抗病性轉基因植物的製作方法

2023-09-20 17:46:05

專利名稱：抗病性轉基因植物的製作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及賦予植物抗病性的方法和材料。更具體地說，本發明涉及含有賦予抗病性，特別是抗傳染性病原體如病毒的異源核酸的轉基因植物。本發明還涉及製備這些轉基因植物的方法和材料。
栽培植物的傳染病造成全世界的食品、飼料和纖維大量減產。這些疾病的控制主要建立在培養實踐上，包括除去受感染的碎屑、消滅雜草宿主(使用除草劑)、防止載體傳染(使用殺蟲劑)、尋找無病原體原料(種子或無性繁殖體)和培育抗病性。大規模治療被病毒感染的植物的方法不存在。因此，疾病的控制依賴於預防或延遲感染形成的方法。
上述疾病控制方法中，因為培育抗病性對培育者不需要附加勞動或費用，因此它通常是最經濟且切實可行的方法之一。而且，控制抗病性不需要使用除草劑或殺蟲劑消滅雜草宿主和昆蟲載體。因此，宿主抗性是用於控制植物疾病中對環境最安全且持久的方法之一。不幸的是，在許多植物-病毒體系中，抗性不易獲得並且不能使用傳統植物育種策略獲得。然而，在分子生物學和基因工程中的最新進展已證實，將新型抗病因子整合到之前從未存在的植物-病毒體系中是有幫助的。
背景技術：
轉基因植物的開發已證實是一種防止植物遭受病毒病的有價值的策略。例如，Stubbs,G等人的美國專利US5723750描述了表達編碼不同病毒種群的野生型和經過修飾的外殼蛋白的基因的轉基因植物。已顯示這些轉基因植物具有不同水平的抗相應病毒感染抗性。不幸的是，編碼外殼蛋白的異源基因的表達不賦予廣譜抗病毒感染抗性並對其它傳染試劑引起的病理無效。
植物抗致病傳染性的重要機理為過敏反應(「HR」)。在該HR期間，對病原體的識別誘導快速細胞死亡過程，該過程導致圍繞感染部位形成死細胞區(壞死)。該HR病灶據信抑制病原體進一步擴散並產生激活宿主防禦機理的信號，並且在許多情況下誘導長期系統性的抗廣譜病原體的抗性(Ross,1961)。(在本說明書後面提供了參考書目。)這種系統抗性的誘導被稱為系統獲得抗性(SAR)並伴隨幾種病理相關(PR)的蛋白質的合成速度增加和水楊酸(SA)的累積增加(Malamy等人，1990；Metraux等人，1990；Ward等人，1991)。
還描述了在感染植物中誘導該HR的方法。例如，Lam,E.等人的US5629470描述了一種通過用細菌視蛋白(bO)基因轉化植物細胞提供具有對一種或多種植物病原體的致病性攻擊的抗性增強的高等植物的方法。
鑑於傳染病對農業生產的巨大經濟影響，因此一直存在對產生致病傳染抗性的轉基因植物的需要。
發明概述根據本發明，已發現，用黃瓜花葉病毒屬的2b基因或其活性片段穩定轉化的轉基因植物具有對致病感染因子如病毒的系統抗性。由該基因編碼的該蛋白質激活宿主植物中強的抗病性反應。
本發明另一方面涉及用黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段穩定轉化的轉基因植物的種子和繁殖部分。本發明還提供了將黃瓜花葉病毒屬2b基因引入植物的方法和載體。
附圖簡述

圖1描述了來自質粒pTMV-t2b和pPVX-t2b的嵌合病毒RNA轉錄物的結構特徵和基因組結構。
圖2為顯示該2b基因對致病相關蛋白質在用攜帶該2b基因的菸草花葉病毒感染的菸草植物葉中表達的影響的Northern印跡雜交。
發明詳述黃瓜花葉病毒(CMV)屬於稱為黃瓜花葉病毒的病毒屬，該屬還包括番茄無子病毒(TAV)。黃瓜花葉病毒屬含有編碼以下5個基因的三聯單鏈RNA基因組1a、2a、2b、3a和外殼蛋白。該2b基因的鑑定和功能分析已描述在以前出版物中(Ding等人，1994；1995；1996)。已證實，這些黃瓜花葉病毒屬編碼的該2b基因對系統性病毒擴散和毒力確定都是重要的。在SEQ ID NO.1中提供了該2b基因的核糖核苷酸序列。
已公開了，當該2b基因由黃瓜花葉病毒屬的基因組單獨地表達時，當受到致病病毒感染時它在許多植物種中激活強的抗性反應。這些反應包括誘導致病相關蛋白質並形成消除侵入病原體的壞死斑。因此，一方面，本發明涉及用可操縱地與啟動子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段穩定地轉化的轉基因植物，當所述植物被致病生物體感染時該啟動子能夠影響所述基因在所述植物中表達。用於生產抗病性植物的黃瓜花葉病毒屬2b基因優選為SEQ IDNO.1的核酸在嚴格條件下與其雜交的基因。
在一相關方面，本發明提供了使植物抗傳染性病原體引起的疾病的方法，該方法包括用操縱地與植物活性啟動子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段穩定地轉化該植物，當所述植物被致病生物體感染時該啟動子能夠實現所述基因在所述植物中表達。在另一方面，本發明提供了含有可操縱地與植物活性啟動子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段的表達載體。
突變分析已證實，該2b基因引起該抗性反應。已顯示該基因中的點突變使其失去功能並廢止該基因激活該抗性反應的能力。此外，儘管可以在不失活情況下將編碼這4個C-端胺基酸的密碼子除去，但是已發現該基因的C-端26個胺基酸和45個胺基酸序列對其抗病功能是必不可少的。將編碼番茄無子病毒2b基因的C-端26個胺基酸和C-端45個胺基酸的密碼子轉移到無活性黃瓜花葉病毒2b基因的相應區域不能產生活性嵌合基因；因此，該蛋白質的N-端部分還顯示含有一個或多個對抗性激活必不可少的結構域。進一步的常規基因圖譜實驗將證實該2b基因的活性結構域。因此，本發明涉及含有該2b基因活性片段的轉基因植物和載體。
可以使用常規載體和步驟將該2b基因或其活性片段(下文的「2b基因」)引入植物。通常，這些技術涉及將該2b基因插入含有用於轉錄和翻譯插入的編碼序列和一個或多個便於選擇轉化細胞或植物的標記序列所必需的元件的表達載體中。
在本領域中已知大量植物活性的啟動子，並且可以將它們用於實現本發明公開的核酸序列的表達。可以使用組成型啟動子，例如花椰菜花葉病毒的nos啟動子或35S啟動子；然而，組成型表達可能對轉基因植物有害。因此，優選可誘導的啟動子，特別是病原體可誘導的啟動子，如致病相關蛋白質啟動子。
一旦將該2b基因克隆到表達載體中，可以使用常規轉化步驟將其導入植物細胞中。術語「植物細胞」意指包含來自包括未分化組織如愈傷組織和懸浮培養物、以及植物種子、花粉或植物胚的植物的任意細胞。適宜轉化的植物組織包括葉組織、根組織、分生組織、原生質體、下胚軸、子葉、角質鱗片、苗端、根、未成熟胚、花粉和花葯。
用於轉化植物的一種技術是通過將這些植物的組織與用含有本發明的2b基因的載體轉化的細菌接種物接觸。通常該步驟涉及用細菌懸浮液接種植物組織並在沒有抗生素的再生培養基上在25-28℃下將該組織培養48-72小時。
可以優選使用來自農桿菌屬的細菌轉化植物細胞。這些細菌的適宜種包括根癌農桿菌和毛根農桿菌。由於根癌農桿菌(例如菌株LBA4404或EHA105)的眾所周知的轉化植物的能力，因此它特別有用。
用本發明的核酸轉化植物細胞的另一方法涉及將惰性或生物活性顆粒推入植物細胞中。該技術公開在授予Sanford等人的美國專利US4945050、5036006和5100792中，將它們加入本文作為參考。通常，該步驟涉及在有效地穿透細胞外表面並摻入其內部的條件下將惰性或生物活性顆粒推入細胞中。當使用惰性顆粒時，可以通過用含有2b基因的載體包被該顆粒將該載體導入該細胞中。還可以將生物活性顆粒(例如乾酵母細胞、幹細菌或噬菌體，各自含有經尋找待引入的DNA)推入植物細胞組織中。
轉化植物細胞的另一方法是電穿孔法。該方法涉及將原生質體和所需DNA混合併通過電脈衝在細胞膜上形成孔，從而將該DNA引入這些細胞中，因此轉化這些細胞。該方法目前具有高的再現性並且已通過該方法將不同基因引入單子葉植物，特別是水稻中(Toriyama等人，1988,Shimamoto等人，1989和Rhodes等人，1988)。
一種與電穿孔法相似的方法，它是將所需基因和原生質體混合併用聚乙二醇(「PEG」)處理該混合物，從而將該基因引入這些原生質體中。該方法與電穿孔法的不同之處在於使用PEG代替電脈衝(ZhangW.等人，1988,Datta等人，1990和Christou等人，1991)。
其它方法包括1)用核酸培養種子或胚(Topfer R.等人，1989,Ledoux等人，1974)、2)花粉管處理(Luo等人，1988)、3)脂質體法(Caboche,1990)和4)顯微注射法(Neuhaus G.等人，1987)。
可以使用由經過轉化的植物細胞再生植物的已知方法製備本發明的轉基因植物。通常，可以將外植體、愈傷組織或懸浮培養物暴露於適宜化學環境(例如細胞分裂素和生長素)中，這樣該新生長的細胞可以分化並產生胚，然後這些胚再生成根和莖。
在單子葉植物("monocots")和雙子葉植物("dicots")中，如玉米、小麥、水稻、粟、燕麥、大麥、高粱、向日葵、甘薯、苜蓿、甜菜、芥子、番茄、胡椒、大豆、菸草、甜瓜、南瓜、馬鈴薯、花生、豌豆、棉花或可可中，該2b基因在增強對致病病原體的抗性中都是有用的。
通過以下實施例進一步描述本發明，但不將其限制本發明。
實施例實施例1(載體構建)
近年來已開發出幾個基於植物RNA病毒的有效植物表達系統。將基於菸草花葉病毒(TMV)(US5589367)和馬鈴薯病毒X(PVX；Chapman等人，1992)的載體用於表達黃瓜花葉病毒屬的2b基因的這些工作。圖1顯示了構建的嵌合病毒(TMV-t2b和PVX-t2b)的結構特徵。通過使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)由pQCD2qt(Ding等人，1996)PCR擴增TAV ORF 2b編碼序列(RNA2中核苷酸2447-2734)製備TAV(SEQ ID NO.1，編碼95個胺基酸)的2b基因的編碼序列。將該序列插入TMV和PVX基因組中各自外殼蛋白(CP)基因的上遊。在稱為pTMV-30B的TMV載體的PmeI位點平端克隆該PCR片段，從而獲得TMV-t2b(圖1)。在TMV-t2b中的TAV插入片段作為AgeⅠ-XhoⅠ片段被切下(參見圖1)，並且該片段被末端補平並克隆成ClaⅠ-消化且末端補平的pPC2S(基於馬鈴薯病毒X的表達載體(Chapman等人，1992))，從而生產PVX-t2b。通過非依賴性啟動子(圖1中箭頭標記為1和3)控制該2b基因表達，這些啟動子僅被TMV或PVX編碼的各自RNA依賴型RNA聚合酶識別。
使用TMV或PVX的2b表達衍生物(TMV-t2b和PVX-t2b)感染植物，並將該2b基因的功能作用表示為野生型和其2b表達衍生物之間在誘導植物反應中的差異。
實施例2(在菸草Samsun中的抗性)TMV-t2b在Samsun(nn)菸草植物中誘導典型的過敏反應(HR)。如所述(Chapman等人，1992)在有帽模擬物(NEB)的情況下使用T7RNA聚合酶(Promega)在體外將質粒pTMV-30B、pPC2S及其衍生物線性化並轉錄。加帽RNA轉錄物經機械接種到茂盛生長的菸草Samsun(nn)的葉上。將這些植物在Conviron生長室(24℃恆定，75％溼度和16小時光照/8小時黑暗)中培養。在接種約4天後在所接種的葉上出現局部壞死斑，一直進行觀察(5周)，植物的剩餘部分沒有症狀。通過Northern印跡分析沒有檢測出病毒RNA在未接種葉上部累積，因此進一步證實了TMV-t2b沒有擴散到Samsun(nn)植物系統。而且，用於致病相關(PR)蛋白質1(PR-1)、PR-3和PR-5的mRNA的轉錄在接種葉中經過誘導。參見圖2，為用TMV-t2b或TMV攻擊的植物葉的Northern印跡。使用PR-1a cDNA作為探針(通過由基於Comelissen,B.J.等人公開的序列的菸草植物的PCR擴增獲得(1987))進行Northern印跡雜交。第5天(道1)、第7天(道2)、第10天(道3)和第13天(道4)從植物提取的所有RNA顯示PR-1的表達增加。道5和6用野生型TMV感染；然而，道5的菸草基因型為nn，而道6的為NN。
這些結果顯示出，Samsun(nn)菸草植物對TMV-t2b有抗性，並且通過TMV-t2b的攻擊接種誘導HR的形態學標記(局部壞死斑)和分子標記(PR蛋白質誘導)都表達在這些植物中。
已知，菸草Samsun(nn)不含對TMV特異性的抗性基因，並且這在本研究中得到證實當單獨用載體TMV-30B感染時，這些菸草植物形成系統性花葉症狀並且觀察不到PR基因的誘導。因此，得出結論菸草植物對TMV-t2b攻擊的抗性反應是由於來自TMV基因組的TAV 2b基因的順式表達。
實施例3(證明2b基因引起抗性)構建兩個TMV-t2b突變體，各含有點突變以破壞讀框2b。預期TMV-tΔ2b1(SEQ ID NO.2)不翻譯感染植物中的任意2b蛋白質。然而，在用TMV-tΔ2b2(SEQ ID NO.3)感染的植物中，希望表達失去C-端52個胺基酸殘基的截短的2b蛋白質。在經過接種的葉中TMV-tΔ2b1和TMV-tΔ2b2都不誘導局部壞死斑，也不誘導PR蛋白質的mRNA的轉錄。因此，TAV 2b蛋白質起抗性反應激活劑的作用。插入的TAV核苷酸序列本身在引起HR中不起作用。此外，看出TAV 2b蛋白質的C-端52胺基酸序列對該活性(參見下面)是必不可少的。
實施例4(抗性激活結構域的測定)
通過黃瓜花葉病毒(CMV)的Q菌株編碼的2b基因(SEQ ID NO.4)經過相似改造以由TMV基因組表達。系統性感染Samsun菸草植物的稱為TMV-q2b的衍生物在接種葉上不誘導壞死斑，也不誘導用於PR蛋白質的mRNA的轉錄。這說明，與TAV 2b蛋白質相反，該CMV2b蛋白質對抗性激活無活性。
為了定位對抗性激活重要的結構域，將TMV-t2b編碼的TAV 2b蛋白質逐漸從C-端被CMV 2b蛋白質的結構等價的區域所替換。傳染性測定顯示，替換TAV 2b蛋白質的C-端4個胺基酸保留其HR觸發活性。但是，TAV 2b蛋白質的C端替換26個或45個胺基酸，其觸發HR的能力消失。這說明，儘管在不失去活性的情況下可以將編碼4個C-端胺基酸的密碼子除去，但是TAB 2b蛋白質的C-端26個胺基酸對在菸草植物中的抗性激活是必不可少的。將編碼番茄無子病毒2b基因的C-端26個胺基酸和C-端45個胺基酸的密碼子轉移到無活性黃瓜花葉病毒2b基因的相應區域不產生活性嵌合基因；因此，該蛋白質的N-端部分也顯示含有一個或多個對抗性激活必不可少的結構域。
實施例5(在其它植物種中的抗性)因為Nicotiana benthamiana和Physalis floridana植物與該Samsun菸草的相似之處在於它們都對TMV敏感，並且被感染的植物不產生HR。感染性測定顯示，用TMV-t2b的攻擊接種在Nicotianabenthamiana和Physalis floridana植物的接種葉中都誘導典型局部壞死斑，同時植物未感染部分保持無症狀。這些結果暗示，TAV 2b基因還能夠激活這些植物種對TMV的抗性。TAV 2b基因能夠在2個屬的三個不同植物種中激活對TMV的抗性的事實暗示，它在廣泛宿主種中起相似作用。
實施例6(對馬鈴薯病毒X的抗性)Samsun(nn)和Xanthi-nc(NN)菸草(N.tabacum)植物對馬鈴薯病毒X(PVX)和來自以PVX為基礎的載體(pPC2S)的RNA轉錄物都完全敏感(Chapman等人，1992)。但是，用PVX-t2b轉錄物接種在兩種菸草品種的葉中都誘導HR。通過PVX-t2b感染誘導的壞死斑與通過TMV-t2b在Samsun(nn)植物上誘導的大致相同。此外，Northern印跡分析顯示，在用PVX-t2b攻擊的植物中還誘導PR基因的轉錄，但在用PVX或單獨用PVX載體攻擊的植物中不誘導PR基因的轉錄。因此，來自PVX基因組的TAV 2b基因順式表達還能夠在不含對PVX特異的抗性基因的菸草植物中觸發抗性反應。
TMV和PVX是不同病毒屬的不同植物RNA病毒，這兩個病毒的編碼蛋白質具有最小序列相似性。因此，不太可能TAV 2b基因的抗性激活需要與由兩個病毒載體編碼的任意蛋白質特異性相互作用。這些結果暗示了一種可能性，TAV 2b基因將可以激活對廣泛植物病原體的抗性機理。
野生型TAV(Ding等人，1994)和CMV/TAV嵌合CMV-qt(Ding等人，1996)都編碼TAV 2b基因，它在被感染的植物中以高水平表達(Shi等人，1997)。以前還顯示，用於該工作的所有三個植物種對TAV和CMV-qt完全敏感(Ding等人，1996)。這暗示，這些植物種不含識別TAV 2b基因的抗性基因。該結果說明，TAV 2b基因的抗性激活活性在這些植物種中不是組成型的，它可能需要例如用某些毒性病原體(例如TMV和PVX)感染的誘導事件。這種屬性將該TAV 2b基因與已知通過植物病原體編碼的無毒性基因區別開來。
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序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人丁守偉(ⅱ)發明名稱抗病性轉基因植物(ⅲ)序列數4(ⅳ)通信地址(A)收信人Rothwell,Figg,Ernst Kurz(B)街道555 Thirteenth Street,N.W.,Suite 701 East(C)城市華盛頓(D)州DC(E)國家美國(F)郵編20004(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release #1.0,Version #1.30(ⅵ)本申請數據(A)申請號(B)申請日(C)分類號(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Figg,Edward A.
(B)登記號27195(C)索引/摘要號2248-108(ⅸ)通訊信息(A)電話202-783-6040(B)傳真202-783-6031(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度328個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設無(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物體番茄無子病毒(ⅶ)即時來源(B)克隆pTMV-30B(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ACCGTTAAGA AGAAGAAGAA TGGCAAGCAT CGAGATCCCT CTACACGAGA TCATTCGAAA 60GTTGGAACGG ATGAATCAAA AGAAACAAGC ACAGAGGAAA CGACACAAAC TGAACCGCAA 120GGAGCGGGGT CACAAAAGTC CAAGTGAACA AAGGCGATCG GAGTTATGGC ACGCGCGTCA 180AGTTGAACTT TCTGCCATTA ATTCCGATAA TTCTTCAGAT GAGGGTACCA CTCTGTGTCG 240CTTTGACACA TTTGGTTCCA AGTCTGATGC TATTTGTGAT CGCTCTGACT GGTGTCTCGA 300TCAATGATTT CCGACCCTTC GTCGTCCG 328(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度328個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸
(A)說明/desc=「合成DNA」(ⅲ)假設無(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物體番茄無子病毒(ⅶ)即時來源(B)克隆pTAVd2b1(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:ACCGTTAAGA AGAAGTAGAA TGTAAAGCAT CGAGATCCCT CTACACGAGA TCATTCGAAA 60GTTGGAACGG ATGAATCAAA AGAAACAAGC ACAGAGGAAA CGACACAAAC TGAACCGCAA 120GGAGCGGGGT CACAAAAGTC CAAGTGAACA AAGGCGATCG GAGTTATGGC ACGCGCGTCA 180AGTTGAACTT TCTGCCATTA ATTCCGATAA TTCTTCAGAT GAGGGTACCA CTCTGTGTCG 240CTTTGACACA TTTGGTTCCA AGTCTGATGC TATTTGTGAT CGCTCTGACT GGTGTCTCGA 300TCAATGATTT CCGACCCTTC GTCGTCCG 328(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度328個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)說明/desc=「合成DNA」(ⅲ)假設無(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物體番茄無子病毒(ⅶ)即時來源
(B)克隆pTAVd2b2(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ACCGTTAAGA AGAAGTAGAA TGTAAAGCAT CGAGATCCCT CTACACGAGA TCATTCGAAA 60GTTGGAACGG ATGAATCAAA AGAAACAAGC ACAGAGGAAA CGACACAAAC TGAACCGCAA 120GGAGCGGGGT CACAAAAGTC CAAGTGAATA AAGGTGATCG GAGTTATGGC ACGCGCGTCA 180AGTTGAACTT TCTGCCATTA ATTCCGATAA TTCTTCAGAT GAGGGTACCA CTCTGTGTCG 240CTTTGACACA TTTGGTTCCA AGTCTGATGC TATTTGTGAT CGCTCTGACT GGTGTCTCGA 300TCAATGATTT CCGACCCTTC GTCGTCCG 328(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度504個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設無(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物體黃瓜花葉病毒(ⅶ)即時來源(B)克隆pCMV2b(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GATCCATGGA TGTGTTGACA GTAGTGGTGT CGACCGCCGA CCTCCACTTA GCCAATTTGC 60AGGAGGTGAA ACGTCGAAGA CGAAGGTCTC ACGTCAGAAA CCGGCGAGCG AGGGGTTACA 120AAAGTCCCAG CGAGAGAGCG CGATCTATAG CGAGACTTTT CCAGATGTTA CCATTCCACG 180GAGTAGATCC CGTGGATTGG TTTCCTGATG TCGTTCGCTC TCCGTCCGTT ACCAGCCTTG 240TTTCTTATGA ATCTTTTGAT GATACTGATT GGTTTGCTGG TAACGAATGG GCCGAAGGGT 300CGTTTTGATT TCCGACCCTT CGTCGTCCGA AGACGTTAAA CTACGCTCTC TTTATTGCGA 360GTGCTGAGTT GGTAGTTTGC TCTAAACTAT CTGAAGTCGC TAAATCCATT ACTGGTTGCG 420AACGGGTTGT CCATCCAGCT TACGGCTAAA ATGGTCAGTC ATGCCCCAAA GGCATGCCGA 480CACCCTACAG GGTTGTCGAG GTAC 50權利要求
1．一種用可操縱地與啟動子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段穩定轉化的轉基因植物，當所述植物被致病生物體感染時該啟動子能夠實現所述基因在所述植物中的表達。
2．權利要求1的轉基因植物，其中所述黃瓜花葉病毒屬2b基因為SEQ ID NO.1的核酸在嚴格條件下與其雜交的基因。
3．權利要求1的轉基因植物，其中所述黃瓜花葉病毒屬2b基因基本上具有SEQ ID NO.1的序列。
4．權利要求1的轉基因植物，其中所述植物用所述黃瓜花葉病毒屬2b基因的活性片段穩定轉化。
5．權利要求4的轉基因植物，其中所述片段包括編碼黃瓜花葉病毒屬2b基因所編碼的蛋白質的至少26個C-端胺基酸的核酸序列。
6．權利要求4的轉基因植物，其中所述片段包括編碼黃瓜花葉病毒屬2b基因所編碼的蛋白質的至少45個C-端胺基酸的核酸序列。
7．權利要求4的轉基因植物，其中所述片段不含編碼黃瓜花葉病毒屬2b基因所編碼的蛋白質的4個C-端胺基酸的胺基酸。
8．權利要求1的轉基因植物，其中所述2b基因的表達是由病原體誘導的啟動子控制的。
9．權利要求8的轉基因植物，其中病原體誘導的啟動子為PR蛋白質基因啟動子。
10．一種賦予植物抗感染性病原體引起的疾病的抗性的方法，包括用可操縱地與啟動子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段穩定地轉化植物，當所述植物被致病生物體感染時該啟動子能夠實現所述基因在所述植物中的表達。
11．權利要求10的方法，其中所述黃瓜花葉病毒屬2b基因為SEQID NO.1的核酸在嚴格條件下與其雜交的基因。
12.權利要求10的方法，其中所述黃瓜花葉病毒屬2b基因基本上具有SEQ ID NO.1的序列。
13．權利要求10的方法，其中所述植物用所述黃瓜花葉病毒屬2b基因的活性片段穩定轉化。
14．權利要求13的方法，其中所述片段包括編碼黃瓜花葉病毒屬2b基因所編碼的蛋白質的至少26個C-端胺基酸的核酸序列。
15．權利要求13的方法，其中所述片段包括編碼黃瓜花葉病毒屬2b基因所編碼的蛋白質的至少45個C-端胺基酸的核酸序列。
16．權利要求13的方法，其中所述片段不含編碼黃瓜花葉病毒屬2b基因所編碼的蛋白質的4個C-端胺基酸的胺基酸。
17．權利要求10的方法，其中所述2b基因的表達是由病原體誘導的啟動子控制的。
18．權利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的轉基因植物的種子。
19．權利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的轉基因植物的繁殖部分。
20．權利要求1的轉基因植物，為玉米、小麥、水稻、粟、燕麥、大麥、高粱、向日葵、甘薯、苜蓿、甜菜、芥子、番茄、胡椒、大豆、菸草、甜瓜、南瓜、馬鈴薯、花生、豌豆、棉花或可可。
21．一種表達載體，含有可操縱地與植物活性啟動子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段。
22．權利要求21的表達載體，其中黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段的表達是由病原體誘導的啟動子控制的。
23．權利要求22的表達載體，其中所述病原體誘導的啟動子為PR蛋白質基因啟動子。
全文摘要
用黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段轉化的轉基因植物表現出對感染性病原體如病毒引起的疾病的抗性。該2b基因的表達引起過敏反應活化並在不能對某些病原體有該反應的植物中表達致病性相關蛋白質。用包含可操縱地與植物活性啟動子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因的表達載體轉化各類植物使這些植物能抗致病性感染。
文檔編號C12N15/82GK1301308SQ9881416
公開日2001年6月27日 申請日期1998年5月12日 優先權日1998年5月12日
發明者丁守偉 申請人:分子農業生物學院