齡(P＝0.66)、性別(P＝0.18)、隨機化前6個月存在體重減輕(P＝0.74)、腫瘤分期(IIIB與IV，P＝0.39)、或胸膜滲出的存在(P＝0.25，均採用Mann-Whitney U檢驗)之間沒有顯著關聯。在具有不同的表現狀態分級(P＝0.48，Kruskal-Wallis檢驗)或不同的腫瘤類型(所有四種類型，P＝0.10，Kruskal-Wallis檢驗)的患者的校正的相對ERCC1表達水平之間沒有顯著差異，但SCC腫瘤的校正的相對ERCC1表達水平(中值8.6×10-3)與腺癌相比明顯更高(中值5.2×10-3，P＝0.015，Mann-Whitney檢驗)。
對化療的反應47名可評價反應的患者的腫瘤反應如圖3所示。總體反應率為44.7％。完全反應和部分反應，即「應答」腫瘤的校正的相對ERCC1表達水平(中值4.3×10-3，範圍1.2×10-3-24.6×10-3)與穩定疾病和進展疾病，即「無應答」腫瘤的水平(中值7.85×10-3，範圍0.8×10-3-24.3×10-3，P＝0.31，Mann-Whitney檢驗)無顯著差異。校正的相對ERCC1表達值高於和低於任何ERCC1水平的應答和無應答腫瘤的比例之間沒有顯著差異(所有都是Fisher精確檢驗)。具有低於域值的校正的相對ERCC1表達的腫瘤(「低表達」，52％應答者)中的反應率高於具有高於域值的校正的相對ERCC1表達的腫瘤(「高表達」，36.4％應答者，Fisher精確檢驗，P＝0.38)。
患者總體存活與校正的相對ERCC1表達水平之間的關聯中值總體存活時間為36.6周(範圍0-113.4周)，到進展的中值時間為24.4周(範圍0-102.9周)。用對數秩檢驗和最大卡方統計鑑定將患者分為預後差和預後好亞組的域校正相對ERCC1表達水平表明，判別值包括中值，因此將其用作存活分析的域值。因此，確定NSCLC的域校正相對ERCC1表達值為6.7×10-3。圖1表示腫瘤內校正相對ERCC1表達水平高於和低於域校正相對ERCC1表達水平的患者的Kaplan-Meier存活曲線。如圖4所示，具有低於域值的校正相對ERCC1表達水平的患者與具有高於域值的校正相對ERCC1表達水平的患者的20.4周(95％C.I.6.9，33.9周)相比，具有顯著更長的61.6周的中值存活(95％C.I.42.4，80.7周)。對腫瘤分期進行校正後，低或高校正相對ERCC1表達和總體存活之間的關聯的對數秩統計量為3.97，P值為0.046。未校正的對數秩結果如圖4所示。
檢驗了5.8×10-3的分離校正相對ERCC1表達域值，因為以前的研究表明，該值與胃癌患者的總體存活相關。(Metzger等，J Clin Oncol1998；16309-316)。在該研究中，校正相對ERCC1水平低於5.8×10-3的NSCLC患者組的總體存活顯著低於ERCC1水平高於5.8×10-3的患者(對數秩統計量6.37，P＝0.011)，但更高的6.7×10-3的校正相對ERCC1表達域水平是更強的判別因素。
其它在使用Kaplan Meier存活曲線和對數秩檢驗進行的單變量分析中與總體存活顯著相關的因素是治療期體重減輕和ECOG表現狀態(表2)。患者年齡(P＝0.18)、性別(P＝0.87)、腫瘤分期(P＝0.99)、腫瘤細胞類型(P＝0.63)和胸膜滲出的存在(P＝0.71)都不是總體存活的顯著預後因素。校正的相對ERCC1表達水平、ECOG表現狀態和體重減輕在Cox危險比回歸模型多變量分析中仍然是存活的顯著預後因素。對腫瘤分析進行分層的Cox回歸模型的P值是0.038，體重減輕為0.017，ECOG表現狀態為0.02(PS 0與1或2)。
該研究發現了用基於鉑的化療治療癌症患者後低ERCC1 mRNA表達水平與改進的存活之間的關聯。
序列表110K.D.達南伯格等120基於ERCC1和TS表達確定化療方案的方法13011220/145140待定141- -15009/877,0951512001-06-1115009/796,4911512001-03-021607170FastSEQ for Windows Version 4.0210121121212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4001gggaatttgg cgacgtaatt c21210221118212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4002gcggaggctg aggaacag18210321125212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4003cacaggtgct ctggcccagc acata25210421118212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4004accaccacgg ccgagcgg18210521118212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4005tgagcgcggc tacagctt18210621120212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4006tccttaatgt cacgcacgat 2021072111097212DNA213人(Homo sapiens)4007aagtgctgcg agccctgggc cacgctggcc gtgctggcag tgggccgcct cgatccctct 60gcagtctttc ccttgaggct ccaagaccag caggtgaggc ctcgcggcgc tgaaaccgtg 120aggcccggac cacaggctcc agatggaccc tgggaaggac aaagaggggg tgccccagcc 180ctcagggccg ccagcaagga agaaatttgt gatacccctc gacgaggatg aggtccctcc 240tggagtggcc aagcccttat tccgatctac acagagcctt cccactgtgg acacctcggc 300ccaggcggcc cctcagacct acgccgaata tgccatctca cagcctctgg aaggggctgg 360ggccacgtgc cccacagggt cagagcccct ggcaggagag acgcccaacc aggccctgaa 420acccggggca aaatccaaca gcatcattgt gagccctcgg cagaggggca atcccgtact 480gaagttcgtg cgcaacgtgc cctgggaatt tggcgacgta attcccgact atgtggcggg 540ccagagcacc tgtgccctgt tcctcagcct ccgctaccac aacctgcacc cagactacat 600ccatgggcgg ctgcagagcc tggggaagaa cttcgccttg cgggtcctgc ttgtccaggt 660ggatgtgaaa gatccccagc aggccctcaa ggagctggct aagatgtgta tcctggccga 720ctgcacattg atcctcgcct ggagccccga ggaagctggg cggtacctgg agacctacaa 780ggcctatgag cagaaaccag cggacctcct gatggagaag ctagagcagg acttcgtctc 840ccgggtgact gaatgtctga ccaccgtgaa gtcagtcaac aaaacggaca gtcagaccct 900cctgaccaca tttggatctc tggaacagct catcgscgca tcaagagaag atctggcctt 960atgcccaggc ctgggccctc agaaagcccg gaggctgttt gatgtcctgc acgagccctt 1020cttgaaagta ccctgatgac cccagctgcc aaggaaaccc ccagtgtaat aataaatcgt 1080cctcccaggc caggctc 109權利要求
1.一種確定用於治療患者腫瘤的基於鉑的化療方案的方法，所述方法包括(a)獲得腫瘤的組織樣品並固定樣品，以獲得固定的腫瘤樣品；(b)從固定的腫瘤樣品分離mRNA；(c)使用在嚴格條件下與ERCC1基因的一個區雜交的寡核苷酸引物對擴增mRNA，獲得擴增樣品；(d)測定擴增樣品中的ERCC1 mRNA的量；(e)比較步驟(d)的ERCC1 mRNA的量與內部對照基因的mRNA量；並且(f)基於擴增樣品中ERCC1 mRNA的量和ERCC1基因表達的預定域水平確定基於鉑的化療方案。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸引物由寡核苷酸引物對ERCC1，或基本上與其相同的寡核苷酸引物對組成。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述腫瘤是非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述ERCC1基因表達的閾水平是內部對照基因表達水平的約6.7×10-3倍。
5.一種用基於鉑的化療方案治療腫瘤的方法，包括(a)獲得腫瘤的組織樣品並固定樣品，以獲得固定的腫瘤樣品；(b)從固定的腫瘤樣品分離mRNA；(c)使用在嚴格條件下與ERCC1基因的一個區雜交的寡核苷酸引物對擴增mRNA，獲得擴增樣品；(d)測定擴增樣品中的ERCC1 mRNA的量；(e)比較步驟(d)的ERCC1 mRNA的量與內部對照基因的mRNA量；並且(f)當測定的ERCC1基因的基因表達水平低於預定域值時，提供包含基因毒性劑的基於鉑的化療方案。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述腫瘤是非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤。
7.根據權利要求5所述的方法，其中所述基因毒性劑是吉西他濱、順鉑或其聯合。
8.一種測定固定且石蠟包埋的組織樣品中ERCC1表達水平的方法，包括(a)將組織樣品脫石蠟，獲得脫石蠟的樣品；(b)在存在有效量離液劑的條件下，分離脫石蠟樣品的mRNA；(c)使用在嚴格條件下與ERCC1基因的一個區雜交的寡核苷酸引物對擴增mRNA，獲得擴增樣品；(d)測定相對於內部對照基因mRNA量的ERCC1 mRNA量。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述寡核苷酸引物對由寡核苷酸引物對ERCC1或基本上與其相似的寡核苷酸引物對組成。
10.根據權利要求8所述的方法，其中所述內部對照基因是β-肌動蛋白。
11.根據權利要求8所述的方法，其中mRNA的分離是通過下列步驟進行的(a)將含有有效濃度離液化合物的溶液中的組織樣品加熱至大約75℃-100℃，加熱約5-120分鐘；並且(b)回收離液溶液中的所述mRNA。
12.一種具有SEQ ID NO1序列的寡核苷酸引物或基本上與其相同的寡核苷酸。
13.一種具有SEQ ID NO2序列的寡核苷酸引物或基本上與其相同的寡核苷酸。
14.一種檢測ERCC1基因表達的試劑盒，其含有寡核苷酸對ERCC1或基本上與其相同的寡核苷酸對。
全文摘要
本發明涉及用於醫學，特別是癌症化療中的預測方法。本發明目的是提供一種通過檢測患者腫瘤細胞中ERCC1 mRNA的量，並把它預定閾表達水平進行比較，從而評價固定或固定且石蠟包埋的組織中ERCC1的表達水平，並確定基於鉑的化療的方法。更特別是，本發明提供寡核苷酸引物對ERCC1，及使用它們檢測ERCC1 mRNA水平的方法。
文檔編號C12N15/09GK1636069SQ01822442
公開日2005年7月6日 申請日期2001年11月29日 優先權日2000年12月1日
發明者K·D·達南伯格 申請人:應答遺傳公司